JP5767618B2 - 微生物定量装置及び微生物定量方法 - Google Patents
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Description
本発明は、液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として微生物の定量を行う微生物定量装置及び微生物定量方法に関する。
従来、検体に含まれる微生物の定量方法（計数方法）としては、微生物から抽出したＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を定量することで微生物を間接的に計数するＡＴＰ法が知られている。
特許文献１には、濾過膜を用いるＡＴＰ・バイオルミネッセンス法による微生物数の検出法において、微生物以外のノイズ発光点を完全に除去して１個の微生物の有無を確実に判定する発明が記載されている。
このＡＴＰ法では、捕集した微生物にＡＴＰ抽出試薬を接触させることで微生物に内在するＡＴＰを抽出し、このＡＴＰに発光試薬を反応させた際の発光強度に応じて微生物を計数する。このＡＴＰ法によれば、例えば平板培地で培養した微生物のコロニ数によって微生物の計数を行う培養法では数日間を要するところ、微生物を捕集してからその計数までの時間を１時間ないし数時間程度に飛躍的に短縮することができる。
このＡＴＰ法では、捕集した微生物にＡＴＰ抽出試薬を接触させることで微生物に内在するＡＴＰを抽出し、このＡＴＰに発光試薬を反応させた際の発光強度に応じて微生物を計数する。このＡＴＰ法によれば、例えば平板培地で培養した微生物のコロニ数によって微生物の計数を行う培養法では数日間を要するところ、微生物を捕集してからその計数までの時間を１時間ないし数時間程度に飛躍的に短縮することができる。
また、特許文献２には、多量の液状検体を迅速かつ簡便に定量分析することができる微生物定量方法が記載されている。この微生物定量方法は、微生物を含む液状検体をフィルタで濾過し、フィルタ上に濾別された微生物のＡＴＰを抽出するように構成されている。
しかしながら、ＡＴＰ法に準拠した従来の微生物定量方法のうち、液状検体中の微生物をフィルタ上で濾別するものは微生物の測定感度が不十分である問題があった。
そこで、本発明の課題は、液状検体中の微生物をその生体物質を指標として定量するものであって、従来よりも微生物の測定感度に優れた微生物定量装置及び微生物定量方法を提供することにある。
前記課題を解決する微生物定量装置は、液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過する濾過機構と、前記フィルタ上の前記微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する定量機構と、前記フィルタ上における前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止機構と、を備え、前記濾過機構は、前記フィルタを内部に有する回収容器と、該回収容器の前記液状試料を吸引する吸引ポンプと、を備え、前記乾燥防止機構は、前記フィルタ上の液量を検出して液量検出信号を出力する液量検出部と、前記フィルタ上に補液を行う補液機構と、前記液量検出信号に基づいて前記液量が所定量以下になったと判断した場合に前記フィルタ上に補液が行われるように前記補液機構を起動させる制御部と、を備えることを特徴とする。
また、前記課題を解決する微生物定量方法は、液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する微生物定量方法において、前記フィルタ上での前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止工程を有し、前記濾過は、前記フィルタを内部に有する回収容器内の前記液状試料を吸引ポンプで吸引することで行い、前記乾燥防止工程は、濾過された前記微生物が前記フィルタ上で空気接触した後直ちに前記フィルタ上に補液を行うことによって、前記微生物の乾燥を防止することを特徴とする。
また、前記課題を解決する微生物定量方法は、液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する微生物定量方法において、前記フィルタ上での前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止工程を有し、前記濾過は、前記フィルタを内部に有する回収容器内の前記液状試料を吸引ポンプで吸引することで行い、前記乾燥防止工程は、前記フィルタ上での所定の液位を維持することによって、前記微生物の乾燥を防止する微生物定量方法であって、前記フィルタ上での所定の液位は、前記フィルタで濾過を行いながら、前記フィルタ上に補液を行うことによって維持されることを特徴とする。
