CN103901200A - 一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法，所述试纸为由磁性样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成的检测试纸，且在硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体；在磁性样品垫加入待测样品后，使用超顺磁共振检测仪MAR测定检测区的磁场强度，通过与设定的临界值比对而确定其阳性或阴性结果；质控区的测定结果则作为该测定方法的质控内标。本发明提供的试纸实现了对烟草花叶病毒的客观化测定，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点。本发明提供的制备方制作步骤简单，节约成本。

Description

一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于农业技术领域，具体涉及一种检测烟草中烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术
烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是一类分布广泛，并能够感染多种植物的有害病毒，此病毒最早于1857年就曾被Swieten在烟草生长的反常现象中发现，并记载了感染此病毒的植物的病理特征。1886年Mayer首次将此病毒命名为“Mosaic”，并且通过一系列实验证明了此病毒具有传染性。直到1939年，德国的科学家Kausche等利用电子显微镜技术第一次观察到了烟草花叶病毒（TMV）的杆状病毒颗粒。
烟草花叶病毒引起的植物病害在全世界烟叶种植地区均有发生，我国的南北烟叶种植区广泛的存在此病害，尤以南方烟叶种植地区发病率为高。目前对于烟草病毒的诊断主要通过ELISA（酶联免疫吸附检验技术）检测和应用电子显微镜检测；ELISA是目前较为广泛的方法，然而该方法必须要使用抗血清，商业渠道购买的抗血清价格昂贵且品种较少，无法满足烟草生产上多种病毒病诊断的需要，自制抗血清程序复杂，产生的抗血清质量往往不高，不宜用于准确的诊断，同时对那些在植物体内含量较低的病毒，该检测方法往往灵敏度不够，无法实现可靠的诊断。
由于传统病毒诊断方法往往需要较长的时间，并且每次诊断只能针对单一的病原物，面对病毒复合浸染的情况往往显得束手无策，有时甚至会得出错误的结论，从而导致生产上大面积防治措施不能及时到位。因此急需研究一种灵敏度高、测试准确、稳定性强的烟草花叶病毒诊断试纸。
超顺磁性复合粒子具有良好的磁学特性，由于其受背景干扰小，特别适宜于不含磁性物质的生物样品的检测。而应用广泛的胶体金标记分子和荧光标记分子在用于测流免疫层析检测时，只可在其检测区膜表面观测到约10%的信号分子强度，而用超顺磁性复合粒子作为标记材料，则可检测到检测区膜三维立体结构中的所有磁信号分子，可极大提高灵敏度，并可用对应的磁信号检测仪实现定量测定，因此，超顺磁性复合粒子成为近年来在LFIAs中最受关注的材料。
然而，目前的生物检测用磁性纳米复合粒子多采用化学法如共沉淀法先制备得到有机相的磁性纳米粒子，再采用硅（SiO2）或聚苯乙烯、聚丙烯酸、明胶等高分子材料对其表面进行稳定化包覆修饰，以得到稳定的、水溶性的磁性标记材料。上述制备修饰方法往往较为繁琐复杂，得到的超顺磁性复合粒子在尺寸大小、生物相容性、饱和磁强度、外磁场响应速度、稳定性和标记效率等方面不能同时满足LFIAs的要求：其尺寸多在200-300nm之间，由于磁珠颗粒偏大，在试纸上的泳动时间较慢，显色时间较长；而太小的粒子又无法提供足够的磁共振信号；另外还有生物相容性不稳定、磁珠容易聚合等问题；这上述不足限制了超顺磁性复合粒子在LFIAs中的应用。
本发明针对现有技术存在的上述问题进行研究，力求开发一种灵敏度高、特异性强、快速、简便的完成检测的磁性试纸。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、测定准确，可应用于烟草花叶病毒检测的磁性免疫层析试纸。
本发明的第一目的是这样实现的，该试纸包括含有烟草花叶病毒标记抗体的磁性样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板，所述磁性样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，所述硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与所述烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体。
所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒抗体和超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体。
