JP2023085456A - 標的の検出 - Google Patents

Abstract

【課題】標的を検出するための方法およびカートリッジの提供。【解決手段】標的を検出するための方法およびカートリッジが、提供される。生物学的サンプルが、カートリッジに導入される。サンプル内の標的が、カセット内で第１の液体層内の蛍光粒子を用いて光子標識される。光子標識標的が、カセット内でサンプルから第２の液体層の中に分離され、検出され、そして対象内の標的の存在を示すように計数される。カートリッジは、受容リザーバと、サンプルを光子標識および磁性粒子に導入するための混合ウェルと、サンプルから標的を検出および計数するための撮像ウェルとを含む。サンプルは、ヒト糞便サンプルであり得る。フィルタが、サンプルから粒子状物質を除外するために使用され得る。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、それぞれの内容が、参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる、２０１８年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／６６０，０７５号および２０１８年７月３０日に出願された米国仮出願第６２／７１１，７８４号の利益および優先権を主張する。
技術分野
本発明は、概して、微生物および分子の分析ならびに検出に関する。

発明の背景
微生物および分子を検出することは、人間医学、獣医学、農業、工業微生物学、および科学研究における重要な用途の基礎となる。感染性疾患診断は、微生物の検出が中心的役割を果たす、１つの重要な分野である。

ある範囲の病原体によって引き起こされる感染性疾患は、死亡の主要な原因である。例えば、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、任意の他の病原体よりも致命的な院内感染を引き起こす、微生物に関するＣＤＣの緊急脅威レベルカテゴリの最上位にある。クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）は、推定４５０，０００件の感染症、２９，０００件の死亡、および米国で１年あたり医療コストにおいて１～６０億ドルの原因となる。クロストリジウム・ディフィシレ感染症は、偽膜性大腸炎、中毒性巨大結腸、多臓器不全、および死亡につながり得る、重度の下痢を引き起こす。残念ながら、クロストリジウム・ディフィシレに関する検出の従来の方法は、感度および特異性が欠けている。

クロストリジウム・ディフィシレは、入院患者において５０％もの高コロニー形成率を伴う一般的な片利共生グラム陽性胞子形成嫌気性腸内微生物である。殆どの感染患者は、その休眠および良性胞子形態でクロストリジウム・ディフィシレを抱えている。微生物胞子が、増殖し、他の腸内微生物が抗菌剤によって排除されるときに起こる腸内代謝産物の変化によって猛毒になるように誘導され得るため、抗生物質を服用している患者は、クロストリジウム・ディフィシレ感染症の危険性がより高い。猛毒の毒素原性クロストリジウム・ディフィシレ株は、毒素Ｂおよび毒素Ａを含む、細胞変性毒素を分泌する。感染症がないコロニー形成された患者は、糞便内の毒素のレベルに基づいて、クロストリジウム・ディフィシレ感染症がある患者と区別されることができる。クロストリジウム・ディフィシレ感染症がある患者は、コロニー形成された非感染患者よりも高いレベルの毒素Ｂを有する。

高速商業用免疫学的検定が、糞便サンプル内のクロストリジウム・ディフィシレ毒素を検出するために利用可能であるが、臨床閾値を有意に上回る数ｎｇ／ｍｌの分析感度を有することに起因して、全てのクロストリジウム・ディフィシレ感染患者を検出するために十分に臨床的に敏感ではない。至適基準である細胞毒性中和検定（ＣＣＮＡ）に基づく、より敏感な検査が、商業的に利用可能であるが、遅く（結果に関して１～３日かかる）、主観的であり得、日常的臨床使用のためには高価すぎる。

現在の高速免疫学的検定検査と対照的に、核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）は、高臨床感度を有する。しかしながら、それらの検査は、クロストリジウム・ディフィシレゲノムの存在を検出するが、クロストリジウム・ディフィシレ胞子を良性にコロニー形成される患者と、クロストリジウム・ディフィシレ感染症を有する患者とを区別することができない。重度の下痢がある患者のみが、クロストリジウム・ディフィシレ感染症に関して検査されるべきであるが、病院内の多くの患者が、便秘薬、薬物反応、およびウイルス感染症等の他の原因に起因して、下痢を有する。それらの患者の有意な割合が、良性胞子形態のクロストリジウム・ディフィシレをコロニー形成され、活動性感染症を有していない。故に、そのような患者からのサンプルが、偽陽性結果を生じさせる。したがって、臨床的に敏感であるが、核酸ベースの検定は、臨床的特異性が欠け、比較的に不良な陽性予測値を有する。

毒素免疫学的検定から核酸ベースの検定に切り替えた病院は、部分的に、コロニー形成されたが感染していない患者からの偽陽性の増加に起因して、５０～１００％のクロストリジウム・ディフィシレ感染症診断率の増加を経験している。偽陽性は、患者が不必要な抗生物質療法を受ける可能性が高いため問題であり、抗生物質療法は、実際に、非感染患者においてクロストリジウム・ディフィシレ感染症を発症させる危険性を増加させる。偽陽性はまた、病院にとって財政的負担も増加させ得る。
利用可能な高速毒素免疫学的検定の比較的に低い感度および核酸ベースの検査の臨床的特異性の欠如は、現在の市場を、コロニー形成された患者を活動性クロストリジウム・ディフィシレ感染症がある患者と区別する、高臨床感度および特異性を伴うＣＤＩ診断検査が１つもない状態にしている。

発明の要旨
本発明は、最小限のサンプル調製を要求する、サンプル内の微生物およびバイオマーカを検出するための方法およびデバイスを提供する。臨床医が、所望の臨床被分析物（または標的）の検出のために、サンプルを取得し、それをカートリッジ内に直接入れる。

本発明のある実施形態は、サンプル内の標的微生物の高速、敏感、かつ正確な計数（カウント）のために有用である、標的微生物の検出のための方法、デバイス、およびキットを対象とする。本発明の一側面では、サンプル内の標的微生物の存在を判定するための方法が、提供される。例えば、標的微生物は、クロストリジウム・ディフィシレまたはその成分であり得、検出は、対象がクロストリジウム・ディフィシレ感染症を有するかどうかを判定する。本方法は、クロストリジウム・ディフィシレまたは毒素Ａもしくは毒素Ｂ等のその成分の存在に関して、対象からの糞便サンプルを検査するステップを含む。例えば、本発明の方法のある実施形態は、糞便サンプルを使用する３０分のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査に関しては４５ｐｇ／ｍｌの分析感度、および糞便サンプルを使用する３０分のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ検査に関しては３６５ｐｇ／ｍｌの分析感度を有することができる。したがって、本発明は、標的微生物の高速で敏感な検出を提供する。

本発明の方法およびデバイスは、最小限のサンプル調製を要求し、それによって、微生物の検出および分析と関連付けられる時間ならびにコストを節約する。例えば、糞便サンプルを使用して、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａおよび毒素Ｂに関して検査するとき、サンプル調製は、単に検定緩衝剤内で糞便を希釈することを伴うことができ、これは、次いで、検定試薬を添加する前に大型粒子状物質を除去するように、ナイロンメッシュフィルタを通して通過される。単純なサンプル調製、洗浄ステップの欠如、および試薬の段階的添加の排除は、他の検査方法と比較して、有意な実践時間を排除し、コストを低下させ、計装を単純化する。

本発明の方法は、標的を検出および計数（カウント）することを対象とする。標的は、検出されるべき実体である。例えば、本発明の方法は、細胞、タンパク質、核酸、および炭水化物を検出するために有用である。本願における実施例は、分泌される分子の検出を実証する。しかしながら、本発明は、バイオマーカ、ホルモン、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、核酸、および全細胞を含む、広範囲の分子および細胞を検出するために有用である。

本発明は、標的結合光子および磁気標識を用いて標的をタグ付けすることによって、それらを検出および計数することができる。実施例として、対象によって取得される液体サンプルが、底部に検出表面を伴う撮像ウェルを含有するカセットまたはカートリッジの中への導入後に分析される。撮像ウェルの底面は、密度剤と、光を吸収する染料とを含む、染料クッション試薬でコーティングされる。カートリッジはまた、結合剤、例えば、標的に特異的に結合する抗体でコーティングされる、磁性および蛍光粒子も含有する。液体サンプルが、添加されると、染料クッションは、溶解し、低密度の不透明水性層を形成する。磁性および蛍光粒子ならびにサンプルは、上側検定層を形成する。標的は、検定層内の蛍光および磁気標識に結合する。カートリッジは、染料クッション層を通して磁性粒子の全てを引き寄せ、撮像ウェルの検出表面上に磁性粒子を堆積させる、磁石にわたって設置される。磁性粒子および蛍光粒子に結合される標的もまた、撮像表面上に堆積され、撮像および計数されることができる。染料クッションは、検出表面からサンプルおよび非結合蛍光標識を光学的に隔離するように機能する。これは、サンプルが撮像されるときに信号対雑音レベルを大いに改良し、それによって、ユーザによるサンプル調製および洗浄ステップの必要性を最小限にする、または排除することができる。

いくつかの実施例では、サンプルは、ヒト糞便サンプルであり、またはヒト糞便に由来し、標的は、クロストリジウム・ディフィシレ等の病原体である。例示的標的は、クロストリジウム・ディフィシレによって分泌される毒素Ａおよび毒素Ｂを含む。別の実施例では、標的は、炭疽菌から分泌される致死性毒素のサブユニットである、致死因子を含む。当業者は、本開示の考慮に応じて明白である、多数の付加的標的を認識している。

いくつかの実施形態では、検出ステップはさらに、標的を計数するステップを含む。着目標的が、蛍光標識標的の蛍光粒子からの蛍光を観察することによって、検出表面上で検出および計数される。検出するステップは、デジタル撮像を含む。デジタル撮像は、蛍光粒子を照明すること、および光電子アレイ検出器上で蛍光粒子から放射される信号を検出することを含む。任意の好適なデジタル撮像デバイスが、使用されてもよい。ある実施形態では、検出は、５倍を上回る光学倍率を採用しないか、またはいかなる倍率も採用しない。いくつかの実施形態では、本方法のステップは、カセットまたはカートリッジを使用して実施される。カートリッジは、蛍光粒子および磁性粒子を事前装填される。カートリッジは、ユーザがサンプルを導入する、受容リザーバと、混合ウェルと流体連通する撮像ウェル内に提供される染料クッションおよび検出表面と、相互と並列である複数の対合撮像ウェルおよび混合ウェルセットとを含む。カートリッジはまた、サンプルからカートリッジ内の流体流を遮断し得る大型粒子状物質等の粒子状物質を濾過する、フィルタを含むこともできる。

本発明のある側面は、カセット内の複数のチャネルと並行して検定を実施するステップを対象とする。第１のチャネルは、サンプル検出を含む。第２のチャネルは、陽性対照を含む。陽性対照は、既知量の着目標的が導入される、陽性対照サンプル内の標的を検出および計数することを含む。第３のチャネルは、中和対照を含む。中和対照は、着目標的を隔離し、それによって、標的の蛍光標識を防止する中和結合剤が、導入される、中和対照サンプル内の標的を検出および計数することを含む。本方法はさらに、中和対照から検出される信号に対するサンプルからの検出信号の比を計算するステップを含む。本方法はさらに、比が閾値を超えるかどうかを判定するステップを含む。

ある実施形態では、光子標識は、蛍光粒子、フルオロフォア、化学発光剤、生物発光剤、共鳴光散乱粒子、光吸収もしくは発色シグナリング剤、量子ドット、または上方変換蛍光体を含むことができる。

ある実施形態では、粒子試薬が、着目標的またはその成分に結合する結合分子に結合される。結合分子の実施例は、抗体もしくはその抗原結合断片またはアプタマーを含む。ある実施形態では、着目標的は、クロストリジウム・ディフィシレから分泌される毒素Ａおよび毒素Ｂ等の病原体から分泌される毒素である。

本発明のある側面は、カセットまたはカートリッジを対象とする。カートリッジは、ユーザがサンプルを導入する、受容リザーバを備える。カートリッジはまた、サンプルを蛍光粒子および磁性粒子に導入するための混合ウェルと、サンプルから標的を検出および計数するための撮像ウェルとを備えることもできる。撮像ウェルは、混合ウェルと流体連通する。本発明のいくつかの実施形態では、カートリッジはさらに、相互と並列である複数の対合撮像ウェルおよびサンプルウェルセットを備える。カートリッジはさらに、混合および検出の前にサンプルから粒子状物質を濾過するためのフィルタを備える。

撮像ウェルはさらに、染料クッションと、検出表面とを備える。染料クッションは、検出表面から離れるように非結合サンプルおよびサンプル内の非結合蛍光粒子を保持する密度媒体と、サンプル内の非結合蛍光粒子からの光の透過に干渉する染料とを含む。磁場が、染料クッションを横断して印加されるとき、磁場は、染料クッションを通して磁性粒子を検出表面に引動する。いくつかの実施形態では、染料クッションは、サンプルによって湿潤されるまで、カートリッジ内の撮像ウェル内に乾燥または凍結乾燥状態で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、染料クッションは、カートリッジ内で乾燥形態であり、サンプルを提供することは、乾燥形態の染料クッションを水和する。

本発明のいくつかの実施形態では、カートリッジはさらに、既知量の標的を伴う陽性対照サンプルを備える。いくつかの実施例では、カートリッジは、サンプルと、標的に結合して複合体形成を低減させる自由結合分子とを含む、中和対照サンプルを含む。

