NO340300B1 - Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat. - Google Patents

Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat. Download PDF

Info

Publication number
NO340300B1
NO340300B1 NO20063767A NO20063767A NO340300B1 NO 340300 B1 NO340300 B1 NO 340300B1 NO 20063767 A NO20063767 A NO 20063767A NO 20063767 A NO20063767 A NO 20063767A NO 340300 B1 NO340300 B1 NO 340300B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
seq
antibody
chain variable
antigen
variable region
Prior art date
Application number
NO20063767A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20063767L (no
Inventor
Jr William D Thomas
Israel Lowy
Donna Ambrosino
Greogry J Babcock
Teresa Broering
Robert Graziano
Hector Javier Hernandez
Robert Mandell
Deborah Molrine
Hui-Fen Zhang
Original Assignee
Univ Massachusetts
Squibb & Sons Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36928722&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO340300(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Massachusetts, Squibb & Sons Llc filed Critical Univ Massachusetts
Publication of NO20063767L publication Critical patent/NO20063767L/no
Publication of NO340300B1 publication Critical patent/NO340300B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/809—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fv, fc, heavy chain or light chain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat.
Bakgrunn for oppfinnelsen
Clostridium difficile ( C. difficilé) er en gram-positiv bakterie som forårsaker gastrointestinal sykdom hos mennesker. C. difficile er den mest vanlige årsak til infeksiøs diaré hos sykehuspasienter og er én av de mest vanlige sykehusinfeksjoner totalt (Kelly et al, New Eng. J. Med, 330:257-62, 1994). Sykdom forbundet med dette patogenet kan faktisk ramme så mange som tre million pasienter innlagt på sykehus pr. år i USA (McFarland et al, New Eng. J. Med, 320:204-10, 1989; Johnson et al, Lancet, 336:97-100, 1990).
Behandling med antibiotika slik som ampicillin, amoxicillin, cefalosporiner og klindamycin som forstyrrer normal tarmflora kan tillate kolonisering i tarmen med C. difficile og fører til C. difficile- sykdom (Kelly og Lamont, Annu. Rev. Med, 49:375-90, 1998). Oppstart av C. difficile- sykdom inntreffer typisk fire til ni dager etter start av antibiotikabehandling, men kan også forekomme etter avbrytelse av antibiotikabehandling. C. difficile kan frembringe symptomer i spekteret fra mild til alvorlig diaré og kolitt, omfattende pseudomembranøs kolitt (PMC), en alvorlig form av kolittkarakterisert vedabdominal smerte, vannholdig diaré og systemisk sykdom { f. eks., feber, kvalme). Tilbakefall av sykdom kan forekomme hos opptil 20% av pasientene behandlet for en første sykdomsepisode og de som har et tilbakefall har større risiko for ytterligere tilbakefall (Kelly og Lamont, Annu. Rev. Med, 49:375-90,1998). C. difficile- sykdom er antatt å være forårsaket av virkningene av to eksotoksiner, toksin A og toksin B, på tarmepitel. Begge toksinene er høymolekylvekt proteiner (280-300 kDa) som katalyserer kovalent modifikasjon av Rho-proteiner, små GTP-bindingsproteiner involvert i aktinpolymerisering, i vertsceller. Modifikasjon av Rho-proteiner ved toksinene inaktiverer dem, hvilket fører til depolymerisering av aktinfilamenter og celledød. Begge toksinene er letale for mus når injisert parenteralt (Kelly og Lamont, Annu. Rev. Med, 49:375-90,1998). C. difficile- sykdom kan diagnostiseres ved analyser som detekterer tilstedeværelse eller aktivitet av toksin A eller toksin B i avføringsprøver, f.eks., enzymimmunanalyser. Cytotoksin-analyser kan anvendes for å detektere toksinaktivitet. For å utføre en cytotoksin-analyse, blir avføring filtrert for å fjerne bakterier og de cytopatiske effektene av toksiner på dyrkede celler blir bestemt (Merz et al, J. Clin. Microbiol, 32:1142-47, 1994). C.fi6^?c/7e-behandling er komplisert ved det faktum at antibiotika utløser C. difficile- assosiert sykdom. Allikevel er antibiotika for øyeblikket det primære valget for behandling. Antibiotika som er minst egnet til å forårsake C. difficile- assosiert sykdom slik som vankomycin og metronidazol anvendes ofte. Vankomycinresistens som utvikles i andre mikroorganismer er en grunn til bekymring ved anvendelse av dette antibiotika for behandling, ettersom det er den eneste effektive behandlingen for infeksjon med andre mikroorganismer (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 250:127-39, 2000). Probiotiske metoder, hvor et subjekt blir administrert ikke-patogene mikroorganismer som antagelig konkurrerer om plass med de patogene bakteriene, anvendes også. For eksempel er behandling med en kombinasjon av vankomycin og Saccharomyces boulardii rapportert (McFarland et al, JAMA., 271(24): 1913-8,1994. Erratum i: JAMA, 272(7):518, 1994).
Det har blitt utviklet vaksiner som beskytter dyr fra letal provokasjon i infeksiøse modeller av sykdom (Torres et al, Infect. Immun. 63(12):4619-27,1995). I tillegg har polyklonale antistoffer blitt vist å beskytte hamstere fra sykdom når administrert ved injeksjon eller foring (Giannasca et al, Infect. Immun. 67(2):527-38, 1999; Kink og Williams, Infect. Immun., 66(5):2018-25, 1998). Det har blitt isolert murine monoklonale antistoffer som binder til C. difftcile- toksmer og nøytraliserer deres aktiviteter in vivo og in vitro (Corthier et al, Infect. Immun., 59(3): 1192-5, 1991). Det er noen angivelser om at humane polyklonale antistoffer inneholdende toksin-nøytraliserende antistoffer kan forhindre tilbakefall av C. difficile (Salcedo et al, Gut, 41(3):366-70, 1997). Antistoffrespons mot toksin A har blitt korrelert med sykdomsutfall, hvilket indikerer effektiviteten av humorale responser med hensyn til å kontrollere infeksjon. Individer med kraftige toksin A ELIS A-responser hadde mindre alvorlig sykdom sammenlignet med individer med lave nivåer av toksin A antistoff (Kyne et al, Lancet, 357(9251):189-93, 2001).
De individuelle rollene av toksin A og toksin B ved sykdomspatogenese og rollen til anti-toksin antistoffer ved beskyttelse mot C. difficile- sykdom er kontroversielle og kan avhenge av verten. Hos mennesker har anti-toksin A antistoffresponsen blitt korrelert med sykdomsutfall, hvilket indikerer et krav om anti-toksin A-respons for beskyttelse. Denne observasjonen står i kontrast til angivelser av sykdomsforårsakende C. difficile- OTgamsmer som kun uttrykker toksin B, hvilket antyder at toksin B kan bidra til sykdom hos mennesker. Disse toksin A-negative stammene kan også forårsake sykdom hos hamstere (Sambol et al, J. Infect. Dis., 183(12): 1760-6, 2001).
KINK JOHN A. ET AL., "Antibodies to recombinant Clostridium difficule toxins A and B are effective treatment and prevent relapse of C. difficile-associated disease in a hamster model of infection", Infection and Immunity, American Society for Microbiology, vol. 66, no. 5, 1998, side 2018-2025 beskriver virkningen av C. difficile toksin A og B på patogenese og muligheten til å behandle sykdom forårsaket av C. difficile med et antistoff rettet mot rekombinante epitoper på toksin A
ogB.
DENG XIAO K. ET AL., "Recombinant single-Chain variable fragment antibodies directed against Clostridium difficile toxin B produced by use of an optimized phage display system", Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol. 10, no. 4, 2003, side 587-595. Her er det fremstilt enkelt-kjede antistoffer (scFv) mot Clostridium difficile toksin B fra en muse B celle hybridoma cellelinje 5A8 som produserer monoklonale antistoffer mot toksinet.
WO 0192340 A2 beskriver anvendelse av interleukin-4 antagonister og sammensetninger derav.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat.
Foreliggende oppfinnelse er følgelig basert, delvis, på det funnet at administrering av antistoffer mot C. difficile toksin A til et subjekt kan beskytte subjektet mot tilbakefall av C. difficile- medieit sykdom in vivo. Administrering av antistoffer mot ett eller begge av toksin A og toksin B kan forhindre primær C. difficile- mediert sykdom. Antistoffer med høy affinitet mot C. difficile- toksmer kan produseres, f.eks., i mus, slik som transgene mus som uttrykker gensegmenter for humant immunoglobulin. Disse antistoffene kan nøytralisere cytotoksisitet av toksinet in vitro og nøytralisere toksin-enterotoksisitet in vivo. Antistoffer som gjenkjenner toksin A og/eller toksin B kan hemme og beskytte mot sykdom in vivo.
I ett aspekt angår oppfinnelsen et isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, som spesifikt binder til et eksotoksin av Clostridium difficile ( C.
difficile) omfattende tung og lettkjede variabel region CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser valgt fra gruppen bestående av:
(i) en tungkj ede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 7; en tungkj ede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 8; en tungkj ede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 9; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 16; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 17; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 18; (ii) en tungkj ede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 10; en tungkj ede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 11; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 12; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 19; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:20; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:21; (iii) en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 13;
en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 14;
en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 15;
en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:22;
en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:23;
en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:24; og
(iv) en tungkj ede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 62;
en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:64;
en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:66;
en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:68;
en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:70;
en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:72.
I visse utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til C. difficile- Xdksm A (toksin A). I andre utførelsesformer binder antistoffet eller antigenbindende deler derav spesifikt til C. difficile- toksm B (toksin B). I andre utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til både toksin A og toksin B.
I visse utførelsesformer nøytraliserer antistoffene eller antigenbindende deler derav toksin A in vitro, hemmer binding av toksin A til mammalske celler og/eller hemmer C. difficile- mediert sykdom in vivo.
I forskjellige utførelsesformer har antistoffene eller antigenbindende deler derav én eller flere av de følgende egenskapene: når administrert til en mus, beskytter de musen mot administrering av et C. difficile- toksim i en mengde som ville være dødelig for en kontrollmus ikke administrert antistoffet; beskytter mot eller hemmer C. difficile- medieTt kolitt, antibiotikaassosiert kolitt eller pseudomembranøs kolitt (PMC) hos et subjekt; beskytter mot eller hemmer diaré hos et subjekt; og/eller hemmer tilbakefall av C. difficile-mediert sykdom.
Antistoffene eller antigenbindende deler derav kan spesifikt binde til en epitop innenfor den N-terminale halvdelen av toksin A, f.eks., en epitop mellom aminosyrene 1-1256 av toksin A. I andre utførelsesformer, binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til en epitop innenfor det C-terminale reseptorbindende domenet av toksin A, f.eks., en epitop mellom aminosyrene 1852-2710 av toksin A, eller en epitop mellom aminosyrene 659-1852, f.eks., en epitop innenfor aminosyrerestene 900-1852, 900-1200 eller 920-1033 av toksin A. I andre utførelsesformer, binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt en epitop innenfor aminosyrene 1-600, 400-600, eller 415-540 av toksin A. Andre spesielle antistoffer eller antigenbindende deler derav, kan spesifikt binde til en epitop innenfor aminosyrerestene 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 eller 2200-2300, 2300-2400, 2400-2500, 2500-2600, 2600-2710 av toksin A eller hvilket som helst intervall, del eller område derav.
I visse utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til toksin A med en KD på mindre enn ca. 20 x IO"<6>M. I en bestemt utførelsesform, binder antistoffet eller antigenbindende del derav, spesifikt til toksin A med en KD på mindre enn ca. 10 x IO"<7>M, mindre enn ca. 10 x 10"<8>M, mindre enn ca. 10 x IO"<9>M eller mindre enn ca. 10 x 10"<10>M. I andre bestemte utførelsesformer, binder antistoffet eller antigenbindende del derav, spesifikt til toksin A med en KD på mindre enn ca. 50 x 10"<10>M, mindre enn ca. 20 x 10"10M, mindre enn ca. 15 x IO-<10>M, mindre enn ca.
8 x 10"<10>M eller mindre enn ca. 5 x 10"10M.
I forskjellige andre utførelsesformer, omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav en variabel tung kjede region omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel tung kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV JX) NR: 1), 1B11 (SEKV ID NR:2) eller 3H2 (SEKV ID NR: 3).
I visse utførelsesformer, omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav en variabel lett kjede region omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel lett kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:4) , 1B11 (SEKV ID NR: 5) eller 3H2
(SEKV ID NR: 6).
I visse utførelsesformer, omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav hver både en variabel tung kjede region omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel tung kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 1), 1B11 (SEKV ID NR:2) eller 3H2 (SEKV ID NR:3) og en variabel lett kjede region omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel lett kjede aminosyresekvens av klon 3D8 (SEKV ID NR:4), 1B11 (SEKV ID NR: 5) eller 3H2 (SEKV ID NR: 6).
I forskjellige utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til en epitop som overlapper med en epitop bundet av et antistoff produsert av klon 3D8, 1B11 eller 3H2 og/eller konkurrerer om binding til toksin A med et antistoff produsert av klon 3D8, 1B11 eller 3H2.
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:7-9), 1B11(SEKV ID NR: 10-12) eller 3H2 (SEKV ID NR:13-15) (også vist i Tabell 1).
En variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR: 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR:22-24) (også vist i Tabell 2).
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:7-9), 1B11(SEKV ID NR: 10-12) eller 3H2 (SEKV ID NR: 13-15) og en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR: 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR:22-24).
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:7-9), 1B11(SEKV ID NR: 10-12) eller 3H2 (SEKV ID NR: 13-15).
I noen utførelsesformer omfatter en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR: 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR22-24).
I noen utførelsesformer omfatter en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav én eller flere CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR:22-24), og en variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatter tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:7-9), 1B11(SEKV ID NR 10-12) eller 3H2 (SEKV ID NR:13-15). Den variable lett kjede regionen kan omfatte tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR: 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR22-24).
