PT2857418T - Anticorpos contra toxinas de clostridium difficile e utilizações dos mesmos - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "ANTICORPOS CONTRA TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS"
Antecedentes da invenção
Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria gram positiva que causa doença gastrointestinal em seres humanos. C. difficile é a causa mais comum de diarreia infeciosa em pacientes de hospital, e é uma das mais comuns infeções nosocomiais globais (Kelly et ai., New Eng. J. Med., 330: 257-62, 1994). De facto, a doença associada a este patogénio pode chegar a afetar três milhões de pacientes hospitalizados por ano nos Estados Unidos (McFarland et ai., New Eng. J. Med., 320: 204-10, 1989;
Johnson et ai., Lancet, 336: 97-100, 1990). O tratamento com antibióticos como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas e clindamicina que afetam a flora intestinal normal pode permitir a colonização do intestino com C. difficile, resultando em doença de C. difficile (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998). O aparecimento de doença de C. difficile tipicamente ocorre quatro a nove dias após o inicio do tratamento com antibiótico, mas também pode ocorrer após a descontinuação de terapêutica com antibiótico. C. difficile pode produzir sintomas que variam de diarreia e colite moderada a grave, incluindo colite pseudomembranosa (PMC), uma forma grave de colite caraterizada por dor abdominal, diarreia aquosa, e doença sistémica (por exemplo, febre, náusea). Nesta doença a recaida pode ocorrer em até 20 % dos pacientes tratados para um primeiro episódio de doença, e aqueles que têm uma recaida estão em maior risco de novas recaidas (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998).
Acredita-se que a doença de C. difficile seja causada pelas ações de duas exotoxinas, toxina A e toxina B, no epitélio do intestino. Ambas as toxinas são proteínas de alto peso molecular (280-300 kDa) que catalisam a modificação covalente de proteínas Rho, pequenas proteínas de ligação a GTP envolvidas na polimerização de actina, em células hospedeiras. A modificação de proteínas Rho pelas toxinas inativa-as, levando a despolimerização de filamentos de actina e morte celular. Ambas as toxinas são letais para ratinhos quando injetadas por via parentérica (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998). A doença de C. difficile pode ser diagnosticada por meio de ensaios que detetam a presença ou atividade de toxina A ou toxina B em amostras de fezes, por exemplo, imunoensaios enzimáticos. Os ensaios de citotoxina podem ser utilizados para detetar a atividade de toxina. Para realizar um ensaio de citotoxina, as fezes são filtradas para retirar bactérias, e os efeitos citopáticos de toxinas sobre as células cultivadas são determinados (Merz et ai., J. Clin. Microbiol., 32: 1142-47, 1994). O tratamento de C. difficile é complicado pelo facto de que antibióticos provocam doença associada a C. difficile. Não obstante, os antibióticos são atualmente a opção de tratamento primário. Os antibióticos menos prováveis de causar a doença associada a C. difficile tal como vancomicina e metronidazol são com frequência utilizados. O desenvolvimento de resistência a vancomicina em outros microrganismos é uma causa de preocupação em relação à utilização deste antibiótico para tratamento, já que é o único tratamento eficaz para infeção com outros microrganismos (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250: 127-39, 2000) . As abordagens probióticas, em que se administram a uma pessoa microrganismos não patogénicos que competem presumivelmente por nichos com as bactérias patogénicas, são também utilizadas. Por exemplo, o tratamento com uma combinação de vancomicina e Saccharomyces boulardii foi relatado (McFarland et ai, JAMA., 271(24): 1913-8, 1994. Erratum em: JAMA, 272(7): 518, 1994).
Desenvolveram-se vacinas que protegem animais da inoculação letal em modelos infeciosos da doença (Torres et al., Infect. Immun. 63(12): 4619-27,1995). Além disso, estudos mostraram que os anticorpos policlonais protegem hamsters da doença quando são administrados por meio de injeção ou alimentação (Giannasca et ai., Infect. Immun. 67(2): 527-38, 1999; Kink e Williams, Infect. Immun., 66(5): 2018-25, 1998). Isolaram-se anticorpos monoclonais murinos que se ligam a toxinas de C. difficile e neutralizam as suas atividades in vivo e in vitro (Corthier et al., Infect. Immun., 59(3): 1192-5, 1991). Existem alguns estudos que mostram que os anticorpos policlonais humanos contendo anticorpos de neutralização de toxina podem prevenir a recaida de C. difficile (Salcedo et al., Gut., 41(3): 366-70, 1997). A resposta de anticorpo contra a toxina A tem sido correlacionada com o resultado da doença, o que indica a eficácia das respostas humorais no controle da infeção. Os indivíduos com respostas fortes de ELISA a toxina A apresentaram doença menos grave em comparação com indivíduos com baixos niveis de anticorpo contra a toxina A (Kyne et al., Lancet, 357 (9251): 189-93, 2001) . O papel individual de toxina A e toxina B na patogénese da doença, e o papel de anticorpos antitoxina na proteção contra a doença de C. difficile são controversos e podem depender do hospedeiro. Em seres humanos, a resposta de anticorpo antitoxina A foi correlacionada com o resultado (outcome) da doença, o que sugere um requisito para a resposta protetora da antitoxina A. Esta observação é em contraste com relatos de organismos C. difficile causadores de doença que expressam somente toxina B, implicando que a toxina B pode contribuir para a doença em seres humanos. Estas estirpes toxina A negativas podem também causar a doença em hamsters (Sambol et al., J. Infect. Dis., 183(12): 1760-6, 2001).
Genth et al. (Inf. & Imm. ; vol. 68, n° 3, 2000) revelam o fabrico de anticorpos contra o domínio catalítico nativo (aminoácidos de 1 até 546) de Toxina B de C. difficile e estes anticorpos inibiram a atividade enximática.
Sumário da invenção O assunto da invenção é definido pelas reivindicações apensas. Esta revelação baseia-se, em parte, na descoberta de que a administração de anticorpos contra a toxina A de C. difficile a um indivíduo pode proteger o indivíduo contra a recaída da doença decorrente de C. difficile in vivo. A administração de anticorpos a uma ou tanto a toxina A como a toxina B pode prevenir doença primária decorrente de C. difficile. Os anticorpos de alta afinidade contra as toxinas de C. difficile podem ser produzidos, por exemplo, em ratinhos, tais como ratinhos transgénicos que expressam segmentos de gene da imunoglobulina humana. Estes anticorpos podem neutralizar a citotoxicidade da toxina in vitro, e neutralizar a enterotoxicidade da toxina in vivo. Os anticorpos que reconhecem a toxina A e/ou a toxina B podem inibir e proteger contra a doença in vivo. A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especif icamente à toxina B de
Clostridium difficile (C. difficile), em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58, e em que o anticorpo é um anticorpo humano. Numa forma de realização o anticorpo isolado é um isótipo de IgGl. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo monoclonal da invenção num veiculo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina B de C. difficile com um KD de menos de 10 x 10~10 M como medido por ressonância do plasmão de superfície e neutralize a toxina B de C. difficile, em que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 das SEQ ID NOs: 62, 64 e 66; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de CDRl, CDR2 e CDR3 das SEQ ID NOs: 68, 70 e 72 formulado para administração parentérica.
Numa forma de realização a composição é um anticorpo humano. Numa outra forma de realização o anticorpo é um isótipo de IgGl. A presente invenção também proporciona um anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo da invenção ou uma composição da invenção, para utilização em (a) um método de tratamento do corpo humano ou animal por meio de terapêutica ou num método de diagnóstico levado a cabo no corpo humano ou animal, ou (b) um método de tratamento da doença decorrente de C. difficile num indivíduo, ou (c) um método para prevenir recorrência da doença decorrente de C. difficile num indivíduo.
Numa forma de realização o anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio, ou composição é para utilização de acordo com a invenção e (a) o indivíduo é o ser humano; e/ou (b) o anticorpo, porção de ligação a antigénio ou composição é administrado intravenosamente, intramuscularmente, ou subcutaneamente ao indivíduo.
Numa outra forma de realização o anticorpo monoclonal isolado, porção de ligação a antigénio ou composição é para utilização de acordo com a invenção e o anticorpo, porção de ligação a antigénio ou composição é administrado com um outro agente terapêutico.
Numa outra forma de realização, o anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição é para utilização de acordo com a invenção e o agente terapêutico de coadministração é: (a) um antibiótico, gamaglobulina policlonal, agente probiótico ou vacina de C. difficile; ou (b) vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii ou uma vacina de toxoide de C. difficile.
Numa outra forma de realização, o anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição é para utilização de acordo com a invenção e o agente terapêutico de coadministração é vancomicina ou metronidazol.
Numa outra forma de realização o anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição é para utilização de acordo com a invenção e a doença decorrente de C. difficile a ser tratada é colite pseudomembranosa (PMC) decorrente de C. difficile, diarreia, ou recaida de doença decorrente de C. difficile. São revelados no presente documento anticorpos monoclonais humanos isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile). Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente à toxina A de C. difficile (toxina A). Noutras formas de realização, o anticorpo ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente à toxina B de C. difficile (toxina B) . Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a ambas toxina A e toxina B.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos neutralizam a toxina A in vitro, inibem a ligação de toxina A às células de mamíferos, e/ou inibem a doença decorrente de C. difficile in vivo.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos têm uma ou mais das seguintes caraterísticas: quando são administrados a um ratinho, protegem o ratinho contra a administração de uma toxina de C. difficile numa quantidade que seria fatal a um ratinho de controlo que não se administrou o anticorpo; protegem contra ou inibem colite medida por C. difficile, colite associada a antibiótico, ou colite pseudomembranosa (PMC) num indivíduo; protegem contra ou inibem a diarreia num indivíduo; e/ou inibem a recaida da doença decorrente de C. difficile.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem ligar-se especificamente a um epitopo dentro da metade do terminal N de toxina A, por exemplo, um epitopo entre os aminoácidos 1-1256 de toxina A. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a um epitopo dentro do dominio de ligação do recetor do terminal C da toxina A, por exemplo, um epitopo entre os aminoácidos 1852-2710 da toxina A, ou um epitopo entre os aminoácidos 659-1852, por exemplo, um epitopo dentro de residuos de aminoácidos 900-1852, 900-1200, ou 920-1033 da toxina A. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a um epitopo dentro de aminoácidos 1-600, 400-600, ou 415-540 da toxina A. Outros anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos particulares, podem ligar-se especificamente a um epitopo dentro de residuos de aminoácidos 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 ou 2200-2300, 2300-2400, 2400-2500, 2500-2600, 2600-2710 da toxina A, ou qualquer intervalo, porção ou série dos mesmos.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos especificamente ligam-se a toxina A com um Kd de menos de aproximadamente 20 x 10~6 M. Numa forma de realização particular, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina A com um KD de menos de aproximadamente 10 x 10~7 M, menos de aproximadamente 10 x 10~8 M, menos de aproximadamente 10 x 10~9 M, ou menos de aproximadamente 10 x 10_1° M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina A com um KD de menos de aproximadamente 50 x 10_1° M, menos de aproximadamente 20 x 10_1° M, menos de aproximadamente 15 x 10_1° M, menos de aproximadamente 8 x 10_1° M, ou menos de aproximadamente 5 x 10_1° M.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos incluem uma região de cadeia pesada variável gue inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 1), 1B11 (SEQ ID NO: 2), ou 3H2 (SEQ ID NO: 3).
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos incluem uma região de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma região de cadeia leve variável sequência de aminoácidos do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), ou 3H2 (SEQ ID NO: 6) .
Cada um dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui tanto uma região de cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 1), 1B11 (SEQ ID NO: 2), ou 3H2 (SEQ ID NO: 3), como uma região de cadeia leve variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável do clone 3D8 (SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), ou 3H2 (SEQ ID NO: 6).
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a um epítopo que se sobrepõe com um epítopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11, ou 3H2 e/ou competem pela ligação a toxina A com um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11, ou 3H2.
Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:7-9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15) (também mostrado no Quadro 1).
Uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24) (também mostrado no Quadro 2).
Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:7-9), 1B11 (SEQ ID NOs:10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15), e uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24).
Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9) , 1B11 (SEQ ID NOs:10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs:13- 15) .
Uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24).
Uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui uma ou mais CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18) , 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24), e uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:7-9) , 1B11 (SEQ ID NOs:10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15) . The região variável de cadeia leve pode incluir três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24) .
Uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9) , 1B11 (SEQ ID NOs:10-12), ou 3H2 (SEQ ID N0s:13-15), e uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs:16-18), 1B11 (SEQ ID NOs:19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs:22-24), por exemplo, uma região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada do anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo são idênticas a uma região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 4) , 1B11 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:5), ou 3H2 (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6).
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos neutralizam a toxina B in vitro, inibem a ligação da toxina B às células de mamíferos, e/ou neutralizam a toxina B in vivo.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a um epitopo numa porção terminal C da toxina B (por exemplo, entre os aminoácidos 1777-2366 da toxina B) . Outros anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos particulares, podem ligar-se especificamente a um epitopo dentro de residuos de aminoácidos 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 ou 2200-2366 da toxina B, ou qualquer intervalo, porção ou série dos mesmos.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos especificamente ligam-se a toxina B com um Kd de menos de aproximadamente 20 x 10~6 M. Numa forma de realização particular, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina B com um KD de menos de aproximadamente 10 x 10~7 M, menos de aproximadamente 10 x 10~8 M, menos de aproximadamente 10 x 10~9 M, ou menos de aproximadamente 10 x 10_1° M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina B com um KD de menos de aproximadamente 50 x 10~10 M, menos de aproximadamente 20 x 10_1° M, menos de aproximadamente 15 x 10_1° M, menos de aproximadamente 8 x 10~10 M, ou menos de aproximadamente 5 x 10~10 M.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos incluem uma região de cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54), 2A11, ou 1G10.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos incluem uma região de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em (SEQ ID NO: 58), 2A11, ou 1G10 .
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, cada um, incluem tanto uma região de cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54), 2A11, ou 1G10, como uma região de cadeia leve variável que inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58), 2A11, ou 1G10.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos ligam-se especificamente a um epitopo que se sobrepõe a um epitopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 124-152, 2A11, ou 1G10 e/ou compete para ligar-se à toxina B com um anticorpo produzido pelo clone 124-152, 2A11, ou 1G10.
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10 (Quadro 3).
Uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10 (Quadro 4).
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10, e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10.
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10. A região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10. A região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui uma ou mais CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10, e uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10. A região de cadeia leve variável pode incluir três CDRs que são pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 99 %, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10. A região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10, e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 68, 70, ou 72), 2A11, ou 1G10, por exemplo, uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável do anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo são idênticas a uma região de cadeia leve variável e a uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (SEQ ID NOs: 62, 64, ou 66), 2A11, ou 1G10 .
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem ser anticorpos de comprimento completo, podem incluir um domínio efetor, por exemplo, um domínio Fc, pode ser anticorpos de isótipo gama imunoglobulina, anticorpos de cadeia simples, ou fragmentos Fab. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem incluir ainda um veículo farmaceuticamente aceitável e/ou um marcador.
As composições incluindo os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos são livres de outros polipéptidos humanos (por exemplo, contêm menos de 5 % de polipéptidos humanos diferentes dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos). São reveladas no presente documento composições incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile; e (b) um anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especif icamente a uma exotoxina de C. difficile. 0 anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina A de C. difficile, e o anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina B de C. difficile. Numa forma de realização, o anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina B de C. difficile, e o anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga- se especif icamente à toxina A de C. difficile. Os anticorpos podem incluir outras caraterísticas descritas no presente documento. São revelados no presente documento anticorpos monoclonais humanos isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene VH 3-33 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk humano selecionado a partir do grupo que consiste em Vk L19, Vk L6 e Vk L15. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem incluir outras caraterísticas descritas no presente documento. São revelados no presente documento anticorpos monoclonais humanos isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene VH 5-51 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk A27 humano. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos também podem incluir outras caraterísticas descritas no presente documento. São revelados no presente documento polipéptidos isolados que incluem uma porção de ligação a antigénio de um anticorpo produzido pelo clone de hibridoma 3D8, 1B11, ou 3H2 (também denominado no presente documento como "3D8", "1B11", e "3H2"). São revelados no presente documento polipéptidos isolados que incluem uma porção de ligação a antigénio de um anticorpo produzido pelo clone de hibridoma 124-152, 2A11, ou 1G10 (também denominado no presente documento como "124-152", "2AI1", e "1G10"). São revelados no presente documento anticorpos monoclonais isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente a uma exotoxina de C. difficile, neutralizam a toxina, inibem, e/ou protegem da doença decorrente de C. difficile. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos são anticorpos de mamiferos (por exemplo, seres humanos) ou porções de ligação a antigénio dos mesmos. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos podem incluir outras caraterísticas descritas no presente documento. São reveladas no presente documento composições incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especif icamente à toxina A de C. difficile; e (b) um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente à toxina B de C. difficile.
São revelados no presente documento ácidos nucleicos isolados que incluem uma sequência que codifica polipéptidos pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs:38, 39, 40, 35, 36, ou 37. A invenção também carateriza vetores de expressão incluindo um ácido nucleico que codifica um polipéptido pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs:l,2, 3, 4, 5, ou 6; por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs:38, 39, 40, 35, 36, ou 37, bem como células hospedeiras, por exemplo, células bacterianas, por exemplo, células de E. coli, incluindo um ácido nucleico que codifica um polipéptido pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4, 5, ou 6; por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs:38, 39, 40, 35, 36, ou 37 . São revelados no presente documento isolado ácidos nucleicos incluindo um sequência que codifica um polipéptido que é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs: 54, 56, 58, ou 60, por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 55, 57, 59, ou 61. A invenção também carateriza vetores de expressão incluindo um ácido nucleico que codifica um polipéptido pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs: 54, 56, 58, ou 60, por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 55, 57, 59, ou 61. A invenção também proporciona células hospedeiras, por exemplo, células bacterianas, por exemplo, células de E. coli, que incluem um ácido nucleico que codifica um polipéptido que é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idênticas às SEQ ID NOs: 54, 56, 58, ou 60, por exemplo, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 %, ou mais idêntica às SEQ ID NOs: 55, 57, 59, ou 61.
As células hospedeiras podem também ser células eucarióticas, por exemplo, células de levedura, células de mamíferos, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NS0, ou células de mieloma.
Num outro aspeto, a invenção carateriza kits incluindo um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo da invenção. O kit pode incluir instruções para utilização na prevenção ou tratamento de doença decorrente de C. difficile. 0 kit pode incluir ainda um anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente uma exotoxina de C. difficile. 0 anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina B de C. difficile. São revelados no presente documento kits incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga especif icamente à toxina A de C. difficile; e (b) um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga especificamente à toxina B de C. difficile. São revelados no presente documento métodos de tratamento de C. difficile doença num indivíduo por meio da administração ao indivíduo de um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) numa quantidade eficaz para inibir a doença de C. difficile, por exemplo, colite medida por C. difficile, colite associada a antibiótico, colite pseudomembranosa (PMC) decorrente de C. difficile, ou diarreia, ou recaida da doença decorrente de C. difficile. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo podem ser administrados, por exemplo, intravenosamente, intramuscularmente, ou subcutaneamente, ao indivíduo. 0 anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo podem ser administrados em separado ou em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um segundo anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo. Num exemplo, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina A de C. difficile, e o segundo anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo liga-se especificamente à toxina B de C. difficile. Em outro exemplo, o segundo agente é um antibiótico, por exemplo, vancomicina ou metronidazol. 0 segundo agente pode ser gamaglobulina policlonal (por exemplo, gamaglobulina humana).
Um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo é administrado o gual inclui uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável idêntica à região de cadeia leve variável e à região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 4 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a SEQ ID NO: 1.
Este anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo é administrado em combinação com um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo que inclui uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável idêntica à região de cadeia leve variável e à região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 58 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a SEQ ID NO: 54).
Um anticorpo ou porção de ligação a antigénio produzido pelo clone 3D8 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 4 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a (SEQ ID NO: 1), é administrado em combinação com um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo produzido pelo clone 124-152 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 58 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a SEQ ID NO: 54). São revelados no presente documento métodos para o fabrico de um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especif icamente a uma exotoxina de C. difficile, por meio da imunização de um animal transgénico não humano que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve humano com uma composição que inclui uma exotoxina inativada, e isolamento de um anticorpo do animal. A exotoxina pode ser inativada, por exemplo, por tratamento com UDP-dialdeido ou por mutação (por exemplo, utilizando métodos recombinantes). 0 método pode incluir ainda avaliar a ligação do anticorpo à exotoxina. São revelados no presente documento são métodos para o fabrico de um anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo pela provisão de um ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo que se liga especif icamente a uma exotoxina de C. difficile, e que expressa o ácido nucleico numa célula hospedeira. É revelado no presente documento um hibridoma ou transfetoma que inclui um ácido nucleico que codifica porções de ligação a antigénio (por exemplo, CDRs, ou regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11, ou 3H2. É revelado no presente documento um hibridoma ou transfetoma que inclui um ácido nucleico que codifica porções de ligação a antigénio (por exemplo, CDRs, ou regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 124-152, 2A11, ou 1G10. É revelado no presente documento um método para o fabrico de um hibridoma que expressa um anticorpo que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile por meio da imunização de um animal transgénico não humano que tem um genoma que inclui um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve humano, com uma composição que inclui a exotoxina, em que a toxina é inativada; isolamento de esplenócitos do animal; geração de hibridomas a partir dos esplenócitos; e selecção de um hibridoma que produz um anticorpo que se liga especificamente à exotoxina. 0 tratamento de seres humanos com anticorpos monoclonais humanos oferece diversas vantagens. Por exemplo, os anticorpos são provavelmente menos imunogénicos em seres humanos que anticorpo não humanos. A terapêutica é rápida; a inativação da toxina pode ocorrer tão logo o anticorpo alcance os locais de infeção e neutralize diretamente a(s) toxina(s) que causa(m) a doença. Os anticorpos humanos localizam locais apropriados em seres humanos mais eficientemente que os anticorpos não humanos. Além disso, o tratamento é especifico para C. difficile, e é improvável que destrua a flora intestinal normal, ao contrário da terapêutica tradicional com antibióticos.