ある側面では、本発明の方法はさらに、陽性対照サンプル内の標的を検出および計数するステップを含み、陽性対照は、既知量の標的を含む。例えば、ある実施形態では、本方法はさらに、サンプルと、既知量の標的とを含む、陽性対照サンプルを用いて、ステップを繰り返すステップを含む。本方法はまた、サンプルと、標的に結合して複合体形成を低減させる自由結合分子とを含む、中和対照サンプルを用いて、ステップを繰り返すステップを含んでもよい。本方法はまた、陽性および中和対照の両方を実施するステップを含むこともできる。本方法は、サンプルから計数される標的が、中和対照サンプルから計数される標的の閾値を超えるかどうかを判定するステップを含んでもよい。本方法は、中和対照サンプルから計数される標的に対するサンプルから計数される標的の比が閾値を超えるかどうかを判定するステップを含んでもよい。本方法はまた、陽性対照サンプルから計数される標的が閾値を超えるかどうかを判定するステップを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、小分子標的の検出を可能にし得る、競合形式で実行される。そのような実施例では、磁性粒子および蛍光粒子は、相互に結合して複合体を形成し、標的は、形成される複合体の数を削減するために、磁性粒子または蛍光粒子のうちの１つに結合する。

ある側面では、本発明は、蛍光粒子、磁性粒子、および液体密度試薬または乾燥密度試薬を含む、キットを提供する。蛍光粒子および磁性粒子は、サンプル内の着目標的に結合し、標的の複合体を形成する。本キットはまた、競合検定のために調合されてもよく、蛍光粒子および磁性粒子は、相互に結合して複合体を形成し、標的は、蛍光粒子または磁性粒子のいずれかに結合し、形成される粒子の複合体の数を削減する。本キットはさらに、自由結合剤および／または既知量の標的を含んでもよい。本キットはさらに、検出表面を伴うカートリッジ、複数のカートリッジ、または対照検査の実施を可能にするための複数のウェルを伴うカートリッジを含んでもよい。ある実施形態では、液体密度試薬または乾燥密度試薬は、カートリッジ内に貯蔵される。本キットはさらに、液体密度試薬もしくは乾燥密度試薬内に配置される染料、または染料クッションを含んでもよい。ある実施形態では、染料は、蛍光粒子へ、またはそこからの光の透過に干渉する。ある実施形態では、光子標識は、蛍光粒子、フルオロフォア、化学発光剤、生物発光剤、共鳴光散乱粒子、光吸収もしくは発色シグナリング剤、量子ドット、または上方変換蛍光体を含む。他の実施形態では、蛍光粒子および磁性粒子は、着目標的またはその成分に独立して結合する、結合分子に結合される。結合分子の実施例は、抗体もしくはその抗原結合断片またはアプタマーを含む。標的の例示的成分は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａまたは毒素Ｂ等の分泌される成分である。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
標的を検出するための方法であって、
分析のために生物学的サンプルをカセットに直接導入するステップと、
前記カセット内で第１の液体層内の光子標識を用いて前記サンプル内の標的を標識するステップと、
前記カセット内で前記サンプルから第２の液体層の中に光子標識標的を分離するステップと、
前記第２の層内の前記光子標識標的を検出するステップと、
を含む、方法。
（項目２）
前記標的は、細胞、ウイルス、および分子から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記分子は、タンパク質、核酸、炭水化物、および糖から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記光子信号は、蛍光である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記光子標識は、蛍光粒子またはフルオロフォアである、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記標的は、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａおよび毒素Ｂのうちの少なくとも１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記標的は、炭疽菌細胞によって分泌されるバイオマーカを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記バイオマーカは、致死因子である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記標的は、磁性粒子を用いて標識される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記標的は、磁性粒子および光子標識を用いて標識される、項目２に記載の方法。
（項目１１）
前記光子標識は、蛍光粒子である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第１および第２の層は、異なる密度を有する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記標的は、微生物である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
光子標識は、１つまたはそれを上回る標的に結合する、蛍光標識抗体もしくはその断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記分離するステップは、
磁性粒子を前記サンプルに導入し、標的に結合することと、
磁場を印加し、前記サンプルから磁性粒子結合標的を分離することと、
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記磁性粒子は、着目標的に結合する抗体を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第２の液体層は、染料クッションであり、前記染料クッションは、
密度剤と、
光を吸収する染料と、
を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記カセットは、標的特異的蛍光粒子および磁性粒子を事前装填される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記カセットはさらに、
ユーザが前記サンプルを導入する、受容リザーバと、
混合ウェルと流体連通する撮像ウェル内に提供される染料クッションおよび検出表面と、
相互と並列である複数の対合撮像ウェルおよび混合ウェルセットと、
を備える、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記カセットはさらに、前記サンプルから粒子状物質を濾過するフィルタを備える、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記検出するステップは、前記光子標識標的からの光子信号を観察することによって、検出表面上の標的を検出および計数することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記検出するステップはさらに、デジタル撮像を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記デジタル撮像は、前記検出表面上の蛍光粒子を照明すること、および光電子アレイ検出器上で前記蛍光粒子から放射される前記信号を検出することを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記カセット内の複数のチャネルと並行して前記方法を実施するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
第１のチャネルは、前記サンプル内の前記標的を検出するための試薬を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
第２のチャネルは、前記サンプルが内因性標的を含有しない場合でさえも、前記サンプル内の前記標的検出が効果的であることを実証するための陽性対照試薬を加えた、前記第１のチャネルと共通する前記試薬を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記陽性対照は、既知量の着目標的が導入される、陽性対照サンプル内の標的を検出および計数することを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
第３のチャネルは、中和対照を備える、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記中和対照は、着目標的を隔離し、それによって、前記標的の光子標識を防止する中和結合剤が導入される、中和対照サンプル内の標的を検出および計数することを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記中和対照から検出される信号に対するサンプルからの検出信号の比を計算するステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記比が閾値を超えるかどうかを判定するステップをさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記サンプルは、ヒト糞便サンプルであるか、またはヒト糞便に由来する、項目１に記載の方法。
（項目３３）
カートリッジであって、
ユーザがサンプルを導入する、受容リザーバと、
前記サンプルを光子標識および磁性粒子に導入するための混合ウェルと、
前記サンプルから標的を検出および計数するための撮像ウェルと、
を備える、カートリッジ。
（項目３４）
前記光子標識は、着目標的に結合する、蛍光標識抗体もしくはその断片を含む、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３５）
前記磁性粒子は、着目標的に結合する、抗体もしくはその断片を含む、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３６）
混合および検出の前に前記サンプルから粒子状物質を濾過するためのフィルタをさらに備える、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３７）
前記撮像ウェルは、前記混合ウェルと流体連通する、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３８）
前記撮像ウェルはさらに、染料クッションと、検出表面とを備える、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目３９）
前記染料クッションは、
密度剤と、
光を吸収する染料と、
を含む、項目３８に記載のカートリッジ。
（項目４０）
前記カートリッジはさらに、既知量の標的を伴う陽性対照サンプルを備える、項目３３に記載のカートリッジ。
（項目４１）
中和結合剤を伴う中和対照サンプルをさらに備える、項目３３に記載のカートリッジ。

図１は、本発明の方法の例示的実施形態のフローチャートである。 図２は、本発明の方法の例示的実施形態を示す。 図３は、本発明による、カートリッジの例示的実施形態を示す。 図４は、本発明で使用するための器具の例示的実施形態を示す。 図５は、本発明の概略表現を示す。 図６は、毒素Ｂ分子によって磁性粒子に連結され、染料クッションを通して引き寄せられ、検出表面上に堆積された、個々の微視的蛍光粒子を示す、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査からの非拡大画像を示す。 図７は、検定の容器内の染料およびクッションが洗浄ステップの必要性を排除する様子を描写する図である。 図８は、非結合蛍光粒子から背景を排除するための染料およびクッションの有効性を実証する、染料の有無別のクッション層に重なる非結合粒子を含有する、ウェルの画像を示す。 図９は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の分析感度を描写する。 図１０は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の検定精度プロファイルを描写する。 図１１は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の用量応答およびダイナミックレンジを描写する。 図１２は、臨床サンプルを使用するクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査において陽性と呼ぶための閾値のグラフ表現である。 図１３は、臨床サンプルを使用するクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の結果を描写する。 図１４は、毒素Ａ性能（ＦｏＤ）を示す。 図１５は、磁性粒子および蛍光粒子の抗体対に関する毒素Ａ臨床サンプル検査を示す。 図１６は、磁性粒子および蛍光粒子の抗体対に関する毒素Ａ臨床サンプル検査を示す。 図１７は、毒素Ａを使用する、新鮮臨床サンプルのためのプレートを使用するデータのプロットを示す。 図１８は、毒素Ｂを使用する、新鮮臨床サンプルのためのプレートを使用するデータのプロットを示す。 図１９は、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）毒素Ｂの検出のために使用される技術を示す。 図２０は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出のために使用される技術を示す。 図２１は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出のために使用される技術を示す。 図２２は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出のためのプラットフォームワークフローを示す。 図２３は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出に関する分析結果を示す。 図２４は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出に関する分析結果を示す。 図２５は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出に関する分析結果を示す。 図２６は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素致死因子の検出に関する検定概観を示す。 図２７は、炭疽菌毒素致死因子の検出のためのワークフローを示す。 図２８は、炭疽菌毒素致死因子の検出に関する結果を示す。 図２９は、炭疽菌毒素致死因子の検出に関する非混入および混入サンプルの集団の信号の分布を示す。 図３０は、炭疽菌毒素致死因子の検出に関する動的範囲結果を示す。 図３１は、サンプル調製または洗浄ステップを伴わない標的を検出するステップを示す。 図３２は、炭疽菌検査（Ａｈｔｈｒａｘ Ｔｅｓｔ）の分析性能を示す。 図３３は、炭疽菌検査の実施例１を示す。 図３４は、炭疽菌検査の実施例２を示す。 図３５は、実施例２でＮＨＰ吸入炭疽菌サンプルを検査するステップを示す。 図３６は、カートリッジ内のＡＳＴワークフローを示す。 図３７は、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＦＩＳＨとの従来のＦＩＳＨの比較を示す。 図３８は、マイクロタイタプレート内の研究である、ＵＴＩ ＩＤ検査を示す。 図３９は、ＵＴＩ病原体に関する高分析感度を示す。 図４０は、マイクロタイタプレート内の研究である、ＵＴＩ ＡＳＴ検査を示す。 図４１は、ＵＴＩ ＡＳＴ正確度を示す。 図４２は、可変接種レベルに対するＭｕｌｔｉＰａｔｈ高速ＡＳＴロバスト性を示す。 図４３は、高速ＡＳＴ結果への多菌性サンプルの影響を示す。 図４４は、ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴからの結果を示す。 図４５は、オプション１ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴ概要を示す。 図４６は、ＦＩＳＨプローブ包括性を示す。 図４７は、ＦＩＳＨプローブ排他性を示す。 図４８は、例示的プラットフォームカートリッジを示す。

詳細な説明
本発明の方法およびデバイスは、単純な光学機器、最小限のサンプル調製、および迅速な検査所要時間を用いて、個々の標的を列挙する。本発明は、複合体サンプル内の有益な標的を超敏感に検出することができる。例えば、これは、最小限に処理された糞便サンプル内で直接、低レベルの疾患を引き起こすクロストリジウム・ディフィシレ毒素を検出することができる。別の実施例として、本発明の方法およびデバイスは、炭疽病を引き起こす低濃度の毒素を検出するために使用されることができる。

本発明の方法を使用する、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂに関する検定は、毒素Ｂに関して極めて敏感であり、クロストリジウム・ディフィシレ毒素検査の規制当局の認可に使用される、ＣＣＮＡ基準方法と同等の性能を実証する。糞便サンプルにおける３０分のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の分析感度は、高い、例えば、４５ｐｇ／ｍｌであることが見出され、糞便サンプルにおける３０分のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａ検査の分析感度は、３６５ｐｇ／ｍｌであることが見出される。また、検査された臨床サンプルの正確度は、敏感な基準方法である、細胞毒性検定のものに匹敵する。

本発明の方法およびデバイスは、最小限のサンプル調製を要求し、それによって、微生物の検出および分析と関連付けられる時間およびコストを節約する。染料クッションの使用は、染料クッションが、検出表面からサンプルおよび非結合蛍光粒子を光学的に隔離するため、最小限のサンプル処理を伴う検出を可能にする。具体的には、本発明の方法の準備は、単に検定緩衝剤内で糞便を希釈し、ナイロンメッシュフィルタを通して通過させ、検定試薬を添加する前に大型粒子状物質を除去するステップを伴う。単純なサンプル調製、洗浄ステップの欠如、および試薬の段階的添加の排除は、他の検査方法と比較して、有意な実践時間を排除し、コストを低下させ、計装を単純化する。

