CN106497887A - 一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 - Google Patents
一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106497887A CN106497887A CN201610847144.XA CN201610847144A CN106497887A CN 106497887 A CN106497887 A CN 106497887A CN 201610847144 A CN201610847144 A CN 201610847144A CN 106497887 A CN106497887 A CN 106497887A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tmv
- colloidal gold
- pad
- detection
- films
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 87
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 60
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 36
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 36
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 claims abstract description 22
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 67
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 15
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 4
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 101150083464 CP gene Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001478482 Saccharothrix syringae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000008831 immune no. 2 Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003126 immunogold labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- ZKYZRKAQLUNELL-UHFFFAOYSA-O oxo-[[1-[3-[4-(oxoazaniumylmethylidene)pyridin-1-yl]propyl]pyridin-4-ylidene]methyl]azanium;bromide Chemical compound [Br-].C1=CC(=C[NH+]=O)C=CN1CCCN1C=CC(=C[NH+]=O)C=C1 ZKYZRKAQLUNELL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000003325 tomography Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000008689 wuhua Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体，该抗体由杂交瘤细胞株BALB/c‑15‑50分泌产生；所述NC膜上设置有检测线和控制线，检测线上包被有三种病毒的特异抗原；控制线上包被有胶体金标记的二抗。该试纸条尤其是对广东烟区的TMV的检测，快速、灵敏、准确、成本低、操作简便，实现一次取样，多病毒同时诊断，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，推广应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于病原物检测技术领域。更具体地，涉及一种TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是侵染烟草的主要病毒之一。它引发的病毒病每年导致烟草产业巨大的经济损失。快速、准确地定性检测相关病毒是生产上防控病害、减少损失的重要手段之一。
在科学研究中，植物病毒的检测方法主要有生物学检测法(症状类型辨别、鉴别寄主等)、电镜技术、血清学检测法(酶联免疫吸附反应(Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)等)和分子生物学检测法(包括PCR技术、核酸探针技术等)等。分离病毒照电镜虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用。血清学检测方法比较费时、费力。免疫荧光、ELLSA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价并且适合于基层应用的病毒诊断方法。
1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化学。Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法观察沙门氏菌。许多学者进一步证实胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位。胶体金溶液是指分散相粒子直径在l～150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。免疫胶体金层析技术(Gold immunochromatography assay，GICA)作为一种新的免疫学检测方法，是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特的诊断技术。这项技术将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单(多)克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起，具有简单、快速、准确、无污染、操作简单和无需特殊设备等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。20世纪90年代初到中期，胶体金标记免疫层析诊断技术开始进入商业化应用。利用这种技术开发的胶体金快速检测试纸条具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，可在现场(临床)对目标病原进行初筛，节省大量的人力、物力。在医学领域，这种技术除用于激素、传染病病原的抗原和抗体、细菌、寄生虫的检测外，还发展到了对毒品等小分子物质的检测。检测的标本类型也涵盖了血清、血浆、全血、尿、粪便及唾液等，显示出了广阔的前景和巨大的应用价值。
