JPH0728758B2 - 微生物生菌数の迅速測定方法および測定キット - Google Patents
微生物生菌数の迅速測定方法および測定キットInfo
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- JPH0728758B2 JPH0728758B2 JP3027636A JP2763691A JPH0728758B2 JP H0728758 B2 JPH0728758 B2 JP H0728758B2 JP 3027636 A JP3027636 A JP 3027636A JP 2763691 A JP2763691 A JP 2763691A JP H0728758 B2 JPH0728758 B2 JP H0728758B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/06—Quantitative determination
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- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中の微生物生菌数
を、迅速かつ簡便に測定する方法及び測定キットに関
し、金属加工分野，腐敗が問題となる染料分野，食品分
野，尿中の細菌が問題となる診断分野等をはじめ、広汎
な分野において有効に利用することができる。
を、迅速かつ簡便に測定する方法及び測定キットに関
し、金属加工分野，腐敗が問題となる染料分野，食品分
野，尿中の細菌が問題となる診断分野等をはじめ、広汎
な分野において有効に利用することができる。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】例え
ば、切削油，圧延油，熱処理油などの水溶性金属加工油
や液体調味料，液体飲食品，酒類などの液状食品，水溶
性塗料等は、微生物が繁殖するための条件を満足してい
るため、その管理の程度によっては、著しく繁殖して、
腐敗に至ることがある。
ば、切削油，圧延油，熱処理油などの水溶性金属加工油
や液体調味料，液体飲食品，酒類などの液状食品，水溶
性塗料等は、微生物が繁殖するための条件を満足してい
るため、その管理の程度によっては、著しく繁殖して、
腐敗に至ることがある。
【０００３】このような水溶性金属加工油，液状食品等
の腐敗を初期段階で防止して、好ましい状態に保管する
ためには、これら試料中の微生物の数、とりわけ好気性
細菌の生菌数を正しく把握しておくことが必要である。
の腐敗を初期段階で防止して、好ましい状態に保管する
ためには、これら試料中の微生物の数、とりわけ好気性
細菌の生菌数を正しく把握しておくことが必要である。
【０００４】従来、各種試料中の酵母，細菌等の好気性
微生物の生菌数を測定する方法として、例えば所定量の
試料を寒天培地上で培養して生成するコロニー数を求
め、該コロニー数から生菌数を算出する方法が知られて
いる。しかしながら、この方法は特殊な機器（例えば恒
温槽など）を必要とすると共に、測定結果が得られるま
でに長時間を要する（通常、４８時間必要）などの欠点
があった。
微生物の生菌数を測定する方法として、例えば所定量の
試料を寒天培地上で培養して生成するコロニー数を求
め、該コロニー数から生菌数を算出する方法が知られて
いる。しかしながら、この方法は特殊な機器（例えば恒
温槽など）を必要とすると共に、測定結果が得られるま
でに長時間を要する（通常、４８時間必要）などの欠点
があった。
【０００５】そこで好気性微生物の生菌数を迅速に測定
する方法として、酵素活性（カタラーゼ活性）を測定す
る方法（特開昭５７−７４０９５号公報) や蛍光色素で
染色して測定する方法（特開昭６２−１３８１８５号公
報 )が提案されている。しかしながら、前者には使用す
る過酸化水素が不安定である、という問題があり、また
後者には特殊な機器（蛍光光度計）を必要とするため、
特殊な環境以外では使用することができない、という問
題があった。
する方法として、酵素活性（カタラーゼ活性）を測定す
る方法（特開昭５７−７４０９５号公報) や蛍光色素で
染色して測定する方法（特開昭６２−１３８１８５号公
報 )が提案されている。しかしながら、前者には使用す
る過酸化水素が不安定である、という問題があり、また
後者には特殊な機器（蛍光光度計）を必要とするため、
特殊な環境以外では使用することができない、という問
題があった。
【０００６】このため、負に帯電したフィルターに微生
物を吸着させた後、色素により染色して測定する方法
（特開平１−１２４７６７号公報) が提案されている。
しかしながら、この方法ではフィルターに微生物を吸着
させる際、ｐＨ１〜３の強酸による前処理操作が必要で
あると共に、塩酸等の強酸が測定者の皮膚に触れないよ
うに注意する必要があり、さらに、過剰な自由色素を除
去するために、二次にわたる洗浄操作を必要とするな
ど、操作が極めて煩雑であるという欠点があった。
物を吸着させた後、色素により染色して測定する方法
（特開平１−１２４７６７号公報) が提案されている。
しかしながら、この方法ではフィルターに微生物を吸着
させる際、ｐＨ１〜３の強酸による前処理操作が必要で
あると共に、塩酸等の強酸が測定者の皮膚に触れないよ
うに注意する必要があり、さらに、過剰な自由色素を除
去するために、二次にわたる洗浄操作を必要とするな
ど、操作が極めて煩雑であるという欠点があった。
【０００７】さらに、米国特許第 4,336,337号明細書に