図１は、標的を検出するための方法１０１の略図である。方法１０１は、好ましくは、感染症がある患者からの糞便サンプル等の着目標的を含有する疑いがあるサンプルを取得するステップを含む。サンプルは、本明細書のステップに従った処理のために、収集管、ウェル、リザーバ、またはカートリッジの中に送達されてもよい１０７。例えば、糞便サンプルが、収集カップを使用して患者によって収集され、臨床医に送達されてもよい。サンプルは、凍結されてもよい。臨床医は、１ｍＬプラスチック目盛り付き移送ピペット等の使い捨てピペットを使用し、サンプルの一部を検査デバイスまたはカートリッジの受容リザーバの中に移送してもよい１０７。本方法はさらに、糞便サンプルが、粒子状物質の高い潜在性を有するため、サンプルを濾過するステップ１０９を含んでもよい。サンプル内の標的の存在を識別または検出するために、方法１０１は、サンプルを、特定の標的のみに結合する蛍光粒子および磁性粒子と混合するステップ１１３を含む。例えば、蛍光粒子および磁性粒子は、細胞、タンパク質、核酸、炭水化物、および糖から選択される標的に独立して結合する、分子に結合されてもよい。実施例では、標的は、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａおよび毒素Ｂのうちの少なくとも１つを含む。実施例では、標的は、炭疽菌から分泌される致死性毒素のサブユニットである、致死因子を含む。方法１０１はさらに、サンプルから、結合された、および結合されていない、磁性粒子を分離するステップ１２９を含む。標的に結合された磁性粒子が、サンプルの残部から分離される。磁性粒子に結合された標的はまた、蛍光粒子にも結合されるであろう。したがって、標的が、存在する場合、標的は、磁性粒子および蛍光粒子に結合され、サンプルの残部から分離されるであろう。方法はさらに、標的に結合された蛍光粒子からの蛍光を観察することによって、標的を検出１３５および計数するステップを含む。

図２は、本発明による、方法を示す。方法は、標的結合光子および磁気標識を用いて標的をタグ付けすることによって、それらを検出および計数する。実施例として、対象によって取得される液体サンプルが、底部に検出表面を伴う撮像ウェルを含有するカセットまたはカートリッジの中への導入後に分析される。撮像ウェルの底面は、密度剤と、光を吸収する染料とを含む、染料クッション試薬でコーティングされる。カートリッジはまた、結合剤、例えば、標的に特異的に結合する抗体でコーティングされる、磁性および蛍光粒子も含有する。液体サンプルが、添加されると、染料クッションは、溶解し、低密度の不透明水性層を形成する。磁性および蛍光粒子ならびにサンプルは、上側検定層を形成する。標的は、検定層内の蛍光および磁気標識に結合する。カートリッジは、染料クッション層を通して磁性粒子の全てを引き寄せ、撮像ウェルの検出表面上に磁性粒子を堆積させる、磁石にわたって設置される。磁性粒子および蛍光粒子に結合される標的もまた、撮像表面上に堆積され、撮像および計数されることができる。染料クッションは、検出表面からサンプルおよび非結合蛍光標識を光学的に隔離するように機能する。これは、サンプルが撮像されるときに信号対雑音レベルを大いに改良し、それによって、ユーザによるサンプル調製および洗浄ステップの必要性を最小限にする、または排除することができる。

図２は、印加された磁場を使用して、密度勾配媒体を通して標的を引動することによって、非結合蛍光粒子および残留サンプルから分離されている磁性粒子結合標的を示す。密度媒体は、分離するステップが、染料クッションにわたって磁性粒子結合標的を分配することと、磁場を使用して、染料クッションを通して撮像表面上に結合標的を引動し、染料クッションの表面上に非結合プローブを残すこととを含み得るように、描かれるように管またはウェル内に供給されてもよい（および「染料クッション」を提供するための染料を含んでもよい）。検出するステップは、次いで、デジタル撮像を使用して、撮像表面を撮像するステップを含んでもよい。したがって、示されるように、混合するステップは、サンプルを着目標的に結合する磁性粒子に暴露することを含み、分離するステップは、磁場を使用して、非結合標識から離れるように結合標的を引動することを含む。好ましくは、分離するステップは、染料クッションの表面にわたって磁性粒子結合標的を分配することと、磁場を使用して、染料クッションを通して撮像表面上に結合標的を引動し、染料クッションの表面上に非結合標識を残すこととを含む。

議論されるように、分離の実施形態は、染料クッションを提供するための染料と、密度剤とを含み得る、密度勾配媒体染料クッションを利用する。染料クッション８０３は、密度剤（イオジキサノール等）と、光吸収染料とを含んでもよい。光を吸収する染料をさらに含む、染料クッションは、随意に、サンプルへの暴露に先立って乾燥または凍結乾燥されてもよい。染料クッションは、サンプルおよび検定試薬を含有する検定層よりも高い密度である、水性層を形成する。染料クッションは、例えば、スクロース、ジアトリゾ酸塩、イオジキサノール（別名ＯｐｔｉＰｒｅｐ）、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ、またはアルブミンを含む、種々の密度剤を単独で、または組み合わせて（かつ種々の濃度において）含むことができる。実施形態はまた、ジアトリゾ酸ナトリウム、他の糖、オリゴ糖、合成ポリマー（例えば、フィコール）、および臭化カリウム等の種々の塩、ならびにその他等の他の一般的に使用されている密度剤を含む、他の密度剤を組み込むこともできる。実施形態は、光子検出のための異なる種々の励起および放射体制ならびに使用時の光子標識の対応する光子シグナリング特性に合致するための染料を使用してもよい。例えば、染料トルイジンブルーＯが、蛍光標識テキサスレッド（スルホローダミン）と併用され得る。一実施形態は、検定ウェルの中にピペット採取された５％ｗ／ｖのトレハロースを加えた、２ｍｇ／ｍＬのクロモトロープＲ２および１０％ｖ／ｖのＯｐｔｉＰｒｅｐ（イオジキサノールの６０％ｗ／ｖ溶液）である、染料クッション試薬の６５μＬアリコートを使用する。染料クッションは、９６ウェル半面積直径の透明底部黒色プレート内に、またはカートリッジの撮像ウェルの中に事前等分される、１５％のＯｐｔｉＰｒｅｐおよび５ｍｇ／ｍＬのクロモトロープＲ２であってもよい。ウェル９１５を参照すると、染料クッション９０３は、任意の随意の染料を含む、イオジキサノールまたはポリビニルピロリドンの溶液を調製し、そこでウェル９１５内の溶液を乾燥または凍結乾燥させ、染料クッション９１５を形成することによって、形成されることができる。染料クッション９１５は、次いで、本質的に固体であろう（例えば、乾燥される、例えば、ウェル９１５は、使用するまで上下逆を含む任意の配向で貯蔵されることができる）。液体サンプルが、ウェル９１５の中に送達されるとき、液体は、染料クッション８０３を再水和する。実際に、本方法で使用するための本明細書の全体を通して開示および議論される試薬は、以降の使用のために乾燥または凍結乾燥形態で提供されてもよい。これは、試薬が、調製され、カートリッジ上に乾燥して装填されることを可能にし、これは、次いで、出荷または貯蔵され、本開示の方法で後に使用されてもよい。

微生物および分子を検出するための方法およびデバイスのある実施形態が、標的特異的抗体に結合される磁性粒子を使用する。

図３は、本方法を実施するために有用なカセットまたはカートリッジ９０１の一実施形態を示す。カートリッジ９０１は、混合ウェル９１１を含む。潜在的に着目標的２０１を含むサンプルが、混合ウェル９１１の中に送達される。サンプルは、混合ウェル９１１に送達される前に、フィルタ９５５を通して通過してもよい。サンプルは、粒子状物質を含む糞便サンプルであってもよい。フィルタを通してサンプルを通過させることは、カートリッジを詰まらせる危険性を低減させるであろう。０．４５ミクロン膜フィルタ、０．４５ｐｍニトロセルロースフィルタ、０．６５μｍニトロセルロースフィルタ、または０．６μｍポリカーボネートフィルタ等の任意の好適なフィルタが、使用されてもよい。

カートリッジ９０１はまた、着目標的に結合する磁性粒子６０５と、検出表面８０５に隣接する染料クッションとを含む。磁場が、染料クッション８０３を横断して印加されるとき、磁場は、染料クッションを通して磁性粒子６０５を透明壁に引動する。染料クッション８０３は、非結合蛍光粒子２００からの光を吸収する染料をさらに含む、密度勾配媒体８０１の溶液を含む。描写される実施形態では、染料クッション８０３および透明壁等の検出表面８０５は、混合ウェル９１１と流体連通する撮像ウェル９１５内に提供される。染料クッション８０３は、サンプルによって湿潤されるまで、カートリッジ内の撮像ウェル内に乾燥または凍結乾燥状態で提供される。

示されるように、カートリッジは、相互と並列である複数の対合撮像ウェル／混合ウェルセットを含んでもよい。ここで、カートリッジ９０１は、各チャネルが、分割ウェル９０１、混合ウェル９１１、および撮像ウェル９１５を含む、８つの並列「チャネル」を含むものとして示される。カートリッジの実施形態は、付加的な８つのチャネルが８つの可視チャネルの背後にあろう（カートリッジが３次元物体である）ため、図４の図がほぼ同一に見えるであろうように、８つのチャネルの２つの集団を含んでもよい。カートリッジは、高さｈ、長さｌ、および幅ｗ等のその寸法に従って説明され得る（幅ｗは、図３ではページに対して垂直に測定される）。高さｈは、約３～１０ｃｍであってもよい。長さｌは、約５～１２ｃｍであってもよい。幅ｗは、約０．５～３ｃｍであってもよい。例えば、一実施形態では、ｈは、約６ｃｍであり、ｌは、約８ｃｍであり、ｗは、約２ｃｍである。

カートリッジ９０１は、好ましくは、ユーザがサンプルをカートリッジの中にピペット採取し得る、受容リザーバ９２５を含む。ある実施形態では、カートリッジ９０１は、それを通してチャネルを伴うガスケットを備える、摺動可能ゲート９３１を含む。ゲート９３１が、第１の位置に位置付けられるとき、受容リザーバ９２５は、少なくとも第１の分割ウェル９０７と流体連通する。ゲート９３１が、第２の位置にあるとき、受容リザーバ９２５、第１の分割ウェル９０７、および第１の混合ウェル９１１は全て、相互からシールされる。ゲート９３１が、第３の位置にあるとき、第１の分割ウェル９０７および第１の混合ウェル９１１は、相互と流体連通する。

カートリッジ９０１は、外部器具に結合し、そこから空気圧を受容し、受容リザーバ９２５からのサンプルを分割ウェル９２７の中に分割し（故に、「分割」）、続いて、分割ウェル９０７から対応する混合ウェル９１１の中に液体を通過させるための継手９３５を含んでもよい。

染料クッション８０３は、密度剤８０１と、光を吸収する染料とを含む。染料クッション８０３は、サンプルによって湿潤されるまで、カートリッジ内の撮像ウェル内に乾燥または凍結乾燥状態で提供されてもよい。

図４は、カートリッジ９０１内でサンプルの標的識別および分析を実施するための例示的器具１００１（例えば、分析器）を示す。器具１００１は、カートリッジ９０１と相互作用し、本発明によって伴われる方法１０１およびプロセスを実施するために使用されてもよい。器具１００１は、プロンプト、結果、報告１２９を表示するため、かつコマンドを受信するためのユーザインターフェース１００３（例えば、タッチスクリーン）を含むことができる。器具１００１は、複数のワークステーションを含んでもよい。器具は、カートリッジを輸送するためのカルーセル１００５と、処理および随意のインキュベーション機器を収納するための上側コンパートメント１００７と、電子機器、撮像、および空気圧式機器を収納するための下側コンパートメント１００９とを含んでもよい。器具１００１は、複数の分析カートリッジを受入および分類するための入力機構１０１３（例えば、装填ラックまたはトレイ）を含んでもよい。器具１００１はまた、カルーセル１００５と、器具内でカートリッジを移動させるためのプッシャ機構とを含んでもよい。器具１００１はまた、タスクスケジューラを含んでもよい。器具１００１は、好ましくは、分析カートリッジの操作、微生物識別および分析の実施、ならびに結果の発生を自動化するように、コンピュータによって制御される。器具１００１は、本発明の方法を実施するための複数のサブシステムを含んでもよい。

器具１００１のサブシステムは、空気圧式サブシステムと、磁気サブシステムと、クラムシェル加熱器と、撮像サブシステム１０２３とを含んでもよい。磁気サブシステムは、例えば、磁場Ｂを提供し、撮像のために分析カートリッジの検出表面上の磁性粒子および標的を引動するための永久磁石または電磁石を含んでもよい。撮像サブシステムは、標的の画像を捕捉するための米国特許第９，６４３，１８０号および第８，０２１，８４８号（両方とも参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明されるもの等、および器具１００１の撮像モジュールに対してカートリッジの検出表面を操作するためのステージであってもよい。撮像サブシステム１０２３は、画像処理、分析、および表示能力を提供するようにコンピュータと動作可能に関連付けられることができる。空気圧式サブシステムは、カートリッジ内のサンプルおよび試薬の移動を促すように動作可能であり得る。

いくつかの実施形態では、プッシャ機構（例えば、機械的コンベヤアーム）は、器具１００１内の種々のサブシステムの間でカートリッジ９０１を移動させるように動作可能であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、プッシャ機構は、カルーセル１００５と器具の種々のサブシステムとの間でカートリッジを移送する。プッシャ機構は、カートリッジをカルーセル１００５上に押動する、またはそこから引動する。カルーセル１００５は、回転してサブシステムのうちの別のものに隣接してカートリッジを位置付け、プッシャは、次いで、力を印加し、サブシステム上にカートリッジを摺動させてもよい。いくつかの実施形態では、器具は、器具１００１内の分析カートリッジを管理するためのタスクスケジューラを含む。タスクスケジューラは、複数のサブシステムの間の分析カートリッジのそれぞれの輸送および移送等の移動を制御するように動作可能である。いくつかの実施形態では、各カートリッジがサブシステム内で費やす時間もまた、タスクスケジューラによって管理されてもよい。タスクスケジューラは、分析カートリッジのそれぞれの分析のために、必要に応じて種々のサブシステム上の時間を確保してもよい。本発明のいくつかの実施形態では、タスクスケジューラは、カートリッジの内容物を識別することによって、カートリッジの移動（すなわち、実施されるべき分析のステップ／パラメータ）を管理してもよい。

