JP6660888B2

JP6660888B2 - 薬剤感受性試験システム

Info

Publication number: JP6660888B2
Application number: JP2016565788A
Authority: JP
Inventors: 博子多田; 野田　英之; 英之野田; 英樹仁井見; 北島　勲; 勲北島
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2020-03-11
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: JPWO2016103433A1; US10619182B2; US20170314057A1; WO2016103433A1

Description

本発明は、菌の増殖評価に関する。特に、細菌の薬剤感受性試験を実施する方法、装置及びシステムに関するものである。

感染症による死亡者数の増加や、薬剤耐性菌の出現に伴い、感染症起因菌の薬剤感受性試験の迅速化が注目されている。従来は、薬剤感受性試験は培養法に基づき実施されてきた。感染症患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰などの検体を採取後、常在菌が混在する検体から感染症起因菌を単独コロニーで得るため分離培養を一昼夜行なう。さらに、単独コロニーを形成した菌を一定濃度に調製後、各種各濃度の薬剤・抗生物質が配置された容器に分配し、薬剤感受性培養を一昼夜行なう。そして、培養後、菌の増殖の有無を基に感染症起因菌の薬剤感受性試験の結果が得られ、その結果を受けて患者に対し適切な投薬が行われる。そのため感染症患者に対し適切な投薬が行われるのは、検体採取後３日目以降である。

これに対して、薬剤感受性試験を迅速に行なう方法として、菌内にエネルギー源として存在するＡＴＰ（Adenosine Triphosphate：アデノシン三リン酸）の変化量を菌の増殖の指標とするＡＴＰ生物発光法が注目されている。ＡＴＰ法は、菌内にエネルギー源として存在するＡＴＰを、ホタル由来の酵素ルシフェラーゼを利用して検出する方法である。ルシフェラーゼが、菌内のＡＴＰとMg^２+存在下において基質であるルシフェリンを酸化し、その際に生じる発光量がＡＴＰ量に比例するため、発光量の変化から菌の増殖を評価可能である。ＡＴＰ法を利用した菌数の判定方法として、例えば、特許文献１において、ＡＴＰ測定により生菌を計数し、ＤＮＡ法により総菌を計数し、この総菌から生菌を減算して生菌数と死菌数を得る技術が開示されている。

特開平０８-３０４４０２

ＡＴＰ法を利用した従来の菌の増殖判定では、検体中の遊離ＡＴＰを消去し、生きている菌体内のＡＴＰ(生菌ＡＴＰ）のみを評価する。この方法では、培養時間の経過に伴う生菌ＡＴＰの増減により菌の増殖を判定するため、薬剤感受性培養実施中に生菌ＡＴＰの測定を複数回実施する必要があり、測定毎に試料調製の手間がかかるとともに、薬剤感受性結果を迅速に入手することが困難であった。

上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、薬剤感受性試験装置に、薬剤及び菌を含む培養液のＡＴＰ発光計測を行う計測部と、計測部が計測した培養液中の死菌由来のＡＴＰ発光量に基づいて、菌の薬剤への感受性の有無を判定する判定部と、を設ける。

本発明により、ＡＴＰ薬剤感受性試験を迅速及び簡便に実施することで、感染症患者に対し抗生物質の早急な適正投与が可能となる。上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施例の説明により明らかにされる。

薬剤感受性試験の対象とする菌培養液の構成例を示す図。生菌ＡＴＰ及び死菌ＡＴＰを測定するための試料調製方法を模式的に示す図。各方法で測定可能なＡＴＰを示す表。抗生物質非存在下での生菌ＡＴＰ発光量及び死菌ＡＴＰ発光量の経時変化の一例を示すグラフ。抗生物質存在下での生菌ＡＴＰ発光量及び死菌ＡＴＰ発光量の経時変化の一例を示すグラフ。薬剤感受性試験システムによる処理工程の一例を示すフロー図。薬剤感受性試験システムによる死菌ＡＴＰ発光量の測定工程の一例を示すフロー図。本実施例における薬剤感受性試験システムの構成例を示す図。計測装置の内部構成を示す図。死菌/生菌比較部の内部構成を示すブロック図。薬剤感受性試験の判定基準とするデータベースの例を示す表である。 E.coliの培養時間の経過に伴うＡＴＰ量比の例を示すグラフである。Ｓ.aureuＳの培養時間の経過に伴うＡＴＰ量比の例を示すグラフである。