また、前記課題を解決する微生物定量方法は、液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する微生物定量方法において、前記フィルタ上での前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止工程を有し、前記濾過は、前記フィルタを内部に有する回収容器内の前記液状試料を吸引ポンプで吸引することで行い、前記乾燥防止工程は、前記フィルタ上での所定の液位を維持することによって、前記微生物の乾燥を防止する微生物定量方法であって、前記フィルタ上での所定の液位は、前記フィルタで濾過を行いながら、前記フィルタ上に補液を行うことによって維持されることを特徴とする。
本発明によれば、液状検体中の微生物をその生体物質を指標として定量するものであって、従来よりも微生物の測定感度に優れた微生物定量装置及び微生物定量方法を提供することができる。
次に、本発明の実施形態について適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
本発明の微生物定量装置及び微生物定量方法は、定量の指標となる生体物質としてのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を抽出する対象となる微生物の乾燥を防止することを主な特徴とする。なお、「微生物の乾燥」の定義については後に詳しく説明する。
以下では、本発明の実施形態に係る微生物定量装置の全体構成について説明した後に、この微生物定量装置の動作、及びこの微生物定量装置を使用した微生物の定量原理について説明しながら本発明の微生物定量方法について説明する。
本発明の微生物定量装置及び微生物定量方法は、定量の指標となる生体物質としてのＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を抽出する対象となる微生物の乾燥を防止することを主な特徴とする。なお、「微生物の乾燥」の定義については後に詳しく説明する。
以下では、本発明の実施形態に係る微生物定量装置の全体構成について説明した後に、この微生物定量装置の動作、及びこの微生物定量装置を使用した微生物の定量原理について説明しながら本発明の微生物定量方法について説明する。
＜微生物定量装置の全体構成＞
図１に示すように、微生物定量装置１は、液状試料８ａに含まれる微生物をフィルタ２６で濾過する濾過機構２と、フィルタ２６上に得られる微生物のＡＴＰ（生体物質）を指標として微生物の定量を行う定量機構３と、フィルタ２６上の微生物の乾燥を防止する乾燥防止機構４と、を備えて構成されている。
図１に示すように、微生物定量装置１は、液状試料８ａに含まれる微生物をフィルタ２６で濾過する濾過機構２と、フィルタ２６上に得られる微生物のＡＴＰ（生体物質）を指標として微生物の定量を行う定量機構３と、フィルタ２６上の微生物の乾燥を防止する乾燥防止機構４と、を備えて構成されている。
（濾過機構）
図１に示すように、濾過機構２は、フィルタ２６を内部に有する回収容器２１と、吸引ヘッド２３と、吸引ヘッド２３を上下移動させる昇降機構２２と、吸引ヘッド２３を介して回収容器２１の内容物を真空引きする吸引ポンプ２４と、を備えている。
図１に示すように、濾過機構２は、フィルタ２６を内部に有する回収容器２１と、吸引ヘッド２３と、吸引ヘッド２３を上下移動させる昇降機構２２と、吸引ヘッド２３を介して回収容器２１の内容物を真空引きする吸引ポンプ２４と、を備えている。
回収容器２１は、これに投入される液状試料８ａに含まれる微生物を分離すると共に、この分離した微生物のＡＴＰを抽出して回収するものである。この液状試料８ａからの微生物の分離・ＡＴＰの抽出工程については後に詳しく説明する。
この回収容器２１は、ロート状に形成された本体２５の底部にフィルタ２６が設けられて構成されている。本実施形態でのフィルタ２６は、後記するように、親水性フィルタ２６ａ（図３（ｂ−１）参照）と、疎水性フィルタ２６ｂ（図３（ｂ−１）参照）の二枚重ねになっており、図１には図示しないが、二枚重ねの上側に親水性フィルタ２６ａが配置され、二枚重ねの下側に疎水性フィルタ２６ｂが配置されている。
このように構成されたフィルタ２６は、次に説明する吸引ヘッド２３を介して吸引しない限りは、本体２５に投入された液状試料８ａをフィルタ２６上に保持するようになっている。また、吸引ヘッド２３で吸引すると、フィルタ２６は、液状試料８ａのうち微生物（図示省略）をフィルタ２６上に残して、その液状成分を、フィルタ２６を介して吸引ヘッド２３側に排出できるようになっている。
ちなみに、回収容器２１は、微生物定量装置１内に設けられる処理ステージ５の所定の位置に着脱自在に取り付けられることとなる。
ちなみに、回収容器２１は、微生物定量装置１内に設けられる処理ステージ５の所定の位置に着脱自在に取り付けられることとなる。
吸引ヘッド２３は、前記したように、昇降機構２２によって上下移動可能になっており、回収容器２１の内容物をフィルタ２６で濾過する場合には、昇降機構２２が吸引ヘッド２３を上昇させて吸引ヘッド２３と回収容器２１とを連結させることとなる。また、回収容器２１を処理ステージ５に取り付け、又は処理ステージ５から取り外す際には、昇降機構２２は、吸引ヘッド２３を下降させて吸引ヘッド２３と回収容器２１との連結を解くこととなる。