は、尿などをＥＤＴＡ存在下、サフラニン染色し、次い
で正に帯電したフィルターに吸着させ、しかる後、ｐＨ
2.7〜4.0 の洗浄剤で洗浄し、色の強弱により微生物の
生菌数を測定する装置が開示されている。しかしなが
ら、この特許の場合、過剰な色素の除去に、真空ポンプ
または吸引する設備が必要であり、装置が大掛かりとな
ると共に、使用する場所が限定されてしまうという欠点
があった。
は、尿などをＥＤＴＡ存在下、サフラニン染色し、次い
で正に帯電したフィルターに吸着させ、しかる後、ｐＨ
2.7〜4.0 の洗浄剤で洗浄し、色の強弱により微生物の
生菌数を測定する装置が開示されている。しかしなが
ら、この特許の場合、過剰な色素の除去に、真空ポンプ
または吸引する設備が必要であり、装置が大掛かりとな
ると共に、使用する場所が限定されてしまうという欠点
があった。
【０００８】本発明は、このような従来の欠点を解消
し、特別な機器を必要とせず、しかも迅速かつ簡便に微
生物の生菌数を測定する方法及び測定キットを提供する
ことを目的とするものである。
し、特別な機器を必要とせず、しかも迅速かつ簡便に微
生物の生菌数を測定する方法及び測定キットを提供する
ことを目的とするものである。
【０００９】
すなわち本発明は、試料中の微生物生菌数を測定するに
あたり、微生物を染色した後に疎水性フィルターに捕集
するか、或いは疎水性フィルターに捕集した後に微生物
を染色し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、微生
物の着色度から試料中の微生物生菌数を測定することを
特徴とする微生物生菌数の迅速測定方法を提供するもの
である。
あたり、微生物を染色した後に疎水性フィルターに捕集
するか、或いは疎水性フィルターに捕集した後に微生物
を染色し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、微生
物の着色度から試料中の微生物生菌数を測定することを
特徴とする微生物生菌数の迅速測定方法を提供するもの
である。
【００１０】本発明の方法は、疎水性フィルター，該フ
ィルターを装着しうる注射筒，色素液，洗浄液および色
対照表よりなる微生物生菌数の測定キットを用いること
により、容易に実施することができる。
ィルターを装着しうる注射筒，色素液，洗浄液および色
対照表よりなる微生物生菌数の測定キットを用いること
により、容易に実施することができる。
【００１１】本発明を適用することができる試料は、特
に制限はなく、例えば切削油，圧延油，熱処理油などの
水溶性金属加工油；液体調味料，液体飲食品，酒類など
の液状食品；水溶性塗料等をはじめとして、河川水，池
水，水槽水，生活廃水などの水等にも幅広く適用するこ
とができる。
に制限はなく、例えば切削油，圧延油，熱処理油などの
水溶性金属加工油；液体調味料，液体飲食品，酒類など
の液状食品；水溶性塗料等をはじめとして、河川水，池
水，水槽水，生活廃水などの水等にも幅広く適用するこ
とができる。
【００１２】また、本発明の対象とする微生物は、金属
加工油，塗料，尿中などに存在する黴，酵母，細菌等で
あり、特に好気性細菌である。
加工油，塗料，尿中などに存在する黴，酵母，細菌等で
あり、特に好気性細菌である。
【００１３】本発明では、まず試料中の微生物を染色し
た後に疎水性フィルターに捕集するか、或いは疎水性フ
ィルターに捕集した後に微生物を染色する。すなわち、
微生物の染色の前後のいずれかの時期に、疎水性フィル
ターで捕集を行なう。
た後に疎水性フィルターに捕集するか、或いは疎水性フ
ィルターに捕集した後に微生物を染色する。すなわち、
微生物の染色の前後のいずれかの時期に、疎水性フィル
ターで捕集を行なう。
【００１４】ここで微生物の染色は、各種色素を用い、
これを色素液とし、この色素液を、疎水性フィルターで
微生物を捕集する前或いは捕集した後の試料に添加する
ことにより行なう。
これを色素液とし、この色素液を、疎水性フィルターで
微生物を捕集する前或いは捕集した後の試料に添加する
ことにより行なう。
【００１５】染色に用いる色素としては、微生物の染色
に使用可能な色素であればよく、例えばフクシン，サフ
ラニン，ビクトリアブルーなどが挙げられ、特に過剰の
色素の除去のしやすさの点より、フクシン，サフラニン
が好ましい。上記色素は、水溶液（色素液）として使用
される。色素液とする際、必要に応じてエタノール等を
添加することもできる。
に使用可能な色素であればよく、例えばフクシン，サフ
ラニン，ビクトリアブルーなどが挙げられ、特に過剰の
色素の除去のしやすさの点より、フクシン，サフラニン
が好ましい。上記色素は、水溶液（色素液）として使用
される。色素液とする際、必要に応じてエタノール等を
添加することもできる。
【００１６】なお、色素液の濃度は、通常、0.0005〜2.
0 ％、好ましくは 0.002〜１％とする。ここで色素液の
濃度が0.0005％未満であると着色が不充分となり、一
方、色素液の濃度が2.0 ％を超えると過剰の色素の除去
が困難となるため、いずれも好ましくない。
0 ％、好ましくは 0.002〜１％とする。ここで色素液の
濃度が0.0005％未満であると着色が不充分となり、一
方、色素液の濃度が2.0 ％を超えると過剰の色素の除去
が困難となるため、いずれも好ましくない。
【００１７】本発明においては、上記の色素液には、界
面活性剤を必要に応じて添加してもよく、その場合は0.
0001〜１％添加すればよい。
面活性剤を必要に応じて添加してもよく、その場合は0.