以下、本発明の好適な実施形態について、図面を用いつつ実施例を示して説明する。但し、この実施例に記載されているシステム、装置、デバイス、部材等の寸法、材質、形状、その他の相対的な配置等は特に特定的な記載がない限りは、この発明の範囲をそれに限定する趣旨ではなく、あくまで説明例に過ぎない。

図１を用いて本実施例の薬剤感受性試験の対象とする菌培養液１について説明する。菌培養液１中には、生菌２、細胞膜の損傷がない死菌３、細胞膜が損傷した死菌４など、菌が多様な状態で存在する。菌培養液１のうち、生菌２及び細胞膜の損傷がない死菌３はＡＴＰを細胞膜内に内包する。一方、細胞膜が損傷した死菌４においては、細胞膜の損傷が進むに従いＡＴＰが細胞膜の損傷部から漏れ出すため、細胞膜が損傷した死菌４由来のＡＴＰは培養液中に遊離ＡＴＰ５として存在する。

次に、図２を用いて生菌及び死菌由来のＡＴＰを測定するための方法について説明する。方法(１)の生菌ＡＴＰ法は、菌体外のＡＴＰ５を消去し、生菌２の細胞膜に内包されたＡＴＰ２０００と、細胞膜の損傷がない死菌３の細胞膜に内包されたＡＴＰ３０００と、を測定する方法である。方法(２)の液中ＡＴＰ法は、生菌２及び死菌３、４の菌体を含んだまま培養液１中の細胞膜が損傷した死菌４と遊離ＡＴＰ５を測定する方法である。死菌４は、後述する生物発光分子である酵素ルシフェラーゼ反応の基質と酵素が損傷部位から進入するため、測定の対象となる。方法(３)のろ液ＡＴＰ法は、後述するフィルタリング容器１２を用いた遠心分離により培養液１をろ過することにより菌体２、３、４を除去し、ろ液１０００中に含まれる遊離ＡＴＰ５を測定する方法である。方法(４）の全ＡＴＰ法は、生菌２の細胞膜に内包されたＡＴＰ２０００と、細胞膜の損傷がない死菌３の細胞膜に内包されたＡＴＰ３０００と、細胞膜が損傷した死菌４の細胞膜内に残存するＡＴＰ４０００と、を抽出し、遊離ＡＴＰ５を合わせて測定する方法である。

以上の方法(１)〜(４)で測定可能な培養液１中のＡＴＰを図３に整理して示す。方法（１）では、生菌(細胞膜あり)の細胞膜に内包されたATPと死菌(細胞膜あり)の細胞膜に内包されたATPを測定可能である。方法（２）では、死菌(細胞膜損傷)の細胞膜に内包されたATPと死菌(細胞膜損傷)由来の遊離ATP を測定可能である。方法（３）では、死菌(細胞膜損傷)由来の遊離ATP を測定可能である。方法（４）では、生菌(細胞膜あり)の細胞膜に内包されたATP と死菌(細胞膜あり)の細胞膜に内包されたATP と死菌(細胞膜損傷)の細胞膜に内包されたATPと死菌(細胞膜損傷)由来の遊離ATP を測定可能である。

このように、遊離ＡＴＰ５として培養液１中に存在する死菌由来のＡＴＰは、方法(２)〜(４)に含まれるため、方法(２)〜(４)により遊離ＡＴＰ５の量に基づいて死菌ＡＴＰを測定可能である。