目前，胶体金试纸条在国内主要应用于医学领域和畜牧兽医领域，植物病毒方面很少见到。在农牧领域，较少有成熟的产品，更多的出现在相关的科研项目中。孙艳等(2011)应用胶体金技术进行了黄瓜细菌性角斑病(Pseudomona.s.syringaepv.Lachrymans)的快速检测研究。国内涉及到烟草病毒病检测的商用胶体金试纸条非常少。国外的商品化试纸条非常昂贵，价格在50～60元人民币/张，不适于生产上大批烟苗的检测使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种广东烟区TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条。核心技术是开发针对烟草苗期主要病毒烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的单重胶体金检测试纸条，让烟农操作方便，诊断及时准确。
本发明的目的是提供一株可以产生TMV特异单抗的杂交瘤细胞株BALB/c-15-50。
本发明另一目的是提供一种TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条。
本发明的再一目的是提供所述TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一株产生TMV的特异单抗的杂交瘤细胞株BALB/c-15-50，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
同时，由上述杂交瘤细胞株BALB/c-15-50分泌产生的TMV特异单抗也在本发明的保护范围之内。
另外，上述TMV特异抗体在制备TMV病毒检测制剂或产品方面的应用也在本发明的保护范围之内。优选地，所述TMV病毒是指广东烟区的TMV病毒。
具体地，由上述TMV特异抗体制备的TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体，所述NC膜上设置有检测线(T线)和控制线(C线)，且检测线(T线)位于胶体金垫和控制线(C线)之间的位置；检测线(T线)上包被有TMV病毒的特异抗原；控制线(C线)上包被有胶体金标记的二抗。
上述TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条在TMV病毒的检测方面，具有很好的应用前景，尤其是针对广东烟区的TMV病毒，检测灵敏度可以达到1g/100mL。
本发明利用竞争抑制法，成功构建了TMV单重检测试纸条。其基本原理如下：
胶体金标记的TMV特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，TMV病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的测试线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。
当待测样本含有TMV病毒时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。
当待测样本没有TMV病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。
本发明具有以下有益效果：
本发明首次针对植物病毒构建了TMV单重病毒的检测试纸条，创新性很强，开发的TMV单重病毒快速检测试纸条利用胶体金免疫层析技术，结合了色谱层析和免疫反应的原理，实现了快速、准确地定性检测病原的目的，可以在田间快速、大规模的检测样品，检测结果准确、可靠。与ELISA方法相比，本发明的试纸条具有快速、灵敏、直观、成本低廉、操作简便、对人体无害、易于大量样本的检测等特点，让烟农操作方便，诊断及时准确。
更重要的是，本发明的试纸条检测的病毒的特异性很强，是专门针对广东烟区的TMV的检测。该试纸条采用的关键抗体是专门针对广东烟区TMV的流行株系构建得到，所制备的针对性的单克隆抗体灵敏度非常高，可以达到1g/100mL，对广东烟区TMV病毒的快速检测具有重要的意义。
另外，本发明的整个产品体积小、携带方便，不需要仪器设备，操作简单。可现场检测，在3～10min内即可出结果；结果可由肉眼根据T线颜色的深浅进行判断，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，具有强大的推广应用前景。
附图说明
图1为CP-T-GD连接到pET30a-GST载体的重组载体示意图。
图2为CP-T-GD蛋白小量表达检测电泳图；M：marker，1：目标蛋白，2：未诱导对照。
图3为CP-T-GD蛋白大量表达检测电泳图；M：marker，1：上清，2：沉淀。
图4为CP-T-GD蛋白纯化结果；M：marker，1：样品稀释100倍。
图5为胶体金快速检测试纸条的示意图。
图6为TMV单重病毒胶体快速金检测试纸条检测效果；(左边为阴性样本，右边为阳性样本)。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1广东烟区TMV病毒株的分离
1、2012～2014年，从广东省韶关市的南雄、始兴、乳源、乐昌，清远市的连洲，梅州市的五华、蕉岭、大埔和梅县等9个地县29个镇，33个村的烟田里表现普通花叶病的烟草植株上进行取样。取样点覆盖广东省的所有烟区。共72个样品。将之分别进行生物学和ELISA(酶联免疫吸附测定)的分离、鉴定。
共分离得到49个TMV分离物，都已得到ELISA检测验证。生物学鉴定结果表明：所采TMV分离物属于普通株系。
2、对TMV病毒的全CP(coat protein))基因进行扩增。将PCR产物胶回收后与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α。挑取阳性克隆扩大繁殖培养，碱裂解法抽提质粒后，进行双酶切鉴定，得到含有重组质粒的阳性转化子。将阳性转化子送北京奥科生物技术有限公司测序。
测序得到的TMV CP基因为470bp(序列如SEQ ID NO.1所示)，将之分别命名为CP-T-GD。
进入NCBI的数据库，用Blast工具将CP-T-GD序列分别与数据库里的数据进行比对分析。
3、分析结果显示：CP-T-GD序列与其他报道的TMV CP基因的序列的相似性为16.5％～95％。这说明本研究获得的在广东烟区占主要优势地位的TMV分离物与普通的TMV株系存在一定差异。
实施例2制备CP基因原核表达特异蛋白