I visse utførelsesformer omfatter en variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav tre CDR'er som er identiske med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR:7-9), 1B11 (SEKV ID NR: 10-12) eller 3H2 (SEKV ID NR: 13-15), og en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatter tre CDR'er som er identiske med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 16-18), 1B11 (SEKV ID NR: 19-21) eller 3H2 (SEKV ID NR22-24), f eks., en variabel lett kjede region og variabel tung kjede region av antistoffet eller antigenbindende del derav er identisk med en variabel lett kjede region og variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 3D8 (SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR:4), 1B11 (SEKV ID NR2, SEKV ID NR5) eller 3H2
(SEKV ID NR:3, SEKV ID NR:6).
I noen utførelsesformer nøytraliserer antistoffene eller antigenbindende deler derav toksin B in vitro, hemmer binding av toksin B til mammalske celler og/eller nøytraliserer toksin B in vivo.
I noen utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til en epitop i en C-terminal del av toksin B ( f. eks., mellom aminosyrene 1777-2366 av toksin B). Andre spesielle antistoffer eller antigenbindende deler derav, kan binde spesifikt til en epitop innenfor aminosyrerestene 1-100,100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200,2100-2200 eller 2200-2366 av toksin B eller hvilket som helst intervall, del eller område derav.
I visse utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til toksin B med en KDlavere enn ca. 20 x IO"<6>M. I en bestemt utførelsesform, binder antistoffet eller antigenbindende del derav, spesifikt til toksin B med en KDpå lavere enn ca. 10 x IO"<7>M, lavere enn ca. 10 x 10"<8>M, lavere enn ca. 10 x IO"<9>M eller lavere enn ca. 10 x 10"<10>M. I andre spesielle utførelsesformer, binder antistoffet eller antigenbindende del derav, spesifikt til toksin B med en KDlavere enn ca. 50 x 10"<10>M, lavere enn ca. 20 x 10"10M, lavere enn ca. 15 x 10-10M, lavere enn ca. 8 x 10"<10>M eller lavere enn ca. 5 x 10"<10>M.
I forskjellige andre utførelsesformer omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav en variabel tung kjede region omfattende en aminosyresekvens som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel tung kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 124-152 (dvs., aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR:54), 2A11, eller 1G10.
I visse utførelsesformer omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav en variabel lett kjede region omfattende en aminosyresekvens som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel tung kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 124-152 (dvs., aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR58), 2A11, eller 1G10.
I visse utførelsesformer omfatter antistoffene eller antigenbindende deler derav hver både en variabel tung kjede region omfattende en aminosyresekvens minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel tung kjede region aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 124-152 ( dvs., aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR:54), 2A11 eller 1G10 og en variabel lett kjede region omfattende en aminosyresekvens som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% eller mer identisk med en variabel lett kjede aminosyresekvens av antistoffet produsert av klon 124-152 ( dvs., aminosyresekvensen vist i SEKV ID NR:58), 2A11, eller 1G10.
I forskjellige utførelsesformer binder antistoffene eller antigenbindende deler derav spesifikt til en epitop som overlapper med en epitop bundet av et antistoff produsert av klon 124-152, 2A11 eller 1G10 og/eller konkurrerer om binding til toksin B med et antistoff produsert av klon 124-152, 2A11 eller 1G10.
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2A11 eller 1G10 (Tabell 3).
En variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1G10 (Tabell 4).
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identiske med en CDR av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2Al 1 eller 1G10, og en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte én eller flere CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1 Gl 0.
En variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2A11 eller 1G10.
I visse utførelsesformer omfatter den variable lett kjede regionen av antistoffene eller antigenbindende deler derav tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1G10.
I andre utførelsesformer omfatter den variable lett kjede regionen av antistoffene eller antigenbindende deler derav én eller flere CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1G10, og en variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatter tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identiske med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2A11 eller 1G10. Den variable lett kjede regionen kan omfatte tre CDR'er som er minst 80%, 85%, 90%, 95% eller 99% eller mer identisk med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1 Gl 0.
I enda andre utførelsesformer omfatter den variable tung kjede regionen av antistoffene eller antigenbindende deler derav tre CDR'er som er identiske med en CDR av en variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2A11 eller 1G10, og en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatter tre CDR'er som er identiske med en CDR av en variabel lett kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 68, 70 eller 72), 2A11 eller 1G10, f.eks., en variabel lett kjede region og variabel tung kjede region av antistoffet eller antigenbindende del derav er identisk med en variabel lett kjede region og variabel tung kjede region av antistoffet produsert av klon 124-152 (SEKV ID NR: 62, 64 eller 66), 2All eller 1G10.
Antistoffene eller antigenbindende deler derav kan være fullengde antistoffer, kan omfatte et effektordomene, f.eks., et Fc-domene, kan være immunglobulin gamma isotype-antistoffer, enkeltkjede antistoffer eller Fab-fragmenter. Antistoffene eller antigenbindende deler derav kan videre omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et merke.
I forskjellige utførelsesformer er blandinger omfattende antistoffene eller antigenbindende deler derav fri for andre humane polypeptider ( f. eks., de inneholder mindre enn 5% humane polypeptider forskjellig fra antistoffene eller antigenbindende deler derav).
I forskjellige utførelsesformer er blandinger omfattende: (a) et isolert humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til et eksotoksin fra C. difficile; og (b) et polyklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til et eksotoksin av C. difficile.
I én utførelsesform binder det humane monoklonale antistoffet eller antigenbindende del derav spesifikt til C. difficile toksin A og det polyklonale antistoffet eller antigenbindende del derav binder spesifikt til C. difficile toksin B. I én utførelsesform binder det humane monoklonale antistoffet eller antigenbindende del derav spesifikt til C. difficile toksin B og det polyklonale antistoffet eller antigenbindende del derav binder spesifikt til C. difficile toksin A. Antistoffene kan omfatte andre trekk beskrevet her.
Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig et farmasøytisk preparat omfattende antistoffet eller antigen bindende del derav, iføgle hvilken som helst av de foregående kravene i en farmasøytisk akseptabel bærer.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en isolert nukleinsyre omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som angitt i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR2, SEKV
ID NR:3, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR5, SEKV ID NR6, SEKV ID NR54, SEKV ID
NR56, SEKV ID NR58 eller SEKV ID NR60.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyren ifølge krav 22.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre en vertscelle omfattende nukleinsyren ifølge krav 22.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et sett omfattende et isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene og instruksjoner for anvendelse for behandling av C. difficile- mediert sykdom.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et preparat omfattende et første monoklonalt antistoff et andre monoklonalt antistoff, hvor: (a) det første antistoffet eller antigen bindende delen derav, som omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs: 1 og 4, SEKV ID NRs:2 og 5 eller SEKV ID NRs:3 og 6, og (b) den andre antistoff eller antigen bindende delen derav, som omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs: 54 og 58.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre anvendelse av et antistoff eller antigen bindende del derav, ifølge hvilke som helst av de foregående kravene for å produsere et farmasøytisk preparat for behandling av C. difficile sykdom ved å hemme symptomene på sykdommen eller forhindre tilbakekomst av C. difficile- medieTt sykdom.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen isolerte humane monoklonale antistoffer eller antigenbindende deler derav som spesifikt binder til et eksotoksin av Clostridium difficile ( C. difficile), hvor antistoffene: (a) omfatter en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 5-51-gen; og/eller (b) omfatter en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkA27-gen. Antistoffene eller antigenbindende deler derav også kan omfatte andre trekk beskrevet her.
Det er heri beskrevet isolerte polypeptider som omfatter en antigenbindende del av et antistoff produsert av hybridom klon 3D8, 1B11 eller 3H2 (også referert til her som "3D8", "IB 11" og "3H2").
Det er heri beskrevet isolerte polypeptider som omfatter en antigenbindende del av et antistoff produsert av hybridom klon 124-152, 2A11 eller 1G10 (også referert til her som "124-152", "2A11" og "1G10").
I et annet aspekt er det beskrevet isolerte monoklonale antistoffer eller antigenbindende deler derav som spesifikt binder til et eksotoksin fra C. difficile, nøytraliserer toksinet, hemmer og/eller beskytter mot C. difficile- mediert sykdom. I én utførelsesform er antistoffene eller antigenbindende deler derav mammalske ( f. eks., human) antistoffer eller antigenbindende deler derav. Antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte andre trekk beskrevet her.
I et annet aspekt er det beskrevet blandinger omfattende: (a) et isolert humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til C. difficile toksin A; og (b) et isolert humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til C. difficile toksin B.
I et annet aspekt er det beskrevet isolerte nukleinsyrer omfattende en sekvens som koder for polypeptider minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR:1, 2, 3, 4, 5 eller 6; f.eks., hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NRs:38, 39, 40, 35, 36 eller 37. Det er videre beskrevets ekspresjonsvektorer omfattende en nukleinsyre som koder for et polypeptid minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NRl, 2, 3, 4, 5 eller 6; f.eks., hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR:38, 39, 40, 35, 36 eller 37, så vel som vertsceller, f.eks., bakterieceller, f.eks., E. co//'-celler, omfattende en nukleinsyre som koder for et polypeptid minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR:1, 2, 3, 4, 5 eller 6; f.eks., hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR38, 39, 40, 35, 36 eller 37.
I et annet aspekt er det beskrevet isolerte nukleinsyrer omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 54, 56, 58 eller 60, for eksempel hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 55, 57, 59 eller 61. Det er også beskrevet ekspresjonsvektorer omfattende en nukleinsyre som koder for et polypeptid minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 54, 56, 58 eller 60, for eksempel hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 55, 57, 59 eller 61. Det er videre beskrevet vertsceller, f.eks., bakterieceller, f.eks., E. co//'-celler, som omfatter en nukleinsyre som koder for et polypeptid som er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 54, 56, 58 eller 60, for eksempel hvor nukleinsyresekvensen er minst 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% eller mer identisk med SEKV ID NR: 55, 57, 59 eller 61.
Vertscellene kan også være eukaryote celler, f.eks., gjærceller, mammalske celler, f.eks., ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler), NSO-celler eller myelomceller.
I et annet aspekt angår oppfinnelsen sett som angitt ovenfor. Settet kan omfatte instruksjoner for anvendelse for forebygging eller behandling av C. difficile- mediert sykdom.
Settet kan videre omfatte et polyklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder et eksotoksin fra C. difficile. I én utførelsesform binder det humane monoklonale antistoffet eller antigenbindende del derav spesifikt til C. difficile-
toksin A. I én utførelsesform binder det polyklonale antistoffet eller antigenbindende delen derav spesifikt til C. difficile- toksm B.
Det er mulig å behandle C. difficile- sykdom hos et subjekt ved å administrere til subjektet et isolert humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til et eksotoksin fra Clostridium difficile (C. difficile) i en mengde effektiv til å hemme C. difficile- sykdom, f.eks., C. difficile- mediert kolitt, antibiotikaassosiert kolitt, C. difficile- mediert pseudomembranøs kolitt (PMC) eller diaré eller tilbakefall av C. difficile- medieTt sykdom. Antistoffet eller antigenbindende del derav kan administreres, f.eks., intravenøst, intramuskulært eller subkutant, til subjektet.
Antistoffet eller antigenbindende del derav kan administreres alene eller i kombinasjon med et annet terapeutisk middel, f.eks., et andre humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav. I ett eksempel binder antistoffet eller antigenbindende del derav spesifikt til C. difficile toksin A og det andre humane monoklonale antistoffet eller antigenbindende del derav binder spesifikt til C. difficile toksin B. I et annet eksempel er det andre midlet et antibiotika, f.eks., vankomycin eller metronidazol. Det andre midlet kan være polyklonalt gamma-globulin ( f. eks., humant gamma-globulin).
I en bestemt utførelsesform administreres et antistoff eller antigenbindende del derav som omfatter en variabel lett kjede region og en variabel tung kjede region identisk med den variable lett kjede regionen og den variable tunge kjede regionen av antistoffet produsert av klon 3D8 ( dvs., omfattende en variabel lett kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR:4 og en variabel tung kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR:1).
I en annen utførelsesform blir dette antistoffet eller antigenbindende del derav administrert i kombinasjon med et antistoff eller antigenbindende del derav som omfatter en variabel lett kjede region og en variabel tung kjede region identisk med den variable lett kjede regionen og den variable tunge kjede regionen av antistoffet produsert av klon 124-152 ( dvs., omfattende en variabel lett kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR:58 og en variabel tung kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR:54).
I enda en annen utførelsesform blir et antistoff eller antigenbindende del produsert av klon 3D8 ( dvs., omfattende en variabel lett kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR4 og en variabel tung kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR:1), administrert i kombinasjon med et antistoff eller antigenbindende del derav
produsert av klon 124-152 ( dvs., omfattende en variabel lett kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR: 58 og en variabel tung kjede region-sekvens identisk med SEKV ID NR: 54).
Det er mulig å fremstille et antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til et eksotoksin fra C. difficile, ved å immunisere et transgent ikke-humant dyr som har et genom omfattende et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen med en sammensetning som omfatter et inaktivert eksotoksin og isolering av et antistoff fra dyret. Eksotoksinet kan inaktiveres, for eksempel ved behandling med UDP-dialdehyd eller ved mutasjon ( f. eks., ved anvendelse av rekombinante metoder). Metoden kan videre omfatte evaluering av binding av antistoffet til eksotoksinet.
Det er videre mulig å fremstille et humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav ved å tilveiebringe en nukleinsyre som koder for et humant monoklonalt antistoff eller antigenbindende del derav som spesifikt binder til et eksotoksin fra C. difficile og som uttrykker nukleinsyren i en vertscelle.
Det er videre beskrevet et hybridom eller transfectom omfattende en nukleinsyre som koder for antigenbindende deler ( f. eks., CDR'er eller variable regioner) av antistoffet produsert av klon 3D8, 1B11 eller 3H2. Hybridomet eller transfectomet kan omfatte en nukleinsyre som koder for antigenbindende deler ( f. eks., CDR'er eller variable regioner) av antistoffet produsert av klon 124-152, 2A11 eller 1G10.
Det er mulig å fremstille et hybridom som uttrykker et antistoff som spesifikt binder til et eksotoksin fra C. difficile ved å immunisere et transgent ikke-humant dyr som har et genom som omfatter et humant tung kjede transgen og et humant lett kjede transgen, med en sammensetning som omfatter eksotoksinet, hvor toksinet er inaktivert; isolering av splenocytter fra dyret; fremstilling av hybridomer fra splenocyttene; og selektere et hybridom som gir et antistoff som spesifikt binder til eksotoksinet.
