BRPI0507433B1 - Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, composição, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, e, kit - Google Patents

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Abstract

anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno, polipeptídeo isolado, composição, ácido nucleido isolado, vetor de expressão célula hospedeira, kit, e, métodos para tratar doença de c. difficile em indivíduo e para tratar uma doença ou distúrbio associado a c. difficile em mamífero anticorpos que especificamente se ligam a toxinas de c. difficele, suas partes de ligação em antígeno e métodos de produzir e utilizar os anticorpos e suas partes de ligação em antígeno são aqui fornecidos.

Description

(54) Título: ANTICORPO MONOCLONAL RECOMBINANTE OU SUA PARTE DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, COMPOSIÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, KIT (73) Titular: UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS, Entidade Norte-Americana. Endereço: One Beacon Street, 26Th Floor, Boston, Massachusetts 02108, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US); MEDAREX, L.L.C., Companhia Norte Americana. Endereço: ROUTE 2 0 6 ANO PROVINCE LINE ROAD, PRINCETON, NEW JERSEY, 08540, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: DONNA AMBROSIO; GREGORY J. BABCOCK; THERESA BROERING; ROBERT GRAZIANO; HECTOR JAVIER HERNANDEZ; ISRAEL LOWY; ROBERT MANDELL; DEBORAH MOLRINE; WILLIAM D. THOMAS JR.; HUI-FEN ZHANG
Código de Controle: F284AFC4D3F652EB 8D20906194F3C9BC
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 20/03/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 20/03/2018
Assinado digitalmente por:
Júlio César Castelo Branco Reis Moreira
Diretor de Patente “ANTICORPO MONOCLONAL RECOMBINANTE OU SUA PARTE DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO, COMPOSIÇÃO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, KIT”.
Informações Relacionadas
O pedido reivindica prioridade para o pedido de patente número 60/542.357, depositado em 6 de fevereiro de 2004 e pedido de patente provisória número 60/613.854, depositado em 28 de setembro de 2004, cujo inteiro conteúdo de ambos é por este meio incorporado aqui por referência.
O conteúdo de quaisquer patentes, pedidos de patente e referências citadas por toda esta especificação é por este meio incorporado por referência em sua totalidade.
Fundamentos da Invenção
Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria grampositiva, que causa doença gastrintestinais em humanos. C. difficile é a causa mais comum de diarréia infecciosa em pacientes hospitalizados e é uma das mais comuns infecções nosocômicas em toda parte (Kelly et al., New Eng. J. Med., 330:257-62, 1994). De fato, a doença associada com este patógeno pode afligir tantos quantos três milhões de pacientes hospitalizados por ano nos Estados Unidos (McFarland et al., New Eng. J. Med., 320:204-10, 1989; Johnson et al., Lancet, 336:97-100, 1990).
O tratamento com antibióticos, tais como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas e clindamicina, que rompem a flora intestinal normal, pode permitir a colonização do intestino com C. difficile e resultar em doença C. dfficile (Kelly e Lamont, Annu. Ver. Med., 49:375-90, 1998). O início da doença C. dfficile tipicamente ocorre quatro a nove dias após começar o tratamento com antibiótico, mas pode também ocorrer após a descontinuação da terapia antibiótica. C. difficile pode produzir sintomas variando de diarréia e colite suave a severa, incluindo colite pseudomembranosa (PMC), uma forma severa de colite caracterizada por dor abdominal, diarréia aquosa e doença sistêmica (por exemplo, febre, náusea). A recaída da doença pode ocorrer em até 20 % dos pacientes tratados por um primeiro episódio da doença e aqueles que têm recaída estão em um risco maior de recaídas adicionais (Kelly e Lamont, Annu. Ver. Med., 49:375-90, 1998).
A doença C. difficile acredita-se ser causada pela ação de duas exotoxinas, toxina A e toxina B, no epitélio do intestino. Ambas as toxinas são proteínas de elevado peso molecular (280 - 300 kDa), que catalisam a modificação covalente das proteínas Rho, pequenas proteínas de ligaçàoGTPb envolvidas na polimerização da actina, nas células hospedeiras. A modificação das proteínas Rho pelas toxinas inativa-as, resultando na despolimerização dos filamentos de actina e morte celular. Ambas toxinas são letais para camundongos, quando injetadas parenteralmente (Kelly e Lamont, Annu. Ver. Med., 49:375-90, 1998).
A doença C. difficile pode ser diagnosticada por ensaios que detectam a presença ou atividade da toxina A ou toxina B em amostras de fezes, por exemplo, imunoensaios enzimáticos. Os ensaios de citotoxina podem ser usados para detectar a atividade da toxina. Para realizar o ensaio da citotoxina, as fezes são filtradas para remover as bactérias e os efeitos citopáticos das toxinas nas células cultivadas são determinados (Merz et al., J. Clin. Microbiol., 32:1142-47,1994).
O tratamento de C. difficile é complicado pelo fato de que os antibióticos disparam a doença associada com C. difficile. Contudo, os antibióticos são a opção de tratamento primária atualmente. Os antibióticos menos prováveis causarem doença associada com C. difficile, tais como vancomicina e metronidazol, são usados frequentemente. A resistência a vancomicina, desenvolvendo-se em outros microorganismos, é a causa de preocupação no uso deste antibiótico para tratamento, visto que é o único tratamento eficaz para infecção com outros microorganismos (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250: 127 - 39, 2000). Abordagens probióticas, em que são administrados em um indivíduo microorganismos não patogênicos, que presumivelmente competem por nichos com as bactérias patogênicas, são também usadas. Por exemplo, o tratamento com uma combinação de vancomicina e Sac charomyces boulardii tem sido informado (McFarland et al., A4ÀL4., 271(24: 1913-8, 1994. Errata em: JAMA, 272: 518,1994).
As vacinas têm sido desenvolvidas vacinas que protegem animais da provocação letal em modelos infecciosos da doença (Torres et al., Infect. Immun . 63(12): 4619 - 27, 1995). Além disso, os anticorpos policlonais têm mostrado proteger hamsters da doença, quando administrados por injeção ou alimentação (Giannasca et al., Infect. Immun. 67(2): 527 - 38, 1999; Kink e Williams, Infect. Immun., 66(5}: 2018 - 25, 1998). Têm sido isolados anticorpos monoclonais de murino que se ligam às toxinas de C. difficile e neutralizam suas atividades in vivo e in vitro (Corthier et al., Infect. Immun. 59 (3): 1192 - 5 , 1991). Há alguns relatos de que os anticorpos monoclonais humanos, contendo anticorpos neutralizadores da toxina, podem evitar a recaída por C. difficile (Salcedo et al., Gut., 41(3): 366 - 70, 1997). A resposta do anticorpo contra a toxina A tem sido correlacionada com o resultado da doença, indicando a eficácia das respostas humorais no controle da infecção. Indivíduos com respostas ELISA a toxina robusta A tiveram doença menos severa, em comparação com indivíduos com baixos níveis de anticorpo de toxina A (Kyne et al., Lancet, 357(9252): 189 - 93, 2001).
O papel individual da toxina A e toxina B na patogênese da doença e o papel dos anticorpos anti-toxina na proteção da doença C. difficile são controvertidos e podem depender do hospedeiro. Em humanos, a resposta anticorpo da anti-toxina A tem sido correlacionada com o resultado da doença, sugerindo uma necessidade de resposta anti-toxina A para proteção. Esta observação contraria os relatos de organismos C. difficile causando a doença, que expressam somente a toxina B, implicando que a toxina B pode contribuir para a doença em humanos. Estas cepas negativas de toxina A podem também provocar doença em hamsters (Sambol et al., J. Infect. Dis., 183(12): 1760-6, 2001).
Sumário da Invenção
Esta invenção é baseada, em parte, na descoberta de que a administração de anticorpos contra a toxina A de C. difficile em um indivíduo pode proteger o indivíduo de recaída de doença mediada por C. difficile in vivo. A administração de anticorpos a uma ou ambas das toxina A e toxina B pode evitar doença mediada por C. difficile primária. Os anticorpos de alta afinidade contra toxinas C. difficile podem ser produzidos, por exemplo, em camundongos, tais como camundongos transgênicos expressando segmentos genéticos da imunoglobulina humana. Estes anticorpos podem neutralizar a citotoxicidade da toxina in vitro e neutralizar a enterotoxicidade da toxina in vivo. Os anticorpos que reconhecem a toxina A e/ou toxina B podem inibir e proteger da doença in vivo.
Em um aspecto, a invenção caracteriza anticorpos monoclonais humanos isolados ou suas partes de ligação de antígeno, que especificamente ligam-se a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile). Em certas formas de realização, os anticorpos ou partes de ligação de antígeno deles especificamente ligam-se à toxina A de C. difficile (toxina A). Em outras formas de realização, o anticorpo ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se à toxina B (toxina B) de C. difficile. Em outras formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a tanto toxina A como toxina B.
Em certas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno neutralizam a toxina A in vitro, inibem a ligação da toxina A em células mamíferas e/ou inibem a doença mediada por C. difficile in vivo.
Em várias formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno têm uma ou mais das seguintes características: quando administrados a um camundongo, eles protegem o camundongo contra administração de uma toxina C. difficile em uma quantidade que seria fatal para um camundongo de controle não receberam o anticorpo; protegem ou inibem de colite mediada por C. difficile, colite associada com antibiótico ou colite pseudomembranosa (PMC) em um indivíduo; protegem da ou inibem diarréia em um indivíduo; e/ou inibem a recorrência de doença mediada por C. difficile.
Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem especificamente ligarem-se a um epítopo dentro da metade da toxina A de terminal-N, por exemplo, um epítopo entre aminoácidos 1-1256 da toxina A. Em outras formas de realização, os anticorpos ou partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a um epítopo dentro do domínio de ligação do receptor de terminal-C da toxina A, por exemplo, um epítopo entre os aminoácidos 1852 - 2710 da toxina A ou um epítopo entre os aminoácidos 659 - 1852, por exemplo, um epítopo dentro dos resíduos aminoácidos 900 1852, 900 - 1200 ou 920 - 1033 da toxina A. Em outras formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 1 - 600, 400 - 600 ou 415 - 540 da toxina A. Outros anticorpos particulares ou suas partes de ligação em antígeno podem especificamente ligarem-se a um epítopo dentro dos resíduos aminoácidos 1 - 100, 100 - 200, 200 - 300, 300 - 400, 400 - 500, 500 - 600, 600 - 700, 700 - 800, 900 - 1000, 1100 - 1200, 1200 - 1300, 1300 - 1400, 1400 - 1500, 1500 - 1600, 1600 - 1700, 1800 - 1900, 1900 - 2000, 2100 2200 ou 2200 - 2300, 2300 - 2400, 2400 - 2500, 2500 - 2600, 2600 - 2710 da toxina A ou qualquer intervalo, parte ou faixa deles.
Em certas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno ligam-se especificamente à toxina A com um KD menor do que cerca de 20 x 10'ΰ M. Em uma forma de realização particular, o ‘5 anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente liga-se à toxina com um KD menor do que cerca de 10 x 10'7 M, menor do que cerca de 10 x 108 M, menor do que cerca de 10 x 10'9 M ou menor do que cerca de 10 x 10’ 10 M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno liga-se especificamente à toxina A com um KD menor do que cerca de 50 x 10'10 M, menor do que cerca de 20 x 10'10, menor do que cerca de 15 x 10'1θΜ, menor do que cerca de 8 x 10'i0 ou menor do que cerca de 5 x 10’1θΜ.
Em várias outras formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem uma região de cadeia pesada variável, incluindo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NO: 1), 1B11 (SEQ. ID NO: 2) ou 3H2 (SEQ. ID NO: 3).
Em certas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem uma região de cadeia leve variável, compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido da região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ, ID NO: 4), 1BI1 (SEQ. ID NO: 5) ou 3H2 (SEQ. ID NO: 6).
Em certas formas de realização, cada um dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui tanto uma região de cadeia pesada variável, incluindo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%,
90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido de região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NO: 1), 1B11 (SEQ. ID NO: 2) ou 3H2 (SEQ. ID NO: 3) e uma região de cadeia leve variável, incluindo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve variável do clone 3D8 (SEQ. ID NO: 4), 1ΒΠ (SEQ. ID NO: 5) ou 3H2 (SEQ. ID NO: 6).
Em várias formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a um epítopo que se sobrepõem com um epítopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11 ou 3H2 e/ou competem pela ligação à toxina A com um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11 ou 3H2.
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 7 - 9), 1B11 (SEQ. ID NOS: 10 - 12) ou 3H2 (SEQ. ID NOS: 13 -15) (também mostrado na Tabela 1).
Uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir uma ou mais DDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. IDNOS: 16-18), 1B11 (SEQ. IDNOS: 19-21)ou3H2 ((SEQ. IDNOS: 22 -24) (também mostrado na Tabela 2).
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 7-9), 1B11 ((SEQ. ID NOS: 10 - 12), ou 3H2 (SEQ. ID NOS: 13-15) e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 16-18), 1B11 (SEQ. ID NOS: 19-21) ou 3H2 (SEQ. IDNOS: 22 - 24).
'5 Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 7-9), 1B11 (SEQ. IDNOS: 10- 12)ou3H2 (SEQ. IDNOS: 13-15).
Em algumas formas de realização, uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 16 - 18), 1B11 (SEQ. ID NOS: 19 - 21) ou 3H2 (SEQ. IDNOS: 22-24).
Em algumas formas de realização, uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 16 - 18), 1B11 (SEQ. ID NOS: 19 - 21) ou 3H2 (SEQ. ID NOS: 22 - 24) e uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. IDNOS: 7-9), 1B11 (SEQ. IDNOS: 10- 12) ou 3H2 (SEQ. IDNOS:
- 15). A região de cadeia leve variável pode incluir três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ.
IDNOS: 16-18), 1B11 (SEQ. ID NOS: 19-21) ou 3H2 (SEQ. IDNOS: 22
-24).
Em certas formas de realização, uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável '5 do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 7-9), 1B11 (SEQ. ID NOS: 10 - 12) ou 3H2 (SEQ. ID NOS: 13 - 15) e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NOS: 16 - 18), 1B11 (SEQ. ID
NOS: 19 - 21) ou 3H2 (SEQ. ID NOS: 22 - 24), por exemplo, uma região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno são idênticas a uma região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ. ID NO: 1, SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ. ID NO: 2, SEQ. ID NO:
5) ou 3H2 (SEQ. ID NO: 3, SEQ ID NO: 6).
Em algumas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno neutralizam a toxina B in vitro, inibem a ligação da toxina B em células mamíferas e/ou neutralizam a toxina B in vivo.
Em algumas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a um epítopo de uma parte de terminal-C da toxina B (por exemplo, entre os aminoácidos 1777 - 2366 da toxina B). Outros anticorpos particulares ou suas partes de ligação em antígeno podem especificamente ligarem-se a um epítopo dentro dos resíduos aminoácidos 1 - 100, 100 - 200, 200 - 300, 300 - 400, 400 - 500, 500 - 600,
600 - 700, 700 - 800, 900 - 1000, 1100 - 1200, 1200 - 1300, 1300 - 1400,
1400 - 1500, 1500 - 1600, 1600 - 1700, 1800 - 1900, 1900 - 2000, 2100 2200 ou 2200 ou 1366 da toxina B ou qualquer seu intervalo, parte ou faixa.
Em certas formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se à toxina B com uma KD menor do que cera de 20 x 10'6 M. Em uma forma de realização particular, o anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno, especificamente liga-se à toxina B com uma KD menor do que cerca de 10 x IO'7 M, menor do que cerca de 109 x 10'8, menor do que cerca de 10 x 10'9 M ou menor do que cerca de 10 x 10'l° M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno, especificamente liga-se à toxina B co uma KD menor do que cerca de 50 x IO'10 M, menor do que cerca de 20 x 10'10 M, menor do que cerca de 15 x 10'10 M, menor do que cerca de 8 x 10'l° ou menor do que cerca de 5 x 10‘10 M.
Em várias outras formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno incluem uma região de cadeia pesada variável incluindo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica à seqüência de aminoácido de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ. ID NO: 54), 2Al 1 ou IG10.
Em certas formas de realização, os anticorpos ou suas parte de ligação ao antígeno incluem uma região de cadeia leve variável compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124— 152 (isto é, a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 58), 2A11 ou IG10.
Em certas formas de realização, cada um dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui tanto uma região de cadeia pesada variável, incluindo uma seqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 (isto é, a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 54), 2A11 ou IG10, e uma região de cadeia leve variável incluindo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou mais idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 (isto é, a seqüência de aminoácido mostrada na SEQ IDNO: 58), 2A11 ouIGlO.
Em várias formas de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno especificamente ligam-se a um epítopo que se sobrepõe com um epítopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 124 -152, 2A11 ou IG10 e/ou competem por ligação à toxina B com um anticorpo produzido pelo clone 124 - 152, 2A11 ou IG10.
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%; 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124 152 (SEQ ID NOS: 62, 64 ou 66), 2A11 ou IG10 (Tabela 3).
Uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124- 152 (SEQ. ID NOS: 68, 70 ou 72), 2A11 ou IG10 (Tabela 4).
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 (SEQ. ID NOS: 62,64 ou 66), 2A11 ou IG10 e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124 -152 (SEQ. ID NOS: 68, 70 ou 72),2A11 ouIGlO
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124- 152 (SEQ. ID NOS: 62, 64 ou 66), 2A11 ou IG10.