次に、図４a及び図４bを用いて、大腸菌を例として方法(１)〜(４)により処理しＡＴＰ量を測定した結果の一例を示す。ＡＴＰ法は、菌内にエネルギー源として存在するＡＴＰを、ホタル由来の酵素ルシフェラーゼを利用した生物発光検出である。ルシフェラーゼが、菌内のＡＴＰとMg^２+存在下において基質であるルシフェリンを酸化し、その際に生じる発光量がＡＴＰ量に比例するため、発光量の変化から菌の増殖を評価する。

本実施例では、発光量を60secのフォトンカウント値の積算で表わし、単位を発光量（Amount of luminescence (a.u.)）とする。先に述べたように、発光量とＡＴＰ量は比例関係にあり、発光量が増加している場合はＡＴＰ量が増加していると判定する。

図４aは、大腸菌を抗生物質非存在下で培養した結果、図４bは大腸菌を抗生物質であるアンピシリン（以下ABPCとする）8μg/mL存在下で培養した結果を示す。図４aと図４bの結果を比較すると、図４aでは培養時間の経過に伴って方法(１)の生菌ＡＴＰ法は培養時間４時間まで発光量が培養時間とともに増加し、その後の培養時間５時間、６時間では、飽和する傾向を示すのに対して、方法(２)の液中ＡＴＰ法〜(４)全ＡＴＰ法も同様の傾向を示す。一方、図４bでは培養時間の経過（３hrs以降）に伴い方法(１)の生菌ＡＴＰの発光量が減少するのに対し、方法(２)液中ＡＴＰ法〜(４)全ＡＴＰ法では発光量が増加もしくは大きく変化しないといった傾向を示す。

これは、培養時間４時間で、抗生物質であるアンピシリンが大腸菌に作用し、生菌の増殖を停止させ、時間が経つにつれて菌を死に至らせている反応を示している。死菌由来のＡＴＰは細胞膜の損傷が進むに従い細胞膜の損傷部から漏出するため、菌培養液中のＡＴＰは増加する。方法(２)の液中、(３)のろ液中、(４)の全ＡＴＰの培養時間４時間以降で発光量が一定になっている理由は、いずれも死菌由来のＡＴＰが増加していることを示す結果である。

次に、図５を用いて生菌ＡＴＰまたは死菌ＡＴＰを求める際に本実施例における薬剤感受性試験システムによる処理工程の一例を示す。なお、当該試験の測定対象となる菌は、菌体内にＡＴＰを含有するものであれば特に限定されない。

感染症患者から血液、咽頭ぬぐい液、喀痰等の検体を採取し（Ｓ５０１）、常在菌が混在する検体から感染症起因菌を単独コロニーで得るため分離培養を一昼夜約24h行なう(Ｓ５０２)。分離培養後、単独コロニーを形成した菌を一定濃度に調製後(Ｓ５０３)、各種各濃度の薬剤・抗生物質が配置された容器に分配し(Ｓ５０４)、薬剤感受性培養を実施する(Ｓ５０５)。

ここで、Ｓ５０５で使用する分配容器の材質及び形状は特に限定されないが、平面上に複数の穴（ウェル）を有するプレート状のものが望ましく8ウェル×12ウェルで合計96ウェルが一体となった96穴マイクロプレート、または、16ウェル×24ウェルで合計384ウェルが一体となった384穴マイクロプレート、32ウェル×48ウェルで合計1532ウェルが一体となった1532穴マイクロプレート、等を用いる。

また、薬剤感受性培養に使用する薬剤・抗生物質は特に限定されないが、ペニシリン系、セフェム系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系、ホスホマイシン系等の殺菌作用を有する抗生物質が望ましい。

薬剤感受性培養を数時間実施後、培養液中に含まれる生菌由来の生菌ＡＴＰを生菌ＡＴＰ測定フローで測定する。また、培養液中の死菌由来の死菌ＡＴＰを、死菌ＡＴＰ測定フローで測定する。これらの測定フローの測定結果に基づいて菌の薬剤感受性を判定する。