Outras caraterísticas e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um quadro que faz uma lista das sequências de aminoácidos das cadeias VH e VL codificadas pelas sequências de ARNm de cada clone. As letras em minúsculas representam aminoácidos no péptido lider. As CDRs são sublinhadas. 0 clone 3D8, que expressa 6 regiões V de cadeia leve únicas, somente expressou a sequência de aminoácidos do grupo I.
A Figura 2A é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 3D8. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas.
A Figura 2B é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 3D8. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 3A é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 1B11. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 3B é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 1B11. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 4A é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 33.3H2 (denominado no presente documento como 3H2; 33.3H2 e 3H2 são utilizados intercambiavelmente no presente documento). Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 4B é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 33.3H2. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 5 é um gráfico que representa os resultados de ensaios ELISA, que mediram a ligação de anticorpos monoclonais antitoxina A à toxina A.
As Figuras 6A-B são um conjunto de gráficos que representa os resultados de ensaios de neutralização in vitro na presença e ausência de anticorpos monoclonais antitoxina A. A FIG. 6A representa os resultados para ensaios realizados com células IMR-90. A FIG. 6B representa os resultados para ensaios realizados com células T-84. A Figura 7 é uma representação esquemática da toxina A polipéptido, que indica fragmentos que foram analisados para estudos de mapeamento de epítopos. A Figura 8A-B são representações esquemáticas dos fragmentos de toxina A analisados para estudos de mapeamento de epítopos. A Figura 9 é um quadro que faz uma lista dos resultados de ensaios in vivo para determinar a proteção de ratinho contra inoculação letal com toxina A por anticorpos monoclonais antitoxina A. A Figura 10 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de acumulação de fluidos na alça ileal de ratinhos para medir a eficácia de neutralização de anticorpo antitoxina in vivo. A Figura 11A é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de recaída em hamsters. A Figura 11B é um gráfico que representa os resultados dos ensaios como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. A Figura 12 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. A Figura 13 é um gráfico que representa os resultados de ensaios em que a neutralização in vitro da toxina A e toxina B foi medida na presença e ausência de antissoros policlonais de cabras imunizadas com toxoide B. "G330" refere-se a amostras em que soros de cabra #330 foram testados. "G331" refere-se a amostras em que soros de cabra #331 foram testados. A Figura 14 é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de recaida em hamsters. A Figura 15 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaida em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8, vancomicina e antissoros de cabra #331, ou vancomicina, 3D8, e antissoros de cabra #331. A Figura 16 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaida em hamsters como a percentagem de animais saudáveis após tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. "Cabra 331" refere-se a antissoros de cabra #331. A Figura 17 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaida em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8, ou não receberam tratamento. A Figura 18 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaida em hamsters como a percentagem de animais saudáveis após tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina. A Figura 19 é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de inoculação direta com C. difficile. "331" refere-se a antissoros de cabra #331. "Clinda" refere-se a tratamento com clindamicina. A Figura 20 é um gráfico que representa os resultados de modelo de inoculação direta como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. difficile. A Figura 21 é um gráfico que representa os resultados de modelo de inoculação direta como a percentagem de animais saudáveis após inoculação direta com C. difficile. A Figura 22 é uma representação da sequência de aminoácidos da toxina A de C. difficile. A Figura 23 é uma representação da sequência de aminoácidos da toxina B de C. difficile. A Figura 24 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. difficile. A Figura 25 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. difficile. A Figura 26 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. difficile. A Figura 27 é um gráfico que representa os resultados de ensaios em que a neutralização in vitro da toxina A e toxina B foi medida na presença de anticorpos monoclonais contra a toxina B ou soros policlonais de cabra contra a toxina B. A Figura 28 é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 29 é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 30 é uma representação da sequência germinal relacionada e aminoácido da cadeia VH expressa pelo clone 124-152. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 31 é uma representação das sequências germinais relacionadas e aminoácido da cadeia VL expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 32 é uma representação esquemática do polipéptido da toxina B, que indica os fragmentos que foram analisados para estudos de mapeamento de epitopos.
Simbolos de referência similares nos vários desenhos indicam elementos similares.
Descrição detalhada da Invenção A fim de proporcionar um entendimento claro da memória descritiva e reivindicações, as seguintes definições são convenientemente proporcionadas a seguir. Definições 0 termo "toxina A" refere-se à proteina de toxina A codificada por C. difficile. A sequência de aminoácidos da toxina A de C. difficile (SEQ ID NO: 41) é proporcionada em GenBank® sob número de acesso A37052, versão GI 98593 (veja-se também Figura 22). "Toxina B" refere-se à proteina de toxina B codificada por C. difficile. A sequência de aminoácidos da toxina B de C. difficile (SEQ ID NO: 42) é proporcionada em GenBank® sob número de acesso S70172, versão GI 7476000 (veja-se também Figura 23). "Proteína" é utilizada intercambiavelmente com "polipéptido."
Um "anticorpo anti-C. difficile" é um anticorpo que interage com (por exemplo, liga-se a) uma proteína ou outro componente produzido por bactérias C. difficile. Um "anticorpo antitoxina" é um anticorpo que interage com uma toxina produzida por C. difficile (por exemplo, toxina A ou toxina B). Um anticorpo de proteína antitoxina pode ligar-se a um epítopo, por exemplo, um epítopo conformacional ou um epítopo linear, ou a um fragmento da proteína de toxina de comprimento completo.
Um "anticorpo humano", é um anticorpo que tem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências germinais de imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos descritos no presente documento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências germinais de imunoglobulina humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagénese aleatória ou específica de um locus in vitro ou por meio de mutação somática in vivo).
Um anticorpo antitoxina, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pode ser administrado em separado ou em combinação com um segundo agente. O indivíduo pode ser um paciente infectado com C. difficile, ou que tem um sintoma de doença associada a C. difficile ("CDAD"; por exemplo, diarreia, colite, dor abdominal) ou uma predisposição para a doença associada a C. difficile (por exemplo, que está a passar por tratamento com antibióticos, ou que sofreu da doença associada a C. difficile e em risco de recaída da doença). O tratamento pode ser para curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, paliar, recuperar, ou afetar a infeção e a doença associada à infeção, os sintomas da doença, ou a predisposição para a doença.
Uma quantidade de um anticorpo antitoxina eficaz para tratar uma CDAD, ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz", é uma quantidade do anticorpo que é eficaz, em administração de dose única ou doses múltiplas a um indivíduo, na inibição de CDAD num indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como a estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que os efeitos terapeuticamente benéficos têm mais importância que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo. A capacidade de um anticorpo de inibir um parâmetro mensurável pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo de eficácia em seres humanos. Por exemplo, a capacidade de um anticorpo antitoxina de proteger os ratinhos contra a inoculação letal com C. difficile pode predizer a eficácia em seres humanos. Outros modelos animais predicativos de eficácia são descritos no presente documento, tais como o modelo de ligação intestinal descrito nos Exemplos. Alternativamente, esta propriedade de um anticorpo ou composição de anticorpo pode ser avaliada por meio do exame da capacidade do composto de modulação, tal modulação in vitro pode ser avaliada por meio de ensaios conhecidos do perito na especialidade. Os ensaios in vitro incluem ensaios de ligação, tais como ELISA, e ensaios de neutralização.
Uma quantidade de um anticorpo antitoxina eficaz para prevenir um distúrbio, ou "uma quantidade profilaticamente eficaz", do anticorpo é uma quantidade que é eficaz, em administração de dose única ou doses múltiplas ao indivíduo, na prevenção ou atraso da ocorrência do aparecimento ou recorrência de CDAD, ou inibição de um sintoma da mesma. No entanto, se intervalos de tempo mais longos de proteção são desejados, doses aumentadas podem ser administradas.
Os termos "agonizar", "induzir", "inibir", "potencializar", "elevar", "aumentar", "diminuir", ou similares, por exemplo, que denotam diferenças quantitativas entre dois estados, referem-se a uma diferença, por exemplo, uma diferença estatisticamente ou clinicamente significativa, entre os dois estados.
Como é utilizado no presente documento, "ligação especifica" ou "liga-se especificamente a" refere-se à capacidade de um anticorpo de: (1) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade de pelo menos 1 x 107 M_1, e (2) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que a sua afinidade para um antigénio não especifico.
Um "anticorpo" é uma proteina que inclui pelo menos uma ou duas regiões variáveis da cadeia pesada (H) (abreviadas no presente documento como VHC) e pelo menos uma ou duas regiões variáveis da cadeia leve (L) (abreviadas no presente documento como VLC). As regiões VHC e VLC podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, denominadas "regiões de determinação de complementaridade" ("CDR, interpoladas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões framework" (FR) . A extensão da região framework e das CDRs foi definida com exatidão (veja-se, Rabat, E. A., et ai. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242, 1991, e Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987,) . Preferentemente, cada VHC e VLC está composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas desde o terminal amino até o terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A cadeia VHC ou VLC do anticorpo pode incluir ainda toda ou parte de uma região constante de cadeia leve ou pesada. Numa forma de realização, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, em que as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina são interligadas por meio de, por exemplo, ligações de dissulfeto. A região constante de cadeia pesada inclui três dominios, CHI, CH2 e CH3. A região constante de cadeia leve está compreendida de um dominio, CL. A região variável das cadeias leves e pesadas contém um dominio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos tipicamente medeiam a ligação do anticorpo to tecidos ou fatores do hospedeiro, que inclui várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico. 0 termo "anticorpo" inclui imunoglobulinas intactas dos tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (bem como subtipos dos mesmos) , em que as cadeias leves da imunoglobulina podem ser de tipos capa ou lambda. "Imunoglobulina" refere-se a uma proteina que consiste num ou mais polipéptidos substancialmente codificados pelos genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina humana reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa (IgAl e IgA2), gama (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon, e mu, bem como os genes da região variável da imunoglobulina miriades. As "cadeias leves" da imunoglobulina de comprimento completo (aproximadamente 25 KD e 214 aminoácidos) são codificadas por um gene da região variável no terminal NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) e um gene da região constante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" da imunoglobulina de comprimento completo (aproximadamente 50 KD e 446 aminoácidos), são codificadas de maneira similar por um gene da região variável (aproximadamente 116 aminoácidos) e um dos outros genes da região constante mencionados anteriormente, por exemplo, gama (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). O termo "imunoglobulina" inclui uma imunoglobulina que tem: CDRs a partir de uma fonte humana ou não humana. O framework da imunoglobulina pode ser humano, humanizado, ou não humano, por exemplo, um framework murino modificado para diminuir a antigenicidade em seres humanos, ou um framework sintético, por exemplo, uma sequência consenso.
Como é utilizado no presente documento, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGi) que é codificada pela região constante de cadeia pesada genes. 0 termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo", ou "porção"), como é utilizado no presente documento, refere-se a uma porção de um anticorpo que se liga especificamente a uma toxina de C. difficile (por exemplo, toxina A), por exemplo, uma molécula em que uma ou mais cadeias de imunoglobulina não são de comprimento completo, mas que se liga especificamente a uma toxina. Os exemplos de porções de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VLC, VHC, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VHC e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VLC e VHC de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et ai., Nature 341: 544-54 6, 198 9), que consiste num domínio VHC; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR) que tem suficiente framework para ligar-se especificamente a, por exemplo, uma porção de ligação a antigénio de uma região variável. Uma porção de ligação a antigénio de uma região variável de cadeia leve e uma porção de ligação a antigénio de uma região variável de cadeia pesada, por exemplo, os dois domínios do fragmento Fv, VLC e VHC, podem se juntados, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que o par de regiões VLC e VHC forma moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja-se, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) . Tais anticorpos de cadeia única são também abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estas porções de anticorpo são obtidas utilizando técnicas convencionais conhecidas daqueles peritos na especialidade, e as porções são rastreadas para utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos. 0 termo "anticorpo monoespecífico" refere-se a um anticorpo que mostra uma afinidade e especificidade de ligação única para um alvo particular, por exemplo, epítopo. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", que como é utilizado no presente documento refere-se a uma preparação de anticorpos ou porções dos mesmos com uma composição molecular única. 0 termo anticorpo "recombinante", como é utilizado no presente documento, refere-se a anticorpos que são preparados, expressos, criados, ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfetado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo recombinante, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico para genes da imunoglobulina humana ou anticorpos preparados, expressos, criados, ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem excisão-reparação de sequências de gene da imunoglobulina humana a outras sequências de ADN. Tais anticorpos recombinantes incluem anticorpos humanizados, enxertados com CDR, quiméricos, gerados in vitro (por exemplo, por meio de apresentação em fagos) , e podem opcionalmente incluir regiões constantes derivadas de sequências germinais de imunoglobulina humana.
Como é utilizado no presente documento, o termo "substancialmente idêntica" (ou "substancialmente homóloga") refere-se a uma primeira sequência de nucleótido ou aminoácido que contém um número suficiente de residuos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral similar, por exemplo, substituições de aminoácidos conservados) de aminoácidos ou nucleótidos a uma segunda sequência de nucleótido ou aminoácido tal que as primeira e segunda sequências de nucleótido ou aminoácido têm atividades similares. No caso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelo menos 50 % da afinidade do primeiro anticorpo.
Os cálculos de "homologia" entre duas sequências são realizados como segue. As sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótimos (por exemplo, espaços podem ser introduzidos numa ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de ácido nucleico ou aminoácido para o alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). O comprimento de uma sequência de referência alinhada para propósitos de comparação é pelo menos 50 % do comprimento da sequência de referência. Os residuos de aminoácidos ou nucleótidos em posições de aminoácido ou posições de nucleótido correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo residuo de aminoácido ou nucleótido como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como é utilizado no presente documento aminoácido ou ácido nucleico "identidade" é equivalente a "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de espaços, e o comprimento de cada espaço, que é necessário que seja introduzido para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de percentagem de homologia entre duas sequências podem ser conseguidas utilizando um algoritmo matemático. A percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-453, 1970, que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz de pontuação de Blossum 62 com uma penalidade de espaço de 12, uma penalidade de extensão de espaço de 4, e uma penalidade de espaço de alteração de grelha de leitura de 5.
Como é utilizado no presente documento, o termo "hibridiza sob condições de restringência baixa, restringência média, restringência alta, ou restringência muito alta" descreve condições para hibridação e lavagem. Orientação para realizar reações de hibridação pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989. Os métodos aquosos e não aquosos são descritos nessa referência e podem ser utilizados. As condições de hibridação especificas denominadas no presente documento são como segue: 1) condições de hibridação de restringência baixa: 6X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por duas lavagens em 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS pelo menos a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada até 55 °C para condições de restringência baixa); 2) condições de hibridação de restringência média: 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C; 3) condições de hibridação de restringência alta: 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C; e 4) condições de hibridação de restringência muito alta: 0,5 M sódio fosfate, 7 % de SDS a 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens a 0,2X de SSC, 1 % de SDS a 65 °C.
Entende-se que os anticorpos e porções de ligação a antigénio dos mesmos descritos no presente documento podem ter substituições de aminoácidos não essenciais ou conservativas adicionais, que não têm um efeito substancial sobre as funções de polipéptido. Se uma substituição particular será tolerada ou não, isto é, não afetará adversamente propriedades biológicas desejadas, tais como atividade de ligação, pode ser determinada como foi descrito em Bowie et al., Science, 247: 1306-1310, 1990. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que um residuo de aminoácido é substituído por um residuo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As familias de residuos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica. Estas familias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Um residuo de aminoácido "não essencial" é um residuo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de um polipéptido, tal como um agente de ligação, por exemplo, um anticorpo, sem substancialmente alterar uma atividade biológica, ao passo que um residuo de aminoácido "essencial" resulta em tal mudança. A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado que comummente entendido por um perito médio na especialidade à qual esta invenção pertence.
Embora métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles descritos no presente documento podem ser utilizados na prática ou realização de testes da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos a seguir. No caso de conflito, a presente memória descritiva, a qual inclui definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não são destinados a serem limitativos.
Visão global 0 C. difficile é uma bactéria gram positiva produtora de toxinas, que causa colite e diarreia associada a antibiótico em seres humanos. Proporcionam-se no presente documento anticorpos e composições para o tratamento e a prevenção de doença associada a C. difficile (CDAD). As composições incluem anticorpos que reconhecem proteínas e outros componentes moleculares (por exemplo, lipidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos) de bactérias C. difficile, que incluem anticorpos que reconhecem toxinas produzidas por C. difficile (por exemplo, toxina A e toxina B). Em particular, proporcionam-se os anticorpos monoclonais humanos. Em certas formas de realização, estes anticorpos monoclonais humanos são produzidos em ratinhos que expressam segmentos de gene da imunoglobulina humana (descritas a seguir). Também se proporcionam combinações de anticorpos antitoxina.
Os anticorpos (e porções de ligação a antigénio dos mesmos) que se ligam a uma toxina de C. difficile descritos no presente documento podem inibir CDAD num indivíduo. Por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina A humanos descritos no presente documento podem neutralizar a toxina A e inibir a recaida da doença decorrente de C. difficile. Em outros exemplos, as combinações de anticorpos antitoxina A (por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina A) e anticorpos antitoxina B podem inibir a doença primária e reduzir a incidência da doença recaida. Os anticorpos monoclonais humanos podem localizar a locais da doença (por exemplo, o intestino) in vivo. 1. Geração de Anticorpos
Imunogénios
Em geral, os animais são imunizados com antigénios expressos por C. difficile para produzir anticorpos. Para produzir anticorpos antitoxina, os animais são imunizados com toxinas inativadas, ou toxoides. As toxinas podem ser inativadas, por exemplo, por tratamento com formaldeído, glutaraldeído, peróxido, ou tratamento com oxigénio (veja-se, por exemplo, Relyveld et ai., Methods in Enzymology, 93: 24, 1983; Woodrow e Levine, eds., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1990). As toxinas mutantes de C. difficile com toxicidade reduzida podem ser produzidas utilizando métodos recombinantes (veja-se, por exemplo, Patentes US 5.085.862; 5.221.618; 5.244.657; 5.332.583; 5.358.868; e 5.433.945). Por exemplo, mutantes que contêm deleções ou mutações pontuais no local ativo da toxina podem ser feitas. Os fragmentos recombinantes das toxinas podem ser utilizados como imunogénios. Outro enfoque é inativar a toxina por tratamento com UDP-dialdeído (Genth et ai., Inf. and Immum., 68(3): 1094-1101, 2000). Este método preserva a estrutura nativa da toxina mais prontamente que outros tratamentos, e assim pode provocar anticorpos mais reativos à toxina nativa. Este método é também descrito no Exemplo 1, a seguir.
Os anticorpos antitoxina que se ligam e neutralizam a toxina A podem interagir com epítopos específicos da toxina A. Por exemplo, um anticorpo antitoxina A pode ligar-se a um epítopo numa região N-terminal da toxina A (por exemplo, entre os aminoácidos 1-1033 da toxina A), ou uma região C-terminal (por exemplo, entre os aminoácidos 1853-2710 da toxina A) . Num exemplo, um anticorpo que se liga a e neutraliza a toxina A liga-se a um epítopo, dentro dos aminoácidos 1853-2710 da toxina A.
De maneira similar, os anticorpos antitoxina B podem reconhecer um epitopo especifico da toxina B, por exemplo, um epitopo N-terminal, ou um epitopo C-terminal. Num exemplo, um anticorpo que se liga a e neutraliza a toxina B liga-se a um epitopo dentro de aminoácidos 1777-2366 da toxina B.
Geração de Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de uma maneira não possivel com anticorpos policlonais. Os antissoros policlonais variam de animal a animal, ao passo que preparações monoclonais exibem uma especificidade antigénica uniforme. Os sistemas de animais murinos são úteis para gerar anticorpos monoclonais, e protocolos de imunização, técnicas para isolar e fusionar esplenócitos, e métodos e reagentes para produzir hibridomas são bem conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, que inclui metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Veja-se geralmente,
Harlow, E. e Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI, 1988 .
Embora estas técnicas padrão sejam conhecidas, é desejável utilizar anticorpos humanos ou humanizados ao invés de anticorpos murinos para tratar humano individuos, porque os seres humanos montam uma resposta imune a anticorpos de ratinhos e outras espécies. A resposta imune a anticorpos murinos é chamada uma resposta de anticorpo anti-ratinho humano ou resposta HAMA (Schroff, R. et al., Cancer Res., 45, 879-885, 1985) e é uma condição que causa a doença do soro em seres humanos e resulta em rápida depuração dos anticorpos murinos da circulação do indivíduo. A resposta imune em seres humanos mostrou-se ser contra ambas as regiões variáveis e constantes de imunoglobulinas murinas. Os anticorpos monoclonais humanos são mais seguros para administração a seres humanos gue os anticorpos derivados de outros animais e anticorpos policlonais humanos.
Um tipo de animal no qual é útil gerar anticorpos monoclonais humanos é um ratinho transgénico que expressa genes da imunoglobulina humana ao invés dos seus próprios genes da imunoglobulina de ratinho. Tais ratinhos transgénicos, por exemplo, ratinhos "HuMAb™", contêm miniloci de gene da imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e leve k humana não rearranjadas, juntamente com mutações alvo que inativam os loci de cadeia μ e κ endógena (veja-se, por exemplo, Lonberg, N. et al., Nature 368(6474): 856-859, 1994, e Patente US 5.770.429). Consequentemente, os ratinhos exibem expressão reduzida de IgM ou κ de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesada humanos introduzidos passam por comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGK humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al., supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; Lonberg, N. e Huszar, D. , Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995, e Harding, F. e Lonberg, N. , Ann. N.Y. Acad. Sei., 764: 536-546, 1995).