0001〜１％添加すればよい。
【００１８】上記色素液の調製にあたっては、予め所定
濃度の色素液を作製しておき、これを後述する如き洗浄
液を用いて希釈して、所望する濃度のものとしてもよ
い。また、試料液量当たりの色素液量比は１以上、好ま
しくは５以上とする。ここで試料液量当たりの色素液量
比が１未満であると、着色が不充分となってしまい好ま
しくない。
濃度の色素液を作製しておき、これを後述する如き洗浄
液を用いて希釈して、所望する濃度のものとしてもよ
い。また、試料液量当たりの色素液量比は１以上、好ま
しくは５以上とする。ここで試料液量当たりの色素液量
比が１未満であると、着色が不充分となってしまい好ま
しくない。
【００１９】次に疎水性フィルターとしては、ポリテト
ラフルオロエチレン（商品名：テフロン）等のフッ素系
ポリマーやオレフィン系のポリマーを材料とするものが
用いられ、特にポリテトラフルオロエチレン，オレフィ
ン系のポリマーを材料とするものが、過剰の色素の除去
が容易であるため好ましい。
ラフルオロエチレン（商品名：テフロン）等のフッ素系
ポリマーやオレフィン系のポリマーを材料とするものが
用いられ、特にポリテトラフルオロエチレン，オレフィ
ン系のポリマーを材料とするものが、過剰の色素の除去
が容易であるため好ましい。
【００２０】この疎水性フィルターの孔径は、対象とす
る微生物の種類に応じて適宜選定すればよく、例えば細
菌の場合では 0.22 〜0.50μｍの孔径のものが好まし
い。なお、この疎水性フィルターの大きさは特に制限は
ない。通常、この疎水性フィルターは注射筒に装着して
用いるので、その口径が 13 〜 25 mm程度のものが好ま
しい。
る微生物の種類に応じて適宜選定すればよく、例えば細
菌の場合では 0.22 〜0.50μｍの孔径のものが好まし
い。なお、この疎水性フィルターの大きさは特に制限は
ない。通常、この疎水性フィルターは注射筒に装着して
用いるので、その口径が 13 〜 25 mm程度のものが好ま
しい。
【００２１】この疎水性フィルターの色としては、用い
る色素を考慮し、判定容易な色を定めればよい。着色の
程度を容易に判定するためには、白色のフィルターが好
ましい。また、透明，半透明のフィルターを用いること
ができるが、白色用紙の上にフィルターを載せて判定す
ると、判定が容易となる。
る色素を考慮し、判定容易な色を定めればよい。着色の
程度を容易に判定するためには、白色のフィルターが好
ましい。また、透明，半透明のフィルターを用いること
ができるが、白色用紙の上にフィルターを載せて判定す
ると、判定が容易となる。
【００２２】上記の如き疎水性フィルターを用いて試料
中の微生物を捕集する点に、本発明の最大の特徴があ
る。通常は、疎水性フィルターを注射筒に装着し、この
注射筒に、既に染色された試料或いは染色前の試料を入
れ、加圧ろ過することにより、微生物を捕集する。染色
前の試料を入れた場合には、この後に染色する。
中の微生物を捕集する点に、本発明の最大の特徴があ
る。通常は、疎水性フィルターを注射筒に装着し、この
注射筒に、既に染色された試料或いは染色前の試料を入
れ、加圧ろ過することにより、微生物を捕集する。染色
前の試料を入れた場合には、この後に染色する。
【００２３】このようにして染色され、かつ疎水性フィ
ルターに捕集された試料から、過剰の色素を洗浄により
除去する。ここで用いる洗浄液としては、水，各種緩衝
液（ｐＨ６〜８程度のもの）を使用することができる。
さらに、必要に応じて各種界面活性剤を添加してもよ
い。この場合は、0.0001〜１％添加すればよい。
ルターに捕集された試料から、過剰の色素を洗浄により
除去する。ここで用いる洗浄液としては、水，各種緩衝
液（ｐＨ６〜８程度のもの）を使用することができる。
さらに、必要に応じて各種界面活性剤を添加してもよ
い。この場合は、0.0001〜１％添加すればよい。
【００２４】洗浄液の使用量はフィルターの口径に依存
するが、例えばフィルターの口径が１３mmであれば、１
〜５ml（ミリリットル）、好ましくは２〜３mlとする。
この場合洗浄液の使用量が１ml未満であると、洗浄が不
充分であり、一方、洗浄液の使用量が５mlを超えると、
微生物菌体から色素が漏出する可能性がある。洗浄液の
使用量は、色の対照表や、検量線を作成する際の使用量
と、生菌数未知試料を洗浄する使用量とを等量にするこ
とが、誤差を抑える意味で好ましい。
するが、例えばフィルターの口径が１３mmであれば、１
〜５ml（ミリリットル）、好ましくは２〜３mlとする。
この場合洗浄液の使用量が１ml未満であると、洗浄が不
充分であり、一方、洗浄液の使用量が５mlを超えると、
微生物菌体から色素が漏出する可能性がある。洗浄液の
使用量は、色の対照表や、検量線を作成する際の使用量
と、生菌数未知試料を洗浄する使用量とを等量にするこ
とが、誤差を抑える意味で好ましい。
【００２５】過剰の色素の除去は、具体的には例えば、
前記の如く染色され、かつ疎水性フィルターに捕集され
た試料が入れられた注射筒に、上記の如き洗浄液をと
り、加圧ろ過によって、除去することにより行なえばよ
い。
前記の如く染色され、かつ疎水性フィルターに捕集され
た試料が入れられた注射筒に、上記の如き洗浄液をと
り、加圧ろ過によって、除去することにより行なえばよ
い。
【００２６】このようにして過剰の色素が除去された試
料中の微生物の着色度から、試料中の微生物生菌数を測
定する。この微生物生菌数の測定は、（１）目視によ
り、或いは（２）光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定による比色
定量により、行なえばよい。
料中の微生物の着色度から、試料中の微生物生菌数を測
定する。この微生物生菌数の測定は、（１）目視によ
り、或いは（２）光学密度（Ｏ．Ｄ．）測定による比色
定量により、行なえばよい。
【００２７】上記（１）の目視による微生物生菌数の測
定は、具体的には、フィルター上に存在する微生物の着
色度、すなわち色の強度を、既知量の生菌数の試料を用
いて予め作成しておいた色の対照表と比較することによ
り行なえばよい。色の対照表は、既知量の生菌数の試料
を用い、本発明の方法で染色，洗浄したフィルターをカ