所述超顺磁性复合粒子为粒径为100nm、磁饱和强度为40 emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒、表面羧基含量为80 μmol/g的超顺磁性Fe3O4纳米粒子。
所述烟草花叶病毒抗体的亲和常数为108 M-1。
所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体。
所述烟草花叶病毒包被抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
所述烟草花叶病毒包被抗体的浓度为2 mg /ml，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1 mg /ml。
所述磁性样品垫采用玻璃纤维膜制作。
本发明的第二目的在于提供一种制备上述检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的方法。
本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：
A、制备烟草花叶病毒标记抗体：
1）将2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、1.15mg的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1ml 0.1M MES缓冲液（pH=4.7）混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到活化后磁性粒子； 
2） 将步骤1中得到的活化后磁性粒子、0.15mg烟草花叶病毒抗体和0.8ml浓度为50mM，pH为8.5的硼砂缓冲液混匀，在37oC温度条件下反应3.5h，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；
3）将步骤2中得到的反应液中加入浓度为5%的BSA混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；
4）将步骤3中得到的反应液中的封闭后磁性粒子用0.02M PBS缓冲液（pH=7.4）进行洗涤、悬浮，得到烟草花叶病毒标记抗体，4 oC保存待用；
B、制备设置有检测区和质控区的硝酸纤维素膜：
将所述烟草花叶病毒包被抗体和抗抗体分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成检测区和质控区，得到含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；
C、制备含有烟草花叶病毒标记抗体的磁性样品垫：
将步骤A中制得的烟草花叶病毒标记抗体用缓冲液稀释50倍,得到烟草花叶病毒标记抗体溶液；将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1小时；用上述烟草花叶病毒标记抗体溶液喷涂上述玻璃纤维膜，得到磁性样品垫，然后放入干燥室中干燥；
D、将所述磁性样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，裁切得到检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，4℃贮存。
所述步骤C中使用的缓冲液由2ml TritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml浓度为0.02M、pH为7.4的PBS缓冲液混合得到，调节pH至7.4，并定容到1000ml。
本发明提供了一种由磁性样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板组成的检测试纸，且在硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与所述烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体；在磁性样品垫加入待测样品后，基于测流免疫层析原理，样品中的烟草花叶病毒与烟草花叶病毒标记抗体结合后层析到检测区处喷涂的烟草花叶病毒包被抗体，在检测区处形成烟草花叶病毒包被抗体-抗原-烟草花叶病毒标记抗体免疫复合物；同时，多余的烟草花叶病毒标记抗体则在质控区处与抗抗体结合形成烟草花叶病毒标记抗体-抗抗体免疫复合物；使用超顺磁共振检测仪MAR测定检测区的磁场强度，通过与设定的临界值比对而确定其阳性或阴性结果；质控区的测定结果则作为该测定方法的质控内标。本发明提供的试纸实现了对烟草花叶病毒的客观化测定，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点。
附图说明
