CN101363867B - 一种艰难梭菌a、b毒素胶体金检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测艰难梭菌A、B毒素的快速检测试纸条。它是在硝酸纤维膜(NC膜)上包被艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多抗、艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多抗和质控二抗IgG，结合胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法，检测标本中艰难梭菌A、B毒素。应用本发明试纸条检测，操作简单、方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对艰难梭菌感染诊断起到辅助作用。

Description

一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条及其制备方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用。 

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile)属厌氧性细菌，是梭菌属的一个成员。梭菌属可分为几个群，其中几个对人具有致病性的，最著名的有产气荚膜梭菌、破伤风梭菌和肉毒梭菌。艰难梭菌是造成抗生素相关腹泻及伪膜性结肠炎的病原菌。 

艰难梭菌芽孢菌的细菌平时寄生在人类肠道中。如果过量服用抗生素致使菌群增长速度过快，就会引发严重的炎症。该菌能引起伪膜性肠炎，90～95％的伪膜性肠炎患者粪便中能检出本菌。涂片染色可见粗大革兰氏阳性杆菌，位于菌体近端至颈端可见呈卵圆形芽胞，可结合临床作出早期诊断。艰难梭菌的一种流行菌株产生高水平的A、B毒素，毒素A有肠毒性，毒素B有细胞毒性。毒素A也有一定的细胞毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艰难梭菌的主要致病因子，可干扰肠道上皮细胞的肌动蛋白骨架，使细胞丧失功能。目前实验室检验可帮助诊断艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)。 

由艰难梭菌引发的医院内感染日益被人们重视，艰难梭菌产毒株的快速诊断、鉴定对确定病源、防止及控制医院内感染的传播和有效治疗极其重要。组织培养的方法检测艰难梭菌的产毒株，需要特殊的组织培养条件，操作繁琐复杂，且检测周期长，用于院内感染的监控难以普及。采用免疫学方法检测艰难梭菌毒素A&B则逐渐得以应用。 

艰难梭菌感染的临床表现轻重不一，且无特异性，诊断主要依赖于辅助检查，方法很多，各自的敏感性和特异性相差较大。艰难梭菌的分离培养一般用环丝氨酸-甲氧头孢噻嗪-果糖-琼脂(CCFA)选择培养基，其敏感性和特异性分别为97％和93％；细胞培养法测定细胞毒素的敏感性和特异性分别为67％和99％。免疫学测定毒素的方法(如放免、乳凝、ELISA等)敏感性和特异性在68％和95％左右。前两种方法费时，耗物，但准确可靠，后者简便快速可用于筛选。近年有文献报道用基因探针方法检测艰难梭菌感染，其敏感性和特异性有待进一步评价。此外，对于重症病人及时行纤维肠镜检查，常可发现特异性的伪膜，具有确诊意义。 

但通常认为艰难梭菌诊断以毒素检测和培养细胞的毒素中和试验为“金标准”。产毒素培养是检测艰难梭菌分离菌株的毒素产生情况，并具有较高的敏感性和相当的特异性。通常肠毒素的检测采用琼脂双扩散法、ELISA法、家兔肠管结扎试验、反向间接血球凝集试验、小鼠致死试验、豚鼠皮肤试验等，而直接粪便标本毒素验中和实验，在已确诊的CDAD患者中，会有15～38％检测不到毒素。但以上方法均存在需专业人员在特定的实验室，需要一定的设备和仪器，操作繁琐，时间长等缺点。 

胶体金免疫层析法(Immunochromatography Assay)始于上世纪90年代中期，是在免疫渗滤法的基础上发展起来的。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗原、胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。 

发明内容

本发明的目的是提供一种使用方便、快捷，用于检测艰难梭菌A、 B毒素的试纸条，检测人类粪便中艰难梭菌A、B毒素，用于艰难梭菌感染的辅助诊断。 

本发明的另一目的是提供一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的制备方法。 

本发明的再一目的是提供一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的应用。 

本发明提供了一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条，其包含：同时包被艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体、抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体和二抗IgG三个条带的硝酸纤维膜；及含有胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的玻璃纤维膜。 

其中，所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体的位点特异性的针对A毒素羧基端320个氨基酸的功能区。 

所述艰难梭菌B毒素单克隆抗体的位点特异性的针对B毒素羧基端的615个氨基酸的抗原区CDB3。 

艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素特异性抗原的多克隆抗体是用原核表达的基因工程抗原免疫Bab/c纯系小鼠制备获得。 

所述的二抗IgG为抗鼠IgG抗体。 

所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.2±0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.5±0.1mg/ml。所述抗鼠IgG抗体的浓度为2±0.2mg/ml。 

所述玻璃纤维膜中胶体标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为以18～24μg/ml胶体金加入艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体。 

本发明所述艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条，还包括反应支持物、金标抗体保护膜和吸水垫，所述反应支持物上依次相互搭接 粘贴的金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。 

反应支持物优选PVC板；吸水垫优选滤油纸；金标抗体保护膜同时具有吸水功能，优选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。 

本发明所述的艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条的制备方法，包括如下步骤： 

1)制备艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素特异性抗原的多克隆抗体； 

2)硝酸纤维膜的制备：艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.2±0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.5±0.1mg/ml，抗鼠IgG抗体包被浓度为2±0.2mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用； 

3)玻璃纤维膜的制备：艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体标记胶体金调整抗体pH值为7.6～8.0，以18～24μg/ml胶体金加入艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体，经稳定剂(含0.05％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65ul的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用； 

4)最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。 

本发明所述艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条在检测艰难梭菌A、B毒素中的应用。 

本发明采用纯化的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素的多克隆抗体和抗鼠IgG分别固相于硝酸纤维膜上(NC膜)，结合胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体，应用膜层析双抗体夹心法的原理检测标本中的艰难梭菌A、B毒素。 

本发明的试纸条利用胶体金标记技术和膜层析技术，用于快速定性半定量检测样本中可能存在的艰难梭菌A、B毒素，达到快速筛检 病人，及时控制疫情的目的。节省了大量人力物力，方便、快速、简捷，不需特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，操作简单，易于推广，适合基层，适合于现场检测和流行病学调查，对艰难梭菌的感染诊断起到辅助作用。 

附图说明

图1A为本发明艰难梭菌A、B毒素试纸条的正面示意图； 

图1B为本发明艰难梭菌A、B毒素试纸条的侧面示意图； 

其中，1：吸水垫 

2：硝酸纤维膜(T1：艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A毒素的多克隆抗体的条带；T2：艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌B毒素的多克隆抗体的条带；C：包被抗鼠IgG的质控条带) 

3：含有胶体金标记艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的玻璃纤维膜 

4：金标抗体保护膜 

5：反应支持物 

图2为本发明试纸条检测结果示意图。 

从左至右依次为：T1、T2、C两条线阳性；C一条线阴性；T、C两条线阴性，无效。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 

实施例1  艰难梭菌A毒素基因工程抗原的制备 

(1)目的基因的获得 

根据目的基因片段序列(GenBank登录号为NC009012)及pGEX-4T-1(Pharmacia)表达载体的特点设计两端含有限制性内协酶 EcoR1、Xho1酶切位点的引物： 

5’TCCGAATTGGGCCTCAACTGGTTATACAAGT  3’ 

5’GTGCTCGAGAGGGGCTTTTACTCCATCAAC3’ 

然后，从基因组中扩增出目的基因片断，扩增条件：95℃变性5min；95℃1min，49.8℃1min，70℃1min，进行35个循环；最后70℃延伸10min。 

(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 

PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16℃过夜连接后，转化到DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。 

(3)融合表达载体的构建 

用限制性内切酶EcoRI、XhoI分别酶切阳性重组子和pGEX-4T-1，1％琼脂糖电泳切胶回收目的片段和pGEX-4T-1双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16℃过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶EcoR I、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。 

(4)pGEX-A融合蛋白的诱导表达 

筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1∶100的比例接种至1000ml LB液体培养基中，37℃摇床培养。基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm 0.5)，IPTG浓℃0.3mmol/L，29℃诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。 

(5)pGEX-A融合蛋白的纯化、鉴定 

将(4)中1000ml菌液12000r/m、4℃离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进 行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。 

融合蛋白的Western-Blot鉴定 

切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为A毒素单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。 

实施例2：艰难梭菌B毒素基因工程抗原的制备 

(1)目的基因的扩增 

参考GenBank收录的Cd VPI10463基因序列，设计引物，并在其5’端加上合适的限制性核酸内切酶的酶切位点： 

上游引物：5’TCCGAATTCGCTTATGTCAACTAGTGAA  3’ 

下游引物：5’GCACTCGAGTTCACTA ATCACT AATTC 3’ 

反应体系共50ul：上游引物(20pmol/L)1ul，下游引物(20pmol/L)1ul，细菌DNA模板2ul，dd H20 44ul，加入PCR扩增管中(已加入PCR buffer、pfu酶和d NTPs)。反应条件：94℃变性45s，60℃退火60s，72℃延伸150s，39个循环后，72℃再延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。 

(2)目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 

PCR扩增产物电泳后切胶回收，与PMD-18T克隆载体16℃过夜连接后，转化到DH5α感受态细胞中，挑取单克隆菌株，37℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行PCR鉴定阳性克隆菌株，测定序列。 

(3)融合表达载体的构建 

用限制性内切酶EcoRI、XhoI分别酶切T/重组子和pGEX-4T-1，1％琼脂糖电泳切胶回收目的片段和pGEX-4T-1双酶切后的大片段，用T4连接酶将两者16℃过夜连接，连接产物转入BL21感受态细胞，LB固体培养基培养8～10小时，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用PCR及限制性内切酶EcoR I、XhoI双酶切分别鉴定，PCR产物和酶切产物用 1％琼脂糖电泳进行分析，筛选阳性克隆，将重组的质粒测序。 

(4)pGEX-B融合蛋白的诱导表达 

筛选出的阳性克隆菌在LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照1∶100的比例接种至1000ml LB液体培养基中，37℃摇床培养。克隆基因转化菌在接种后2小时为最佳诱导时机(OD600nm 0.5)，IPTG浓℃0.3mmol/L，29℃诱导8小时，目的蛋白存在于细胞裂解液上清中。 

(5)pGEX-B融合蛋白的纯化、鉴定 

将(4)中1000ml菌液12000r/m、4℃离心，弃上清，将菌体用细胞裂解液裂解，使用含有GST标签的亲和层析柱子纯化融合蛋白，用GST-融合蛋白纯化试剂盒(B-PER细菌GST标签融合蛋白柱式纯化Kit货号：78200赛默飞世尔科技)，按试剂盒推荐步骤和体系进行纯化，纯化产物进行SDS-PAGE电泳以判断纯化效果，通过紫外薄层测得产率在95％以上。 

融合蛋白的Western-Blot鉴定 

切取一半胶用BioRad公司生产的半干电转仪转于硝酸纤维素膜上，进行印迹试验，一抗为B毒素单抗(北京博奥森生物技术有限公司)，TMB显色后，结果有特异性蛋白条带出现。 

实施例3艰难梭菌A毒素单克隆抗体的研制 

(1)免疫小鼠 

A毒素基因工程抗原从-20℃低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背部皮下注射(0.2ml/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0.15ml进行攻击。免疫效果用ELISA法进行检测。 

(2)骨髓瘤细胞 

SP2/0骨髓瘤细胞：用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10％小牛血清DMEM培养基中培养48～72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。 

(3)细胞融合 

制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配制成2×10⁷/ml和1×10⁸/ml。各取1ml室温下混合。用0.8ml，50％的PEG(分子量1500)作为融合剂；培养液用10％小牛血清DMEM。 

(4)阳性孔的检测和筛选 

ELISA法检测。包被A毒素抗原酶标板。对融合细胞的培养上清液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1.0的阳性孔进行亚克隆。共检出阳性克隆34株，选择11株进行亚克隆操作。 

(5)单抗细胞株的亚克隆 

用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得7株可稳定分泌特异性抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体细胞株。 

(6)单克隆抗体细胞株检定 

细胞株核型分析：对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为96条；证明他们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。 

细胞株稳定性：对7株产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株经连续克隆化检测单克隆抗体阳性率100％，在体外传代5个月，并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体，培养上清ELISA效价大于1∶1000。 

实施例4：抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的检定 

(1)单抗腹水制备： 

小鼠：SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。 

细胞株扩大培养：取生产批细胞管1支复苏，加营养液扩大培养，1只生产细胞只用一次，不再冻存。 

杂交瘤细胞株接种：制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。一周后每只小鼠腹 腔注射杂交瘤细胞1～3×10⁶/0.2ml。 

腹水采集：注射细胞株7～10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，置-20℃保存。 

(2)单克隆抗体的提纯： 

采用硫酸铵沉淀法粗提，进而用HiTrap rProtein A柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。 

(3)抗体亲合力测定： 

采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED50的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。 

(4)亚型检定： 

采用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。 

(5)抗原位点检定： 

用相加ELISA法对7株单抗的抗原结合位点进行检测。从而筛选出配对单克隆抗体。 

实施例5艰难梭菌B毒素单克隆抗体的研制 

(1)免疫小鼠 

B毒素基因工程抗原从-20℃低温冰箱取出溶解后，给BALB/C小鼠背部皮下注射(0.2ml/只)，间隔10天。融合前3日，在小鼠腹腔以抗原0.15ml进行攻击。免疫效果用ELISA法进行检测。 

(2)骨髓瘤细胞 

SP2/0骨髓瘤细胞：用时将存储在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10％小牛血清DMEM培养基中培养48～72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈对数分裂，准备融合。 

(3)细胞融合 

制备好的SP2/0细胞和免疫的BALB/C小鼠的脾淋巴细胞分别配制成2×10⁷/ml和1×10⁸/ml。各取1ml室温下混合。用0.8ml，50％的PEG(分子量1500)作为融合剂；培养液用10％小牛血清DMEM。 

(4)阳性孔的检测和筛选 

ELISA法检测。包被B毒素抗原酶标板。对融合细胞的培养上清液进行检测，选择ELISA效价OD值大于1.0的阳性孔进行亚克隆。共检出阳性克隆28株，选择9株进行亚克隆操作。 

(5)单抗细胞株的亚克隆 

用有限稀释法对阳性克隆细胞株进行克隆化筛选。对筛选的的阳性克隆经过冻存、复苏、传代等过程，最终获得5株可稳定分泌特异性抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体细胞株。 

(6)单克隆抗体细胞株检定 

细胞株核型分析：对上述杂交瘤细胞染色体进行检测为96条；证明他们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。 

细胞株稳定性：对5株产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株经连续克隆化检测单克隆抗体阳性率100％，在体外传代5个月，并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体，培养上清ELISA效价大于1∶1000。 

实施例6：抗艰难梭菌B毒素单克隆抗体的检定 

(1)单抗腹水制备： 

小鼠：SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。 

细胞株扩大培养：取生产批细胞管1支复苏，加营养液扩大培养，1只生产细胞只用一次，不再冻存。 

杂交瘤细胞株接种：制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。一周后每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞1～3×10⁶/0.2ml。 

腹水采集：注射细胞株7～10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，置-20℃保存。 

(2)单克隆抗体的提纯： 

采用硫酸铵沉淀法粗提，进而用HiTrap rProtein A柱纯化，经SDS-PAGE电泳检定，仅显示单一蛋白带。 

(3)抗体亲合力测定： 

采用NaSCN竞争ELISA实验，测定其ED50的下降值，来间接反映其抗体亲合力的大小。 

(4)亚型检定：采用免疫扩散法对细胞培养上清的单抗进行Ig亚类的检测。 

(5)抗原位点检定：用相加ELISA法对5株单抗的抗原结合位点进行检测。从而筛选出配对单克隆抗体。 

实施例7  艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条(参见图1) 

(1)胶体金抗体结合物的制备： 

经实验确定，艰难梭菌A、B毒素单克隆抗体胶体金标记的最佳pH值为8.0，胶体金和抗体的配比为22μg/ml胶体金。标记胶体金经稳定剂(含0.5％BSA，pH8.0，0.01MTris缓冲液)处理后，按每平方厘米65μl的量，取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，并在干燥环境中保存。 

(2)包被抗体于硝酸纤维膜： 

艰难梭菌A毒素的单克隆抗体包被浓度为1.2±0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体的包被浓度为1.5±0.1mg/ml，抗鼠IgG抗体包被浓度为2±0.2mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；把固定有抗体的硝酸纤维置37℃烤箱中干燥2小时。干燥环境中保存备用。 

(3)艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条 

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗鼠IgG，艰难梭菌A毒素的单克隆抗体、抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体玻璃纤维膜3； 金标抗体保护膜4为2.7cm×0.4cm的聚脂膜；即形成了艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条。 

(4)艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条特异性及敏感度实验： 

用艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条检测基因工程抗原标本，其A抗原的最低检出量为5ng/ml，B抗原的最低检出量为2ng/ml。 

根据本产品的检测对象为粪便，设计检测如下的阴性质控品，包括：大肠杆菌、O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、空肠弯曲菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、正常粪便，血便，结果均为阴性，表明本产品与上述样品无交叉反应。 

实施例8艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条(参见图1) 

反应支持物5为6.5cm×0.4cm PCV板；吸水垫1为2cm×0.4cm的滤油纸；1.8cm×0.4cm的硝酸纤维膜2依次包被抗鼠IgG，艰难梭菌A毒素的多克隆抗体、抗艰难梭菌B毒素的多克隆抗体，含有0.4cm×0.4cm胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体玻璃纤维膜3；金标抗体保护膜4为2.7cm×0.4cm的玻璃纤维；即形成了艰难梭菌A、B毒素胶体金快速检测试纸条。 

实施例9  检测方法(参见图2) 

将标本放入装有稀释液的小瓶内，将实施例7或8试纸条“4”处插入瓶内(直至观察完结果后方可取出试纸条)，样品中的液体吸起上行，10～15分钟判读。 

结果： 

如含有艰难梭菌A、B毒素，则与试纸条上胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体形成相应的复合物，上行与包被在硝酸纤维膜上的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素的多克隆抗体，形成红色线条，即在T处形成红色条带。 

无论是否含有相对应的抗原，胶体金标记艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体继续向上爬行与包被在膜上的抗鼠IgG形成红色沉淀线，即在“C”处形成红色条带。此线是质控线，如胶体金失效，此线就不会出现，说明试纸条失效。 

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 

                     序列表 

<110>北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 

<120>一种艰难梭菌A、B毒素胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用 

<130> 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>31 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

tccgaattgg gcctcaactg gttatacaag t                                    31 

<210>2 

<211>30 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

gtgctcgaga ggggctttta ctccatcaac                                      30 

<210>3 

<211>28 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

tccgaattcg cttatgtcaa ctagtgaa                                        28 

<210>4 

<211>27 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

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Claims (3)

1.一种艰难梭菌A、B毒素检测试纸条，其特征在于，其包含：同时包被艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素特异性抗原的多克隆抗体和抗鼠IgG三个条带的硝酸纤维膜（2）；及含有胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的玻璃纤维膜（3）；所述玻璃纤维膜中胶体金标记的艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体的pH值为7.6～8.0，胶体金和抗体的配比为18～24μg/ml胶体金；所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.2±0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的包被浓度为1.5±0.1mg/ml，所述抗鼠IgG抗体的浓度为2±0.2mg/ml；所述艰难梭菌A毒素的单克隆抗体的位点特异性地针对以艰难梭菌DNA为模板、SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2为引物PCR扩增的目的片段核苷酸编码的A毒素羧基端氨基酸的功能区；所述艰难梭菌B毒素单克隆抗体的位点特异性地针对以艰难梭菌DNA为模板、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4为引物PCR扩增的目的片段核苷酸编码的B毒素羧基端的氨基酸抗原区。

2.根据权利要求1所述艰难梭菌A、B毒素检测试纸条，其特征在于，还包括反应支持物（5）、金标抗体保护膜（4）和吸水垫（1），所述反应支持物（5）上依次相互搭接粘贴的金标抗体保护膜（4）、玻璃纤维膜（3）、硝酸纤维膜（2）和吸水垫（1）。

3.一种制备权利要求2所述的艰难梭菌A、B毒素检测试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）制备艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体或抗艰难梭菌A、B毒素特异性抗原的多克隆抗体；

2）硝酸纤维膜的制备：将艰难梭菌A毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为1.2±0.2mg/ml，抗艰难梭菌B毒素的单克隆抗体或多克隆抗体的浓度为1.5±0.1mg/ml，将抗鼠IgG抗体的浓度为2±0.2mg/ml， 喷于硝酸纤维膜上，分别形成检测线和对照线，且于37℃中干燥2小时，备用；

3）玻璃纤维膜的制备：艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体标记胶体金的pH值为7.6～8.0，于胶体金中加入艰难梭菌A、B毒素的单克隆抗体使其终浓度为18～24μg/ml胶体金，经稳定剂处理后，按每平方厘米65μl的量均匀吸附于玻璃纤维膜上，冷冻干燥，备用；

4）最后在反应支持物上依次相互搭接粘贴金标抗体保护膜、玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫。 

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