1、制备CP-T-GD原核表达蛋白，将CP-T-GD构建到pET30a-GST载体上，转化BL21菌株，进行原核表达，纯化表达蛋白。
相关信息汇总如下表1所示。
表1
2、具体方法如下。
(1)目的基因序列：根据大肠杆菌密码子优化后序列，两端加酶切位点EcoR I和Xho I。合成目的基因到pUC57载体。
(2)通过酶切、连接，将目的基因连接到pET30a-GST载体，构建后的重组载体示意图如附图1所示。
基因片段酶切：43μl重组质粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃过夜反应。(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI)。
载体酶切：43μl载体(pET30a-GST)质粒，1μl EcoR I，1μl Xho I，5μl 10×Buffer，37℃过夜反应。(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，BPI)。
连接：1μl载体酶切片段，3μl基因酶切片段，1μl连接酶(BPI)，5μl 2×RapidBuffer，混匀，室温反应30min。
(3)将重组载体转化BL21感受态细胞：
1)取出-80℃保存的100μl感受态细胞(BL21)，放在冰上缓慢解冻；
2)将感受态细胞加入1μl重组质粒的管中，混匀，冰上放置30min；
3)42℃热激90s；
4)冰浴2min后，加入800μl无抗性的LB培养基；
5)37℃培养45min；
6)5000rpm离心3min，弃大部分上清，留约100-150μl，重悬菌体，选择有相应抗性的LB平板，涂板；
7)晾干，于37℃培养箱中倒置培养过夜。然后测序验证正确。
(4)小量表达检测：
1)从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养；
2)培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导，37℃，200rpm培养2h；
3)取1ml诱导的菌液，12000rpm，离心1min，弃上清，沉淀用50-100μl 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液吹散(加入缓冲液的量视菌体量而定)；
4)加入与缓冲液等体积的2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测(15％SDS-PAGE)。
结果如附图2所示，有正确表达条带。
(5)大量表达：
1)挑选验证正确的菌株，接5～10μl活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养；
2)将培养的菌液转接到500mL LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6，IPTG(0.5mM)诱导4h；
3)大量收菌：用400ml大离心筒，6000rpm，离心5min，弃上清；
4)超声破菌：沉淀用25ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，超声；
5)电泳确定表达形式：取100μl超声(500W,90次，每次3s，间隔6s)后的菌悬液，12000rpm，离心10min，取50μl上清至另一EP管，上清去除干净后，沉淀用50μl 10mM Tris-HCl(pH 8.0)溶液吹散，加入50μl 2×loading buffer，100℃煮5min，电泳检测(15％SDS-PAGE)。
结果如附图3所示，蛋白有表达，主要表达在沉淀中。
(6)蛋白质纯化(洗包涵体)：
1)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬超声离心得到的沉淀，静置10min；
2)12000rpm，离心10min，上清转入另一管中保存；
3)20～30ml 10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，静置10min；
4)12000rpm，离心10min，弃上清；
5)重复3)、4)一次；
6)先加入少量的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液重悬沉淀，再加5～10ml含8M尿素的10mM Tris-HCl(pH8.0)溶液溶解蛋白；
7)12000rpm，离心10min，收集上清，取50μl电泳(15％SDS-PAGE)。
结果如附图4所示，纯化得到目的蛋白CP-T-GD。
实施例3构建表达TMV病毒特异单抗的杂交瘤细胞株
利用实施例2得到的CP基因原核表达特异蛋白，用表达蛋白免疫小鼠；进行融合试验，得到产生TMV病毒的特异单抗的阳性杂交瘤细胞株。
1、具体方法如表2所示。
表2
2、具体方法如下：
(1)免疫
1)用“TMV”，按60ug蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：1、2，3，4。
2)初免两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
3)第一次加强免疫两周后，皮下第二次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
4)第二次加强免疫两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30ug蛋白/只。
5)第二次加强免疫一周后，眼眶取血，测血清效价。
(2)免疫效价检测：
用“TMV”，2ug/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。
表3免疫效价(效价为大于最大OD/2的最小OD读数所对应的稀释度)
| 编号 | 200 | 400 | 800 | 1600 | 3200 | 6400 | 12800 | 25600 | 51200 | 102400 | 空白 | 阴性 |
| TMV-1 | 1.63 | 1.534 | 1.438 | 1.33 | 1.144 | 0.887 | 0.648 | 0.419 | 0.238 | 0.141 | 0.031 | 0.046 |
| TMV-2 | 1.619 | 1.543 | 1.503 | 1.314 | 1.128 | 0.943 | 0.706 | 0.52 | 0.302 | 0.158 | 0.034 | 0.049 |
| TMV-3 | 1.54 | 1.5 | 1.386 | 1.177 | 1.018 | 0.723 | 0.612 | 0.429 | 0.242 | 0.14 | 0.033 | 0.045 |
| TMV-4 | 1.633 | 1.577 | 1.499 | 1.309 | 1.073 | 0.87 | 0.695 | 0.487 | 0.274 | 0.16 | 0.025 | 0.035 |