图1为本发明中检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的结构示意图。
图中：1为磁性样品垫、2为硝酸纤维素膜、3为吸水垫、4为检测区、5为质控区、6为背板。
具体实施方式
下面对本发明作进一步详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，即属于现有技术。
实际检测过程中，所述超顺磁性复合粒子要由磁性样品垫泳动至硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，在检测区发生烟草花叶病毒包被抗体-抗原-烟草花叶病毒标记抗体的反应，在质控区发生烟草花叶病毒标记抗体-抗抗体的反应；若超顺磁性复合粒子的粒径太大（>300nm），则在试纸上的涌动时间长，测试慢；同时，在偶联时较容易发生聚集，并容易产生非特异反应；而粒径太小则磁强度往往不够。因此在选择标记材料时，优选粒径为80-200nm的超顺磁性复合粒子。
超顺磁性复合粒子的饱和磁强度及其外磁场响应速度直接决定了检测灵敏度和检测精确性，传统方法制备的超顺磁性复合粒子的饱和磁强度通常都<30 emu/g，外磁场响应速度则在100～200秒。为提高检测灵敏度及检测准确性，优选磁饱和强度为35～70 emu/g ，对应的外磁场响应速度为20～50秒的超顺磁性复合粒子。
为将超顺磁性复合粒子用于烟草花叶病毒检测，超顺磁性复合粒子表面需带有易于与烟草花叶病毒抗体偶联的基团，这些基团可以是羧基、氨基等基团，优选的基团是带羧基的表面官能团，通常采用化学方法连接抗体，即用EDC和NHS活化超顺磁性复合粒子后，再与抗体发生羧合反应而完成偶联反应。超顺磁性复合粒子表面的羧基含量不同会影响到检测的灵敏度，为提高灵敏度，优选羧基含量为50～300 μmol/g 的活化后磁性粒子。
本发明采用的超顺磁性复合粒子购自深圳市泰勒斯科技有限公司，产品目录号为MP-2，该公司所采用的制备方法是将用化学法制得的油溶性Fe3O4溶解在有机试剂中得到溶液A，将双亲性齐聚物溶于3次蒸馏水中并调节pH为8～10得溶液B，常温下将溶液B注入溶液A中得到混合液，对混合液进行充分搅拌使有机溶剂挥发，然后进行离心分离，将离心分离的产物干燥后即可得水溶性的超顺磁性复合粒子。用上述方法制备获得的超顺磁性复合粒子饱和磁强度高、磁响应快、磁珠尺寸均匀、单分散性好、稳定性强、涌动时间快，可很好地满足LFIAs的检测要求；具体来说采用上述方法制备获得的超顺磁性Fe3O4纳米粒子的粒径为100nm、磁饱和强度为40 emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒、表面羧基含量为80 μmol/g，非常适宜用于烟草花叶病毒的免疫检测。
当然，在免疫检测中抗体的性能指标对于检测的准确性至关重要，通常而言， 特异性强、亲和力高的抗体，可以显著地提高检测的准确性；为提高灵敏度，优选亲和常数为108 M-1 的烟草花叶病毒抗体。
实施例1
检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的制备。
A、制备烟草花叶病毒标记抗体：
1）将2.5mg超顺磁性复合粒子用0.1M MES缓冲液（pH=4.7）洗涤并用0.4T的磁架分离富集后，用1ml MES缓冲液重悬，然后加入0.96mg的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）和1.15mg的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到活化后磁性粒子； 
2） 将步骤1中得到的活化后磁性粒子、0.15mg烟草花叶病毒抗体和0.8ml浓度为50mM，pH为8.5的硼砂缓冲液混匀，在37oC温度条件下反应3.5h，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；
3）将步骤2中得到的反应液中加入浓度为5%的BSA混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；
4）将步骤3中得到的反应液中的封闭后磁性粒子用0.02M PBS缓冲液（pH=7.4）进行洗涤、悬浮，得到烟草花叶病毒标记抗体，4 oC保存待用；
B、制备设置有检测区和质控区的硝酸纤维素膜：
将所述烟草花叶病毒包被抗体的浓度配制为2mg /ml；采用0.02M PB（pH=7.4）的缓冲液将羊抗鼠IgG抗体（长沙博优生物科技有限公司，ABGAM-0500）的浓度配制为1 mg /ml，采用BioDot的XYZ3050喷膜系统中的BioJet喷头将上述配置好的烟草花叶病毒包被抗体和羊抗鼠IgG抗体分别喷在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成检测区和质控区，得到含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜，将上述硝酸纤维素膜放置于相对湿度为10%以下的干燥车间抽湿4小时后放入干燥室中干燥备用；
C、制备含有烟草花叶病毒标记抗体的磁性样品垫：
将步骤A中制得的烟草花叶病毒标记抗体用含0.2% TritonX100、1% BSA、5%蔗糖的0.02M PBS（pH=7.4）的缓冲液稀释50倍,得到烟草花叶病毒标记抗体溶液；将玻璃纤维膜在温度为37℃的含0.2% TritonX100、1% BSA、5%蔗糖的0.02M PBS（pH=7.4）的缓冲液中浸泡1小时；采用BioDot的XYZ3050喷膜系统中的AirJet喷头将上述烟草花叶病毒标记抗体溶液喷涂在上述玻璃纤维膜上，得到磁性样品垫，将上述磁性样品垫放置于相对湿度为10%以下的干燥车间抽湿4小时后放入干燥室中干燥备用；
D、在10万级洁净和干燥的车间中将上述干燥好的磁性样品垫、硝酸纤维素膜，以及吸水垫从上到下依次固定在背板上进行搭配组装后，采用BioDot的CM4000裁切系统将贴好的纸板裁切，得到检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，4℃贮存备用。
实施例2
测试上述制备好的用于检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的灵敏度。
量取烟草花叶病毒提纯样品，选用0.02M的PBS（pH=7.4）缓冲液进行稀释，配制浓度为0ng/ml、0.1ng/ml、0.5 ng/ml、1ng/ml、5 ng/ml、10ng/ml、50 ng/ml、100ng/ml、500 ng/ml、1000ng/ml的烟草花叶病毒标准溶液，使用实施例1得到的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸进行检测；并采用超顺磁共振检测仪MAR（Magna BioSciences ，8094-101-01 & 8094-101-02）读取检测结果；将上述检测结果与临界值进行比较即可得出检测区所检测样本的阳性或是阴性结果。上述的临界值为大量测定不同烟叶样品提取液的正常样本所确定出的各不同正常样本的测定均值。
检测步骤：先将待检测样品的温度恢复至室温（25℃），用精确移液器取待检测样品50μl垂直缓慢滴入磁性试纸条的加样端，然后滴入100ul 0.02M（pH=7.4）的PBS冲洗液，20分钟后用超顺磁共振检测仪MAR读取检测结果，超顺磁共振检测仪MAR设置的临界值（CUT-OFF）为28，即大于三倍0值检测浓度对应的测试值（CUT-OFF>8.9×3），其检测结果如表1所示。
表1  不同浓度的烟草花叶病毒样品磁性试纸检测值
Figure 2014101190003100002DEST_PATH_IMAGE002
从检测结果中可以得出实施例1得到的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的灵敏度为0.1ng/ml。
实施例3
使用实施例1制备好的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸进行田间样品的检测。
①样品提取: 取待测烟叶0.1g（约1cm2），放入样品提取袋(该提取袋为中间夹层带网格的塑料袋,该塑料袋中密封装有4ml 0.02M硼酸（pH=8.5）缓冲液)中，并标注样本号；用笔杆或其它平滑的硬物磨擦样品提取袋，确保完全把烟叶磨碎，来回晃动样品袋，使烟叶提取液混匀。
②检测方法：精确移液器取待检测样品50μl垂直缓慢滴入磁性试纸条的加样端，然后滴入100ul 0.02M（pH=7.4）的PBS冲洗液，20分钟后用超顺磁共振检测仪MAR读取检测结果。
③结果判定：超顺磁共振检测仪MAR检测值设定临界值（CUT-OFF）为28，当检测区值小于28，说明样本没有感染烟草花叶病毒；当检测区值大于等于28，说明样本感染烟草花叶病毒；质控区值小于100为无效结果，说明检测无效，应重新测试。
由云南省烟草科学研究所提供的新鲜烟叶样本，以及从云南省各地州采集到的疑似感染病毒的新鲜烟叶样本共计842份，选用美国Agdia公司的TMV胶体金试剂盒作为对照，对本发明提供的磁性免疫层析试纸进行特异性、敏感性及准确性检测，检测结果如表2所示。
表2  842份烟叶样本的检测结果
从检测结果中可以得出本发明提供的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的特异性达100%，即105/（105+0）*100%=100%；敏感性达100%，即737/（737+0）*100%=100%；准确性达100%，即（737+105）/（737+105）*100%=100%。
综上所述，本发明提供的试纸实现了对烟草花叶病毒的客观化测定，具有灵敏度高、特异性强、敏感性强、准确性好、快速、简便等优点；具有很好的推广应用价值。

Claims (10)