Behandling av mennesker med humane monoklonale antistoffer gir mange fordeler. For eksempel er antistoffene egnet til å være mindre immunogene for mennesker enn ikke-humane antistoffer. Behandlingen er rask; inaktivering av toksin kan inntreffe så snart antistoffet når infeksjonsstedene og direkte nøytraliserer de(t) sykdomsforårsakende toksinet(toksinene). Humane antistoffer lokaliseres til passende steder hos mennesker mer effektivt enn ikke-humane antistoffer. Videre er behandlingen spesifikk for C. difficile og det er lite sannsynlig at den forstyrrer normal tarmflora, i motsetning til tradisjonell antibiotikabehandling.
Andre trekk og fordeler ifølge oppfinnelsen vil fremgå av den følgende detaljerte beskrivelsen og fra kravene.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 er en tabell som lister opp aminosyresekvensene av VH og VL-kj edene kodet for av mRNA-sekvenser fra hver klon. Små bokstaver representerer aminosyrer i leder-peptidet. CDR'er er understreket. Klon 3D8, som uttrykker 6 unike lett kjede V-regioner, uttrykte bare gruppe I aminosyresekvensen. Figur 2A er en representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VL-kj eden uttrykt ved klon 3D8. Genene for V-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 2B er a representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VH-kjeden uttrykt ved klon 3D8. Genene for V-segment, D-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 3A er en representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VL-kj eden uttrykt ved klon 1B11. Genene for V-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 3B er en representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VH-kjeden uttrykt ved klon 1B11. Genene for V-segment, D-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 4A er en representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VL-kj eden uttrykt ved klon 33,3H2 (referert til her som 3H2; 33,3H2 og 3H2 blir anvendt om hverandre her). Genene for V-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 4B er en representasjon av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VH-kjeden uttrykt ved klon 33,3H2. Genene for V-segment og J-segment er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 5 er en kurve som viser resultatene av ELISA-analyse, som målte binding av anti-toksin A monoklonale antistoffer til toksin A. Figurene 6A- B er et sett av kurver som viser resultater av in vitro nøytraliseringsforsøk i nærvær og fravær av anti-toksin A monoklonale antistoffer. FIG. 6A viser resultater for analyser utført med IMR-90-celler. FIG. 6B viser resultater for analyse utført med T-84-celler. Figur 7 er en skjematisk fremstilling av toksin A-polypeptidet, som angir fragmenter som ble analysert for epitopkartlegging-studier. Figur 8A- B er skjematiske fremstillinger av toksin A-fragmenter analysert for epitopkartlegging-studier. Figur 9 er en tabell som lister opp resultatene av in vzvo-analyser for å bestemme beskyttelse av mus mot letal provokasjon med toksin A ved anti-toksin A monoklonale antistoffer. Figur 10 er en kurve som viser resultatene av analyser av mus ileum løkke væske-akkumulering for å måle effektivitet av nøytralisering av anti-toksin antistoff in vivo. Figur 11A er et skjematisk diagram av tidslinjen for administrering av forskjellige midler til hamstere i en hamster tilbakefall-modell. Figur 11B er en kurve som viser resultatene av analysene som prosentandelen av hamstere som overlever klindamycinbehandling fulgt av provokasjon med C. difficile. Figur 12 er en kurve som viser resultater av hamster tilbakefallsanalyse som prosentandelen av hamstere som overlever klindamycinbehandling fulgt av provokasjon med C. difficile. Figur 13 er en kurve som viser resultater av analyser hvor in v/7/*o-nøytralisering av toksin A og toksin B ble målt i nærvær og fravær av polyklonale antisera fra geiter immunisert med toksoid B. "G330" angir prøver hvor sera fra geit nr. 330 ble testet. "G331" angir prøver hvor sera fra geit nr. 331 ble testet. Figur 14 er et skjematisk diagram av tidslinjen for administrering av forskjellige midler til hamstere i en hamster tilbakefall-modell. Figur 15 er en kurve som viser resultatene av hamster tilbakefall-analysen som prosentandelen av hamstere som overlever klindamycinbehandling fulgt av C. dijficile-provokasjon. Hamstere ble behandlet med vankomycin, vankomycin og 3D8, vankomycin og antisera fra geit nr. 331 eller vankomycin, 3D8 og antisera fra geit nr. 331. Figur 16 gt en kurve som viser resultatene av hamster tilbakefalls-analyse som prosentandelen av friske dyr etter klindamycinbehandling fulgt av C. difficile- pwvokasjon. "Geit 331" angir antisera fra geit nr. 331. Figur 17 gt en kurve som viser resultatene av hamster tilbakefall-analyser som prosentandelen av hamstere som overlever klindamycinbehandling fulgt av C. diffcile-provokasjon. Hamstere ble immunisert med et fragment av toksin B før klindamycinbehandling. Hamstere ble behandlet med vankomycin, vankomycin og 3D8 eller mottok ingen behandling. Figur 18 er en kurve som viser resultatene av hamster tilbakefallsanalyse som prosentandelen av friske dyr etter klindamycinbehandling fulgt av C. difficile provokasjon. Hamstere ble immunisert med et fragment av toksin B før klindamycinbehandling. Figur 19 er et skjematisk diagram av tidslinjen for administrering av forskjellige midler til hamstere i en C. difficile direkte provokasjon-modell. "331" angir antisera fra geit nr. 331. "Clinda" angir behandling med klindamycin. Figur 20 er en kurve som viser resultatene av direkte provokasjonsanalyse som prosentandelen av hamstere som overlever direkte C. difficile- pTovokasjon. Figur 21 er en kurve som viser resultatene av direkte provokasjonsanalyse som prosentandelen av friske dyr etter direkte provokasjon med C. difficile.
Figur 22 er en fremstilling av aminosyresekvensen av C. difficile toksin A.
Figur 23 er en fremstilling av aminosyresekvensen av C. difficile toksin B.
Figur 24 er en kurve som viser resultatene av analyse av primær provokasjon som prosentandelen av hamstere som overlever direkte C. d/#/cz7e-provokasjon. Figur 25 er en kurve som viser resultatene av primær provokasjonsanalyse som prosentandelen av hamstere som overlever direkte C. fi6$?cz7e-provokasjon. Figur 26 er en kurve som viser resultatene av primær provokasjonsanalyse som prosentdelen av hamstere som overlever direkte C. difficile-\ xovokas] on. Figur 27 gt en kurve som viser resultater av forsøk hvor in vitro nøytralisering av toksin A og toksin B ble målt i nærvær av monoklonale antistoffer mot toksin B eller geit polyklonale sera mot toksin B. Figur 28 er en fremstilling av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VH-kjeden uttrykt ved klon 124-152. Genene for V-segmentet, D-segmentet og J-segmentet er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 29 er en fremstilling av aminosyre og nukleinsyresekvensene av VL-kj eden uttrykt ved klon 124-152. Genene for V-segmentet og J-segmentet er listet opp over aminosyre og nukleinsyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 30 gt en fremstilling av aminosyre og relatert kjønnscellesekvens av VH-kjeden uttrykt ved klon 124-152. Genene for V-segmentet, D-segmentet og J-segmentet er listet opp over aminosyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 31 gt en fremstilling av aminosyre og relaterte kjønnscellesekvenser av VL-kjeden uttrykt ved klon 124-152. Genene for V-segmentet og J-segmentet er listet opp over aminosyresekvensene. CDR'ene er overstreket. Figur 32 er en skjematisk fremstilling av toksin B-polypeptidet, som angir fragmenter som ble analysert for epitopkartlegging-studier.
Like referansesymboler i de forskjellige figurene angir like elementer.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
For å gi en klar forståelse av beskrivelsen og kravene er de følgende definisjonene hensiktsmessig gitt nedenfor.
Definisjoner
Betegnelsen "toksin A" refererer til toksin A-proteinet kodet for av C. difficile. Aminosyresekvensen av C. difficile toksin A (SEKV ID NR:41) er gitt i GenBank® under aksesjonsnummer A37052, versjon GI 98593 (se også Figur 22). "Toksin B" angir toksin B-proteinet kodet for av C. difficile. Aminosyresekvensen av C. difficile toksin B (SEKV ID NR: 42) er gitt i GenBank® under aksesjonsnummer S70172, versjon GI 7476000 (se også Figur 23). "Protein" anvendes om hverandre med "polypeptid."
Et "anti-C. difficile- a, n\\$ to^ T, er et antistoff som interagerer med { f. eks., binder til) et protein eller annen komponent produsert av C. difficile- baktGTiGT. Et "anti-toksin-antistoff' er et antistoff som interagerer med et toksin produsert av C. difficile (f.eks., toksin A eller toksin B). Et anti-toksin protein-antistoff kan binde til en epitop, f.eks., en konformasjonell eller en lineær epitop eller til et fragment av fullengde toksin-proteinet.
Et "humant antistoff," er et antistoff som har variable og konstante regioner avledet fra human kjønnscelle immunglobulinsekvenser. De humane antistoffene beskrevet her kan omfatte aminosyrerester ikke kodet for av human kjønnscelle immunglobulinsekvenser (f.eks., mutasjoner innført ved tilfeldig eller setespesifikke mutagenese in vitro eller ved somatisk mutasjon in vivo).
Et anti-toksin antistoff eller antigenbindende del derav, kan administreres alene eller i kombinasjon med et andre middel. Subjektet kan være en pasient infisert med C. difficile eller som har et symptom på C. difficile- assosiert sykdom ("CDAD"; f.eks., diaré, kolitt, abdominal smerte) eller en predisponering for C. difficile- assosiert sykdom (f.eks., som gjennomgår behandling med antibiotika eller som har erfart C. difficile- assosiert sykdom og med risiko for tilbakefall av sykdommen). Behandlingen kan være å kurere, helbrede, lindre, lette, endre, avhjelpe, forbedre, døyve, forbedre eller påvirke infeksjonen og sykdommen forbundet med infeksjonen, symptomene på sykdommen eller predisponeringen for sykdommen.
En mengde av et anti-toksin antistoff effektiv for å behandle en CD AD eller en "terapeutisk effektiv mengde," er en mengde av antistoffet som er effektiv, ved administrering av enkel eller multippel dose til et subjekt, for å hemme CD AD i et subjekt. En terapeutisk effektiv mengde av antistoffet eller antistoffragment kan variere i henhold til faktorer slik som sykdomstilstanden, alder, kjønn og vekt av individet og evnen av antistoffet eller antistoff-andelen til å fremkalle en ønsket respons i individet. En terapeutisk effektiv mengde er også én hvor hvilke som helst toksiske eller skadelige effekter av antistoffet eller antistoff-andelen oppveies av de terapeutisk fordelaktige effektene. Evnen av et antistoff til å hemme en målbar parameter kan evalueres i et dyremodellsystem prediktiv for effektivitet hos mennesker. For eksempel evnen av et anti-toksin antistoff til å beskytte mus fra letal provokasjon med C. difficile kan predikere effektivitet hos mennesker. Andre dyremodeller prediktive for effektivitet er beskrevet her, slik som tarm ligeringsmodell beskrevet i eksemplene. Alternativt kan denne egenskapen av et antistoff eller antistoffblanding evalueres ved undersøkelse av forbindelsens evne til å modulere, hvor slik modulering er in vitro ved analyser kjent for fagfolk. In vzZro-analyser omfatter bindingsforsøk, slik som ELISA og nøytraliseringsforsøk.
En mengde av et anti-toksin antistoff effektiv for å forebygge en lidelse eller "en profylaktisk effektiv mengde," av antistoffet er en mengde som er effektiv, ved administrering av enkelt eller multippel dose til subjektet, for å forebygge eller forsinke opptreden av oppstart eller tilbakefall av CD AD eller hemme et symptom derav. Imidlertid, dersom lengre tidsintervaller for beskyttelse er ønsket, kan økte doser administreres.
Betegnelsene "pine," "indusere," "hemme," "forsterker," "heve," "øke," "redusere," eller lignende, f.eks., som betyr kvantitative forskjeller mellom to tilstander, refererer til en forskjell, f.eks., en statistisk eller klinisk signifikant forskjell, mellom de to tilstandene.
Som anvendt her refererer "spesifikk binding" eller "spesifikt binder til" evnen av et antistoff til å: (1) binde til et toksin fra C. difficile med en affinitet på minst 1 x IO<7>M"<1>og (2) binde til et toksin fra C. difficile med en affinitet som er minst to ganger høyere enn dets affinitet for et uspesifikt antigen.
Et "antistoff" er et protein omfattende minst én eller to, tung (H) kjede variable regioner (forkortet her som VHC) og minst én eller to lett (L) kjede variable regioner (forkortet her som VLC). VHC og VLC-regionene kan deles ytterligere opp i regioner av hypervariabilitet, betegnet "komplementaritetsbestemmende regioner" ("CDR"), innfelt med regioner som er mer konserverte, betegnet "struktur ("rammeverk") regioner" (FR). Størrelsen av struktur ("rammeverk")-regionen og CDR'ene har blitt nøyaktig definert (se Kabat, E.A., et al. Sequences of Proteins oflmmunological Interest, Femte Utgave, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publikasjon nr. 91-3242, 1991 og Chotia, C. et al, J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Fortrinnsvis er hver VHC og VLC sammensatt av tre CDR'er og fire FR'er, arrangert fra den aminoterminale til den karboksyterminale enden i den følgende rekkefølgen: FRI, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
VHC eller VLC-kjeden av antistoffet kan videre omfatte hele eller del av en tung eller lett kjede konstant region. I én utførelsesform, er antistoffet en tetramer av to tunge immunglobulinkjeder og to lette immunglobulinkjeder, hvor de tunge og lette immunglobulinkjedene er innbyrdes forbundet ved, f.eks., disulfidbindinger. Den tunge kjede konstante regionen omfatter tre domener, CH1, CH2 og CH3. Den lette kjede konstante regionen er omfattet av ett domene, CL. Den variable regionen av de tunge og lette kjedene inneholder et bindende domene som interagerer med et antigen. De konstante regionene av antistoffene medierer typisk bindingen av antistoffet til vertsvev eller faktorer, inkludert forskjellige celler av immunsystemet (f.eks., effektorceller) og den første komponenten (Clq) av det klassiske komplementsystemet. Betegnelsen "antistoff omfatter intakte immunglobuliner av typene IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (så vel som subtyper derav), hvor de lette kjedene av immunglobulinet kan være av typene kappa eller lambda.