生菌ＡＴＰ測定フローＡＴＰは、ＡＴＰ消去工程Ｓ５０６と、ＡＴＰ抽出工程Ｓ５０７と、発光測定Ｓ５０８から構成される。ＡＴＰ消去工程Ｓ５０６においては、菌体外の遊離ＡＴＰの除去を実施する。遊離ＡＴＰを除去する方法は特に限定されず、アピラーゼ等のＡＴＰ分解酵素を用いる方法や、フィルタろ過により除去する方法が挙げられる。ＡＴＰ抽出工程Ｓ５０７においては、菌体の膜を破砕しＡＴＰを膜外へ抽出する。菌体の膜を破砕する方法は特に限定されず、界面活性剤等を添加し破砕する方法や、超音波照射法、フレンチプレスやホモジナイザなどによる破砕法などが挙げられる。その後、発光測定Ｓ５０８を行う。

死菌ＡＴＰ測定フローは、フィルタろ過工程Ｓ５０９と、ろ液回収工程Ｓ５１０と、発光測定Ｓ５１１から構成される。フィルタろ過工程Ｓ５０９において、フィルタ孔径よりサイズの大きい菌体を除去し、ろ液回収工程Ｓ５１０においてろ液を回収し、発光計測を行い（Ｓ５１１）、死菌ＡＴＰ量の判定を行う。

このように、図５に例示する死菌ＡＴＰ測定フローでは、方法(３)のろ液中のＡＴＰ、すなわち、細胞膜の損傷により漏出した遊離ＡＴＰ５を死菌ＡＴＰとして判定する。ただし、死菌ＡＴＰの測定方法はこれに限定されず、図２の方法(２)における培養液をそのまま用いて培養液中に菌体から漏出した遊離ＡＴＰ５を測定する方法や、菌培養液の全ＡＴＰ（図２(４)）を測定対象としてもよい。全ＡＴＰを死菌ＡＴＰ測定の対象とする場合は、発光測定Ｓ５１１と発光測定Ｓ５０８の差分を死菌ＡＴＰとする。方法(４)を用いる場合、培養液に界面活性剤等を添加しＡＴＰを抽出する方法や、超音波照射法、フレンチプレスやホモジナイザなどにより菌体からＡＴＰを抽出する方法などが挙げられる。

次に、図７を用いて本実施例における薬剤感受性試験システムの構成例を示す。本システムは、培養器６、分注機７、遠心機８、計測装置９、死菌/生菌比較部１０から構成される。培養器６では、薬剤感受性試験の対象となる菌体の培養を実施する。分注機７は、菌体の培養後に、薬剤感受性試験用のプレート１１の各容器へ菌体液を分注する。分注機７は、数マイクロリットルから数100マイクロリットルまで分注可能な分注機構を搭載しており、１０マイクロリットルから２００マイクロリットルの範囲で任意に変更可能であるが、１００マイクロリットルが好適である。

次に、薬剤感受性試験が終了した薬剤感受性試験プレート１１中の各容器内の試料を、底部にフィルタを有する容器１２、第２の発光測定容器１４へ分注する。分注機７は、数マイクロリットルから数100マイクロリットルまで分注可能な分注機構を搭載し、底部にフィルタを有する容器１２、第２の発光測定容器１４へ所定の試料量を分注する。そして分注機７による工程が終了した第２の発光測定容器１４を計測装置９に導入する。遠心機８では、死菌ＡＴＰの調製工程において、菌培養液１から菌体を除去するためのフィルタろ過を実施する。底部にフィルタを有するフィルタリング容器１２は、第１の発光測定容器１３の上部に設置し、遠心機８により遠心されることで、底部にフィルタを有する容器１２中の溶液がろ過され、ろ液が第１の発光測定容器１３中に得られる。そして第１の発光測定容器１３を計測装置９に導入する。