ラー写真に撮ることにより、またこのフィルターと同程
度にろ紙等を着色することにより、作成することができ
る。
定は、具体的には、フィルター上に存在する微生物の着
色度、すなわち色の強度を、既知量の生菌数の試料を用
いて予め作成しておいた色の対照表と比較することによ
り行なえばよい。色の対照表は、既知量の生菌数の試料
を用い、本発明の方法で染色，洗浄したフィルターをカ
ラー写真に撮ることにより、またこのフィルターと同程
度にろ紙等を着色することにより、作成することができ
る。
【００２８】ここで既知量の生菌数の試料の選定は、生
菌数の未知試料の測定の精度に合わせて行なえばよい。
生菌数の未知試料の腐敗の程度を判定する場合には、通
常、１０4 〜１０5 個/ mlでは腐敗しておらず、１０7
個/ mlでは腐敗が進んでいるといわれるので、例えば１
０4 個/ ml以下、１０5 個/ ml程度、１０6 個/ ml程
度、１０7 個/ ml以上の４点で色の対照表を作成すれば
よい。このように色の対照表を用いる場合には、前記し
た疎水性フィルター，該フィルターに装着しうる注射
筒，色素液，洗浄液と組み合わせて、微生物生菌数を迅
速かつ簡便に測定しうる測定キットとすることができ
る。
菌数の未知試料の測定の精度に合わせて行なえばよい。
生菌数の未知試料の腐敗の程度を判定する場合には、通
常、１０4 〜１０5 個/ mlでは腐敗しておらず、１０7
個/ mlでは腐敗が進んでいるといわれるので、例えば１
０4 個/ ml以下、１０5 個/ ml程度、１０6 個/ ml程
度、１０7 個/ ml以上の４点で色の対照表を作成すれば
よい。このように色の対照表を用いる場合には、前記し
た疎水性フィルター，該フィルターに装着しうる注射
筒，色素液，洗浄液と組み合わせて、微生物生菌数を迅
速かつ簡便に測定しうる測定キットとすることができ
る。
【００２９】なお注射筒は、フィルターと組み合わせて
加圧ろ過できるものであればよく、特に制限はない。ま
た、その材質はガラス製，プラスチック製のいずれも使
用することができる。さらに、その容量は使用する洗浄
液等の液量に応じて選択すればよい。
加圧ろ過できるものであればよく、特に制限はない。ま
た、その材質はガラス製，プラスチック製のいずれも使
用することができる。さらに、その容量は使用する洗浄
液等の液量に応じて選択すればよい。
【００３０】また、上記（２）の光学密度（Ｏ．Ｄ．）
測定による比色定量は、フィルター上に存在する微生物
に着色した色素を有機溶剤を用いて溶出させ、溶出液の
着色度を、吸光度により測定し、この測定値を、予め作
成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と微生物生菌数との検量線
を用いて定量すればよい。吸光度は、用いる色素によ
り、適宜定めればよい。ここで有機溶剤としては、各種
アルコール類を使用することができるが、特にエタノー
ルが好ましい。
測定による比色定量は、フィルター上に存在する微生物
に着色した色素を有機溶剤を用いて溶出させ、溶出液の
着色度を、吸光度により測定し、この測定値を、予め作
成した光学密度（Ｏ．Ｄ．）と微生物生菌数との検量線
を用いて定量すればよい。吸光度は、用いる色素によ
り、適宜定めればよい。ここで有機溶剤としては、各種
アルコール類を使用することができるが、特にエタノー
ルが好ましい。
【００３１】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。
る。
【００３２】なお、検量線は以下の方法によって作成し
た。 〔検量線の作成〕 金属加工油Ａ（マイクロエマルジョン型）について、新
しい同一油剤で各種濃度に希釈して試料を調製した。フ
クシン染色液（濃度 20 mg／100 ml) を、洗浄液( 0.00
25％ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ 7.8）で４分
の１濃度に希釈して得たフクシン液２mlを、５ml容チュ
ーブに取り、これに前記試料 50 μl を添加して、好気
性細菌を染色した。１〜２秒間かく拌した後、口径１３
mm，孔径０．５０μｍのポリテトラフルオロエチレン系
フィルター（商品名：ＤＩＳＭＩＣ−１３ＪＰ，アドバ
ンテック東洋製）を装着した５ml容注射筒に入れ、加圧
ろ過することにより、前記ポリテトラフルオロエチレン
系フィルターに、好気性細菌を捕集した（捕集状態を示
す参考図を図１に示す。）。次いで注射筒とフィルター
を分離し、この注射筒に洗浄液（上記と同じもの）2.5m
lをとり、再度、注射筒とフィルターを装着し、洗浄液
で洗浄，ろ過して、過剰の色素を除去した。このように
して前記５ml容注射筒に装着されたフィルターに捕集さ
れた、微生物に着色した色素を、溶剤としてエタノール
１mlを用い、ろ過して溶出させた。上記の如くして得ら
れた溶出液のうち、 200μl （マイクロリットル）を 9
6 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダー( コロ
ナ社製) を用いて、着色度を492ｎｍの光学密度（Ｏ．
Ｄ．）により測定した。一方、各種の濃度に希釈した試
料と同一試料の試料溶液中の好気性細菌生菌数を、寒天
平板法により算出した。即ち、試料溶液の一定量を、肉
エキス 0.5％，ペプトン 1.0％，塩化ナトリウム 0.5
％，寒天 1.5％を含む培地（ｐＨ 7.0）に接種し、３０
℃で４８時間培養し、生成したコロニー数から好気性細
菌数を求めた。両者の結果から、生菌数と光学密度の検
量線を作成した。図２に検量線を示す。
た。 〔検量線の作成〕 金属加工油Ａ（マイクロエマルジョン型）について、新
しい同一油剤で各種濃度に希釈して試料を調製した。フ
クシン染色液（濃度 20 mg／100 ml) を、洗浄液( 0.00
25％ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ 7.8）で４分
の１濃度に希釈して得たフクシン液２mlを、５ml容チュ
ーブに取り、これに前記試料 50 μl を添加して、好気
性細菌を染色した。１〜２秒間かく拌した後、口径１３