A preparação de tais ratinhos transgénicos é descrita em mais detalhe em Tailor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295, 1992; Chen, J. et al., International Immunology 5: 647-656, 1993; Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90: 3720-3724, 1993; Choi et al., Nature Genetics, 4: 117-123, 1993; Chen, J. et al., EMBO J., 12: 821-830, 1993; Tuaillon et al., J. Immunol., 152: 2912-2920, 1994; Tailor, L. et al., International Immunology, 6: 579-591, 1994; e Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996. Veja-se ainda, Patente US 5.545.806; Patente US 5.569.825, Patente US 5.625.126, Patente US 5.633.425, Patente US 5.661.016, Patente US 5.770.429, Patente US 5.789.650, Patente US 5.814.318, Patente US 5.874.299 e Patente US 5.877.397, todos por Lonberg e Kay, e Publicação PCT N° WO 01/14424, Publicação PCT N° WO 98/24884, Publicação PCT N° WO 94/25585, Publicação PCT N° WO 93/1227, e Publicação PCT N° WO 92/03918.
Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos a um antigénio, os ratinhos HuMAb podem ser imunizados com um imunogénio, como foi descrito por Lonberg, N. et al. Nature, 368(6474): 856-859, 1994; Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996 e documento WO 98/24884. Preferentemente, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade na primeira imunização. Por exemplo, uma preparação purificada de toxina A inativada pode ser utilizada para imunizar os ratinhos HuMAb intraperitonealmente. Para gerar anticorpos contra proteínas, lipidos, e/ou moléculas de hidrato de carbono de C. difficile, os ratinhos podem ser imunizados com organismos C. difficile mortos ou não viáveis.
Os ratinhos transgénicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações IP semana sim, semana não (até um total de 6) com antigénio em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma que estão a ser obtidas por sangramentos retroorbitais. O plasma pode ser rastreado, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo, e ratinhos com titulações suficientes de imunoglobulina antitoxina humana pode ser utilizado para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes de sacrifício e retirada do baço. Espera-se que 2-3 fusões para cada antigénio possam ser necessárias de serem realizadas. Diversos ratinhos são tipicamente imunizados para cada antigénio.
Os esplenócitos de ratinhos podem ser isolados e fusionados com PEG a uma linha de célula de mieloma de ratinhos com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes são então rastreados para a produção de anticorpos específicos a antigénio. Por exemplo, as suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados são fusionadas a um sexto do número de células de mieloma de ratinho não secretor P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50 % de PEG. As células são colocadas em placa a aproximadamente 2xl05 em placa para microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo que contém 20 % de Soro fetal de Clone, 18 % de meios condicionados "653", 5 % de Origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e lx de HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão) . Após duas semanas, as células são cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Os sobrenadantes de poços individuais são então rastreados por ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais de célula antitoxina humanos. O anticorpo que secreta hibridomas é colocado em placa de novo, rastreado de novo, e se ainda for positivo para IgG humana, os anticorpos monoclonais antitoxina, podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitativa. Os subclones estáveis são então cultivados in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caraterização.
Numa forma de realização, o animal transgénico utilizado para gerar anticorpos humanos contra a toxina contém pelo menos uma, tipicamente 2-10, e algumas vezes 25-50 ou mais cópias do transgene descrito no Exemplo 12 do documento WO 98/24884 (por exemplo, pHCl ou pHC2) criados com um animal que contém uma cópia única de um transgene de cadeia leve descrito nos Exemplos 5, 6, 8, ou 14 do documento WO 98/24884, e a criação da progénie com o animal JH deletado descrito no Exemplo 10 do documento WO 98/24884. Os animais são criados à homozigosidade para cada um destes três traços. Tais animais têm o seguinte genótipo: uma cópia única (por conjunto haploide de cromossomas) de um mini-locus não rearranjado de cadeia pesada humana (descrito no Exemplo 12 do documento WO 98/24884), uma cópia única (por conjunto haploide de cromossomas) de uma construção de cadeia leve K rearranjada humana (descrita no Exemplo 14 do documento WO 98/24884), e uma deleção em cada locus de cadeia pesada endógena de ratinho que retira todos os segmentos JH funcionais (descritos no Exemplo 10 do documento WO 98/24884) . Tais animais são criados com ratinhos que são homozigóticos para a deleção dos segmentos JH (Exemplo 10 do documento WO 98/24884) para produzir a progénie que são homozigóticos para a deleção JH e hemizigóticos para as construções de cadeia pesada e leve humana. Os animais resultantes são injetados com antigénios e utilizados para a produção de anticorpos monoclonais humanos contra estes antigénios.
As células B isoladas de tal animal são monoespecíficas com relação às cadeias leves e pesadas humanas porque contêm somente uma cópia única de cada gene. Além disso, serão monoespecíficas com relação a cadeias pesadas humanas ou de ratinhos porque ambas cópias de gene de cadeia pesada endógena de ratinho são não funcionais por virtude da abrangência da deleção a região JH introduzida como foi descrita nos Exemplos 9 e 12 do documento WO 98/24884. Além disso, uma fração substancial das células B serão monoespecíficas com relação às cadeias leves humanas ou de ratinho, porque a expressão da cópia única do gene de cadeia leve rearranjada capa humana excluirá alelicamente e isotipicamente o rearranjo dos genes de cadeia capa e lambda endógena de ratinho numa fração significativa de células B.
Numa forma de realização, o ratinho transgénico exibirá produção de imunoglobulina com um repertório significativo, de maneira ideal substancialmente similar a essa de um ratinho nativo. Assim, por exemplo, nas formas de realização onde os genes Ig endógenos foram inativados, os niveis de imunoglobulina total variarão desde aproximadamente 0,1 até 10 mg/ml de soro, por exemplo, 0,5 a 5 mg/ml, ou pelo menos aproximadamente 1,0 mg/ml. Quando um transgene capaz de efetuar uma comutação a IgG a partir de IgM foi introduzido no ratinho transgénico, a razão de ratinho adulto de soro IgG a IgM é preferentemente aproximadamente 10:1. A razão IgG a IgM será muito menor no ratinho imaturo. Em geral, superior a aproximadamente 10 %, por exemplo, aproximadamente 40 a 80 % do baço e as células B de nódulos linfáticos expressarão exclusivamente proteina IgG humana. O repertório no ratinho transgénico será aproximado de maneira ideal a esse mostrado num ratinho não transgénico, usualmente pelo menos aproximadamente 10 % como máximo, preferentemente 25 a 50 % ou mais como máximo. Geralmente, pelo menos aproximadamente mil imunoglobulinas diferentes (de maneira ideal IgG), preferentemente 104 a 106 ou mais, serão produzidas, dependendo primariamente do número de regiões V, J, e D diferentes introduzidas no genoma do ratinho. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade para os antigénios pré-selecionados de pelo menos aproximadamente ΙΟ7 Μ-1, ΙΟ9 Μ-1, ΙΟ10 Μ-1, 1011 Μ-1, 1012 M_1, ou mais, por exemplo, até 1013 M_1 ou mais.
Os ratinhos HuMAb podem produzir células B gue passam por comutação de classe via recombinação de comutação intratransgene (comutação cis) e expressam imunoglobulinas reativas com a toxina. As imunoglobulinas podem ser anticorpos de sequência humana, em que os polipéptidos de cadeia pesada e leve são codificados por sequências de transgene humana, que podem incluir sequências derivadas por meio de mutação somática e juntas de recombinação de região V, bem como sequências codificadas por linhas germinais. Estas imunoglobulinas de sequência humana podem ser denominadas como sendo substancialmente idênticas a uma sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene VL ou VH humano e um segmento JL ou JL humano, mesmo embora outras sequências não de linhas germinais podem estar presentes como um resultado de mutação somática e juntas de recombinação V-J e V-D-J diferencial. Com relação a tais anticorpos de sequência humana, as regiões variáveis de cada cadeia são tipicamente pelo menos 80 por cento codificadas pela linha germinal humana V, J, e, no caso de cadeias pesadas, D, segmentos de gene. Com frequência pelo menos 85 % das regiões variáveis são codificadas pelas sequências de linhas germinais humanas presentes no transgene. Com frequência 90 ou 95 % ou mais das sequências de região variável são codificadas por sequências de linhas germinais humanas presentes no transgene. No entanto, uma vez que as sequências não de linhas germinais são introduzidas por meio de mutação somática e junção VJ e VDJ, os anticorpos de sequência humana terão com frequência algumas sequências de região variável (e com menos frequência sequências de região contante) que não são codificadas pelos segmentos de gene humano V, D, ou J como encontrado no (s) transgene(s) humano(s) na linha germinal dos ratinhos. Tipicamente, tais sequências não de linhas germinais (ou posições de nucleótido individuais) agruparão em ou próximas às CDRs, ou em regiões onde mutações somáticas são conhecidas para agrupar.
Os anticorpos de sequência humana que se ligam à toxina podem resultar da comutação de isótipo, tal que os anticorpos humanos que compreendem uma cadeia gama de sequência humana (tal como gama 1, gama 2, ou gama 3) e uma cadeia leve de sequência humana (tal como K) são produzidas. Tais anticorpos de sequência humana de isótipo comutado com frequência contêm uma ou mais mutações somáticas, tipicamente na região variável e com frequência em ou dentro de aproximadamente 10 resíduos de uma CDR) como um resultado de maturação de afinidade e seleção de células B por antigénio, particularmente subsequente à inoculação de antigénio secundário (ou subsequente) . Estes anticorpos de sequência humana de alta afinidade têm afinidades de ligação de pelo menos aproximadamente lxlO9 M-1, tipicamente pelo menos 5xl09 M-1, com frequência maior que lxlO10 M-1, e algumas vezes 5xl010 M_1 a lxlO11 M_1 ou mais .
Os anticorpos antitoxina podem também ser originados em outros mamíferos, que incluem ratinhos não transgénicos, seres humanos, coelhos, e cabras.
Anticorpos antitoxina A
Os anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente à toxina A incluem anticorpos produzidos pelos clones 3D8, 1B11, e 3H2 descritos no presente documento. Os anticorpos com regiões de cadeia leve variável e de cadeia pesada variável que são pelo menos 80 %, ou mais, idênticas às regiões de cadeia leve e pesada variáveis 3D8, 1B11, e 3H2 podem também ligar-se a toxina A. Anticorpos antitoxina A incluem, por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de 3D8, 1B11, ou 3H2 . As CDRs das regiões variáveis da cadeia pesada destes clones são apresentadas no Quadro 1, a seguir Quadro 1. Sequências de Aminoácidos de CDR de Cadeia Pesada
Variável
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas no Quadro 2, a seguir.
Quadro 2. Sequências de aminoácidos de CDR de Cadeia Leve
Variável
As CDRs são as porções de imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antigénio particular. As CDRs correspondentes às CDRs nos Quadros 1 e 2 que têm variações de sequência (por exemplo, substituições conservativas) podem ligar-se a toxina A. Por exemplo, CDRs, em que 1, 2, 3, 4, ou 5 residuos, ou menos de 20 % de residuos totais na CDR, são substituídos ou deletados podem estar presentes num anticorpo (ou porção de ligação a antigénio do mesmo) gue se liga a toxina A.
Do mesmo modo, anticorpos antitoxina podem ter CDRs gue contêm uma seguência consenso, uma vez gue os motivos de seguência conservados entre os múltiplos anticorpos podem ser importantes para a atividade de ligação. Por exemplo, a CDR1 de uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir a sequência de aminoácidos R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A (SEQ ID NO: 25), a CDR2 de uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir a sequência de aminoácidos A-S-X-X-X-S/T (SEQ ID NO:26), e/ou a CDR3 de uma região variável de cadeia leve dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir a sequência de aminoácidos Q-Q-X-X-S/N-X-P/S (SEQ ID NO:27), em que X é qualquer aminoácido. A CDR1 de uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir a sequência de aminoácidos Y-G-M-H (SEQ ID NO:28), e/ou CDR2 de uma região variável de cadeia pesada dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui a sequência de aminoácidos I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G (SEQ ID NO:29), em que X é qualquer aminoácido.
Os anticorpos antitoxina humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto de, ou derivados de, genes da imunoglobulina humana específicos. Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto de, ou derivada de um gene VH3-33 humano. Numerosas sequências para anticorpos derivados deste gene estão disponíveis no GenBank® (veja-se, por exemplo, N° de acesso: AJ555951, N° GI: 29836865; N° de acesso: AJ556080, N° GI: 29837087; N° de acesso: AJ556038, N° GI: 29837012, e outros segmentos de gene VH3-33 humano rearrajados proporcionados no GenBank®). Os anticorpos podem também, ou alternativamente, incluir uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene Vk L19 humano (veja-se, por exemplo, N° de acesso do GenBank® AJ556049, N° GI: 29837033 para uma sequência parcial de um segmento de gene rearranjado Vk L19 humano). Como é conhecido no estado da técnica, e descrito nesta secção, acima, regiões de imunoglobulina variáveis de anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo em que a variabilidade é introduzida a segmentos genómicos que codificam as regiões. Consequentemente, as regiões variáveis derivadas de um gene VH-33 ou Vk L19 humano podem incluir nucleótidos que são diferentes daqueles no gene encontrado em tecidos não linfoides. Estas diferenças de nucleótido são tipicamente concentradas nas CDRs.
Anticorpos antitoxina B
Os anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente à toxina B incluem anticorpos produzidos pelos clones 124-152, 2A11, e 1G10 descritos no presente documento. Os anticorpos com regiões de cadeia leve variável e de cadeia pesada variável que são pelo menos 80 %, ou mais, idênticas às regiões de cadeia leve e pesada variáveis de -152, 2A11, e 1G10 podem também ligar-se a toxina B. Em formas de realização relacionadas, os anticorpos antitoxina B incluem, por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de -152, 2A11, ou 1G10. As CDRs das regiões de cadeia pesada variáveis destes clones são mostradas no Quadro 3, a seguir.
Quadro 3. Sequências de Aminoácidos de CDR de Cadeia Pesada
Variável
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas no Quadro 4, a seguir.
Quadro 4. Sequências de aminoácidos de CDR de Cadeia Leve
Variável
As CDRs são as porções de imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antigénio particular. Em certas formas de realização, as CDRs correspondentes às CDRs nos Quadros 3 e 4 que têm variações de sequência (por exemplo, substituições conservativas) podem ligar-se a toxina B. Por exemplo, as CDRs, em que 1, 2, 3, 4, ou 5 residuos, ou menos de 20 % de residuos totais na CDR, são substituídas ou deletadas podem estar presentes num anticorpo (ou porção de ligação a antigénio do mesmo) que se liga à toxina B.
Os anticorpos antitoxina B humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto de, ou derivadas de, genes da imunoglobulina humana específicos (veja-se Figs. 28-31) . Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto de, ou derivada de um gene VH 5-51 humano. Os anticorpos podem também, ou alternativamente, incluir uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene Vk A27 humano e/ou gene JK1. Como é conhecido no estado da técnica, e descrito nesta secção, acima, regiões de imunoglobulina variáveis de anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo em que a variabilidade é introduzida a segmentos genómicos que codifica as regiões. Consequentemente, as regiões variáveis derivadas de um VH-5-51 humano ou gene Vk A27/JK1 podem incluir nucleótidos que são diferentes daqueles no gene encontrado em tecidos não linfoides. Estas diferenças de nucleótido são tipicamente concentradas nas CDRs. 2. Produção e Modificação de Anticorpos
Muitas formas diferentes de anticorpos antitoxina podem ser úteis na inibição de CDAD. Os anticorpos podem ser dos vários isotipos, que incluem: IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD, ou IgE. Preferentemente, o anticorpo é um isótipo IgG, por exemplo, IgGl. As moléculas de anticorpo podem ser de comprimento completo (por exemplo, um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem incluir somente um fragmento de ligação a antigénio (por exemplo, um Fab, F(ab')2, Fv ou um Fv de fragmento de cadeia única) . Estes incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos), os anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados, bem como porções de ligação a antigénio dos anteriores.
Os anticorpos antitoxina ou porções dos mesmos úteis na presente invenção podem também ser anticorpos recombinantes produzidos por células hospedeiras transformadas com ADN que codifica as cadeias pesadas e leves da imunoglobulina de um anticorpo desejado. Os anticorpos recombinantes podem ser produzidos por meio de técnicas de engenharia genética conhecidas. Por exemplo, os anticorpos recombinantes podem ser produzidos por meio de clonagem de uma sequência de nucleótidos, por exemplo, um ADNc ou ADN genómico, que codifica as cadeias pesadas e leves da imunoglobulina do anticorpo desejado. A sequência de nucleótidos que codifica aqueles polipéptidos é então inserida num vetor de expressão de modo que ambos genes são operativamente ligados as suas próprias sequências de controlo de expressão transcricional e traducional. O vetor de expressão e sequências de controlo de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. Tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas podem ser utilizadas. A expressão em células hospedeiras eucarióticas é preferida porque tais células são mais prováveis de montar e secretar um anticorpo imunologicamente ativo apropriadamente dobrado que células procarióticas. No entanto, qualquer anticorpo produzido que é inativo devido a dobragem imprópria pode ser renaturada de acordo com métodos bem conhecidos (Kim e Baldwin, Ann. Rev. Biochem., 51: 459-89, 1982). É possivel que as células hospedeiras produzissem porções de anticorpos intactos, tais como dimeros de cadeia leve ou dimeros de cadeia pesada, que também são homólogos de anticorpo de acordo com a presente invenção.
Os anticorpos descritos no presente documento também podem ser produzidos num transfetoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfeção de genes como são bem conhecidos no estado da técnica (Morrison, S., Science, 229: 1202, 1985) . Por exemplo, numa forma de realização, o(s) gene (s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo humano, podem ser ligados num vetor de expressão tal como um plasmideo de expressão eucariótico tal como é utilizado num sistema de expressão GS revelado no documento WO 87/04462, documento WO 89/01036 e documento EP 338 841, ou em outros sistemas de expressão bem conhecidos no estado da técnica. O plasmideo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas tais como células CHO ou células NSO ou alternativamente outras células eucarióticas como células derivadas de plantas, fungos ou células de levedura. 0 método utilizado para introduzir estes genes pode ser gualguer método descrito no estado da técnica, tal como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou transfeção balística, em gue células são bombardeadas com microparticulas que portam o ADN de interesse (Rodin, et al. Immunol. Lett., 74(3): 197-200, 2000). Após a introdução destes genes de anticorpo nas células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfetomas que podem então ser amplificados para o seu nivel de expressão e aumentados em escala para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e/ou células utilizando técnicas padrão.
Será entendido que variações nos procedimentos anteriores são úteis na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejado transformar uma célula hospedeira com ADN que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo. A tecnologia de ADN recombinante pode também ser utilizada para retirar algum ou todo o ADN que codifica qualquer ou ambas as cadeias leves e pesadas que não são necessárias para ligar, por exemplo, a região constante pode ser modificada por meio de, por exemplo, deleção de aminoácidos específicos. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de ADN truncadas são úteis nos métodos descritos no presente documento. Além disso, os anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve ligam-se a uma toxina, e a outra cadeia pesada e cadeia leve são especificas para um antigénio diferente da toxina, ou outro epítopo da toxina.
Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos por meio de técnicas de ADN recombinante conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, um gene que codifica a região constante Fc de uma molécula de anticorpo monoclonal murino (ou outras espécies) é digerida com enzimas de restrição para retirar a região gue codifica a Fc murina, e a porção eguivalente de um gene gue codifica uma região constante Fc humana é substituida (veja-se Robinson et ai., Publicação de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., Pedido de Patente Europeia 184.187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171.496; Morrison et al., Pedido de Patente Europeia 173.494; Neuberger et al., Pedido de Patente Internacional WO 86/01533; Cabilly et al. Patente US 4.816.567; Cabilly et al., Pedido de Patente Europeia 125.023; Better et al. (1988 Science, 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS, 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol., 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al, 1987, Cane. Res., 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature, 314: 446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst., 80: 1553-1559). Os anticorpos quiméricos podem também ser criados por meio de técnicas de ADN recombinante onde o ADN que codifica regiões V murinas podem ser ligadas ao ADN que codifica as regiões constantes humanas.
Um anticorpo ou uma cadeia de imunoglobulina pode ser humanizado por métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma vez que os anticorpos murinos sejam obtidos, as regiões variáveis podem ser sequenciadas. A localização das CDRs e residuos framework pode ser determinada (veja-se, Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917). As regiões variáveis de cadeia pesada e leve podem, opcionalmente, ser ligadas às correspondentes regiões constantes. De facto, entende-se que qualquer dos anticorpos descritos no presente documento, que incluem anticorpos completamente humanos, podem ser alterados (por exemplo, por mutação, substituição) para conter uma região constante substituta, por exemplo, região Fc, ou porção (s) da mesma para alcançar, por exemplo, uma estrutura de anticorpo, função (por exemplo, função efetora), subtipo, alotipo, subclasse desejadas, ou similares. Os anticorpos antitoxina podem ser sequenciados utilizando técnicas reconhecidas na especialidade. As moléculas enxertadas com CDR de anticorpo ou imunoglobulinas podem ser produzidas por enxerto de CDR ou substituição de CDR, em que uma, dois, ou todas as CDRs de uma cadeia de imunoglobulina podem ser substituídas. Veja-se, por exemplo, a Patente US 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature, 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science, 239: 1534; Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 4053-4060; e Winter, Patente US 5.225.539.