計測装置９では、ＡＴＰの調整工程Ｓ５０６、Ｓ５０７等の実施、及び死菌ＡＴＰの発光計測Ｓ５０８、Ｓ５１１を実施する。死菌/生菌比較部１０では、計測装置９により計測されたＡＴＰ発光量から、生菌ＡＴＰ発光量と死菌ＡＴＰ発光量の算出と、死菌ＡＴＰ発光量/生菌ＡＴＰ発光量の比率の判定を行なう。なお、前記分注機７は、単独コロニーを形成した菌を一定濃度に調製後(Ｓ５０３)、各種各濃度の薬剤・抗生物質が配置された容器に分配する工程(Ｓ５０４)にも利用できる。

図９に、死菌/生菌比較部１０の機能ブロック構成図を示す。死菌/生菌比較部１０は、生菌ＡＴＰ算出部９０１、死菌ＡＴＰ算出部９０２、及びこれら９０１、９０２における処理を最終的な結果として纏めて結果表示する死菌ＡＴＰ/生菌ＡＴＰ算出部９０３、データベース記憶部９０４、判定部９０５で構成される。

具体的には、図５の発光測定(Ｓ５０８)の結果が生菌ＡＴＰ算出部９０１に、発光測定(Ｓ５１１)の結果が死菌ＡＴＰ算出部９０２に記憶され、死菌ＡＴＰ/生菌ＡＴＰ算出部９０３にて、死菌ＡＴＰ発光量をx、生菌ＡＴＰ発光量をyとすると、死菌ＡＴＰ発光量/生菌ＡＴＰ発光量がx/yという値として記憶され、死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量の量比の最終結果として表示される。もちろん、分割して表示することも可能であり、Ｓ５０８、Ｓ５１１の結果だけを表示されることも可能である。

また、データベース記憶部９０４では過去の死菌ＡＴＰ/生菌ＡＴＰ算出部９０３での発光量比（x/y）の算出結果をもとに菌種ごとにデータベース化された判定基準が記憶されている。判定部９０５は、この判定基準に基づいて薬剤感受性の有無を判定する。例えば、菌種が同定されていれば、判定部９０５において、データベース記憶部９０４から菌種を選び、判定基準となる生菌ＡＴＰ発光量 (Ｓ５０８)/死菌ＡＴＰ発光量 (Ｓ５１１)の比率（x/y）の閾値を読み出し、死菌ＡＴＰ/生菌ＡＴＰ算出部９０３での算出結果と閾値を比較することで薬剤感受性の有無判定を行う。これにより、過去の試験結果に基づく正確な判定が可能となる。ただし、データベース記憶部９０４に記憶される判定基準は過去の死菌ＡＴＰ/生菌ＡＴＰ算出部９０３での算出結果に基づくものであることが必須ではなく、予め所定の閾値が設定されている構成でもよい。

図１０にデータベース記憶部９０４に記憶される判定基準の１例を示す。菌種毎に、死菌発光量(x)と、生菌発光量(y)と、死菌ＡＴＰと生菌ＡＴＰの量比を示す死菌ＡＴＰ発光量 /生菌ＡＴＰ発光量 (x/y)が記憶される。菌Aを例とした場合、一定時間培養後に測定した菌液の、死菌発光量(x)と生菌発光量(y)を元に算出された死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量（x/y）が、Aよりも大きい場合、判定部９０５はその薬剤に対し菌Aは感受性であると判定する。逆に死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量（x/y）がA以下である場合、判定部９０５はその薬剤に対し菌Aは感受性がない、つまり耐性と判定する。

図８に計測装置９の内部構成の一例を示す。計測装置９は試薬分注機構部１５、試料調製機構部１６、発光検出機構部１７から構成される。

試薬分注機構部１５は、第１の電動アクチュエータ１８と、第２の電動アクチュエータ１９による位置調整機構２０、分注ノズル２１、チューブ配管２２、シリンジ２３、さらに、シリンジ２３を動かす第３の電動アクチュエータ２４で構成され、分注ノズル２１とチューブ配管２２は、固定部２５を用いて連結される。