Em certas formas de realização, a região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 (SEQ. ID NOS: 68, 70 ou 72), 2A11 ou IG10.
Em outras formas de realização, a região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124- 152 (SEQ. ID NOS: 68, 70 ou 72), 2A11 ou IG10, e uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124 -152 (SEQ. ID NOS: 62, 64 ou 66), 2A11 ou IG10. A região de cadeia leve variável pode incluir três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124- 152 (SEQ. IDNOS: 68, 70 ou 72), 2A11 ou IG10.
Em ainda outras formas de realização, a região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 SEQ. ID NOS: 62, 64 ou 66), 2A11 ou IG10 e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui três CDRs que são idênticas a uma
CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 124 -152 (SEQ. ID NOS: 68, 70 ou 72), 2A11 ou IG10, por exemplo, uma região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno são idênticas a uma região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124 - 152 SEQ. ID NOS: 62,64 ou 66), 2A11 ou IG10.
Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem ser anticorpos de comprimento total, podem incluir um domínio de efetor, por exemplo, um domínio Fc, podem ser anticorpos de isotipo gamma de imunoglobulina, anticorpos de cadeia simples ou fragmentos Fab. Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem ainda incluir um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou uma marcação.
Em várias formas de realização, as composições incluindo os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno são livres de outros polipeptídeos humanos (por exemplo, contêm menos do que 5% de polipeptídeos humanos exceto anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno).
Em ainda outro aspecto, a invenção caracteriza composições incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente liga-se a uma exotoxina de C. difficile; e (b) um anticorpo policlonal ou sua parte de ligação ao antígeno que especificamente liga-se a uma exotoxina de C. difficile.
Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno liga-se especificamente à toxina A de C. difficile e o anticorpo policlonal ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente liga-se à toxina B de C. difficile. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente liga-se à toxina B de C. difficile e o anticorpo policlonal ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente liga-se à toxina
A de C. difficile. Os anticorpos podem incluir outras características aqui descritas.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza anticorpos monoclonais humanos ou suas partes de ligação em antígeno, que especificamente ligam-se a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada, que é o produto de um derivado de um gene VH 3-33 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de um derivado de um gene Vk humano, selecionado do grupo consistindo de Vk
L19, Vk L6 e Vk L15. Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir outras características aqui descritas.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza anticorpos monoclonais humanos ou suas partes de ligação em antígeno, que especificamente se ligam a uma exotoxina de Clostridium difficile (C.
difficile), em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que é o produto de um derivado de um gene VH 5-51 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene Vk A27 humano. Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem também incluir outras características descritas aqui.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza polipeptídeos que incluem uma parte de ligação ao antígeno de um anticorpo produzido pelo clone de hibridoma 3D8, 1B11 ou 3H2 (também referido aqui como “3D8”, 1B11 ou 3H2 (também referido aqui como “3D8”, “1B11 e “3H2”).
Em outro aspecto, a invenção caracteriza polipeptídeos isolados, que incluem uma parte de ligação de antígeno de um anticorpo produzido por clone de hibridoma 214-152, 2A11 ou IG10 (também referido aqui como “124-152!, “2A11” e “IG10”.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza anticorpos monoclonais isolados ou suas partes de ligação em antígeno, que especificamente ligam-se a uma exotoxina de C. difficile, neutralizam a toxina, inibem e/ou protegem de doença mediada por C. difficile. Em uma forma de realização, os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno são anticorpos de mamíferos (por exemplo, humanos) ou suas partes de ligação em antígeno. Os anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno podem incluir outras características aqui descritas.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza composições incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente liga-se à toxina A de C. difficile', e (b) um anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga à toxina B de C. difficile.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza ácidos nucléicos isolados, incluindo uma seqüência codificando polipeptídeos pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idênticos às SEQ. ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; por exemplo, em que a seqüência de ácido nucléico é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS: 38, 39, 40, 35, 36 ou 37. A invenção também caracteriza vetores de expressão incluindo um ácido nucléico codificando um polipeptídeos pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idênticos às SEQ. ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ou 6; por exemplo, em que a seqüência de ácido nucléico é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS: 38, 39, 40, 35, 36 ou 37, bem como células hospedeiras, por exemplo, células bacterianas, por exemplo, células de E. coli, incluindo um ácido nucléico codificando polipeptídeos pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idênticos às SEQ. ID NOS: 1,2, 3, 4, 5 ou 6; por exemplo, em que a seqüência de ácido nucléico é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS: 38, 39, 40, 35, 36, ou 37.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza ácidos nucléicos isolados, incluindo uma seqüência codificando um polipeptídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntico às SEQ. ID NOS:
54, 56, 58 ou 60, por exemplo, em que a seqüência de ácido nucleico é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS:
55, 57, 59 ou 61. A invenção também caracteriza vetores de expressão incluindo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntico às SEQ. ID NOS: 54, 56, 58 ou
60, por exemplo, em que a seqüência de ácido nucleico é pelo menos de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS: 55, 57, 59 ou
61. A invenção também provê células hospedeiras, por exemplo, células bacterianas, por exemplo, células de E. coli, que incluem um ácido nucleico codificando um polipeptídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntico às SEQ. ID NOS: 54, 56, 58 ou 60, por exemplo, em que a seqüência de ácido nucleico é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou mais idêntica às SEQ. ID NOS: 55, 57, 59 ou 61.
As células hospedeiras podem também ser células eucarióticas, por exemplo, células de levedura, células de mamífero, por exemplo, ovário de hamster chinês (CHO), células NS0 ou células de mieloma.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza kits incluindo um anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno que especificamente liga-se a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile), por exemplo, um anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno aqui descrito. O kit podem incluir instruções para uso em prevenir ou tratar doença mediada por C. difficile.
O kit pode ainda incluir um anticorpo policlonal ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga a uma exotoxina de C. difficile. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente se liga à toxina A de C. difficile. Em uma forma de realização, o anticorpo policlonal ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente se liga à toxina B de C. difficile.
Em outro aspecto, a invenção caracteriza kits incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado, que especificamente se liga à toxina A de C. difficile; e (b) um anticorpo monoclonal humano isolado, que especificamente se liga à toxina B de C. difficile.
A invenção também caracteriza métodos de tratar doença de C. difficile em um indivíduo, pela administração ao indivíduo de um anticorpo monoclonal humano isolado ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) em uma quantidade eficaz para inibir doença de C. difficile, por exemplo, colite mediada por C. difficile, colite associada com antibiótico, colite pseudomembranosa (PMC) mediada por C. difficile. O anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno pode ser administrada intravenosa, intramuscular ou subcutaneamente ao indivíduo.
O anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno pode ser administrado sozinho ou em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um segundo anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno. Em um exemplo, o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente se liga à toxina A de C. difficile e o segundo anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente ligase à toxina B de C. difficile. Em outro exemplo, o segundo agente é um antibiótico, por exemplo, vancomicina ou metronidazol. O segundo agente pode ser gamma-globulina policlonal (por exemplo, gamma-globulina humana).
Em uma forma de realização particular, um anticorpo ou uma sua parte de ligação ao antígeno é administrado, que inclui uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável idênticas às região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (Isto é, incluindo uma seqüência de região de cadeia leve variável idêntica à SEQ ID NO: 4 e uma seqüência de região de cadeia pesada variável idêntica à SEQ ID NO: 1.
Em outra forma de realização, este anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno é administrado em combinação com um anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno, que inclui uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável idênticas às região de cadeia leve variável e região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, incluindo uma seqüência de região de cadeia leve variável idêntica à SEQ ID NO: 58 e uma seqüência de região de cadeia pesada variável idêntica à SEQ ID NO: 54).
Em ainda outra forma de realização, um anticorpo ou parte de ligação ao antígeno produzido pelo clone 3D8 (isto é, incluindo uma seqüência de região de cadeia leve variável idêntica à SEQ ID NO: 4 e uma seqüência de região de cadeia pesada variável idêntica à SEQ ID NO:1), é administrado em combinação com um anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno produzido pelo clone 124-152 (isto é, incluindo uma seqüência de região de cadeia leve variável idêntica à SEQ ID NO: 58 e uma seqüência de região de cadeia pesada variável idêntica à SEQ ID NO: 54),
Em outro aspecto, a invenção caracteriza métodos para produzir um anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga a uma exotoxina de C. difficile, imunizando um animal não-humano transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana, com uma composição que inclui uma exotoxina inativada, e isolando um anticorpo do animal. A exotoxina pode ser inativada, por exemplo, por tratamento com UDP-dialdeído ou por mutação (por exemplo, empregando-se métodos recombinantes). O método pode ainda incluir avaliar ligação do anticorpo à exotoxina.
A invenção também caracteriza métodos para produzir um anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno, provendo um ácido nucléico codificando um anticorpo monoclonal humano ou sua parte de ligação ao antígeno, que especificamente se liga a uma exotocina de C. difficile e expressando o ácido nucléico em uma célula hospedeira.
Em ainda outro aspecto, a invenção caracteriza um hibridoma *
ou transfectoma, incluindo um ácido nucléico codificando partes de ligação de antígeno (por exemplo, CDRs ou regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11 ou 3H2.
Em ainda outro aspecto, a invenção caracteriza um hibridoma ou transfectoma incluindo um ácido nucléico codificando partes de ligação de antígeno (por exemplo, CDRs o regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 124-152, 2A11 ou IG10.
Além disso, a invenção caracteriza um método para produzir um hibridoma que expressa um anticorpo que especificamente se liga a uma exotocina de C. difficile, imunizando um animal não-humano transgênico, tendo um genoma que inclui um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve humana, com uma composição que inclui a exotoxina, em que a toxina é inativada; isolando esplenócitos do animal; gerando hibridomas dos esplenócitos; e selecionando um hibridoma que produz um anticorpo que especificamente se liga à exotoxina.
O tratamento de humanos com anticorpos monoclonais humanos oferece diversas vantagens. Por exemplo, os anticorpos são prováveis serem menos imunogênicos em anticorpos humanos do que nãohumanos. A terapia é rápida; a inativação da toxina pode ocorrer tão logo o anticorpo alcance sítios de infecção e diretamente neutraliza a(s) toxina(s) causadoras da doença. Os anticorpos humanos localizam-se em apropriados sítios de humanos mais eficientemente do que os anticorpos não humanos. Além disso, o tratamento é específico para C. difficile e é improvável romper a flora normal do intestino, diferente das terapias antibióticas tradicionais.
Outros aspectos e vantagens da invenção serão evidentes pela seguinte descrição detalhada e pelas reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é uma tabela listando as seqüências de aminoácido das cadeias VH e VL codificadas pelas seqüências de mRNA de cada clone.
*
As letras em caixa baixa representam aminoácidos do peptídeo líder. As CDRs são sublinhadas. O clone 3D8, que expressa 6 regiões de cadeia leve V únicas, somente expressou a seqüência de aminoácido do grupo I.
A Figura 2A é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VL expressa pelo clone 3D8. Os genes dos segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 2B é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VH expressa pelo clone 3D8. Os genes do segmento-V, segmento-D e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 3A é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VL expressa pelo clone 1B11. Os genes de segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 3B é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VH expressa pelo clone 1B11. Os genes de segmento-V, segmento-D e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 4A é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VL expressa pelo clone 33.3H2 (referido aqui como 3H2; 33.3H2 e 3H2 são usados intercambiavelmente aqui). Os genes de segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucléico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 4B é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucléico da cadeia VH expressa pelo clone 33.3H2. Os genes de segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucléico. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 5 é um gráfico representando os resultados de ensaios ELISA, que mediram a ligação de anticorpos monoclonais anti-toxina A com a toxina A.
As Figuras 6A-B são um conjunto de gráficos representando resultados dos ensaios de neutralização in vitro, na presença e ausência de anticorpos monoclonais anti-toxina A. A Fig. 6A representa resultados para ensaios realizados com células IMR-90. A Fig. 6B representa resultados para ensaios realizados com células T-84.
A Figura 7 é uma representação esquemática do polipeptídeo da toxina A, indicando fragmentos que foram analisados por estudos de mapeamento de epítopo.
A Figura 8A-B são representações esquemáticas de fragmentos de toxina A, analisados por estudos de mapeamento de epítopo.
A Figura 9 é uma tabela listando os resultados de ensaios in vivo, para determinar a proteção de camundongo de provocação letal com toxina A por anticorpos monoclonais anti-toxina A.
A Figura 10 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de acúmulo de fluido da alça ileal de camundongo, para medir a eficácia de neutralização de anticorpo anti-toxina in vivo.
A Figura 11A é um diagrama esquemático da linha de tempo de administração de vários agentes em hamsters em um modelo de reincidência de hamster.
A Figura 11B é um gráfico representando os resultados dos ensaios como percentagem de hamsters sobrevivendo a tratamento com clindamicina, seguido por provocação com C. difficile.
A Figura 12 é um gráfico representando resultados de ensaios de reincidência de hamster, como uma percentagem de hamsters sobrevivendo a tratamento com clindamicina, seguido por provocação com C. difficile.
A Figura 13 é um gráfico representando resultados de ensaios em que neutralização in vivo da toxina A e toxina B foi medida na presença e ausência de antissoros policlonais de cabras imunizadas com toxóide B. “G330” refere-se a amostras em que soros de cabra #330 foram testados. “G331” refere-se a amostras em que os soros de cabra #331 foram testados.
A Fig. 14 é um diagrama esquemático da linha de tempo de administração de vários agentes em hamsters em um modelo de reincidência de hamster.
A Fig. 15 é um gráfico representando os resultados de ensaios de reincidência de hamster como percentagem de hamsters sobrevivendo a tratamento com clindamicina, seguido por provocação com C. diffiicile. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8, vancomicina e antissoros de cabra #331 ou vancomicina 3D8 e antissoros de cabra #331.
A Fig. 16 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de recaída de hamster como uma percentagem dos animais saudáveis após tratamento com clindamicina, seguido por provocação com C. difficile. “Cabra 331” refere-se aos antissoros de cabra #331.
A Fig. 17 é um gráfico representando os resultados de ensaios de recaída de hamster como uma percentagem dos hamsters sobrevivendo a tratamento com clindamicina, seguido por provocação por C. difficile. Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8 ou não receberam nenhum tratamento.
A Fig. 18 é um gráfico representando os resultados de ensaios de recaída de hamster como uma percentagem de animais saudáveis após tratamento com clindamicina, seguido por provocação com C. difficüe. Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina.
A Fig. 19 é um diagrama esquemático da linha de tempo de administração de vários agentes em hamsters em um modelo de provocação direta de C. difficüe. “331” refere-se aos antissoros de cabra #331. “Clinda” refere-se a tratamento com clindamicina.
A Fig. 20 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de provocação direta como percentagem de hamsters sobrevivendo à provocação direta com C. difficile.
A Fig. 21 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de provocação direta como percentagem de animais saudáveis após provocação direta com C. difficile.
A Fig. 22 é uma representação da seqüência de aminoácido da toxina A de C. difficile.
A Fig. 23 é uma representação da seqüência de aminoácido da toxina B de C. difficile.
A Fig. 24 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de provocação primária como percentagem de hamsters sobrevivendo a provocação direta com C. difficile.
A Fig. 25 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de provocação primária, como a percentagem de hamsters sobrevivendo a provocação direta com C. difficile.
A Fig. 26 é um gráfico representando os resultados dos ensaios de provocação primária, como a percentagem de hamsters sobrevivendo a provocação direta com C. difficile.
A Fig. 27 é um gráfico representando os resultados dos ensaios em que neutralização in vitro da toxina A e toxina B foram medidos na presença de anticorpos monoclonais para toxina B ou soro policlonal de cabra contra a toxina B.
A Fig. 28 é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VH pelo clone 124-152. Os genes de segmento-V, ’5 segmento D e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Fig. 29 é uma representação das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico da cadeia VL, expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido e de ácido nucleico. As CDRs são riscadas por cima.
A Fig. 30 é uma representação da seqüência de aminoácido e de linha germinativa relacionada da cadeia VH, expressa pelo clone 124-152. Os genes de segmento-V, segmento-D e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido. As CDRS foram riscadas por cima.
A Figura 31 é uma representação das seqüências de aminoácido e linha germinativa relacionada da cadeia VL, expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento-V e segmento-J são listados acima das seqüências de aminoácido. As CDRs são riscadas por cima.
A Figura 32 é uma representação esquemática do polipeptídeo de toxina B, indicando fragmentos que foram analisados para estudos de mapeamento de epítopos.
Os símbolos de referência iguais dos vários desenhos indicam elementos iguais.
Descrição Detalhada da Invenção
A fim de prover-se um entendimento claro do relatório e reivindicações, as seguintes definições são convenientemente fornecidas abaixo.
Definições
O termo “toxina A” refere-se à proteína da toxina A codificada por C. difficile. A seqüência de aminoácido da toxina A de C. difficile (SEQ ID NO:41) é provida no GenBank® sob o número de acesso A37052, versão GI 98593 (vide também a Figura 22). A “Toxina B” refere-se à proteína da toxina B codificada por C. difficile. A seqüência de aminoácido da toxina A de C. difficile (SEQ ID NO:42) é provida no GenBank® sob o número de acesso S70172, versão GI 7476000 (vide também Figura 23). “Proteína” é usada intercambiavelmente com polipeptídeo”.
