JP5711278B2 - 微生物検出装置、検出方法、及びそれに用いられる試料容器 - Google Patents
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Description
法がある(特許文献1)。
[実施例1]
(微生物の検出装置と方法)
図1は、本発明による微生物検出装置の一例の一部断面摸式図である。微生物検出装置は、二層構造メンブレンフィルター101を底部に備える容器102と、試薬供給部103、試薬供給用配管104、吸引部105、洗浄液供給部106、洗浄液供給用配管107、加熱部108、アーム109、分注部110、分注用配管111、検出部112、反応容器113、入力・制御部114を有する。入力・制御部114は装置各部の動作を統括制御する。容器102は装置に対して着脱自在である。また、反応容器113には発光試薬115が入っている。
(微生物検出実験1:大腸菌)
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による大腸菌の検出感度を比較した。
(微生物検出実験2:芽胞状態枯草菌)
本発明による二層構造メンブレンフィルターを備える容器と、従来の親水性メンブレンフィルターを備える容器による芽胞状態枯草菌の検出感度を比較した。
以上のように、本発明の微生物検出装置は、枯草菌を高感度、高精度、迅速、簡便に計測できた。
[実験例1]
(水溶液の保持と陰圧で水溶液のろ過が可能な疎水性メンブレンフィルターの調査)
水溶液を保持でき、かつ陰圧でろ過が可能な、疎水性メンブレンフィルターの有無を調べた。
(二層構造メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力の測定実験)
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルターの微生物溶解液保持能力を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを底部に備えた容器を用意した。
この結果から、二層構造メンブレンフィルターは、微生物溶解液をその上に保持できることがわかった。
(メンブレンフィルター内のATP溶離実験)
二層構造メンブレンフィルターと単層親水性メンブレンフィルター内のATP分子の溶離量を比較するため、二種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。1つは、底部に二層構造メンブレンフィルター101を備える容器102である(図15(a))。二層構造メンブレンフィルター101は上層の第一層が親水性メンブレンフィルター116、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルター117で構成される。第一層親水性メンブレンフィルター116には、孔径0.45μm、厚さ150μm、空隙率79%のMF−ミリポアメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルター117には孔径10μmのマイテックスメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。
(湿潤剤を用いた場合の微生物計測実験)
二層構造メンブレンフィルターと、湿潤剤を染みこませることで水溶液がろ過できる疎水性メンブレンフィルターを用いた時の微生物検出感度を比較するため、四種類のメンブレンフィルターを備える容器を用意した。
二層構造メンブレンフィルターは上層の第一層が親水性メンブレンフィルター、下層の第二層が疎水性メンブレンフィルターで構成される。第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径0.45μm、厚さ150μm、空隙率79%のMF−ミリポアメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。第二層疎水性メンブレンフィルターには孔径10μmのマイテックスメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。
単層親水性メンブレンフィルターには、孔径0.45μm、厚さ150μm、空隙率79%のMF−ミリポアメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。
二枚重ねのメンブレンフィルターの第一層親水性メンブレンフィルターには、孔径0.45μm、厚さ150μm、空隙率79%のMF−ミリポアメンブレンフィルター(日本
ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。第二層の疎水性メンブレンフィルターとして、孔径0.45μmの疎水性デュラポアメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。
単層の疎水性メンブレンフィルターとして孔径0.45μmの疎水性デュラポアメンブレンフィルター(日本ミリポア)を使用し、直径を0.5cmに加工した。
102 容器
103 試薬供給部
105 吸引部
106 洗浄液供給部
108 加熱部
109 アーム
110 分注部
112 検出部
113 反応容器
114 入力・制御部
115 発光試薬
116 親水性メンブレンフィルター
117 疎水性メンブレンフィルター
118 廃液部
301 試薬
302 試薬槽
601 励起光照射部
701 大腸菌
702 大腸菌懸濁液
703 微生物溶解液
704 大腸菌由来ATP分子
801 容器の底部
802 環状の蓋
803 ネジ
901 容器のネジ様溝を持つ底部
902 ネジ様溝を持つ環状の蓋
1001 単層親水性メンブレンフィルター
1002 容器
1003 染み落ちた微生物溶解液
1004 染み落ちた大腸菌由来ATP分子
1101 吸引口
1501 ATP分子
1601 染み落ちたATP分子
Claims (16)
- 上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターと、
前記二層構造のメンブレンフィルターの周縁部を固定して底部に保持する容器と、
を備え、
前記上層の親水性メンブレンフィルターの孔径が前記下層の疎水性メンブレンフィルターの孔径よりも小さく形成されており、かつ、前記親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉する機能を有し、前記疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する機能を有する