根据结果选取冲击2号小鼠做细胞融合实验。融合前，用免疫原“TMV”50ug，腹腔冲击免疫2号小鼠。
(2)细胞融合
取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
1)实验器材：灭菌的手术器械(包括三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿)，湿盒，2个500ml烧杯，2个50ml离心管，3个15ml离心管。
2)实验试剂：IMDM培养基；IMDM完全培养基(含15％血清)；2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA，货号：M0262-100G；新生牛血清10ml；PEG1500：厂家：Roche，货号：78364；HAT：厂家：Sigma，货号：H0262-10VL；HT：厂家：Sigma，货号：H0137-10VL。
3)融合实验步骤
a.将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。
b.小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。
c.在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。
d.用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。
e.将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。
f.将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。
g.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。
(3)挑克隆
挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。
(4)单克隆细胞1筛
用“TMV”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到19株阳性杂交瘤细胞株。
1)实验试剂：
包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6
PBS缓冲液pH7.4
封闭液：2％牛奶in PBS
洗液：PBS－T(0.05％吐温，PBS)
显色液:1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2 in柠檬酸缓冲液)
终止液：2M硫酸
二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP
2)实验步骤
用包被液稀释“TMV”，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。
a.2％牛奶封闭液封闭，200ul/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。
b.加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 1000倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。
c.加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。
d.显色，显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。
e.每孔加入50ul终止液终止。
f.双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。包括对免疫蛋白筛选呈阳性的杂交瘤细胞株的数据、阳性对照读数、空白对照读数以及阴性对照读数。
根据结果筛选得到对免疫蛋白筛选呈阳性的杂交瘤细胞株，共19株。
(5)单克隆细胞2筛
将19株阳性的细胞株，用“TMV”及标签蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到5株阳性杂交瘤细胞株。
(6)将筛选出来的5株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到3株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。
1)实验试剂
包被抗体：(Southern Biotech)
封闭液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；
显色液:0.2ml A液+10ul 30％H2O2 in 10ml B液(A液：15mg/ml ABTS in H2O；B液：柠檬酸缓冲液,pH4.0)
2)各型亚类二抗：(Southern Biotech)实验步骤：
a.用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5ug/ml，每孔加0.1ml，4℃，过夜。
b.PBS-T洗2次，每孔加入200ul封闭液，370C孵育2h。
c.PBS-T洗3次；每孔加入100ul杂交瘤上清，370C孵育1h。
d.PBS-T洗3次；用封闭液1：10000(κ,λ)或1：20000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，370C孵育1h。
e.PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min内于双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。
表4
最终得到3株杂交瘤细胞株，均为G1亚型。选取最好的一株培育保存，并命名为BALB/c-15-50，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
杂交瘤细胞株BALB/c-15-50可以产生TMV的特异单抗。
实施例4制备TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条
1、实验材料
(1)胶体金颗粒：枸橼酸钠还原法制备(30nm)
(2)TMV病毒的特异性抗体
将实施例3的阳性杂交瘤细胞株BALB/c-15-50进行培养表达，进行Protein A过柱纯化，得到TMV病毒的特异单克隆抗体。
(3)二抗：Goat-anti-Rabbit Ig G
特异抗体胶体金标记的pH为8.2，胶体金标记二抗的pH为9.0。
金标抗体用BSA做稳定剂。
2、仪器设备：
JY-EQ03 连续式划膜仪，JY-EQ02 喷金机，JY-EQ01 斩切式切刀，I JY-EQ05 压壳机。
3、耗材：