いくつかの実施形態では、器具１００１はまた、カートリッジ上の一意の識別子（例えば、バーコード）を分析するように動作可能なリーダを含んでもよい。カートリッジの内容物および要求される処理は、カートリッジ上のバーコードと関連付けられてもよい。器具１００１は、リーダを介して一意のバーコードを読み取り、一意のバーコードをタスクスケジューラが実行するための命令の特定のセットと関連付けてもよい。器具は、好ましくは、本明細書に説明される動作を制御するための（例えば、インターフェース１００３内にあるか、またはそれに接続される）コンピュータを含む。コンピュータは、好ましくは、非一過性のメモリデバイスに結合されるプロセッサを含む。メモリは、好ましくは、本システムに器具１００１内の分析カートリッジを操作させるように、かつ標識微生物の画像を取得および処理させるように、プロセッサによって実行可能な命令を記憶する。

プロセッサは、処理動作を実施する、任意のデバイスまたはデバイスのシステムを指す。プロセッサは、概して、中央処理装置（ＣＰＵ）を提供するための単一コアまたはマルチコアチップ等のチップを含むであろう。プロセッサは、ＩｎｔｅｌまたはＡＭＤからのチップによって提供されてもよい。プロセッサは、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）によって商標ＸＥＯＮ Ｅ７の下で販売されているマイクロプロセッサ、またはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）によって商標ＯＰＴＥＲＯＮ １０２００の下で販売されているマイクロプロセッサ等の任意の好適なプロセッサであってもよい。

メモリは、機械可読形式でデータまたは命令を記憶する、デバイスまたはデバイスのシステムを指す。メモリは、コンピュータのプロセッサのうちの１つまたはそれを上回るものによって実行されると、本明細書に説明される方法または機能のうちのいくつかもしくは全てを遂行し得る、命令の１つまたはそれを上回るセット（例えば、ソフトウェア）を含んでもよい。好ましくは、コンピュータは、ソリッドステートドライブ、フラッシュドライブ、ディスクドライブ、ハードドライブ、サブスクライバ識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、光学および磁気媒体、その他、もしくはそれらの組み合わせ等の非一過性のメモリを含む。

入出力デバイスは、データを器具へのコンピュータの中または外に転送するための機構もしくはシステムである。例示的入出力デバイスは、ビデオディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）または陰極線管（ＣＲＴ））、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、バーコードスキャナ、リーダ、ディスクドライブユニット、信号発生デバイス（例えば、スピーカ）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、および、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ－Ｆｉカード、またはセルラーモデムであり得るネットワークインターフェースデバイスを含む。入出力デバイスは、ユーザが器具を制御し、結果を表示し、カートリッジの分析から取得される報告を発生させることを可能にするために使用されてもよい。

したがって、器具は、サンプルを着目標的に結合するために特異的な磁性粒子および蛍光粒子と混合するステップと、サンプルからサンプル内の結合および非結合磁性粒子を分離するステップであって、標的に結合された磁性粒子は、サンプルから分離する、ステップと、標的に結合された蛍光標識からの蛍光を観察し、サンプル内の標的の存在を示すことによって、標的を検出および計数するステップとによって、微生物を検出するための本発明の方法を実施するために、カートリッジと併用されてもよい。混合するステップは、好ましくは、サンプルを着目標的に結合する磁性粒子および蛍光粒子に暴露することを含む。検出するステップは、好ましくは、デジタル撮像を使用して、蛍光標識標的を撮像することを含む。

着目標的は、任意のタイプの細胞または分子であり得る。ある実施形態では、標的は、クロストリジウム・ディフィシレの毒素Ａおよび毒素Ｂのうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、標的は、炭疽菌から分泌される致死性毒素のサブユニットである、致死因子を含む。いくつかの事例では、標的は、病原体である。

本発明は、商業用免疫学的検定よりも敏感であり、細胞毒性中和検定（ＣＣＮＡ）よりも高速であり、核酸検査よりも特異的である、クロストリジウム・ディフィシレ毒素等の標的の検出のための方法およびキットを提供する。本技術は、単純な光学機器、最小限のサンプル調製、およびサンプルから回答の形式の迅速な検査所要時間を用いて、単一標的を列挙することができる。これはまた、クロストリジウム・ディフィシレ毒素検査の規制当局の認可に使用される、極めて敏感な毒素Ｂ細胞毒性検定基準方法との性能の等価性も実証する。

本発明は、複雑な患者サンプル内で直接、診断マーカの高速かつ敏感な検出のための新規の方法を提供する。下記に例示されるように、糞便サンプルにおける３０分のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の分析感度は、主要な酵素免疫測定法（ＥＩＡ）よりも１５倍敏感である、４５ｐｇ／ｍｌであることが見出される。また、検査された臨床サンプルの正確度は、ＣＣＮＡのものに匹敵する。一意の染料クッション形式は、検出表面からサンプルおよび非結合標識を光学的に隔離するため、最小限のサンプル処理を伴う検出を可能にする。具体的には、糞便は、単に、検定緩衝剤内で希釈され、検定試薬を添加する前に大型粒子状物質を除去するように、ナイロンメッシュフィルタを通して通過されることができる。単純なサンプル調製、洗浄ステップの欠如、および試薬の段階的添加の排除は、他のＥＩＡと比較すると、有意な実践時間を排除し、コストを低下させ、計装を単純化する潜在性を提供する。全体的に、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素および他の標的、例えば、微生物およびその成分の正確かつ敏感な検出のための有望な技術を特徴とする。

本発明は、広範囲の被分析物を急速かつ敏感に検出するその能力において一意である。限定ではないが、毒素、核酸、およびバイオマーカを含む、分子等の標的を検出することに加えて、本方法はまた、細胞病原体（細菌、真菌、および寄生虫）、ウイルス、ならびに診断的に重要なヒト細胞を検出および計数することもできる。本明細書に説明される方法は、診断的に有益なヒト細胞（例えば、好中球）、毒素（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ）、ウイルス（例えば、ノロウイルス）、およびバイオマーカ（例えば、サイトカイン）を含む、種々の被分析物に関して、単一のサンプルを同時に検査するために使用されることができる。

本発明を実行するための一般的な方法、キット、および分析器が、国際公開第ＷＯ０３／０３６２９０号、第ＷＯ０３／０７３８１７号、第ＷＯ２０１０／０３６８０８号、第ＷＯ２０１０／０３６８２７号、および第ＷＯ２０１０／０３６８２９号（それぞれの内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）に説明されている。

本発明の方法は、着目標的、例えば、微生物、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ、分泌される物質等のその細胞または成分、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａまたは毒素Ｂに結合し、複合体を形成する、標識粒子および磁性粒子を採用する。

複合体は、容器内の液体層内に入れられる、または形成される。本方法は、少なくとも２つの液体層を採用し、複合体は、最初に、クッション層によって容器の検出表面から分離される上を覆う層内に存在する。クッション層は、上を覆う層よりも高密度である。磁性粒子は、非結合であるか、複合体内にあるかどうかにかかわらず、容器の検出面積に隣接する検出ゾーン内に磁性粒子およびそれらに結合されたあらゆるものを堆積させるように、上を覆う層およびクッション層を通して磁力によって移動されることができる。非結合標識粒子、標的、および他のサンプル成分が、上を覆う層内に残留する。サンプル内の標的の量が、次いで、検出ゾーン内の標識粒子の数を計数することによって検出されることができる。ある実施形態では、クッションはさらに、上を覆う層内の非結合標識粒子からの信号発生および放射を遮断する染料を含むことができる。

本方法はまた、１つまたはそれを上回る対照を採用してもよい。例えば、本方法は、サンプルのアリコートが、複合体を形成するように、分泌される物質、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａまたは毒素Ｂ等の既知量の標的を混入される、陽性対照を採用してもよい。検定は、次いで、非混入サンプルと同様に完了される。陽性対照は、サンプル内の成分が検定の任意の部分を阻止しているかどうかを判定するために使用されることができる。陽性対照サンプルが、既知量の標的を含有するため、検出される標的の量は、混入される量に比例するべきである。検出される量が、予期されるものよりも有意に低い場合には、サンプルが検定に干渉していることが判定されることができ、サンプルの検定が、無効にされる。例えば、陽性対照内で検出される量が、予期される量の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５０％、またはある他の割合未満である場合、サンプルの検定は、無効にされ得る。当然ながら、より多くの標的が、混入よりもサンプル内に存在する場合、陽性対照は、予期されるよりも多くの量の標的を生じさせるであろう。そのようなサンプルは、次いで、無効にされない。

本方法は、代替として、または加えて、サンプルが、標識粒子および／または磁性粒子もしくは両方の結合に干渉する結合分子を混入される、中和対照を含んでもよい。添加された結合分子は、標識および磁性粒子上のものと同一であるか、または異なり得る。中和対照は、標的に特異的ではない背景計数を判定するために使用されることができる。本背景は、サンプル検定で検出される量から減算されることができる。代替として、中和サンプルからの量は、陽性結果を判定するための閾値を設定するために使用されることができる。例えば、検定サンプルが陽性と見なされるために、検出される標的の量は、閾値を上回る必要があり得る。代替として、または加えて、検定サンプルが陽性と見なされるために、中和対照からの信号に対する検定サンプルからの信号の比は、閾値を上回る必要があり得る（または反比は、閾値よりも低くある必要があり得る）。一実施例では、サンプル検定からの信号に対する中和対照からの信号の比は、陽性サンプルに関して、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、または０．４未満、例えば、０．５未満である。

さらに、検定は、サンプル調製を要求しない、または最小限のサンプル調製を要求する。本発明は、洗浄ステップを要求することなく、個々の標識標的の検出および列挙を採用することによって、高感度を実現しながら検査動作を単純化する。サンプル源は、広範囲に及び得る。ヒトサンプルは、例えば、尿、糞便、血液、血清、血漿、唾液、鼻汁、脳脊髄液、皮膚、創傷、および多くのその他を含むことができる。工業サンプルは、食品、飲料、および医薬品を含むことができ、環境サンプルは、水、空気、または表面サンプルを含むことができる。一実施形態では、例えば、クロストリジウム・ディフィシレまたは他の腸内微生物に関して、サンプルは、糞便サンプル（例えば、形成された、半ば形成された、もしくは形成されていない）または糞便に由来するサンプルである。例えば、糞便サンプルは、大型粒子状物質を除去するように希釈および濾過されてもよい。

標識粒子は、当技術分野で公知である任意の好適な粒子であってもよく、例えば、標識粒子は、ポリスチレン、ガラス、またはラテックスビーズ、もしくは量子ドットであってもよい。粒子は、任意の検出可能な部分、典型的には、フルオロフォア、化学発光剤、生物発光剤、共鳴光散乱粒子、光吸収もしくは発色シグナリング剤、量子ドット、または上方変換蛍光体等の光学的に検出可能な部分によって標識されてもよい。

代替として、粒子は、自然に、例えば、光学的に検出可能であり得る。例えば、粒子は、蛍光、吸収、光散乱、リン光、またはルミネセンスによって検出されてもよい。磁性粒子が、当技術分野で公知であり、常磁性および超常磁性粒子を含む。

標識粒子および磁性粒子は、１つの標的、例えば、バイオマーカまたは分子の複合体の形成に有利に働く量で提供されることができる。本量は、サンプル内で見出されるべき標的の予期される量または最大量に照らして、過剰な粒子を提供することによって判定されることができる。このように、本発明は、検出ゾーン内の標識粒子の数を判定することによって、サンプル内に存在する個々の標的の計数を可能にする。

結合分子が、当技術分野で公知であり、抗体もしくはその抗原結合断片またはアプタマーを含む。標的、例えば、微生物に応じて、結合分子はまた、細胞表面受容体またはマーカに結合する、リガンドもしくは他の化合物を含んでもよい。

染料クッションは、例えば、スクロース、ジアトリゾ酸塩、イオジキサノール（商標名Ｏｐｔｉｐｒｅｐ(登録商標)）、ＮａＣｌ、ＣｓＣｌ、Ｐｅｒｃｏｌｌ(登録商標)、メトリザミド、またはアルブミンを含む、種々の密度剤を単独で、または組み合わせて（かつ種々の濃度において）含むことができる。クッション層の密度は、任意の好適な値、例えば、少なくとも１．０１ｇ／ｍｌ、少なくとも１．０５ｇ／ｍｌ、少なくとも１．１ｇ／ｍｌ、少なくとも１．２ｇ／ｍｌ、少なくとも１．３ｇ／ｍｌ、またはより高くあり得る。層の密度はまた、均一または不均一、例えば、勾配であり得る。不均一な層が、存在するとき、それは、少なくとも１．０１ｇ／ｍｌ、少なくとも１．０５ｇ／ｍｌ、少なくとも１．１ｇ／ｍｌ、少なくとも１．２ｇ／ｍｌ、少なくとも１．３ｇ／ｍｌ、またはより高い平均密度を有することができる。例えば、上を覆う層からの液体によるクッションの水和が、クッションにおける密度勾配につながり得る。