mm，孔径０．５０μｍのポリテトラフルオロエチレン系
フィルター（商品名：ＤＩＳＭＩＣ−１３ＪＰ，アドバ
ンテック東洋製）を装着した５ml容注射筒に入れ、加圧
ろ過することにより、前記ポリテトラフルオロエチレン
系フィルターに、好気性細菌を捕集した（捕集状態を示
す参考図を図１に示す。）。次いで注射筒とフィルター
を分離し、この注射筒に洗浄液（上記と同じもの）2.5m
lをとり、再度、注射筒とフィルターを装着し、洗浄液
で洗浄，ろ過して、過剰の色素を除去した。このように
して前記５ml容注射筒に装着されたフィルターに捕集さ
れた、微生物に着色した色素を、溶剤としてエタノール
１mlを用い、ろ過して溶出させた。上記の如くして得ら
れた溶出液のうち、 200μl （マイクロリットル）を 9
6 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダー( コロ
ナ社製) を用いて、着色度を492ｎｍの光学密度（Ｏ．
Ｄ．）により測定した。一方、各種の濃度に希釈した試
料と同一試料の試料溶液中の好気性細菌生菌数を、寒天
平板法により算出した。即ち、試料溶液の一定量を、肉
エキス 0.5％，ペプトン 1.0％，塩化ナトリウム 0.5
％，寒天 1.5％を含む培地（ｐＨ 7.0）に接種し、３０
℃で４８時間培養し、生成したコロニー数から好気性細
菌数を求めた。両者の結果から、生菌数と光学密度の検
量線を作成した。図２に検量線を示す。
【００３３】実施例１ フクシン染色液（濃度 20 mg／100 ml) を、洗浄液( 0.
0025％ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ 7.8）で４
分の１濃度に希釈して得たフクシン液２mlを、５ml容の
チューブに取り、これに金属加工油Ｂ（マイクロエマル
ジョン型） 50μl を添加して、好気性細菌を染色し
た。１〜２秒間かく拌した後、口径１３mm，孔径０．５
０μｍのポリテトラフルオロエチレン系フィルター（商
品名：ＤＩＳＭＩＣ−１３ＪＰ，アドバンテック東洋
製）を装着した５ml容の注射筒に入れて、加圧ろ過する
ことにより、前記ポリテトラフルオロエチレン系フィル
ターに好気性細菌を捕集した（図１参照）。次いで、注
射筒とフィルターを分離し、この注射筒に、洗浄液（上
記と同じもの） 2.5mlをとり、再度、注射筒とフィルタ
ーを装着し、洗浄液で洗浄，ろ過して、過剰の色素を除
去した。このようにして前記５ml容の注射筒に装着され
たフィルターに捕集された、微生物に着色した色素を、
溶剤としてエタノール１mlを用いて、ろ過して溶出させ
た。上記の如くして得られた溶出液のうち、 200μl を
96 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダー( コ
ロナ社製) を用いて、着色度を 492ｎｍの光学密度
（Ｏ．Ｄ．）により測定した。その結果、溶出液の光学
密度（Ｏ．Ｄ．）は、0.665 であり、検量線より求めた
好気性細菌の生菌数は 5.0× 107個／mlであった。な
お、比較のために寒天培養法で求めた同一試料の生菌数
は 2.3 × 107個／mlであった。
0025％ツイーン２０添加ＰＢＳ緩衝液，ｐＨ 7.8）で４
分の１濃度に希釈して得たフクシン液２mlを、５ml容の
チューブに取り、これに金属加工油Ｂ（マイクロエマル
ジョン型） 50μl を添加して、好気性細菌を染色し
た。１〜２秒間かく拌した後、口径１３mm，孔径０．５
０μｍのポリテトラフルオロエチレン系フィルター（商
品名：ＤＩＳＭＩＣ−１３ＪＰ，アドバンテック東洋
製）を装着した５ml容の注射筒に入れて、加圧ろ過する
ことにより、前記ポリテトラフルオロエチレン系フィル
ターに好気性細菌を捕集した（図１参照）。次いで、注
射筒とフィルターを分離し、この注射筒に、洗浄液（上
記と同じもの） 2.5mlをとり、再度、注射筒とフィルタ
ーを装着し、洗浄液で洗浄，ろ過して、過剰の色素を除
去した。このようにして前記５ml容の注射筒に装着され
たフィルターに捕集された、微生物に着色した色素を、
溶剤としてエタノール１mlを用いて、ろ過して溶出させ
た。上記の如くして得られた溶出液のうち、 200μl を
96 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダー( コ
ロナ社製) を用いて、着色度を 492ｎｍの光学密度
（Ｏ．Ｄ．）により測定した。その結果、溶出液の光学
密度（Ｏ．Ｄ．）は、0.665 であり、検量線より求めた
好気性細菌の生菌数は 5.0× 107個／mlであった。な
お、比較のために寒天培養法で求めた同一試料の生菌数
は 2.3 × 107個／mlであった。
【００３４】実施例２〜５ 金属加工油の種類を変えたこと以外は、実施例１と同様
にして行ない、光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、図２の
検量線より好気性細菌の生菌数を求めた。結果を第１表
に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法での結果
も示す。
にして行ない、光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定し、図２の
検量線より好気性細菌の生菌数を求めた。結果を第１表
に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法での結果
も示す。
【００３５】
【表１】第１表 ＊金属加工油の種類 Ｃ，Ｅ：エマルジョン型 Ｄ：ソリュブル型 Ｆ：マイクロエマルジョン型
【００３６】実施例６ （１）色の対照表の作成 生菌数が既知の金属加工油Ａを、新しい油剤で希釈し、
生菌数がそれぞれ、１０7 個/ ml以上のもの、１０
6 個/ ml程度のもの、１０5 個/ ml程度のもの、１
０4 個/ ml以下のものの標準サンプルを作成し、これら
について、過剰の色素を洗浄液により洗浄，除去すると
ころまで実施例１と同様の操作を行なった。次いで、疎
水性フィルター上に存在する好気性細菌の着色度（着色
の強弱）を目視により観察した。その結果、次の通りで