Winter descreve um método de enxerto de CDR que pode ser utilizado para preparar os anticorpos da presente invenção (Pedido de Patente UK GB 2188638A, depositado em 26 de Março de 1987; Patente US 5.225.539 de Winter) . Por exemplo, todas as CDRs de um anticorpo particular podem ser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR humana (por exemplo, uma CDR do clone 3D8, como é mostrado nos Quadros 1 e 2, e/ou clone 124-152, como é mostrado nos Quadros 3 e 4, acima) ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas. É somente necessário substituir o número de CDRs requerido para a ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado (por exemplo, uma exotoxina de C. difficile) .
Os anticorpos humanizados podem ser gerados por meio da substituição de sequências da região variável Fv que não estão diretamente envolvidas na ligação a antigénio com sequências equivalentes de regiões variáveis Fv humanas. Os métodos gerais para gerar anticorpos humanizados são proporcionados por Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214, e por Queen et al. Patente US 5.585.089, Patente US 5.693.761 e Patente US 5.693.762. Aqueles métodos incluem o isolamento, manejo, e expressão de sequências de ácido nucleico que codificam toda ou parte das regiões variáveis Fv da imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. As fontes de tal ácido nucleico são bem conhecidas a aqueles peritos na especialidade e, por exemplo, podem ser obtidos de um hibridoma que produz um anticorpo contra um alvo predeterminado, como foi descrito anteriormente. 0 ADN recombinante que codifica o anticorpo humanizado, ou fragmento do mesmo, pode então ser clonado num vetor de expressão apropriado. Outras técnicas para humanizar anticorpos são descritas em Padlan et ai. documento EP 519596 Al, publicado em 23 de Dezembro de 1992.
Também dentro do âmbito da invenção são anticorpos nos quais os aminoácidos específicos foram substituídos, suprimidos, ou adicionados. Em particular, os anticorpos preferidos têm substituições de aminoácidos na região framework, tal como para melhorar a ligação ao antigénio. Por exemplo, um número pequeno selecionado de resíduos framework de aceitador da cadeia de imunoglobulina pode ser substituído pelos aminoácidos dadores correspondentes. As localizações preferidas das substituições incluem resíduos de aminoácidos adjacentes à CDR, ou que são capazes de interagir com uma CDR (veja-se, por exemplo, Patente US 5.585.089). Os critérios para selecionar aminoácidos a partir de dador são descritos na Patente US 5.585.089 (por exemplo, colunas 12-16). O framework aceitador pode ser uma sequência framework de anticorpo maduro humano ou uma sequência consenso.
Uma "sequência consenso" é uma sequência formada a partir de aminoácidos de ocorrência mais frequente (ou nucleótidos) numa família de sequências relacionadas (Veja-se, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1987). Numa família de proteínas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido de ocorrência mais frequente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem igualmente com frequência, podem ser incluídos na sequência consenso. Um "framework consenso" de uma imunoglobulina refere-se a uma região framework na sequência consenso da imunoglobulina.
Um anticorpo antitoxina, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional (por exemplo, outro péptido ou proteína) . Por exemplo, um anticorpo pode ser funcionalmente ligado (por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo, um agente detetável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar a associação com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou uma cauda de poli-histidina).
Um tipo de proteína derivatizada é produzido por ligação cruzada de duas ou mais proteínas (do mesmo tipo ou de tipos diferentes). Os agentes de ligação cruzada adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, que tem dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo, disuccinimidil suberato). Tais ligantes estão disponíveis de Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Os agentes detetáveis úteis com os quais uma proteína pode ser derivatizada (ou marcada) incluem compostos fluorescentes, várias enzimas, grupos protéticos, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Os agentes detetáveis fluorescentes exemplares incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, e, ficoeritrina. Uma proteína ou anticorpo pode também ser derivatizada com enzimas detetáveis, tais como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano picante, p-galactosidase, acetilcolinesterase, glucose oxidase e similares. Quando uma proteína é derivatizada com uma enzima detetável, é detetada pela adição dos reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reação detetável. Por exemplo, quando o agente detetável peroxidase de rábano picante está presente, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina leva a um produto de reação corado, que é detetável. Uma proteína pode também ser derivatizada com um grupo protético (por exemplo, estreptavidina/biotina e avidina/biotina). Por exemplo, um anticorpo pode ser derivatizado com biotina, e detetado através de medição indireta de ligação a avidina ou estreptavidina.
As proteínas marcadas e anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, diagnosticamente e/ou experimentalmente num número de contextos, que inclui (i) isolar um antigénio predeterminado por meio de técnicas padrão, tais como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação; e (ii) detetar um antigénio predeterminado (por exemplo, uma toxina, por exemplo, num lisado celular ou uma amostra de paciente) a fim de monitorizar níveis de proteína em tecido como parte de um procedimento de ensaios clínicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Um anticorpo antitoxina ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo pode ser conjugado a outra entidade molecular, tal como um marcador. 3. Métodos de Rastreio
Os anticorpos antitoxina podem ser caraterizados para ligar-se à toxina por uma variedade de técnicas conhecidas. Os anticorpos são tipicamente caraterizados por ELISA primeiro. De maneira breve, as placas de microtitulação podem ser revestidas com o antigénio da toxina ou toxoide em PBS, e então bloqueadas com proteínas irrelevantes tais como albumina de soro bovino (BSA) diluída em PBS. As diluições de plasma de ratinhos imunizados com toxina são adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37 °C. As placas são lavadas com PBS/ Tween 20 e então incubadas com um reagente policlonal específico para Fc de IgG anti-humana de cabra conjugado a fosfatase alcalina durante 1 hora a 37 °C. Após a lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS, e analisadas em OD de 405. Preferentemente, os ratinhos que desenvolvem as titulações mais altas serão utilizados para as fusões.
Um ensaio ELISA como foi descrito anteriormente pode ser utilizado para rastrear para anticorpos e, assim, hibridomas que produzem anticorpos que mostram reatividade positiva com a toxina. Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam, preferentemente com alta afinidade, à toxina podem ser subclonados então e caraterizados adicionalmente. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células originais (por ELISA), pode então ser escolhido para o fabrico de um banco de células, e para purificação de anticorpo.
Para purificar os anticorpos antitoxina de hibridomas selecionados podem ser crescidos em garrafas rolantes, balões centrifugadores de dois litros ou outros sistemas de cultura. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia por afinidade com Sepharose-proteína A (Pharmacia, Piscataway, N.J.) para purificar a proteína. Após permuta de tampão para PBS, a concentração pode ser determinada por métodos espectrofotométricos.
Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados ligam-se a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilados utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, III). A ligação de MAb biotinilados pode ser detetada com uma sonda marcada com estreptavidina. Os anticorpos antitoxina podem ser testados ainda para a reatividade com a toxina por meio de Western blotting.
Outros ensaios para medir a atividade dos anticorpos antitoxina incluem ensaios de neutralização. Os ensaios de neutralização in vitro podem medir a capacidade de um anticorpo de inibir um efeito citopático sobre células em cultura (veja-se Exemplo 3, a seguir). Os ensaios in vivo para medir a neutralização de toxina são descritos nos Exemplos 5, 6, e 7, a seguir. 4. Composições Farmacêuticas e Kits São reveladas no presente documento composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, que incluem uma molécula de anticorpo descrita no presente documento ou porção de ligação a antigénio do mesmo, formulada juntamente com um portador farmaceuticamente aceitável. "Portadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, agentes de atraso de absorção e isotónicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Os portadores podem ser adequados para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, rectal, espinhal, ou epidérmica (por exemplo, por meio de injeção ou infusão).
As composições podem ser numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem liquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções liquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusiveis), dispersões ou suspensões, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composições úteis são na forma de soluções injetáveis e infusiveis. Um modo útil de administração é a parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Por exemplo, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo pode ser para administração por infusão ou injeção intravenosa. Em outra forma de realização, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo é para administração por injeção intramuscular ou subcutânea.
As frases "administração parentérica" e "administrados parentericamente" como é utilizado no presente documento significam modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por meio de injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtragueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra-espinhal, epidural, e intra-esternal.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adeguada para concentração de anticorpo alta. As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas por meio da incorporação do composto ativo (isto é, anticorpo ou porção de anticorpo) na guantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, como for requerido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio da incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos de preparação úteis são secagem por vácuo e liofilização que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser ocasionada pela inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Os anticorpos e porções de anticorpo descritos no presente documento podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica, e para muitas aplicações terapêuticas. Como será apreciado pelo perito na especialidade, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.
Um anticorpo, ou porção de anticorpo do mesmo pode ser administrado oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um portador comestível assimilável. 0 composto (e outros ingredientes, se for desejado) pode também ser incluído numa cápsula de gelatina de cobertura dura ou mole, comprimido em comprimidos, ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração oral terapêutica, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, e similares. Para administrar um composto por via outra que não a administração parentérica, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir sua inativação. As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como for indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária como é utilizada no presente documento refere-se a unidades fisicamente discretas adeguadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias é ditada por e dependente diretamente de (a) as caraterísticas únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes no estado da técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Um intervalo exemplar, não limitativo para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo é 0,1-60 mg/kg, por exemplo, 0,5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg, ou 0,75-10 mg/kg. Entende-se ainda que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o critério profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem indicados no presente documento são exemplares somente e não se pretende que limitem o âmbito ou prática da composição reivindicada. São revelados no presente documento kits que incluem um anticorpo antitoxina ou porção de ligação a antigénio do mesmo. Os kits podem incluir um ou mais outros elementos que incluem: instruções para utilização; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico, ou um agente útil para quelar, ou de outro modo acoplar, um anticorpo a um marcador ou agente terapêutico, ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; portadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um individuo. Várias combinações de anticorpos podem ser embaladas juntas. Por exemplo, um kit pode incluir anticorpos que se ligam a toxina A (por exemplo, os anticorpos que incluem as regiões de cadeia leve e pesada variáveis de 3D8) e anticorpos que se ligam a toxina B (por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina B humanos, por exemplo, 124-152, 2A11, e/ou 1G10, ou antissoros policlonais reativos com toxina B) . Os anticorpos podem ser misturados juntos, ou embalados separadamente dentro do kit.
As instruções para utilização podem incluir instruções para a aplicação terapêutica que inclui dosagens sugeridas e/ou modos de administração, por exemplo, num paciente com um sintoma de CDAD. Outras instruções podem incluir instruções sobre o acoplamento do anticorpo a um quelante, um marcador ou um agente terapêutico, ou para a purificação de um anticorpo conjugado, por exemplo, a partir de componentes de conjugação não reagidos. 0 kit pode incluir um marcador detetável, um agente terapêutico, e/ou um reagente útil para quelar ou de outro modo acoplar um marcador ou agente terapêutico ao anticorpo. Os agentes de acoplamento incluem agentes tais como N-hidroxisuccinimida (NHS). Em tais casos, o kit pode incluir um ou mars de um recipiente de reação para levar a cabo a reação ou um dispositivo de separação, por exemplo, uma coluna cromatográfica, para utilização na separação do produto acabado a partir de materiais de partida ou intermediários de reação. 0 kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional, tal como um agente de diagnóstico ou terapêutico, por exemplo, um agente de diagnóstico ou terapêutico como é descrito no presente documento, e/ou um ou mais anticorpos anti-C. difficile (ou porções do mesmo) ou antitoxina adicionais, formulados conforme for apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas,
Outros kits podem incluir ácidos nucleicos otimizados que codificam anticorpos antitoxina, e instruções para a expressão dos ácidos nucleicos. 5. Composições e Métodos Terapêuticos
As novas proteínas e anticorpos têm utilidades terapêutica, profilática, e de diagnóstico in vitro e in vivo. Por exemplo, estes anticorpos podem ser administrados as células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, a invenção também proporciona anticorpos para utilização in vivo, para tratar, inibir, prevenir a recaída, e/ou diagnosticar C. difficile e doença associada a C. difficile.
Como é utilizado no presente documento, o termo "indivíduo" pretende-se que inclua animais humanos e não humanos. 0 termo "animais não humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, galinhas, ratinhos, cães, gatos, porcos, vacas, e cavalos.
As proteínas e anticorpos podem ser utilizados em células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, as células podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura e a etapa de colocar em contacto pode ser efetuada pela adição do anticorpo antitoxina ou fragmento do mesmo, ao meio de cultura. Os métodos podem ser realizados em viriões ou células presentes num indivíduo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ou profilático). Onde os anticorpos são para utilização in vivo, a etapa de colocar em contacto é efetuada num indivíduo e inclui administrar um anticorpo antitoxina ou porção do mesmo ao indivíduo sob condições eficazes para permitir a ligação do anticorpo, ou porção, a qualquer toxina expressa pelas bactérias no indivíduo, por exemplo, no intestino.
Os métodos de administração de moléculas de anticorpo são descritos no presente documento. As dosagens adequadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e peso do indivíduo e o fármaco particular utilizado. As moléculas de anticorpo podem ser utilizadas como agentes competitivos para ligar ligando para inibir ou reduzir uma interação indesejável, por exemplo, para inibir a ligação de toxinas a o epitélio gastrointestinal.
Os anticorpos antitoxina (ou porções de ligação a antigénio dos mesmos) podem ser administrados em combinação com outros anticorpos anti-C. difficile (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, gamaglobulina policlonal). Combinações de anticorpos que podem ser usados incluem um anticorpo antitoxina A ou porção de ligação a antigénio do mesmo e um anticorpo antitoxina B ou porção de ligação a antigénio do mesmo. 0 anticorpo antitoxina A pode ser 3D8, um anticorpo que inclui as regiões variáveis de 3D8, ou um anticorpo com regiões variáveis pelo menos 90 % idênticas às regiões variáveis de 3D8. O anticorpo antitoxina B pode ser 124-152, 2A11, 1G10, ou um anticorpo com regiões variáveis pelo menos 90 % idênticas às regiões variáveis dos anteriores, por exemplo, 124-152. As combinações de antitoxina A (por exemplo, 3D8) e anticorpos antitoxina B (por exemplo, 124-152) podem proporcionar uma inibição potente de CDAD.
Entende-se que quaisquer dos agentes descritos no presente documento, por exemplo, anticorpos antitoxina A ou antitoxina B, ou fragmentos dos mesmos, podem ser combinados, por exemplo, em razões ou quantidades diferentes, para efeito terapêutico melhorado. De facto, os agentes podem ser formulados como uma mistura, ou ligados quimicamente ou geneticamente utilizando técnicas reconhecidas na especialidade pela presente resultando em anticorpos ligados covalentemente (ou fragmentos de anticorpo ligados covalentemente) , que tem ambas as propriedades de ligação antitoxina A e antitoxina B. A formulação combinada pode ser guiada por uma determinação de um ou mais parâmetros tais como a afinidade, avidez, ou eficácia biológica do agente em separado ou em combinação com outro agente. Os agentes descritos no presente documento podem também ser administrados em combinação com outros agentes que aumentam o acesso, semivida, ou estabilidade do agente terapêutico em alvejar, eliminar, e/ou sequestrar C. difficile ou um antigénio do mesmo.
Tais terapêuticas de combinação são preferentemente aditivas e incluso sinergísticas em sua atividade terapêutica, por exemplo, na inibição, prevenção (por exemplo, de recaída), e/ou tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com C. difficile (veja-se, por exemplo, o Exemplo 16 que mostra a eficácia de terapêuticas de anticorpo único e combinado). A administração de tais terapêuticas de combinação pode diminuir a dosagem do agente terapêutico (por exemplo, anticorpo ou mistura de fragmento de anticorpo, ou anticorpo ou fragmento de anticorpo biespecífico de ligação cruzada ou geneticamente fusionado) necessário para alcançar o efeito desejado.
Composições imunogénicas que contêm uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma toxina, ou fragmentos da mesma, são descritas no presente documento, e podem ser utilizadas na geração de anticorpos antitoxina. Epítopos imunogénicos numa sequência de toxina podem ser identificados de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica, e proteínas, ou fragmentos que contêm aqueles epítopos podem ser distribuídos por vários meios, numa composição de vacina. Composições adequadas podem incluir, por exemplo, lipopéptidos (por exemplo, Vitiello et ai., J. Clin. Invest. 95: 341 (1995)), composições de péptido encapsuladas em poli(DL-lactida-co-glicolida) ("PLG") microesferas (veja-se, por exemplo, Eldridge et ai., Molec. Immunol. 28: 287-94 (1991); Alonso et ai., Vaccine 12: 299-306 (1994); Jones et ai., Vaccine 13: 675-81 (1995)), composições de péptido contidas em complexos imunoestimuladores (ISCOMS) (veja-se, por exemplo, Takahashi et al., Nature 344: 873-75 (1990); Hu et al., Clin. Exp. Immunol. 113: 235-43 (1998)), e sistemas de péptido de antigénio múltiplos (MAPs) (veja-se, por exemplo, Tam, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Um. 85: 5409-13 (1988); Tam, J. Immunol. Methods 196: 17-32 (1996)).
Portadores úteis que podem ser utilizados com composições imunogénicas são bem conhecidos, e incluem, por exemplo, tiroglobulina, albuminas tais como humano albumina de soro, toxoide do tétano, poliaminoácidos tais como poli L- lisina, ácido poli L-glutámico, influenza, proteina de núcleo do virus da hepatite B, e similares. As composições podem conter um diluente fisiologicamente tolerável (isto é, aceitável) tal como água, ou solução salina, tipicamente solução salina tamponada com fosfato. As composições e vacinas também tipicamente incluem um adjuvante. Os adjuvantes tais como adjuvante de Freund incompleto, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, ou alúmen são exemplos de materiais bem conhecidos no estado da técnica. Adicionalmente, respostas CTL podem ser iniciadas por meio da conjugação de toxinas (ou fragmentos, derivados inativos ou análogos das mesmas) a lipidos, tais como tripalmitoil-S-glicerilcisteinil-seril- serina (P3CSS).
Os anticorpos antitoxina podem ser administrados em combinação com outros agentes, tais como composições para tratar CDAD. Por exemplo, as terapêuticas que podem ser administradas em combinação com anticorpos antitoxina incluem antibióticos utilizados para tratar CDAD, tais como vancomicina, metronidazol, ou bacitracina. Os anticorpos podem ser usados em combinação com agentes probióticos tais como Saccharomyces boulardii. Os anticorpos podem também ser administrados em combinações com uma vacina de C. difficile, por exemplo, uma vacina de toxoide. 6. Outros Métodos
Um anticorpo antitoxina (por exemplo, anticorpo monoclonal) pode ser utilizado para isolar toxinas por meio de técnicas padrão, tais como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação. Além disso, um anticorpo antitoxina pode ser utilizado para detetar a toxina (por exemplo, numa amostra de fezes), por exemplo, para rastrear amostras para a presença de C. difficile. Os anticorpos antitoxina podem ser utilizados diagnosticamente para monitorizar os niveis da toxina em tecido como parte de um procedimento de ensaios clinicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Exemplificação
Ao longo dos exemplos, os seguintes materiais e métodos foram utilizados a não ser que de outro modo indicado.
Materiais e Métodos
Em geral, a prática da presente invenção utiliza, a não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de quimica, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia de anticorpo), e técnicas padrão em preparação de polipéptidos. Veja-se, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). EXEMPLOS A invenção é descrita ainda nos seguintes exemplos, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
Exemplo 1. Geração de Anticorpos Monoclonais Antitoxina A A toxina A de C. difficile foi obtida de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) , ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com UDP- dialdeido reativo, que resulta em alquilação de resíduos catalíticos ao mesmo tempo em que preserva a estrutura da toxina nativa. Para o protocolo detalhado, veja-se Genth et ai., Inf e Immun. 68(3): 1094-1101, 2000. De maneira breve, a toxina A purificada foi incubada com UDP-2', 3'-dialdeido (0,1-1,0 mM) em tampão durante 18 horas a 37 °C, filtrada através de um filtro de corte de 100 kDa para retirar UDP-2',3'-dialdeido não reagido, e lavada com tampão. A toxina A inativada (toxoide A) foi utilizada para a imunização.
Os ratinhos transgénicos HCo7, gerados como foi descrito anteriormente na secção intitulada "Geração de Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb" e fornecidos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes, cada um, com 10 μρ de toxoide em adjuvante RIBI. Nos ratinhos transgénicos HCo7, o gene capa de cadeia leve endógena foi quebrado homozigoticamente como foi descrito em Chen et ai. (1993) EMBO J. 12: 811-820 e o gene de cadeia pesada endógena de ratinho foi quebrado homozigoticamente como foi descrito no Exemplo 1 de Publicação PCT WO 01/09187. Os ratinhos transgénicos HCo7 portam um transgene capa de cadeia leve humano, KCo5, como foi descrito em Fishwild et ai. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e o transgene de cadeia pesada humano HCo7 como foi descrito nas Patentes US N° 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. O soro foi colhido de cada ratinho e testado para a reatividade à toxina A por ELISA e neutralização de citotoxicidade em células IMR-90.. Os ratinhos que deram positivo no teste para toxina A-reativo e neutralização de antissoro foram injetados com 5-10 μρ de toxoide A através da veia da cauda. Os ratinhos foram sacrificados e os baços foram isolados para a fusão a hibridomas aproximadamente 3 dias após a injeção na veia da cauda ter sido realizada.
Os hibridomas clonais foram gerados e rastreados por ELISA. Percentagens de cadeia leve capa/gama positivo, especifico a antigénio, e neutralização de clones identificados por rastreio de clones gerados a partir de quatro fusões de hibridoma separadas são indicadas no Quadro 5.