"Immunglobulin" refererer til et protein bestående av ett eller flere polypeptider hovedsakelig kodet for av immunglobulingener. De anerkjente humane immunoglobulingenene omfatter kappa, lambda, alfa (IgAl og IgA2), gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon og mu konstant region-gener, så vel som de utallige immunglobulin variabel region-genene. Fullengde immunglobulin "lette kjeder" (omtrent 25 KD og 214 aminosyrer) er kodet for av et variabel region-gen ved den NH2-terminale enden (ca. 110 aminosyrer) og et kappa eller lambda konstant region-gen ved den COOH-terminale enden. Fullengde immunglobulin "tunge kjeder" (omtrent 50 KD og 446 aminosyrer), er tilsvarende kodet for av et variabel region-gen (ca. 116 aminosyrer) og ett av de andre ovennevnte konstant region-genene, f.eks., gamma (som koder for ca. 330 aminosyrer). Betegnelsen "immunglobulin" omfatter et immunglobulin som har: CDR'er fra en human eller ikke-human kilde. Strukturen ("framework") av immunglobulinet kan være human, humanisert eller ikke-human, f.eks., en murin struktur ("framework") modifisert for å redusere antigenisitet hos mennesker eller en syntetisk struktur ("framework"), f.eks., en konsensussekvens.
Som anvendt her refererer "isotype" til antistoffklassen (f.eks., IgM eller IgGi) som er kodet for av tung kjede konstant region-gener.
Betegnelsen "antigenbindende del" av et antistoff (eller ganske enkelt "antistoff-andel," eller "del"), som anvendt her, angir en del av et antistoff som spesifikt binder til et toksin fra C. difficile (f.eks., toksin A), f.eks., et molekyl i hvilket én eller flere immunglobulinkjeder ikke er fullengde, men som spesifikt binder til et toksin. Eksempler på bindende deler omfattet innenfor betegnelsen "antigen-bindende del" av et antistoff omfatter (i) et Fab-fragment, et monovalent fragment bestående av VLC, VHC, CL og CH1 -domenene; (ii) et F(ab')2-fragment, et bivalent fragment omfattende to Fab-fragmenter bundet av en disulfidbro ved hengselsregionen; (iii) et Fd-fragment bestående av VHC og CH1 -domenene; (iv) et Fv-fragment bestående av VLC og VHC-domenene av en enkelt arm av et antistoff, (v) et dAb-fragment (Ward et al, Nature 341:544-546, 1989), som består av et VHC-domene; og (vi) en isolert komplementaritetsbestemmende region (CDR) som har tilstrekkelig struktur ("framework") til å spesifikt binde til, f.eks., en antigenbindende del av en variabel region. En antigenbindende del av en lett kjede variabel region og en antigenbindende del av en tung kjede variabel region, f.eks., de to domenene av Fv-fragmentet, VLC og VHC, kan forbindes ved anvendelse av rekombinante metoder, ved en syntetisk linker som muliggjør fremstilling av disse som en enkelt proteinkjede hvor VLC og VHC-regionene pares for å danne monovalente molekyler (kjent som enkeltkjede Fv (scFv); se f. eks., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; og Huston et al.
(1988) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Slike enkeltkjede antistoffer er også omfattet innenfor betegnelsen "antigenbindende del" av et antistoff. Disse antistoff-andelene blir oppnådd ved anvendelse av konvensjonelle teknikker kjent for fagfolk på området og delene blir screenet for nytte på samme måte som intakte antistoffer.
Betegnelsen "monospesifikt antistoff" refererer til et antistoff som oppviser en enkelt bindingsspesifisitet og affinitet for et bestemt mål, f.eks., epitop. Denne betegnelsen omfatter et "monoklonalt antistoff eller "monoklonalt antistoff-blanding," hvilket som anvendt her refererer til en fremstilling av antistoffer eller deler derav med en enkelt molekylær sammensetning.
Betegnelsen "rekombinant" antistoff, som anvendt her, refererer til antistoffer som blir fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved rekombinante metoder, slik som antistoffer uttrykt ved anvendelse av en rekombinant ekspresjonsvektor transfektert inn i en vertscelle, antistoffer isolert fra et rekombinant, kombinatorisk antistoff-bibliotek, antistoffer isolert fra et dyr (f.eks., en mus) som er transgen for humane immunglobulingener eller antistoffer fremstilt, uttrykt, dannet eller isolert ved hvilke som helst andre metoder som omfatter spleising av humane immunglobulin-gensekvenser til andre DNA-sekvenser. Slike rekombinante antistoffer omfatter humaniserte, CDR-bundne ("grafted"), kimære, in vitro-fremstilte (f.eks., ved fag-display) antistoffer og kan eventuelt omfatte konstante regioner avledet fra humane kjønnscelle immunglobulinsekvenser.
Som anvendt heri refererer betegnelsen "hovedsakelig identisk" (eller "hovedsakelig homolog") til en første aminosyre eller nukleotidsekvens som inneholder et tilstrekkelig antall av identiske eller ekvivalente (f.eks., med en lignende sidekjede, f.eks., konserverte aminosyresubstitusjoner) aminosyrerester eller nukleotider som en andre aminosyre eller nukleotidsekvens slik at den første og andre aminosyren eller nukleotidsekvensene har lignende aktiviteter. I tilfellet av antistoffer, har det andre antistoffet samme spesifisitet og har minst 50% av affiniteten til det første antistoffet.
Beregninger av "homologi" mellom to sekvenser utføres som følger. Sekvensene blir sammenstilt for optimale sammenligningsformål (f.eks., gaps kan innføres i én eller begge av en første og en andre aminosyre eller nukleinsyresekvens for optimal sammenstilling og ikke-homologe sekvenser kan overses for sammenligningsformål). Lengden av en referansesekvens sammenstilt for sammenligningsformål er minst 50% av lengden av referansesekvensen. Aminosyrerestene eller nukleotidene ved tilsvarende aminosyreposisjoner eller nukleotidposisjoner blir deretter sammenlignet. Når en posisjon i den første sekvensen er okkupert av samme aminosyrerest eller nukleotid som den tilsvarende posisjonen i den andre sekvensen, så er molekylene identiske ved denne posisjonen (som anvendt her er aminosyre eller nukleinsyre-"identitet" ekvivalent med aminosyre eller nukleinsyre-"homologi"). Prosent identitet mellom de to sekvensene er en funksjon av antallet identiske posisjoner felles for sekvensene, tatt i betraktning antallet gaps og lengden av hvert gap, som må innføres for optimal sammenstilling av de to sekvensene.
Sammenligning av sekvenser og bestemmelse av prosent homologi mellom to sekvenser kan gjennomføres ved anvendelse av en matematisk algoritme. Prosent homologi mellom to aminosyresekvenser blir bestemt ved anvendelse av Nedleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970, -algoritme som har blitt innført i GAP-programmet i GCG programvarepakken, ved anvendelse av en Blossum 62 scoringsmatrise med en gap straff på 12, en gap utvidelse straff på 4 og en gap straff for skift i leseramme pa 5.
Som anvendt heri beskriver betegnelsen "hybridiserer under lav stringens, medium stringens, høy stringens eller svært høy stringens-betingelser" betingelser for hybridisering og vasking. Veiledning for utførelse av hybridiseringsreaksjoner kan finnes i Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6,3,1-6,3,6, 1989. Vandige og ikke-vandige metoder er beskrevet i denne referansen og begge kan anvendes. Spesifikke hybridiseringsbetingelser referert til her er som følger: 1) lav stringens hybridiseringsbetingelser: 6X natriumklorid/natriumcitrat (SSC) ved ca. 45°C, fulgt av to vaskinger i 0,2X SSC, 0,1% SDS minst ved 50°C (temperaturen av vaskingene kan økes til 55°C for lav stringens-betingelser); 2) medium stringens hybridiseringsbetingelser: 6X SSC ved ca. 45°C, fulgt av én eller flere vaskinger i 0,2X SSC, 0,1% SDS ved 60°C; 3) høy stringens hybridiseringsbetingelser: 6X SSC ved ca. 45°C, fulgt av én eller flere vaskinger i 0,2X SSC, 0,1% SDS ved 65°C; og 4) svært høy stringens hybridiseringsbetingelser: 0,5 M natriumfosfat, 7% SDS ved 65°C, fulgt av én eller flere vaskinger ved 0,2X SSC, 1% SDS ved 65°C.
Det er forstått at antistoffene og antigenbindende deler derav beskrevet her kan ha ytterligere konservative eller ikke-essensielle aminosyresubstitusjoner, som ikke har en vesentlig effekt på polypeptidfunksjonene. Hvorvidt eller ikke en bestemt substitusjon vil bli tolerert, dvs., ikke vil negativt påvirke ønskede biologiske egenskaper, slik som bindingsaktivitet, kan bestemmes som beskrevet i Bowie et al, Science, 247:1306-1310, 1990. En "konservativ aminosyresubstitusjon" er én hvor en aminosyrerest blir erstattet med en aminosyrerest som har en lignende sidekjede. Familier av aminosyrerester som har lignende sidekjeder er definert på området. Disse familiene omfatter aminosyrer med basiske sidekjeder (f.eks., lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (f.eks., asparaginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (f.eks., asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin, cystein), ikke-polare sidekjeder (f.eks., glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan), beta-forgrenede sidekjeder (f.eks., treonin, valin, isoleucin) og aromatiske sidekjeder (f.eks., tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin).
En "ikke-essensiell" aminosyrerest er en rest som kan endres fra villtypesekvensen av et polypeptid, slik som et bindemiddel, f.eks., et antistoff, uten hovedsakelig endring av biologisk aktivitet, mens en "essensiell" aminosyrerest resulterer i en slik forandring.
Hvis ikke på annen måte definert, har alle tekniske og vitenskapelige betegnelser anvendt her samme betydning som vanlig forstått av en fagmann på området til hvilket foreliggende oppfinnelse tilhører. Selv om metoder og materialer som ligner eller er ekvivalente med de beskrevet her kan anvendes ved utøvelse eller testing ifølge foreliggende oppfinnelse, er egnede metoder og materialer beskrevet nedenfor.
Oversikt
C. difficile er en gram-positiv toksinproduserende bakterie som forårsaker antibiotika-assosiert diaré og kolitt hos mennesker. Tilveiebrakt heri er fremgangsmåter og blandinger for behandling og forebygging av C. dijficile- assosiert sykdom (CDAD). Blandingene omfatter antistoffer som gjenkjenner proteiner og andre molekylære komponenter (f.eks., lipider, karbohydrater, nukleinsyrer) fra C. dijfficile- baktenei, omfattende antistoffer som gjenkjenner toksiner produsert av C. difficile (f.eks., toksin A og toksin B). Spesielt tilveiebringes human monoklonale antistoffer. I visse utførelsesformer, produseres disse humane monoklonale antistoffene i mus som uttrykker humane immunglobulin-gensegmenter (beskrevet nedenfor). Kombinasjoner av anti-toksin antistoffer tilveiebringes også.
De nye fremgangsmåtene omfatter administrering av antistoffer (og antigen-bindende deler derav) som binder til et C. difficile- Xoksm til et subjekt for å hemme CD AD hos subjektet. For eksempel kan humane monoklonale anti-toksin A-antistoffer beskrevet heri nøytralisere toksin A og hemme tilbakefall av C. difficile- medieTt sykdom. I andre eksempler kan kombinasjoner av anti-toksin A-antistoffer (f.eks., anti-toksin A monoklonale antistoffer) og anti-toksin B antistoffer administreres for å hemme primær sykdom og redusere forekomsten av tilbakefall av sykdom. De humane monoklonale antistoffene kan lokaliseres til sykdomssteder (f.eks., tarmen) in vivo.
1. Fremstilling av antistoffer
Immunogener
Generelt blir dyr immunisert med antigener uttrykt ved C. difficile for å produsere antistoffer. For å produsere anti-toksin-antistoffer, blir dyr immunisert med inaktiverte toksiner eller toksoider. Toksiner kan inaktiveres, f.eks., ved behandling med formaldehyd, glutaraldehyd, peroksid eller oksygenbehandling (se f.eks., Relyveld et al., Methods in Enzymology^ 93:24, 1983; Woodrow og Levin, eds., New Generation Vaccines, Marcel Dekker, Inc., New York, 1990). Mutante C. difficile- Xoksmex med redusert toksisitet kan fremstilles ved anvendelse av rekombinante metoder (se f.eks., U.S. Pat. 5,085,862; 5,221,618; 5,244,657; 5,332,583; 5,358,868; og 5,433,945). For eksempel kan mutanter inneholdende delesjoner eller punktmutasjoner i det aktive setet i toksinet fremstilles. Rekombinante fragmenter av toksinene kan anvendes som immunogener. En annen metode er å inaktivere toksinet ved behandling med UDP-dialdehyd (Genth et al, Inf. and Immun., 68(3): 1094-1101, 2000). Denne metoden bevarer den native strukturen av toksinet lettere enn andre behandlinger og kan således fremkalle antistoffer mer reaktive mot det native toksinet. Denne metoden er også beskrevet i Eksempel 1, nedenfor.
Anti-toksin antistoffer som binder og nøytraliserer toksin A kan interagere med spesifikke epitoper av toksin A. For eksempel kan et anti-toksin A antistoff binde en epitop i en N-terminal region av toksin A (f.eks., mellom aminosyrene 1-1033 av toksin A) eller en C-terminal region (f.eks., mellom aminosyrene 1853-2710 av toksin A). I ett eksempel, binder et antistoff som binder og nøytraliserer toksin A til en epitop innenfor aminosyrene 1853-2710 av toksin A.
Tilsvarende kan anti-toksin B-antistoffer gjenkjenne en spesifikk epitop på toksin B, f.eks., en N-terminal epitop eller en C-terminal epitop. I ett eksempel binder et antistoff som binder og nøytraliserer toksin B til en epitop innenfor aminosyrene 1777-2366 av toksin B.