あった。 標準サンプル 着色の程度 強い やや強い 弱い 極めて弱い、または無し さらに、これらのフィルタをカラー写真に撮り、色の対
照表とした。なお、標準サンプルの生菌数は寒天平板法
により確認した。
生菌数がそれぞれ、１０7 個/ ml以上のもの、１０
6 個/ ml程度のもの、１０5 個/ ml程度のもの、１
０4 個/ ml以下のものの標準サンプルを作成し、これら
について、過剰の色素を洗浄液により洗浄，除去すると
ころまで実施例１と同様の操作を行なった。次いで、疎
水性フィルター上に存在する好気性細菌の着色度（着色
の強弱）を目視により観察した。その結果、次の通りで
あった。 標準サンプル 着色の程度 強い やや強い 弱い 極めて弱い、または無し さらに、これらのフィルタをカラー写真に撮り、色の対
照表とした。なお、標準サンプルの生菌数は寒天平板法
により確認した。
【００３７】（２）生菌数の判定 実施例１〜５で用いた金属加工油Ｂ〜Ｆ，金属加工油Ｇ
（マイクロエマルジョン型），金属加工油Ｈ（ソリュブ
ル型）とについて、過剰の色素を洗浄液により洗浄，除
去するところまで、実施例１と同様の操作を行なった。
次いで、疎水性フィルター上に存在する好気性細菌の着
色度を目視により観察し、上記（１）で作成した色の対
照表と比較して目視による判定を行なった。結果を下記
の第２表に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法
での結果も併せて示す。
（マイクロエマルジョン型），金属加工油Ｈ（ソリュブ
ル型）とについて、過剰の色素を洗浄液により洗浄，除
去するところまで、実施例１と同様の操作を行なった。
次いで、疎水性フィルター上に存在する好気性細菌の着
色度を目視により観察し、上記（１）で作成した色の対
照表と比較して目視による判定を行なった。結果を下記
の第２表に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法
での結果も併せて示す。
【００３８】
【表２】第２表
【００３９】実施例７ 疎水性フィルターを、ポリテトラフルオロエチレン系の
ものからオレフィン系ポリマーのもの（商品名：クロマ
トディスク13ＡＩ，口径１３mm，孔径０．４５μｍ，ク
ラボウ製造）に変えたこと以外は、実施例１と同様の操
作を行なって、金属加工油Ｂ（マイクロエマルジョン
型）の生菌数を測定したところ、光学密度（Ｏ．Ｄ．）
は0.510 であり、検量線より求めた好気性細菌の生菌数
は、 3.0×107個／mlであった。なお、比較のために寒
天培養法で求めた同一試料の生菌数は 2.3 × 107個／
mlであった。
ものからオレフィン系ポリマーのもの（商品名：クロマ
トディスク13ＡＩ，口径１３mm，孔径０．４５μｍ，ク
ラボウ製造）に変えたこと以外は、実施例１と同様の操
作を行なって、金属加工油Ｂ（マイクロエマルジョン
型）の生菌数を測定したところ、光学密度（Ｏ．Ｄ．）
は0.510 であり、検量線より求めた好気性細菌の生菌数
は、 3.0×107個／mlであった。なお、比較のために寒
天培養法で求めた同一試料の生菌数は 2.3 × 107個／
mlであった。
【００４０】実施例８ 金属加工油Ｂ（マイクロエマルジョン型）100 μl を１
mlの水に希釈した後、そのうちの 0.5mlを、実施例１と
同様のフィルター（５ml容注射筒に装着されたポリテト
ラフルオロエチレン系フィルター）を用いて、加圧ろ過
して、該フィルター上に好気性細菌を捕集した。次い
で、実施例１で用いたと同様のフクシン液２mlを、前記
５ml容注射筒にとり、加圧ろ過して、好気性細菌を染色
した。次いで、実施例１で用いたと同じ洗浄液 2.5ml
を、前記５ml容注射筒にとり、洗浄，ろ過して、過剰の
色素を除去した。このようにして前記５ml容の注射筒に
装着されたフィルターに捕集された、微生物に着色した
色素を、溶剤としてエタノール１mlを用い、ろ過して、
溶出させた。上記の如くして得られた溶出液のうち 200
μl を 96 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダ
ー( コロナ社製) を用いて、着色度を 492ｎｍの光学密
度（Ｏ．Ｄ．）により測定した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）
は 0.546であり、検量線より求めた好気性細菌の生菌数
は 3.6×107 個／mlであった。なお、比較のために寒天
培養法で求めた同一試料の生菌数は 2.3×107 個／mlで
あった。
mlの水に希釈した後、そのうちの 0.5mlを、実施例１と
同様のフィルター（５ml容注射筒に装着されたポリテト
ラフルオロエチレン系フィルター）を用いて、加圧ろ過
して、該フィルター上に好気性細菌を捕集した。次い
で、実施例１で用いたと同様のフクシン液２mlを、前記
５ml容注射筒にとり、加圧ろ過して、好気性細菌を染色
した。次いで、実施例１で用いたと同じ洗浄液 2.5ml
を、前記５ml容注射筒にとり、洗浄，ろ過して、過剰の
色素を除去した。このようにして前記５ml容の注射筒に
装着されたフィルターに捕集された、微生物に着色した
色素を、溶剤としてエタノール１mlを用い、ろ過して、
溶出させた。上記の如くして得られた溶出液のうち 200
μl を 96 穴プレートにとり、マイクロプレートリーダ
ー( コロナ社製) を用いて、着色度を 492ｎｍの光学密
度（Ｏ．Ｄ．）により測定した。光学密度（Ｏ．Ｄ．）
は 0.546であり、検量線より求めた好気性細菌の生菌数
は 3.6×107 個／mlであった。なお、比較のために寒天
培養法で求めた同一試料の生菌数は 2.3×107 個／mlで
あった。
【００４１】実施例９ 川水，池水，金魚を飼育している水槽の水及び活性汚泥
処理装置に入る生活廃水の各々１５０μl を試料とした
こと以外は、過剰の色素を洗浄液により洗浄、除去する
ところまで、実施例１と同様な操作を行なった。次い
で、疎水性フィルター上に存在する好気性細菌の着色度
を目視により観察し、実施例６（１）で作成した色の対
照表と比較して、目視による判定を行なった。結果を第