そして、このような吸引ヘッド２３から延出する配管Ｐ１の途中に設けられた前記吸引ポンプ２４が起動することで、前記したように、回収容器２１内の液状成分は、フィルタ２６、吸引ヘッド２３、及び吸引ポンプ２４を介して微生物定量装置１の図示しない廃液貯留槽内に排出されることとなる。
そして、このような吸引ヘッド２３から延出する配管Ｐ１の途中に設けられた前記吸引ポンプ２４が起動することで、前記したように、回収容器２１内の液状成分は、フィルタ２６、吸引ヘッド２３、及び吸引ポンプ２４を介して微生物定量装置１の図示しない廃液貯留槽内に排出されることとなる。
（定量機構）
図１に示すように、定量機構３は、液分注装置３１と、発光強度測定ユニット３２と、この発光強度測定ユニット３２から出力されるＡＴＰ発光強度の検出信号に基づいて微生物を定量する制御部３４の演算部３４ｆと、を主に備えて構成されている。
図１に示すように、定量機構３は、液分注装置３１と、発光強度測定ユニット３２と、この発光強度測定ユニット３２から出力されるＡＴＰ発光強度の検出信号に基づいて微生物を定量する制御部３４の演算部３４ｆと、を主に備えて構成されている。
液分注装置３１は、液分注ノズル３１ａと、この液分注ノズル３１ａに所定量の液体を吸引させ、又は排出させる分注ポンプ３１ｂと、微生物定量装置１の筐体７内で液分注ノズル３１ａを三次元的に移動させるアクチュエータ３１ｃと、制御部３４の第２流量制御部３４ｂと、を備えている。
この液分注装置３１によれば、その液分注ノズル３１ａが、後記する工程によって回収容器２１内に得られるＡＴＰ抽出液の所定量を次に説明する発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注し、そして試薬ホルダ６のＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注することとなる。
なお、液分注装置３１のアクチュエータ３１ｃによる液分注ノズル３１ａの三次元的な移動は、制御部３４のアクチュエータ制御部３４ｇによるアクチュエータ３１ｃの所定の制御によって実現されることとなる。また、ＡＴＰ抽出液、ＡＴＰ発光試薬８ｂ等の分注量の調節は、第２流量制御部３４ｂによる分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって実現されることとなる。
この液分注装置３１によれば、その液分注ノズル３１ａが、後記する工程によって回収容器２１内に得られるＡＴＰ抽出液の所定量を次に説明する発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注し、そして試薬ホルダ６のＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注することとなる。
なお、液分注装置３１のアクチュエータ３１ｃによる液分注ノズル３１ａの三次元的な移動は、制御部３４のアクチュエータ制御部３４ｇによるアクチュエータ３１ｃの所定の制御によって実現されることとなる。また、ＡＴＰ抽出液、ＡＴＰ発光試薬８ｂ等の分注量の調節は、第２流量制御部３４ｂによる分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって実現されることとなる。
発光強度測定ユニット３２は、分注されたＡＴＰ抽出液とＡＴＰ発光試薬８ｂとを受け入れて発光反応させる発光用チューブ３２ｂと、この発光反応時のＡＴＰ発光強度を検出する光電子増倍管等を有する光検出部本体３２ａとを備えている。
そして、光検出部本体３２ａは、前記したように、ＡＴＰ発光強度の検出信号を制御部３４の演算部３４ｆに出力することとなる。
そして、光検出部本体３２ａは、前記したように、ＡＴＰ発光強度の検出信号を制御部３４の演算部３４ｆに出力することとなる。
演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａから出力されるＡＴＰ発光強度の検出信号に基づいて、回収容器２１に投入された液状試料８ａに含まれる微生物を定量するように構成されている。この演算部３４ｆの微生物の定量手順については、後に詳しく説明する。
（乾燥防止機構）
図1に示すように、本実施形態での乾燥防止機構４は、回収容器２１内にバッファ液８ｃを注入するバッファ液注入装置４１と、前記の濾過機構２の構成要素でもある吸引ポンプ２４と、回収容器２１内の液量を検出し、その液量検出信号を出力する液面計４２と、この液量検出信号に基づいて回収容器２１内の液量が所定量以下になったと判断したときに、駆動している吸引ポンプ２４を停止し、若しくはバッファ液注入装置４１を起動し、又は吸引ポンプ２４の停止及びバッファ液注入装置４１の起動を行うように制御する制御部３４の液量検出信号入力部３４ｃ、吸引ポンプ制御部３４ｄ、及び第１流量制御部３４ａと、を備えて構成されている。