試薬の出し入れは、シリンジ２３の押し引きに使用される第３の電動アクチュエータ２４の上下移動に連動して、シリンジ２３のピストンが上下することで行われ、試薬フォルダ２６内の試薬の分取や、発光測定容器２８への分注が可能である。また位置調整機構２０により、試薬フォルダ２６及び発光測定容器２８上の適切な位置へ分注ノズル２１を移動させることが可能である。

試料調製機構部１６は、試薬フォルダ２６と発光測定容器２８を設置するステージ２９、ステージ２９を任意の位置に移動可能な第１の電動スライダ３０、第２の電動スライダ３１で構成される。試薬フォルダ２６は、生菌ＡＴＰの調製工程Ｓ５０６、Ｓ５０７で使用する消去試薬、抽出試薬、及びＡＴＰの発光計測工程Ｓ５０８、Ｓ５１１で使用する発光試薬を包含する。試薬フォルダ２６上には、これらの試薬以外にも適宜必要な試薬等を搭載可能であり、例えば、クロスコンタミネーションを防ぐためのノズル洗浄用の第１の洗浄液、分注機構部２０の試薬と接する分注ノズル２１、チューブ配管２２、シリンジ２３内全てを洗浄するための第２の洗浄液、さらに、洗浄後の第１の洗浄液、第２の洗浄液を貯留するための空容器等、も搭載可能である。

先に述べたクロスコンタミネーションを防ぐために、分注ノズル２１を測定毎に交換する場合も考慮し、本発明の薬剤感受性システムの計測装置９のステージ２９には、ディスポチップを設置するチップ群設置部２７が設けられている。分注ノズル２１は、位置調整機構２０によりチップ群設置部２７へアクセス可能で、自動でチップの取り外しと取り付けを行う。

発光測定容器２８の設置場所のステージ２９の底部は透明または、部材が切り抜かれており、発光検出機構部１７において発光検出が可能となっている。ステージ２９の第１の電動スライダ３０、第２の電動スライダ３１と、試薬分注機構部１５の位置調整機構２０が連動して位置制御を行い、分注ノズル２１から発光測定容器２８上の任意の目的容器（ウェル）へ試薬を分注する。

発光検出機構部１７における発光の検出方法は特に限定されないが、本実施例では、光電子増倍管（Photomultiplier Tube、以下PMTとする）を用いた１例を図８に示した。発光検出機構部１７は、光ファイバケーブル３２とPMT３３で構成される。ファイバカプラで光ファイバケーブル３２とPMT３３を接続し、光ファイバ先端に入射した光をPMT３３の受光部まで伝送する。発光測定容器２８の本形態では、光ファイバケーブル３２の先端直径が発光測定容器２８の各容器と同程度か小さいものを使用することで、発光測定容器２８上の特定位置での発光検出が可能となる。また、第１の電動スライダ３０と第２の電動スライダ３１により、発光測定容器２８上の任意の目的容器（ウェル）における発光測定が可能である。感度の面でPMTが好適であるが、検出器としてPMT３３だけでなく、CCDカメラやフォトダイオードでも代替可能である。

これまで図７、図８、図９等を用いて薬剤感受性試験システムの構成例について説明してきた。ここで、図７では、培養器６、分注機７、遠心機８、計測装置９、死菌/生菌比較部１０を、各々機能ごとに分割した装置であるが、もちろん、これら全てを一体化した全自動システムであっても良い。その場合は、培養器６、分注機７、遠心機８、計測装置９へ、適切なタイミングで、薬剤感受性試験プレート１１、底部にフィルタを有する容器１２、第１の発光測定容器１３、第２の発光測定容器１４を移動させ、ローディング可能なロボットアームを用意し、連続的に処理できる形態に構成されたシステムとなる。

また、図９で説明した各機能ブロックは、ソフトウェアモジュールとして実装しても良いしハードウェアで実現してもよい。つまり、各機能ブロックは、死菌/生菌比較部１０内において、それぞれの機能を実現するメモリに格納されたプログラムをプロセッサが解釈して実行することによりソフトウェアで実現することができる。また、各機能ブロックは、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、ファイル、データベース、関数データ、変数データ、等の情報は、例えば、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（ＳｏｌｉｄＳｔａｔｅＤｒｉｖｅ）等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くこともできる。