反応媒体が、励起光または他の照明光に対して、ならびに撮像信号を生成する反射または放射光に対して実質的に透過性であるとき、検出ゾーンの外側にある非結合標識粒子は、大型非特異的光学信号を画像に寄与することができる。クッションの中への染料の包含が、検出ゾーンの外側に存在する非結合標識粒子によって生成される信号を排除する、または低減させるために使用されることができる。例えば、適切な濃度における染料は、容器の残りの部分内で非結合標識粒子から信号を覆い隠しながら、検出表面またはその近傍で検出ゾーン内の蛍光の検出を可能にする。シグナリング部分が、蛍光であるとき、使用される染料は、蛍光シグナリング部分の励起もしくは放射波長に重複する光の吸収度を有することができる、または励起および放射光の両方を吸収することができる。例えば、蛍光シグナリング部分が黄緑色であるときに本発明で有用である染料は、クロモトロープ２Ｒおよびアシッドレッド１を含む。墨汁または１９もしくは１６８等のダイレクトブラック等の本および他のスペクトル領域内で適切な多くの他の染料が、当業者に公知である。

高密度クッション層および染料の組み合わせは、洗浄することなく標識標的を撮像するための効率的な方法を提供する。本アプローチは、非結合標識粒子および標的以外の標識実体に起因して、背景信号を排除することができる。クッションは、磁性粒子とのそれらの関連性によって高密度層を通して引き寄せられる標的のみが、検出ゾーンに到達することを確実にすることができる。染料は、上を覆うバルク反応混合物内の自由標識粒子に起因して、信号の検出を防止し、それによって、検出ゾーン内に堆積される磁性粒子に複合体形成される、標識標的の信号を単離する。

クッションおよび染料は、液体または乾燥形態で本方法において採用されてもよい。一実施形態では、クッションは、染料の有無を問わず、容器内で液体形態であり、サンプル（または対照）は、クッションにわたって添加される。別の実施形態では、クッションは、染料の有無を問わず、容器内で乾燥形態であり、液体の添加は、クッションを水和する。有利なこととして、乾燥したクッションは、染料の有無を問わず、サンプル（または対照）からの液体によって水和されてもよい。サンプル（または対照）が、容器に添加されるとき、サンプル（または対照）からの液体は、乾燥試薬を水和してクッション層を形成し、これは、次いで、検出表面からサンプルの残部を分離する。

本方法は、標識標的が後続の検出のための選択によって堆積される、検出表面または検出面積を伴う１つまたはそれを上回る容器を採用する。容器は、典型的には、標識標的の光学検出を支援する性質および特徴を有する。これらの性質および特徴は、集束のための光学的に適切な材料、幾何学形状、および基準特徴を含んでもよい。

一般に、検出面積を含む容器の面は、標的を標識するために使用される、標識粒子を検出するために非常に適している性質を伴って光学的に透明である。例えば、蛍光が、検出される場合、光学窓は、標的の対応するスペクトル範囲内の波長において非蛍光性であるべきである。容器はまた、背景信号を増加させることによって撮像にも干渉し得る、具体的波長における入射光の低反射率も有するであろう。

画像表面は、埃、擦過傷、および汚染から保護されてもよい。これは、撮像を複雑にし得る、非特異的背景またはアーチファクトを限定することに有益であり得る。表面を保護するいくつかの手段は、物理的スタンドオフ、脚部、もしくは障壁を組み込むこと、または箔もしくはプラスチックカバーで光学表面を被覆することによるものを含む。代替として、ヒンジ連結される、または摺動するドアが、表面を保護するために使用されることができる。これらの保護特徴は、撮像が起こる前に除去されることができる、または撮像の間に自動的に除去されることができる。代替として、これらの特徴は、保護または傷防止コーティングを用いた場合のように、可動性特徴ではない場合がある。

容器または検出表面は、環状オレフィンコポリマー、アクリル、ポリスチレン、および他の透明材料等のプラスチックであり得る。これはまた、ホウケイ酸塩ガラス、溶融石英、石英、またはその他の等のガラスから加工されることもできる。他の材料は、限定ではないが、ＰＤＭＳ、ＲＴＶ、光学接着剤、および積層を含む。容器または検出表面は、エネルギーのある波長を遮断または吸収する積層もしくは付加的物理層等のコーティングまたは構造組成を含み得る、光学フィルタリング機能性を内蔵している場合がある。

検出は、アレイ光検出器、例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤの使用によるものであり得る。検出器は、単一の画像内の検出ゾーン全体を検出するように定寸されてもよい。検出はまた、光学倍率を採用しなくてもよい、または５倍もしくはそれ未満の光学倍率を採用してもよい。典型的には、本方法は、大面積検出を採用する。例えば、検出器は、典型的には、１ｍｍ、例えば、少なくとも１ｃｍの少なくとも１つの断面寸法を伴う面積を検出するであろう。

洗浄とは、所望されない成分と対照的に、いずれかコンテナ内に留保される、標的からの望ましくない成分を含有する液体をコンテナから物理的に除去するためのプロセスを意味する。

洗浄を要求しない検査とは、標的が洗浄ステップを使用することなく検出される、検査を意味する。

クッション、密度クッション、液体クッション、クッション層、または液体密度クッションとは、上を覆う層よりも高密度である実質的に液体の層を意味する。本発明では、クッションは、選択に先立って、検出表面と、サンプルおよび検査試薬を含む液体層との間に位置する、容器内で見出される。本クッションは、検査の試薬と検出表面との間に物理的分離を提供する。選択を使用して、標識粒子および磁性粒子と複合体形成される標的が、クッションを通して移動され、検出ゾーン内に堆積される。磁性粒子と複合体形成されない、標識粒子は、クッションの高密度液体層によって検出ゾーンから除外される。

染料とは、標識粒子へ、またはそこからの光の生成もしくは透過に干渉する、反応に添加される物質または混合物を意味する。染料は、検出ゾーン内で標識粒子に由来する信号の検出を可能にしながら、検出ゾーンの外側で生じる信号を低減させる、または排除する。蛍光標識粒子に関して、染料は、蛍光励起周波数、蛍光放射周波数、または両方の光を吸収することができる。光散乱および吸光度を含む、種々の染料性質が、本目的のために有用であり得る。種々の実施形態では、染料は、信号を少なくとも５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはさらに９９％を上回って低減させる。

染料クッションとは、染料を含むクッションを意味する。染料クッションは、同時に、（高密度層内に含まれる染料の関数として）上を覆う反応から検出器への信号の伝送を防止または低減させながら、（染料クッションの密度の関数として）検出ゾーンからのバルク反応の物理的除外を提供する。

いくつかの実施形態では、標的とは、サンプル内に潜在的に存在し、その存在が本発明によって検査される、微生物、例えば、クロストリジウム・ディフィシレまたはその成分、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａまたは毒素Ｂ等の分泌される生成物を意味する。本用語はまた、多細胞生物、例えば、ヒト等の哺乳類からの細胞、およびその成分を含む。

結合分子とは、標的に特異的に結合する分子または分子複合体を意味する。結合分子の実施例は、抗体、その抗原結合断片、およびアプタマーである。

粒子とは、サイズが５０ミクロン未満であるマトリックスを意味する。粒子の集団またはバッチのサイズは、粒子のサンプルに関する直交寸法の最長対の平均測定として定義される。多くの粒子は、固体のいくつかの特性を有する。しかしながら、剛性ではない場合がある、分子足場または複合体もまた、粒子として定義される。例えば、デンドリマーまたは他の分岐分子構造が、粒子と見なされる。同様に、リポソームが、別のタイプの粒子である。粒子は、信号要素と関連付けられる、またはそれに結合されることができる。粒子は、多くの場合、それらの寸法または幾何学形状を反映する用語を用いて参照される。例えば、用語「ナノスフェア」、「ナノ粒子」、または「ナノビーズ」が、任意の所与の軸に沿って１ミクロン未満である粒子を指すために使用される。同様に、用語「ミクロスフェア」、「微粒子」、または「マイクロビーズ」が、任意の所与の軸に沿って１ミリメートル未満である粒子を指すために使用される。粒子の実施例は、ラテックス粒子、ポリアクリルアミド粒子、マグネタイト微粒子、強磁性流体（磁性ナノ粒子）、量子ドット等を含む。

蛍光粒子または標識粒子とは、標的に特異的に結合し、信号を発生させ得る、粒子を意味する。

略平面的な表面または基板とは、距離が、表面上の任意の１ｍｍ×１ｍｍ平方内の点から仮想平面上の最接近点まで測定されるときに、平均距離の絶対値が、５０マイクロメートル未満であるように、仮想平面と並列に整合され得る表面を意味する。

検出表面とは、略平面的な基板の表面を意味する。検出表面は、標識粒子の信号に対して透過性である。

検出面積とは、本発明によって同時に分析される容器の面積を意味する。検出面積は、典型的には、その最長直線寸法が、１ｍｍを上回る、例えば、５ｍｍ、１０ｍｍ、または１５ｍｍを上回る。例えば、収集レンズおよびＣＣＤチップを含む光学デバイスによって同時に撮像される、スライドガラスの区分は、０．８ｃｍ×０．５ｃｍであり得る。検出面積は、次いで、０．４ｃｍ^２である。

検出ゾーンとは、標的が検出され得る、容積を意味する。検出ゾーンは、検出面積と同一の断面寸法を有するが、標識粒子が検出および識別され得る深度に対応する、深度を有する。検出ゾーンの深度は、したがって、陽性信号に関してスコア化するために使用される閾値基準に依存する。光学検出が、使用されるとき、検出ゾーンの深度は、光学的被写界深度に依存する。

検出面積の一区分内で標的を同時に検出することとは、１つのステップで略平面的な検出表面の一区分からの信号の検出を意味する。

サンプルとは、標的の存在に関して本発明によって走査される材料を意味する。

光電子検出器とは、光子信号を電気信号に変換する人工デバイスまたは器具を意味する。光電子検出器の実施例は、ＣＣＤ検出器、ＣＭＯＳ検出器、光電子増倍管検出器、およびフォトダイオード検出器、例えば、アバランシェフォトダイオードを含む。

照明とは、電磁放射線を照射することを意味する。種々の波長の電磁放射線が、照明するために使用されることができる。これは、例えば、スペクトルのＸ線、紫外線、可視、または赤外線領域内の波長を伴う放射線を含む。照明放射線は、必ずしも可視範囲内ではないことに留意されたい。照明は、好ましくは、１９０～１，１００ｎｍの範囲で起こる。

微生物とは、単細胞生物、例えば、細菌、原生生物、古細菌、または真菌、もしくはウイルスを意味する。

一実施形態では、本方法は、単一分子計数を達成し、倍率を伴わずに個々の標的を計数する。図５は、倍率を使用することなく、本方法が蛍光ナノ粒子でタグ付けされた標的を検出する様子を示す。蛍光粒子タグ付け標的を照明することは、標識標的に光子を放射させる。光子は、独立した感光性ピクセル要素のアレイを含有する、デジタルカメラ（携帯電話内のもののような）内のＣＭＯＳチップに衝突する。したがって、個々の標的の直上に位置するピクセル要素が、結果として生じる画像内の白点として「光を発する」（図６）。本発明は、本方法が、最小限のサンプル調製を伴って、標的、例えば、微生物、またはその成分、例えば、複合糞便サンプル内のクロストリジウム・ディフィシレ毒素分子を迅速かつ特異的に計数することを可能にする、染料クッション層を特徴とする（図７）。標的を潜在的に含有する液体サンプルが、２つのタイプの乾燥試薬、すなわち、染料（例えば、ダイレクトブラック）および密度剤（ＯｐｔｉＰｒｅｐ）を含有する、透明底部容器に添加される。容器の底面における乾燥染料クッション試薬は、水和されたときに高密度層を形成する。標的特異的蛍光および磁性ナノ粒子が、小型凍結乾燥球（約１ｍｍ直径）内で安定化される。磁性ナノ粒子は、標的、例えば、微生物、またはその成分、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素分子上の１つの抗原部位に特異的な抗体でコーティングされ、蛍光ナノ粒子は、同一の標的上の明確に異なる抗原部位に結合する相補的抗体でコーティングされる。サンプルによる乾燥試薬の水和に応じて、２つの層、すなわち、高密度染料クッション層および検定層が、形成される。検定層では、標的分子は、磁性および蛍光ナノ粒子に結合し、それらをともに連結する。粒子の高濃度（約１０９／ｍｌ）および小型サイズ（２００～５００ｎｍ）は、機械的混合機能性の必要性を排除することによって計装を単純化する、拡散混合のみを用いて高速の結合反応速度を促す。永久磁石にわたって容器またはカートリッジを３分間設置することは、染料クッション層を通して、磁性粒子、および標的分子を介してそれらに連結される任意の蛍光粒子を引き寄せ、検出ゾーン内にそれらを堆積させる。捕捉された蛍光粒子は、非拡大デジタル撮像を用いて瞬時に撮像および計数される。コンピュータが、存在する標的の数を示す、照明されたピクセルを瞬時に列挙する。低被分析物濃度において、個別標識標的をデジタルで計数することは、検出面積を横断した信号を積分するより一般的な方法と比較して、より良好な信号対雑音比を発生させる。非拡大撮像は、広い視野が一瞬で撮像されることを可能にし、少数の標的が大量のサンプル内で迅速に検出されることを可能にする。本方法の革新的な非拡大デジタル撮像アプローチから生じる主要な技術的利点は、迅速に、非常に低コストの構成要素を用いて、非常に低いレベルの標的を検出する技術の能力である。単一の分子が、低標的濃度において蛍光粒子を磁性粒子に連結することができるため、磁気的に堆積された標識粒子の数を計数することは、捕捉された標的分子の数に対応する。染料クッションは、サンプル調製および洗浄ステップを排除する、または低減させる。図８は、染料クッションが、数千万個の高蛍光非結合粒子の強い蛍光を完全に遮断することを示す。