なお、バッファ液８ｃは、特許請求の範囲にいう「補液」に相当し、バッファ液注入装置４１は、特許請求の範囲にいう「補液機構」に相当する。
図1に示すように、本実施形態での乾燥防止機構４は、回収容器２１内にバッファ液８ｃを注入するバッファ液注入装置４１と、前記の濾過機構２の構成要素でもある吸引ポンプ２４と、回収容器２１内の液量を検出し、その液量検出信号を出力する液面計４２と、この液量検出信号に基づいて回収容器２１内の液量が所定量以下になったと判断したときに、駆動している吸引ポンプ２４を停止し、若しくはバッファ液注入装置４１を起動し、又は吸引ポンプ２４の停止及びバッファ液注入装置４１の起動を行うように制御する制御部３４の液量検出信号入力部３４ｃ、吸引ポンプ制御部３４ｄ、及び第１流量制御部３４ａと、を備えて構成されている。
なお、バッファ液８ｃは、特許請求の範囲にいう「補液」に相当し、バッファ液注入装置４１は、特許請求の範囲にいう「補液機構」に相当する。
このような乾燥防止機構４は、前記したように、フィルタ２６上における微生物の乾燥を防止するものである。そして、本実施形態での「微生物の乾燥」とは、微生物の通常の活性を阻害する程度の乾燥を意味する。したがって、微生物の細胞の表面を覆う水膜が、単に大気中に蒸発する状態はここでの乾燥を意味しない。ちなみに、微生物が乾燥すると、生物活性の低下によるＡＴＰの再合成がされにくくなる等の理由が考えられＡＴＰの抽出量が減少する。
バッファ液注入装置４１は、図１に示すように、バッファ液貯留槽４３と、バッファ液貯留槽４３から延出してその先端が回収容器２１の上方に位置する配管Ｐ２と、この配管Ｐ２の途中に設けられる送液ポンプ４４と、備えている。
本実施形態での液面計４２は、この液面計４２から回収容器２１の内容物の液面までの距離を検出することで、間接的に回収容器２１の内容物の液量を検出するように構成されている。なお、この液面計４２は、特許請求の範囲にいう「液量検出部」に相当する。この液面計４２としては、特に制限はないがレーザー光等を使用した光学式のものを好適に使用することができる。
制御部３４の液量検出信号入力部３４ｃは、インターフェース、Ａ／Ｄ変換部等で構成され、液面計４２からの液量検出信号を入力するようになっている。そして、吸引ポンプ制御部３４ｄ及び第１流量制御部３４ａでは、それらの有する中央演算処理部（図示省略）、記憶部（図示省略）等が液量検出信号入力部３４ｃを介して入力する液量検出信号に基づいて協働することで、前記のように、駆動する吸引ポンプ２４の停止やバッファ液注入装置４１（送液ポンプ４４）の起動を実行するようになっている。なお、吸引ポンプ制御部３４ｄ及び第１流量制御部３４ａにおける中央演算処理部（図示省略）、記憶部（図示省略）等は、互いに共通するものを使用してもよいし、吸引ポンプ制御部３４ｄ及び第１流量制御部３４ａのそれぞれが、中央演算処理部（図示省略）、記憶部（図示省略）等を独立して有するものであってもよい。
＜微生物定量装置の動作及び微生物の定量原理＞
次に、微生物定量装置１の動作及び微生物の定量原理について説明しながら本発明の微生物定量方法について説明する。ここでは図１及び図２を参照しながら説明する。図２は、本発明の実施形態における微生物定量方法の概略を示すフローチャートである。
次に、微生物定量装置１の動作及び微生物の定量原理について説明しながら本発明の微生物定量方法について説明する。ここでは図１及び図２を参照しながら説明する。図２は、本発明の実施形態における微生物定量方法の概略を示すフローチャートである。
図１に示す微生物定量装置１では、回収容器２１が処理ステージ５に配置され、次いでこの回収容器２１に検査対象となる液状試料８ａが注入された後、図示しない起動スイッチがオンにされることで制御部３４が次の手順を実行する。
制御部３４の昇降機構制御部３４ｅは、吸引ヘッド２３を上昇させて回収容器２１と連結させるように昇降機構２２に指令を出力する。
次に、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄは、吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物（液状試料８ａ）の濾過を開始する（図２のステップＳ１）。このステップＳ１の濾過の工程によって、フィルタ２６上に微生物が回収されると共に、液状試料８ａ中の液体成分は、吸引ヘッド２３側に排出される。この際、液状試料８ａの液体成分に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰの大部分、及び後のＡＴＰの発光反応を阻害する物質もこの液体成分と共に排出される。
次に、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄは、吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物（液状試料８ａ）の濾過を開始する（図２のステップＳ１）。このステップＳ１の濾過の工程によって、フィルタ２６上に微生物が回収されると共に、液状試料８ａ中の液体成分は、吸引ヘッド２３側に排出される。この際、液状試料８ａの液体成分に含まれる微生物の細胞外に存在するＡＴＰの大部分、及び後のＡＴＰの発光反応を阻害する物質もこの液体成分と共に排出される。