Um “anticorpo anti-C. difficile” é um anticorpo que interagem com (por exemplo, liga-se com) uma proteína ou outro componente produzido pelas bactérias C. difficile. Um “anticorpo anti-toxina” é um anticorpo que interage com uma toxina produzida por C. difficile (por exemplo, toxina A ou toxina B). Uma proteína anti-toxina pode ligar-se a um epítopo, por exemplo, um epítopo conformacional ou um linear ou a um fragmento da proteína de toxina de comprimento total.
Um “anticorpo humano” é um anticorpo que tem regiões variáveis e constantes, derivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos aqui descritos podem incluir resíduos aminoácidos não codificados pelas seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo).
Uma anticorpo anti-toxina ou sua parte de ligação ao antígeno pode ser administrado sozinho ou em combinação com um segundo agente. O indivíduo pode ser um paciente infectado com C. difficile, ou tendo um sintoma de doença associado com C. difficile (“CDAD”; por exemplo, diarréia, colite, dor abdominal) ou uma predisposição para doença associadacom C. difficile e em risco de recaída da doença. O tratamento pode ser curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, melhorar, paliar, melhorar ou afetar a infecção e a doença associada com a infecção, os sintomas da doença ou a predisposição para a doença.
Uma quantidade de um anticorpo anti-toxina eficaz para tratar uma CDAD ou uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade do anticorpo que é eficaz, em administração de dose única ou múltipla a um indivíduo, na inibição da CDAD em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo ou parte de anticorpo eliciar uma desejada resposta no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que qualquer tóxico ou efeitos nocivos do anticorpo ou parte de anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. A capacidade de um anticorpo para inibir um parâmetro mensurável pode ser avaliada em um sistema de modelo animal que prediz a eficácia em humanos. Por exemplo, a capacidade de um anticorpo anti-toxina de proteger camundongos da provocação letal com C. difficile pode predizer a eficácia em humanos. Outros modelos animais que predizem a eficácia são aqui descritos, tais como o modelo de ligação intestinal descrito nos Exemplos. Altemativamente, esta propriedade de um anticorpo ou composição de anticorpo pode ser avaliada pelo exame da capacidade do composto modular, tal modulação in vitro por ensaios conhecidos do prático hábil. Os ensaios in vitro incluem ensaios de ligação, tais como ELISA e ensaios de neutralização.
Uma quantidade de um anti-corpo anti-toxina, eficaz para evitar um distúrbio ou “uma quantidade profilaticamente eficaz” do anticorpo é uma quantidade que é eficaz, na administração de dose única ou múltipla ao indivíduo, em evitar ou retardar a ocorrência do início ou recorrência de CDAD, ou inibir um seu sintoma. Entretanto, se forem desejados intervalos de tempo de proteção mais longos, podem ser administradas doses aumentadas.
Os termos “agonizar”, “induzir”, “inibir”, ”potenciar”, “elevar”, “aumentar”, “diminuir” ou similares, p.ex., que denotem diferenças quantitativas entre dois estados, referem-se a uma diferença, por exemplo, uma diferença estatística ou clinicamente significativa, entre os dois estados.
Como aqui usado, “ligação específica” ou “especificamente liga-se a” refere-se à capacidade de um anticorpo: (1) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade de pelo menos 1 x 107 M'1 e (2) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade para um antígeno não-específico.
Um “anticorpo” é uma proteína incluindo pelo menos uma ou duas regiões variáveis de cadeia pesada (H) (abreviado aqui VHC) e pelo menos uma ou duas regiões variáveis de cadeia leve (L) (abreviado aqui como VLC). As regiões VHC e VLC podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas “regiões determinantes da complementaridade” (“CDR”), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas “regiões estruturais” (FR). A extensão da região estruturada e das CDRs foi precisamente definida (vide Kabat, E.A. et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242, 1991 e Chothia, C et al., J. Mol. Biol. 196: 901 - 917, 1987, que são incorporadas aqui por referência). Preferivelmente, cada VHC e VLC é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do término-amino ao términocarbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
A cadeia VHC ou VLC do anticorpo pode incluir ainda toda ou parte de uma região constante de cadeia pesada ou leve. Em uma forma de realização, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias de imunoglobulina pesada e duas cadeias de imunoglobulina leve, em que as cadeias de imunoglobulina pesada e leve são interconectadas por, p. e., ligações dissulfeto. A região constante de cadeia pesada inclui três domínios, CHI, CH2 e CH3. A região constante de cadeia leve consiste de um domínio, CL.
A região variável de cadeias pesada e leve contém um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões dos anticorpos tipicamente mediam a ligação do anticorpo com os tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico. O termo “anticorpo” inclui imunoglobulinas intactas dos tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (bem como seus subtipos), em que as cadeias leves da imunoglobulina podem ser dos tipos kappa ou lambda.
“Imunoglobulina” refere-se a uma proteína consistindo de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina humana reconhecidos incluem os genes da região constante kappa, lambada, alfa (IgAl e IgA2), gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon e um, bem como a miríade de genes da região variável da imunoglobulina. As “cadeias leves” de imunoglobulina de comprimento total (cerca de 25 KD e 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável no término-NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante kappa ou lambda no término COOH. As “cadeias pesadas” da imunoglobulina de comprimento total (cerca de 50 KD e 446 aminoácidos), são similarmente codificadas por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante supracitados, por exemplo, gamma (codificando cerca de 330 aminoácidos). O termo “imunoglobulina” inclui uma imunoglobulina tendo: CDRs de uma fonte humana ou não-humana. A estrutura da imunoglobulina pode ser humana, humanizada ou não-humana, por exemplo, uma estrutura de murino modificada para diminuir a antigenicidade em humanos ou uma estrutura sintética, por exemplo, uma seqüência de consenso.
Como aqui usado, “isotipo” refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGt) que é codificada por genes da região constante de cadeia pesada.
A expressão “parte de ligação ao antígeno” de um anticorpo (ou simplesmente “parte de anticorpo” ou “parte”), como aqui usado, referese a uma parte de um anticorpo que especificamente se liga a uma toxina C de C. difficile (por exemplo, toxina A), por exemplo, uma molécula em que uma ou mais cadeias de imunoglobulina não é de comprimento total, porém que especificamente se liga a uma toxina. Exemplos de partes de ligação abrangidas dentro do termo “parte de ligação de antígeno” de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento mono vai ente consistindo dos domínios VLC, VHC, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VHC e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos domínios VLC e VHC de um único braço de um anticorpo, (V) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989), que consiste de um domínio VHC; e (vi) uma região determinante da complementaridade isolada (CDR), tendo suficiente estrutura para especificamente ligar-se a uma parte de ligação ao antígeno de uma região variável. Uma parte de ligação ao antígeno de uma região variável de cadeia leve e uma parte de ligação ao antígeno de uma região variável de cadeia pesada, por exemplo, os dois domínios do fragmento Fv, VLC e VHC, podem ser unidos, empregando-se métodos recombinantes, por um ligador sintético que os possibilita serem produzidos como uma cadeia de proteína única, em que as regiões VLC e VHC pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei USA 85: 5879 - 5883). Tais anticorpos de cadeia única são também abrangidos dentro do termo “parte de ligação de antígeno” de um anticorpo. Estas partes de anticorpo são obtidas empregando-se técnicas convencionais conhecidas daqueles hábeis na técnica, e as partes são avaliadas quanto à utilidade, da mesma maneira como se fossem anticorpos intactos.
A expressão “anticorpo monoespecífico” refere-se a um anticorpo que exibe uma única especificidade e afinidade de ligação para um alvo particular, por exemplo, epítopo. Este termo inclui um “anticorpo monoclonal” ou “composição anticorpo monoclonal”, que, como aqui usada, refere-se a uma preparação de anticorpos ou partes deles com uma única composição molecular.
A expressão anticorpo “recombinante”, como aqui usada, refere-se a anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos usando-se um vetor de expressão recombinante, transfectado dentro de uma célula hospedeira, anticorpos isolados de um recombinante, biblioteca anticorpo combinatorial, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que seja transgênico para genes de imunoglobulina humana ou anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva união das seqüências genéticas da imunoglobulina humana com outras seqüências de DNA. Tais anticorpos recombinantes incluem anticorpos humanizados, enxertados CDR, quiméricos, gerados in vitro (por exemplo, por exibição de fago) e podem opcionalmente incluir regiões constantes, derivadas de seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana.
Como aqui usado, a expressão “substancialmente idêntico” (ou “substancialmente homólogo”) refere-se a um primeiro aminoácido ou seqüência de nucleotídeo que contenha um número suficiente de resíduos aminoácidos ou nucleotídeos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral similar, por exemplo, substituições de aminoácidos conservados) a uma segunda seqüência de aminoácido ou nucleotídeo, de modo que as primeira e segunda seqüências de aminoácido ou nucleotídeo tenham atividades similares. No caso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelo menos 50% da afinidade do primeiro anticorpo.
Cálculos da “homologia” entre duas seqüências são realizados como segue. As seqüências são alinhadas para fins de ótima comparação (por exemplo, os vãos podem ser introduzidos em um ou ambos de uma primeira e uma segunda seqüência de aminoácido ou ácido nucléico para ótimo alinhamento e as seqüências não homólogas podem ser desconsideradas para fins de comparação). O comprimento de uma seqüência de referência alinhada para fins de comparação é pelo menos 50% do comprimento da seqüência de referência. Os resíduos aminoácidos ou nucleotídeos das posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição da primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduo aminoácido ou nucleotídeo da posição correspondente da segunda seqüência, então as moléculas são idênticas naquela posição (como aqui usado, “identidade” de aminoácido ou ácido nucléico é equivalente a “homologia” de aminoácido ou ácido nucléico). A identidade percentual entre as duas seqüências é função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências, considerando-se o número de vãos e o comprimento de cada vão que necessitam ser introduzidos para alinhamento ótimo das duas seqüências.
A comparação das seqüências e a determinação da homologia percentual entre as duas seqüências podem ser realizadas empregando-se um algoritmo matemático. A homologia percentual entre duas seqüências de aminoácido é determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444 453, 1970, que foi incorporado dentro do programa GAP do pacote de software GCG, empregando-se uma matriz de contagem Blossum 62, com uma penalidade de vão de 12, uma penalidade de extensão de vão de 4 e uma penalidade de vão de mudança de estrutura de 5.
Como aqui usada, as expressão “hibridiza sob condições de baixa rigorosidade, média rigorosidade, alta rigorosidade ou rigorosidade muito alta” descreve condições para hibridização e lavagem. Orientação para realizar as reações de hibridização pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989, que é incorporada aqui por referência. Métodos aquosos e não aquosos são descritos naquela referência e um ou outro pode ser usado. Condições de hibridização específicas referidas aqui são como seguem: 1) condições de hibridização de baixa severidade: 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, seguido por duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS pelo menos a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55 °C para baixas condições de severidade); 2) condições de hibridização de média severidade: 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 60 °C; 3) condições de hibridização de alta severidade: 6X SSC a cerca de 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 65 °C; e 4) condições de hibridização de muito alta severidade: 0,5 M fosfato de sódio, 7% SDS a 65 °C, seguido por uma ou mais lavagens a 0,2X SSC, 1% SDS a 65 °C.
Entende-se que os anticorpos e suas partes de ligação em antígeno aqui descritos podem ter substituições de aminoácidos conservadores ou não-essenciais adicionais, que não têm um efeito substancial sobre as funções dos polipeptídeos. Quer ou não uma substituição particular seja tolerada, isto é, não afete adversamente as propriedades biológicas desejadas, tais como atividade de ligação, pode ser determinada como descrito em Bowie et al., Science, 247: 1306 - 1310, 1990. Uma “substituição de aminoácido conservador” é uma em que um resíduo aminoácido é substituído por um resíduo aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos aminoácidos, tendo cadeias laterais similares, foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares descarregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Um resíduo aminoácido “não-essencial” é um resíduo que pode ser alterado da seqüência tipo selvagem de um polipeptídeo, tal como um agente de ligação, por exemplo, um anticorpo, sem substancialmente alterar uma atividade biológica, enquanto que um resíduo aminoácido “essencial” resulta em tal mudança.
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados como comumente entendidos por uma pessoa de habilidade comum na técnica a que esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporados por referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos somente e não se destinam a ser limitativos.
Sumário
C. difficile é uma bactéria produtora de toxina gram positiva, que causa diarréia e colite em humanos associada com antibióticos. São providos aqui métodos e composições para tratamento e prevenção da doença associada a C. difficile (CDAD). As composições incluem anticorpos que reconhecem proteínas e outros componentes moleculares (por exemplo, lipídeos, carboidratos, ácidos nucleicos) das bactérias C. difficile, incluindo anticorpos que reconhecem as toxinas produzidas por C. difficile (por exemplo, toxina A e toxina B). Em particular, são fornecidos anticorpos monoclonais humanos. Em certas formas de realização, estes anticorpos monoclonais humanos são produzidos em camundongos expressando segmentos genéticos da imunoglobulina humana (descritos abaixo). Combinações de anticorpos anti-toxina são também fornecidos.
Os novos métodos incluem administrar anticorpos (e suas partes de ligação em antígeno) que se ligam a uma toxina C. difficile em um indivíduo para inibir CDAD no indivíduo. Por exemplo, os anticorpos antitoxina A monoclonais humanos aqui descritos podem neutralizar a toxina A e inibir a recaída da doença mediada por C. difficile. Em outros exemplos, combinações de anticorpos anti-toxina A (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-toxina A) e anticorpos anti-toxina B podem ser administrados para inibir a doença primária e reduzir a incidência de recaída da doença. Os anticorpos monoclonais humanos podem localizar os sítios da doença (por exemplo, o intestino) in vivo.
I. Geração de Anticorpos
Imunogenos
Em geral, os animais são imunizados com antígenos expressos por C. difficile, para produzir anticorpos. Para produzir anticorpos anti-toxina, os animais são imunizados com toxinas inativadas, ou toxóides. As toxinas podem ser inativadas, por exemplo, por tratamento com formaldeído, glutaraldeído, peróxido ou oxigênio (vide, por exemplo, Relyveld et al., Methods in Enzymology, 93:24, 1983; Woodrow e Levine, eds. New Generation Vacines, Marcei Dekker, Inc. New York, 1990). As toxinas de C. difficile mutantes, com reduzida toxicidade, podem ser produzidas utilizandose métodos recombinantes (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.085.862; 5.221.618; 5.244.657; 5.332.583; 5.358.868; e 5.433.945). Por exemplo, mutantes contendo deleções ou mutações pontuais no sítio ativo da toxina podem ser produzidos. Fragmentos recombinantes das toxinas podem ser usados como Imunógenos. Outra abordagem é inativar a toxina por tratamento com UDP-dialdeído (Genth et al., Inf. and Immun. 68(3):10941101, 2000). Este método preserva a estrutura nativa da toxina mais prontamente do que outros tratamentos e, assim, pode eliciar anticorpos mais reativos para a toxina nativa. Este método é também descrito no Exemplo 1, abaixo.
Os anticorpos anti-toxina que se ligam à e neutralizam a toxina A podem interagir com epítopos específicos da toxina A. Por exemplo, um anticorpo anti-toxina A pode ligar-se a um epítopo em um região de terminal
N da toxina A (por exemplo, entre os aminoácidos 1 -1033 da toxina A) ou uma região de terminal-C (por exemplo, entre os aminoácidos 1853-2710 da toxina A). Em um exemplo, um anticorpo que se liga à e neutraliza a toxina A liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 1853 - 2710 da toxina A.
Similarmente, os anticorpos anti-toxina B podem reconhecer um epítopo específico da toxina B, por exemplo, um epítopo de terminal-N ou um epítopo de terminal-C. Em um exemplo, um anticorpo que se liga à e neutraliza a toxina B liga-se a um epítopo dentro dos aminoácidos 1777 2366 da toxina B.
Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos em Camundongos HuMAb
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de uma maneira não possível com os anticorpos policlonais. Os antissoros policlonais variam de animal para animal, enquanto que as preparações monoclonais exibem uma especificidade antigênica uniforme. Os sistemas do animal murino são úteis para gerar anticorpos monoclonais e protocolos de imunização, técnicas para isolar e fundir esplenócitos e métodos e reagentes para produzir hibridomas são bem conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Vide genericamente Harlow, E e Lane, D. Antíbodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.
Embora estas técnicas padrão sejam conhecidas, é desejável utilizarem-se anticorpos humanizados ou humanos em vez de anticorpos de murinos, para tratar indivíduos humanos, porque os humanos montam uma resposta imune para anticorpos de camundongos e outras espécies. A resposta imune para os anticorpos de murinos é chamada uma resposta anticorpo anticamundongo humana ou HAMA (Schroff, R. et al., Câncer Res., 45, 879 885, 1985) e é uma condição que causa náusea do soro em humanos e resulta em rápida depuração dos anticorpos murinos da circulação de um indivíduo. A resposta imune em humanos tem mostrado ser contra regiões tanto variáveis como constantes das imunoglobulinas de murino. Os anticorpos monoclonais humanos são mais seguros para administração a humanos do que os anticorpos derivados de outros animais e anticorpos policlonais humanos.