染料クッション層は、光の励起および放射波長の両方を吸収する、高密度着色層を受動的に形成する。本層は、光が検定層内の非結合蛍光粒子に到達しないように防止する（数百万個が、存在し、それらは、そうでなければ非常に明るいであろう）。同様に、染料クッションは、検出表面からサンプルを光学的かつ物理的に隔離し、ユーザによる広範なサンプル調製を要求することなく、最も困難なサンプルマトリックスに対してさえも検定をロバストにする。

上記に議論される方法に加えて、本方法は、競合検定として採用されてもよく、磁性粒子は、標的競合物に結合される。少なくとも２つのタイプの複合体が、形成され、１つの複合体は、磁性粒子と標識粒子との間に形成され、別の複合体は、標的と磁性粒子または標識粒子のいずれかとの間に形成される。存在するとき、標的は、粒子のうちの一方に結合し、それが他方の粒子に結合しないように防止することによって、磁性粒子または標識粒子の間に形成される複合体の数を削減する。標的の検出は、標的がない場合に形成される磁性粒子および標識粒子の複合体の量の低減によって、間接的に起こる。理解されるであろうように、対照から陽性結果または有効検定を判定するための閾値が、競合検定において逆転されるであろう。

本発明はまた、本明細書に説明される方法を実行するためのキットも提供する。キットは、標識粒子と、磁性粒子と、液体クッション試薬または水和に応じてクッションを形成する乾燥試薬とを含む。キットはさらに、随意に容器内に貯蔵された液体または乾燥クッション試薬とともに、検出表面を有する、容器またはカートリッジを含んでもよい。キットはさらに、例えば、液体または乾燥クッション試薬と混合される、もしくは別個に貯蔵される、染料を含んでもよい。キットはさらに、陽性対照、例えば、典型的には精製される、事前判定された量の標的、および／または中和対照、例えば、自由結合分子のために要求される、試薬を含んでもよい。
（参照による組み込み）
特許、特許出願、特許公開、定期刊行物、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文書の参照および引用が、本開示の全体を通して行われた。全てのそのような文書は、あらゆる目的のために、本明細書に参照することによってそれらの全体として本明細書に組み込まれる。
（均等物）
本発明およびその多くのさらなる実施形態の種々の修正が、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本明細書で引用される科学および特許文献の参照を含む、本書の全内容から、当業者に明白となるであろう。本明細書の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実践に適合され得る、重要な情報、例示、および指針を含有する。

本発明は、以下の非限定的実施形態に関して説明される。特に、実施例は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出を例証するが、本方法は、他の標的とともに採用されてもよい。別様に記述されない限り、実施例に具体的に説明されるデバイスの任意の要素が、概して、本発明のデバイスまたはキットとともに採用されてもよい。

試薬。蛍光微粒子（５００ｎｍ）が、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）から購入された。カルボン酸ポリスチレン磁性粒子（２９２ｎｍ）が、Ａｄｅｍｔｅｃｈ（Ｐｅｓｓａｃ， Ｆｒａｎｃｅ）から購入された。磁性粒子を捕捉するための磁石が、Ｄｅｘｔｅｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｌｋ Ｇｒｏｖｅ， ＩＬ）から入手された。マイクロタイタプレート（９６ウェル透明底部、半面積黒色プレート）が、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ（Ｍｏｎｒｏｅ， ＮＣ）から入手された。クロストリジウム・ディフィシレ（リボタイプ０８７）から精製された天然毒素Ｂ標準が、Ｌｉｓｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ， ＣＡ）から購入された。クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂに対して惹起されたマウスモノクローナル抗体が、ＢＢｉ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ， ＵＫ）およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ （Ａｃｔｏｎ， ＭＡ）から入手された。異好性阻害剤（ＨＢＲ－１１）が、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｓａｎｔｅｅ， ＣＡ）から入手された。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、カゼイン酸加水分解物（Ｆｌｙ－カゼインＳＦ）、Ｔｒｉｚｍａ(登録商標)塩基、Ｔｒｉｚｍａ(登録商標)－ＨＣＩ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、およびＯｐｔｉＰｒｅｐが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から入手された。ダイレクトブラック１９が、Ｏｒｉｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃｒａｎｆｏｒｄ， ＮＪ）から入手された。プロテアーゼ阻害剤カクテルが、Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）から入手された。

臨床サンプル。匿名化された廃棄糞便サンプルが、Ｂｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｏｓ Ｏｓｏｓ， ＣＡ）から取得された。サンプルは、１２ヶ月の周期にわたって収集された。我々は、形成された糞便サンプル（半固体または固体のいずれか）および２歳未満の小児からのサンプルを除外した。サンプルは、臨床微生物学研究室内で３～７日間、４℃で貯蔵され、サンプルは、＞４℃を維持するように氷または氷パックを用いた冷却器内で我々の研究室に移送された。サンプルを受容した後、それらは、水で４０％まで希釈され、単回使用アリコートが、作成され、次いで、使用まで－８０℃で貯蔵された。プール陰性糞便サンプルが、リアルタイムＰＣＲによってクロストリジウム・ディフィシレ陰性としてスコア化された１４個の個々の糞便サンプルから作成された。検定混合物内の最終組成が、８％の糞便、４ｍｇ／ｍｌのカゼイン、８ｍｇ／ｍｌのＨｙ－カゼインＳＦ、５０ｍＭのトリス－ＨＣＩであり、１：１５０希釈において１ｍｇ／ｍｌのＨＢＲ－１１およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充されたｐＨ７．３であるように、糞便希釈液が、検査に先立ってサンプルに添加された。希釈糞便サンプルは、粒子状物質を除去するように、検査に先立って１０ミクロンナイロンメッシュフィルタ（ＰｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳ）を通して濾過された。

撮像システム。撮像システムは、蛍光ベースの画像入手サブシステムにわたって各ウェルを位置付けるためにＰｒｉｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＡ）からの高精度直線状ステージを使用する、マイクロタイタプレートの選択されたウェルから画像データを自動的に捕捉することが可能である、特注の器具およびソフトウェアである。器具は、４つの別個の色チャネル内で撮像することができ、対物レンズ、照明ＬＥＤ、蛍光フィルタセット、およびカメラを使用する。対物レンズは、マイクロタイタプレートウェル全体の画像を捕捉するように設計される視野を有する。照明モジュール光源は、色チャネルあたり２つの高出力ＬＥＤを含む。一連の蛍光画像フレームが、ピクセル量子化あたり１２ビットを伴う３．１ ＭＰ Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２６５単色センサを使用するカメラを用いて捕捉される。ウェル毎の最終画像が、次いで、複数のフレームを合計することによって形成される。クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査に関して、我々は、４７０／４０ｎｍ励起および５１５／３０ｎｍ放射フィルタを使用し、２０ミリ秒露出において２フレームを捕捉した。

染料クッションを含有するマイクロタイタプレートの調製。染料クッションが、ｐＨ７．５である、５０ｍＭのトリス－ＨＣＩ内の０．２５ｍｇのダイレクトブラック１９、１０％（ｖ／ｖ）ＯｐｔｉＰｒｅｐを含有する、５０μＬの溶液を、表面プラズマ処理された９６ウェルマイクロタイタプレートの各ウェルに添加し、６０℃で３時間乾燥することによって、調製された。乾燥プレートが、最大１ヶ月間、乾燥状態で貯蔵された。

抗体結合磁性および蛍光粒子の調製。抗毒素Ｂモノクローナル抗体が、粒子製造業者（Ａｄｅｍｔｅｃｈ， ＰＥＳＳＡＣ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＴｈｅｒｍｏ ＦｌＳｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ））によって推奨される標準結合方法を使用して、カルボキシル結合（ＥＤＣ／ＮＨＳ化学）を通して磁性および蛍光粒子に結合された。結合磁性粒子は、可視光吸収によって定量化され、結合蛍光粒子は、後続の検定調合の目的のためにフローサイトメトリを使用して定量化された。

クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査。検定混合物を調製するために、糞便が、糞便希釈液、７ｅ８粒子／ｍｌの抗体結合磁性粒子、１．１ｅ７粒子／ｍｌの抗体結合蛍光粒子、および指示された量の毒素Ｂ（２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、および０．０５％ｖ／ｖのＰｒｏｃｌｌｎ－３００を含有する、ｐＨ７．８緩衝剤である、５０ｍＭのトリス－ＨＣＩ内で希釈される）の混合物、またはブランクのために緩衝剤のみを用いて、８％まで希釈された。１００μＬの検定混合物が、各乾燥染料クッション含有ウェルの中にピペット採取された。３５℃における３０分のインキュベーションに続いて、磁性粒子が、Ｄｅｘｔｅｒ磁石上に検定プレートを３分間設置することによって引動された。プレートは、次いで、撮像システムを使用して撮像され、信号は、下記に説明されるように定量化された。

画像分析。蛍光粒子の数が、以下のように入手された画像毎に定量化された。画像は、閾値を上回る強度を伴う全てのピクセルが１に設定される、二値画像を作成する固定ピクセル閾値で覆い隠された。画像からのピクセルは、各アクティブなピクセルが、ｘまたはｙ画像方向のいずれかで直接隣接する全てのアクティブなピクセルと群化されるように、接続性分析を使用して群化された。ピクセル群または小塊（ｂｌｏｂ）が、次いで、面積（ピクセルの数）、小塊強度（小塊内の全てのピクセルの全強度）、および密集度

等のパラメータのセットを判定するように処理された。小塊のリストが、次いで、サンプルマトリックスによって引き起こされ得る非特異的信号を除去するようにフィルタ処理された。これは、サイズ、強度、および／または不規則形状に基づいて、小塊を除去することによって行われた。いったん小塊リストがフィルタ処理されると、全小塊強度が、各小塊の強度を合計することによって算出された。検出された蛍光粒子の数が、次いで、全小塊強度を単一の蛍光粒子の基準強度で除算することによって算出された。

検出限界、ブランクの限界、動的範囲、および精度プロファイル。これらの測定は、プール陰性糞便サンプルを使用して実施された。クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査に関する検出限界は、被分析物がないサンプルの２４個の複製およびそれぞれ７つの毒素Ｂ濃度の１２個の複製を流すことによって判定された。ブランクの限界、検出限界、および精度プロファイルは、臨床・検査標準協会（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従って判定された。

クロストリジウム・ディフィシレ臨床サンプルの検査。３２０個の臨床サンプルが、３ウェル検定（サンプル毎に検査、陽性対照、および中和対照）を使用して、上記に説明されるように検査された。調査される各サンプルは、２人のオペレータによって独立して検査された。陽性対照に関して、患者サンプルを含む検定混合物が、マトリックス阻害影響を検出するように１００ｐｇ／ｍｌのクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂを混入された。中和対照に関して、検定は、中和されていないサンプル内の任意の信号が毒素Ｂ検出の結果であることを確認するように、２．５μｇ／ｍｌのクロストリジウム・ディフィシレ抗毒素Ｂ抗体を混入された。

細胞毒性中和検定（ＣＣＮＡ）。検査に使用されたサンプルのアリコートが、ＣＣＮＡのためにドライアイス上で凍結されてＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔｓ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）に送られた。受領に応じて、サンプルの完全性が、チェックされ、ＣＣＮＡが、５倍試料希釈液を使用して、ＭＲＣ－５線維芽細胞およびＱｕｉｄｅｌ細胞毒性試薬（Ｑｕｉｄｅｌ、カタログ番号０３－０５０００）を使用して実施され、ペレット固形物まで２，０００～６，０００ｘｇで１０分間遠心分離された。上澄みが、無菌０．４５ミクロン膜フィルタを通して濾過され、適切な対照を組織培養プレートに接種するために使用され、プレートが、３５℃で２４～４８時間培養された。特異的細胞変性影響の発現が、陽性サンプルに関して２４時間以内に観察された一方で、陰性サンプルは、最大４８時間保持された。

データ分析。データが、ＪＭＰおよびＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析された。信頼区画が、Ｃｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ分析を使用して判定された。
（実施例１)
サンプル内のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの検出
本方法は、倍率を伴わずにデジタル撮像を使用して、蛍光染色されたナノ粒子で標識される分子を検出する。蛍光ナノ粒子標識を照明することは、それらに１：１ｆ／４リレーレンズを使用して収集される光子を放射させる。粒子によって放射される光は、結果として生じる画像内に白点を形成する、デジタルカメラのＣＭＯＳチップ上のピクセルの小クラスタに衝突する。低被分析物濃度において、個別標識標的をデジタルで計数することは、検出面積全体からの信号を単純に積分することと比較して、より良好な信号対雑音比を発生させる。非拡大撮像は、広い視野が撮像されることを可能にし、数ミリ秒で大量のサンプル内の少数の標的分子の検出を可能にする。

サンプルが、最初に、希釈液、およびクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂに特異的な相補的抗体でコーティングされた蛍光ならびに磁性粒子から成った標的特異的免疫試薬と、混合された。検定混合物が、次いで、その底部が乾燥染料クッション試薬でコーティングされた、透明底部マイクロタイタウェルに添加された。染料クッション試薬は、可視光を吸収する染料（これらの実験ではダイレクトブラック１９）および密度剤、すなわち、イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標））の混合物であった。乾燥染料クッションは、検定混合物の添加に続いて再構成され、検定層の下に高密度不透明水性層を形成した。光は、検定層まで染料クッション層に浸透することができなかった。本特徴は、検出表面から非結合蛍光標識およびサンプルマトリックスを光学的に隔離した。したがって、染料クッションは、非結合標識およびサンプルマトリックス成分から背景信号を排除するために他の免疫学的検定形式で要求される、面倒なサンプル調製および洗浄ステップの必要性を排除した。
（実施例２）
分析性能の推定。