1.一种检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，该试纸包括含有烟草花叶病毒标记抗体的磁性样品垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和背板，所述磁性样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置有相互分离的检测区和质控区，所述检测区含有烟草花叶病毒包被抗体，所述质控区含有能与所述烟草花叶病毒标记抗体特异结合的抗抗体。
2.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒抗体和超顺磁性复合粒子以肽键共价结合形成的聚合体。
3.根据权利要求2所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述超顺磁性复合粒子为粒径为100nm、磁饱和强度为40 emu/g，对应的外磁场响应速度为20秒、表面羧基含量为80 μmol/g的超顺磁性Fe3O4纳米粒子。
4.根据权利要求2所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒抗体的亲和常数为108 M-1。
5.根据权利要求1、2、3、4任一权利要求所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒标记抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒包被抗体为烟草花叶病毒单克隆抗体；所述抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。
7.根据权利要求6所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述烟草花叶病毒包被抗体的浓度为2 mg /ml，所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为1 mg /ml。
8.根据权利要求1所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，其特征在于，所述磁性样品垫采用玻璃纤维膜制作。
9.一种制备如权利要求1、2、3、4、6、7、8中任一权利要求所述的检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备烟草花叶病毒标记抗体：
1）将2.5mg超顺磁性复合粒子、0.96mg的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、1.15mg的N-羟基丁二酰亚胺（NHS）和1ml 0.1M MES缓冲液（pH=4.7）混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到活化后磁性粒子； 
2） 将步骤1中得到的活化后磁性粒子、0.15mg烟草花叶病毒抗体和0.8ml浓度为50mM，pH为8.5的硼砂缓冲液混匀，在37oC温度条件下反应3.5h，得到含有偶联后磁性粒子的反应液；
3）将步骤2中得到的反应液中加入浓度为5%的BSA混匀，在37 oC温度条件下反应0.5h，得到含有封闭后磁性粒子的反应液；
4）将步骤3中得到的反应液中的封闭后磁性粒子用0.02M PBS缓冲液（pH=7.4）进行洗涤、悬浮，得到烟草花叶病毒标记抗体，4 oC保存待用；
B、制备设置有检测区和质控区的硝酸纤维素膜：
将所述烟草花叶病毒包被抗体和抗抗体分别喷涂在硝酸纤维素膜的两端不同区域，形成检测区和质控区，得到含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜，然后放入干燥室中干燥；
C、制备含有烟草花叶病毒标记抗体的磁性样品垫：
将步骤A中制得的烟草花叶病毒标记抗体用缓冲液稀释50倍,得到烟草花叶病毒标记抗体溶液；将玻璃纤维膜在温度为37℃的缓冲液中浸泡1小时；用上述烟草花叶病毒标记抗体溶液喷涂上述玻璃纤维膜，得到磁性样品垫，然后放入干燥室中干燥；
D、将所述磁性样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫从上到下依次固定在背板上，裁切得到检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸，然后将试纸与干燥剂一起放入铝箔袋密封包装，4℃贮存。
10.根据权利要求9所述的制备检测烟草花叶病毒的磁性免疫层析试纸的方法，其特征在于，所述步骤C中使用的缓冲液由2ml TritonX100、10g BSA、50g蔗糖和950ml浓度为0.02M、pH为7.4的PBS缓冲液混合得到，调节pH至7.4，并定容到1000ml。
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