Um tipo útil de animal em que gerar anticorpos monoclonais humanos é um camundongo transgênico, que expressa genes da imunoglobulina humana em vez de seus próprios genes da imunoglobulina de camundongo. Tais camundongos transgênicos, por exemplo, camundongos “HuMAb™”, contêm minilocais que codificam as seqüências da imunoglobulina de cadeias pesada (μ e γ) e leve κ humanas dessarranjadas, junto com mutações alvejadas que inativam os locais de cadeia μ e κ endógenas (vide, Lonberg, N et al., Nature 368 (6474): 856 - 859, 1994 e Patente U.S. 5.770.429). Por conseguinte, os camundongos exibem reduzida expressão de IgM ou κ de camundongo e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos sofrem a clássica troca e mutação somática, para gerar anticorpos monoclonais IgGK humanos de alta afinidade (Lonberg, N et al., supra; recapitulado em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49 - 101, 1994; Lonberg, N. e Huszar, D., Intern. Ver. Immunol., 13: 65 - 93, 1995, e Harding, F. e Lonberg, N., Ann.
NY. Acad. Sei., 764:536 - 546, 1995).
A preparação de tais camundongos transgênicos é descrita com mais detalhes em Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20: 6287 - 6295, 1992; Chen. J et al., International Immunology 5: 647 - 656, 1993; Tuaillon et al., Proc. Nat. Acad. Sei USA 90: 3720 - 3724, 1993; Choi et al., Nature Genetics, 4: 117 -123, 1993; Chen. J. et al., EMBO J., 12: 821 - 830, 1993; Tuaillon et al., J. Immunol., 152:2912 - 2920, 1994; Taylor, L. et al., International Immunology, 6: 579 - 591, 1994; e Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845 - 851, 1996. Vide ainda, Patentes U.S. 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.425, 5.789.650, 5.814.318, 5.874.299 e 5.877.397, todas de Lonberg e Kay, e Publicação PCT Nos. WO 01/14424, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227 e WO 92/03918.
Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para um antígeno, camundongos HuMAb podem ser imunizados com um imunógeno, como descrito por Lonberg, N. et al., Nature, 368(6474): 856 859, 1994; Fishwild, D et al., Nature Biotechnology, 14: 845 -851, 1996 e WO 98/24884. Preferivelmente, os camundongos terão 6 — 16 semanas de idade na primeira imunização. Por exemplo, uma preparação purificada de toxina A inativada pode ser usada para imunizar os camundongos HuMAb intraperitonealmente. Para gerar anticorpos contra proteínas, lipídeos e/ou moléculas de carboidrato de C. difficile, os camundongos podem ser imunizados com organismos de C. difficile mortos ou não-viáveis.
Os camundongos transgênicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antígeno em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações IP cada duas semanas (até um total de 6), com antígeno em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imune pode ser monitorada através do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangrias retro-orbitais. O plasma pode ser avaliado, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo e camundongos com suficiente títulos de imunoglobulina humana anti-toxina podem ser usados para fusões. Camundongos podem ser reforçados intravenosamente com antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que 2-3 fusões para cada antígeno possam ser necessárias ser realizadas. Diversos camundongos são tipicamente imunizados para cada antígeno.
Os esplenócitos de camundongo podem ser isolados e fundidos com PEG em uma linhagem de célula de mieloma de camundongo, com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes são então avaliados quanto à produção de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados são fundidas em um-sexto do número de células de mieloma de camundongo nãosecretantes P3X63-Ag8.ó53 (ATCC, CRL 1580) com 50% PEG. As células são revestidas a aproximadamente 2x10 em placas de microtítulo de fundo chato, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20% de Soro de Clone fetal, 18% de meios condicionados “653”, 5% de origem (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 5 mM E1EPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e lx HAT (Sigma; HAT é adicionado 35 h após a fusão). Após duas semanas, são cultivadas células em meio em que HAT é substituído por HT. Os sobrenadantes de poços individuais são então avaliados por ELISA quanto a anticorpos IgM e IgG monoclonais de célula anti-toxina humanos. O anticorpo secretando hibridomas é re-revestido, avaliado novamente e, se ainda positivo para anticorpos monoclonais anti-toxina IgG humanos, podem ser subclonados pelo menos duas vezes limitando a diluição. Os subclones estáveis são então cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.
Em uma forma de realização, o animal transgênico usado para gerar anticorpos humanos para a toxina contém pelo menos uma, tipicamente 2-10 e às vezes 25 - 50 ou mais cópias do transgene descrito no Exemplo 12 do WO 98/24884 (por exemplo, pHCl ou pHC2) criado com um animal contendo uma única cópia de um transgene de cadeia leve, descrito nos
Exemplos 5, 6, 8 ou 14 do WO 98/24884 e a descendência criada com o animal com JH deletado, descrito no Exemplo 10 do WO 98/24884, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Os animais são criados para homozigosidade para cada uma destas três características. Tais animais têm o seguinte genótipo: uma única cópia (por conjunto haplóide de cromossomas) de um mini-local desarranjado de cadeia pesada humana (descrito no Exemplo 12 do WO 98/24884), uma única cópia (por conjunto haplóide de cromossomas) de um constructo de cadeia leve K humana rearranjada (descrito no Exemplo 14 do WO 98/24884) e uma deleção em cada local de cadeia pesada de camundongo endógena, que remove todos os segmentos Jh funcionais (descritos no Exemplo 10 do WO 98/24884). Tais animais são criados com camundongos que são homozigotos para a deleção dos segmentos Jh (Exemplos 10 de WO 98/24884) para produzir descendência que são homozigoto para a deleção JH e homozigoto para os constructos de cadeia pesada e leve humana. Os animais resultantes são injetados com antígenos e usados para produção de anticorpos monoclonais humanos contra estes antígenos.
Células B isolados de tal animal são monoespecíficas com respeito às cadeias pesadas e leves humanas, porque elas contêm somente uma única cópia de cada gene. Além disso, elas serão monoespecíficas com respeito às cadeias pesadas humanas ou de camundongo, porque ambas as cópias de gene de cadeia pesada de camundongo endógeno não são funcionais em virtude da deleção abrangendo a região JH introduzida como descrito nos
Exemplos 9 e 12 de WO 98/24884. Além disso, uma fração substancial das células B será monoespecífica com respeito às cadeias leves humanas de camundongo, porque a expressão da única cópia do gene de cadeia leve kappa humana rearranjado alélica e isotipicamente excluirá o rearranjo dos genes de cadeia kappa e lambda de camundongo endógeno em uma fração significativa de células-B.
Em uma forma de realização, o camundongo transgênico exibirá produção de imunoglobulina com um repertório significativo, idealmente substancialmente similar àquele de uma camundongo nativo. Assim, por exemplo, nas formas de realização em que os genes Ig endógenos foram inativados, os níveis de imunoglobulina total variarão de cerca de 0,1 a 10 mg/ml. Quando um transgene capaz de efetuar uma mudança par IgG de IgM foi introduzido dentro do camundongo transgênico, a relação de camundongo adulto do soro IgG para IgM é preferivelmente de cerca de 10:1. A relação de IgG para IgM será muito menor no camundongo imaturo. Em geral, mais do que cerca de 10%, por exemplo, cerca de 40 a 80% das células B do baço e linfonodo expressarão exclusivamente proteína IgG humana.
O repertório do camundongo transgênico idealmente se aproximará daquele mostrado em um camundongo não-transgênico, usualmente pelo menos cerca de 10% tão elevado, preferivelmente 25 a 50% ou mais tão elevado. Geralmente, pelo menos cerca de mil diferentes imunoglobulinas (idealmente IgG), preferivelmente 104 a 106 ou mais, serão produzidas, dependendo principalmente do número de diferentes regiões V, L e D introduzidas dentro do genoma do camundongo. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade para antígenos presselecionados de pelo menos cerca de 107 M1, 109M’’, ΙΟ'θΜ'1, 1011M’\ 10l2M‘! ou maior, por exemplo, até ΙΟΆΤ1 ou maior.
Os camundongos HuMAb podem produzir células B que sofrem comutação-clássica via recombinação de comutação intratransgene (comutação-cis) e expressam imunoglobulinas reativas com a toxina. As imunoglobulinas podem ser anticorpos de seqüência humana, em que os polipeptídeos de cadeia pesada e leve são codificados por seqüências transgênicas humanas, que podem incluir seqüências derivadas por mutação somática e juntas recombinatoriais de região V, bem como seqüências codificadas de linhagem germinativa. Estas imunoglobulinas de seqüência humana podem ser referidas como sendo substancialmente idênticas a uma seqüência de polipeptídeo codificada por um segmento de gene VL ou VH humano e um segmento JL humano ou JL, mesmo embora outras seqüências de linhagem não germinativa possam estar presentes, como resultado de mutação sonfitica e juntas de recombinação V-J e V-D-J diferencial. Com respeito a tais anticorpos de seqüência humana, as regiões variáveis de cada cadeia são tipicamente pelo menos 80 por cento codificadas pela linha germinativa humana V, J e, no caso de cadeias pesadas, D, segmentos de gene. Freqüentemente, pelo menos 85 por cento das regiões variáveis são codificadas por seqüências de linha germinativa humanas presentes no transgene. Com freqüência, 90 ou 95 por cento ou mais das seqüências de região variável são codificadas pelas seqüências de linha germinativa humana presentes no transgene. Entretanto, uma vez que seqüências de lmha nãogerminativa são introduzidas por mutação somática e união VJe VDJ, os anticorpos de seqüência humana freqüentemente terão algumas seqüências de região variável (e menos freqüentemente seqüências de região constante) que não são codificadas por segmentos de gene V, D ou J, como encontrado no(s) transgene(s) humano(s) da linha germinativa dos camundongos. Tipicamente, tais seqüências de linha não-germinativa (ou posições de nucleotídeos individuais) agrupar-se-ão dentro ou próximo das CDRs ou em regiões em que as mutações somáticas são sabidas agruparem-se.
Os anticorpos de seqüência humana, que se ligam à toxina, podem resultar de comutação de isotipos, de modo que os anticorpos humanos, compreendendo uma cadeia gamma de seqüência humana (tal como gamma 1, gamma 2 ou gamma 3) e uma cadeia leve de seqüência humana (tal como K), são produzidos. Tais anticorpos de seqüência humana comutada por isotipo com freqüência contém uma ou mais mutação(ões) somática(s), tipicamente na região variável e} com freqüência, em ou dentro de cerca de 10 resíduos de uma CDR), como resultado de maturação por afinidade e seleção de células B por antígeno, particularmente subseqüente a provocação de antígeno secundária (ou subseqüente). Estes anticorpos de seqüência humana de alta afinidade têm afinidades de ligação de pelo menos cerca de 1 x 109 M \ tipicamente pelo menos 5 x 109 M'1, freqüentemente mais do que 1 x 1010 M's e, às vezes, 5x 101θ M'1 a lxlO11 M'1 ou mais.
Os anticorpos anti-toxina podem ser criados em outros mamíferos, incluindo camundongos não-transgênicos, humanos, coelhos e cabras.
Anticorpos Anti-toxina A
Os anticorpos monoclonais humanos que especificamente se ligam à toxina A incluem anticorpos produzidos pelos clones 3D8, 1B11 e 3H2 aqui descritos. Os anticorpos com regiões de cadeia pesada e cadeia leve variáveis, que são pelo menos 80% ou mais idênticas às regiões de cadeia pesada e leve variáveis de 3D8, 1B11 e 3H2, podem também ligar-se à toxina
A. Em formas de realização relacionadas, os anticorpos anti-toxina A incluem, por exemplo, as regiões determinantes de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de 3D8, 1B11 ou 3H2, As CDRs das regiões de cadeia pesada variável destes clones são mostradas na Tabela 1, abaixo,
Tabela 1. Seqüências de aminoácido de CDR de Cadeia Pesada Variável
Clone Cadeia CDR Seqüência de aminoácido SEQ ID NO:
3D8 H CDR1 NYGMH 7
1B11 H CDR1 SYGMH 10
3H2 H CDR1 KYGMH 13
3D8 H CDR2 LIWYDGSNEDYTDSVKG 8
1B11 H CDR2 VIWASGNKKYYIESVEG 11
3H2 H CDR2 VIWYDGTNKYYADSMKG 14
3D8 H CDR3 WGMVRGVIDVFDI 9
1B11 H CDR3 ANFDY 12
3H2 H CDR3 DPPTANY 15
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas na tabela 2 abaixo.
Tabela 2. Seqüências de aminoácido de CDR de Cadeia Leve Variável
Clone Cadeia CDR Seqüência de aminoácido SEQ ID NO:
3D8 L CDR1 RASQGISSWLA 16
1B11 L CDR1 RASQSVSSYLA 19
3H2 L CDR1 RASQGISSWLA 22
3D8 L CDR2 AASSLQS 17
1B11 L CDR2 DASNRAT 20
3H2 L CDR2 AASSLQS 23
3D8 L CDR3 QQANSFPWT 18
1B11 L CDR3 QQRSNWSQFT 21
3H2 L CDR3 QQYKSYPVT 24
As CDRs são as partes das imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antígeno particular. Em certas formas de realização, as CDRs correspondendo às CDRs das tabelas 1 e 2, tendo variações de seqüência (por exemplo, substituições conservativas), podem ligar-se à toxina A. Por exemplo, as CDRs, em que 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos, ou menos do que 20% dos resíduos totais da CDR, são substituídos ou deletados, podem estar presentes em um anticorpo (ou sua parte de ligação ao antígeno) que se liga à toxina A.
Similarmente, os anticorpos anti-toxina podem ter CDRS contendo uma seqüência de consenso, visto que motivos de seqüência conservados entre múltiplos anticorpos podem ser importantes para atividade de ligação. Por exemplo, a CDR1 de uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir a seqüência de aminoácido R-A-S-Q-X-X-X-S-S-X-L-A (SEQ ID NO:25), a CDR2 de uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir a seqüência de aminoácido A-S-X-X-X-X/T (SEQ ID
NO: 26) e/ou a CDR3 de uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno pode incluir a seqüência de aminoácido QQ-X-X-S/N-X-P/S (SEQ ID NO: 27), em que X é qualquer aminoácido.
Em algumas formas de realização, a CDR1 de uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas partes de ligação em antígeno inclui a seqüência de aminoácido Y-G-M-H (SEQ ID NO: 28) e/ou CDR2 de uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou suas parte de ligação ao antígeno inclui a seqüência de aminoácido I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-SX-X-G (SEQ ID NO: 29), em que X é qualquer aminoácido.
Os anticorpos anti-toxina humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto de ou derivadas de genes da imunoglobulina humana específicos. Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto de ou derivada de um gene VH3-33 humano. Numerosas seqüências para anticorpos derivados deste gene são disponíveis no GenBank® (vide, por exemplo, Ac. No.: AJ555951, Gí No.: 29836865; Ac. No. AJ556080, GI No.: 29837087; Ac. No. AJ556038, GI No.: 29837012 e outros segmentos de gene rearranjado VH3-33 humano fornecido pelo GenBank®). Os anticorpos podem também ou, altemativamente, incluir uma região variável de cadeia leve que é o produto ou derivada de um gene LI9 Vk humano (vide, por exemplo, GenBank® Ac. No. AJ556049, GI No. 29837033 para uma seqüência parcial de um segmento de gene L19 Vk humano rearranjado). Como sabido na técnica e descrito nesta seção acima, as regiões de imunoglobulina variáveis de anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo, em que a variabilidade é introduzida em segmentos genômicos codificando as regiões. Por conseguinte, as regiões variáveis, derivadas de um gene L19 VH33 ou Vk humano, podem incluir nucleotídeos que são diferentes daqueles do gene encontrado em tecidos não-linfóides. Estas diferenças de nucleotídeo são tipicamente concentradas nas CDRs.
Anticorpos Anti-toxina B
Os anticorpos monoclonais humanos que especificamente ligam-se à toxina B incluem anticorpos produzidos pelos clones 124-152, 2A1 e IG10, aqui descritos. Os anticorpos com região de cadeia pesada variável e de cadeia leve variável, que são pelo menos 80% ou mais idênticas às regiões de cadeia pesada e leve variáveis de -152, 2A11 e 1G10, podem também ligar-se à toxina A. Em formas de realização relacionadas, os anticorpos antitoxina B incluem, por exemplo, as regiões determinantes da complementaridade (CDR) das cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de -152, 2A11 ou 1G10. As CDRs das regiões de cadeia pesada variável destes clones são mostradas na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3. Seqüências de aminoácido de CDR de Cadeia Pesada Variável
Clone Cadeia CDR Seqüência de aminoácido SEQ ID NO: (a.a.) SEQ ID NO: (n.t.)
124-152 H CDR1 SYWIG 62 63
124-152 H CDR2 IFYPGDSSTRYSPSFQG 64 65
124-152 H CDR3 RRNWGNAFDI 66 67
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas na Tabela 4, abaixo.
Tabela 4. Seqüências de aminoácido de CDR de Cadeia Leve Variável
Clone Cadeia CDR Seqüência de aminoácido SEQ ID NO: (a.a.) SEQ ID NO: (n.t.)
124-152 L CDR1 RASQSVSSSYLAW 68 69
124-152 L CDR2 GASSRAT 70 71
124-152 L CDR3 QQYGSSTWT 72 73
As CDRs são as partes das imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antígeno particular. Em certas formas de realização, as CDRs correspondendo às CDRs das Tabelas 3 e 4, tendo variações de seqüência (por exemplo, substituições conservativas), podem ligar-se à toxina
B. Por exemplo, as CDRs, em que 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos ou menos do que 20% dos resíduos totais da CDR são substituídos ou deletados, podem estar presentes em um anticorpo (ou sua parte de ligação ao antígeno) que se liga à toxina B.