次に、回収容器２１の内容物の濾過が完了した後、直ちに回収容器２１内にバッファ液８ｃが注入される（図２のステップＳ２）。ここで「濾過後、直ちに」とは、回収容器２１の液体成分がフィルタ２６を介して流下し切った後、バッファ液８ｃを注入するまでの時間が短ければ短いほどよく、できれば５秒以内が望ましい。
このステップＳ２の工程によって、フィルタ２６上に回収された微生物の乾燥が防止されることとなる。このステップＳ２の工程は、特許請求の範囲にいう「乾燥防止工程」に相当する。
このステップＳ２の工程によって、フィルタ２６上に回収された微生物の乾燥が防止されることとなる。このステップＳ２の工程は、特許請求の範囲にいう「乾燥防止工程」に相当する。
次に、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄは、吸引ポンプ２４を起動することで、吸引ヘッド２３は、回収容器２１の内容物の濾過を再び開始する（図２のステップＳ３）。そして、制御部３４の吸引ポンプ制御部３４ｄは、液面計４２からの液量検出信号に基づいて、回収容器２１内の液量が所定量以下になったときに濾過を停止する（図２のステップＳ３）。
このステップＳ３の工程によっても、フィルタ２６上の微生物の乾燥が防止されることとなる。このステップＳ３の工程も、特許請求の範囲にいう「乾燥防止工程」に相当する。
このステップＳ３の工程によっても、フィルタ２６上の微生物の乾燥が防止されることとなる。このステップＳ３の工程も、特許請求の範囲にいう「乾燥防止工程」に相当する。
次のステップＳ４では、回収容器２１内にＡＴＰ消去試薬が分注される（図２のステップＳ４参照）。ちなみに、ＡＴＰ消去試薬は、試薬ホルダ６に配置されており、前記の液分注装置３１の液分注ノズル３１ａによって、試薬ホルダ６から回収容器２１に分注されることとなる。
このＡＴＰ消去試薬の分注によって、微生物の細胞外に存在するＡＴＰは、より確実に消去されることとなる。
このＡＴＰ消去試薬としては、ＡＴＰ分解酵素が挙げられる。
このＡＴＰ消去試薬の分注によって、微生物の細胞外に存在するＡＴＰは、より確実に消去されることとなる。
このＡＴＰ消去試薬としては、ＡＴＰ分解酵素が挙げられる。
また、この液分注装置３１の液分注ノズル３１ａは、前記したように、アクチュエータ制御部３４ｇ及び第２流量制御部３４ｂによるアクチュエータ３１ｃ及び分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって回収容器２１内にＡＴＰ抽出試薬を分注する（図２のステップＳ５）。
このＡＴＰ抽出試薬の分注によって、微生物に含まれるＡＴＰが抽出されて回収容器２１内にＡＴＰ抽出液が生成することとなる。
このＡＴＰ抽出試薬の分注によって、微生物に含まれるＡＴＰが抽出されて回収容器２１内にＡＴＰ抽出液が生成することとなる。
このＡＴＰ抽出試薬としては、例えば、界面活性剤、エタノールとアンモニアの混合液、メタノール、エタノール、トリクロロ酢酸、過塩素酸、トリス緩衝液等を好適に使用することができる。中でも界面活性剤が望ましく、この界面活性剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイルリン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等が挙げられる。
次に、この液分注装置３１の液分注ノズル３１ａは、前記したように、アクチュエータ制御部３４ｇ及び第２流量制御部３４ｂによるアクチュエータ３１ｃ及び分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって、回収容器２１内のＡＴＰ抽出液を発光強度測定ユニット３２の発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ６）。
また、液分注ノズル３１ａは、前記したように、アクチュエータ制御部３４ｇ及び第２流量制御部３４ｂによるアクチュエータ３１ｃ及び分注ポンプ３１ｂの所定の制御によって、試薬ホルダ６に配置されているＡＴＰ発光試薬８ｂを発光用チューブ３２ｂに分注する（図２のステップＳ７）。
このＡＴＰ発光試薬８ｂとしては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
これにより、発光用チューブ３２ｂ内ではＡＴＰ抽出液中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとの発光反応によって発光を生じることとなる。
このＡＴＰ発光試薬８ｂとしては、例えば、ルシフェラーゼ・ルシフェリン試薬が挙げられる。