さらに、判定部９０５による薬剤感受性の判定基準としては、図５に示した生菌ＡＴＰ発光量と死菌ＡＴＰ発光量の両方の測定結果を用いる方法の他に、図６に示す死菌ＡＴＰ発光量の測定結果のみを用いることも可能である。この場合の発光量測定は、図５に示す死菌ＡＴＰ量を測定する方法に準ずる。具体的には図６のＳ６０１〜Ｓ６０５は、図５のＳ５０１〜Ｓ５０５と同様の操作を実施する。図６のＳ６０６〜Ｓ６０８は、図５のＳ５０９〜Ｓ５１１と同様の操作を実施する。

以下では、本実施例による薬剤感受性の判定例について実験内容を交えてより詳細に説明する。

本実験例では、Escherichia coli （ATCC25922株、以下E.coliとする）とStaphylococcus aureus（ATCC25923、以下S.aureusとする）を菌体として使用し、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験を実施した。抗生物質としては、アンピシリン、レボフロキサシン（以下LVFXとする）を用いた。

まず、菌体をLB寒天培地上で一晩培養し、翌日コロニーをMueller-Hinton（以下MHとする）培地中に懸濁し0.5マクファーランドに調製した菌懸濁液を作製した。次に、予め終濃度の2倍濃度の抗生物質入りMH培地を50 μLずつ分注したプレートに、MH培地で500倍に希釈した菌懸濁液を50μLずつ分配し、37 ℃で一定時間静置培養を行い、菌懸濁液を調製した。抗生物質の終濃度は、E.coliを測定対象とした場合にはABPCは4 μg/mL、 LVFXは0.125 μg/mL、S.aureusを測定対象とした場合には、ABPCは0.25 μg/mL、 LVFXは0.125 μg/mLとした。なお、抗生物質を含まないMH培地中で培養したものを比較対照とした。

ＡＴＰ生菌ＡＴＰは、前述の菌培養液18 μLにＡＴＰ消去液2 μLを混合し、室温で30分間静置した。その後ＡＴＰ抽出試薬20 μLを混合し、室温で1分間静置することで調製した。死菌ＡＴＰは、菌培養液をフィルタ（膜孔径0.22μm）上に添加し、遠心によりフィルタろ過したろ液を死菌ＡＴＰとした。調製した生菌ＡＴＰまたは死菌ＡＴＰに発光試薬を添加し、1分間のフォトンカウンティングを行い、得られた発光量（Amount of luminescence (a.u.)）をＡＴＰ量の指標として用いた。

上記により、死菌ＡＴＰ発光量及び生菌ＡＴＰ発光量の発光量比を求め、それを生菌ＡＴＰと死菌ＡＴＰの量比として算出した結果を図１１及び図１２に示す。

図１１は、E.coliの生菌ＡＴＰと死菌ＡＴＰの量比を示す。抗生物質を含まない培地では、死菌ＡＴＰ発光量/生菌ＡＴＰ発光量、つまり死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量は大凡0.1以下で推移した。一方、ABPCまたはLVFX存在下では、培養時間の経過に伴い、死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量が増加した。抗生物質の効果を判定する基準を死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量＝1とすると、ABPC及びLVFXのE.coliに対する効果は、薬剤感受性培養を開始後およそ3時間で判定可能であることが示された。

次にS.aureusの生菌と死菌の量比を図１２に示す。抗生物質を含まない培地では、死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量は大凡0.5以下で推移した。ABPCまたはLVFX存在下では、E.coliの場合と同様に培養時間の経過に伴い、死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量が増加した。抗生物質の効果を判定する基準を死菌ＡＴＰ量/生菌ＡＴＰ量＝1とすると、ABPCのS.aureusに対する効果は薬剤感受性培養を開始後およそ2.5時間、LVFXのS.aureusに対する効果は、およそ4時間で判定可能であることが示された。