３表に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法での
結果も併せて示す。
処理装置に入る生活廃水の各々１５０μl を試料とした
こと以外は、過剰の色素を洗浄液により洗浄、除去する
ところまで、実施例１と同様な操作を行なった。次い
で、疎水性フィルター上に存在する好気性細菌の着色度
を目視により観察し、実施例６（１）で作成した色の対
照表と比較して、目視による判定を行なった。結果を第
３表に示す。なお、比較のために求めた寒天平板法での
結果も併せて示す。
【００４２】
【表３】第３表
【００４３】実施例１０ 試料として、第４表に示した各排泄尿試料３００μｌを
使用したこと以外は、過剰の色素を洗浄液により洗浄、
除去するところまで、実施例１と同様な操作を行なっ
た。次いで、疎水性フィルター上に存在する細菌の着色
度を目視により観察し、実施例６（１）で作成した色の
対照表と比較して、細菌数を目視により判定した。結果
を第４表に示す。なお、比較のため寒天平板法（本実施
例では日水製薬製造の標準寒天培地を使用）で測定した
結果も併せて示す。
使用したこと以外は、過剰の色素を洗浄液により洗浄、
除去するところまで、実施例１と同様な操作を行なっ
た。次いで、疎水性フィルター上に存在する細菌の着色
度を目視により観察し、実施例６（１）で作成した色の
対照表と比較して、細菌数を目視により判定した。結果
を第４表に示す。なお、比較のため寒天平板法（本実施
例では日水製薬製造の標準寒天培地を使用）で測定した
結果も併せて示す。
【００４４】
【表４】第４表
【００４５】
【発明の作用・効果】本発明の方法においては、特に疎
水性フィルターを用いているため、過剰の染料の洗浄に
際し、従来の如く、フィルター上に過剰の染料が強固に
付着して、除去することが困難であるというおそれがな
い。このため、過剰の色素の除去に真空ポンプや吸引設
備等を必要とすることがなく、しかも洗浄操作も簡単で
済む。
水性フィルターを用いているため、過剰の染料の洗浄に
際し、従来の如く、フィルター上に過剰の染料が強固に
付着して、除去することが困難であるというおそれがな
い。このため、過剰の色素の除去に真空ポンプや吸引設
備等を必要とすることがなく、しかも洗浄操作も簡単で
済む。
【００４６】したがって、本発明の方法によれば、迅
速、かつ簡便に、しかも特別な機器を必要とすることな
く、試料中の微生物の生菌数を測定することができる。
本発明の方法によれば、通常、１０分以内に測定可能で
ある。また、本発明の方法においては、黴，酵母，細菌
等の全ての微生物に適用可能である。
速、かつ簡便に、しかも特別な機器を必要とすることな
く、試料中の微生物の生菌数を測定することができる。
本発明の方法によれば、通常、１０分以内に測定可能で
ある。また、本発明の方法においては、黴，酵母，細菌
等の全ての微生物に適用可能である。
【００４７】さらに、本発明の測定キットは、極めて簡
単かつ安価なものであって、特別な機器を必要としない
ので、どのような現場においても使用することができる
という利点がある。
単かつ安価なものであって、特別な機器を必要としない
ので、どのような現場においても使用することができる
という利点がある。
【００４８】したがって、本発明は、試料、特に水溶性
金属加工油中に増殖する微生物の生菌数の測定に極めて
有効であり、金属加工分野，腐敗が問題となる塗料分
野，食品分野，尿中の細菌が問題となる診断分野等にお
いて有効に利用することができる。
金属加工油中に増殖する微生物の生菌数の測定に極めて
有効であり、金属加工分野，腐敗が問題となる塗料分
野，食品分野，尿中の細菌が問題となる診断分野等にお
いて有効に利用することができる。
【図１】注射筒と疎水性フィルター装着した図である。
【図２】本発明の実施例で用いた検量線である。
符号１は注射筒、符号２は試料、符号３は疎水性フィル
ターである。
ターである。
フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4336337（ＵＳ，Ａ) Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，14 （３）， Ｐ．342−346，1981 Ｃａｎ Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，29 （10）， Ｐ．1247−1252，1983 Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ，36（１）， Ｐ．76−80，1978 Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ，７（２）， Ｐ．87−102，1988
Claims (5)
- 【請求項１】 試料中の微生物生菌数を測定するにあた
り、微生物を染色した後に疎水性フィルターに捕集する
か、或いは疎水性フィルターに捕集した後に微生物を染
色し、次いで過剰の色素を洗浄により除去し、微生物の
着色度から試料中の微生物生菌数を測定することを特徴
とする微生物生菌数の迅速測定方法。 - 【請求項２】 微生物に着色した色素を、有機溶剤で溶
出し、溶出液の着色度を光学密度測定により比色定量す
る請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 試料が水溶性金属加工油である請求項１
記載の方法。 - 【請求項４】 疎水性フィルター，該フィルターを装着
しうる注射筒，色素液，洗浄液および色対照表よりなる
微生物生菌数の測定キット。 - 【請求項５】 色素液および／または洗浄液が、界面活
性剤を含有するものである請求項４記載の測定キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3027636A JPH0728758B2 (ja) | 1990-07-11 | 1991-01-30 | 微生物生菌数の迅速測定方法および測定キット |
| EP91110913A EP0465987B1 (en) | 1990-07-11 | 1991-07-02 | Method for rapid measurement of living microorganisms and measuring kit |