Fremstilling av humane monoklonale antistoffer i HuMAb - mus
Monoklonale antistoffer kan fremstilles på en måte som ikke er mulig med polyklonale antistoffer. Polyklonale antisera er forskjellige fra dyr til dyr, mens monoklonale fremstillinger fremviser en jevn antigen spesifisitet. Murine dyresystemer er anvendelige for fremstilling av monoklonale antistoffer og fremgangsmåter for immunisering, teknikker for å isolere og fusjonere splenocytter og metoder og reagenser for å produsere hybridomer er velkjente. Monoklonale antistoffer kan produseres ved en rekke teknikker, omfattende konvensjonell monoklonal antistoff-metodikk, f.eks., standard hybridiseringsteknikk for somatiske celler ved Kohler og Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Se generelt, Harlow, E. og Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988.
Selv om disse standardteknikkene er kjent, er det ønskelig å anvende humaniserte eller humane antistoffer heller enn murine antistoffer for å behandle mennesker, fordi mennesker iverksetter en immunrespons mot antistoffer fra mus og andre arter. Immunresponsen mot murine antistoffer kalles en human anti-mus antistoff eller HAMA-respons (Schroff, R. et al, Cancer Res., 45, 879-885, 1985) og er en tilstand som forårsaker serumsykdom hos mennesker og resulterer i rask clearance av de murine antistoffene fra et individs sirkulasjon. Immunresponsen hos mennesker er vist å være mot både den variable og den konstante regionen av murine immunglobuliner. Humane monoklonale antistoffer er sikrere for administrering til mennesker enn antistoffer avledet fra andre dyr og humane polyklonale antistoffer.
En anvendelig type dyr i hvilket humane monoklonale antistoffer kan fremstilles er en transgen mus som uttrykker humane immunglobulingener heller enn dens egne mus immunglobulingener. Slike transgene mus, f.eks., "HuMAb™"-mus, inneholder humane immunglobulingen miniloci som koder for ikke rearrangerte human tung (\ i og y) og k lett kjede immunglobulinsekvenser, sammen med målrettede mutasjoner som inaktiverer de endogene \ i og k kjede loci (se f.eks., Lonberg, N. et al, Nature 368(6474): 856-859,1994 og U.S. Pat. 5,770,429). Følgelig oppviser musen redusert ekspresjon av mus IgM eller k og som respons på immunisering, gjennomgår de innførte humane tung og lett kjede transgenene klasse switching og somatisk mutasjon for å danne humane IgGic monoklonale antistoffer med høy affinitet (Lonberg, N. et al, supra, gjennomgått i Lonberg, N. HandbookofExperimentalPharmacology 113:49-101, 1994; Lonberg, N. og Huszar, D., Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93, 1995 og Harding, F. og Lonberg, N., Ann. NY. Acad. Sei., 764:536-546, 1995).
Fremstilling av slike transgene mus er beskrevet mer detaljert i Taylor, L. et al, Nucleic Acids Research, 20:6287-6295, 1992; Chen, J. et al, InternationalImmunology 5: 647-656, 1993; Tuaillon et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 90:3720-3724,1993; Choi et al, Nature Genettes, 4:117-123, 1993; Chen, J. etal., EMBOJ. ,12: 821-830, 1993; Tuaillon et al, J. Immunol., 152:2912-2920, 1994; Taylor, L. et al, International Immunology, 6: 579-591,1994; og Fishwild, D. et al, Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996. Se videre U.S. Pat. 5,545,806; U.S. Pat. 5,569,825, U.S. Pat. 5,625,126, U.S. Pat. 5,633,425, U.S. Pat. 5,661,016, U.S. Pat. 5,770,429, U.S. Pat. 5,789,650, U.S. Pat. 5,814,318, U.S. Pat. 5,874,299 og U.S. Pat. 5,877,397, alle ved Lonberg og Kay og PCT-publikasjoner nr. WO 01/14424, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227 og WO 92/03918.
For å fremstille fullstendig humane monoklonale antistoffer mot et antigen, kan HuMAb-mus immuniseres med et immunogen, som beskrevet av Lonberg, N. et al. Nature, 368(6474): 856-859, 1994; Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996 og WO 98/24884. Fortrinnsvis vil musene være 6-16 uker gamle ved den første immuniseringen. For eksempel kan en renset fremstilling av inaktivert toksin A anvendes for å immunisere HuMAb-musene intraperitonealt. For å fremstille antistoffer mot C. diJfjficile- pTotemer, lipider og/eller karbohydratmolekyler, kan mus immuniseres med drepte eller ikke-viable C. d/$?cz7e-organismer.
Transgene HuMAb-mus responderer best når initielt immunisert intraperitonealt (TP) med antigen i complete Freund's adjuvans, etterfulgt av IP immuniseringer hver andre uke (opptil totalt 6) med antigen i incomplete Freund's adjuvans. Immunresponsen kan overvåkes under immuniseringprotokollen ved plasmaprøver oppnådd ved retroorbitale tappinger. Plasmaet kan screenes, for eksempel ved ELISA eller flow cytometri og mus med tilstrekkelig titere av anti-toksin humant immunglobulin kan anvendes for fusjoner. Mus kan boostes intravenøst med antigen 3 dager før avlivning og fjerning av milten. Det er forventet at det kan være nødvendig å gjennomføre 2-3 fusjoner for hvert antigen. Mange mus blir typisk immunisert for hvert antigen.
Splenocyttene fra mus kan isoleres og fusjoneres med PEG til en mus myelomcellelinje basert på standardmetoder. De resulterende hybridomene blir deretter screenet for fremstilling av antigen-spesifikke antistoffer. For eksempel blir enkeltcellesuspensjoner av milt lymfocytter fra immuniserte mus fusjonert med én sjettedel av antallet P3X63-Ag8,653 ikke-sekreterende mus myelomceller (ATCC, CRL 1580) med 50% PEG. Celler plates ut ved omtrent 2xl0<5>i flatbunnet mikrotiterplate, etterfulgt av to ukers inkubering i selektivt medium inneholdende 20% føtalt Clone Serum, 18% "653" kondisjonert medium, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 enheter/ml penicillin, 50 mg/ml streptomycin, 50 mg/ml gentamycin og lx HAT (Sigma; HAT blir tilsatt 24 timer etter fusjonen). Etter to uker blir celler dyrket i medium hvor HAT er erstattet med HT. Supernatanter fra individuelle brønner blir deretter screenet ved ELISA for humane anti-toksin celle monoklonal IgM og IgG-antistoffer. De antistoff-utskillende hybridomene plates ut på nytt, screenes igjen og dersom de fortsatt er positive for human IgG, kan anti-toksin monoklonale antistoffer, subklones minst to ganger ved "limiting dilution". De stabile subklonene blir deretter dyrket in vitro for fremstilling av små mengder av antistoff i vevskulturmedium for karakterisering.
I én utførelsesform omfatter det transgene dyret anvendt for å fremstille humane antistoffer mot toksinet minst én, typisk 2-10 og noen ganger 25-50 eller flere kopier av transgenet beskrevet i Eksempel 12 fra WO 98/24884 (f.eks., pHCl eller pHC2) krysset med et dyr inneholdende en enkelt kopi av et lett kjede transgen beskrevet i Eksemplene 5, 6, 8 eller 14 i WO 98/24884 og avkommet krysset med det JH-deleterte dyret beskrevet i Eksempel 1 i WO 98/24884. Dyr blir krysset til homozygositet for hvert av disse tre trekkene. Slike dyr har den følgende genotypen: en enkelt kopi (pr. haploid sett av kromosomer) av et humant tung kjede ikke-rearrangert mini-lokus (beskrevet i Eksempel 12 i WO 98/24884), en enkelt kopi (pr. haploid sett av kromosomer) av en rearrangert human K lett kjede-konstruksjon (beskrevet i Eksempel 14 i WO 98/24884) og en delesjon ved hvert endogen mus tung kjede lokus som fjerner alle de funksjonelle JH-segmentene (beskrevet i Eksempel 10 i WO 98/24884). Slike dyr krysses med mus som er homozygote for delesjon av JH-segmentene (Eksempel 10 i WO 98/24884) for å produsere avkom som er homozygote for JH-delesjonen og hemizygote for de humane tung og lett kjede konstruksjonene. Det resulterende dyret blir injisert med antigener og anvendt for produksjon av humane monoklonale antistoffer mot disse antigenene.
B-celler isolert fra et slikt dyr er monospesifikke med hensyn til de humane tunge og lette kjedene fordi de inneholder kun en enkelt kopi av hvert gen. Videre vil de være monospesifikke med hensyn til humane eller mus tunge kjeder fordi begge endogene mus tung kjede gen-kopier er ikke-funksjonelle i kraft av delesjonen som spenner over JH-regionen innført som beskrevet i Eksemplene 9 og 12 i WO 98/24884. Videre vil en vesentlig del av B-cellene være monospesifikke når det gjelder de humane eller mus lette kjedene, fordi ekspresjon av enkeltkopien av det rearrangerte human kappa lett kjede genet allelisk og isotypisk vil utelukke rearrangering av de endogene mus kappa og lambda kjede-genene i en betydelig del av B-celler.
I én utførelsesform vil den transgene musen fremvise immunglobulinproduksjon med et betydelig repertoar, ideelt sett hovedsakelig likt det for den native musen. Følgelig vil for eksempel i utførelsesformer hvor de endogene Ig-genene har blitt inaktivert, de totale immunglobulinnivåene variere fra ca. 0,1 til 10 mg/ml serum, f.eks., 0,5 til 5 mg/ml eller minst ca. 1,0 mg/ml. Når et transgen som er i stand til å bevirke en switch til IgG fra IgM har blitt innført i den transgene musen, er forholdet av IgG til IgM i serum hos den voksne musen foretrukket ca. 10:1. IgG til IgM-forholdet vil være mye lavere i den umodne musen. Generelt vil mer enn ca. 10%, f.eks., ca. 40 til 80% av milt og lymfeknute B-cellene uttrykke utelukkende humant IgG-protein.
Repertoaret i den transgene musen vil ideelt sett være nært opptil det vist i en ikke-transgen mus, vanligvis minst ca. 10% av størrelsen, fortrinnsvis 25 til 50% eller mer av størrelsen. Generelt vil minst omtrent tusen forskjellige immunglobuliner (ideelt sett IgG), foretrukket IO<4>til IO6 eller mer, produseres, avhengig primært av antallet forskjellige V, J og D-regioner innført i musens genom. Immunglobulinene vil typisk vise affinitet for preselekterte antigener på minst ca. 107M-\ 10<9>M.-\ lO^M"<1>, lO1^"1, lO^M"<1>eller mer, f.eks., opptil 1013M_1 eller mer.
HuMAb-mus kan produsere B-celler som gjennomgår klasse-switching via intratransgen switch rekombinasjon (cis-switching) og uttrykke immunglobuliner reaktive med toksinet. Immunglobulinene kan være human sekvens-antistoffer, hvor tung og lett kjede polypeptidene er kodet for av humane transgensekvenser, som kan omfatte sekvenser avledet ved somatisk mutasjon og V region rekombinasjon sammenføyninger, så vel som kjønnscelle-kodete sekvenser. Disse human sekvens-immunglobulinene kan refereres til som hovedsakelig identiske med en polypeptidsekvens kodet for av et humant VL eller VH-gensegment og et humant JL eller JL-segment, selv om andre ikke-kjønnscellesekvenser kan være til stede som et resultat av somatisk mutasjon og differensiell V-J og V-D-J rekombinasjon sammenføyninger. Med hensyn til slike human sekvens-antistoffer er de variable regionene av hver kjede typisk minst 80 prosent kodet for av human kjønnscelle V, J og, i tilfellet av tunge kjeder, D, gensegmenter. Ofte er minst 85 prosent av de variable regionene kodet for av humane kjønnscellesekvenser til stede i det transgene dyret. Ofte er 90 eller 95 prosent eller mer av de variabel region-sekvensene kodet for av humane kjønnscellesekvenser til stede i den transgene organismen. Imidlertid, siden ikke-kjønnscellesekvenser blir innført ved somatisk mutasjon og sammenføyning av VJ og VDJ, vil human sekvens-antistoffene ofte ha noen variabel region-sekvenser (og mindre ofte konstant region-sekvenser) som ikke er kodet for av humane V, D eller J-gensegmenter som funnet i det humane transgenet(transgenene) i kjønnscellen fra musen. Typisk vil slike ikke-kjønnscelle sekvenser (eller individuelle nukleotid-
posisjoner) samles i klynger ("cluster") i eller nær CDR'er eller i regioner hvor somatiske mutasjoner er kjent å samles i klynger.
De humane sekvens-antistoffene som binder til toksinet kan være resultatet av isotype switching, slik at humane antistoffer omfattende en human sekvens gammakjede (slik som gamma 1, gamma 2 eller gamma 3) og en human sekvens lett kjede (slik som K) blir produsert. Slike isotype-switchede human sekvens-antistoffer inneholder ofte én eller flere somatiske mutasjoner, typisk i den variable regionen og ofte i eller innenfor ca. 10 rester av en CDR) som et resultat av affinitetsmodning og seleksjon av B-celler ved antigen, spesielt etter sekundær (eller påfølgende) antigen provokasjon. Disse høyaffinitet human sekvens-antistoffene har bindingsaffiniteter på minst ca. lxl 09 M"<1>, typisk minst 5x109M"<1>, ofte mer enn lxl010M"<1>og noen ganger 5x1010M"<1>til lxl011 M"<1>eller høyere.
Anti-toksin antistoffer kan også fremkalles i andre pattedyr, omfattende ikke-transgene mus, mennesker, kaniner og geiter.
Anti - toksin A - antistoffer
Humane monoklonale antistoffer som spesifikt binder til toksin A omfatter antistoffer produsert av 3D8, 1B11 og 3H2-klonene beskrevet her. Antistoffer med variable tung kjede og variable lett kjede regioner som er minst 80% eller mer, identiske med de variable tung og lett kjede regionene av 3D8, 1B11 og 3H2 kan også binde til toksin A. I relaterte utførelsesformer, omfatter anti-toksin A-antistoffer for eksempel de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR) av variable tunge kjeder og/eller variable lette kjeder av 3D8, 1B11 eller 3H2. CDR'ene av de variable tung kjede regionene fra disse klonene er vist i Tabell 1, nedenfor.