JY-D101 DB-6 底板，JY-X115 H5072 吸水纸，JY-BX101 金标垫，JY-JZ112fusion 3 样品垫，JY-C111 A-11 塑料卡。
4、试纸条的组装
(1)如附图5所示，将背衬(背衬)、样品垫、吸水垫(吸水滤纸)、硝酸纤维素膜(NC膜)、金标垫(胶体金垫)粘在一起，利用切条机将其切成4.5mm宽的试纸条，于4℃干燥保存备用。
(2)试纸条组装条件：
试纸条的组装要求在室温恒定干燥的环境下，湿度大或温度过高会影响玻璃纤维、NC膜的性质和二抗、包被抗体、金标抗体的活性，进而影响试纸条的层析速度及显色反应。各部分组装时，要粘贴紧密不要划到NC膜，否则会影响出线效果。本试纸条在室温25℃、湿度低于40％条件下进行组装。
5、本发明的TMV单重病毒检测试纸条的结构描述如下：
由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体，所述NC膜上设置有检测线(T线)和控制线(C线)，且检测线(T线)位于胶体金垫和控制线(C线)之间的位置；检测线(T线)上包被有TMV病毒的特异抗原；所述胶体金垫上的金标抗体可以与检测线上的抗原结合反应并显色；控制线(C线)上包被有胶体金标记的二抗。
该试纸条的检测基本原理如下：
胶体金标记的TMV特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，TMV病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的测试线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。
当待测样本含有TMV病毒时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的相应病毒的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。
当待测样本没有TMV病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。
实施例5胶体金快速检测试纸条的样品检测
1、取感染了TMV病毒的烟草，以及健康烟草的叶片作为实验材料，各0.2g，加PBS缓冲液(pH8.0，0.01M)，进行研磨，不要用自来水稀释叶子。
各取50uL研磨液加到制备好的试纸条样品垫上，五分钟后判读结果。
2、结果如附图6所示。感病烟草样本的试纸条C处质检带出现明显的红棕色条带，实验结果为阳性。
健康烟草样本的试纸条C处质检以及T处检测带带出现明显的2条红棕色条带，实验结果为阴性。
结果显示，本发明的TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条对TMV病毒的检测效果良好。
实施例5胶体金快速检测试纸条的灵敏度检测
1、将0.1g烟草病样用0.01mol/L的PBS稀释6个系列浓度，与样品处理液等体积混合后，终浓度为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL，以PBS与样品处理液等体积混合为阴性对照，测定试纸条灵敏度。
2、当烟草病样的浓度为10-3mg/mL时，试纸条的检测条带模糊不清。因此，本发明试纸条的检测灵敏度可达到10-2mg/mL。
Claims (8)
1.一株产生TMV的特异单抗的杂交瘤细胞株BALB/c-15-50，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12678，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种TMV的特异单抗，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株BALB/c-15-50分泌产生。
3.权利要求2所述TMV的特异单抗在制备TMV病毒检测制剂或产品方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述TMV病毒是指广东烟区的TMV病毒。
5.一种TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的TMV特异抗体，所述NC膜上设置有检测线和控制线，且检测线位于胶体金垫和控制线之间的位置；检测线上包被有TMV病毒的特异抗原；控制线上包被有胶体金标记的二抗。
6.根据权利要求5所述的TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，所述TMV特异抗体是权利要求2所述的TMV的特异单抗。
7.权利要求5或6所述TMV单重病毒胶体金快速检测试纸条在TMV病毒的检测方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述TMV病毒是指广东烟区的TMV病毒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610847144.XA CN106497887A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610847144.XA CN106497887A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106497887A true CN106497887A (zh) | 2017-03-15 |
Family
ID=58290346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610847144.XA Pending CN106497887A (zh) | 2016-09-23 | 2016-09-23 | 一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106497887A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106526180A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-03-22 | 华南农业大学 | 一种tmv‑cmv双重病毒胶体金快速检测试纸条 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1424326A (zh) * | 2002-12-24 | 2003-06-18 | 浙江大学 | 八种植物病毒的单克隆抗体及其检测方法 |
| CN101294963A (zh) * | 2007-04-26 | 2008-10-29 | 福建农林大学 | 检测烟草病毒系列免疫胶体金试剂及其制备方法 |