ことを特徴とする微生物検出処理用試料容器。 - 請求項1記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、多孔性で孔径が0.8μm〜80μmのメンブレンフィルター、もしくはメッシュ構造でピッチサイズが1μm〜59μmであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
- 請求項1又は2記載の微生物検出処理用試料容器において、前記疎水性メンブレンフィルターは、厚みが7μm〜800μmのメンブレンフィルターであることを特徴とする微生物検出処理用試料容器。
- 上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備え、前記上層の親水性メンブレンフィルターの孔径が前記下層の疎水性メンブレンフィルターの孔径よりも小さく形成されており、かつ、前記親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉する機能を有し、前記疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する機能を有する試料容器と、
前記二層構造メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせる吸引部と、
微生物外生体物質除去試薬と微生物溶解液を個別に前記試料容器に添加する試薬供給部と、
試料の発光を検出する検出部と、
装置各部の制御を行う制御部とを有し、
前記微生物外生体物質除去試薬は、ATP分解酵素、DNA分解酵素又はRNA分解酵素であり、
前記制御部は、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器中の試料に微生物外生体物質除去試薬を添加したのち前記吸引部を作動させて前記試料容器中の溶液を前記二層構造メンブレンフィルターでろ過し、その後、前記試薬供給部を作動させて前記試料容器に前記微生物溶解液を添加する制御を行うことを特徴とする微生物検出装置。 - 請求項4記載の微生物検出装置において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が0.05μm〜0.65μmであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が0.8μm〜80μmであることを特徴とする微生物検出装置。
- 請求項4記載の微生物検出装置において、前記制御部は、前記吸引部を制御して陰圧と常圧を切り替えることにより、前記疎水性メンブレンフィルターによる溶液の通過・非通過を切り替え制御することを特徴とする微生物検出装置。
- 請求項4〜6のいずれか1項記載の微生物検出装置において、前記試薬供給部は前記試料容器に発光試薬を添加し、前記検出部は、前記発光試薬が添加された試料容器中の溶液から発生する発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
- 請求項4〜6のいずれか1項記載の微生物検出装置において、分注部を備え、前記検出部は、前記分注部によって反応容器に分注された前記微生物溶解液が添加された試料溶液と発光試薬との反応によって生じる発光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
- 請求項4〜6のいずれか1項記載の微生物検出装置において、励起光照射部を備え、前記検出部は、前記励起光照射部からの励起光照射によって試料から発生される蛍光を検出することを特徴とする微生物検出装置。
- 上層の親水性メンブレンフィルターと下層の疎水性メンブレンフィルターを重ねた二層構造のメンブレンフィルターを底部に備え、前記上層の親水性メンブレンフィルターの孔径が前記下層の疎水性メンブレンフィルターの孔径よりも小さく形成されており、かつ、前記親水性メンブレンフィルターは微生物を捕捉する機能を有し、前記疎水性メンブレンフィルターは試薬を保持する機能を有する試料容器に微生物を含む試料を添加する工程と、
微生物外生体物質除去試薬を添加する工程と、
前記二層メンブレンフィルター下に陰圧を生じさせ、前記試料容器内の溶液をろ過する工程と、
前記微生物を溶解する試薬を添加し前記微生物から生体物質を抽出する工程と、
を有し、
前記微生物外生体物質除去試薬は、ATP分解酵素、DNA分解酵素又はRNA分解酵素であることを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項10記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質と発光試薬とを反応させる工程と、
前記反応で生じた発光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項10記載の微生物検出方法において、更に、
前記生体物質に励起光を照射する工程と、
前記励起光照射によって生じた蛍光を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。 - 請求項10〜12のいずれか1項記載の微生物検出方法において、前記微生物を溶解する試薬は前記疎水性メンブレンフィルターを湿潤しない試薬であることを特徴とする微生物検出方法。
- 請求項10〜13のいずれか1項記載の微生物検出方法において、前記親水性メンブレンフィルターは孔径が0.05μm〜0.65μmであり、前記疎水性メンブレンフィルターは孔径が0.8μm〜80μmであることを特徴とする微生物検出方法。
- 請求項10〜14のいずれか1項記載の微生物検出方法において、試料の粘性が高いとき、前記微生物外生体物質除去試薬を添加に先だって試料の加熱及び/又は洗浄液を供給する工程を有することを特徴とする微生物検出方法。
- 請求項10〜15のいずれか1項記載の微生物検出方法において、測定対象微生物が非栄養型細胞を形成しているとき、前記ろ過の後、栄養型細胞変換試薬を添加する工程を有し、前記栄養型細胞変換試薬がグルコースとアラニンを含む試薬であることを特徴とする微生物検出方法。
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