CDR'ene av de variable lett kjede regionene fra disse klonene er vist i tabell 2, nedenfor.
CDR'er andelene av immunglobulinene som bestemmer spesifisiteten for et bestemt antigen. I visse utførelsesformer kan CDR'er svarende til CDR'ene i tabellene 1 og 2 som har sekvens variasjoner (f.eks., konservative substitusjoner) binde til toksin A. For eksempel kan CDR'er, i hvilke 1, 2 3, 4 eller 5 rester eller mindre enn 20% av de totale restene i CDR er substituert eller deletert være til stede i et antistoff (eller antigenbindende del derav) som binder toksin A.
Tilsvarende kan anti-toksin antistoffer ha CDR'er som inneholder en konsensussekvens, da sekvensmotiver konservert blant multiple antistoffer kan være viktig for bindingsaktivitet. For eksempel kan CDR1 av en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatte aminosyresekvensen R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A (SEKV ID NR: 25), CDR2 av en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte aminosyresekvensen A-S-X-X-X-S/T (SEKV ID NR:26) og/eller CDR3 av en variabel lett kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav kan omfatte aminosyresekvensen Q-Q-X-X-S/N-X-P/S (SEKV ID NR: 27), hvor X er hvilken som helst aminosyre.
I noen utførelsesformer omfatter CDR1 av en variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav aminosyresekvensen Y-G-M-H (SEKV ID NR:28) og/eller CDR2 av en variabel tung kjede region av antistoffene eller antigenbindende deler derav omfatter aminosyresekvensen I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G (SEKV ID NR29), hvor X er hvilken som helst aminosyre.
Humane anti-toksin antistoffer kan omfatte variable regioner som er produktet av eller avledet fra, spesifikke humane immunglobulingener. For eksempel kan antistoffene omfatte en variabel tung kjede region som er produktet av eller avledet fra et humant VH3-33-gen. En rekke sekvenser for antistoffer avledet fra dette genet er tilgjengelig i GenBank® (se f.eks., Aksesjonsnummer: AJ555951, GI No:29836865; Aksesjonsnummer:AJ556080, GI nr.: 29837087; Aksesjonsnummer.: AJ556038, GI nr.:29837012 og andre humane VH3-33 rearrangerte gensegmenter gitt i GenBank®). Antistoffene kan også eller alternativt, omfatte en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkL19-gen (se f.eks., GenBank® Aksesjonsnummer AJ556049, GI No:29837033 for en partiell sekvens av et rearrangert humant VkL19-gensegment). Som kjent på området og beskrevet i dette avsnittet, ovenfor, blir variable immunglobulinregioner av rekombinante antistoffer avledet ved en fremgangsmåte for rekombinasjon in vivo hvor variabilitet innføres til genomiske segmenter som koder for regionene. Følgelig kan variable regioner avledet fra et humant VH-33 eller VkL19-gen omfatte nukleotider som er forskjellige fra de i genet funnet i ikke-lymfoid vev. Disse nukleotidforskjellene er typisk konsentrert i CDR'ene.
Anti - toksin B antistoffer
Human monoklonale antistoffer som spesifikt binder til toksin B omfatter antistoffer produsert av 124-152, 2A11 og lG10-klonene beskrevet her. Antistoffer med variable tung kjede og variable lett kjede regioner som er minst 80% eller mer, identiske med de variable tung og lett kjede regionene av -152, 2A11 og 1G10 kan også binde til toksin B. I relaterte utførelsesformer omfatter anti-toksin B-antistoffer for eksempel de komplementaritetsbestemmende regionene (CDR) av variable tung kjeder og/eller variable lette kjeder av -152, 2A11 eller 1G10. CDR'ene av de variable tunge kjede regionene fra disse klonene er vist i Tabell 3, nedenfor.
CDR'ene av de variable lett kjede regionene fra disse klonene er vist i Tabell 4, nedenfor.
CDR'er er de delene av immunglobulinene som bestemmer spesifisiteten for et bestemt antigen. I visse utførelsesformer, kan CDR'er svarende til CDR'ene i Tabellene 3 og 4 som har sekvens variasjoner (f.eks., konservative substitusjoner) binde til toksin B. For eksempel kan CDR'er, hvor 1, 2, 3, 4 eller 5 rester eller færre enn 20% av totale rester i CDR, er substituert eller deletert, være til stede i et antistoff (eller antigenbindende del derav) som binder toksin B.
Humane anti-toksin B antistoffer kan omfatte variable regioner som er produktet av eller avledet fra, spesifikke humane immunglobulingener (se Fig. 28-31). For eksempel kan antistoffene omfatte en variabel tung kjede region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 5-51-gen. Antistoffene kan også eller alternativt, omfatte en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkA27-gen og/eller JK1-gen. Som kjent på området og beskrevet i dette avsnittet, ovenfor, blir variable immunglobulinregioner av rekombinante antistoffer avledet ved en fremgangsmåte for rekombinasjon in vivo hvor variabilitet innføres til genomiske segmenter som koder for regionene. Følgelig kan variable regioner avledet fra et humant VH-5-51 eller VkA27/JKl-gen omfatte nukleotider som er forskjellige fra de i genet funnet i ikke-lymfoid vev. Disse nukleotidforskjellene er typisk konsentrert i CDR'ene.
2. Fremstilling og modifikasjon av antistoffer
Mange forskjellige former av anti-toksin antistoffer kan være anvendelige ved hemming av CD AD. Antistoffene kan være av de forskjellige isotypene, omfattende: IgG (f.eks., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD eller IgE. Fortrinnsvis er antistoffet en IgG-isotype, f.eks., IgGl. Antistoffmolekylene kan være fullengde (f.eks., et IgGl eller IgG4-antistoff) eller kan omfatte kun et antigen-bindende fragment (f.eks., et Fab, F(ab')2, Fv eller et enkeltkjede Fv-fragment). Disse omfatter monoklonale antistoffer (f.eks., humane monoklonale antistoffer), rekombinante antistoffer, kimære antistoffer og humaniserte antistoffer, så vel som antigen-bindende deler av foregående.
Anti-toksin antistoffer eller deler derav anvendelige heri kan også være rekombinante antistoffer produsert av vertsceller transformert med DNA som koder for immunglobulin lette og tunge kjeder av et ønsket antistoff. Rekombinante antistoffer kan fremstilles ved kjente genetiske konstruksjonsteknikker. For eksempel kan rekombinante antistoffer fremstilles ved å klone en nukleotidsekvens, f.eks., et cDNA eller genomisk DNA, som koder for immunglobulin lette og tunge kjeder av det ønskede antistoffet. Nukleotidsekvensen som koder for disse polypeptidene blir deretter insertert i en ekspresjonsvektor slik at begge genene er operativt bundet til deres egne transkripsjonelle og translasjonelle ekspresjonskontrollsekvenser. Ekspresjonsvektoren og ekspresjonskontroll-sekvensene velges slik at de er kompatible med ekspresjonsvertscellen som anvendes. Typisk inserteres begge genene i samme ekspresjonsvektor. Prokaryote eller eukaryote vertsceller kan anvendes.
Ekspresjon i eukaryote vertsceller er foretrukket fordi slike celler er mer egnet enn prokaryote celler til å sette sammen og utskille et korrekt foldet og immunologisk aktivt antistoff. Imidlertid kan hvilket som helst antistoff produsert som er inaktivt på grunn av uriktig folding renatureres i henhold til velkjente metoder (Kim og Baldwin, Ann. Rev. Biochem., 51:459-89, 1982). Det er mulig at vertscellene vil produsere deler av intakte antistoffer, slik som lett kjede dimerer eller tung kjede dimerer, hvilke også er antistoffhomologer som beskrevet heri.
Antistoffene beskrevet her kan også produseres i en vertscelle transfectom ved anvendelse av, for eksempel en kombinasjon av rekombinant DNA-teknikker og metoder for gentransfeksjon som er velkjente på området (Morrison, S., Science, 229:1202, 1985). For eksempel kan, i én utførelsesform, genet(genene) av interesse, f.eks., humane antistoffgener, ligeres inn i en ekspresjonsvektor slik som en eukaryot ekspresjonsplasmid slik som anvendt i et GS genekspresjonssystem beskrevet i WO 87/04462, WO 89/01036 og EP 338 841 eller i andre ekspresjonssystemer velkjent på området. Det rensede plasmidet med de klonede antistoffgenene kan innføres i eukaryote vertsceller slik som CHO-celler eller NSO-celler eller alternativt andre eukaryote celler som planteavledet celle, sopper eller gjærceller. Metoden anvendt for å innføre disse gener kan være hvilken som helst metode beskrevet på området, slik som elektroporering, lipofektin, lipofectamin eller ballistisk transfeksjon, hvor celler bombarderes med mikropartikler som bærer DNA'et av interesse (Rodin, et al. Immunol. Lett., 74(3): 197-200, 2000). Etter innføring av disse antistoffgenene i vertscellene, kan celler som uttrykker antistoffet identifiseres og selekteres. Disse cellene representerer transfectomene som deretter kan amplifiseres for deres ekspresjonsnivå og oppskaleres for å produsere antistoffer. Rekombinante antistoffer kan isoleres og renses fra disse kultursupernatantene og/eller celler ved anvendelse av standardteknikker.
Det vil forstås at variasjoner av fremgangsmåtene ovenfor er anvendelige heri. For eksempel kan det være ønsket å transformere en vertscelle med DNA som koder for enten den lette kjeden eller tunge kjeden (men ikke begge) av et antistoff. Rekombinant DNA-teknologi kan også anvendes for å fjerne noe eller alt DNA som koder for en av eller begge de lette og tunge kjedene som ikke er nødvendig for binding, f.eks., den konstante regionen kan modifiseres ved, for eksempel, å deletere spesifikke aminosyrer. Molekylene uttrykt fra slike trunkerte DNA-molekyler er anvendelige ved fremgangsmåtene beskrevet her. I tillegg kan det fremstilles bifunksjonelle antistoffer hvor én tung og én lett kjede binder til et toksin og de andre tunge og lette kjedene er spesifikke for et antigen forskjellig fra toksinet eller en annen epitop av toksinet.
Kimære antistoffer kan fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker kjent på området. For eksempel kan et gen som koder for Fc konstant region av et murint (eller annen art) monoklonalt antistoffmolekyl kløyves med restriksjonsenzymer for å fjerne regionen som koder for den murine Fc, og den ekvivalente delen av et gen som koder for en human Fc konstant region settes inn i stedet (se Robinson et al, Internasjonal patentpublikasjonPCT/US86/02269; Akira, et al, europeisk patentsøknad 184, 187; Taniguchi, M., europeisk patentsøknad 171,496; Morrison et al, europeisk patentsøknad 173,494; Neuberger et al, Internasjonal søknad WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Pat. 4,816,567; Cabilly et al, europeisk patentsøknad 125,023; Better et al. (1988 Science, 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS, 84:3439-3443; Liu et al, 1987, J. Immunol, 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura etal, 1987, Canc. Res., 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature, 314:446-449; og Shaw et al, 1988, J. Nati. Cancer Inst., 80:1553-1559). Kimære antistoffer kan også fremstilles ved rekombinante DNA-teknikker hvor DNA som koder for murine V-regioner kan ligeres til DNA som koder for de humane konstante regionene.
Et antistoff eller en immunglobulinkjede kan humaniseres ved fremgangsmåter kjent på området. For eksempel når murine antistoffer først er oppnådd, kan variable regioner sekvenseres. Lokalisering av CDR'ene og struktur ("framework")-restene kan bestemmes (se Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH-publikasjon nr. 91-3242 og Chotia, C. etal. (1987) J. Mol. Biol, 196:901-917). De lette og tunge kjede variable regionene kan, eventuelt, ligeres til tilsvarende konstante regioner. Riktignok er det forstått at hvilke som helst av antistoffene beskrevet her, omfattende fullstendig humane antistoffer, kan endres (f.eks., ved mutasjon, substitusjon) til å inneholde en substituert konstant region, f.eks., Fc-region eller del(er) derav for å oppnå, for eksempel en ønsket antistoffstruktur, funksjon (f.eks., effektorfunksjon), subtype, allotype, subklasse eller lignende. Anti-toksin antistoffer kan sekvenseres ved anvendelse av teknikker kjent på området. CDR-bundne ("grafted") antistoffmolekyler eller immunglobuliner kan fremstilles ved CDR-binding ("grafting") eller CDR-substitusjon, hvor én, to eller alle CDR'ene av en immunglobulinkjede kan erstattes. Se f.eks., U.S. Pat. 5,225,539; Jones et al, 1986, Nature, 321:552-525; Verhoeyan etal, 1988, Science, 239:1534; Beidler etal, 1988, J. Immunol, 141:4053-4060; og Winter, U.S. Pat. 5,225,539.
Winter beskriver en metode for CDR-binding som kan anvendes for å fremstille antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse (UK Patentsøknad GB 2188638A, innlevert 26. mars, 1987; Winter U.S. Pat. 5,225,539). For eksempel kan alle CDR'ene fra et bestemt antistoff erstattes med minst en del av en human CDR (f.eks., en CDR fra klon 3D8, som vist i Tabellene 1 og 2 og/eller klon 124-152, som vist i Tabellene 3 og 4, ovenfor) eller bare noen av CDR'ene kan erstattes. Det er bare nødvendig å erstatte antall CDR'er nødvendig for binding av antistoffet til et forutbestemt antigen (f.eks., et eksotoksin fra C. difficile).
Humaniserte antistoffer kan fremstilles ved å erstatte sekvenser av Fv variabel region som ikke er direkte involvert i antigenbinding med ekvivalente sekvenser fra humane Fv variable regioner. Generelle metoder for fremstilling av humaniserte antistoffer er gitt ved Morrison, S. L., 1985, Science, 229:1202-1207, by Oi et al, 1986, BioTechniques, 4:214 og ved Queen etal. U.S. Pat. 5,585,089, U.S. Pat. 5,693,761 og U.S. Pat. 5,693,762. Disse metodene omfatter isolering av, manipulering og ekspresjon av nukleinsyresekvensene som koder for hele eller del av immunglobulin Fv variable regioner fra minst én av en tung eller lett kjede. Kilder for slik nukleinsyre er velkjent for fagfolk på området og, kan for eksempel oppnås fra et hybridom som produserer et antistoff mot et forutbestemt mål, som beskrevet ovenfor. Det rekombinante DNA som koder for det humaniserte antistoffet eller fragment derav, kan deretter klones inn i en passende ekspresjonsvektor. Andre teknikker for humanisering av antistoffer er beskrevet i Padlan et al. EP 519596 Al, publisert den 23. desember, 1992.