Os anticorpos anti-toxina B humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto ou derivadas de genes da imunogíobulina humana específicos (vide Figs. 28-31). Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto ou derivada de uma gene VH
5-51 humano. Os anticorpos podem também, ou altemativamente, incluir uma região variável de cadeia leve, que é o produto ou derivada de um gene A27 κ e/ou gene JK1 humanos. Como mostrado na técnica e descrito nesta seção acima, as regiões de imunoglobulina variáveis dos anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo, em que a variabilidade é introduzida em segmentos genômicos codificando as regiões. Por conseguinte, as regiões variáveis, derivadas de um gene VH-5-51 ou A27. Vk/JK1 humano, podem incluir nucleotídeos que são diferentes daqueles do gene encontrado em tecidos não-linfóides. Estas diferenças de nucleotídeo são tipicamente concentradas nas CDRs.
2. Produção e Modificação de Anticorpos
Muitas diferentes formas de anticorpos anti-toxina podem ser úteis na inibição de CDAD. Os anticorpos podem ser dos vários isotipos, incluindo: IgG (por exemplo, IgGl, IgG2, IgGs, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD ou IgE. Preferivelmente, o anticorpo é um isotipo IgG, por exemplo, IgGl. As moléculas de anticorpo podem ser de comprimento total (por exemplo, um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem incluir somente um fragmento de ligação em antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2, Fv ou Fv de cadeia única). Estes incluem anticorpos moclonais (por exemplo, anticoros monoclonaís humanos) anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, bem como partes de ligação de antígeno dos precedentes.
Os anticorpos anti-toxina ou suas partes úteis na presente invenção podem também ser anticorpos recombinantes, produzidos por células hospedeiras transformadas com cadeias leves e pesadas de imunoglobulina codificando DNA de um anticorpo desejado. Os anticorpos recombinantes podem ser produzidos por técnicas de construção genética conhecidas. Por exemplo, os anticorpos recombinantes podem se produzidos clonando-se uma seqüência de nucleotídeo, por exemplo, um cDNA ou DNA genômico, codificando as cadeias leves e pesadas da imunoglobulina do desejado anticorpo. A seqüência de nucleotídeo codificando esses polipeptídeos é então inserida dentro de um vetor de expressão, de modo que ambos os genes sejam operativamente ligados a suas próprias seqüências de controle de expressão transcricional e translacional. A expressão vetor e expressão seqüências de controle são escolhidas para serem compatíveis com a expressão célula hospedeira usada. Tipicamente, ambos os genes são inseridos dentro do mesmo vetor de expressão. Podem ser usadas células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas.
A expressão células hospedeiras eucarióticas é preferida porque tais células são mais prováveis do que as células procarióticas reunirem-se e secretar um anticorpo apropriadamente dobrado e imunologicamente ativo. Entretanto, qualquer anticorpo produzido que seja inativo devido a dobragem imprópria pode ser renaturado de acordo com métodos bem conhecidos (Kim e Baldwin, Ann. Ver. Biochem., 51: 459 - 89, 1982). É possível que as células hospedeiras produzam partes de anticorpos intactos, tais como dímeros de cadeia leve ou dímeros de cadeia pesada, que também são homólogos de anticorpo de acordo com a presente invenção.
Os anticorpos descritos aqui também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira empregando-se, por exemplo, uma combinação das técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene, como é bem conhecido na técnica (Morrison, S., Science, 229: 1202, 1985). Por exemplo, em uma forma de realização, o(s) gene(s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo humanos, podem ser ligados em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucarótico, tal como usado em um sistema de expressão de gene GS descrito no WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841, ou em outros sistemas de expressão bem conhecidos na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO ou células NOS ou, altemativamente, células eucarióticas como uma planta derivada de células, células de fungos ou levedura. O método usado para introduzir estes genes pode ser qualquer método descrito na técnica, tal como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou transfecção balística, em que células são bombardeadas com micropartículas contendo o DNA de interesse (Rodin et al., Immunol. Lett., 74(3): 197 - 200, 2000). Após introduzir estes genes de anticorpo nas células hospedeiras, as células expressando o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados quanto a seu nível de expressão e supra-escalado para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados por estes sobrenadantes de cultura e/ou células, empregando-se técnicas padrão.
Deve ser entendido que variações dos procedimentos acima são úteis na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejado transformar uma célula hospedeira com DNA codificando a cadeia leve ou a cadeia pesada (porém não ambas) de um anticorpo. A tecnologia de DNA recombinante pode também ser usada para remover parte do ou todo o DNA codificando uma ou outra das ou ambas as cadeias leve e pesada, que não são necessárias para ligação, por exemplo, a região constante pode ser modificada, por exemplo, deletando-se os aminoácidos específicos. As moléculas expressas de tais moléculas de DNA truncadas são úteis nos métodos descritos aqui. Além disso, anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma leve ligam-se a uma toxina e as outras cadeias pesada e leve são específicas para um antígeno que não a toxina, ou outro epítopo da toxina.
Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica. Por exemplo, um gene codificando a região constante Fc de uma molécula de anticorpo monoclonal de murino (ou outra espécie) é digerido com enzimas de restrição, para remover a região codificando a Fc de murino e a equivalente parte de um gene codificando uma região constante Fc humana é substituída (vide Robinson et al., Publicação de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira et al., Pedido de Patente Européia 184.187; Taniguchi, M, Pedido de Patente
Européia 171.496; Morrison et al., Pedido de Patente Européia 173.494; Neuberger et al., Pedido Internacional WO 86/01533; Cabilly et al., Patente U.S. 4.816.567; Cabilly et al., Pedido de Patente Européia 125.023; Better et al. (1988 Science, 240: 1041 - 1043); Liu et al. (1987) PNAS, 84: 3439-3443; Liu et al, 1987, J. Immunol, 139:3521-3256; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214
-128; Nishimura et al, 1987, Canc. Res, 47: 999 - 1005; Wood et al. (1985)
Nature, 314: 446 - 449; e Shaw et al, 1988, J. Natl. Câncer Inst., 80: 1553 1559). Os anticorpos quiméricos podem também ser criados por técnicas de DNA recombinante, em que o DNA codificando as regiões V de murino pode ser ligado ao DNA codificando as regiões constantes humanas.
Um anticorpo ou uma cadeia de imunoglobulina podem ser humanizados por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma vez sejam obtidos anticorpos de murino, as regiões variáveis podem ser seqüenciadas. A localização das CDRs e resíduos estruturais podem ser determinados (vide Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of
Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901 - 917). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada podem, opcionalmente, ser ligadas às correspondentes regiões constantes. Na realidade, entende-se que qualquer um dos anticorpos aqui descritos, incluindo anticorpos totalmente humanos, pode ser alterado (por exemplo, por mutação, substituição) para conter uma região constante substituta, por exemplo, região Fc, ou parte(s) dela, para obter-se, por exemplo, uma desejada estrutura, função (por exemplo, função efetora),sub tipo, alotipo, subclasse ou similar anticorpo. Os anticorpos anti-toxina podem ser seqüenciados utilizando-se técnicas reconhecidas na técnica. As moléculas ou imunoglobulinas anticorpo enxertadas com CDR podem ser produzidas por enxerto de CDR ou substituição de CDR, em que uma, duas ou todas as CDRs de uma cadeia de imunoglobulina podem ser substituídas. Vide, por exemplo,
Patente U.S. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature, 321:552-525; Verhoeyan et al.; 1988, Science, 239:1534; Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 4053 4060; e Winter, Patente U.S. 5.225.539.
Winter descreve um método de enxertar-CDR que pode ser usado para preparar os anticorpos da presente invenção (Pedido de Patente
UK GB 2188638A, depositado em 26 de março de 1987; Winter Patente U.S. 5.225.539), cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência. Por exemplo, todas as CDRs de um anticorpo particular podem ser substituídas por pelo menos uma parte de um CDR humano (por exemplo, um CDR de clone 3D8, como mostrado nas Tabelas 1 e 2 e/ou clone 124 - 152, como mostrado nas Tabelas 3 e 4 acima) ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas. É somente necessário substituir o número de CDRs requeridas para ligação do anticorpo a um predeterminado antígeno (por exemplo, uma exotoxina de C. difficile).
Os anticorpos humanizados podem ser gerados substituindo-se seqüências da região variável Fv que não são diretamente envolvidas na ligação de antígeno com seqüências equivalentes de regiões variáveis Fv humanas. Métodos gerais para gerar anticorpos humanizados são providos por Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202 - 1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques, 4:214 e por Queen et al., Patente U.S. 5.585.089, Patente U.S.
5,693.761 e Patente U.S. 5.693.762. Aqueles métodos incluem isolar, manipular e expressar as seqüências de ácido nucléico que codificam todas as ou parte das regiões variáveis Fv da imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. As fontes de tal ácido nucléico são bem conhecidas daqueles hábeis na técnica e, por exemplo, podem ser obtidas de um hibridoma produzindo um anticorpo contra um predeterminado alvo, como descrito acima. O DNA recombinante, codificando o anticorpo humanizado ou seu fragmento, pode então ser clonado em um apropriado vetor de expressão. Outras técnicas para humanizar anticorpos são descritas em Padlan et al. EP 519596 Al, publicada em 23 de dezembro de 1992.
Também dentro do escopo da invenção estão anticorpos em que aminoácidos específicos foram substituídos, deletados ou adicionados. Em particular, anticorpos preferidos têm substituições de aminoácido na região estrutural, tal como para melhorar a ligação ao antígeno. Por exemplo, um pequeno número selecionado de resíduos estruturais aceitadores da cadeia de imunoglobulina pode ser substituído pelos correspondentes aminoácidos doadores. Locais preferidos das substituições incluem resíduos aminoácidos adjacentes à CDR, ou que sejam capazes de interagir com uma DCR (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.585.089). Critérios para selecionar aminoácidos do doador são descritos na Patente U.S. 5.585.089 (por exemplo, colunas 12 16), cujo conteúdo são por este meio incorporados por referência. A estrutura aceitadora pode ser uma seqüência de estrutura anticorpo humana madura ou uma seqüência de consenso.
Uma “seqüência de consenso” é uma seqüência formada dos aminoácidos mais freqüentemente ocorrentes (ou nucleotideos) de uma família de seqüências relacionadas (vide, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1987), Em uma família de proteínas, cada posição da seqüência de consenso é ocupada pelo aminoácidos ocorrendo mais freqüentemente naquela posição da família. Se dois aminoácidos ocorrerem igualmente freqüentemente, um ou outro pode ser incluído na seqüência de consenso. Uma “estrutura de consenso” de uma imunoglobulina refere-se a uma região estrutural da seqüência de imunoglobulina de consenso.
Um anticorpo anti-toxina ou sua parte de ligação ao antígeno pode ser derivatizada ou ligada em outra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Por exemplo, um anticorpo pode ser funcionalmente ligado (por acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outro modo) a uma ou mais de outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo, um agente detectável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeo que possa mediar a associação com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou um marcador de poliistidina).
Um tipo de proteína derivatizada é produzido por reticulação de duas ou mais proteínas (do mesmo típo ou de diferentes tipos). Reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos reativos distintos separados por um apropriado espaçador (por exemplo, m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida éster) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Tais ligadores são disponíveis em Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Agentes detectáveis úteis com que uma proteína pode ser derivatizada (ou rotulada) incluem compostos fluorescentes, várias enzimas, grupos proféticos,materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Agentes detectáveis fluorescentes incluem fluoresceína, isotiocíanato de fluoresceína, rodamina e ficoeritrina. Uma proteína ou anticorpo pode também ser derivatizado com enzimas detectáveis, tais como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, acetilcolinesterase, glicose oxidase e similares. Quando uma proteína é derivatizada com uma enzima detectável, ela é detectada adicionando-se reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reação detectável. Por exemplo, quando a peroxidase de rábano silvestre detectável por agente está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina resulta em um produto de reação colorido, que é detectável. Uma proteína pode também ser derivatizada com um grupo profético (por exemplo, estreptavidina/biotina e avidina/biotina). Por exemplo, um anticorpo pode ser derivatizado com biotina e detectado através de medição indireta de ligação de avidina ou estreptavidina.
Podem ser usados proteínas e anticorpos rotulados, por exemplo, diagnosticamente e/ou experimentalmente em um número de contextos, incluindo (i) isolar um antígeno predeterminado por técnicas padrão, tais como cromatografia de afinidade ou imunoprecipitação; e (ii) detectar um antígeno predeterminado (por exemplo, uma toxina, por exemplo, em um lisado celular ou uma amostra de paciente), a fim de monitorar os níveis de proteína no tecido, como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Um anticorpo anti-toxina ou seu fragmento de ligação de antígeno pode ser conjugado com outra entidade molecular, tal como um rótulo.
3. Métodos de Avaliação
Os anticorpos anti-toxina podem ser caracterizados para ligação à toxina por uma variedade de técnicas conhecidas. Os anticorpos são tipicamente caracterizados primeiro por ELISA. Resumidamente, as placas de microtítulo podem ser revestidas com a toxina ou antígeno toxóide em PBS e então bloqueadas com proteínas irrelevantes, tais como albumina de soro bovino (BSA) diluída em PBS. Diluições de plasma de camundongos imunizados com toxina são adicionadas em cada poço e incubadas pro 1 - 2 h a 37 °C. As placas são lavadas com PBS/Tween 20 e então incubadas com um reagente policlonal específico-Fc IgG de cabra-anti-humano conjugado com fosfatase alcalina por 1 hora a 37 °C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS e analisadas em OD de 405. Preferivelmente, os camundongos que desenvolvem os títulos mais elevados serão usados para fusões.
Um ensaio ELISA como descrito acima pode ser usado para avaliar quanto a anticorpos e, assim, hibridomas que produzem anticorpos que apresentam reatividade positiva com a toxina. Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam, preferivelmente com alta afinidade, à toxina, podem então ser subclonados e mais caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células precursoras (por ELISA), pode então ser escolhido para produzir um banco de células e para purificação anticorpo.
Para purificar os anticorpos anti-toxina, hibridomas selecionados podem ser cultivados em garrafas cilíndricas, frascos rotores, frascos rotores de dois litros ou outros sistemas de cultura. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com Sefarose de proteína A (Pharmacia Piscataway, N.J.) para purificar a proteína. Após troca do tampão para PBS, a concentração pode ser determinada por métodos espectrofotométricos.
Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados ligam-se a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando-se reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, 111). Ligação MAb bionitilada pode ser detectada com uma sonda rotulada estreptavidina. Os anticorpos antitoxina podem ser ainda testados quanto à reatividade com a toxina por Western blotting.
Outros ensaios para medir a atividade dos anticorpos antitoxina incluem ensaios de neutralização. Os ensaios de neutralização in vitro podem medir a capacidade de um anticorpo inibir um efeito citopático nas células em cultura (vide Exemplo 3, abaixo). Ensaios in vivo para medir a neutralização da toxina são descritos nos Exemplos 5, 6 e 7 abaixo.
4. Composições Farmacêuticas e Kits
Em outro aspecto, a presente invenção provê composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, que incluem uma molécula de anticorpo aqui descrita ou sua parte de ligação ao antígeno, formuladas junto com um carreador farmaceuticamente aceitável.
“Carreadores farmaceuticamente aceitáveis” incluem quaisquer e todos os solventes, dispersão, meios, agentes isotônicos e de retardamento de absorção e similares, que sejam fisiologicamente compatíveis. Os carreadores podem ser adequados para administração ,5 intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, retal, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).
As composições doença inflamatória do intestino podem ser em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões líquidas, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e a aplicação terapêutica. Composições úteis são na forma de soluções injetáveis ou infusíveis. Um modo útil de administração é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal). Por exemplo, o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno pode ser administrada por infusão ou injeção intravenosa. Em outra forma de realização, o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.
As frases “administração parenteral” e “parenteralmente administrado”, como aqui usadas, significam modos de administração que não administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, íntratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intraestemal e infusão.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de manufatura e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma ou outra estrutura ordenada, adequada para alta concentração de anticorpo.
Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando-se o composto ativo (isto é, anticorpo e parte de anticorpo) na quantidade requerida em um apropriado solvente,com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como necessário, seguido por esterilização _5 filtrada. Genericamente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo dentro de um veículo estéril, que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos úteis da preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma sua solução previamente filtradaestéril. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.
Absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada incluindose na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Os anticorpos e partes de anticorpo aqui descritos podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e para muitas aplicações terapêuticas. Como será apreciado pelo artífice hábil, via e/ou o modo de administração variarão, dependendo dos resultados desejados.
Em certas formas de realização, um anticorpo ou sua parte de anticorpo, pode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ou um carreador comestível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser incluído em uma cápsula de gelatina de casca dura ou macia, comprimido em tabletes ou incorporado diretamente dentro da dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de tabletes ingeríveis , tabletes bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias e similares. Para administrar um composto da invenção por outra administração que não parenteral, pode ser necessário revestir ou coadministrar o composto com um material para evitar sua inativação. As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica.
Regimes de dosagens são ajustadas para prover a ótima resposta desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas durante o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. E especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária, como aqui usada, refere-se a unidades fisicamente distintas, adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados: cada unidade contém uma predeterminada quantidade de composto ativo calculada para produzir o desejado efeito terapêutico, em associação com o carreador farmacêutico requerido. A especificação para as formas unitárias de dosagem da invenção é ditada pelas e diretamente dependente das (a) características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido e (b) limitações inerentes na técnica de composição, tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Uma faixa exemplificativa, não limitativa para uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção é 0,1 - 60 mg/kg, por exemplo, 0,5 - 25 mg/kg, 1-2 mg/kg ou 0,75-10 mg/kg. Deve ser ainda entendido que para qualquer indivíduo particular, regimes específicos de dosagem devem ser ajustados durante o tempo, de acordo com a necessidade individual e o julgamento do profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições e essas faixas de dosagem dadas aqui são exemplificativas somente e não se destinam a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada.
Além disso, dentro do escopo da invenção estão kits incluindo um anticorpo anti-toxina ou sua parte de ligação ao antígeno. Os kits podem incluir um ou mais de outros elementos incluindo: instmções para uso; outros reagentes, por exemplo, um rótulo, um agente terapêutico ou um agente útil para quelar ou de outro modo acoplar um anticorpo a um rótulo ou agente terapêutico, ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração;
carreadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um indivíduo.
Várias combinações de anticorpos podem ser embaladas juntas. Por exemplo, um kit pode incluir anticorpos que se ligam à toxina A (por exemplo, anticorpos que incluem as regiões de cadeia pesada e leve variáveis de 3D8) e anticorpos que se ligam à toxina B (por exemplo, anticorpos anti-toxina B monoclonais humanos, por exemplo, 124 - 152, 2A11 e/ou IG10, ou antissoros policlonais reativos com toxina B). Os anticorpos podem ser misturados entre si ou embalados separadamente dentro do kit.
Instruções para uso podem incluir instruções para aplicação terapêutica, incluindo dosagens sugeridas e/ou modos de administração, por exemplo, em um paciente com um sintoma de CDAD. Outras instruções podem incluir instruções sobre acoplamento do anticorpo a um quelador, um rótulo ou um agente terapêutico, ou para purificação de um anticorpo conjugado, por exemplo, de componentes de conjugação não-reagidos.
O kit pode incluir um rótulo detectável, um agente terapêutico e/ou um reagente útil para quelar ou de outro modo acoplar um rótulo ou agente terapêutico ao anticorpo. Agentes de acoplamento incluem agentes tais como N-hidroxissuccinimida (NHS). Em tais casos, o kit pode incluir um ou mais de um vaso de reação para realizar a reação ou um dispositivo de separação, por exemplo, uma coluna cromatográfica, para uso na separação do produto acabado dos materiais de partida ou intermediários de reação.
O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional, tal _5 como um agente diagnóstico ou terapêutico, p.ex., um agente diagnóstico como aqui descrito e/ou um ou mais anticorpos adicionais anti-toxina ou antiC. difficile (ou suas partes) formulados como apropriado, em uma ou mais preparações farmacêuticas separadas.
Outros kits podem incluir ácidos nucleicos otimizados,codificando anticorpos anti-toxina, e instruções para expressão dos ácidos nucleicos.
5. Métodos e Composições Terapêuticos
As novas proteínas e anticorpos têm utilidades terapêuticas, profiláticas e diagnosticas in vivo. Por exemplo, estes anticorpos podem ser administrados em células sem cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, in vivo, para tratar, inibir, evitar recaída e/ou diagnosticar C. difficile e doença associada com C. difficile.
Como aqui usado, o termo “indivíduo” é destinado a incluir animais humanos e não-humanos. A expressão “animais não-humanos” inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não-mamíferos, tais como primatas não-humanos,galinhas, camundongos, cães, gatos, porcos, vacas e cavalos.
As proteínas e anticorpos podem ser usados em células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, as células podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura e a etapa de contatar pode ser realizada adicionando-se o anticorpo anti-toxina ou seu fragmento ao meio de cultura.
Os métodos podem ser realizados em vírions ou células presentes em um indivíduo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ou profilático). Para formas de realização ín vivo, a etapa de contatar é realizada em um indivíduo e inclui administrar um anticorpo anti-toxina ou parte dele ao indivíduo sob condições eficazes para permitir ligação do anticorpo, ou parte, a qualquer toxina expressa por bactérias no indivíduo, por exemplo, no intestino.
Métodos de administrar moléculas de anticorpo são aqui descritos. Dosagens adequadas das moléculas usadas dependerão da idade e peso do indivíduo e do medicamento particular usado. As moléculas de anticorpo podem ser usadas como agentes competitivos para ligação de ligando, para inibir ou reduzir uma interação indesejável, por exemplo, para inibir a ligação de toxinas ao epitélio gastrintestinal.
Os anticorpos anti-toxina (ou suas partes de ligação de antígeno) podem ser administrados em combinação com outros anticorpos anti-C. difficile (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, garnmaglobulina policlonal). Combinações de anticorpos que podem ser usadas incluem uma anticorpo anti-toxina ou sua parte de ligação ao antígeno e um anticorpo anti-toxina B ou uma sua parte de ligação ao antígeno. O anticorpo anti-toxina A pode ser 3D8, um anticorpo que inclui as regiões variáveis de 3D8. O anticorpo anti-toxina B pode ser 124-152, 2A11, 1G10 ou um anticorpo com regiões variáveis pelo menos 90% idênticas às regiões variáveis do precedente, por exemplo, 124-152. Combinações de anticorpos anti-toxina A (por exemplo, 3D8) e anti-toxina B (por exemplo, 124-152) podem fornecer potente inibição de CDAD.
Deve ser entendido que quaisquer dos agentes da invenção, por exemplo, anticorpos anti-toxina A ou antí-toxina B, ou seus fragmentos, podem ser combinados, por exemplo, em diferentes relações ou quantidades, para efeito terapêutico aperfeiçoado. Na realidade, os agentes da invenção podem ser formulados como uma mistura ou química ou geneticamente ligados usando-se técnicas reconhecidas na técnica, desse modo resultando em anticorpos covalentemente ligados (ou fragmentos de anticorpo covalentemente ligados), tendo propriedades de ligação tanto em anti-toxina A como em anti-toxina B. A formulação combinada pode ser guiada por uma determinação de um ou mais parâmetros, tais como a afinidade, avidez ou eficácia biológica do agente sozinho ou em combinação com outros agentes que aumentam o acesso, meia-vida ou estabilidade do agente terapêutico no alvejamento, depuração e/ou seqüestro de C. difficile ou um seu antígeno.
Tais terapias de combinação são preferivelmente aditivas e mesmo sinérgicas em sua atividade terapêutica, por exemplo, na inibição, prevenção (por exemplo, recaída) e/ou tratamento de doenças relacionadas com C. difficile (vide, por exemplo, Exemplo 16, que mostra a eficácia de terapias anticorpo únicas e combinadas). A administração de tais terapias de combinação pode diminuir a dosagem do agente terapêutico (por exemplo, anticorpo ou mistura de fragmentos de anticorpo, ou anticorpo biespecífico reticulado ou geneticamente fundido ou fragmento de anticorpo) necessária para obter-se o desejado efeito.
As composições imunogênicas que contêm uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma toxina, ou seus fragmentos, são aqui descritas e podem ser usadas na geração de anticorpos anti-toxina. Epítopos imunogênicos de uma seqüência de toxina podem ser identificados de acordo com os métodos conhecidos na técnica e proteínas ou fragmentos contendo aqueles epítopos podem ser supridos por vários meios em uma composição de vacina, composições adequadas podem incluir, por exemplo, lipopeptídeos (por exemplo, Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341 (1995)), composições de peptídeo encapsuladas em microesferas de poli(DL-lactida-co-glicolida) (“PLG”) (vide, por exemplo, Eldridge et al., Molec. Immunol. 28: 287 - 94 (1991); Alonso et al., Vaccine 12: 299 - 306 (1994); Jones et al., Vaccine 13:675 (11995)), composições de peptídeo contidas em complexos imuno estimulantes (ISCOMS) (vide, por exemplo, Takahashi et al., Nature 344: 873 - 75 (1990));
Hu et al., Clin. Exp. Immunol. 113: 235 - 43 (1998)) e múltiplos sistemas de antígeno peptídeo (MAPs) (vide, por exemplo, Tam, Proc. Nat. Acad. Sei USA 85: 5409 - 13 (1988); Tam, J. Immunol. Methods 196: 17-32 (1996)).
Veículos úteis que podem ser usados com composições imunogênicas da invenção são bem conhecidas e incluem, por exemplo, tiroglobulina, albuminas tais como albumina de soro humano, toxóide de tétano, ácidos poliamino, tais como poli L-lisina, ácido poli L-glutâmico, influenza, proteína de núcleo de vírus da hepatite B e similares. As composições podem conter um diluente fisiologicamente tolerável (isto é, aceitável), tal como água ou solução salina, tipicamente solução salina tamponada com fosfato. As composições e vacinas também tipicamente incluem um adjuvante. Adjuvantes tais como adjuvante de Freund incompleto, fosfato de alumínio, hidróxido de amônio ou alume são exemplos de materiais bem conhecidos na técnica. Adicionalmente, as respostas CTL podem ser imprimadas conjugando-se toxinas (ou fragmentos, derivados inativos ou seus análogos) com lipídeos, tais como tripalmitoil-Sglicerilcisteinil-seril-serina (P3CSS).
Os anticorpos anti-toxina podem ser administrados em combinação com outros agentes, tais como composições para tratar CDAD. Por exemplo, terapêuticos que podem ser administrados em combinação com anticorpos anti-toxina incluem antibióticos usados para tratar CDAD, tais como vancomicina, metronidazol ou bacitracina. Os anticorpos podem ser usados em combinação com agentes probióticos, tais como Saccharomyces boulardii. Os anticorpos podem também ser administrados em combinações com uma vacina de C. difficile, por exemplo, uma vacina toxóide.
6. Outros Métodos
Um anticorpo anti-toxina (por exemplo, anticorpo monoclonal) pode ser usado para detectar a toxina (por exemplo, em uma amostra de fezes), por exemplo, para avaliar as amostras quanto à presença de C. difficile.
Os anticorpos anti-toxina podem ser usados diagnostícamente para monitorar níveis da toxina em tecido, como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Exemplificação
Por todos os exemplos, os seguintes materiais e métodos foram 5 usados, a menos que de outro modo citado.
Materiais e Métodos
Em geral, a prática da presente invenção emprega, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais de química, biologia molecular, tecnologia de DNA recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia anticorpo) e técnicas padrão na preparação de polipeptídeo. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series,
169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual,
Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992).
EXEMPLOS
A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.
Exemplo 1. Geração de Anticorpos Monoelonais Anti-Toxina A
Toxina C. difficile foi obtida da Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com dialdeído-UDP reativo, que resulta em alquilação de resíduos catalíticos, enquanto preservando a estrutura da toxina nativa. Para protocolo detalhado, vide Genth et al., Infi e Immun. 68(3):1094 - 1101, 2000. Resumidamente, a toxina A purificada foi incubada com UDP-2’,3’-dialdeído (0,1 - 1,0 mM) em tampão por 18 h a 37 °C, filtrada através de um filtro de corte de 100 kDa para remover UDP-2’-3’-dialdeído não-reagido e lavado com tampão. A toxina A inativada (toxóide A) foi usada para imunização.
Camundongos transgênicos HCo7, gerados como descrito acima na seção intitulada “Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos em
Camundongos HuMAb” e supridos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes cada com 10 ug de toxóide em adjuvante RIBI. Nos camundongos transgênicos HCo7, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno foi homozigotamente rompido como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811 - 820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi homozigotamente rompido como descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. O camundongo transgênico HCo7 contém um transgene de cadeia leve kappa humano, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 e o transgene de cadeia pesada humano HCo7 como descrito nas Patentes U.S.
5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. Soro foi coletado de cada camundongo e testado quanto à reatividade à toxina A por ELISA e neutralização de citotoxicidade em células IMR-90. Os camundongos que testaram positivo para a toxina A-reativa e antissoro neutralizante foram injetados com 5-10 qg de toxóide A através da veia da cauda. Os camundongos foram sacrificados e os baços foram isolados para fusão a hibridomas aproximadamente 3 dias após injeção na veia da cauda ter sido realizada.
Os hibridomas clonais foram gerados e avaliados por ELISA. Percentagens de clones kappa/gamma positivos de cadeia leve, específicos de antígeno e neutralizantes, identificados avaliando-se os clones gerados por quatro fusões de hibridoma separadas, são listadas na Tabela 5.
Tabela 5
Fusão % kappa/gamma positiva % específica antígeno % neutralização
1 5,7 (94/1632) 3,4 (56/1632) 0,7 (12/1632)
2 0,2 (1/384) 0 (0/384) 0 (0/384)
3 1,8 (14/768) 0,39 (3/768)
4 4,4 (43/960) 1,7 (17/960)
Três clones de hibridoma foram selecionados para mais análise: 3D8, 1B11 e 33.3H2. CDNAs de cada clone foram amplificados por RT-PCR de mRNA, clonados e seqüenciados. Uma seqüência de consenso da região V de cadeia pesada foi constatada para cada clone. Todos três clones utilizaram uma região VH derivada do mesmo gene da região V da linha germinativa (VH 3-33), porém utilizaram diferentes seqüências J. As seqüências de aminoácido das regiões VH e VL de cada clone são mostradas na Figura 1 (SEQ. ID NOS: 1 - 6). As regiões determinantes da complementaridade (CDRs) são riscadas por cima na Figura.
Análise da seqüência dos genes kappa V (cadeia leve Vk) revelou que cada HuMAb 1B11 e 33.3H2 expressou uma seqüência V de cadeia kappa e consenso. O hibridoma 1B11 expressou uma cadeia leve Vk, derivada do gene de linha germinativa L6 Vk, enquanto que o hibridoma 33.3H2 expressou uma cadeia leve Vk derivada do gene de linha germinativa LI5 Vk, Na análise dos clones Vk, as cadeias leves HuMAb 3D8, 6 (I-VI) foram expressas no nível mRNA (Figura 1). Para determinar quais das cadeias leves forem expressas no nível de proteína, espectroscopia de massa e seqüenciamento de terminal-N do anticorpo 3D8 purificado foram realizados. Quando cadeias leves foram isoladas da proteína celular e analisadas por espectroscopia de massa, uma única cadeia leve foi vista com uma massa de 23.569 Daltons. Isto correspondeu à cadeia leve com a seqüência do aminoácido do grupo I representado na Figura 1, que é derivado do gene de linha germinativa LI9 Vk. O seqüenciamento do terminal-N da cadeia leve confirmou este resultado. As Figuras 2A, 3A e 4A representam o nucleotídeo e as seqüências de aminoácido de Vk de cada 3D8 (grupo I; SEQ ID NOs: 4 e 30-34), 1B11 (SEQ ID NO: 5) e 33.3H2 (SEQ ID NO: 6), respectivamente. As CDRs são riscadas pro cima e a linha germinativa Vk e Jk são mostradas.
Assim, o anticorpo 3D8 compreende uma região variável de cadeia pesada, que é o produto de ou derivado de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve, que é o produto de ou derivada de um gene L19 Vk humano. O anticorpo 1B11 compreende uma região variável de cadeia pesada, que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve, que é o produto de ou derivada de um .5 gene L6 Vk humano. O anticorpo 33.3H2 compreende uma região variável de cadeia pesada, que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene L15 Vk humano.
Os anticorpos 3D8 e 1B11 expressam regiões constantes de
IgGl humano e o anticorpo 33.3H2 expressa regiões constantes IgG3 humano. Os anticorpos descritos nos Exemplos 2-7 foram isolados destes hibridomas e, assim, expressam as seqüências variáveis mostradas na Figura 1, juntamente com regiões constantes humanas. O DNA codificando a parte de ligação ao antígeno de cada clone foi clonado em um vetor a ser expresso como um anticorpo humano para administração em humanos.
Exemplo 2. Atividade de Ligação de Anticorpos Anti-Toxina A
A ligação de cada anticorpo à toxina A foi determinada por ELISA utilizando-se técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados na Figura 5. Os anticorpos produzidos por 3D8, 1B11 e 33.3H2 foram comparados com um quarto anticorpo monoclonal humano com atividade de ligação na toxina A, 8E6. A Figura 5 mostra que os anticorpos ligam-se à toxina A com afinidades comparáveis.
A afinidade dos anticorpos 3D8 e 1B11 para a toxina A foi também medida com instrumento Biacore®, que detecta interações de ligação biomoleculares com tecnologia de ressonância plásmon de superfície. Cada anticorpo foi adicionado aos chips de sensor revestido com proteína A, e toxina A foi permitida escoar através do chipe para medir ligação. 3D8 tinha um KD de 14,6 X 1015 m. 1B11 tinha um KD de 7,38 χ 10'!o M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina A. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para uso em terapia humana.