Quadro 5
Três clones de hibridoma foram selecionados para análise adicional: 3D8, 1B11, e 33.3H2. Os ADNc de cada clone foram amplificados por RT-PCR a partir de ARNm, clonado, e sequenciado. Uma sequência consenso de região V de cadeia pesada foi encontrada para cada clone. Todos os três clones utilizaram uma região VH derivada do mesmo gene de região V de linha germinal (VH 3-33), mas utilizaram sequências J diferentes. As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de cada clone são mostradas na Figura 1 (SEQ ID NOs: 1-6) . As regiões de determinação de complementaridade (CDRs) são sobrelinhadas na Figura. A análise da sequência dos genes de capa V (cadeia leve Vk) revelou que cada um de HuMAb 1B11 e 33.3H2 expressa uma sequência consenso da cadeia V capa. 0 hibridoma 1B11 expressou uma cadeia leve Vk derivada do gene da linha germinal Vk L6, ao passo que o hibridoma 33.3H2 expressa uma cadeia leve Vk derivada do gene de linha germinal Vk L15. Na análise dos clones Vk de HuMAb 3D8, 6 (I-VI) cadeias leves foram expressas no nível de ARNm (Figura 1) . Para determinar quais das cadeias leves foram expressas no nível de proteína, espectroscopia de massa e sequenciamento N-terminal do anticorpo 3D8 purificado foram realizados. Quando cadeias leves foram isoladas da proteína celular e analisadas por espectroscopia de massa, uma cadeia leve única foi vista com uma massa de 23,569 Daltons. Isto correspondeu à cadeia leve com a sequência de aminoácidos do grupo I representada na Figura 1, que é derivada do gene de linha germinal Vk L19. 0 sequenciamento N-terminal da cadeia leve confirmou este resultado. As Figuras 2A, 3A, e 4A representam o nucleótido e as sequências de aminoácidos da Vk de cada 3D8 (grupo I; SEQ ID NOs: 4, e 30-34), 1B11 (SEQ ID NO: 5), e 33.3H2 (SEQ ID NO: 6) respetivamente. As CDRs são sobrelinhadas e as Vk e Jk de linha germinal são mostradas.
Assim, o anticorpo 3D8 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L19 humano. O anticorpo 1B11 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L6 humano. O anticorpo 33.3H2 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk L15 humano.
Os anticorpos 3D8 e 1B11 expressam regiões constantes de IgGl humana, e anticorpo 33.3H2 expressa regiões constantes de IgG3 humana. Os anticorpos descritos nos Exemplos 2-7 foram isolados destes hibridomas, e assim expressam as sequências variáveis mostradas na Figura 1 juntamente com regiões constantes humanas. O ADN que codifica a porção de ligação a antigénio de cada clone foi clonado num vetor a ser expresso como um anticorpo humano para administração a seres humanos.
Exemplo 2. Atividade de ligação de Anticorpos Antitoxina A A ligação de cada anticorpo à toxina A foi determinada por ELISA utilizando técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados na Figura 5. Os anticorpos produzidos por 3D8, 1B11, e 33.3H2 foram comparados a um quarto anticorpo monoclonal humano com atividade de ligação a toxina A, 8E6. A Figura 5 mostra que os anticorpos se ligam à toxina A com afinidades comparáveis. A afinidade dos anticorpos 3D8 e 1B11 para a toxina A foi também medida com instrumento Biacore®, que deteta interações de ligação biomolecular com tecnologia de ressonância do plasmão de superfície. Cada anticorpo foi adicionado a chips de sensor revestido com proteina A, e a toxina A foi permitida que flua sobre o chip para medir a ligação. 3D8 teve um KD de 14,6 x ΙΟ-10 Μ. 1B11 teve um KD de 7,38 x 10~10M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina A. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para utilização em terapêutica humana.
Exemplo 3. Neutralização de toxina por Anticorpos Antitoxina A
Os anticorpos expressos por hibridomas 1B11, 3D8, e 33.3H2 foram testados para atividade de neutralização de toxina A in vitro. As células foram incubadas na presença de concentrações variadas da toxina A, o que faz com que as células se reúnam e ocorra a perda da aderência às placas de cultura de células. 0 efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual de células. Uma pontuação de CPE desde 0-4 foi determinada, com base nos resultados da inspeção visual (4 = 100 % de citotoxicidade, 0 = 0 % de toxicidade). Os resultados destes ensaios são representados nas Figuras 6A e 6B. A neutralização de toxicidade contra uma linha de células de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90, e uma linha de células epiteliais de intestino humano, T-84, foi determinada. A Figura 6A mostra que todos os anticorpos tiveram capacidade de neutralização para as células IMR-90. A atividade de neutralização relativa da citotoxicidade de toxina A em células IMR-90 foi 1B11 > 3H2 > 3D8. De maneira interessante, a atividade de neutralização relativa foi 3D8 >1B11 > 3H2 contra células T-84, que são células epiteliais colónicas humanas (Fig. 6A). Acredita-se que as células T-84 sejam mais sensíveis à toxina A que outros tipos de células. As células T- 84 podem proporcionar uma célula alvo mais relevante para determinar a citotoxicidade de toxina A.
Exemplo 4. Mapeamento de Epítopos de Anticorpos Antítoxina A O epitopo da toxina A ligado por cada anticorpo monoclonal foi determinado por western blotting. Clones recombinantes de E. coli foram construídos os quais expressam quatro fragmentos da toxina A que representam o dominio enzimático (isto é, aminoácidos 1-659 da toxina A), o dominio de ligação de recetor (isto é, aminoácidos 1853-2710 da toxina A) , e as duas regiões entre os mesmos (isto é, aminoácidos 660-1255 e 1256-1852 da toxina A). Os segmentos apropriados do gene da toxina A foram amplificados por PCR a partir de ADN genómico preparado de estirpe de C. difficile ATCC 43255. Os fragmentos foram clonados utilizando um vetor pET e transformados em células BL21 DE3 para a expressão. O vetor proporciona expressão induzivel e dominios de afinidade para a purificação (isto é, uma cauda His) e deteção (isto é, uma etiqueta de epitopo V5). A expressão foi induzida com IPTG e os fragmentos foram purificados por meio de cromatografia por afinidade. A ligação a quatro fragmentos da toxina A diferentes foi medida: o fragmento 1 correspondeu a aminoácidos 1-659; o fragmento 2 correspondeu a aminoácidos 660-1255; o fragmento 3 correspondeu a aminoácidos 1256-1852; e o fragmento 4 correspondeu a aminoácidos 1853-2710 (Figura 7). 1B11 reagiu com fragmentos 1 e 2. 33.3H2 reagiu com fragmento 2. 3D8 e outro anticorpo monoclonal humano, 6B4, reagiram com fragmento 4 (o dominio de ligação de recetor). Um antissoro policlonal de coelhos imunizados com toxoide A reagiu com todos os guatro fragmentos.
Os epitopos 1B11 e 33.3H2 foram mapeados em mais detalhe. Para mapear o epítopo 1B11, os subfragmentos de fragmento 1 (aminoácidos 1-659) correspondentes aos aminoácidos 1-540, 1-415, 1-290, e 1-165, foram gerados (Figura 8A). 1B11 ligado ao fragmento 1 e ao fragmento que contém aminoácidos 1-540. 1B11 não se ligou aos outros subfragmentos. Portanto, o epitopo ligado por 1B11 mapeia entre os aminoácidos 415-540 da toxina A.
Para mapear o epitopo 33.3H2, os subfragmentos de fragmento 2 (aminoácidos 660-1255) correspondentes aos aminoácidos 660-1146, 660-1033, 660-920, e 660-807, foram gerados (Figura 8B) . 33.3H2 ligado aos fragmentos correspondentes aos aminoácidos 660-1255, 660-1146, e 660-1033. 33.3H2 não se ligou aos outros subfragmentos. Portanto, o epitopo ligado por 33.3H2 mapeia entre os aminoácidos 920-1033 da toxina A.
Exemplo 5. Proteção de Ratinhos Contra Inoculação Letal de Toxina Ά por Administração de Anticorpos Antitoxina Ά
Cada anticorpo foi testado para a capacidade de proteger ratinhos contra a inoculação com uma dose letal da toxina A. Os ratinhos fêmeas Swiss Webster, cada um pesando 10-20 gramas, foram injetados intraperitonealmente com até 250 μg de 3D8, 1B11, ou 33.3H2, ou um anticorpo de controlo (anticorpo anti- virus sincicial respiratório, Medlmmune) antes de inoculação com toxina A. Aproximadamente 24 horas após a injeção, os ratinhos foram inoculados com uma dose da toxina A de mais de 10 vezes a dose letal (DL5o) , tipicamente 100 ng. Os animais foram observados para sinais
de toxicidade durante os 7 dias seguintes. Os resultados destas experiências são sumarizados na Figura 9. Os dados são expressos como percentagem de sobrevivência. Os números em parêntesis referem-se a dose de anticorpo, se uma dose diferente de 250 μρ foi dada. A Figura 9 mostra gue cada um dos anticorpos foi capaz de proteger os ratinhos contra a inoculação letal de toxina A até certo grau. A percentagem de ratinhos gue sobrevivem guando tratados com 3D8 variou desde 10-100 %. A percentagem de ratinhos que sobrevivem ao serem tratados com 33.3H2 variou desde 20-100 %. A
percentagem de ratinhos que sobrevivem ao serem tratados com 1B11 variou desde 0-60 %. A capacidade relativa destes monoclonais de proteger os ratinhos foi 3H2 > 3D8 > 1B11. Exemplo 6. Neutralização da Enterotoxicidade de Toxina A em Alças Intestinais Ligadas de Ratinho com Anticorpos Antitoxina A
Os anticorpos 3D8 e 33.3H2 foram testados para a neutralização da enterotoxicidade de toxina A num modelo de alça ileal ratinho. Este modelo mede a acumulação de fluidos induzida por toxina A em intestino de ratinho. Para realizar estas experiências, cada ratinho foi mantido em jejum durante 16 horas, anestesiado, e o ileo próximo ao ceco foi exposto. Uma alça de 3 a 5 centímetros foi ligada duplamente em cada extremidade e injetada com 10 μρ da toxina A. A alça ileal foi retornada à cavidade abdominal, a ferida foi fechada, e permitiu-se que o animal se recuperasse. Quatro horas após a cirurgia, o animal foi eutanizado e a alça foi retirada do animal. O comprimento de cada segmento foi remedido, e o fluido intraluminal foi extraido. O volume do fluido e a razão de volume em relação a comprimento (V:C) em milímetros por centímetro foi calculada para cada alça. Os ratinhos de teste foram injetados com anticorpo parentericamente 1-2 dias antes da cirurgia. Os resultados destas experiências são representados na Figura 10. A injeção com toxina A aumentou a razão de peso em relação a comprimento de fluido intestinal em 50 %. Ambos 3D8 e 33.3H2 preveniram este aumento em acumulação de fluidos. Os ratinhos administrados com qualquer anticorpo tiveram uma razão de peso em relação a comprimento comparável a ratinhos que não receberam qualquer injeção de toxina A. Portanto, 3D8 e 33.3H2 protegem contra acumulação de fluido intestinal in vivo.
Estes resultados indicam que os anticorpos monoclonais antitoxina A protegem contra enterotoxicidade decorrente de toxina A in vivo. Os dados de alça ligada de ratinho mostram que estes anticorpos monoclonais podem proteger contra dano na mucosa quando são administrados sistematicamente.
Exemplo 7. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile com Anticorpos Antitoxina Ά 3D8 foi testado num modelo de recaída em hamsters. Os hamsters são sensíveis aos efeitos tóxicos de toxinas de C. difficile, e tipicamente morrem dentro de 2-3 dias após receber uma dose única de clindamicina na presença de C. difficile. Para testar a eficácia de 3D8 em hamsters, um modelo de recaída foi utilizado. Neste modelo, aos hamsters foram dadas uma dose de clindamicina e uma dose de esporos de C. difficile BI um dia depois. Um conjunto de hamsters de controlo não recebeu nenhum antibiótico ou anticorpo adicional. Um segundo conjunto de hamsters de controlo foi tratado com 10 mg/kg/dia de vancomicina. A vancomicina é um antibiótico utilizado no tratamento de doença de C. difficile. Como é mostrado na Figura 11A, um conjunto de hamsters de teste recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 2 mg/kg/dia de um antissoro policlonal de coelho originado contra a toxina A cada dia durante sete dias após a exposição a C. difficile, como é indicado pelas flechas na Figura. Um segundo conjunto de hamsters de teste recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 50 mg/kg/dia de 3D8 nos mesmos intervalos de tempo. A sobrevivência de hamster foi colocada em gráfico versus tempo e é mostrada na Figura 11B. A Figura 11B mostra que todos os hamsters que receberam somente clindamicina e C. difficile (diamantes) morreram dentro de dois dias após a inoculação com as bactérias. Doze por cento (2/17) de hamsters tratados com vancomicina (quadrados) sobreviveram a inoculação com bactérias; oitenta e oito por cento (15/17) morreram dentro de oito dias. Quarenta e um por cento (7/17) de hamsters tratados com vancomicina e 3D8 (cruzes) sobreviveram a inoculação; cinquenta e nove (10/17) por cento morreram dentro de sete dias. Sessenta e quatro por cento (7/11) de hamsters tratados com vancomicina e soro policlonal de coelho (triângulos) sobreviveram a inoculação com bactérias; trinta e seis por cento (4/11) morreram dentro de nove dias. Estes dados são também representados na Figura 12 como a percentagem de sobreviventes totais em cada grupo de tratamento. Como é mostrado na figura, a percentagem de sobreviventes foi a mais alta (sessenta e quatro por cento) no grupo que recebe vancomicina e soro policlonal de coelho. O grupo que recebe 3D8 e vancomicina tiveram a segunda mais alta taxa de sobrevivência (quarenta e um por cento). Somente doze por cento de hamsters tratados com vancomicina sobreviveram. Aqueles sem tratamento todos morreram. Estes dados mostram que anticorpos policlonal e monoclonal antitoxina protegem contra recaída de doença de C. difficile in vivo quando são administrados após a infeção.
Exemplo 8. Produção de Anticorpos Antitoxina A para administração em seres humanos
As sequências de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada variável e cadeias leves do anticorpo 3D8 foram clonados num vetor pIE-UgamalF utilizando metodologia de ADN recombinante padrão. O vetor foi amplificado em E. coli, purificado, e transfetado em células CHO-dg44. As células transfetadas foram colocadas em placa a 4 x 105 células por poço numa placa de 96 poços e selecionadas para a transfeção de vetor com G418. Um clone, designado 1D3, foi selecionado originalmente por resistência a G418, então testado juntamente com outros transfetomas para a produção de IgG. 1D3 teve um nível mais alto de produção de IgG em relação a outros transfetantes durante diversas séries de expansão. A expressão do anticorpo 3D8 foi amplificada por crescimento na presença de concentrações crescentes de metotrexato. Uma cultura capaz de crescimento em 175 nM de metotrexato foi escolhida para clonar células únicas para desenvolvimento posterior. A colocação em placa da cultura em placas de 96 poços em densidade baixa permitiu a geração de culturas que surgem de uma célula única ou clones. As culturas foram rastreadas para a produção de IgG humana, e a célula que produziu o nível mars alto de IgG foi selecionada para utilização posterior. 0 clone amplificado por metotrexato foi expandido para produzir um banco de células que inclui viais congelados múltiplos de células.
Para preparar os anticorpos a partir de células transfetadas, as células de um clone isolado nas etapas anteriores são cultivadas e expandidas como inoculo para um biorreator. 0 biorreator tipicamente suporta um volume de 500 litros de meio de cultura. As células são cultivadas no biorreator até viabilidade celular cair, o que indica uma concentração de anticorpo máxima foi produzida na cultura. As células são retiradas por meio de filtração. O filtrado é aplicado a uma coluna de proteína A. Os anticorpos ligam-se à coluna, e são eluídos com uma lavagem de pH baixo. Em seguida, os anticorpos são aplicados a uma coluna de Q-Sepharose para retirar contaminantes residuais, tais como proteínas de células CHO, ADN, e outros contaminantes (por exemplo, contaminantes virais, se estiverem presentes). Os anticorpos são eluídos da coluna de Q-Sepharose, nano-filtrados, concentrados, e lavados num tampão tal como PBS. A preparação é então aliquotada assepticamente em viais para administração.
Exemplo 9. Preparação e Caraterização de Anticorpos Policlonais antitoxina B
Duas cabras Nubianas (#330 e #331) foram injetadas intramuscularmente com 50 μρ de toxina B inativada por UDP dialdeido (Techlab) e adjuvante de Freund completo. Doses de reforço de 25 μρ de toxoide B com adjuvante de Freund incompleto foram dadas intramuscularmente em intervalos de duas semanas. Sangramentos de teste foram obtidos após 4 imunizações. A reatividade de ELISA e neutralização de citotoxicidade contra ambas a toxina A e a toxina B foram testadas para medir a especificidade e reatividade cruzada dos soros.
Ambos os animais responderam bem à toxina B e a um grau menor à toxina A como medido por ELISA. Soros de cabra #331 tiveram menos reatividade cruzada à toxina A e foram escolhidos para a maioria das experiências subsequentes. A neutralização de citotoxicidade às células IMR-90 foi determinada como foi descrito no Exemplo 3. Os resultados de neutralização de citotoxicidade são representados na Figura 13, que mostra que os soros de ambos os animais exibiram boas titulações de anticorpo de neutralização de toxina B e titulações de anticorpo de neutralização de toxina A muito baixas, mas detetáveis. A capacidade dos soros de cabra de proteger ratinhos de uma inoculação letal intraperitoneal com toxina B (100 ng) foi também confirmada (dados não mostrados).
Exemplo 10. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile com Anticorpos Antitoxina Ά e antitoxina B
Os grupos de hamsters (n = 20) foram inoculados com clindamicina e C. difficile, e então tratados com vancomicina como foi descrito no modelo de hamster de recaida no Exemplo 7. Deram-se duas vezes ao dia aos anticorpos (ou 3D8, soro de cabra #331, ou 3D8 e soro de cabra #331) após tratamento com vancomicina (Figura 14). Os animais foram monitorizados para a sobrevivência (Figura 15) ou doença (Figura 16) . Doses de anticorpo foram 1 ml duas vezes ao dia para soro de cabra #331 e 3 mg para 3D8 dadas duas vezes ao dia. Os animais gue recebem vancomicina somente (isto é, sem tratamento com anticorpo) serviram como um controlo negativo. Como foi observado anteriormente, 3D8 e tratamento com vancomicina em separado demonstraram um efeito protetor parcial, em que 10 dos 20 animais foram protegidos contra a letalidade (Fig. 15) . Cinquenta por cento de animais neste grupo permaneceram saudáveis (Fig. 16). Seis dos 20 animais que recebem tratamento com vancomicina em separado foram protegidos (Fig. 15) . Trinta por cento permaneceram saudáveis (Fig. 16) . Proteção parcial (9/20 animais protegidos) foi também observada quando o soro de cabra foi utilizado em separado (Fig. 15). Quarenta por cento permaneceram saudáveis. A proteção foi aumentada a proximamente 100 % quando ambos soro de cabra e 3D8 foram dados juntamente (18/20) e o aparecimento da doença foi atrasado (Fig. 15). Noventa por cento destes animais permaneceram saudáveis (Fig. 16). Claramente, proteção contra doença seguiu um padrão similar à proteção contra letalidade. Estes dados demonstram que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada.
Exemplo 11. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile em Hamsters Imunizados com Toxina B
Os hamsters foram imunizados intraperitonealmente com 10 μρ do fragmento COOH-terminal da toxina B (correspondente aos aminoácidos 1777-2366 da toxina B) expresso em E .coli e utilizando RIBI como adjuvante. Os animais receberam 7 doses de antigénio da toxina B. Os anticorpos de resposta a neutralização foram observados nos animais que foram testados. Os grupos de hamsters imunizados foram inoculados com clindamicina e C. difficile então tratados com vancomicina como foi descrito no modelo de hamster de recaida no Exemplo 7. 0 anticorpo (3D8, 3 mg/dose) foi dado duas vezes ao dia após tratamento com vancomicina a 19 animais e comparou-se a um grupo de controlo negativo (n = 20) que não recebeu tratamento (Figuras 17 e 18). Seis animais foram inoculados sem tratamento com vancomicina para assegurar que os hamsters imunizados com antigénio de toxina B foram suscetíveis a infeção por C. difficile. Os animais foram monitorizados para sobrevivência (Figura 17) ou doença (Figura 18) . A Figura 17 mostra que os animais imunizados aos quais não se receberam 3D8 tiveram uma recaida em uma taxa similar a essa observada anteriormente (65 % de recaida). Os animais imunizados com toxina B que recebem 3D8 foram mais completamente protegidos contra a recaida que os observados anteriormente (10 % de recaida, em comparação com aproximadamente 50 % de recaida em animais não previamente imunizados com toxina B em outras experiências). A Figura 18 mostra que alguns dos animais imunizados que recebem 3D8 ficaram doentes, mas recuperaram-se de sua diarreia. Trinta e cinco por cento de animais imunizados que recebem vancomicina em separado permaneceram saudáveis. Em experiências em que os soros reativos de toxina B não estavam presentes em animais, virtualmente todos os animais que tiveram diarreia depois morreram. Estes dados proporcionam evidência adicional de que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada. A neutralização da toxina B além da toxina A foi requerida para a proteção ótima contra doença de C. difficile neste modelo.