Også innenfor omfanget av oppfinnelsen er antistoffer hvor spesifikke aminosyrer har blitt substituert, deletert eller tilføyd. Spesielt har foretrukne antistoffer aminosyresubstitusjoner i struktur ("framework")-regionen, for slik å forbedre binding til antigenet. For eksempel kan et utvalgt, lite antall av akseptor struktur ("framework")-rester fra immunglobulinkjeden erstattes av de tilsvarende donoraminosyrene. Foretrukne lokaliseringer av substitusjonene omfatter aminosyrerester i nabostilling til CDR eller som er i stand til å interagere med en CDR (se f.eks., U.S. Pat. 5,585,089). Kriterier for seleksjon av aminosyrer fra donoren er beskrevet i U.S. Pat. 5,585,089 (f.eks., kolonnene 12-16). Akseptor-strukturen ("framework") kan være en moden humant antistoff struktur ("framework")-sekvens eller en konsensussekvens.
En "konsensussekvens" er en sekvens dannet av de hyppigst forekommende aminosyrene (eller nukleotidene) i en familie av relaterte sekvenser (Se f.eks., Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Tyskland 1987). I en familie av proteiner, er hver posisjon i konsensussekvensen opptatt av aminosyren som forekommer oftest ved denne posisjonen i familien. Hvis to aminosyrer forekommer like ofte, kan den ene eller den andre omfattes i konsensussekvensen. En "konsensus struktur ("framework")" av et immunoglobulin angir en struktur ("framework")-region i konsensus immunglobulinsekvensen.
Et anti-toksin antistoff eller antigenbindende del derav, kan være derivatisert eller bundet til et annet funksjonelt molekyl (f.eks., et annet peptid eller protein). For eksempel kan et antistoff være funksjonelt bundet (ved kjemisk kobling, genetisk fusjon, ikke-kovalent assosiering eller på annen måte) til én eller flere andre molekylære enheter, slik som et annet antistoff, et detekterbart middel, et cytotoksisk middel, et farmasøytisk middel og/eller et protein eller peptid som kan mediere assosiering med et annet molekyl (slik som en streptavidin kjerneregion eller et polyhistidin-merke).
En type derivatisert protein er fremstilt ved kryssbinding av to eller flere proteiner (av samme type eller av forskjellige typer). Egnede kryssbindere omfatter de som er heterobifunksjonelle, som har to distinkte reaktive grupper adskilt med en passende spacer (f.eks., m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid-ester) eller homobifunksjonelle (f.eks., disuccinimidyl-suberat). Slike linkere er tilgjengelige fra Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Anvendelige detekterbare midler med hvilke et protein kan derivatiseres (eller merkes) omfatter fluorescerende forbindelser, forskjellige enzymer, protetiske grupper, luminiscerende materialer, bioluminescerende materialer og radioaktive materialer. Eksempler på fluorescerende detekterbare midler omfatter fluorescein, fluorescein-isotiocyanat, rodamin og fycoerytrin. Et protein eller antistoff kan også derivatiseres med detekterbare enzymer, slik som alkalisk fosfatase, pepperrot peroksidase, P-galaktosidase, acetylcholinesterase, glukoseoksidase og lignende. Når et protein er derivatisert med et detekterbart enzym, detekteres det ved tilsetning av ytterligere reagenser som enzymet anvender for å produsere et detekterbart reaksjonsprodukt. For eksempel når det detekterbare midlet pepperrot peroksidase er til stede, fører tilsetning av hydrogenperoksid og diaminobenzidin til et farget reaksjonsprodukt, som er detekterbart. Et protein kan også derivatiseres med en protetisk gruppe (f.eks., streptavidin/biotin og avidin/biotin). For eksempel kan et antistoff derivatiseres med biotin og detekteres gjennom indirekte måling av avidin eller streptavidinbinding.
Merkede proteiner og antistoffer kan anvendes, for eksempel diagnostisk og/eller eksperimentelt i flere sammenhenger, omfattende (i) for å isolere et forutbestemt antigen ved standardteknikker, slik som affinitetskromatografi eller immunopresipitering; og (ii) for å detektere et forutbestemt antigen (f.eks., et toksin, f.eks., i et cellulært lysat eller en pasientprøve) for å kontrollere proteinnivåer i vev som del av en klinisk testingsprosedyre, f.eks., for å bestemme effektiviteten av et gitt behandlingsregime.
Et anti-toksin antistoff eller antigen-bindende fragment derav kan være konjugert til en annen molekylær enhet, slik som et merke.
3. Metoder for screening
Anti-toksin antistoffer kan karakteriseres for binding til toksinet ved en rekke kjente teknikker. Antistoffer blir typiskkarakterisert vedELISA først. I korthet kan mikrotiterplater belegges med toksin eller toksoidantigenet i PB S og deretter blokkeres med irrelevante proteiner slik som bovint serumalbumin (BSA) fortynnet i PBS. Fortynninger av plasma fra toksin-immuniserte mus blir tilsatt til hver brønn og inkubert i 1-2 timer ved 37°C. Platene vaskes med PBS/Tween 20 og inkuberes deretter med en geit-anti-human IgG Fc-spesifikk polyklonal reagens konjugert til alkalisk fosfatase i 1 time ved 37°C. Etter vasking, blir platene utviklet med ABTS-substrat og analysert ved OD 405. Fortrinnsvis vil mus som utvikler de høyeste titerene anvendes for fusjoner.
En ELISA-analyse som beskrevet ovenfor kan anvendes for å screene for antistoffer og, følgelig, hybridomer som produserer antistoffer som fremviser positiv reaktivitet med toksinet. Hybridomer som produserer antistoffer som binder, fortrinnsvis med høy affinitet, til toksinet kan deretter subklones og karakteriseres ytterligere. En klon fra hvert hybridom, som beholder reaktiviteten til de parentale cellene (ved ELISA), kan deretter velges for fremstilling av en cellebank og for antistoffrensning.
For å rense anti-toksin antistoffene, kan valgte hybridomer dyrkes i rollerflasker, to liters spinnerkolber eller andre dyrkingssystemer. Supernatanter kan filtreres og konsentreres før affinitetskromatografi med protein A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.) for å rense proteinet. Etter buffer utveksling til PBS, kan konsentrasjonen bestemmes ved spektrofotometriske metoder.
For å bestemme om de valgte monoklonale antistoffene binder til unike epitoper, kan hvert antistoff bli biotinylert ved anvendelse av kommersielt tilgjengelige reagenser (Pierce, Rockford, 111.). Biotinylert MAb-binding kan detekteres med en streptavidin-merket probe. Anti-toksin antistoffer kan testes ytterligere for reaktivitet med toksinet ved Western blotting.
Andre analyser for å måle aktivitet av anti-toksin antistoffene omfatter nøytraliserings-analyser. In vitro nøytraliserings-analyser kan måle evnen av et antistoff til å hemme en cytopatisk effekt på celler i kultur (se Eksempel 3, nedenfor). In vzvo-analyser for å måle toksin-nøytralisering er beskrevet i Eksemplene 5, 6 og 7, nedenfor.
4. Farmasøytisk blanding og kit
I et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse som angitt ovenfor blandinger, f.eks., farmasøytisk akseptable blandinger, som omfatter et antistoffmolekyl beskrevet her eller antigenbindende del derav, formulert sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.
"Farmasøytisk akseptable bærere" omfatter hvilke som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedia, isotone og midler som forsinker absorpsjon og lignende som er fysiologisk kompatible. Bærerene kan være egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan, parenteral, rektal, spinal eller epidermal administrering (f.eks., ved injeksjon eller infusjon).
Blandingene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være i en rekke former. Disse omfatter for eksempel flytende, halvfaste og faste doseringsformer, slik som flytende løsninger (f.eks., injiserbare og infuserbare løsninger), dispersjoner eller suspensjoner, liposomer og suppositorier. Den foretrukne formen avhenger av den tilsiktede administreringsmetoden og terapeutiske anvendelsen. Anvendelige blandinger er i form av injiserbare eller infuserbare løsninger. En anvendelig administreringsmetode er parenteral (f.eks., intravenøs, subkutan, intraperitoneal, intramuskulær). For eksempel kan antistoffet eller antigenbindende del derav administreres ved intravenøs infusjon eller injeksjon. I en annen utførelsesform administreres antistoffet eller antigenbindende del derav ved intramuskulær eller subkutan injeksjon.
Uttrykkene "parenteral administrering" og "administrert parenteralt" som anvendt her betyr administreringsmetoder forskjellig fra enteral og topisk administrering, vanligvis ved injeksjon og omfatter, uten begrensning, intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardiell, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkutan, subkutikulær, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoidal, intraspinal, epidural og intrasternal injeksjon og infusjon.
Terapeutiske blandinger skulle typisk være sterile og stabile under betingelsene for fremstilling og lagring. Blandingene kan formuleres som en løsning, mikroemulsjon, dispersjon, liposom eller annen ordnet struktur egnet for høy konsentrasjon av antistoff. Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved å inkorporere den aktive forbindelsen ( dvs., antistoff eller antistoff-andel) i den nødvendige mengden i et passende løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av bestanddeler oppregnet ovenfor, som nødvendig, fulgt av filtersterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen i en steril bærer som inneholder et basisk dispersjonsmedium og nødvendige andre bestanddeler av de oppregnet ovenfor. I tilfelle av sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger, er de anvendelige fremstillingsmetodene vakuum tørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive bestanddelen pluss hvilken som helst ytterligere ønsket bestanddel fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav. Riktig fluiditet av en løsning kan opprettholdes, for eksempel ved anvendelse av et belegg slik som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelsen i tilfellet av dispersjon og ved anvendelse av surfaktanter. Forlenget absorpsjon av injiserbare blandinger kan foranlediges ved å omfatte i blandingen et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel monostearatsalter og gelatin.
Antistoffene og antistoff-andelene beskrevet her kan administreres ved en rekke metoder kjent på området og for mange terapeutiske anvendelser. Som det vil forstås av fagfolk, vil ruten og/eller administreringsmetoden variere avhengig av de ønskede resultatene.
I visse utførelsesformer kan et antistoff eller antistoff-andel derav administreres oralt, for eksempel med et inert fortynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Forbindelsen (og andre bestanddeler, om ønsket) kan også innelukkes i en gelatinkapsel med hardt eller mykt skall, presses til tabletter eller blandes direkte inn i subjektets diett. For oral terapeutisk administrering, kan forbindelsene innføres med tilsetningsmidler og anvendes i form av tabletter som kan inntas, bukkale tabletter, trokéer, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, kjeks og lignende. For å administrere en forbindelse ifølge oppfinnelsen på annen måte enn ved parenteral administrering, kan det være nødvendig å belegge forbindelsen med eller koadministrere forbindelsen med, et materiale for å forhindre dens inaktivering. Terapeutiske blandinger kan administreres med medisinske anordninger kjent på området.
Doseregimer reguleres for å gi optimal ønsket respons (f.eks., en terapeutisk respons). For eksempel kan en enkelt bolus administreres, mange oppdelte doser kan administreres over tid eller dosen kan bli proporsjonalt redusert eller økt som angitt nødvendig ved den terapeutiske situasjonen. Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale blandinger i form av doseringsenheter for enkel administrering og ensartethet av doser. Doseringsenhetsform som anvendt her angir fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoser for subjektene som skal behandles; hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet for å frembringe den ønskede terapeutiske effekten sammen med den nødvendige farmasøytiske bæreren. Spesifisering av doseringsenhetsformene blir diktert av og er direkte avhengig av (a) de unike egenskapene av den aktive forbindelsen og den spesielle terapeutiske effekten som skal oppnås og (b) begrensningene knyttet til området som angår formulering av en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet hos individer.
Et eksempel på et ikke-begrensende område for en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av et antistoff eller antistoff-andel er 0,1-60 mg/kg, f.eks., 0,5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg eller 0,75-10 mg/kg. Det skal videre forstås at for ethvert bestemt subjekt, skulle spesifikke doseregimer reguleres over tid i henhold til det individuelle behovet og fagmessig bedømmelse ved personen som administrerer eller har oppsyn med administrering av blandingene og at doseområder angitt her kun er eksempler og ikke er ment å begrense omfanget eller tilpasningen av blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse.
Også innenfor omfanget ifølge oppfinnelsen er settet som angitt ovenfor. Settet kan omfatte én eller flere andre elementer omfattende: instruksjoner for anvendelse; andre reagenser, f.eks., et merke, et terapeutisk middel eller et middel anvendelig for å chelatere eller på annen måte koble, et antistoff til et merke eller terapeutisk middel eller andre materialer for fremstilling av antistoffet for administrering; farmasøytisk akseptable bærere; og anordninger eller andre materialer for administrering til et subjekt.
Forskjellige kombinasjoner av antistoffer kan pakkes sammen. For eksempel kan settet omfatte antistoffer som binder til toksin A (f.eks., antistoffer som omfatter variable tung og lett kjede regioner av 3D8) og antistoffer som binder til toksin B (f.eks., humane monoklonale anti-toksin B-antistoffer, f.eks., 124-152, 2A11 og/eller 1G10 eller polyklonale antisera reaktive med toksin B). Antistoffene kan blandes sammen eller pakkes separat i settet.
Instruksjoner for anvendelse kan omfatte instruksjoner for terapeutisk anvendelse omfattende foreslåtte doser og/eller administreringsmetoder, f.eks., for en pasient med et symptom på CD AD. Andre instruksjoner kan omfatte instruksjoner angående kobling av antistoffet til en chelator, et merke eller et terapeutisk middel eller for rensning av et konjugert antistoff, f.eks., fra ureagerte komponenter for konjugering.