| CN103901195A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-02 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103901200A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-02 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN104404000A (zh) * | 2014-11-10 | 2015-03-11 | 浙江大学 | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
-
2016
- 2016-09-23 CN CN201610847144.XA patent/CN106497887A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1424326A (zh) * | 2002-12-24 | 2003-06-18 | 浙江大学 | 八种植物病毒的单克隆抗体及其检测方法 |
| CN101294963A (zh) * | 2007-04-26 | 2008-10-29 | 福建农林大学 | 检测烟草病毒系列免疫胶体金试剂及其制备方法 |
| CN103901195A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-02 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种检测烟草花叶病毒的胶体金免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN103901200A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-02 | 云南省烟草农业科学研究院 | 一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法 |
| CN104404000A (zh) * | 2014-11-10 | 2015-03-11 | 浙江大学 | 分泌抗烟草花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吴峰等: "烟草花叶病毒快速检测方法的建立及应用", 《云南大学学报(自然科学版)》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106526180A (zh) * | 2016-09-23 | 2017-03-22 | 华南农业大学 | 一种tmv‑cmv双重病毒胶体金快速检测试纸条 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104007261B (zh) | 禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒及应用 | |
| CN105461805B (zh) | 抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN106636004A (zh) | 一种tmv‑cmv‑pvy三重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN105950563B (zh) | 杂交瘤细胞株7e3及其分泌的抗口蹄疫a型病毒的单克隆抗体与应用 | |
| CN106596931B (zh) | 一种广东烟区黄瓜花叶病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN106244561A (zh) | 一种tmv‑pvy双重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN109187967A (zh) | 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法 | |
| CN101363867B (zh) | 一种艰难梭菌a、b毒素胶体金检测试纸条及其制备方法 | |
| CN101362800A (zh) | 一种用于布鲁氏菌快速检测的试纸条 | |
| CN101363859B (zh) | 布鲁氏菌抗体快速检测试纸条 | |
| CN106479984A (zh) | 一种cmv‑pvy双重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN107312088A (zh) | 猪流行性腹泻病毒特异性SIgA ELISA检测试剂盒及其应用 | |
| CN106841609A (zh) | 一种猪圆环病毒2型阻断elisa抗体检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN111505289A (zh) | 小反刍兽疫检测试剂盒 | |
| CN112745387B (zh) | 抗猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体及其应用 | |
| CN105296435B (zh) | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型（o/gx/09-7）病毒的特异性单克隆抗体与应用 | |
| CN106526179B (zh) | 一种pvy单重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN106497887A (zh) | 一种tmv单重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN109593122A (zh) | 抗猪戊型肝炎病毒orf2蛋白单克隆抗体及其制备与应用 | |
| CN105543177A (zh) | 分泌抗柑橘黄化脉明病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
| CN106526180B (zh) | 一种tmv-cmv双重病毒胶体金快速检测试纸条 | |
| CN101363865A (zh) | 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用 | |
| CN108254556A (zh) | 一种百日咳毒素检测试剂盒及其应用 | |
| CN105567643B (zh) | 可分泌抗ev71病毒蛋白vp1单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用 | |
| CN103808945B (zh) | 一种j亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |