JPH07143898A

JPH07143898A - 細菌数の迅速測定方法及び測定キット

Info

Publication number: JPH07143898A
Application number: JP1206094A
Authority: JP
Inventors: Mikio Sato; 幹夫佐藤; Asami Ito; 朝美伊藤
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd
Priority date: 1993-04-26
Filing date: 1994-01-10
Publication date: 1995-06-06

Abstract

(57)【要約】（修正有）【構成】試料中の細菌数を測定するにあたり、細菌を
吸引ろ過しながら疎水性フィルターに捕集し、染色し、
次いで過剰の色素を洗浄により除去し、細菌の着色度か
ら試料中の細菌数を測定することを特徴とする細菌数の
迅速測定方法、並びに細菌捕集用疎水性フィルター，前
記疎水性フィルターを装着しうる吸引ろ過具，色素液，
洗浄液及び色対照表よりなる細菌数の測定キット。【効果】上記によれば、専門的な技術や知識を必要と
せず、迅速かつ簡便に試料中の細菌数を測定することが
できる。通常１分以内に判定可能である。また培養によ
らず細菌の有無が分かるので、病院の細菌検査の検体ス
クリーニングに活用できる。上記測定キットは、極めて
簡単かつ安価なもので、特別な機器を必要とせず、一般
の素人も使用することができるため、河川等の身の回り
の水質の検査や食品の細菌数の検査等が可能となる。そ
の他尿検査分野（診断領域）をはじめ、各種検査に広く
利用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、専門的な技術や知識を
必要とすることなく、試料中の細菌数を迅速、かつ、簡
便に測定する方法及びその測定キットに関する。本発明
は、尿中の細菌が問題となる診断分野をはじめ、金属加
工分野、腐敗が問題となる染料分野，食品分野など、広
汎な分野において有効に利用することができる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来よ
り、尿検査分野などでは、炎症の発見や病状を推定する
ために、尿等の試料中の細菌数等の測定が行なわれてい
る。例えば、尿中の細菌が増殖した場合、細菌尿症と診
断され、尿路感染症が暗示される。従って、早期治療や
薬投与のため、細菌数の測定を行なっている。このよう
な場合の細菌数の測定は、大部分の試料については平板
培養法により行なわれ、多くは市販の培地や市販キット
を用いて実施されている。より具体的には、例えば所定
量の試料を寒天平板培地などの上で３７℃程度で２４時
間程度培養して、生成するコロニー数を求め、該コロニ
ー数から細菌数を測定することにより行なわれている。
さらに、特に重要と思われる尿細菌については、種々の
市販のキットを用いて病原菌の同定が行なわれているの
が現状である。しかしながら、これらの方法では、医者
が患者の尿を採取しても、検査結果が判るのは翌日であ
る。したがって、検査結果を待つことにより処置が遅
れ、病状が悪化したりするなど、病状に合わせた迅速、
かつ、適切な緊急処置ができないという問題がある。さ
らに、患者は即日に治療が受けられず、時間的或いは経
済的負担も大きい。また、これらの方法では、特殊な技
術や専門知識が必要であり、培養設備のないところでは
測定できないなどの問題点がある。

【０００３】また、尿中の細菌を迅速簡便に検出する方
法として、亜硝酸塩試験法、カタラーゼ試験法、微量尿
糖試験法（いずれも「尿検査マニュアル」、吉沢一太
著、医歯薬出版、１９９１年発行）が知られている。ま
ず亜硝酸塩試験法は、濾紙により細菌を検出するもので
あり、尿中の硝酸塩がある種の細菌により還元されて亜
硝酸塩になることを利用したものであって、この亜硝酸
塩をグリース反応により検出する方法である。しかしな
がら、亜硝酸塩試験法は、硝酸塩還元活性のない菌を検
出することができないという欠点がある。次に、カタラ
ーゼ試験法は試薬が不安定で、特異性が低いという問題
がある。さらに、微量尿糖試験法では、緑膿菌、変形菌
が反応しないなどの問題点がある。

【０００４】このため、負に帯電したフィルターを用い
て細菌を検出する方法が提案されている（特開平１−１
２４７６７号公報) 。この方法は、尿を希塩酸溶液等の
強酸で希釈した後、負に帯電したフィルターに（滴下）
吸着し、次いでサフラニンを滴下して染色し、染色後、
希塩酸溶液を滴下して一次洗浄し、次いで希塩酸溶液を
滴下して二次洗浄し、色の強弱により判定するものであ
る。しかしながら、この方法ではフィルターに微生物を
吸着させる際、ｐＨ１〜３の強酸による前処理操作が必
要であると共に、希塩酸等の強酸が測定者の皮膚に触れ
ないように注意する必要があり、さらに、過剰な自由色
素を除去するために、二次にわたる洗浄操作を必要とす
るなど、操作が極めて煩雑であるという欠点がある。な
お、この方法は、白血球などの動物細胞も吸着し、染色
されるので、細菌特有の検出法とは言えないものであ
る。

【０００５】さらに、尿などをＥＤＴＡ存在下、サフラ
ニン染色し、次いで正に帯電した孔径０．６５μｍの半
透膜のエポキシ−ガラス繊維フィルターに吸着させ、し
かる後、ｐＨ２．７〜４．０の洗浄剤で洗浄し、色の強
弱により微生物の生菌数を測定する方法が提案されてい
る（特公昭５６−３８１９６号公報、米国特許第4,336,
337 号明細書) 。しかしながら、この方法の場合、染色
にキレート剤の添加が不可欠である。しかも、この方法
の場合、過剰な色素の除去に、真空ポンプまたは吸引す
る設備が必要であり、装置が大掛かりとなると共に、使
用する場所が限定されてしまうという欠点があった。す
なわち、この方法は、設備の整った大病院でのみ実施が
可能であり、我が国で大多数を占める小規模な病院或い
は診療所では、実際上実施することが困難であった。な
お、この方法も、白血球などの動物細胞も吸着し、染色
されるので、細菌特有の検出法とは言えないものであ
る。

【０００６】本出願人は、このような従来の欠点を解消
するものとして、微生物を疎水性フィルター上に捕集
し、次いで染色し、微生物の着色度から試料中の微生物
菌数を測定する方法を既に提案している（特開平４−２
１８３９２号公報) 。この方法によれば、熟練した技術
や専門的な知識、特別な設備などを必要とせず、しかも
迅速、かつ、簡便に試料中の微生物菌数を測定すること
が可能となった。しかし、実際使用してみると、若干着
色度が低く、判定に時間を要するという問題があった。

【０００７】本発明は、このような従来の欠点を解消
し、特別な設備や専門的な知識を必要とせず、しかも迅
速（１分以内に）、かつ、簡便に、試料中の細菌数を測
定する方法及びその測定キットを提供することを目的と
するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、試料
中の細菌数を測定するにあたり、細菌を吸引ろ過しなが
ら疎水性フィルターに捕集し、染色し、次いで過剰の色
素を洗浄により除去し、細菌の着色度から試料中の細菌
数を測定することを特徴とする細菌数の迅速測定方法を
提供するものである。

【０００９】このような本発明の方法は、細菌捕集用疎
水性フィルター，前記疎水性フィルターを装着しうる吸
引ろ過具，色素液，洗浄液及び色対照表よりなる細菌数
の測定キットを用いることにより、容易に実施すること
ができる。

【００１０】本発明を適用することができる試料は、特
に制限はなく、例えば尿を初めとして、切削油，圧延
油，熱処理油などの水溶性金属加工油、液体調味料（醤
油，ソースなど），液体飲食品（例えば発酵乳・乳酸菌
飲料など），酒類（例えばワイン，清酒など）などの液
状食品、粉末や固形食品（例えば野菜，魚肉など）の場
合には洗浄した試料、水溶性塗料等、さらには河川水，
池水，水槽水，生活廃水などの水等にも幅広く適用する
ことができる。なお、試料は必要に応じて、適宜、希釈
したり、或いは例えば固形食品などの場合には破砕した
後に、希釈したりするなどして測定用試料とするとよ
い。本発明は、このような試料中に存在する細菌、例え
ば大腸菌（ Escherichia Coli ），黄色ブドウ球菌（ S
taphylococcus aureus )，緑膿菌（ Pseudomonas aerug
inosa ) などについて、その総数を迅速に測定しようと
するものである。

【００１１】本発明では、まず試料中の細菌を吸引ろ過
しながら疎水性フィルターに捕集する。本発明では、こ
のように試料中の細菌を吸引ろ過しながら疎水性フィル
ターに捕集し、その後に、染色，洗浄を行なうので、吸
引ろ過条件下で連続的に、細菌の捕集，染色，洗浄の一
連の操作ができ、操作工程が簡便となる。

【００１２】本発明の方法では、細菌捕集用のフィルタ
ーとして、疎水性フィルターを用いる。疎水性フィルタ
ーは極性が弱いか、或いは極性がなく、過剰の色素の除
去が容易であるため細菌捕集用のフィルターとして好適
である。一方、極性のあるフィルターは過剰の色素の除
去が容易ではないため、好ましくない。このような疎水
性フィルターとしては、例えばナイロン系、ポリテトラ
フルオロエチレン（四フッ化エチレン樹脂）等のフッ素
系、ポリプロピレンなどのポリオレフィン系、或いはガ
ラス系などの疎水性フィルターが挙げられる。これらの
フィルターの中でも特にポリテトラフルオロエチレンや
ポリプロピレンを材料とする疎水性フィルターが、過剰
の色素の除去が容易であるため好ましい。また、親水性
の材料、例えばニトロセルロース系フィルターを表面処
理により疎水性にすれば、疎水性フィルターとして使用
することができる。ここで表面処理としてはコーティン
グなどであり、コーティングに用いる材料として、前記
ナイロン系，フッ素系，ポリオレフィン系の材料などを
用いることができる。

【００１３】この細菌捕集用の疎水性フィルターのろ過
孔径は、対象とする細菌の種類に応じて適宜選定すれば
よいが、通常は１〜４μｍ程度のものが用いられる。捕
集率やろ過性を考慮すると、２〜３μｍ程度のものが好
ましい。なお、試料中に細菌より大型の動物細胞、例え
ば白血球などが共存する場合には、そのような大型の動
物細胞を捕集することができるプレフィルター（例え
ば、ろ過孔径が６〜８μｍ程度のもの）を用いて前処理
すればよい。このようなプレフィルターとしては、極性
が弱いか、或いは極性がなく、細菌の吸着を妨げないこ
とから、上記した如き疎水性のフィルターを用いること
が好ましい。また、上記２枚のフィルター（細菌捕集用
の疎水性フィルターとプレフィルター）を重ねて使用す
ることにより、前処理操作を省略し、最後の判定の段階
で、プレフィルターを取り外して測定してもよく、或い
は洗浄前に取り外して洗浄してもよい。特に細菌以外の
動物細胞が多量に存在する場合には後者の方が好まし
い。なお、プレフィルターによる前処理は、吸引ろ過或
いは加圧ろ過により行なうことができる。

【００１４】この細菌捕集用の疎水性フィルターの吸引
ろ過面積（着色面積）の大きさは、見やすければ特に制
限はない。吸引ろ過される部分の形は特に問わないが、
見やすさの点で円形が望ましく、その口径（直径）が２
〜６mm程度の円形のものが好ましい。この細菌捕集用の
疎水性フィルター全体の大きさは特に制限はない。ま
た、この疎水性フィルター全体の形状は見やすさの点で
円形が好ましく、その口径（直径）は１０〜１５ｍｍ程
度のものが好ましい。

【００１５】この細菌捕集用の疎水性フィルターの色と
しては、用いる色素を考慮して、判定容易な色を定めれ
ばよい。着色の程度を容易に判定するためには、白色の
疎水性フィルターが好ましい。また、透明，半透明の疎
水性フィルターも用いることができ、白色用紙の上に疎
水性フィルターを載せて判定すると、判定が容易とな
る。

【００１６】上記の如き細菌捕集用の疎水性フィルター
を用いて試料中の細菌を捕集するが、本発明においては
試料中の細菌の捕集を吸引ろ過により行なう。通常は、
細菌捕集用の疎水性フィルターを所定の吸引ろ過具に装
着し、この吸引ろ過具に、染色前の試料を入れ、吸引ろ
過することにより、試料中の細菌を捕集する。ここで吸
引ろ過具は、通常は、細菌捕集用の疎水性フィルターを
装着して主にろ過を受け持つろ過具と、主に吸引を受け
持つ吸引具とからなるものであり、例えば細菌捕集用の
疎水性フィルターを装着しうるロート型ろ過器などと、
吸引ポンプとを組合せたものを用いることができる。よ
り具体的には例えば、上記したようなロート型ろ過器な
どのろ過具に、細菌捕集用の疎水性フィルターを装着
し、このろ過具の下部に、吸引ポンプなどの吸引具を配
置し、試料を吸引ろ過すればよい。また、吸引ポンプの
代わりに真空ラインを使用してもよい。ここで吸引ろ過
方法は、加圧ろ過方法に比べ、吸引しながら一連の操作
で、捕集、染色、洗浄ができ、加圧ろ過方法のようなフ
ィルターの差換えなどの操作がない点でより好ましい。

【００１７】図１，図２に、本発明におけるろ過具の例
を示す。図１は、ろ過具の一態様、すなわちロート型ろ
過器を示すものであり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面
図、（ｃ）は前記正面図における一部拡大断面図であ
る。また、図２は、ろ過具の他の態様を示すものであ
り、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は中央部
縦断面図である。図中、符号１がろ過具である。図１に
おいては、細菌捕集用の疎水性フィルター等も併せて示
した。すなわち、符号２はポリエチレンシートであり、
符号３は細菌捕集用の疎水性フィルターであり、符号４
はプレフィルターである。なお、符号５はポリエチレン
シート２に開けられた穴である。また、図２において、
符号６はフィルター支持部材であり、この上に細菌捕集
用の疎水性フィルター３が載せられる。

【００１８】上記したように、細菌の捕集、染色、洗浄
の各操作は、フィルターを吸引ろ過しながら、一連の操
作で実施することができる。細菌の捕集については、試
料（例えば尿）をプレフィルターで前処理（加圧ろ過或
いは吸引ろ過）した後、細菌捕集用の疎水性フィルター
へ注いで細菌を捕集するか、或いは前もって細菌捕集用
の疎水性フィルターの上にプレフィルターを重ねてお
き、その上に試料を注ぐことにより、細菌捕集用の疎水
性フィルターに細菌を捕集する。なお、検体（試料）の
量は、１００〜５００μｌ、望ましくは２００〜４００
μｌである。

【００１９】このように吸引ろ過により細菌捕集用の疎
水性フィルターへ捕集された試料（細菌）について、染
色を行なう。ここで細菌の染色は各種色素を用い、これ
を色素液とし、この色素液を、細菌を捕集した後の細菌
捕集用の疎水性フィルターに添加（通常は滴下）するこ
とにより行なう。染色に用いる色素としては、細菌の染
色に使用可能な色素であればよく、例えばフクシン，サ
フラニン，クリスタルバイオレット，ビクトリアブルー
などが挙げられ、特に過剰の色素の除去のし易さの点よ
り、フクシン，サフラニンが好ましい。

【００２０】上記色素は、水溶液（色素液）として使用
される。色素液とする際、必要に応じて、防腐剤、界面
活性剤等を添加することもできる。色素液の濃度は、通
常、0.0005〜2.0 ％（ｗ／ｖ）、好ましくは 0.002〜１
％（ｗ／ｖ）とする。ここで色素液の濃度が、0.0005％
未満であると着色が不充分となり、一方、色素液の濃度
が2.0 ％を超えると過剰の色素の除去が困難となるた
め、いずれも好ましくない。なお、必要に応じて、上記
の色素液に防腐剤としてエタノールを添加する場合には
１〜２０％（ｖ／ｖ）添加すればよく、また、界面活性
剤を添加する場合には、界面活性剤を0.0001〜１％（ｗ
／ｖ）の割合で添加すればよい。上記色素液の調製にあ
たっては、予め所定濃度の色素液を作製しておき、これ
を後述する如き洗浄液を用いて希釈して、所望する濃度
のものとしてもよい。また、色素液の添加量（滴下量）
は、通常、１００〜３００μｌである。さらに、試料液
量当たりの色素液量比は、０．２〜３．０、好ましくは
０．５〜２．０とする。０．２未満では着色不良とな
り、３．０を超えると色素液が無駄になり、いずれも好
ましくない。なお、細菌捕集用の疎水性フィルターの上
に、プレフィルターを重ねて捕集を行なった場合には、
プレフィルターの上に色素を添加（滴下）してもよく、
プレフィルターを取り除いてから色素液を添加（滴下）
してもよい。

【００２１】このようにして細菌捕集用の疎水性フィル
ターに捕集され、かつ、染色された試料（細菌）から、
過剰の色素を洗浄により除去する。このように洗浄は、
通常は染色後に行なうが、染色前にも該疎水性フィルタ
ーを洗浄しておくことにより、感度を向上させることが
できる。したがって、染色後だけでなく、染色前にも該
疎水性フィルターを洗浄しておくことがより好ましい。
例えば、染色前の洗浄を行わない場合には、１０⁵個／
ｍｌと１０⁴個／ｍｌの識別までしかできなかったの
が、染色前に洗浄を行うことにより、１０⁴個／ｍｌと
１０³個／ｍｌの識別まで可能となる。ここで用いる洗
浄液としては、水，各種緩衝液（ｐＨ６〜８程度のも
の）を使用することができる。さらに、必要に応じて、
各種界面活性剤を添加したものを用いてもよい。界面活
性剤は、0.0001〜1.0 ％（ｗ／ｖ）の割合で添加すれば
よい。

【００２２】洗浄液の使用量は、疎水性フィルターの吸
引ろ過面積（動物細胞捕集面積、すなわち着色面積）に
依存するため、一義的に決定することは困難であるが、
通常は５０〜３００μ１、好ましくは１００〜２００μ
１とする。この場合、洗浄液の使用量が５０μ１未満で
あると洗浄が不充分であり、一方、洗浄液の使用量が３
００μ１を超えると細菌から色素が漏出する可能性があ
る。洗浄液の使用量は、色の対照表や検量線を作成する
際の使用量と、細菌数未知試料を洗浄する使用量とを等
量にすることが、誤差を抑える意味で好ましい。過剰の
色素の除去は、具体的には、例えば前記の如く細菌捕集
用の疎水性フィルターに捕集され、染色された試料が入
れられた吸引ろ過具（上に染色された試料のあるフィル
ターが乗っている。）に、上記の如き洗浄液をとり（例
えば細菌捕集用の疎水性フィルター上に洗浄液を滴下
し）、吸引ろ過によって、除去することにより行なえば
よい。このように、本発明においては、細菌捕集用の疎
水性フィルターへの捕集，染色及び過剰の色素の洗浄除
去を全て吸引条件下で行なうことができる。従って、吸
引ろ過条件下に全ての操作を行なえ、操作の連続性を保
つことができる。

【００２３】このようにして過剰の色素が除去された試
料中の細菌の着色度から、試料中の細菌数を測定する。
この細菌数の測定は、（１）色の対照表を用いて目視に
より比較するのが一番簡便であるが、（２）光学密度
（Ｏ．Ｄ．）測定による比色定量法により行なうことも
できる。目視判定の場合には、細菌捕集用の疎水性フィ
ルターの表側の面のみならず、裏側の面の着色度より、
測定することもできる。これらの場合には、それぞれの
側用の色対照表を作成すればよい。

【００２４】上記（１）の目視による細菌数の測定は、
具体的には、細菌捕集用の疎水性フィルター上に存在す
る細菌の着色度、即ち色の強度を、既知量の細菌数の試
料を用いて予め作成しておいた色の対照表と比較するこ
とにより行なえばよい。色の対照表は、細菌数が既知の
試料を用い、本発明の方法で染色，洗浄した細菌捕集用
の疎水性フィルターをカラー写真に撮ることにより、又
は、この染色された細菌捕集用の疎水性フィルターと同
程度にろ紙等を着色したり、或いは同程度の色を紙に印
刷することにより、作成することができる。

【００２５】例えば、尿中の細菌数を測定する場合に
は、次のようにして色の対照表を作成する。すなわち、
尿中細菌は健常人の尿にも低濃度〔多い場合でも１ｍｌ
（ミリリットル）当り１万個程度〕存在する。１ｍｌ当
り１０万個以上の場合には有意と判断され、１ｍｌ当り
１００万個以上の場合には細菌感染（細菌尿症）が確定
的である。従って、通常、１万個／ｍｌ，１０万個／ｍ
ｌ，１００万個／ｍｌの３点の場合の標準色対照表を作
成すればよい。また、上記したように染色前に藻洗浄を
行うことにより、１０⁴個／ｍｌと１０³個／ｍｌの識
別まで可能となるため、１千個／ｍｌ程度、１万個／ｍ
ｌ程度、１０万個／ｍｌ程度、１００万個／ｍｌ程度、
１０００万個／ｍｌ程度の５点の標準色対照表を作成す
ることができる。

【００２６】このように色の対照表を用いる場合には、
この色対照表に、前記した細菌捕集用の疎水性フィルタ
ー，該フィルターを装着しうる吸引ろ過具，色素液及び
洗浄液、必要に応じてさらに、細菌以外の動物細胞を除
去するためのプレフィルターや、試料採取ピペットを組
み合わせて、試料中の細菌数を迅速、かつ、簡便に測定
しうる測定キットとすることができる。なお、吸引ろ過
具は、細菌捕集用の疎水性フィルターと組み合わせて吸
引ろ過できるものであればよく、特に制限はない。ま
た、その材質は、ガラス製とプラスチック製のいずれを
も使用することができる。さらに、その容量は、使用す
る洗浄液等の液量に応じて選択すればよい。また、細菌
捕集用の疎水性フィルターと、この吸引ろ過具とを一体
化することもできる。

【００２７】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、細菌捕集用の疎水性フィルター
上に存在する細菌を着色した色素を、有機溶剤を用いて
溶出させ、溶出液の着色度を吸光度により測定し、予め
作成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と細菌数との検量線と照
合して定量すればよい。吸光度測定時の波長は、用いる
色素により、適宜定めればよい。ここで有機溶剤として
は、各種アルコール類を使用することができるが、特に
エタノールが好ましい。

【００２８】なお、検量線の作成は、例えば次のように
して行なえばよい。即ち、色素としてフクシンを用いた
場合には、各種の濃度に希釈した試料の着色度を、マイ
クロプレートリーダーを用いて、着色度を４９２ｎｍの
光学密度（Ｏ．Ｄ．）により測定しておき、一方、各種
の濃度に希釈した試料と同一試料の試料溶液中の細菌数
を、寒天平板培養法のコロニー数の計数により算出して
おき、両者の結果から細菌数と光学密度の検量線を作成
すればよい。

【００２９】叙上のように、本発明の原理はシンプルな
ものであるので、測定を自動化することも容易である。
具体的には例えば、放射性同位元素で標識した細胞をろ
紙に集めるセルハーベスターを使用することができ、細
胞の代わりに細菌を使用し、放射性同位元素で標識する
代わりに色素で染色すること以外は、ほぼ同様な操作で
ろ紙に着色された細菌を集めることができる。９６穴フ
ラスコを使用すれば１度に９６個の検体の処理も可能で
ある。また、光学密度で測定する場合も自動化は可能で
ある。すなわち、エタノールなどで色素を吸引させなが
ら溶出させ、マイクロプレートリーダー等で光学密度の
測定，記録を自動化すれば、個人差による誤差が少なく
なり、管理にも便利である。さらに、多数のサンプルに
ついて測定しようとする場合には、従来あるドットブロ
ッターを用い、親水性フィルターを疎水性フィルターに
変えることにより、測定が可能となる。

【００３０】

【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。実施例１（１）色の対照表の作成種菌として、大腸菌（ Escherichia coli )( ATCC 1130
3 ) 及び黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus aureus )(
IFO 3183 )を用いて以下の試験を行なった。肉汁ブイヨ
ン培地に種菌を接種して、３７℃で２４時間の静置培養
を行ない、培養液を標準試料用菌懸濁液とした。一方、
健常人男子の放出尿を採取して、ろ過孔径が０．５μｍ
のポリテトラフルオロエチレン製メンブレンフィルター
（東洋濾紙製）でろ過して、細菌希釈用液を調製した。
この標準試料用菌懸濁液に所定量の前記細菌希釈用液を
添加して、各細菌数が１万個／ｍｌ程度、１０万個
／ｍｌ程度、１００万個／ｍｌ程度の濃度となるよう
に、３種の標準試料を調製した。なお、細菌数はＣＬＥ
Ｄ寒天平板培地で、３７℃、２４時間培養した際のコロ
ニー数により計数した。

【００３１】図１に示す如きろ過具とフィルターとを用
いて、細菌の捕集と染色操作を行なった。すなわち、ロ
ート型ガラス製ろ過器（ＦＮＬ５１Ｇ１）（全長１０
０ｍｍ、最大径５０ｍｍ）（ろ過具１）に、直径３ｍｍ
の円形の穴５を開けた、直径２０ｍｍの円形のポリエチ
レン製の膜（ポリエチレンシート２）を張り、その上に
直径１３ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ
Ｅ）製フィルター（ろ過孔径３μｍ、東洋濾紙製）（細
菌捕集用の疎水性フィルター３）を前記穴５を塞ぐよう
に置き、吸引ポンプにより吸引瓶（共に図示していな
い）を介して吸引しながら、細菌捕集用の疎水性フィル
ター３へ捕集し、そして染色，洗浄操作を行なった。す
なわち、上記の如くして調製された標準試料３００μｌ
を上記細菌捕集用の疎水性フィルター３に滴下し、吸引
ろ過して上記細菌捕集用の疎水性フィルター３に捕集し
た後、さらにフクシン染色液（濃度 0.005 % , W/V )１
５０μｌを滴下し、吸引ろ過して、細菌捕集用の疎水性
フィルター３に捕集された標準試料を染色した。次い
で、これに洗浄液〔 0.05 %(W/V ）ツイーン２０添加Ｐ
ＢＳ緩衝液，ｐＨ７．０〕１５０μl を滴下して過剰色
素を除去した。操作は、全て吸引条件下で行なった。使
用する試薬類は、使用に当たり、０．５μｍのポリテト
ラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製フィルター（東洋濾
紙製）でろ過して、微粒子を除去した。この細菌捕集用
の疎水性フィルター３上に存在する細菌の着色度( 直径
３mmの円の着色度) を目視により観察した結果、下記の
第１表の通りであった。なお、尿の代わりに滅菌水を希
釈剤として用いた場合も同様の結果であった。測定時間
は３０秒であった。

【００３２】

【表１】

【００３３】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。な
お、大腸菌と黄色ブドウ球菌との間で着色の程度に大差
はなかった。

【００３４】（２）尿中細菌数の測定細菌尿患者（女性、３８才），健常人（男性、５４才）
及び健常人（女性、２３才）の放出尿を試料として測定
した。まず、各試料について、細菌以外の大型の細胞を
除去するために、直径１３ｍｍのポリプロピレン製のプ
レフィルター４（ろ過孔径７μｍ）を、細菌捕集用のポ
リテトラフルオロエチレン製メンブレンフィルター（ろ
過孔径３μｍ、東洋濾紙製）（疎水性フィルター３）の
上に重ねたこと以外は、上記（１）と同様の操作を行な
い、染色した。次いで、プレフィルター４を取り外して
除き、洗浄液を上記（１）と同様に添加（滴下）した。
細菌捕集用の疎水性フィルター３上に存在する細菌の着
色度を、目視により観察し、上記（１）で作成した色の
対照表と比較して目視による判定を行なった。結果を第
２表に示す。なお、比較のために、ＣＬＥＤ寒天平板培
地で測定した細菌数も併せて表示した。

【００３５】

【表２】

【００３６】実施例２大腸菌（ Escherichia Coli )( ATCC 11303 ) を肉汁ブ
イヨン液体培地に接種して３７℃て２４時間の静置培養
を行ない、培養液を得た。一方、黄色ブドウ球菌（ Sta
phylococcus aureus )( IFO 3183 )を肉汁ブイヨン液体
培地に接種して３７℃て２４時間の静置培養を行ない、
培養液を得た。得られた各培養液について、それぞれ１
００倍希釈液と１０００倍希釈液を作製し、これら希釈
液について、実施例１（２）と同様な操作を行ない、細
菌数を測定した。結果を第３表に示す。なお、比較のた
めに、肉汁ブイヨン寒天平板培地で測定した細菌数も併
せて表示した。また、色の対照表は実施例１（１）で用
いられたものを用いた。

【００３７】

【表３】

【００３８】比較例１特開平４−２１８３９２号に記載された方法に従って、
尿中の細菌数を測定したところ、測定時間は３分であっ
た。

【００３９】実施例３（１）色の対照表の作成種菌として、大腸菌（ Escherichia coli )( ATCC 1130
3 ) 及び黄色ブドウ球菌（ Staphylococcus aureus )(
IFO 3183 )を用いて以下の試験を行なった。肉汁ブイヨ
ン培地に種菌を接種して、３７℃で２４時間の静置培養
を行ない、培養液を標準試料用菌懸濁液とした。一方、
健常人男子の放出尿を採取して、ろ過孔径が０．５μｍ
のポリテトラフルオロエチレン製メンブレンフィルター
（東洋濾紙製）でろ過して、細菌希釈用液を調製した。
この標準試料用菌懸濁液に所定量の前記細菌希釈用液を
添加して、各細菌数が１千個／ｍｌ程度、１万個／
ｍｌ程度、１０万個／ｍｌ程度、１００万個／ｍｌ
程度、１０００万個／ｍｌ程度の濃度となるように、
５種の標準試料を調製した。なお、細菌数はＣＬＥＤ寒
天平板培地で、３７℃、２４時間培養した際のコロニー
数により計数した。

【００４０】図１に示す如きろ過具とフィルターとを用
いて、細菌の捕集と染色操作を行なった。すなわち、ロ
ート型ガラス製ろ過器（ＦＮＬ５１Ｇ１）（全長１０
０ｍｍ、最大径５０ｍｍ）（ろ過具１）に、直径３ｍｍ
の円形の穴５を開けた、直径２０ｍｍの円形のポリエチ
レン製の膜（ポリエチレンシート２）を張り、その上に
直径１３ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦ
Ｅ）製フィルター（ろ過孔径３μｍ、東洋濾紙製）（細
菌捕集用の疎水性フィルター３）を前記穴５を塞ぐよう
に置き、吸引ポンプにより吸引瓶（共に図示していな
い）を介して吸引しながら、細菌捕集用の疎水性フィル
ター３へ捕集し、そして染色，洗浄操作を行なった。す
なわち、上記の如くして調製された標準試料１００μｌ
を上記細菌捕集用の疎水性フィルター３に滴下し、吸引
ろ過して上記細菌捕集用の疎水性フィルター３に捕集し
た後、洗浄液〔 0.05 %(W/V ）ツイーン２０添加ＰＢＳ
緩衝液，ｐＨ７．０〕１００μl を滴下して洗浄し、次
いでフクシン染色液（濃度 0.005 % ,W/V )１００μｌ
を滴下し、吸引ろ過して、細菌捕集用の疎水性フィルタ
ー３に捕集された標準試料を染色した。次いで、これに
上記と同組成の洗浄液１００μl を滴下して過剰色素を
除去した。操作は、全て吸引条件下で行なった。使用す
る試薬類は、使用に当たり、０．５μｍのポリテトラフ
ルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製フィルター（東洋濾紙
製）でろ過して、微粒子を除去した。この細菌捕集用の
疎水性フィルター３上に存在する細菌の着色度( 直径３
mmの円の着色度) を目視により観察した結果、下記の第
４表の通りであった。なお、尿の代わりに滅菌水を希釈
剤として用いた場合も同様の結果であった。測定時間は
３０秒であった。

【００４１】

【表４】

【００４２】これらの着色したフィルターを、標準サン
プルとしてカラー写真にとり、色の対照表とした。な
お、大腸菌と黄色ブドウ球菌との間で着色の程度に大差
はなかった。

【００４３】（２）尿中細菌数の測定細菌尿患者（女性、３８才），健常人（男性、５４才）
及び健常人（女性、２３才）の放出尿を試料として測定
した。まず、各試料について、細菌以外の大型の細胞を
除去するために、直径１３ｍｍのポリプロピレン製のプ
レフィルター４（ろ過孔径７μｍ）を、細菌捕集用のポ
リテトラフルオロエチレン製メンブレンフィルター（ろ
過孔径３μｍ、東洋濾紙製）（疎水性フィルター３）の
上に重ねたこと以外は、上記（１）と同様の操作を行な
い、染色した。次いで、プレフィルター４を取り外して
除き、洗浄液を上記（１）と同様に添加（滴下）した。
細菌捕集用の疎水性フィルター３上に存在する細菌の着
色度を、目視により観察し、上記（１）で作成した色の
対照表と比較して目視による判定を行なった。結果を第
５表に示す。なお、比較のために、ＣＬＥＤ寒天平板培
地で測定した細菌数も併せて表示した。

【００４４】

【表５】

【００４５】実施例４〜６実施例３（２）において、試料として、細菌尿患者の放
出尿の代わりに、乳酸菌飲料を滅菌水で１０００倍に希
釈した試料を用いたこと以外は、実施例３（２）と同様
の操作を行ない、実施例３（１）の色対照表と対比して
細菌数を算出し、これに１０００倍を乗じて、試料１ｍ
ｌ当りの細菌数を測定した。結果を第６表に示す。実施
例４は、乳酸菌飲料としてポピー（登録商標、高梨乳業
株式会社販売、ホワイト食品製造）を用い、実施例５
は、発酵乳としてヨーク（登録商標、日清ヨーク株式会
社製造）を用い、実施例６は、乳酸菌飲料としてヤクル
ト（登録商標、株式会社千葉ヤクルト工業製造）を用い
た。なお、比較のために、乳酸菌数測定用培地（ＢＣＰ
加プレートカウント寒天培地、栄研化学製）で培養し測
定した細菌数も併せて表示した。培養に際しては、試料
を滅菌水で１０万倍から１千万倍に希釈した試料を用い
て行なった。

【００４６】実施例７〜９実施例３（２）において、試料として、細菌尿患者の放
出尿の代わりに、固形食品（野菜又は魚肉であって、購
入後、数日間冷蔵庫で保存したもの）に重量相当分の滅
菌水を添加した後、ワーリングブレンダー（メーカー：
日本理化学器械製）で破砕（条件：１万回転、１分間）
し、１分間放置後、上清区分を用いたこと以外は、実施
例３（２）と同様の操作を行ない、実施例３（１）の色
対照表と対比して細菌数を測定した。結果を第６表に示
す。実施例７は、固形食品としてトマトを用い、実施例
８は、固形食品としてキャベツを用い、実施例９は、固
形食品としてハムを用いた。なお、比較のために、肉汁
ブイヨン寒天平板培地で測定した細菌数も併せて表示し
た。

【００４７】

【表６】

【００４８】

【発明の作用・効果】本発明の方法によれば、専門的な
技術や知識を必要とせず、しかも、迅速、かつ、簡便に
試料中の細菌数を測定することができる。本発明の方法
によれば、通常、１分以内に判定可能である。しかも本
発明の方法によれば、細菌の培養なしに、細菌の有無が
分かるので、病院の細菌検査の検体スクリーニングに活
用することができ、患者及び病院の経費軽減に貢献する
ことができる。また、本発明の方法においては、特別な
機器を必要としないので、小規模な病院或いは診療所で
も測定することができる。さらに、本発明の方法は、疎
水性フィルターのろ過孔径を選択することにより、多く
の細菌に適用できるので、応用範囲も極めて広い。ま
た、本発明の測定キットは、極めて簡単、かつ、安価な
ものであって、特別な機器を必要としないので、どのよ
うな現場においても使用することができるという利点が
ある。特に、本発明の測定キットは一般の素人も使用す
ることができるため、簡単に河川，海，池などの身の回
りの水質の検査が可能となり、環境保全に貢献すること
ができるばかりか、液状食品や固形食品などの食品にお
ける細菌数の検査等が可能となるという特質がある。し
たがって、本発明は、尿検査分野（診断領域）をはじ
め、各種検査に広く利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ろ過具の一態様を示すものであり、
（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は前記正面図
における一部拡大断面図である。

【図２】図２は、ろ過具の他の態様を示すものであり、
（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図、（ｃ）は中央部縦断
面図である。

【符号の説明】

１ろ過具２ポリエチレンシート３細菌捕集用の疎水性フィルター４プレフィルター５ポリエチレンシート２に開けられた穴６フィルター支持部材

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の細菌数を測定するにあたり、細
菌を吸引ろ過しながら疎水性フィルターに捕集し、染色
し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、細菌の着色
度から試料中の細菌数を測定することを特徴とする細菌
数の迅速測定方法。
【請求項２】染色前に疎水性フィルターを洗浄する請
求項１記載の方法。
【請求項３】疎水性フィルターの孔径が１〜４μｍで
ある請求項１記載の方法。
【請求項４】試料が尿である請求項１記載の方法。
【請求項５】試料が食品である請求項１記載の方法。
【請求項６】試料が発酵乳・乳酸菌飲料，野菜又は魚
肉である請求項５記載の方法。
【請求項７】細菌捕集用疎水性フィルター，前記疎水
性フィルターを装着しうる吸引ろ過具，色素液，洗浄液
及び色対照表よりなる細菌数の測定キット。