| DE69118255T DE69118255T2 (de) | 1990-07-11 | 1991-07-02 | Verfahren zur schnellen Messung lebendiger Mikroorganismen und Satz zur Messung |
| US08/162,790 US5403720A (en) | 1990-07-11 | 1993-12-06 | Method for rapid measurement of living microorganisms and measuring kit |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-181667 | 1990-07-11 | ||
| JP18166790 | 1990-07-11 | ||
| JP3027636A JPH0728758B2 (ja) | 1990-07-11 | 1991-01-30 | 微生物生菌数の迅速測定方法および測定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04218392A JPH04218392A (ja) | 1992-08-07 |
| JPH0728758B2 true JPH0728758B2 (ja) | 1995-04-05 |
Family
ID=26365594
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3027636A Expired - Lifetime JPH0728758B2 (ja) | 1990-07-11 | 1991-01-30 | 微生物生菌数の迅速測定方法および測定キット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5403720A (ja) |
| EP (1) | EP0465987B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0728758B2 (ja) |
| DE (1) | DE69118255T2 (ja) |
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| FR2719602B1 (fr) * | 1994-05-05 | 1996-07-26 | Biocom Sa | Procédé et installation pour la numérisation de cellules et micro-organismes, notamment des produits alimentaires ou des fluides biologiques. |
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| US6090572A (en) * | 1998-06-26 | 2000-07-18 | Biostar, Incorporated | Filtration and extraction device and method of using the same |
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| US8105849B2 (en) | 2004-02-27 | 2012-01-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing sensor elements |
| US8377398B2 (en) | 2005-05-31 | 2013-02-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions related to determination and use of white blood cell counts |
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- 1991-07-02 DE DE69118255T patent/DE69118255T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-02 EP EP91110913A patent/EP0465987B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-06 US US08/162,790 patent/US5403720A/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4336337A (en) | 1978-09-25 | 1982-06-22 | Baylor College Of Medicine | Detection of bacteria |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，３６（１），Ｐ．７６−８０，１９７８ |
| ＣａｎＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２９（１０），Ｐ．１２４７−１２５２，１９８３ |
| ＩｎｔＪＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，７（２），Ｐ．８７−１０２，１９８８ |
| ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１４（３），Ｐ．３４２−３４６，１９８１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| EP0465987B1 (en) | 1996-03-27 |
| US5403720A (en) | 1995-04-04 |
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