Exemplo 3. Neutralização de Toxina por Anticorpos Anti-Toxina A
Os anticorpos expressos pelos hibridomas 1B11, 3D8 e
Λ t5 33.3H2 foram testados quanto à atividade de neutralização da toxina A in • vitro. As células foram incubadas na presença de concentrações variáveis de toxina A, que fazem que as células arredondem para cima e percam aderência nos pratos de cultura de célula. O efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual das células. Uma contagem CPE de 0 - 4 foi determinada, baseada nos resultados da inspeção visual (4 = 100% citotoxicidade, 0 - 0% toxicidade). Os resultados destes ensaios são representados nas Figuras 6A e 6B. Neutralização de toxicidade contra uma linhagem de célula de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90, e uma linhagem de célula epitelial de intestino humano, T-84, foi determinada. A Figura 6A mostra que todos os anticorpos tinham capacidade neutralizante em relação às células IMR-90. A atividade neutralizante relativa da citotoxicidade da toxina A sobre as células IMR-90 foi 1B11 > 3H2 > 3D8. Interessantemente, a atividade neutralizante relativa foi 3D8 >1B11> 3H2 contra células T-84,que são células epiteliais colônicas humanas (Fig, 6A). As células T-84 acredita-se serem mais sensíveis à toxina
A do que outros tipos de células. As células T-84 podem prover uma célula alvo mais relevante, para determinar a citotoxicidade da toxina A.
Exemplo 4. Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-Toxina A
O epítopo da toxina A ligado por cada anticorpo monoclonal foi determinado por Western blotting. Foram construídos clones E. coli recombinantes que expressam quatro fragmentos de toxina A representando o domínio enzimático (isto é, aminoácidos 1-659 da toxina A), o domínio de ligação de receptor (isto é, aminoácidos 1853 - 2710 da toxina A) e as duas regiões do meio (isto é, aminoácidos 660 - 1255 e 1256 - 1852 da toxina A). Os segmentos apropriados do gene da toxina A foram amplificados pro PCR de DNA genômico, preparados de cepa C. difficile ATCC 43255. Os fragmentos foram clonados empregando-se um vetor pET e transformados em células BL21 DE3 para expressão. O vetor fornece domínios de expressão e afinidade indutíveis para purificação (isto é, um marcação-His) e detecção (isto é, marcação epítopo V5). A expressão foi induzida com IPTG e fragmentos foram purificados por cromatografia de afinidade. A ligação a quatro diferentes fragmentos de toxina A foi medida: fragmento 1 correspondeu a aminoácidos 1-659; fragmento 2 correspondeu a aminoácidos 660-1255; fragmento 3 correspondeu a aminoácidos 1256 -1852; e fragmento 4 correspondeu aos aminoácidos 1853 - 2710 (Figura 7), 1B11 reagiu com os fragmentos 1 e 2. 33.3H2 reagiu com o fragmento 2. 3D8 e outro anticorpo monoclonal humano, 6B4, reagiu com fragmento 4 (o domínio de ligação de receptor). Um antissoro policlonal de coelhos imunizados com toxóide A reagiu com todos quatro fragmentos.
Os epítopos 1B11 e 33.3H2 foram mapeados com mais detalhes. Para mapear o epítopo 1B11, subfragmentos do fragmento 1 (aminoácidos 1-659), correspondendo aos aminoácidos 1-540,1-415, 1-290 e 1-165 foram gerados (Figura 8A). 1B11 ligou-se ao fragmento 1 e ao fragmento contendo os aminoácidos 1-540. 1B11 não ligou-se aos outros subfragmentos. Portanto, o epítopo ligou-se por mapas 1B11 entre os aminoácidos 415 - 540 da toxina A.
Para mapear o epítopo 33.3H2, subfragmentos do fragmento 2 (aminoácidos 660 - 1255), correspondendo aos aminoácidos 660-1146, 6601033, 660-920 e 660-807, foram gerados (Figura 8B). 33.3H2 ligou-se aos fragmentos correspondendo aos aminoácidos 660-1255, 660-1146 e 6601033. 33,3H2 não se ligou aos outros subfragmentos. Portanto, o epítopo ligado por 33.3H2 mapeia entre os aminoácidos 920-1033 da toxina A. Exemplo 5. Proteção de Camundongos da Provocação da Toxina A Letal, pela Administração de Anticorpos Anti-Toxina A
Cada anticorpo foi testado quanto à capacidade de proteger camundongos da provocação com uma dose letal de toxina A. Camundongos fêmeas Swiss Webster, cada um pesando 10 - 20 g, foram injetados intraperitonealmente com até 250 pg de 3D8, 1B11 ou 33.3H2, ou um e
anticorpo de controle (anticorpo de vírus sincicial anti-respiratório, Medlmmune) antes da provocação com toxina A. Aproximadamente 24 h após injeção, os camundongos foram provocados com uma dose de toxina A maior do que 10 vezes a dose letal (LD50), tipicamente 100 ng. Os animais foram observados quanto a sinais de toxicidade durante os próximos 7 dias.
Os resultados destes experimentos são resumidos na Figura 9. Os dados são expressos como sobrevivência percentual. Os números em parênteses referem-se a dose anticorpo, se uma dose que não 250 pg fosse dada. A Figura 9 mostra que cada um dos anticorpos foi capaz de proteger os camundongos da provocação com toxina letal A em algum grau. A percentagem de camundongos sobrevivendo, quando tratados com 3D8 variou de 10-100 por cento. A percentagem de camundongos sobrevivendo, quando tratados com 33.3H2, variou de 20 - 100 por cento. A percentagem de camundongos sobrevivendo, quando tratados com 1B11 variou de 0 - 60 por cento. A capacidade relativa destes monoclonais protegerem os camundongos foi de 3H2 > 3D8 > 1B11.
Exemplo 6. Neutralização da Enterotoxicidade da Toxina A em Alças
Intestinais de Camundongo Ligadas com Anticorpos Anti-Toxina A
Anticorpos 3D8 e 33.3H2 foram testados quanto à neutralização da enterotoxicidade da toxina A em um modelo de alça ileal de camundongo. Este modelo mede o acúmulo de fluido induzido pela toxina A em intestino de camundongo. Para realizar estes experimentos, cada camundongo foi jejuado por 16 h, anestesiado e o íleo próximo ao ceco foi exposto. Uma alça de 3 a 5 centímetros foi duplamente ligada em cada extremidade e injetada com 10 pg de toxina A. A alça ileal foi retomada para a cavidade abdominal, o ferimento foi fechado e o animal foi permitido recuperar-se. Quatro horas após cirurgia, o animal foi eutanasiado e a alça foi removida do animal. O comprimento de cada segmento foi medido novamente e o fluido intraluminal foi extraído. O volume do fluido e a relação ,5 de volume-para-comprimento (V:L) em mililitros por centímetro foram calculados para cada alça. Os camundongos de teste foram injetados com anticorpo parenteralmente 1 - 2 dias antes da cirurgia. Os resultados dos experimentos são representados na Figura 10. Injeção com toxina A aumentou a relação peso para comprimento de fluido intestinal perto de 50%. Tanto 3D8 como 33.3H2 evitaram este aumento de acúmulo de fluido. Os camundongos administrados com qualquer um dos anticorpos tiveram uma relação de peso para comprimento comparável com os camundongos que não receberam qualquer injeção de toxina A. Portanto, 3D8 e 33.3H2 protegeram do acúmulo de fluido intestinal in vivo.
Estes resultados indicam que os anticorpos monoclonais antitoxina A protegem da enterotoxicidade mediada pela toxina-A in vivo. Os dados da alça ligada ao camundongo mostram que estes anticorpos monoclonais podem proteger de avaria mucosa, quando administrados sistemicamente.
Exemplo 7. Proteção de Hamsters de Recaída de C. difficile com Anticorpos
Anti-Toxina A
3D8 foi testado em um modelo de recaída de hamster. Os hamsters são sensíveis aos efeitos tóxicos das toxinas C. difficile e tipicamente morrem dentro de 2 - 3 dias do recebimento de uma dose única de clindamicina, na presença de C. difficile. Para testar a eficácia de 3D8 em hamsters, um modelo de recaída foi usado. Neste modelo, os hamsters receberam uma dose de clindamicina e uma dose de esporos BI de C. difficile um dia mais tarde. Um conjunto de hamsters de controle não recebeu antibiótico ou anticorpo adicional. Um segundo conjunto de hamsters de controle foram tratados com 10 mg/kg/dia de vancomicina. A vancomicina é um antibiótico usado no tratamento de doença de C. difficile. Como mostrado na Figura 11 A, um conjunto de teste de hamsters recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 2 mg/kg/dia de um antissoro policlonal de coelho contra toxina .5 A cada dia por sete dias após exposição a C. difficile, como indicado pelas setas da figura. Um segundo conjunto de teste de hamsters recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 50 mg/kg/dia de 3D8 nos mesmos intervalos de tempo, A sobrevivência dos hamsters foi plotada versus tempo e é mostrada na Figura 11B,
A Figura 11B mostra que todos os hamsters que receberam somente clindamicina e C. difficile (losangos) morreram dentro de dois dias da provocação com as bactérias. Doze por cento (2/17) de hamsters tratados com vancomicina (quadrados) sobreviveram à provocação com bactérias; oitenta e oito por cento (15/17) morreram dentro de oito dias. Quarenta e um por cento (7/17) dos hamsters tratados com vancomicina e 3D8 (cruzes) sobreviveram à provocação; cinqüenta e nove (10/17) por cento morreram dentro de sete dias. Sessenta e quatro por cento (7/11) de hamsters tratados com vancomicina e soro de coelho policlonal (triângulos) sobreviveram à provocação com bactérias; trinta e seis por cento (4/11) morreram dentro de nove dias. Estes dados são também representados na Figura 12 como a percentagem de sobreviventes totais em cada grupo de tratamento. Como mostrado na figura, a percentagem de sobreviventes foi mais elevada (sessenta e quatro por cento) no grupo recebendo vancomicina e soro de coelho policlonal. O grupo recebendo 3D8 e vancomicina tinha a segunda mais elevada taxa de sobrevivência (quarenta e um por cento). Somente doze por cento de hamsters tratados com vancomicina sobreviveram. Todos aqueles sem tratamento morreram. Estes dados mostram que os anticorpos anti-toxina policlonais e monoclonais protegeram de recaída da doença de C. difficile in vivo, quando administrados após infecção.
Exemplo 8. Produção de Anticorpos Anti-Toxina A para Administração em
Humanos
Seqüências de ácido nucleico, codificando a cadeia pesada e cadeias leves variáveis do anticorpo 3D8 foram clonadas em um vetor pIEA
UgammalF, empregando-se metodologia de DNA recombinante padrão. O vetor foi amplificado em E. coli, purificado e transfectado em células CHOdg44. As células transfectadas foram revestidas a 4 x 105 células por poço em um prato de 96-poços e selecionadas para transfecção de vetor com G418. Um clone, designado 1D3, foi originalmente selecionado por resistência a
G418, em seguida ensaiado juntamente com outros transfectomas para produção de IgG. ID3 tinha um nível mais elevado de produção de IgG em relação a outros transfectantes, durante diversas ciclos de expansão. A expressão do anticorpo 3D8 foi amplificado por crescimento na presença de concentrações crescentes de metotrexato. Uma cultura capaz de crescimento em metotrexato 175 nM foi escolhida para clonar células únicas para mais desenvolvimento. O revestimento de cultura em placas de 96 poços a baixa densidade permitiu a geração de culturas originando-se de uma única célula ou clones. As culturas foram avaliadas quanto à produção de IgG humano e a célula que produziu o nível mais elevado de IgG foi selecionada para mais uso. O clone amplificado com metotrexato foi expandido para produzir um banco de células incluindo múltiplos frascos congelados de células.
Para preparar anticorpos de células transfectadas, as células de um clone isolado nas etapas anteriores foram cultivadas e expandidas como inóculo para um bio-reator. O bio-reator tipicamente contém um volume de
500 litros de meio de cultura. As células foram cultivadas no bio-reator até a viabilidade de células cair, o que indica que uma concentração de anticorpo máxima foi produzida na cultura. As células são removidas por filtragem. O filtrado é aplicado a uma coluna de proteína A. Os anticorpos ligam-se à coluna e são eluídos com uma lavagem de baixo pH. Em seguida, os anticorpos são aplicados a uma coluna de Sefarose-Q, para remover contaminantes residuais, tais como proteínas de célula CHO, DNA e outros contaminantes (por exemplo, contaminantes virais, se presentes). Os anticorpos são eluídos da coluna de Sefarose-Q, nano-filtrados, concentrados .5 e lavados em um tampão tal como PBS. A preparação é então assepticamente aliquotada para dentro de frascos para administração.
Exemplo 9. Preparação e Caracterização de Anticorpos Policlonais AntiToxina B
Duas cabras Nubianas (#330 e #331) foram injetadas intramuscularmente com 50 pg de toxina B inativada com dialdeído UDP (Techlab) e adjuvante de Freund completo. Doses de reforço de 25 pg de toxóide B com adjuvante incompleto de Freund foram dadas intramuscularmente em intervalos de 2-semanas. Os sangramentos de teste foram obtidos após 4 imunizações. A reatívidade e neutralização da citotoxicidade por ELISA contra tanto toxina A como toxina B foram ensaiadas para medir a especificidade e reatívidade cruzada dos soros.
Ambos os animais responderam bem à toxina B e em uma menor extensão à toxina A, conforme medido por ELISA. Os soros de cabra #331 tiveram menos reatívidade cruzada à toxina A e foram escolhidos para a maior parte dos experimentos subseqüentes. A neutralização da citotoxicidade foi escolhida para a maior parte dos experimentos subseqüentes. A neutralização da citotoxicidade para as células IMR-90 foi determinada como descrito no Exemplo 3. Os resultados da neutralização da citotoxicidade são representados na Figura 13, o que mostra que os soros de ambos os animais exibiram bons títulos de anticorpo neutralizantes da toxina B e muito baixos, porém detectáveis, títulos de anticorpo neutralizantes da toxina A. A capacidade dos soros de cabra protegerem camundongos de uma provocação intraperitoneal letal com toxina B (100 ng) foi também confirmada (dados não mostrados).
Exemplo 10. Proteção de Hamsters de Recaída de C, difficile com Anticorpos de Ant-itoxina A e Anti-toxina B
Grupos de hamsters (n = 20) foram provocados com clindamicina e C. difficile e então tratados com vancomicina, como descrito no modelo de recaída de hamster do Exemplo 7. Anticorpos (3D8, soro de cabra #331, ou 3D8 e soro de cabra #331) foram fornecidos duas vezes diariamente após tratamento com vancomicina (Figura 14). Os animais foram monitorados quanto à sobrevivência (Figura 15) ou doença (Figura 16). As doses anticorpo foram 1 ml duas vezes diariamente para soro de cabra #331 e 3 mg para 3D8 dados duas vezes diariamente. Os animais recebendo vancomicina somente (isto é, nenhum tratamento com anticorpo) serviram como controles negativos. Como observado anteriormente, tratamento com 3D8 e vancomicina somente demonstrou um efeito protetor parcial, em que 10 em cada 20 animais foram protegidos da letalidade (Fig. 15). Cinquenta por cento de animais deste grupo permaneceu saudável (Fig. 16). Seis em cada 20 animais recebendo tratamento com vancomicina apenas foram protegidos (Fig. 15). Trinta por cento permaneceram saudáveis (Fig. 16). Proteção parcial (9/20 animais protegidos) foi também observada quando o soro de cabra foi usado sozinho (Fig. 15). Quarenta por cento permaneceram saudáveis. A proteção foi aumentada para próximo de 100%,quando tanto soro de cabra como 3D8 foram dados juntos (18/20) e o início da doença foi retardado (Fig. 15). Noventa por cento destes animais permaneceram saudáveis (Fig. 16), Claramente, proteção da doença seguiu um padrão similar à proteção da letalidade. Estes dados demonstram que 3D8 pode ser totalmente protetor no modelo de doença de Hamster, quando a toxina B é também neutralizada.
Exemplo 11. Proteção de Hamsters de Recaída de C. difficile em Hamsters
Imunizados com Toxina B
Os hamsters foram imunizados intraperitonealmente com 10 |ug do fragmento terminal-COOH da toxina B (correspondendo aos aminoácidos 1777-2366 da toxina B), expresso em E. coli e empregando-se RIBI como adjuvante. Os animais receberam 7 doses de antígeno de toxina B. Respostas anticorpo neutralizantes foram observadas nos animais que foram testados. Grupos de hamsters imunizados foram provocados com clindamicina e C. difficile então tratada com vancomicina, como descrito no modelo de hamster de recaída do Exemplo 7. O anticorpo (3D8, 3 mg/dose) foi dado duas vezes diariamente após tratamento com vancomicina a 19 animais e comparado com um grupo de controle negativo (n = 20), que não recebeu tratamento (Figuras 17 e 18). Seis animais foram provocados sem tratamento com vancomicina, para assegurar que os hamsters imunizados com antígeno de toxina B eram susceptíveis a infecção por C. difficile. Os animais foram monitorados quanto à sobrevivência (Figura 17) ou doença (Figura 18). A Figura 17 mostra que os animais imunizados, que não receberam 3D8, recaíram em uma taxa similar àquela observada anteriormente (65% de recaída). Os animais imunizados com Toxina B recebendo 3D8 foram mais totalmente protegidos de recaída do que observado anteriormente (10% de recaída, em comparação com aproximadamente 50% de recaída em animais não anteriormente imunizados com toxina B em outros experimentos).
A Figura 18 mostra que alguns dos animais imunizados, recebendo 3D8, ficaram doentes, porém recuperaram-se da diarréia. Trinta e nove por cento dos animais imunizados recebendo vancomicina apenas permaneceram saudáveis. Nos experimentos em que os soros reativos da toxina B não estavam presentes nos animais, virtualmente todos os animais que tiveram diarréia morreram mais tarde. Estes dados fornecem mais evidência de que 3D8 pode ser totalmente protetor no modelo de doença de hamster, quando a toxina B é também neutralizada. A neutralização da toxina B, além da toxina A, foi necessária para proteção ótima da doença C. difficile neste modelo.
Exemplo 12. Proteção de Hamsters de Provocação Primária pro C. difficile,
Empregando-se 3D8 em Hamsters Tratados com Soros Anti-Toxina B de Cabra
Prevenção de recaída de doença de C. difficile nos hamsters foi mais fácil de demonstrar do que proteção de provocação direta (isto é, provocação sem administração de vancomicina). Os experimentos com soros de coelho demonstraram somente fraca proteção de provocação direta e 3D8 não teve efeito detectável sobre provocação direta. Uma vez que 3D8 era mais protetor em um fundo de anticorpos neutralizadores de toxina B, foi determinado se a administração combinada de 3D8 e antissoros anti-toxina B podia evitar doença devida a provocação direta. Grupos de 5 hamsters foram provocados após receberem uma vez diariamente doses de 3D8 (3 mg), soros de 3D8 (3 mg) e de cabra #331 (1 ml) combinados, ou nenhum anticorpo durante os 3 dias antes da provocação, como representado na Figura 19. Os dados da Fig. 20 mostram que os animais não recebendo anticorpos ou soros 3D8 ou de cabra apenas todos morreram com 48 h de provocação com C. difficile. A maior parte dos animais (80%) recebendo soros 3D8 como de cabra sobreviveram e os animais afetados sobreviveram por 10 dias após a provocação. A Fig. 21 mostra que os animais tratados com soros 3D8 e de cabra adoeceram mas se recuperaram. Estes dados fornecem mais evidência de que 3D8 pode ser totalmente protetor no modelo de doença de hamster, quando toxina B e também neutralizada. A neutralização da toxina B, além da toxina A, foi necessária para proteção ótima de doença de C. difficile neste modelo.
A proteção bem sucedida de hamsters diretamente provocados com C. difficile oferece diversas vantagens para a avaliação dos novos candidatos de toxina B. Números menores de animais podem ser usados, uma vez que 100% dos animais não tratados morreram. Anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos) podem ser avaliados diretamente em hamsters, porque o procedimento requer 100 mg ou menos do anticorpo de teste. Outros modos de teste, tais como o modelo de recaída, requerem o esforço de produzir quantidades em grama, devido à baixa taxa de ataque no modelo de recaída, que necessita testar ,5 números maiores de animais. Experimentos de provocação direta são também de duração mais curta com uma leitura definitiva dentro de 3 - 4 dias de provocação com C. difficile, em comparação com 7 -10 no modelo de recaída. Além disso, a eliminação de tratamento com vancomicina pelo método de avaliação reduz o número de vezes que os animais são manuseados.
Exemplo 13. Geração de Anticorpos Monoclonais Anti-Toxina B
A toxina B de C. difficile foi obtida de Techlab, Inc.
(Blacksburg, Va) ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com dialdeído-UDP reativo, o que resulta na alquilação de resíduos catalíticos, enquanto preservando a estrutura da toxina nativa. Resumidamente, a toxina purificada B foi incubada com dialdeído-UDP-2’,3’ (0,1 - 1,0 nM) em tampão por 18 h a 37 °C, filtrado através de um filtro de corte-100 kDa, para remover dialdeído-UDP-2’,3’ não reagido e lavada com tampão. A toxina B inativada (toxóide B) ou fragmentos de toxina B recombinante foram usados como Imunogenos. O domínio de ligação do receptor da toxina B (resíduos aminoácidos 1777-2366) foi expresso em E. coli como uma proteína de fusão contendo um imuno-marcador (hexaistadína) para purificação de afinidade empregando-se cromatografia de afinidade de quelato de níquel (designado fragmento 4; vide Exemplo 11).
Camundongos transgênicos Hcol2, gerados como descrito acima na seção intitulada “Geração de Anticorpos Monoclonais Humanos em
HuMAb” e supridos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes cada um com 10 pg de toxóide em adjuvante RIBI. Nos camundongos transgênicos Hcol2, o gene de cadeia leve kappa de camundongo endógeno tinha sido homozigotamente rompido como descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811 - 820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno tinha sido homozigotamente rompido como ,5 descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Os camundongos
- transgênicos Hcol2 contém um transgene de cadeia leve kappa humano,
KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996), Nature Biotechnology 14: 845 - 851 e o transgene de cadeia pesada humana Hcol2, como descrito nas Patentes U.S. 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. Soro foi coletado de cada camundongo e testado quanto à reatividade à toxina B por ELISA e neutralização da citotoxicidade em células IMR-90, Os camundongos que testaram positivo para reativo-toxina B e antissoro neutralizante foram injetados com 5 - 10 pg de toxóide B ou fragmento 4 através da veia da causa. Os camundongos foram sacrificados e os baços foram isolados para fusão em hibridomas aproximadamente 3 dias após injeção da veia da cauda ser realizada.
Hibridomas clonais foram gerados e avaliados por ELISA.
Três clones de hibridoma foram selecionados para mais análise: 124-152; 2A11; e IG10. Em particular, cDNAs do clone 124-152 foram amplificados por RT-PCR de mRNA, clonados e seqüenciados. A região V de cadeia pesada foi determinada ser derivada da seqüência da linha germinativa VH 551, a região D derivada da seqüência da linha germinativa 7-27 e a seqüência J da região da linha germinativa JH3b. As regiões de cadeia leve (kappa) foram determinadas serem derivadas de A27 e a região J de JK1. O isotipo do clone 124-152 foi determinado ser IgGl. As seqüências de aminoácido das regiões VH e VL do clone 124 - 152 são mostradas nas Figuras 27--28. As regiões determinantes da complementaridade (CDRs) são indicadas nas Figuras. As seqüências da linha germinativa relacionada das regiões VH e VL são mostradas nas Figuras 30-31.
Os anticorpos 124 - 152; 2A11; e IG10 foram isolados dos correspondentes hibridomas e testados quanto a suas características de ligação (infra) O DNA codificando o clone 124-152 foi clonado em um vetor para ser expresso como um anticorpo humano para administração em humanos. Exemplo 14. Atividade de Ligação de Anticorpos Anti-Toxina B
A ligação de cada anticorpo à toxina B foi determinada por
Biacore, empregando-se técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados na Tabela 6. Os anticorpos produzidos por 124-152; 2A11; e IG10 foram comparados com controles apropriados.
Em particular, a afinidade dos anticorpos 124-152; 2A11 e
IG10 para a toxina B foi medida com instrumento Biacore®, que detecta interações de ligação biomolecular com tecnologia de ressonância de plasmônio de superfície. Cada anticorpo foi adicionado a chips sensores revestidos com proteína A e a toxina B foi permitida fluir através do chip para medir a ligação. 124-152 tinha uma KD de 1,64 x ΙΟ'10 Μ; 2A11 tinha um KD de 0,25 x 10~10 M; e IG10 tinha uma Kd de 2,98 x 10’í0 M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina B. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para usar aplicação in vivo, por exemplo, terapia humana.
Tabela 6.
Amostra ID KDxlOlu (M) ka xlO5 (1/Ms) kd xlO5 (1/s)
2A11 0,24 21 5,07
124.152 1,64 34,5 56,4
51.1G10 2,98 1,31 3,89
Exemplo 15. Neutralização de Toxina por Anticorpos Anti-Toxina B
Os anticorpos expressos por hibridomas 124 - 152; 2A11; e
IG10 foram testados quanto à atividade de neutralização da toxina B in vitro.
As células foram incubadas na presença de concentrações variáveis de um anticorpo monoclonal específico para a toxina B, que evitariam que as células arredondassem para cima após exposição à toxina B. O efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual das células. Uma contagem CPE de 0 - 4 foi determinada, com base nos resultados da inspeção visual (4 = 100% de citotoxicidade, 0 = 0% de toxicidade). Os resultados destes ensaios são representados na Figura 27. Neutralização de toxicidade contra uma linhagem de célula de fibroblasto de pulmão humana, IMR-90. A Figura 27 .5 mostra que todos os anticorpos tinham capacidade neutralizante em relação às células IMR-90. A atividade neutralizante relativa da citotoxicidade da toxina A sobre as células IMR-90 foi de 124 - 152 > IG109 > 2a 11.
Exemplo 16. Proteção de Hamsters da Provocação de C. difficile Primária,
Empregando-se Anticorpos Anti-Toxina B
Proteção de provocação direta de um inóculo de C. difficile (clindamicina no dia 1 e esporos de C. difficile no dia 0 (diluição 1/100.000) foi realizada durante um período de 4 a 10 dias, na presença ou ausência de anticorpos anti-toxina B. Os grupos de 5 hamsters foram provocados após receber doses de uma vez diariamente de soros 3D8 (20 mg totais durante 4 dias), 3D8 combinado (Id.) e #331 de cabra (3 ml), 3D8 em combinação com anticorpos anti-toxina 124-152 (18 mg total durante 4 dias), 2A11 (20 mg totais durante 4 dias) ou IG10 (20 mg totais durante 4 dias) ou nenhum anticorpo por 3 dias antes da provocação, como representado na Figura 24. Os dados da Figura 24 mostram que os animais não recebendo anticorpos ou 3D8 ou soro de cabra apenas todos morreram dentro de 72 h de provocação C. difficile, enquanto que os animais recebendo 3D8 e um anticorpo anti-toxina B e, preferivelmente, em combinação com 124-152, tiveram uma taxa de sobrevivência de 40% (Figura 24). Um estudo de 10 dias, similar ao precedente (porém utilizando-se um inóculo C. difficile mais diluído) foi realizado com quantidades crescentes do anticorpo anti-toxina B 124-152 (0,56 mg, l,7mg ou 5,0 mg dados nos dias -3,-2, -1 e 0). Os animais recebendo tanto 3D8 como soro de cabra sobreviveram e a maioria dos animais (60% - 70%) sobreviveram por 10 dias após provocação, se recebessem 3D8 em combinação com 124-152. Mesmo a dosagem mais baixa do anticorpo anti-toxina B 124-152 (0,56 mg em combinação com 3D8) foi altamente eficaz (70% de sobrevivência; vide Figura 25). Os resultados mostram que 124 - 152 e 3D8, sozinhos, são menos eficazes então quando usados em combinação, onde um resultado terapêutico sinérgico, mais do que aditivo, na realidade, é conseguido (Figs. 24 - 26). Estes dados fornecem mais evidência de que o anticorpo anti-toxina B é altamente eficaz, especialmente em combinação com o anticorpo 3D8 anti-toxina A. A neutralização da toxina B, além da toxina A, foi determinada prover proteção de doença de C. difficile neste modelo. Exemplo 17. Mapeamento de Epítopo de Anticorpos Anti-Toxina B
O epítopo da toxina B ligada por cada anticorpo monoclonal foi determinado por Western blotting. Foram construídos clones de E. coli recombinantes que expressam fragmentos de toxina B representando diferentes domínios da toxina B. Os segmentos apropriados do gene da toxina B foram amplificados-PCR de DNA preparado por uma apropriada cepa C. difficile. Os fragmentos foram clonados em um vetor de expressão e expressos em E. coli. O anticorpo monoclonal humano 152 foi usado para sonda o fragmento da toxina B em Western blots, a fim de mapear o epítopo de ligação. Os fragmentos de proteína da Toxina B foram isolados de E. coli contendo uma porção dos genes de toxina B e separados usando-se SDSPAGE. Após eletroforese, os fragmentos de toxina B foram transferidos para nitrocelulose e sondados com anticorpo monoclonal 152, seguido por antihumano de cabra conjugado com fosfatase alcalina, para detectar ligação Mab 152. HuMab 152 foi determinado ligar-se à parte de fragmento -COOH da toxina B entre os aminoácidos 1777 e 2366 (vide, por exemplo, Fig, 32).
Outras Formas de Realização
Numerosas formas de realização da invenção foram descritas. Contudo, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem desvio do espírito e escopo da invenção. Portanto, outras formas de realização estão dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, que se liga especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C difficife), caracterizado (a) pelo fato de compreender uma CDR1 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:7, uma CDR2 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:8, uma CDR3 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:9, uma CDR1 de região de cadeia leve variável estalbelecida na SEQ ID NO: 16, uma CDR2 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO: 17, e uma CDR3 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO; 18,
  2. 2. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, que se liga especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C difficile), caracterizado (a) pelo fato de compreender uma CDR1 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 10, uma CDR2 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 11, uma CDR3 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 12, uma CDR1 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO: 19, uma CDR2 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO: 20, e uma CDR3 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO;2L
  3. 3. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, que se liga especifica mente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C difficile), caracterizado(a) pelo fato de compreender uma CDRI de região dc cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 13, uma CDR2 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 14, uma CDR3 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO: 15, uma CDRI de região de cadeia leve variável estalbelecida na SEQ ID NO:22, uma CDR2 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID
    NO: 23. e uma CDR3 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO:24.
  4. 4. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, que se liga específicamente a uma exotoxina de Cfostridiitm difficile (C. difficile), caracterizado (a) pelo fato de compreender uma CDRl de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:62, uma CDR2 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:64, uma CDR3 de região de cadeia pesada variável estabelecida na SEQ ID NO:66, uma CDRl de região de cadeia leve variável estalbelecida na SEQ ID NO: 68, uma CDR2 de região de cadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO: 70, e uma CDR3 de região de eadeia leve variável estabelecida na SEQ ID NO:72.
  5. 5. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado (a) pelo fato do anticorpo ou sua parte dc ligação ao antígeno compreender regiões de cadeia pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 4.
  6. 6. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado (a) pelo fato do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões de cadeia pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2 e 5.
  7. 7. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado (a) pelo fato do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões de cadeia pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 3 e 6,
  8. 8. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado (a) pelo fato do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões de cadeia pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs; 54 e 58.
  9. 9. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado (a) pelo fato do anticorpo ser um ísotipo IgGl ou IgG3.
  10. 10. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado (a) pelo
    5 fato do anticorpo ser um isotipo IgG 1.
  11. 11. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 4 ou 8, caracterizado (a) peio fato do anticorpo ser um isotipo IgG 1.
  12. 12. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de 10 ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, eaiacterizado(a) pelo fato do anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno especificamente ligar-se à exotoxína com um KD menor do que 20 x ΚΓ6 M.
  13. 13. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12,
    15 caracterizado(a) pelo fato da parte de ligação ao antígeno compreender um Fab, Fab’2, ScFv, Fd, Fv or dAb.
  14. 14. Anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado(a) pelo fato do anticorpo ser um anticorpo de comprimento
    20 total
  15. 15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno como definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1-14 em um carreador farm ac e uti camen te ace i tá v e 1.
    25
  16. 16. Ácido nucléico isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência codificando um polipeptídeo como estabelecido na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO: 58 ou SEQ ID NO: 60.
  17. 17. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucléico como definido na reivindicação 16.
  18. 18. Kit, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo monoclonal recombinante ou sua parte de ligação ao antígeno como defmido(a) em qualquer uma das reivindicações 1-14, e instruções para uso no tratamento da doença mediada por C. difficile.
  19. 19. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um primeiro anticorpo monoclonal recombinante e um segundo anticorpo monoclonal recombinante, em que:
    (a) o primeiro anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno compreende regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 4, SEQ ID NOs: 2 e 5, ou SEQ ID NOs: 3 e 6, respectivamente, e (b) o segundo anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno compreende regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54 e 58, respectivamente.
  20. 20. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato do primeiro anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1 e 4, respectivamente.
  21. 21. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato do primeiro anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 2 e 5, respectivamente.
  22. 22. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato do primeiro anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 3 e 6, respectivamente.
  23. 23. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato do primeiro anticorpo ou sua parte de ligação ao antígeno compreender regiões das cadeias pesada e leve variáveis como estabelecidas nas SEQ ID NOs: 54 e 58, respectivamente.
  24. 24. Composição de acordo com a reivindicação 19, 5 caracterizada pelo fato do primeiro anticorpo, ou sua parte de ligação ao antígeno se ligar a um epítopo entre os aminoácidos 1853-2710 da toxina A de C. difficile.
  25. 25. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato do segundo anticorpo, ou sua parte de ligação ao
    10 antígeno se ligar a um epítopo entre os aminoácidos 1777-2366 da toxina B de C. dfficile.
  26. 26. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-25, caracterizada pelo fato do primeiro ou segundo anticorpo ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um
    15 anticorpo quimérico.
  27. 27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-26, caracterizada pelo fato da parte de ligação ao antígeno compreender um Fab, Fab’2, ScFv, Fd, Fv or dAb.
  28. 28. Composição de acordo com qualquer uma das 20 reivindicações 19-27, caracterizada pelo fato da Kd do primeiro ou segundo anticorpo ou sua parte de ligação ser menor do que 20 x 10'6 M.
  29. 29. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-28, caracterizada pelo fato do primeiro e o segundo anticorpos, ou sua parte de ligação ao antígeno, neutralizar a toxina A de C.
    25 dfficile e a toxina B de C. difficile in vitro ou in vivo.
  30. 30. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-29, caracterizada pelo fato do primeiro e segundo anticorpos, ou sua parte de ligação ao antígeno serem formulados juntos.
  31. 31. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-29, caracterizada pelo fato do primeiro e segundo anticorpos, ou sua parte de ligação ao antígeno serem formulados separados.
    1/35
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