これにより、発光用チューブ３２ｂ内ではＡＴＰ抽出液中のＡＴＰと、ＡＴＰ発光試薬８ｂとの発光反応によって発光を生じることとなる。
次に、制御部３４の演算部３４ｆは、光検出部本体３２ａ（図１参照）がＡＴＰの発光を検出して出力した信号をデジタル処理し、単一光子計数法に基づいて発光強度を測定する（ステップＳ８）。そして、制御部３４は、予め記憶しているＡＴＰ量（ａｍｏｌ）と、発光強度（ＣＰＳ）との関係を示す検量線に基づいて、発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ抽出液に含まれるＡＴＰ量（ａｍｏｌ）を演算すると共に、このＡＴＰ量（ａｍｏｌ）に基づいて、液状試料８ａに含まれる微生物当量のＡＴＰ換算値として微生物の定量を行う（ステップＳ９）。このステップＳ９が行われることで、本実施形態に係る一連の微生物定量方法の所定の工程が終了する。
以上のような本実施形態に係る微生物定量装置１及び微生物定量方法によれば次のような作用効果を奏することができる。次に参照する図３（ａ−１）から（ａ−４）は、前記の微生物定量方法が実施される際の、回収容器内の液位を示す回収容器の断面図である。図３（ｂ−１）から（ｂ−４）は、図３（ａ−１）から（ａ−４）に対応する場面でのフィルタ近傍の様子を拡大して示す模式図である。
なお、図３（ｂ−１）から（ｂ−４）中、符号Ｂで示される微生物は、実際には、マイクロメーターサイズであり、ＡＴＰは、実際には分子レベルの大きさであって、図３（ｂ−１）から（ｂ−４）は、これらの相対的な大きさを示すものではない。
なお、図３（ｂ−１）から（ｂ−４）中、符号Ｂで示される微生物は、実際には、マイクロメーターサイズであり、ＡＴＰは、実際には分子レベルの大きさであって、図３（ｂ−１）から（ｂ−４）は、これらの相対的な大きさを示すものではない。
前記のステップＳ１（図２参照）において、回収容器２１の内容物の濾過が開始される直前は、図３（ａ−１）に示すように、回収容器２１内は所定量（本実施形態では１０ｍＬであるがこれに限定されない）の液状試料８ａで満たされている。なお、図３（ａ−１）中、符号２６は、フィルタである。
そして、図３（ｂ−１）に示すように、フィルタ２６上に満たされる液状試料８ａには、微生物Ｂが含まれている。なお、図３（ｂ−１）中、符号２６ａは、前記のとおり親水性フィルタであり、符号２６ｂは、前記のとおり疎水性フィルタである。
ステップＳ１（図２参照）での濾過が終了すると、図３（ａ−２）に示すように、回収容器２１内は目視で空の状態となる。そして、フィルタ２６（２６ａ，２６ｂ）上には、図３（ｂ−２）に示すように、微生物Ｂが濾別されることとなる。さらに詳しく説明すると、濾過直後の微生物Ｂの表面には、微視的に水膜９が形成された状態でフィルタ２６上に濾別されることとなる。
ステップＳ２（図２参照）で、濾過後、直ちに回収容器２１内にバッファ液８ｃが注入されると、図示しないが、回収容器２１内には、図３（ａ−１）と同程度の液量でバッファ液８ｃが満たされる。
ステップＳ３（図２参照）で、再び濾過が開始された後、回収容器２１内の液量が所定量以下となって濾過が停止すると、図３（ａ−３）に示すように、回収容器２１のフィルタ２６上には少量のバッファ液８ｃが残存することとなる。ちなみに、本実施形態でのバッファ液８ｃの残存量は、０．１ｍＬであるがこれに限定されない。この際、微生物Ｂは、図３（ｂ−３）に示すように、フィルタ２６上でバッファ液８ｃに浸漬された状態となる。
そして、ステップＳ４（図２参照）で回収容器２１内にＡＴＰ消去試薬が分注され、ステップＳ５（図２参照）で回収容器２１内にＡＴＰ抽出試薬が分注されると、図３（ａ−４）に示すように、回収容器２１内の液量は、図３（ａ−３）で示す液量よりも、ＡＴＰ消去試薬及びＡＴＰ抽出試薬の分注量に応じて増量する。
ちなみに、現実のＡＴＰ消去試薬及びＡＴＰ抽出試薬の分注量は僅かであり、作図の便宜上、図３（ａ−３）及び図３（ａ−４）で示す液量の増加分は誇張して描いている。
ちなみに、現実のＡＴＰ消去試薬及びＡＴＰ抽出試薬の分注量は僅かであり、作図の便宜上、図３（ａ−３）及び図３（ａ−４）で示す液量の増加分は誇張して描いている。
そして、回収容器２１内には、図３（ｂ−４）に示すように、バッファ液中にＡＴＰが含まれるＡＴＰ抽出液が生成することとなる。ちなみに、酵素系であるＡＴＰ消去試薬は、界面活性剤系であるＡＴＰ抽出試薬と接触することで失活することとなる。これにより、ステップＳ４で使用されるＡＴＰ消去試薬が、ステップＳ８（図２参照）でのＡＴＰ発光強度の測定に影響を与えることは殆どない。
以上のような本実施形態の微生物定量装置１及び微生物定量方法によれば、フィルタ２６での濾過後、回収容器２１内に直ちにバッファ液８ｃの注入（補液）を行うので（図２のステップＳ２参照）、フィルタ２６上に濾別した微生物Ｂの乾燥を防止することができる。
また、本実施形態の微生物定量装置１及び微生物定量方法によれば、回収容器２１内の液量が所定量以下となったときに濾過を停止するので（図２のステップＳ３参照）、フィルタ２６上の微生物Ｂの乾燥を防止することができる。