Exemplo 12. Proteção de Hamsters Contra Inoculação primária de C. difficile Utilizando 3D8 em Hamsters Tratados Com Soros de Antitoxina B de Cabra A prevenção de recaida de doença de C. difficile nos hamsters foi mais fácil de demonstrar que a proteção contra a inoculação direta (isto é, a inoculação sem administração de vancomicina). As experiências com soros de coelho demonstraram somente proteção fraca contra inoculação direta e 3D8 não teve efeito detetável sobre a inoculação direta. Uma vez que 3D8 foi mais protetor num antecedente dos anticorpos de neutralização de toxina B, determinou-se se a administração combinada de 3D8 e antitoxina B antissoros poderia prevenir a doença devido à inoculação direta. Os grupos de 5 hamsters foram inoculados após receberem doses de 3D8 (3 mg) uma vez ao dia, combinadas de soros de 3D8 (3 mg) e cabra #331 (1 ml), ou sem anticorpos para os 3 dias antes da inoculação como é representado na Figura 19. Os dados na Figura 20 mostram que os animais que não recebem nenhum anticorpo ou 3D8 ou soros de cabra em separado todos morreram com 48 horas de inoculação com C. difficile. A maioria dos animais (80 %) que recebe ambos 3D8 e soros de cabra sobreviveu e os animais afetados sobreviveram durante 10 dias após inoculação. A Figura 21 mostra que os animais tratados com 3D8 e soros de cabra ficaram doentes, mas recuperaram-se. Estes dados proporcionam evidência adicional de que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada. A neutralização da toxina B além da toxina A foi requerida para a proteção ótima contra doença de C. difficile neste modelo. A proteção bem-sucedida de hamsters diretamente inoculados com C. difficile oferece diversas vantagens ao rastreio de novos candidatos de toxina B. Números menores de animais podem ser utilizados uma vez que 100 % de animais não tratados morrem. Os anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos) podem ser rastreados diretamente em hamsters porque o procedimento requer 100 mg ou menos do anticorpo de teste. Outros modos de testes, tais como o modelo de recaida, requerem o esforço de produzir quantidades grandes devido à taxa de ataque baixo no modelo de recaida, que necessita testar maiores números de animais. As experiências de inoculação direta são também mais curtas na duração com uma leitura definitiva dentro de 3-4 dias após a inoculação com C. difficile em comparação com 7-10 no modelo de recaida. Além disso, a eliminação de tratamento com vancomicina a partir do método de rastreio reduz o número de vezes que animais são manejados.
Exemplo 13. Geração de Anticorpos monoclonais antitoxina B A toxina B de C. difficile foi obtida de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) , ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com UDP- dialdeido reativo, que resulta em alquilação de resíduos catalíticos ao mesmo tempo em que preserva a estrutura da toxina nativa. De maneira breve, a toxina B purificada foi incubada com UDP-2',3'-dialdeido (0,1-1,0 mM) em tampão durante 18 horas a 37 °C, filtrada através de um filtro de corte de 100 kDa para retirar UDP-2', 3'-dialdeido não reagido, e lavada com tampão. A toxina B inativada (toxoide B) ou fragmentos recombinantes de toxina B foi utilizada como imunogénios. Um domínio de ligação de recetor de toxina B (resíduos de aminoácidos 1777-2366) foi expresso em E. coli como uma proteína de fusão que contém uma etiqueta imuno (hexahistadina) para a purificação por afinidade utilizando cromatografia por afinidade de quelato de níquel (designado fragmento 4; veja-se Exemplo 11).
Os ratinhos transgénicos Hcol2 gerados, como foi descrito anteriormente na secção intitulada "Geração de Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb" e fornecidos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes, cada um, com 10 μρ de toxoide em adjuvante RIBI. Nos ratinhos transgénicos Hcol2, o gene capa de cadeia leve endógena foi quebrado homozigoticamente como foi descrito em Chen et ai. (1993) EMBO J. 12: 811-820 e o gene de cadeia pesada endógena de ratinho foi guebrado homozigoticamente como foi descrito no Exemplo 1 de Publicação PCT WO 01/09187. Os ratinhos transgénicos Hcol2 portam um transgene capa de cadeia leve humano, KCo5, como foi descrito em Fishwild et ai. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e o transgene de cadeia pesada humano Hcol2 como foi descrito nas Patentes US N° 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. O soro foi colhido de cada ratinho e testado para a reatividade à toxina B por ELISA e neutralização de citotoxicidade em células IMR-90.. Os ratinhos que deram positivo no teste para toxina B-reativo e neutralização de antissoro foram injetados com 5-10 μρ toxoide B ou fragmento 4 através da veia da cauda. Os ratinhos foram sacrificados e os baços foram isolados para a fusão a hibridomas aproximadamente 3 dias após a injeção na veia da cauda ter sido realizada.
Os hibridomas clonais foram gerados e rastreados por ELISA. Três clones de hibridoma foram selecionados para análise adicional: 124-152; 2A11; e 1G10. Em particular, os ADNc do clone 124-152 foram amplificados por RT-PCR a partir de ARNm, clonados, e sequenciados. Determinou-se que a região V da cadeia pesada era derivada da linha germinal sequência VH 5-51, a sequência da região D derivada da linha germinal 7-27, e a sequência J da região da linha germinal JH3b. Determinou-se que as regiões de cadeia leve (capa) eram derivadas de A27 e a região J de JK1. Determinou-se que o isótipo do clone 124-152 era IgGl. As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do clone 124-152 são mostradas nas Figuras 27-28. As regiões de determinação de complementaridade (CDRs) são indicadas nas Figuras. As sequências germinais relacionadas das regiões VH e VL são mostradas nas Figuras 30-31.
Os anticorpos 124-152; 2A11; e 1G10 foram isolados de hibridomas correspondentes e testados para suas caraterísticas (infra) de ligação. O ADN que codifica o clone 124-152 foi clonado num vetor a ser expresso como um anticorpo humano para administração a seres humanos.
Exemplo 14. Atividade de ligação de Anticorpos antitoxina B Ά ligação de cada anticorpo à toxina B foi determinada por Biacore utilizando técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados no Quadro 6. Os anticorpos produzidos por 124-152; 2A11; e 1G10 foram comparados aos controlos apropriados.
Em particular, a afinidade dos anticorpos 124-152; 2A11; e 1G10 para a toxina B foi medida com o instrumento Biacore®, que deteta interações de ligação biomolecular com tecnologia de ressonância do plasmão de superfície. Cada anticorpo foi adicionado a chips de sensor revestido com proteína A, e a toxina B foi permitida que flua sobre o chip para medir a ligação. 124-152 teve um KD de 1,64 x 10" 10 Μ; 2A11 teve um KD de 0,24 x 10~10 M; e 1G10 teve um KD de 2,98 x 10~10 M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina B. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para aplicação de utilização in vivo, por exemplo, terapêutica humana. _Quadro 6 ._
Exemplo 15. Ά neutralização de toxina por Anticorpos antitoxina B
Os anticorpos expressos por 124-152; 2A11; e 1G10 hibridomas foram testados para atividade de neutralização de toxina B in vitro. As células foram incubadas na presença de concentrações variadas de um anticorpo monoclonal específico à toxina B que preveniria que as células se reunissem após a exposição à toxina B. O efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual de células. Uma pontuação de CPE desde 0-4 foi determinada, com base nos resultados da inspeção visual (4 = 100 % de citotoxicidade, 0 = 0 % de toxicidade) . Os resultados
destes ensaios são representados na Figura 27. A neutralização de toxicidade contra uma linha de células de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90. A Figura 27 mostra que todos os anticorpos tiveram capacidade de neutralização para as células IMR- 90. A atividade de neutralização relativa da citotoxicidade de toxina A, em células IMR-90 foi 124-152> 1G10 >2A11.
Exemplo 16. Proteção de Hamsters Contra Inoculação primária de C. difficile Utilizando Anticorpos Antitoxina B A proteção contra a inoculação direta de um inoculo de C. difficile (clindamicina no dia -1 e esporos de C. difficile no dia O (1/100.000 de diluição) foi realizada durante um período de 4 a 10 dias na presença ou ausência de anticorpos antitoxina B. Os grupos de 5 hamsters foram inoculados após receberem uma vez ao dia doses de 3D8 (20 mg em total ao longo de 4 dias), soros de 3D8 (Id.) e cabra #331 (3 ml) combinados, 3D8 em combinação com anticorpos antitoxina B 124-152 (18 mg em total ao longo de 4 dias) , 2A11 (20 mg em total ao longo de 4 dias) , ou 1G10 (20 mg em total ao longo de 4 dias) ou sem anticorpos durante 3 dias antes da inoculação como é representado na Figura 24. Os dados na Figura 24 mostram que os animais que não recebem anticorpos ou 3D8 ou soros de cabra em separado todos morreram dentro de 72 horas após a inoculação com C. difficile ao passo que animais que recebem 3D8 e um anticorpo antitoxina B, e preferentemente em combinação com 124-152, tiveram uma taxa de sobrevivência de 40 % (Figura 24). Um estudo de 10 dias similar ao anterior (mas utilizando um inoculo de C. difficile mars diluído) foi realizado com quantidades crescentes do anticorpo antitoxina B 124-152 (0,56 mg, 1,7 mg, ou 5,0 mg dados nos dias -3, -2, -1, e 0) . Os animais que recebem ambos 3D8 e soros de cabra sobreviveram e a maioria dos animais (60 %-70 %) sobreviveram durante 10 dias após a inoculação se dado 3D8 em combinação com 124-152. Mesmo a dosagem mais baixa do anticorpo antitoxina B 124-152 (0,56 mg em combinação com 3D8) foi altamente eficaz (70 % de sobrevivência; veja-se Figura 25). Os resultados mostram que 124-152 e 3D8, em separado, são menos eficazes então quando são utilizados em combinação onde um resultado mais aditivo, de facto, de terapêutica sinergistica é alcançado (Figs. 24-26). Estes dados proporcionam evidência adicional de que o anticorpo antitoxina B é altamente eficaz, especialmente em combinação com o anticorpo antitoxina A 3D8. A neutralização da toxina B além da toxina A foi determinada para tratar da proteção contra doença de C. difficile neste modelo.
Exemplo 17. Mapeamento de Epítopos de Anticorpos Antitoxina B O epitopo da toxina B ligado por cada anticorpo monoclonal foi determinado por western blotting. Clones recombinantes de E. coli foram construídos os quais expressam fragmentos da toxina B que representam dominios diferentes da toxina B. Os segmentos apropriados do gene da toxina B foram amplificados por PCR a partir de ADN preparado de uma estirpe de C. difficile apropriada. Os fragmentos foram clonados num vetor de expressão e expressos em E. coli. O anticorpo monoclonal humano 152 foi utilizado para sondar o fragmento de toxina B em western blots a fim de mapear o epitopo de ligação. Os fragmentos de proteina de toxina B foram isolados de E. coli os quais contêm uma porção de genes da toxina B e separados utilizando SDS-PAGE. Após electroforese, os fragmentos de toxina B foram transferidos a nitrocelulose e sondados com anticorpo monoclonal 152 seguido por anti-humano de cabra conjugado com fosfatase alcalina para detetar a ligação de MAb 152. Determinou-se que HuMab 152 se liga à porção de fragmento -COOH da toxina B entre os aminoácidos 1777 e 2366 (veja-se, por exemplo, Fig. 32).
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS MEDAREX, INC.
<120> ANTICORPOS CONTRA TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
<130> N98 903D-EP <150> 60/542.357 <151> 06-02-2004 <150> 60/613.854 <151> 28-09-2004 <160> 82 <170> Patentln Ver. 3.3
<210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Leu He Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Trp Gly Met Val Arg Gly Val He Asp Val Phe Asp He Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Gin Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Trp Ala Ser Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr lie Glu Ser Val 50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ala Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ser
<210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Gin Val Gin lieu Val Gin Sen Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met lieu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Pro Pro Thr Ala Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Glu lie Val lieu Thr Gin Ser Pro Ala Thr lieu Ser lieu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Ser Gin 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp He Lys 100 105
<210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser lieu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Lys Ser Tyr Pro Val 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Asn Tyr Gly Met His 1 5
<210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 8
Leu lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly
<210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Trp Gly Met Val Arg Gly Val lie Asp Val Phe Asp lie 15 10
<210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Ser Tyr Gly Met His 1 5
<210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11
Val He Trp Ala Ser Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr He Glu Ser Val Glu 15 10 15
Gly
<210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12
Ala Asn Phe Asp Tyr 1 5
<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
Lys Tyr Gly Met His 1 5
<210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Val He Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Met Lys 15 10 15
Gly
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 15
Asp Pro Pro Thr Ala Asn Tyr 1 5
<210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10
<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17
Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5
<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr 1 5
<210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5
<210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Gin Gin Arg Ser Asn Trp Ser Gin Phe Thr 15 10
<210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22
Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10
<210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser 1 5
<210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Gin Gin Tyr Lys Ser Tyr Pro Val Thr 1 5
<210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> M0D_RES <222> (5)..(6) <223> Aminoácido variável <22 0>
<221> M0D_RES <222> (9) <223> Aminoácido variável <400> 25
Arg Ala Ser Gin Xaa Xaa Ser Ser Xaa Leu Ala 15 10
<210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MOD_RES <222> (3)..(5) <223> Aminoácido variável <22 0> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Ser ou Thr <400> 26
Ala Ser xaa xaa xaa xaa 1 5
<210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0>
<221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Aminoácido variável <22 0> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Ser ou Asn <22 0> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Aminoácido variável <22 0> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Pro ou Ser <400> 27
Gin Gin Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
<210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Tyr Gly Met His 1 <210> 29 <211> 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MOD_RES <222> (3)..(4) <223> Aminoácido variável <22 0> <221> MOD_RES <222> (6) . . (8) <223> Aminoácido variável <22 0>
<221> MOD_RES <222> (10)..(11) <223> Aminoácido variável <22 0> <221> MOD_RES <222> (13)..(14) <223> Aminoácido variável <400> 29 lie Trp Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly 15 10 15
<210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Val He Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Ser Cys Arg Met Ser Gin Gly He Ser Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu He 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 32
<211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 33 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 34 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Leu Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ser Ser Trp 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 35 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(321) <400> 35 gac ate cag atg acc cag tet cca tet tee gtg tet gca tet gta gga 48
Asp lie Gin Met The Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt egg geg agt cag ggt att age age tgg 96
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 20 25 30 tta gee tgg tat cag cat aaa cca ggg aaa gee cct aag etc ctg ate 144
Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 tat get gca tee agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gea act tac tat tgt caa cag get aat agt ttc cot tgg 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn Ser Phe Pro Trp 85 90 95 aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 36 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(324) <4Ο0> 36 gaa att gtg ttg aoa cag tot coa goc aoc ctg tot ttg tot coa ggg 48
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Tbr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 gaa aga gcc acc etc tcc tgc agg gee agt cag agt gtt age age tac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser val Ser Ser Tyr 20 25 30 tta gcc tgg tac caa cag aaa cot ggc cag got coo agg etc etc ate 144
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ttc agt ggc 192
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tet ggg aca gac ttc act etc acc ate age age eta gag cct 240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg tet caa 288
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Ser Gin 85 90 95 ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa 324
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 100 105
<210> 37 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(321) <400> 37 gac ate cag atg acc cag tet cca tee tea ctg tet gca tet gta gga 48
Asp He Gin Met The Gin See Peo See See Leu See Ala See val Gly 15 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt egg geg agt cag ggt att age age tgg 96
Asp Aeg Val The lie The Cys Aeg Ala See Gin Gly He Ser See Tep 20 25 30 tta gee tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gee cct aag tee ctg ate 144
Leu Ala Tep Tye Gin Gin Lys Peo Glu Lys Ala Peo Lys See Leu He 35 40 45 tat get gca tee agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc 192
Tye Ala Ala See See Leu Gin See Gly Val Peo See Aeg Phe See Gly 50 55 60 agt gga tet ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct 240
See Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caa cag tat aag agt tac ccg gtc 288
Glu Asp Phe Ala The Tye Tye Cys Gin Gin Tye Lys Ser Tye Peo Val 85 90 95 act ttc gge gga ggg acc aag gtg gag ate aaa 321
The Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 38 <211> 366 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(366) <400> 38 cag gtg cag ctg gtg gag tot ggg gga ggc gtg gtc cag cot ggc agg 48
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 tcc ctg aga etc tcc tgt geg geg tet gga ttc age ttc agt aac tat 96
Ser lieu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca ett ata tgg tat gat gga agt aat gag gac tat aca gac tcc gtg 192
Ala Leu lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac aeg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr lieu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gee gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg aga tgg ggg atg gtt egg gga gtt ate gat gtt ttt gat ate tgg 336
Ala Arg Trp Gly Met Val Arg Gly Val lie Asp Val Phe Asp lie Trp 100 105 110 ggc caa ggg aca gtg gtc acc gtc tet tea 366
Gly Gin Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 39 <211> 342 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(342) <400> 39 cag atg cag ctg gtg gag tct ggg ggc ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Gin Met Gin lieu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 tcc ctg aga etc tcc tgt gaa geg tct gga ttc tee ttc aat age tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ser Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Ly$ Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tea gtc ata tgg gee agt gga aat aag aaa tat tat ata gaa tcc gtg 192
Ser Val lie Trp Ala Ser Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr lie Glu Ser Val 50 55 60 gag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac aeg ctg tat 240
Glu Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age ctg aga gee gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg aga gee aat ttt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc 336
Ala Arg Ala Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 tcc tea 342
Ser Ser
<210> 40 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(348) <400> 40 cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg 48
Gin Val Gin leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15 tcc ctg aga etc tcc tgt gca geg tct gga ttc acc ttc aat aaa tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr 20 25 30 ggc atg cac tgg gtc ege cag get cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 gca gtt ata tgg tat gat gga act aat aaa tac tat gca gac tcc atg 192
Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Met 50 55 60 aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aat atg ctg tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac age eta aga gcc gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg aga gat ccc ccc act get aac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336
Ala Arg Asp Pro Pro Thr Ala Asn Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tcc tea 348
Thr Val Ser Ser 115
<210> 41 <211> 2710 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 41
Met Ser Leu lie Ser Lys Glu Glu Leu lie Lys Leu Ala Tyr Ser lie 15 10 15
Arg Pro Arg Glu Asn Glu Tyr Lys Thr lie Leu Thr Asn Leu Asp Glu 20 25 30
Tyr Asn Lys Leu Thr Thr Asn Asn Asn Glu Asn Lys Tyr Leu Gin Leu 35 40 45
Lys Lys lieu Asn Glu Ser He Asp val Phe Met Asn Lys Tyr Lys Thr 50 55 60
Ser Ser Arg Asn Arg Ala Leu Ser Asn Leu Lys Lys Asp lie Leu Lys 65 70 75 80
Glu Val lie Leu lie Lys Asn Ser Asn Thr Ser Pro Val Glu Lys Asn 85 90 95 lieu His Phe Val Trp He Gly Gly Glu Val Ser Asp He Ala Leu Glu 100 105 110
Tyr He Lys Gin Trp Ala Asp He Asn Ala Glu Tyr Asn He Lys lieu 115 120 125
Trp Tyr Asp Ser Glu Ala Phe Leu Val Asn Thr Leu Lys Lys Ala lie 130 135 140
Val Glu Ser Ser Thr Thr Glu Ala Leu Gin Leu Leu Glu Glu Glu lie 145 150 155 160
Gin Asn Pro Gin Phe Asp Asn Met Lys Phe Tyr Lys Lys Arg Met Glu 165 170 175
Phe He Tyr Asp Arg Gin Lys Arg Phe He Asn Tyr Tyr Lys Ser Gin 180 185 190
He Asn Lys Pro Thr Val Pro Thr He Asp Asp He He Lys Ser His 195 200 205 lieu Val Ser Glu Tyr Asn Arg Asp Glu Thr Val lieu Glu Ser Tyr Arg 210 215 220
Thr Asn Ser Leu Arg Lys He Asn Ser Asn His Gly He Asp He Arg 225 230 235 240
Ala Asn Ser Leu Phe Thr Glu Gin Glu Leu Leu Asn He Tyr Ser Gin 245 250 255
Glu Leu Leu Asn Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp He Val Arg 260 265 270 lieu lieu Ala lieu Lys Asn Phe Gly Gly Val Tyr lieu Asp Val Asp Met 275 280 285
Leu Pro Gly lie His Ser Asp Leu Phe Lys Thr lie Ser Arg Pro Ser 290 295 300
Ser lie Gly Leu Asp Arg Trp Glu Met lie Lys Leu Glu Ala lie Met 305 310 315 320
Lys Tyr Lys Lys Tyr lie Asn Asn Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Asp Lys 325 330 335
Leu Asp Gin Gin Leu Lys Asp Asn Phe Lys Leu lie lie Glu Ser Lys 340 345 350
Ser Glu Lys Ser Glu lie Phe Ser Lys Leu Glu Asn Leu Asn Val Ser 355 360 365
Asp Leu Glu lie Lys lie Ala Phe Ala Leu Gly Ser Val lie Asn Gin 370 375 380
Ala Leu lie Ser Lys Gin Gly Ser Tyr Leu Thr Asn Leu Val lie Glu 385 390 395 400
Gin Val Lys Asn Arg Tyr Gin Phe Leu Asn Gin His Leu Asn Pro Ala 405 410 415
He Glu Ser Asp Asn Asn Phe Thr Asp Thr Thr Lys lie Phe His Asp 420 425 430
Ser Leu Phe Asn Ser Ala Thr Ala Glu Asn Ser Met Phe Leu Thr Lys 435 440 445 lie Ala Pro Tyr Leu Gin Val Gly Phe Met Pro Glu Ala Arg Ser Thr 450 455 460 lie Ser Leu Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Ala Ser Ala Tyr Tyr Asp Phe 465 470 475 480
He Asn Leu Gin Glu Asn Thr lie Glu Lys Thr Leu Lys Ala Ser Asp 485 490 495
Leu lie Glu Phe Lys Phe Pro Glu Asn Asn Leu Ser Gin Leu Thr Glu 500 505 510
Gin Glu He Asn Ser Leu Trp Ser Phe Asp Gin Ala Ser Ala Lys Tyr 515 520 525
Gin Phe Glu Lys Tyr val Arg Asp Tyr Thr Gly Gly Ser Leu Ser Glu 530 535 540
Asp Asn Gly Val Asp Phe Asn Lys Asn Thr Ala Leu Asp Lys Asn Tyr 545 550 555 560
Leu Leu Asn Asn Lys lie Pro Ser Asn Asn Val Glu Glu Ala Gly Ser 565 570 575
Lys Asn Tyr Val His Tyr He He Gin Leu Gin Gly Asp Asp He Ser 580 585 590
Tyr Glu Ala Thr Cys Asn Leu Phe Ser Lys Asn Pro Lys Asn Ser He 595 600 605
He lie Gin Arg Asn Met Asn Glu Ser Ala Lys Ser Tyr Phe Leu Ser 610 615 620
Asp Asp Gly Glu Ser lie Leu Glu Leu Asn Lys Tyr Arg lie Pro Glu 625 630 635 640
Arg Leu Lys Asn Lys Glu Lys Val Lys Val Thr Phe lie Gly His Gly 645 650 655
Lye Asp Glu Phe Asn Thr Ser Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Asp Ser 660 665 670
Leu Ser Asn Glu lie Ser Ser Phe Leu Asp Thr lie Lys Leu Asp lie 675 680 685
Ser Pro Lys Asn Val Glu Val Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser 690 695 700
Tyr Asp Phe Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Ser 705 710 715 720 lie Met Asp Lys lie Thr Ser Thr Leu Pro Asp val Asn Lys Asn Ser 725 730 735 lie Thr lie Gly Ala Asn Gin Tyr Glu Val Arg lie Asn Ser Glu Gly 740 745 750
Arg Lys Glu Leu Leu Ala His Ser Gly Lys Trp lie Asn Lys Glu Glu 755 760 765
Ala lie Met Ser Asp Leu Ser Ser Lys Glu Tyr lie Phe Phe Asp Ser 770 775 780 lie Asp Asn Lys Leu Lys Ala Lys Ser Lys Asn lie Pro Gly Leu Ala 785 790 795 800
Ser lie Ser Glu Asp lie Lys Thr Leu Leu Leu Asp Ala Ser Val Ser 805 810 815
Pro Asp Thr Lys Phe lie Leu Asn Asn Leu Lys Leu Asn lie Glu Ser 820 825 830
Ser lie Gly Asp Tyr lie Tyr Tyr Glu Lys Leu Glu Pro Val Lys Asn 835 840 845 lie lie His Asn Ser lie Asp Asp Leu He Asp Glu Phe Asn Leu Leu 850 855 860
Glu Asn Val Ser Asp Glu Leu Tyr Glu Leu Lys Lys Leu Asn Asn Leu 865 870 875 880
Asp Glu Lys Tyr Leu lie Ser Phe Glu Asp lie Ser Lys Asn Asn Ser 885 890 895
Thr Tyr Ser val Arg Phe lie Asn Lys Ser Asn Gly Glu Ser Val Tyr 900 905 910
Val Glu Thr Glu Lys Glu He Phe Ser Lys Tyr Ser Glu His He Thr 915 920 925
Lys Glu lie Ser Thr He Lys Asn Ser He He Thr Asp Val Asn Gly 930 935 940
Asn Leu Leu Asp Asn lie Gin Leu Asp His Thr Ser Gin Val Asn Thr 945 950 955 960
Leu Asn Ala Ala Phe Phe lie Gin Ser Leu lie Asp Tyr Ser ser Asn 965 970 975
Lys Asp Val Leu Asn Asp Leu Ser Thr Ser Val Lys Val Gin Leu Tyr 980 985 990
Ala Gin Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr lie Tyr Asp Ser lie Gin 995 1000 1005
Leu Val Asn Leu lie Ser Asn Ala Val Asn Asp Thr lie Asn Val Leu 1010 1015 1020
Pro Thr lie Thr Glu Gly lie Pro lie Val Ser Thr lie Leu Asp Gly 1025 1030 1035 1040
He Asn Leu Gly Ala Ala He Lys Glu Leu Leu Asp Glu His Asp Pro 1045 1050 1055
Leu Leu Lys Lys Glu Leu Glu Ala Lys Val Gly Val Leu Ala lie Asn 1060 1065 1070
Met Ser Leu Ser He Ala Ala Thr Val Ala Ser He Val Gly lie Gly 1075 1080 1085
Ala Glu Val Thr He Phe lieu Leu Pro He Ala Gly He Ser Ala Gly 1090 1095 1100
He Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu lieu He Leu His Asp Lys Ala Thr 1105 1110 1115 1120
Ser Val Val Asn Tyr Fhe Asn His Leu Ser Glu Ser Lys Lys Tyr Gly 1125 1130 1135
Pro Leu Lys Thr Glu Asp Asp Lys lie Leu Val Pro lie Asp Asp Leu 1140 1145 1150
Val He Ser Glu He Asp Phe Asn Asn Asn Ser He Lys Leu Gly Thr 1155 1160 1165
Cys Asn He Leu Ala Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Gly 1170 1175 1180
Asn He Asp His Phe Phe Ser Ser Pro Ser lie Ser Ser His He Pro 1185 1190 1195 1200
Ser Leu Ser He Tyr Ser Ala He Gly He Glu Thr Glu Asn Leu Asp 1205 1210 1215
Phe Ser Lys Lys lie Met Met Leu Pro Asn Ala Pro Ser Arg Val Phe 1220 1225 1230
Trp Trp Glu Thr Gly Ala Val Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp 1235 1240 1245
Gly Thr Arg Leu Leu Asp Ser He Arg Asp Leu Tyr Pro Gly Lys Phe 1250 1255 1260
Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala Phe Phe Asp Tyr Ala He Thr Thr Leu Lys 1265 1270 1275 1280
Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn lie Lys lie Lys Leu Asp Lys Asp Thr 1285 1290 1295
Arg Asn Phe lie Met Pro Thr lie Thr Thr Asn Glu lie Arg Asn Lys 1300 1305 1310
Leu Ser Tyr Ser Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Ser Leu Leu Leu 1315 1320 1325
Ser Ser Tyr Pro lie Ser Thr Asn lie Asn Leu Ser Lys Asp Asp Leu 1330 1335 1340
Trp lie Phe Asn lie Asp Asn Glu Val Arg Glu lie Ser lie Glu Asn 1345 1350 1355 1360
Gly Thr lie Lys Lys Gly Lys Leu lie Lys Asp Val Leu Ser Lys lie 1365 1370 1375
Asp lie Asn Lys Asn Lys Leu lie lie Gly Asn Gin Thr lie Asp Phe 1380 1385 1390
Ser Gly Asp lie Asp Asn Lys Asp Arg Tyr lie Phe Leu Thr Cys Glu 1395 1400 1405
Leu Asp Asp Lys lie Ser Leu lie lie Glu lie Asn Leu Val Ala Lys 1410 1415 1420
Ser Tyr Ser Leu Leu Leu Ser Gly Asp Lys Asn Tyr Leu He Ser Asn 1425 1430 1435 1440
Leu Ser Asn Thr lie Glu Lys He Asn Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys 1445 1450 1455
Asn lie Ala Tyr Asn Tyr Thr Asp Glu Ser Asn Asn Lys Tyr Phe Gly 1460 1465 1470
Ala lie Ser Lys Thr Ser Gin Lys Ser lie He His Tyr Lys Lys Asp 1475 1480 1485
Ser Lys Asn He Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe Asn 1490 1495 1500
Ser Lys Asp Phe He Ala Glu Asp He Asn val Phe Met Lys Asp Asp 1505 1510 1515 1520
He Asn Thr lie Thr Gly Lys Tyr Tyr Val Asp Asn Asn Thr Asp Lys 1525 1530 1535
Ser He Asp Phe Ser He Ser Leu Val Ser Lys Asn Gin Val Lys Val 1540 1545 1550
Asn Gly Leu Tyr Leu Asn Glu Ser Val Tyr Ser Ser Tyr Leu Asp Phe 1555 1560 1565
Val Lys Asn Ser Asp Gly His His Asn Thr Ser Asn Phe Met Asn Leu 1570 1575 1580
Phe Leu Asp Asn He Ser Phe Trp Lys Leu Phe Gly Phe Glu Asn lie 1585 1590 1595 1600
Asn Phe Val He Asp Lys Tyr Phe Thr Leu Val Gly Lys Thr Asn Leu 1605 1610 1615
Gly Tyr Val Glu Phe He Cys Asp Asn Asn Lys Asn He Asp He Tyr 1620 1625 1630
Phe Gly Glu Trp Lys Thr Ser Ser Ser Lys Ser Thr lie Phe Ser Gly 1635 1640 1645
Asn Gly Arg Asn Val Val Val Glu Pro lie Tyr Asn Pro Asp Thr Gly 1650 1655 1660
Glu Asp lie Ser Thr Ser Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Pro Leu Tyr Gly 1665 1670 1675 1680 lie Asp Arg Tyr lie Asn Lys val Leu lie Ala Pro Asp Leu Tyr Thr 1685 1690 1695
Ser Leu lie Asn lie Asn Thr Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Tyr Tyr Pro 1700 1705 1710
Glu lie lie Val Leu Asn Pro Asn Thr Phe His Lys Lys Val Asn lie 1715 1720 1725
Asn Leu Asp Ser Ser Ser Phe Glu Tyr Lys Trp Ser Thr Glu Gly Ser 1730 1735 1740
Asp Phe lie Leu Val Arg Tyr Leu Glu Glu Ser Asn Lys Lys lie Leu 1745 1750 1755 1760
Gin Lys He Arg lie Lys Gly He Leu Ser Asn Thr Gin Ser Phe Asn 1765 1770 1775
Lys Met Ser He Asp Phe Lys Asp He Lys Lys Leu Ser Leu Gly Tyr 1780 1785 1790
He Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser Glu Asn Glu Leu Asp Arg 1795 1800 1805
Asp His Leu Gly Phe Lys lie lie Asp Asn Lys Thr Tyr Tyr Tyr Asp 1810 1815 1820
Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu He Asn He Asn Asn Ser Leu 1825 1830 1835 1840
Phe Tyr Phe Asp Pro lie Glu Phe Asn Leu Val Thr Gly Trp Gin Thr 1845 1850 1855
He Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp He Asn Thr Gly Ala Ala Leu 1860 1865 1870
Thr Ser Tyr Lys He He Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Asn Asp 1875 1880 1885
Gly Val Met Gin Leu Gly Val Phe Lys Gly Pro Asp Gly Phe Glu Tyr 1890 1895 1900
Phe Ala Pro Ala Asn Thr Gin Asn Asn Asn lie Glu Gly Gin Ala lie 1905 1910 1915 1920
Val Tyr Gin Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe 1925 1930 1935
Asp Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg He lie Asn Asn Glu 1940 1945 1950
Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala He Ala Ala Val Gly Leu Gin 1955 1960 1965
Val lie Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asp Thr Ala lie lie 1970 1975 1980
Ser Lys Sly Trp Gin Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr Tyr Phe Asp Thr 1985 1990 1995 2000
Asp Thr Ala lie Ala Phe Asn Gly Tyr Lys Thr lie Asp Gly Lys His 2005 2010 2015
Phe Tyr Phe Asp Ser Asp Cys Val Val Lys lie Gly Val Phe Ser Thr 2020 2025 2030
Ser Asn Sly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Tyr Asn Asn Asn 2035 2040 2045 lie Glu Gly Sin Ala lie Val Tyr Gin Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn 2050 2055 2060
Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp 2065 2070 2075 2080
Gin Thr lie Asp Ser Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Glu 2085 2090 2095
Ala Ala Thr Sly Trp Gin Thr lie Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn 2100 2105 2110
Thr Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gin Thr lie Asp Gly Lys 2115 2120 2125
Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala lie Ala Ser Thr Gly Tyr Thr 2130 2135 2140 lie lie Asn Gly Lys His Phe Tyr Phe Asn Thr Asp Gly He Met Gin 2145 2150 2155 2160 lie Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala 2165 2170 2175
Asn Thr Asp Ala Asn Asn He Glu Gly Gin Ala He Leu Tyr Gin Asn 2180 2185 2190
Glu Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser 2195 2200 2205
Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg lie lie Asn Asn Lys Lys Tyr Tyr Phe 2210 2215 2220
Asn Pro Asn Asn Ala lie Ala Ala He His Leu Cys Thr He Asn Asn 2225 2230 2235 2240
Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr Asp Gly He Leu Gin Asn Gly Tyr He 2245 2250 2255
Thr lie Glu Arg Asn Asn Phe Tyr Phe Asp Ala Asn Asn Glu Ser Lys 2260 2265 2270
Met Val Thr Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn Gly Phe Glu Tyr Phe Ala 2275 2280 2285
Pro Ala Asn Thr His Asn Asn Asn He Glu Gly Gin Ala He Val Tyr 2290 2295 2300
Sin Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Asn 2305 2310 2315 2320
Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp Gin Thr lie Asp Gly Lys Lys Tyr 2325 2330 2335
Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gin Thr lie 2340 2345 2350
Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala Glu Ala Ala Thr 2355 2360 2365
Gly Trp Gin Thr lie Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr 2370 2375 2380
Phe lie Ala Ser Thr Gly Tyr Thr Ser He Asn Gly Lys His Phe Tyr 2385 2390 2395 2400
Phe Asn Thr Asp Gly lie Met Gin lie Gly Val Phe Lys Gly Pro Asn 2405 2410 2415
Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn lie Glu 2420 2425 2430
Gly Gin Ala He Leu Tyr Gin Asn Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys 2435 2440 2445
Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly Leu Arg Thr 2450 2455 2460
He Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn Thr Ala Val Ala Val 2465 2470 2475 2480
Thr Gly Trp Gin Thr lie Asn Gly lys Lys Tyr Tyr Phe Asn Thr Asn 2485 2490 2495
Thr Ser lie Ala Ser Thr Gly Tyr Thr He lie Ser Gly Lys His Phe 2500 2505 2510
Tyr Phe Asn Thr Asp Gly lie Met Gin He Gly Val Phe Lys Gly Pro 2515 2520 2525
Asp Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn He 2530 2535 2540
Glu Gly Gin Ala lie Arg Tyr Gin Asn Arg Phe Leu Tyr Leu His Asp 2545 2550 2555 2560
Asn lie Tyr Tyr Phe Gly Asn Asn Ser Lys Ala Ala Thr Gly Trp Val 2565 2570 2575
Thr lie Asp Gly Asn Arg Tyr Tyr Phe Glu Pro Asn Thr Ala Met Gly 2580 2585 2590
Ala Asn Gly Tyr Lys Thr lie Asp Asn Lys Asn Phe Tyr Phe Arg Asn 2595 2600 2605
Gly Leu Pro Gin He Gly Val Phe Lys Gly Ser Asn Gly Phe Glu Tyr 2610 2615 2620
Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn lie Glu Gly Gin Ala lie 2625 2630 2635 2640
Arg Tyr Gin Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys lie Tyr Tyr Phe 2645 2650 2655
Gly Asn Asn Ser Lys Ala val Thr Gly Trp Gin Thr He Asn Gly Lys 2660 2665 2670
Val Tyr Tyr Phe Met Pro Asp Thr Ala Met Ala Ala Ala Gly Gly Leu 2675 2680 2685
Phe Glu lie Asp Gly Val lie Tyr Phe Phe Gly Val Asp Gly Val Lys 2690 2695 2700
Ala Pro Gly He Tyr Gly 2705 2710
<210> 42 <211> 2367 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 42
Met Ser Leu Val Asn Arg Lys Gin Leu Glu Lys Met Ala Asn Val Arg 15 10 15
Phe Arg Val Gin Glu Asp Glu Tyr Val Ala lie Leu Asp Ala Leu Glu 20 25 30
Glu Tyr His Asn Met Ser Glu Asn Thr Val Val Glu Lys Tyr Leu Lys 35 40 45
Leu Lys Asp lie Asn Ser Leu Thr Asp Thr Tyr lie Asp Thr Tyr Lys 50 55 60
Lys Ser Gly Arg Asn Lys Ala Leu Lys Lys Phe Lys Glu Tyr Leu Val 65 70 75 80 lie Glu lie Leu Glu Leu Lys Asn Ser Asn Leu Thr Pro Val Glu Lys 85 90 95
Asn Leu His Phe lie Trp lie Gly Gly Gin lie Asn Asp Thr Ala lie 100 105 110
Asn Tyr lie Asn Gin Trp Lys Asp Val Asn Ser Asp Tyr Asn Val Asn 115 120 125
Val Phe Tyr Asp Ser Asn Ala Phe Leu lie Asn Thr Leu Lys Lys Thr 130 135 140 lie lie Glu Ser Ala Ser Asn Asp Thr Leu Glu Ser Phe Arg Glu Asn 145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Glu Phe Asn His Thr Ala Phe Phe Arg Lys Arg Met 165 170 175
Gin lie lie Tyr Asp Lys Gin Gin Asn Phe lie Asn Tyr Tyr Lys Ala 180 185 190
Gin Lys Glu Glu Asn Pro Asp Leu lie lie Asp Asp lie Val Lys Thr 195 200 205
Tyr Leu Ser Asn Glu Tyr Ser Lys Asp lie Asp Glu Leu Asn Ala Tyr 210 215 220 lie Glu Glu Ser Leu Asn Lys Vai Thr Glu Asn Ser Gly Asn Asp Vai 225 230 235 240
Arg Asn Phe Glu Glu Phe Lys Thr Gly Glu Vai Phe Asn Leu Tyr Glu 245 250 255
Gin Glu Ser Vai Glu Arg Trp Asn Leu Ala Gly Ala Ser Asp Ile Leu 260 265 270
Arg Vai Ala Ile Leu Lys Asn Ile Gly Gly Vai Tyr Leu Asp Vai Asp 275 280 285
Met Leu Pro Gly lie His Pro Asp Leu Phe Lys Asp Ile Asn Lys Pro 250 295 300
Asp Ser Vai Lys Thr Ala Vai Asp Trp Glu Glu Met Gin Leu Glu Ala 305 310 315 320 lie Met Lys His Lys Glu Tyr lie Pro Glu Tyr Thr Ser Lys His Phe 325 330 335
Asp Thr Leu Asp Glu Glu Vai Gin Ser Ser Phe Glu Ser Vai Leu Ala 340 345 350
Ser Lys Ser Asp Lys Ser Glu lie Phe Leu Pro Leu Gly Asp Ile Glu 355 360 365
Vai Ser Pro Leu Glu Vai Lys Ile Ala Phe Ala Lys Gly Ser Ile Ile 370 375 380
Asn Gin Ala Leu Ile Ser Ala Lys Asp Ser Tyr Cys Ser Asp Leu Leu 385 390 395 400 lie Lys Gin Ile Gin Asn Arg Tyr Lys Ile Leu Asn Asp Thr Leu Gly 405 410 415
Pro lie Ile Ser Gin Gly Asn Asp Phe Asn Thr Thr Met Asn Asn Phe 420 425 430
Gly Glu Ser Leu Gly Ala lie Ala Asn Glu Glu Asn Ile Ser Phe Ile 435 440 445
Ala Lys Ile Gly Ser Tyr Leu Arg Vai Gly Phe Tyr Pro Glu Ala Asn 450 455 460
Thr Thr Ile Thr Leu Ser Gly Pro Thr Ile Tyr Ala Gly Ala Tyr Lys 465 470 475 480
Asp Leu Leu Thr Phe Lys Glu Met Ser Ile Asp Thr Ser Ile Leu Ser 485 490 495
Ser Glu Leu Arg Asn Phe Glu Phe Pro Lys Vai Asn Ile Ser Gin Ala 500 505 510
Thr Glu Gin Glu Lys Asn Ser Leu Trp Gin Phe Asn Glu Glu Arg Ala 515 520 525
Lys Ile Gin Phe Glu Glu Tyr Lys Lys Asn Tyr Phe Glu Gly Ala Leu 530 535 540
Gly Glu Asp Asp Asn Leu Asp Phe Ser Gin Asn Thr Vai Thr Asp Lys 545 550 555 560
Glu Tyr Leu Leu Glu Lys lie Ser Ser Ser Thr Lys Ser Ser Glu Gly 565 570 575
Gly Tyr Val His Tyr lie Val Gin Leu Gin Gly Asp Lys lie Ser Tyr 5S0 585 590
Glu Ala Ala Cys Asn Leu Phe Ala Lys Asn Pro Tyr Asp Ser lie Leu 595 600 605
Phe Gin Arg Asn lie Glu Asp Ser Glu Val Ala Tyr Tyr Tyr Asn Pro 610 615 620
Thr Asp Ser Glu lie Gin Glu lie Asp Lys Tyr Arg lie Pro Asp Arg 625 630 635 640 lie Ser Asp Arg Pro Lys lie Lys Leu Thr Phe lie Gly His Gly Lys 645 650 655
Ala Glu Phe Asn Thr Asp lie Phe Ala Gly Leu Asp Val Asp Ser Leu 660 665 670
Ser Ser Glu lie Glu Thr Ala lie Gly Leu Ala Lys Glu Asp lie Ser 675 680 685
Pro Lys Ser lie Glu lie Asn Leu Leu Gly Cys Asn Met Phe Ser Tyr 690 695 700
Ser Val Asn Val Glu Glu Thr Tyr Pro Gly Lys Leu Leu Leu Arg Val 705 710 715 720
Lys Asp Lys Val Ser Glu Leu Met Pro Ser Met Ser Gin Asp Ser lie 725 730 735 lie Val Ser Ala Asn Gin Tyr Glu Val Arg lie Asn Ser Glu Gly Arg 740 745 750
Arg Glu Leu Leu Asp His Ser Gly Glu Trp lie Asn Lys Glu Glu Ser 755 760 765 lie lie Lys Asp lie Ser Ser Lys Glu Tyr lie Ser Phe Asn Pro Lys 770 775 780
Glu Asn Lys lie lie Val Lys Ser Lys Asn Leu Pro Glu Leu Ser Thr 785 790 795 800
Leu Leu Gin Glu lie Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Asp lie Glu Leu 805 810 815
Glu Glu Lys Val Met Leu Ala Glu Cys Glu lie Asn Val lie Ser Asn 820 825 830 lie Glu Thr Gin Val Val Glu Glu Arg lie Glu Glu Ala Lys Ser Leu 835 840 845
Thr Ser Asp Ser lie Asn Tyr lie Lys Asn Glu Phe Lys Leu lie Glu 850 855 860
Ser lie Ser Glu Ala Leu Cys Asp Leu Lys Gin Gin Asn Glu Leu Glu 865 870 875 880
Asp Ser His Phe lie Ser Phe Glu Asp lie Ser Glu Thr Asp Glu Gly 885 890 895
Phe Ser lie Arg Phe lie Asn Lys Glu Thr Gly Glu Ser lie Phe Val 900 905 910
Glu Thr Glu Lys Thr lie Phe Ser Glu Tyr Ala Asn His lie Thr Glu 915 920 925
Glu lie Ser Lys lie Lys Gly Thr lie Phe Asp Thr Val Asn Gly Lys 930 935 940
Leu Val Lys Lys Val Asn Leu Asp Thr Thr His Glu Val Asn Thr Leu 945 950 955 960
Asn Ala Ala Phe Phe lie Gin Ser Leu lie Glu Tyr Asn Ser Ser Lys 965 970 975
Glu Ser Leu Ser Asn Leu Ser Val Ala Met Lys Val Gin Val Tyr Ala 980 985 990
Gin Leu Phe Ser Thr Gly Leu Asn Thr lie Thr Asp Ala Ala Lys Val 995 1000 1005
Val Glu Leu Val Ser Thr Ala Leu Asp Glu Thr lie Asp Leu Leu Pro 1010 1015 1020
Thr Leu Ser Glu Gly Leu Pro He He Ala Thr lie He Asp Gly Val 1025 1030 1035 1040
Ser Leu Gly Ala Ala He Lys Glu Leu Ser Glu Thr Ser Asp Pro Leu 1045 1050 1055
Leu Arg Gin Glu lie Glu Ala Lys He Gly lie Met Ala Val Asn Leu 1060 1065 1070
Thr Thr Ala Thr Thr Ala lie lie Thr Ser Ser Leu Gly lie Ala Ser 1075 1080 1085
Gly Phe Ser He Leu Leu Val Pro Leu Ala Gly lie Ser Ala Gly He 1090 1095 1100
Pro Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val Leu Arg Asp Lys Ala Thr Lys 1105 1110 1115 1120
Val Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser Leu Val Glu Thr Glu Gly Val 1125 1130 1135
Phe Thr Leu Leu Asp Asp Lys val Met Met Gin Gin Asp Asp Leu val 1140 1145 1150 lie Ser Glu He Asp Phe Asn Asn Asn Ser lie Val Leu Gly Lys Cys 1155 1160 1165
Glu He Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser Gly His Thr Val Thr Asp Asp 1170 1175 1180
He Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser He Thr Tyr Arg Glu Pro His 1185 1190 1195 1200
Leu Ser He Tyr Asp Val Leu Glu Val Gin Lys Glu Glu Leu Asp Leu 1205 1210 1215
Ser Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn Ala Pro Asn Arg Val Phe Ala 1220 1225 1230
Trp Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu Arg Ser Leu Glu Asn Asp Gly 1235 1240 1245
Thr Lys Leu Leu Asp Arg lie Arg Asp Asn Tyr Glu Gly Glu Phe Tyr 1250 1255 1260
Trp Arg Tyr Phe Ala Phe He Ala Asp Ala Leu lie Thr Thr Leu Lys 1265 1270 1275 1280
Pro Arg Tyr Glu Asp Thr Asn He Arg He Asn Leu Asp Ser Asn Thr 1285 1290 1295
Arg Ser Phe lie Val Pro lie He Thr Thr Glu Tyr He Arg Glu Lys 1300 1305 1310
Leu Ser Tyr Ser Phe Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Ala Leu Pro Leu 1315 1320 1325