以上の実験から、ＡＴＰ法による薬剤感受性試験の判定基準として、薬剤を含む反応系において生菌ＡＴＰ量と死菌ＡＴＰ量をＡＴＰ発光量により求め、生菌と死菌のＡＴＰ量比を用いることで、異なる菌種で同一の判定基準で薬剤感受性を判定でき、従来技術より短時間且つ正確に薬剤の効果を判定することが可能であることが明らかになった。

つまり、本実施例の薬剤感受性試験システムによって、ＡＴＰ法を利用した細菌の薬剤感受性試験における薬剤感受性培養に要する時間を短縮し、且つ少ない測定回数で薬剤の効果判定ができることが分かった。これにより、薬剤感受性試験を迅速及び簡便に実施することで、重篤な感染症患者に対し抗生物質の早急かつ適正な投与が可能となる。

さらに、本実施例の薬剤感受性試験システムでは、生菌のＡＴＰ量は菌の膜内に包含するＡＴＰ量から求め、死菌のＡＴＰ量は反応系に含まれる遊離ＡＴＰ量から求めることにより、従来の生菌数/死菌数の判定技術と相違し、生菌と死菌の両方をＡＴＰ法により計数可能であり、手法の違いによる計数誤差が生じないことから、高精度に生菌数と死菌数の計数が可能となる。また、計数方法がＡＴＰ法で統一されるので、簡略な装置構成を実現できる。

ＡＴＰ６…培養器、７…分注機、８…遠心機、９…計測装置、１０…死菌/生菌比較部、１１…薬剤感受性試験プレート、１２…フィルタリング容器、１３…第１の発光測定容器、１４…第２の発光測定容器、１５…試薬分注機構部、１６…試料調製機構部、１７…発光検出機構部、１８…第１の電動アクチュエータ、１９…第２の電動アクチュエータ、２０…位置調整機構、２１…分注ノズル、２２…チューブ配管、２３…シリンジ、２４…第３の電動アクチュエータ、２５…固定部、２６…試薬フォルダ、２７…チップ群設置部、２８…発光測定容器、２９…ステージ、３０…第１の電動スライダ、３１…第２の電動スライダ、３２…光ファイバ、３３…PMT

Claims

培養液中で菌体の培養を行う培養装置と、
培養された菌体を含む培養液に薬剤を注入する分配容器と、
前記分配容器中の薬剤が注入された培養液を第１の発光測定容器及び第２の発光測定容器に分注する分注装置と、を備え、ここで、
前記第１の発光測定容器の上部には、底部にフィルタを有するフィルタリング容器が設けられ、前記第１の発光測定容器は、前記培養液を前記フィルタリング容器内でろ過して得られるろ液をその中に含み、
前記第２の発光測定容器は、前記培養液中の菌体外ＡＴＰを消去したあとの菌体から得られる生菌由来のＡＴＰ抽出液をその中に含み、
さらに、前記第１の発光測定容器内の前記ろ液及び前記第２の発光測定容器内の前記ＡＴＰ抽出液のＡＴＰ発光計測を行う計測部と、前記菌体の前記薬剤への感受性の有無を判定する判定部と、を有する試験装置と、を備える薬剤感受性試験システムであって、
前記計測部は、前記第２の発光測定容器内の前記ＡＴＰ抽出液中の生菌由来のＡＴＰ発光量と、前記第１の発光測定容器内の前記ろ液中の死菌由来のＡＴＰ発光量と、を計測し、
前記判定部は、前記生菌由来のＡＴＰ発光量と、前記ろ液中の死菌由来のＡＴＰ発光量と、の間の発光量比に基づいて、前記菌体の前記薬剤への感受性の有無を判定する、ことを特徴とする、前記薬剤感受性試験システム。
請求項１に記載の薬剤感受性試験システムであって、
前記判定部は、前記ろ液に含まれる遊離ＡＴＰの発光量を前記死菌由来のＡＴＰ発光量として前記判定を行う、ことを特徴とする、前記薬剤感受性試験システム。