そして、このような微生物定量装置１及び微生物定量方法によれば、微生物Ｂの乾燥を防止することができるので、液状試料８ａに含まれる微生物ＢからのＡＴＰの収率が従来よりも一段と良好となる。これにより、微生物定量装置１及び微生物定量方法は、従来よりも微生物Ｂの測定感度（定量感度）に優れることとなる。
なお、本実施形態の微生物定量装置１及び微生物定量方法によって、微生物ＢからのＡＴＰの収率が従来よりも良好となるのは、微生物Ｂの乾燥を防止することで微生物Ｂ（生菌）の生物活性が維持されて、微生物Ｂ（生菌）内でのＡＴＰの減少率の低下が抑制されることによるものと考えられる。
なお、本実施形態の微生物定量装置１及び微生物定量方法によって、微生物ＢからのＡＴＰの収率が従来よりも良好となるのは、微生物Ｂの乾燥を防止することで微生物Ｂ（生菌）の生物活性が維持されて、微生物Ｂ（生菌）内でのＡＴＰの減少率の低下が抑制されることによるものと考えられる。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は前記実施形態に限定されず、種々の形態で実施することができる。
前記実施形態では、濾過後、回収容器２１内に直ちにバッファ液８ｃの注入を行い、或いは回収容器２１内の液量が所定量以下となったときに濾過を停止することで、微生物Ｂの乾燥を防止する構成としたが、本発明は微生物Ｂの乾燥を防止する工程を有するものであれば、これに制限されるものではない。
前記実施形態では、濾過後、回収容器２１内に直ちにバッファ液８ｃの注入を行い、或いは回収容器２１内の液量が所定量以下となったときに濾過を停止することで、微生物Ｂの乾燥を防止する構成としたが、本発明は微生物Ｂの乾燥を防止する工程を有するものであれば、これに制限されるものではない。
図４は、本発明の他の実施形態（変形例）としての微生物定量装置１が実行する微生物定量方法の概略を示すフローチャートである。この図４に示す微生物定量方法は、図２に示す微生物定量方法と比較すると、図２のステップＳ３が、図３ではステップＳ３ａ及びＳ３ｂに変わっている以外は図２に示す微生物定量方法と同様である。よって、ここではステップＳ１、Ｓ２、Ｓ４からＳ９の説明を省略し、ステップＳ３ａ及びＳ３ｂについてのみ説明する。
図４に示すように、この微生物定量方法は、そのステップＳ２の実行後のステップＳ３ａにおいて、回収容器２１の内容物の濾過を再び開始するとともに、回収容器２１内にバッファ液８ｃを、ステップＳ２でのバッファ液８ｃの流量よりも少ない流量で注入し続ける。これにより、回収容器２１内には、バッファ液８ｃが追加されながらも、濾過が続けられることによって、回収容器２１内の液量は徐々に少なくなっていく。これにより、細胞外のＡＴＰが効率よく除去されることとなる。
そして、ステップＳ３ｂでは、回収容器２１内の液量が所定量以下となったときに、制御部３４は、バッファ液８ｃの注入を停止させるとともに、濾過を停止させる。つまり、回収容器２１内の液量は、図３（ａ−３）と同様になる。
これにより、この変形例では、微生物Ｂの乾燥を防止することができるので、液状試料８ａに含まれる微生物ＢからのＡＴＰの収率が従来よりも一段と良好となる。
これにより、この変形例では、微生物Ｂの乾燥を防止することができるので、液状試料８ａに含まれる微生物ＢからのＡＴＰの収率が従来よりも一段と良好となる。
また、前記実施形態では、発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ抽出液に対してＡＴＰ発光試薬８ｂを分注して発光反応を行わせているが、本発明は発光用チューブ３２ｂに分注したＡＴＰ発光試薬８ｂに対してＡＴＰ抽出液を分注して発光反応を行わせる構成とすることもできる。
前記実施形態での微生物Ｂとしては、例えば、コリネバクテリウム、ミクロコッカス、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、セレウス菌、枯草菌等のグラム陽性菌、シトロバクター、大腸菌、緑膿菌、セラチア菌等のグラム陰性菌、コウジカビ、アオカビ、アズキイロカビ、カンジタ菌等の真菌等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。
なお、本発明は、枯草菌等の芽胞形成菌に適用する場合には、前記した試薬にアミノ酸、糖等の栄養形細胞変換試薬を含めることができる。
なお、本発明は、枯草菌等の芽胞形成菌に適用する場合には、前記した試薬にアミノ酸、糖等の栄養形細胞変換試薬を含めることができる。
また、前記実施形態では、ＡＴＰ法によって微生物Ｂの定量を行っているが、本発明は、微生物Ｂから抽出したＤＮＡ、ＲＮＡ、ＮＡＤ等の生体物質に励起光を照射して生じさせた蛍光に基づいて微生物Ｂの定量を行うこともできる。
また、グラム陰性菌を定量する場合には、その細胞膜に含まれるエンドトキシンを指標とし、エンドトキシンにリムルスを反応させた際の発光強度に基づいて定量を行うこともできる。