糞便マトリックスにおけるクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の分析感度を推定するために、リアルタイムＰＣＲクロストリジウム・ディフィシレ検査によって検査されたときに陰性結果を生じた、１４個の無作為に選定された臨床サンプルを含んだプール糞便サンプルが、使用された。クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂを混入されたプールサンプルが、一連の２倍希釈液内で検査された。本方法は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂに関して４５ｐｇ／ｍｌの検出限界を実現した（図９）。類似結果もまた、ＰＣＲ陰性糞便サンプルの異なるプールが、使用されたときに観察された。４５ｐｇ／ｍｌの毒素Ｂ濃度において、反応は、毒素Ｂ分子の数と比較して、約１００倍過剰な磁性粒子を含有した。本被分析物濃度において、本方法が倍率を使用することなく撮像することによって単一分子を検出することを確認して、磁性および蛍光粒子が、平均して単一毒素Ｂ分子によってともに連結されなければならない。さらに、図１０の精度プロファイルは、図９に示されるデータに関して１０％を下回る変動係数（ＣＶ）を示し、毒素Ｂの低濃度において再現可能な結果を実現するための本方法の潜在性を実証する。

図１１は、ある範囲の濃度の外因的に添加された精製クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂを含有する、プール糞便サンプル内のクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査用量応答を示す。データは、それを上回ると応答がプラトーに達する、最大約１μｇ／ｍｌの４～５桁の濃度範囲にわたって略線形であった。本範囲を網羅することは、臨床的に報告されたクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂの最高レベル、すなわち、約１００ｎｇ／ｍｌを超えることが、注目に値する。
（実施例３)
検定対照によるマトリックス影響の検出および軽減
陽性および中和検定対照が、サンプルマトリックス影響の検出および後続の軽減を促進するように設計された。検定対照および毒素Ｂ検査が、臨床サンプルおよび検定試薬を含有する混合物の同等アリコートに並行して実施された。陽性対照は、定義された量の混入毒素（１００ｐｇ）を含む。予期される結果よりも低い陽性対照信号の偏差は、負の検定干渉（検定阻害）を示す。中和対照は、臨床サンプル内の毒素Ｂを隔離し、それを検定において検出不可能にする、毒素Ｂ中和抗体を含有する。このように、中和対照は、サンプル内の毒素Ｂに由来する特異的信号を非特異的信号と区別する。非特異的信号は、検出表面上の蛍光粒子または自己蛍光サンプル成分のいずれかの被分析物非依存性堆積に起因し得る。本研究では、臨床サンプルの訓練セットが、細胞毒性検定基準方法に対して診断正確度を最適化するための信号、中和、および干渉閾値を実験的に確立するために使用された。

図１２は、クロストリジウム・ディフィシレ検査による陽性および陰性コールのための決定マトリックスをグラフで実証する。決定マトリックスは、２つの閾値、すなわち、信号閾値（ｘ軸上）および中和閾値（ｙ軸上）を含む。信号閾値ならびに中和閾値を超えるサンプルのみが、陽性と呼ばれる。これは、図１２および１３の右下側象限内で陽性コール、他の３つの象限に関しては陰性コールとして可視化される。加えて、干渉が、陽性対照内で検出される場合（予期される信号と比較して＞７５％変化）、サンプルは、無効と宣言される。
（実施例４）
臨床サンプルでのクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の正確度
クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査は、クロストリジウム・ディフィシレ感染症を有することが疑われる患者からの３２０個の臨床糞便サンプルを分析するために使用された。サンプルは、重複して検査された。本サンプル訓練セットからの結果は、毒素Ｂ細胞毒性検定基準方法の結果と比較された。受信者動作曲線分析が、正確度を最適化するための検定閾値を実験的に作成するために使用された。３２０個の臨床サンプルのうち、１つだけのサンプル（両方の複製）が、陽性対照の９８％を上回る阻害を示したため、本分析から拒否された。

図１３は、訓練セット結果をプロットする。データは、選定された閾値が、陽性および陰性サンプルを効果的に区別することを例証する。細胞毒性検定を使用して陽性をスコア化したサンプル（赤色ドット）は、右下側象限内にほぼ完全に該当し、有意な中和可能信号を伴うサンプルを表す。対照的に、基準検査によって陰性をスコア化したサンプル（青色ドット）は、他の３つの象限のうちの１つの中にほぼ完全に該当し、低信号、非中和可能信号、または両方のいずれかを有する結果を表す。表１は、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査の結果を基準細胞毒性検定と比較する。

選定された閾値を使用して、ここで提示される新しい方法は、細胞毒性検定基準方法と比較すると、９７．０％感度（９５％Ｃｌ、９１．４～９９．４％）、９８．３％特異性（９５％Ｃｌ、９６．８～９９．２％）、および９８．２％正確度（９５％Ｃｌ、９６．７～９９．０％）を達成した。
（実施例５）
クロストリジウム・ディフィシレ検定の性能の改良およびクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ａの添加
上記に示される表１は、マイクロプレート検定性能を表示する。表２は、カートリッジ／分析器性能を表示する。

合計１４４個の毒素Ａ抗体対が、毒素Ａ抗体対を選択するためにスクリーニングされた。図１４は、毒素Ａ ＬｏＤ（抗体対Ｊ／Ｌ）（１／２ＬｏＤ）を示す。抗体対に関する毒素Ａ臨床サンプル検査が、蛍光粒子Ｌを伴う磁性粒子Ｇ（図１５）に関して、ならびに蛍光粒子Ｌを伴う磁性粒子Ｊ（図１６）に関して実行された。毒素Ａのための抗体が、臨床サンプルでのＬｏＤおよび性能に関する検査に基づいて選択された。

毒素ＡおよびＢに関するＬｏＤは、製品要件を満たす。毒素Ｂに関するＬｏＤは、４５ｐｇ／ｍＬである。毒素Ａに関するＬｏＤは、３６５ｐｇ／ｍＬである。さらに、毒素Ａ（図１７）および毒素Ｂ（図１８）を使用する、新鮮臨床サンプルを用いた検査は、優れた性能を示す。

表３は、カートリッジ／分析器性能を表示する。

（実施例６)
高速単一分子計数方法が、糞便サンプル内で直接、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂを敏感に検出する
背景。サンプル調製を殆どまたは全く伴わずに糞便サンプル内の単一標的分子を計数する、新規のデジタル撮像技術に基づく超敏感ＭｕｌｔｉＰａｔｈクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査が、開発された。クロストリジウム・ディフィシレ胃腸感染症に関する現在の検査は、不正確であり得る。クロストリジウム・ディフィシレ毒素免疫学的検定は、多くの場合、臨床感度が欠けている。核酸増幅検査は、優れた臨床感度を有するが、クロストリジウム・ディフィシレ感染症がある患者をクロストリジウム・ディフィシレ菌のキャリアである患者と区別することができないことに起因して、減退した臨床的特異性を有し得る。毒素の産生が、クロストリジウム・ディフィシレ感染症の特質であるため、本報告で提示されるもの等の超敏感クロストリジウム・ディフィシレ毒素検査は、現在の検査と関連付けられる問題に対処し、本破滅的感染症がある患者を検出するための改良された正確度を提供し得る。

技術的アプローチ。ＭｕｌｔｉＰａｔｈクロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂ検査は、非拡大デジタル撮像を使用し、毒素分子によってともに連結された標的特異的磁性および蛍光粒子を計数する。本方法は、サンプル調製および洗浄ステップの必要性を排除する、新規の染料クッションの使用を含む。臨床糞便サンプルが、検出限界、不正確、および動的範囲を推定するように検査された。良好な臨床正確度を達成するための潜在性が、新しい毒素検査の結果を毒素検出のための敏感な細胞毒性基準方法のものと比較することによって査定された。

技術。使用される技術は、サンプル調製および洗浄を排除する、染料クッションを含む。本技術は、３０分の検査所要時間を有する。使用される技術は、陽性および中和内部対照を含む。全てのステップが、自動分析器上のカートリッジ内で実行される。全ての試薬が、カートリッジ内で安定化される。使用される技術が、図１９－２１に示される。

プラットフォームワークフロー。参照番号１と標識されたサンプルカートリッジおよび参照番号２と標識されたサンプル分析器が、図２２に示される。
分析結果。分析結果が、図２３－２５に示される。

干渉。下痢糞便サンプルと一般的に関連付けられる、２０個の潜在的に干渉する物質は、毒素Ｂを混入されたサンプルに関する検定結果に影響を及ぼさないことが見出された。

包括性。一般的なリボタイプ（０２７、１０６、０１４、００２、０１７、００１、０７８、０３６、０８７）を表す株からの毒素の分析が、プール糞便サンプルの中に混入されたときに類似用量／応答を示した。

排他性／交差反応性。糞便サンプルにおける毒素検定性能が、＞１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬである、２３個の一般的に列挙されるオフターゲットの種の存在下で評価された。それらのうちのいずれも、混入された毒素Ｂの検出を阻害しなかった、または偽陽性結果を引き起こさなかった。

臨床実行可能性結果。

半手動分析。クロストリジウム・ディフィシレ感染症を有する疑いがある患者からの３２０個の臨床未形成糞便サンプルの訓練セットが、細胞毒性中和検定（ＣＣＮＡ）基準検査に対して最適な正確度を生じさせるためのパラメータを選択するために、使用された。検定は、マイクロタイタプレートおよび手動ピペット採取ステップを使用して行われた。商業用酵素免疫測定法およびＰＣＲ検査の結果は、ＣＣＮＡ結果と比較された。

完全自動分析。サンプルの無作為サブセットが、自動ＭｕｌｔｉＰａｔｈ分析器プロトタイプおよびＭｕｌｔｉＰａｔｈ消耗カートリッジ上で検査され、結果をＣＣＮＡ結果と比較した。

限定。検査は、毒素Ａまたは二元毒素ではなくて、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂのみを検出する。研究は、盲検ではなく、パラメータを最適化するための訓練セットとしてサンプルを扱った。我々は、未形成糞便サンプルのみを検査し、それらは、サブ分析のための関連付けられる患者情報を有しておらず、新鮮ではなく、むしろ－８０℃で凍結されていた。

結論。提示されるデータは、クロストリジウム・ディフィシレ毒素Ｂに関する高速で正確な使いやすい検査を実現する超敏感ＭｕｌｔｉＰａｔｈ技術の潜在性を実証する。本技術はまた、種々の他の重要な感染性疾患用途のためにも価値があるはずである。
（実施例７）
血液サンプルから直接の炭疽菌毒素致死因子の高速かつ敏感な検出
要約。致死性毒素のサブユニットである、分泌される致死因子（ＬＦ）は、炭疽菌感染症の最古の公知のバイオマーカであり、それを診断が本潜在的に致死性の病原体への暴露を検出するための論理的標的にする。現在、高速であり（３０分よりも少ない結果までの時間）、医師の研究室内で使用するために十分に単純であり、感染症の初期に低濃度のＬＦ（＜１００ｐｇ／ｍＬ）を検出するために十分に敏感である、炭疽菌ＬＦ検出のための商業用方法は、存在しない。ＭｕｌｔｉＰａｔｈ炭疽菌検査は、サンプル調製を伴わずに使い捨てカートリッジに添加される、少量（＜６０ｍＬ）の静脈または指穿刺全血に実施されることができる。いったん分析器の中に装填されると、検査は、さらなるユーザ入力を伴わずに自動的に進む。サンプル装填から診断結果までの時間は、２０分よりも少なく、２０個ものサンプルが、プラットフォーム上で同時に処理されることができる。純粋ＬＦタンパク質を混入された全血サンプルを使用して判定される、検定の検出限界（ＬｏＤ）は、＜６０ｐｇ／ｍＬである。検定の動的範囲は、炭疽菌感染症の経過にわたって観察される広範囲のＬＦ濃度を考慮すると、重要な性能測定基準である、５対数のＬＦ濃度を網羅する。その使いやすさ、結果までの迅速な時間、および高感度により、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ炭疽菌検査は、炭疽菌診断のためのツールキットにおける重要なギャップを潜在的に埋める。

検定の概観。検定概観が、図２６に示される。

ワークフロー。現在開発されているＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームは、サンプル調製を要求しない。静脈全血または指穿刺血液が、カートリッジ内に貯蔵されたサンプル希釈液に添加される。カートリッジが、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ分析器上に装填される。分析器は、＜２０分で診断読出を提供する。ワークフローは、図２７に示される。

分析感度。致死因子が、静脈全血サンプルの中に連続的に希釈され、次いで、ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームを通して実行された。ブランクの限界が、２４個の独立して調製されたブランクサンプルの平均値を上回る３標準偏差として判定された。分析感度は、データ点の９５％がブランクの限界を上回って存在することが予期される、致死因子の最低補間濃度を判定することによって、判定された。匹敵する性能が、血液サンプルのパネルを横断して見られる。結果が、図２８に示される。

全血サンプルの中に混入される致死因子の検出。静脈全血の４８個の陰性の個々の患者サンプルが、重複してＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォーム上で実行された。致死因子が、次いで、１５０ｐｇ／ｍＬにおいて同一の４８個のサンプルの中に混入され、ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォーム上で重複して実行された。未混入および混入サンプルの集団の信号の分布が、４，０００蛍光単位の信号カットオフを使用する推定診断性能であるように、下記の図２９および表８ならびに９に示される。

微生物干渉に対するロバスト性。致死因子の存在または非存在を正確に識別するＭｕｌｔｉＰａｔｈシステムの能力が、ＣＬＳＩガイドラインにより、１Ｅ７ｃｆｕ／ｍＬにおいて全血の中に混入された、種々の一般的微生物の存在下で検査された。ＭｕｌｔｉＰａｔｈシステムは、全ての場合において致死因子の存在または非存在を正確に検出することができた。