Ser Sin Tyr Asn Met Gly He Asn He Glu Leu Ser Glu Ser Asp Val 1330 1335 1340
Trp He lie Asp Val Asp Asn Val Val Arg Asp Val Thr He Glu Ser 1345 1350 1355 1360
Asp Lys lie Lys Lys Gly Asp Leu lie Glu Gly He Leu Ser Thr Leu 1365 1370 1375
Ser lie Glu Glu Asn Lys He He Leu Asn Ser His Glu He Asn Phe 1380 1385 1390
Ser Gly Glu Val Asn Gly Ser Asn Gly Phe Val Ser Leu Thr Phe Ser 1395 1400 1405
He Leu Glu Gly He Asn Ala He He Glu Val Asp Leu Leu Ser Lys 1410 1415 1420
Ser Tyr Lys Leu Leu He Ser Gly Glu Leu Lys He Leu Met Leu Asn 1425 1430 1435 1440
Ser Asn His He Gin Gin Lys He Asp Tyr He Gly Phe Asn Ser Glu 1445 1450 1455
Leu Gin Lys Asn He Pro Tyr Ser Phe Val Asp Ser Glu Gly Lys Glu 1460 1465 1470
Asn Gly Phe He Asn Gly Ser Thr Lys Glu Gly Leu Phe Val Ser Glu 1475 1480 1485
Leu Pro Asp Val Val Leu He Ser Lys Val Tyr Met Asp Asp Ser Lys 1490 1495 1500
Pro Ser Phe Gly Tyr Tyr Ser Asn Asn Leu Lys Asp Val Lys Val He 1505 1510 1515 1520
Thr Lys Asp Asn Val Asn He Leu Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Asp 1525 1530 1535
He Lys He Ser Leu Ser Leu Thr Leu Gin Asp Glu Lys Thr He Lys 1540 1545 1550
Leu Asn Ser Val His Leu Asp Glu Ser Gly Val Ala Glu He Leu Lys 1555 1560 1565
Phe Met Asn Arg Lys Sly Ser The Asn Thr Ser Asp Ser Leu Met Ser 1570 1575 1500
Phe Leu Glu Ser Met Asn lie Lys Ser lie Phe Val Asn Phe Leu Sin 1585 1590 1595 1600
Ser Asn lie Lys Phe lie Leu Asp Ale Asn Phe lie lie Ser Gly Thr 1605 1610 1615
Thr Ser lie Gly Gin Phe Glu Phe lie Cys Asp Glu Asn Asn Asn lie 1620 1625 1630
Gin Pro Tyr Phe lie Lys Phe Asn Thr Leu Glu Thr Asn Tyr Thr Leu 1635 1640 1645
Tyr Val Gly Asn Arg Gin Asn Met lie Val Glu Pro Asn Tyr Asp Leu 1650 1655 1660
Asp Asp Ser Gly Asp lie Ser Ser Thr Val lie Asn Phe Ser Gin Lys 1665 1670 1675 1680
Tyr Leu Tyr Gly lie Asp Ser Cys Val Asn Lys Val Val lie Ser Pro 1685 1690 1695
Asn lie Tyr Thr Asp Glu lie Asn lie Thr Pro Val Tyr Glu Thr Asn 1700 1705 1710
Asn Thr Tyr Pro Glu Val lie Val Leu Asp Ala Asn Tyr lie Asn Glu 1715 1720 1725
Lys lie Asn Val Asn lie Asn Asp Leu Ser lie Arg Tyr Val Trp Ser 1730 1735 1740
Asn Asp Gly Asn Asp Phe lie Leu Met Ser Thr Ser Glu Glu Asn Lys 1745 1750 1755 1760
Val Ser Gin Val Lys lie Arg Phe Val Asn Val Phe Lys Asp Lys Thr 1765 1770 1775
Leu Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe Ser Asp Lys Gin Asp Val Pro 1780 1785 1790
Val Ser Glu lie lie Leu Ser Phe Thr Pro Ser Tyr Tyr Glu Asp Gly 1795 1800 1805
Leu lie Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val Ser Leu Tyr Asn Glu Lys Phe 1810 1815 1820
Tyr lie Asn Asn Phe Gly Met Met Val Ser Gly Leu lie Tyr lie Asn 1825 1830 1835 1840
Asp Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro Val Asn Asn Leu lie Thr Gly 1845 1850 1855
Phe Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro lie Asn Gly 1860 1865 1870
Gly Ala Ala Ser lie Gly Glu Thr lie lie Asp Asp Lys Asn Tyr Tyr 1875 1880 1885
Phe Asn Gin Ser Gly Val Leu Gin Thr Gly Val Phe Ser Thr Glu Asp 1890 1895 1900
Sly Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu 1905 1910 1915 1920
Gly Glu Ala lie Asp Phe Thr Gly Lys Leu lie lie Asp Glu Asn lie 1925 1930 1935
Tyr Tyr Phe Glu Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu 1940 1945 1950
Asp Gly Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys 1955 1960 1965
Gly Leu Asn Gin lie Gly Asp Asp Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly 1970 1975 1980
Val Met Gin Lys Gly Phe Val Ser lie Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe 1985 1990 1995 2000
Asp Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu lie Asp Gly Lys 2005 2010 2015
His Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gin lie Gly Val Phe Asn 2020 2025 2030
Thr Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly 2035 2040 2045
Asn Glu Glu Gly Glu Glu lie Ser Tyr Ser Gly lie Leu Asn Phe Asn 2050 2055 2060
Asn Lys lie Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp 2065 2070 2075 2080
Lys Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala 2085 2090 2095
Glu Ala Tyr lie Gly Leu Ser Leu lie Asn Asp Gly Gin Tyr Tyr Phe 2100 2105 2110
Asn Asp Asp Gly lie Met Gin Val Gly Phe Val Thr lie Asn Asp Lys 2115 2120 2125
Val Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly lie lie Glu Ser Gly Val Gin Asn 2130 2135 2140 lie Asp Asp Asn Tyr Phe Tyr He Asp Asp Asn Gly lie Val Gin He 2145 2150 2155 2160
Gly Val Phe Asp Thr Ser Asp Gly Tyr Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn 2165 2170 2175
Thr Val Asn Asp Asn lie Tyr Gly Gin Ala Val Glu Tyr Ser Gly Leu 2180 2185 2190
Val Arg Val Gly Glu Asp Val Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr Thr He 2195 2200 2205
Glu Thr Gly Trp He Tyr Asp Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys Tyr Tyr 2210 2215 2220
Phe Val Pro Glu Thr Lys Lys Ala Cys Lys Gly lie Asn Leu lie Asp 2225 2230 2235 2240
Asp lie Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Lys Gly lie Met Arg Thr Gly Leu 2245 2250 2255 lie Ser Phe Glu Asn Asn Asn Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly Glu lie 2260 2265 2270
Gin Phe Gly Tyr lie Asn lie Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe Gly Glu 2275 2280 2285
Asp Gly Val Met Gin lie Gly Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly Phe Lys 2290 2295 2300
Tyr Phe Ala His Gin Asn Thr Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly Glu Ser 2305 2310 2315 2320 lie Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Gly Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe 2325 2330 2335
Thr Asp Glu Tyr lie Ala Ala Thr Gly Ser Val lie lie Asp Gly Glu 2340 2345 2350
Glu Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gin Leu Val lie Ser Glu 2355 2360 2365
<210> 43 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43
Met Asp Met Met val Pro Ale Gin Leu lieu Gly lieu lieu lieu lieu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys lieu lieu lie Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 44 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly lieu lieu lieu lieu Cys 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp lieu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Ser lieu lie Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 45 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu lieu Gly lieu lieu lieu lieu Trp 15 10 15 lieu Pro Gly Ala Arg Cys Val lie Trp Met Thr Gin Ser Pro Ser lieu 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Met Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Glu lieu lieu lie Tyr Ala Ala Ser Thr lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 46 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46
Met Asp Met Met Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly lieu lieu lieu lieu Trp 15 10 15
Phe Pro Gly Ser Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp lieu Ala Trp Tyr Gin His Lys Pro Gly Lys 50 55 60
Ala Pro Lys lieu lieu lie Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 47 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gin Leu Leu Gly lieu lieu lieu lieu Cys 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30
Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Ser lieu lie Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 48 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48
Met Asp Met Arg val lieu Ale Gin Leu lieu Gly lieu lieu lieu lieu Cys 15 10 15
Phe Pro Gly Ale Arg Cys Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Leu Ser Ser 20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Ser lieu lie Tyr Ala Ala Ser Ser lieu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr lieu Thr 85 90 95 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Ala Asn Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys
<210> 49 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15
Val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly lieu 50 55 60
Glu Trp Val Ala Leu lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Glu Asp Tyr Thr 65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Met Val Arg Gly Val lie Asp Val Phe 115 120 125
Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser 130 135 140
<210> 50 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50
Met Glu Ala Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60
Arg Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser 100 105 110
Asn Trp Ser Gin Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys 115 120 125
<210> 51 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15
Val Gin Cys Gin Met Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45
Asn Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Val lie Trp Ala Ser Gly Asn Lys Lys Tyr Tyr lie 65 70 75 80
Glu Ser Vai Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 115 120 125
Vai Thr Vai Ser Ser 130
<210> 52 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys 15 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser 20 25 30 l>eu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45
Gin Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys 50 55 60
Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val 65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95
Ile Ser Ser lieu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 100 105 110
Tyr Lys Ser Tyr Pro Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 115 120 125
Lys <210> 53 <211> 135
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53
Met Glu Fhe Gly Leu Ser Trp val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly 15 10 15 val Gin Cys Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin 20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45
Asn Lys Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ala Val lie Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala 65 70 75 80
Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Met Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Pro Thr Ala Asn Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 54 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54
Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Ser Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp He Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Vai Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Vai Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115
<210> 55 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(357) <400> 55 gag gtg cag ctg gtg cag tct gga gca gag gtg aaa aag tcc ggg gag 48
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Sec Gly Glu 15 10 15 tct ctg aag ate tcc tgt aag ggt tct gga tac age ttt acc age tac 96
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tgg ate ggc tgg gtg ege cag atg ccc ggg aag ggc ctg gag tgg atg 144
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg ate ttc tat cct ggt gac tct agt acc aga tac age ccg tcc ttc 192
Gly lie Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caa ggc cag gtc acc ate tea gcc gac aag tcc gtc aac acc gcc tac 240
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser Val Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gcc teg gac acc gcc atg tat tac tgt 288
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 geg aga cgt ega aac tgg gga aat get ttt gat ate tgg ggc caa ggg 336
Ala Arg Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe Asp He Trp Gly Gin Gly loo 105 no aca atg gtc acc gtc tct tea 357
Thr Met val Thr val Ser Ser 115
<210> 56 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56
Met Gly Ser Thr Ale He Leu Ale Leu lieu Leu Ale vel Leu Gin Gly 15 10 15
Vel Cys Ale Glu Vel Gin Leu Vel Gin Ser Gly Ale Glu Vel Lys Lye 20 25 30
Ser Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45
Thr Ser Tyr Trp He Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Met Gly He Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80
Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vel Thr He Ser Ale Asp Lys Ser Vel Asn 85 90 95
Thr Ale Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ale Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe Asp lie Trp 115 120 125
Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 57 <211> 414 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 57 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagtccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagc tactggatcg gctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaagggcc tggagtggat ggggatcttc tatcctggtg actctagtac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccgtcaacac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag acgtcgaaac 360 tggggaaatg ottttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc ttca 414
<210> 58 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 58
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Vai Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Thr 85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105
<210> 59 <211> 324 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(324) <400> 59 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15 gaa aga gcc acc etc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age age age 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag get ccc agg etc etc 144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 ate tat ggt gca tcc age agg gcc act ggc ate cca gac agg ttc agt 192 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act etc acc ate age aga ctg gag 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gat ttt gca gtg tat tac tgt cag cag tat ggt age tea acg 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Thr 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa 324
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105
<210> 60 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60
Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu lieu lieu lieu Trp Leu Pro 15 10 15
Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45
Val Ser Ser Ser Tyr lieu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60
Pro Arg lieu lieu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie 85 90 95
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110
Gly Ser Ser Thr Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 115 120 125
<210> 61 <211> 384 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 61 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaacgtg gacgttcggc 360 caagggacca aggtggaaat caaa 384
<210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62
Ser Tyr Trp lie Gly 1 5
<210> 63 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1) .. (15) <400> 63 age tac tgg ate ggc 15
Ser Tyr Trp Ile Gly 1 5
<210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 64 lie Phe Tyr Pro Gly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15
Gly
<210> 65 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1) . . (51) <4Ο0> 65 ate ttc tat cct ggt gac tet agt acc aga tac age ccg tee ttc caa 48 lie Phe Tyr Pro Sly Asp Ser Ser Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15 ggc 51
Gly
<210> 66 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66
Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe Asp lie 15 10
<210> 67 <211> 30 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(30) <400> 67 cgt ega aac tgg gga aat get ttt gat ate 30
Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe Asp lie 15 10
<210> 68 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 69 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(36) <400> 6 9 agg gcc agt cag agt gtt age age age tac tta gee 36
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 71 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>
<221> CDS <222> (1)..(21) <400> 71 ggt gca tcc age agg gee act 21
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Thr Trp Thr 1 5
<210> 73 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (1)..(27) <400> 73 cag cag tat ggt age tea aeg tgg aeg 27
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Thr Trp Thr 1 5 <210> 74 <211> 15
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74
Ala Phe Asp lie Trp Gly Gin Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 15 10 15
<210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75
Ser Tyr Trp lie Gly 1 5
<210> 76 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 lie He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gin 15 10 15
Gly
<210> 77 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77
Ala Arg Arg Arg Asn Trp Gly Asn Ala Phe 15 10
<210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78
Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10
<210> 79 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79
Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 15 10
<210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80
Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 81 <211> 98
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 61u Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp lie Gly Trp Val Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60
Gin Gly Gin Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg
<210> 82 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82
Glu lie Vai Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser vai Ser Ser Ser 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 30
Pro Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 5085862 A [0102] • US 5221618 A [0102] • US 5244657 A [0102] • US 5332583 A [0102] • US 5358868 A [0102] • US 5433945 A [0102] • US 5770429 A [0107] [0108] • US 5545806 A [0108] [0180] [0207] • US 5569825 A [0108] • US 5625126 A [0108] • US 5633425 A [0108] • US 5661016 A [0108] • US 5789650 A [0108] • US 5814318 A [0108] • US 5874299 A [0108] • US 5877397 A [0108] • WO 0114424 A [0108] • WO 9824884 A [0108] [0109] [0112] [0113] • WO 9425585 A [0108] • WO 931227 A [0108] • WO 9203918 A [0108] • WO 8704462 A [0132] • WO 8901036 A [0132] • EP 338841 A [0132] • US 8602269 W, Robinson [0134] • EP 171496 A [0134] • EP 173494 A [0134] • WO 8601533 A, Neuberger [0134] • US 4816567 A, Cabilly [0134] • EP 125023 A [0134] • US 5225539 A [0135] [0136] • GB 2188638 A [0136] • US 5585089 A, Queen [0137] [0138] • US 5693761 A [0137] • US 5693762 A [0137] • EP 519596 Al, Padlan [0137] • WO 0109187 A [0180] [0207] • US 5625825 A [0180] [0207] • US 5545807 A [0180] [0207] • WO 60542357 A [0215] • WO 60613854 A [0215]
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Claims (14)

REIVINDICAÇÕES
1. Um anticorpo monoclonal humano isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) , em que o anticorpo ou a porção de ligação a antigénio do mesmo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 54 e uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58.
2. 0 anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo é um isótipo de IgGl.
3. Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 num veiculo farmaceuticamente aceitável.
4. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especif icamente à toxina B de C. difficile com um KD de menos de 10 x 10~10 M como medido por ressonância do plasmão de superfície e neutraliza a toxina B de C. difficile, em que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 das SEQ ID NOs: 62, 64 e 66; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 das SEQ ID NOs: 68, 70 e 72 formulado para administração parentérica.
5. A composição de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo é um anticorpo humano.
6. A composição de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o anticorpo é um isótipo de IgGl.
7. 0 anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 3 a 6, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por meio de terapêutica ou num método de diagnóstico levado a cabo no corpo humano ou animal.
8. 0 anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 3 a 6, para utilização num método de tratamento da doença decorrente de C. difficile num indivíduo.
9. 0 anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou a composição de qualquer uma das reivindicações 3 a 6, para utilização num método para prevenir recorrência da doença decorrente de C. difficile num indivíduo.
10. O anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio, ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que: (a) o indivíduo é o ser humano; e/ou (b) o anticorpo, porção de ligação a antigénio ou composição é administrado intravenosamente, intramuscularmente, ou subcutaneamente ao indivíduo.
11. O anticorpo monoclonal isolado, porção de ligação a antigénio ou composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que o anticorpo, porção de ligação a antigénio ou composição é administrado com um outro agente terapêutico.
12. 0 anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 11, em gue o agente terapêutico é: (a) um antibiótico, gamaglobulina policlonal, agente probiótico ou vacina de C. difficile; ou (b) vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii ou uma vacina de toxoide de C. difficile.
13. 0 anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 12, em gue o agente terapêutico é vancomicina ou metronidazol.
14. 0 anticorpo monoclonal, porção de ligação a antigénio ou composição para utilização de acordo com gualguer uma das reivindicações 8 a 13, em gue a doença decorrente de C. difficile é colite pseudomembranosa (PMC) decorrente de C. difficile, diarreia, ou recaida da doença decorrente de C. difficile.
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