また、前記実施形態では、液状試料８ａ中の微生物Ｂの定量を想定しているが、例えば、空気中を浮遊する微生物をゲル状担体で捕集した後、これを回収容器２１内に配置した状態でバッファ液８ｃ等を加えて液状試料８ａとすることもできる。
ちなみに、ゲル状担体としては、例えば、常温から昇温することでゲルからゾルに相変化する材料で形成されるものが挙げられる。この材料としては、３０℃以上、４０℃未満で液化するものが望ましく、中でも、ゼラチン、ゼラチンとグリセロールの混合物、及びＮ−アクリロイルグリシンアミドとＮ−メタクリロイル−Ｎ´−ビオチニルプロピレンジアミンとの１０：１のコポリマーがさらに望ましい。
ちなみに、ゲル状担体としては、例えば、常温から昇温することでゲルからゾルに相変化する材料で形成されるものが挙げられる。この材料としては、３０℃以上、４０℃未満で液化するものが望ましく、中でも、ゼラチン、ゼラチンとグリセロールの混合物、及びＮ−アクリロイルグリシンアミドとＮ−メタクリロイル−Ｎ´−ビオチニルプロピレンジアミンとの１０：１のコポリマーがさらに望ましい。
１ 微生物定量装置
２ 濾過機構
３ 定量機構
４ 乾燥防止機構
６ 試薬ホルダ
８ａ 液状試料
８ｂ ＡＴＰ発光試薬
８ｃ バッファ液
２１ 回収容器
２２ 昇降機構
２３ 吸引ヘッド
２４ 吸引ポンプ
２６ フィルタ
２６ａ 親水性フィルタ
２６ｂ 疎水性フィルタ
３１ 液分注装置
３１ａ 液分注ノズル
３１ｂ 分注ポンプ
３１ｃ アクチュエータ
３２ 発光強度測定ユニット
３２ａ 光検出部本体
３２ｂ 発光用チューブ
３４ 制御部
３４ａ 第１流量制御部
３４ｂ 第２流量制御部
３４ｃ 液量検出信号入力部
３４ｄ 吸引ポンプ制御部
３４ｅ 昇降機構制御部
３４ｆ 演算部
３４ｇ アクチュエータ制御部
４１ バッファ液注入装置
４２ 液面計
４３ バッファ液貯留槽
４４ 送液ポンプ
Ｂ 微生物
２ 濾過機構
３ 定量機構
４ 乾燥防止機構
６ 試薬ホルダ
８ａ 液状試料
８ｂ ＡＴＰ発光試薬
８ｃ バッファ液
２１ 回収容器
２２ 昇降機構
２３ 吸引ヘッド
２４ 吸引ポンプ
２６ フィルタ
２６ａ 親水性フィルタ
２６ｂ 疎水性フィルタ
３１ 液分注装置
３１ａ 液分注ノズル
３１ｂ 分注ポンプ
３１ｃ アクチュエータ
３２ 発光強度測定ユニット
３２ａ 光検出部本体
３２ｂ 発光用チューブ
３４ 制御部
３４ａ 第１流量制御部
３４ｂ 第２流量制御部
３４ｃ 液量検出信号入力部
３４ｄ 吸引ポンプ制御部
３４ｅ 昇降機構制御部
３４ｆ 演算部
３４ｇ アクチュエータ制御部
４１ バッファ液注入装置
４２ 液面計
４３ バッファ液貯留槽
４４ 送液ポンプ
Ｂ 微生物
Claims (3)
- 液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過する濾過機構と、
前記フィルタ上の前記微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する定量機構と、
前記フィルタ上における前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止機構と、を備え、
前記濾過機構は、
前記フィルタを内部に有する回収容器と、該回収容器の前記液状試料を吸引する吸引ポンプと、を備え、
前記乾燥防止機構は、
前記フィルタ上の液量を検出して液量検出信号を出力する液量検出部と、
前記フィルタ上に補液を行う補液機構と、
前記液量検出信号に基づいて前記液量が所定量以下になったと判断した場合に前記フィルタ上に補液が行われるように前記補液機構を起動させる制御部と、を備えることを特徴とする微生物定量装置。 - 液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する微生物定量方法において、
前記フィルタ上での前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止工程を有し、
前記濾過は、前記フィルタを内部に有する回収容器内の前記液状試料を吸引ポンプで吸引することで行い、
前記乾燥防止工程は、濾過された前記微生物が前記フィルタ上で空気接触した後直ちに前記フィルタ上に補液を行うことによって、前記微生物の乾燥を防止することを特徴とする微生物定量方法。 - 液状試料に含まれる微生物をフィルタで濾過し、この微生物に含まれる所定の生体物質を指標として前記微生物を定量する微生物定量方法において、
前記フィルタ上での前記微生物の乾燥を防止する乾燥防止工程を有し、
前記濾過は、前記フィルタを内部に有する回収容器内の前記液状試料を吸引ポンプで吸引することで行い、
前記乾燥防止工程は、前記フィルタ上での所定の液位を維持することによって、前記微生物の乾燥を防止する微生物定量方法であって、
前記フィルタ上での所定の液位は、前記フィルタで濾過を行いながら、前記フィルタ上に補液を行うことによって維持されることを特徴とする微生物定量方法。
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