化学干渉に対するロバスト性。致死因子の存在または非存在を正確に識別するＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームの能力が、種々の潜在的干渉物質の存在下で検査された。一般的な潜在的干渉内因性および外因性物質が、ＣＬＳＩガイドラインにより、推奨濃度において検査された。ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームは、全ての場合において致死因子の存在または非存在を正確に検出することができた。

動的範囲。ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームは、１Ｅ５ｐｇ／ｍＬ超の致死因子の動的範囲を有する。致死因子が、１ｐｇ／ｍＬから１００ｐｇ／ｍＬまで連続的に希釈され、プールヒト血漿の中に混入された。サンプルは、次いで、ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォーム上で混入レベル毎に重複して実行された。結果が、図３０に示される。

概要。ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォーム上で実行されるＭｕｌｔｉＰａｔｈ炭疽菌検査は、最小限のサンプル調製を要求し、＜２０分で結果を返し、全血内で＜６０ｐｇ／ｍＬまでの広い動的範囲にわたって致死因子を検出することができる一方で、一般的に干渉する物質および生物に対するロバスト性を実証し、炭疽菌への公衆暴露の場合に医学的必要性の時点で迅速な検査解決策を医療提供者に提供する。
（実施例８）
自動プラットフォーム上の高速かつ敏感な炭疽菌およびＡＳＴ検査
本明細書の方法を使用する検査は、生命を救い、コストを低下させ、抵抗を減少させる。患者は、感染症の発症時に標的狭域療法を受ける。本方法は、罹患率、死亡率、および入院期間を低下させ、抵抗の拡散を減少させる。

使用される技術は、一意に広範囲の主要な市場用途に対処する。概念実証データが、臨床サンプルから取得され、稼働プラットフォームプロトタイプが、使用された。抗生物質の不適切な使用を低減させるための圧力（ＰＯＣ、病院）、および感染率を低下させるための病院への有意な財政的圧力が、存在する。

プラットフォームは、病院、診療所、および医師の研究室のための高性能、高速で手頃な値段の検査を提供する。二重用途プラットフォームは、主要な臨床および公衆衛生用途のために好適であり、全ての主要な症候性感染症に関する高速ＡＳＴおよび毒素ならびに病原体に関する高速超敏感検査を提供する。

本技術は、感染症を検出し、３０分で分子、細胞、ウイルス、および毒素、ならびに４時間で病原体に関する表現型ＡＳＴを計数する。本技術は、サンプル調製を伴わずに、サンプル（血液、鼻スワブ、糞便、尿）を直接使用する。本技術は、極めて敏感かつ特異的であり、ｑＰＣＲに匹敵する細菌検出（－１０ＣＦＵ／ｍＬ）を伴って、バイオマーカ／毒素に関する低いｐｇ／ｍＬのＬｏＤに関して等、個々の標的を計数する。本技術は、１～３倍加時間で抗生物質感受性を判定する。全ての試薬が、カートリッジ内に含有される。開発中の検査は、炭疽菌検査、およびクロストリジウム・ディフィシレ、ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴ、ならびにＣＡＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴに関する商業用検査のような、生体防御検査等の有意な医療用途に対処する。図３１は、サンプル調製または洗浄ステップを伴わずに標的を検出することを示す。染料クッションは、ユーザサンプル調製および洗浄ステップを排除する。

分析器は、検定ロバスト性、短縮された検査時間、および細菌増殖のために要求される、エンクロージャならびに熱制御を含む。カートリッジラック装填は、安全インターロックと界面接触する。分析器は、内蔵コンピュータと、統合型結果分析およびデータベースと、グラフィカルユーザインターフェースおよびタッチスクリーンとを含む。分析器は、工業デザインと、より小さい占有面積とを有する。例示的分析器は、Ｈ１８インチ×Ｗ２０インチ×２５インチＤの寸法を有する。別の例示的分析器は、Ｈ１５インチ×Ｗ１５インチ×２４インチＤの寸法を有する。

ソフトウェアは、分析器ユーザインターフェースと、ソフトウェア開発品質プロセスと、自動画像および結果分析と、結果データベースと、ソフトウェア更新を伴わずに検査メニューを拡張するためのソフトウェアと、カートリッジ装填およびゴミ監視ソフトウェアと、自動結果検証試験とを含む。

カートリッジは、進行中の全ての検査のための普遍的モジュール式カートリッジ設計を含む。カートリッジは、ウェル数を６から１６まで増加させ、改良された流体工学を有し（すなわち、泡立ちを最小限にし）、ウェルの数を増加させながら部品数を削減し、組立ステップを削減し、空気圧ポートを５から１に削減する。

炭疽菌検査（Ａｎｔｈｒａｘ Ｔｅｓｔ）
本検査は、生物学的脅威事象に続いて炭疽菌を検出するステップを含む。本検査は、血液サンプル内の致死因子（ＬＦ）を検出する。ＬＦは、炭疽菌によって分泌される毒素サブユニットであり、吸入炭疽感染症の初期に出現し、遊離して、または防御抗原に複合体形成されて生じる（致死性毒素）。本検査は、指穿刺または静脈全血サンプル（７０μＬ）を含む。＞１５０ｐｇ／ｍｌの血液である場合、陽性検査結果が、存在する。内部対照が、正確度を改良する。

分析性能が、図３２に示される。図３３は、実施例１を示し、図３４は、実施例２を示す。検査は、連続して異なる４日に及んだ。４人の患者からの静脈血サンプルが、検査された。複製は、ｎ_{ＢＬＡＮＫ}＝２４、ｎ_{ＳＰＩＫＥＤ}＝１２であった。実施例２でＮＨＰ吸入炭疽菌サンプルを検査するステップが、図３５に示される。サンプルは、２匹の動物に関する感染症の時間経過を網羅する。ＭｕｌｔｉＰａｔｈ結果（陽性／陰性）が、基準方法結果と比較された。

高速ＩＤ／ＡＳＴ検査には、価値がある。現在のＩＤ／ＡＳＴ検査は、最適な療法を判定するために数日かかる。不必要または無効な抗生物質が、処方され得る。経験的広域抗生物質療法が、抵抗を増加させる。高速ＡＳＴの目標は、発症時に狭域療法を処方し、感染患者のみを治療することである。臨床医および患者にとっての価値は、改良された患者転帰、低減された抗生物質抵抗、および改良された抗生物質管理を含む。カートリッジ内のＡＳＴワークフローが、図３６に示される。

ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＩＤ／ＡＳＴのための合理化されたＦＩＳＨ方法が、開発された。他の高速ＡＳＴ方法と対比した主要な競合利点が、提供される。本検査は、分化増殖後の特異的病原体の検出、および非無菌ならびに多菌性感染症に関する高速ＡＳＴを有する。結果は、合理化された古典的蛍光原位置ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）である。ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＦＩＳＨとの従来的ＦＩＳＨの比較が、図３７に示される。

ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴ検査は、患者がＵＴＩを有していないかどうか（＜１０Ｋの合計ＣＦＵ／ｍＬ尿）、患者が４つの最も一般的なＵＴＩ病原体のうちの１つに感染しているかどうか、効果的である４つの主要な抗生物質のうちのいずれかを判定する。ワークフローは、増殖培地を含有するカートリッジに尿を直接添加するステップを含む。ＵＴＩ病原体のうちの１つに関して陽性である場合、ＡＳＴに反映される。結果までの時間の目標：ＩＤでは、３０分で、ＡＳＴでは、４時間。

ＵＴＩ ＩＤ検査：マイクロタイタプレート内の研究が、図３８に示される。図３９は、ＵＴＩ病原体に関する高分析感度を示す。検査は、３０分であり、３０％の尿が、病原体を混入され、４つの異なる尿サンプルが、検査された。本方法は、ＵＴＩに関する一般的閾値である、＜１０Ｋ ＣＦＵ／ｍｌ尿を検出する。

ＵＴＩ ＡＳＴ検査：マイクロタイタプレート内の研究が、図４０に示される。図４１は、ＵＴＩ ＡＳＴ正確度を示す。本方法は、ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＡＳＴ（４時間）を微量液体希釈基準検査（１８時間）と比較した。３～４つのＡｂｘにそれぞれ７～１０株ずつの４つの種が、含まれ、２００件の観察において１つの軽微な誤差があり、非常に大きいまたは大きい誤差はなかった。ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＡＳＴは、基準方法と対比して高い正確度を示した。

図４２は、可変接種レベルに対するＭｕｌｔｉＰａｔｈ高速ＡＳＴロバスト性を示す。４桁を網羅する接種のＡＳＴへの影響が、３つの種および４つの抗生物質に関して検査され、全てのサンプルに関して１００％の本質的一致があった。いかなる接種影響も、４桁を網羅する接種で見られなかった。

図４３は、高速ＡＳＴ結果への多菌性サンプルの影響を示す。添加された非標的細菌は、表皮ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、コリネバクテリウム・ミヌチシマム、黄色ブドウ球菌、アシネトバクター・バウマンニ、サイトロバクター・フレウンディイ、およびクレブシエラ・ニューモニエＮＤＭ１を含んでいた。高レベルの他の細菌の存在下で大腸菌に関するＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＡＳＴを実行した。大腸菌ＭＩＣが、５つの抗生物質に関して基準検査と比較された。＞９８％の本質的一致が、検査された８４個のサンプルに関して基準方法と比較された。イミペネムに関する大腸菌ＭＩＣは、クレブシエラ・ニューモニエＮＤＭ１を分泌する１Ｅ７ＣＦＵ／ｍＬのカルバペネマーゼの存在下で影響を受けなかった。したがって、高速ＡＳＴ結果は、多菌性サンプルによる影響を受けなかった。

図４４は、ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴからの結果を示す。プラットフォーム上でＩＤ／ＡＳＴを使用する、耐性および敏感大腸菌が、検査された。方法は、３２μｇ／ｍｌクロファジミン内の４時間のインキュベーション後に折畳増殖を測定するステップを含んでいた。プラットフォーム上の自動高速ＭｕｌｔｉＰａｔｈ ＡＳＴの潜在性が、示された。図４５は、オプション１ ＵＴＩ ＩＤ／ＡＳＴ概要を示す。

ある範囲の血液サンプルを横断したＬＦ検査性能が、追究された。全血サンプルが、５４人の患者に由来した。各サンプルが、ＬＦ検定において未混入および１５０ｐｇ／ｍｌのＬＦを混入された状態の両方で検査された。全てのサンプルが、単一の例外を伴って、混入または未混入として正確に識別された。結果が、下記の表１２および表１３に示される。図４６は、ＦＩＳＨプローブ包括性を示す。図４７は、ＦＩＳＨプローブ排他性を示す。５５株が、交差反応性および微生物干渉仕様に関して検査された。

プラットフォームおよびワークフロー
ＭｕｌｔｉＰａｔｈプラットフォームが、使用されてもよい。プラットフォームは、卓上のサンプルから回答の検査器具（分析器）である。いかなるサンプル調製または培養／単離も、要求されない。生物識別（ＩＤ）または抗生物質感受性検査（ＡＳＴ）、もしくはそれらの組み合わせ／変異型のために、１つのカートリッジ内で１つのサンプルを検査する。８時間シフトあたり約４０個の患者サンプルを実行する。約１／２時間（ＩＤ）および４時間（ＡＳＴ）の検査結果である。検査メニュー：拡張可能なカートリッジバーコードが、検査およびサンプル識別を含有する。場所：医師の診察室、救急、または病院の検査室。サイズ：約幅１５インチ（３８ｍｍ）、高さ１５インチ（３８ｍｍ）、および深さ２４インチ（６１ｍｍ）。電力：１２０～２４０ＶＡＣ、５０～６０Ｈｚ。コンピュータ：内部。通信：顧客ネットワーク／ＬＩＳを介する、またはＵＳＢポートを介して手動。

ワークフローステップは、１）除去可能なラック内に１～５個のカートリッジを装填する、２）検査によって規定されるようなサンプル（例えば、血液、尿、糞便）をカートリッジの中に分注し、全ての試薬がカートリッジ内に含有される、３）ラックを分析器の中に装填する、４）タッチスクリーンを使用し、実行を開始し、結果を報告する、５）除去可能なゴミ箱（最大２０個のカートリッジ）を空にすることを含む。

分析器は、最大２０個のカートリッジを輸送および培養するための回転カルーセルならびにプッシャを有する。分析器は、カートリッジ処理および（３５℃における等の）インキュベーションのための上側コンパートメントと、電子機器、光学系、および空気圧系を備える下側コンパートメントとを有する。例示的プラットフォームカートリッジが、図４８に示される。カートリッジは、そのそれぞれが、最大４回の検定を実施し得る、最大１６個のウェルを含有する。

プラットフォームユーザインターフェース（ＵＩ）は、結果を報告してもよい。タッチスクリーンＵＩが、実行を開始／監視するため、かつ検査結果を表示、印刷、およびエクスポートするために使用される。カートリッジの最終撮像後に、ソフトウェアは、結果を発生させ、データベース内に全ての検査データを記憶する。ＵＩはまた、データベースがクエリを行われ、ソートされるための手段、および他のデータ管理機能も提供する。ソフトウェアは、データをその研究室情報システム（ＬＩＳ）に自動的にアップロードするためにユーザによってアクセスされ得る、ＬＩＳ ＡＰＩを有する。ユーザは、ローカルまたはネットワークプリンタを構成することができる。ソフトウェアは、アクセスを制御するためのユーザ識別および許可レベルを有する。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。

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