Settet kan omfatte et detekterbart merke, et terapeutisk middel og/eller et reagens anvendelig for å chelatere eller på annen måte koble et merke eller terapeutisk middel til
antistoffet. Koblingsmidler omfatter midler slik som N-hydroksysuccinimid (NHS). I slike tilfeller kan kitet omfatte én eller flere av en reaksjonsbeholder for å utføre reaksjonen eller en separasjonsanordning, f.eks., en kromatografisk kolonne, for anvendelse ved separasjon av det ferdige produktet fra utgangsmaterialer eller intermediater fra reaksjonen.
Settet kan videre inneholde minst én ytterligere reagens, slik som et diagnostisk eller terapeutisk middel, f.eks., et diagnostisk eller terapeutisk middel som beskrevet her og/eller én eller flere ytterligere anti-toksin eller anti-C. difftcile- antistoifer (eller deler derav), formulert som passende, i ett eller flere separate farmasøytiske preparater.
Andre sett kan omfatte optimaliserte nukleinsyrer som koder for anti-toksin-antistoffer og instruksjoner for ekspresjon av nukleinsyrene.
5. Terapeutiske fremgangsmåter og blandinger
De nye proteinene og antistoffene har in vitro og in vivo terapeutiske, profylaktiske og diagnostiske anvendelser. For eksempel kan disse antistoffene administreres til celler i kultur, f.eks., in vitro eller ex vivo eller til et subjekt, f.eks., in vivo, for å behandle, hemme, forhindre tilbakefall og/eller diagnostisere C. difficile og sykdom forbundet med C. difficile.
Som anvendt her, skal betegnelsen "subjekt" omfatte mennesker og ikke-humane dyr. Betegnelsen "ikke-humane dyr" omfatter alle virveldyr, f.eks., pattedyr og ikke-pattedyr, slik som ikke-humane primater, kyllinger, mus, hunder, katter, griser, kuer og hester.
Proteinene og antistoffene kan anvendes for celler i kultur, f.eks., in vitro eller ex vivo. For eksempel kan celler dyrkes in vitro i dyrkningsmedium og kontakt-trinnet kan utføres ved tilsetning av anti-toksin-antistoffet eller fragment derav, til dyrkningsmediet. Fremgangsmåtene kan utføres på virioner eller celler til stede i et subjekt, som del av en in vivo (f.eks., terapeutisk eller profylaktisk)-fremgangsmåte. For in vivo utførelsesformer, utføres kontakt-trinnet i et subjekt og omfatter å administrere et anti-toksin antistoff eller del derav til subjektet under betingelser effektive for å tillate binding av antistoffet eller andelen, til hvilket som helst toksin uttrykt ved bakterier i subjektet, f.eks., i tarmen.
Administreringsmetoder for antistoffmolekyler er beskrevet her. Egnede doser av molekylene anvendt vil avhenge av alderen og vekten til subjektet og det bestemte medikamentet anvendt. Antistoffmolekylene kan anvendes som kompetitive midler for ligandbinding for å hemme eller redusere en uønsket interaksjon, f.eks., for å hemme binding av toksiner til tarmepitelet.
Anti-toksin-antistoffene (eller antigenbindende deler derav) kan administreres i kombinasjon med andre anti-C. i##?cz7e-antistoffer (f.eks., andre monoklonale antistoffer, polyklonalt gamma-globulin). Kombinasjoner av antistoffer som kan anvendes omfatter et anti-toksin A antistoff eller antigenbindende del derav og et anti-toksin B-antistoff eller antigenbindende del derav. Anti-toksin A-antistoffet kan være 3D8, et antistoff som omfatter de variable regionene av 3D8 eller et antistoff med variable regioner minst 90% identisk med de variable regionene av 3D8. Anti-toksin B-antistoffet kan være 124-152, 2A11,1G10 eller et antistoff med variable regioner minst 90% identiske med de variable regionene av de foregående, f.eks., 124-152. Kombinasjoner av anti-toksin A (f.eks., 3D8) og anti-toksin B-antistoffer (f.eks., 124-152) kan gi kraftig hemming av CD AD.
Det er forstått at hvilket som helst av midlene heri, for eksempel anti-toksin A eller anti-toksin B-antistoffer eller fragmenter derav, kan kombineres, for eksempel i forskjellige forhold eller mengder, for forbedret terapeutisk effekt. Faktisk kan midlene beskrevet heri formuleres som en blanding eller kjemisk eller genetisk bundet ved anvendelse av teknikker kjent på området hvilket resulterer i kovalent bundne antistoffer (eller kovalent bundne antistoffragmenter), som har både anti-toksin A og anti-toksin B-bindingsegenskaper. Den kombinerte formuleringen kan veiledes av en bestemmelse av én eller flere parametere slik som affiniteten, aviditeten eller biologisk effektivitet av midlet alene eller i kombinasjon med et annet middel. Midlene kan også administreres i kombinasjon med andre midler som forbedrer tilgjengeligheten, halveringstiden eller stabiliteten av det terapeutiske midlet ved målretting, klaring og/eller kelatering av C. difficile eller et antigen derav.
Slike kombinasjonsterapier er fortrinnsvis additive og til og med synergistiske i deres terapeutiske aktivitet, f.eks., ved hemming, forebygging (f.eks., av tilbakefall) og/eller behandling av C. difficile- Telaterte sykdommer eller lidelser (se f.eks., Eksempel 16 som viser effektiviteten av enkle og kombinerte antistoffbehandlinger). Administrering av slike kombinasjonsterapier kan redusere dosen av det terapeutiske midlet (f.eks., antistoff eller antistoffragment-blanding eller kryssbundet eller genetisk fusjonert bispesifikt antistoff eller antistoffragment) nødvendig for å oppnå den ønskede effekten.
Immunogene blandinger som inneholder en immunogen effektiv mengde av et toksin eller fragmenter derav, er beskrevet her og kan anvendes ved fremstilling av anti-toksin antistoffer. Immunogene epitoper i en toksins ekvens kan identifiseres i henhold til metoder kjent på området og proteiner eller fragmenter inneholdende disse epitopene kan leveres ved forskjellige metoder, i en vaksineblanding. Egnede blandinger kan for eksempel omfatte lipopeptider (f.eks., Vitiello etal, J. Clin. Invest. 95:341 (1995)), peptidblandinger innkapslet i poly(DL-laktid-ko-glykolid) ("PLG") mikrosfærer (se f.eks., Eldridge etal., Molec. Immunol. 28:287-94 (1991); Alonso etal, Vaccine 12:299-306
(1994); Jones etal, Vaccine 13:675-81 (1995)), peptidblandinger inneholdt i immunstimulerende komplekser (ISCOMS) (se f.eks., Takahashi etal, Nature 344:873-75
(1990); Hu etal, Clin. Exp. Immunol 113:235-43 (1998)) og multiple antigen peptidsystemer (MAPs) (se f.eks., Tam, Proe. Nati Acad. Sei. U. S. A. 85:5409-13 (1988); Tam, J. Immunol. Methods 196:17-32 (1996)).
Anvendelige bærere som kan anvendes med immunogene blandinger ifølge oppfinnelsen er velkjente og omfatter for eksempel tyroglobulin, albuminer slik som humant serumalbumin, tetanus toksoid, polyaminosyrer slik som poly L-lysin, poly L-glutaminsyre, influensa, hepatitt B-virus kjerneprotein og lignende. Blandingene kan inneholde et fysiologisk tolererbart ( dvs., akseptabelt) fortynningsmiddel slik som vann eller saltoppløsning, typisk fosfatbufret saltoppløsning. Blandingene og vaksiner omfatter typisk også en adjuvans. Adjuvantia slik som incomplete Freund's adjuvans, aluminiumfosfat, aluminiumhydroksid eller alun er eksempler på materialer velkjente på området. I tillegg kan CTL-responser bli primet ved konjugering av toksiner (eller fragmenter, inaktive derivater eller analoger derav) til lipider, slik som tripalmitoyl-S-glycerylcysteinyl-seryl-serin (P3CSS).
Anti-toksin-antistoffene kan administreres i kombinasjon med andre midler, slik som blandinger for å behandle CD AD. Terapeutiske midler som kan administreres i kombinasjon med anti-toksin antistoffer omfatter for eksempel antibiotika anvendt for å behandle CD AD, slik som vankomycin, metronidazol eller bacitracin. Antistoffene kan anvendes i kombinasjon med probiotiske midler slik som Saccharomyces boulardii. Antistoffene kan også administreres i kombinasjoner med en C. difficile- vaksine, f.eks., en toksoid-vaksine.
6. Andre metoder
Et anti-toksin antistoff (f.eks., monoklonalt antistoff) kan anvendes for å isolere toksiner ved standardteknikker, slik som affinitetskromatografi eller immunopresipitering. Videre kan et anti-toksin antistoff anvendes for å detektere toksinet (f.eks., i en avføringsprøve), f.eks., for å screene prøver for tilstedeværelse av C. difficile. Anti-toksin antistoffer kan anvendes diagnostisk for å overvåke nivåer av toksinet i vev som del av en klinisk testmetode, f.eks., for å, for eksempel bestemme effektiviteten av et gitt behandlingsregime.
Eksemplifisering
I alle eksemplene, ble de følgende materialene og metodene anvendt hvis ikke annet er angitt.
Materialer og metoder
Generelt anvendes det ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse, hvis ikke annet er angitt, konvensjonelle teknikker for kjemi, molekylærbiologi, rekombinant DNA-teknologi, immunologi (spesielt, f.eks., antistoffteknologi) og standardteknikker for fremstilling av polypeptid. Se, f.eks., Sambrook, Fritsch og Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Iri Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow etal, C.S.HL. Press, Pub. (1999); og Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel etal, John Wiley & Sons (1992).
EKSEMPLER
Oppfinnelsen blir ytterligere beskrevet i de følgende eksemplene.
Eksempel 1 . Fremstilling av anti - toksin A monoklonale antistoffer
C. difficile toksin A ble oppnådd enten fra Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) eller ved rekombinant fremstilling. Toksinet ble renset og inaktivert før immunisering. Inaktivering ble utført ved behandling med reaktivt UDP-dialdehyd, som resulterer i alkylering av katalytiske rester mens naturlig toksinstruktur bevares. For detaljert fremgangsmåte, se Genth etal, Inf and Immun. 68(3):1094-1101, 2000.1 korthet ble renset toksin A inkubert med UDP-2',3'-dialdehyd (0,l-l,0mM) i buffer i 18 timer ved 37°C, filtrert gjennom et 100 kDa-cutoff filter for å fjerne ureagert UDP-2',3'-dialdehyd og vasket med buffer. Inaktivert toksin A (toksoid A) ble anvendt for immunisering.
HCo7 transgene mus, fremstilt som beskrevet ovenfor i avsnittet betegnet "Fremstilling av humane monoklonale antistoffer i HuMAb-mus" og levert av Medarex, Milpitas, CA, ble immunisert intraperitonealt 6-12 ganger hver med 10 \ ig toksoid i RIBI-adjuvans. I transgene HCo7 mus, har det endogene mus kappa lett kjede genet blitt homozygot forstyrret som beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 og det endogene mus tung kjede genet har blitt homozygot forstyrret som beskrevet i Eksempel 1 i PCT-publikasjon WO 01/09187. Transgene HCo7 mus omfatter et humant kappa lett kjede transgen, KCo5, som beskrevet i Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 og HCo7 human tung kjede transgenet som beskrevet i U.S. Patenter nr. 5,545,806; 5,625,825; og 5,545,807. Serum ble oppsamlet fra hver mus og testet for reaktivitet mot toksin A ved ELISA og nøytralisering av cytotoksisitet ved IMR-90-celler. Mus som testet positivt for toksin A-reaktivt og nøytraliserende antiserum ble injisert med 5-10 ug toksoid A gjennom halevenen. Mus ble avlivet og milter ble isolert for fusjon til hybridomer omtrent 3 dager etter utførelse av injeksjon i halevenen.
Klonale hybridomer ble fremstilt og screenet ved ELISA. Prosentandeler av kappa/gamma lett kjede positive, antigenspesifikke og nøytraliserende kloner identifisert ved screening av kloner fremstilt fra fire separate hybridomfusjoner er listet opp i Tabell 5.
Tre hybridom-kloner ble valgt for videre analyse: 3D8, 1B11 og 33,3H2. cDNA'er fra hver klon ble amplifisert ved RT-PCR fra mRNA, klonet og sekvensert. En tung kjede V-region konsensussekvens ble funnet for hver klon. Alle tre klonene benyttet en VH-region avledet fra samme kjønnscelle V region-gen (VH 3-33), men benyttet forskjellige J-sekvenser. Aminosyresekvensene av VH og VL-regionene av hver klon er vist i Figur 1 (SEKV ID NR: 1-6). De komplementaritetsbestemmende regionene (CDR'er) er overstreket i Figuren.
Sekvensanalyse av kappa V (Vklett kjede)-genene viste at HuMAb 1B11 og 33,3H2 hver uttrykker én konsensus kappa kjede V-sekvens. 1B11-hybridomet uttrykte en Vklett kjede avledet fra VkL6 kjønnscelle-genet, mens hybdridomet 33,3H2 uttrykker en Vklett kjede avledet fra VkLI 5 kjønnscellegenet. Ved analyse av VK-klonene fra HuMAb 3D8, ble 6 (I-VI) lette kjeder uttrykt på mRNA-nivå (Figur 1). For å bestemme hvilke av de lette kjedene som ble uttrykt på proteinnivå, ble massespektroskopi og N-terminal sekvensering av det rensede 3D8-antistoffet utført. Når lette kjeder ble isolert fra cellulært protein og analysert ved massespektroskopi, ble det sett en enkelt lett kjede med en masse på 23,569 Dalton. Dette svarte til den lette kjeden med gruppe I-aminosyresekvensen vist i Figur 1, som er avledet fra VkLI9 kjønnscellegenet. N-terminal sekvensering av den lette kjeden bekreftet dette resultatet. Figurene 2A, 3A og 4A viser nukleotid og aminosyresekvensene av Vkav hver 3D8 (gruppe I; SEKV ID NR: 4 og 30-34), 1B11 (SEKV ID NR: 5) og 33,3H2 (SEKV ID NR6) henholdsvis. CDR'ene er overstreket og kjønnscelle Vkog Jker vist.
Følgelig omfatter 3D8-antistoffet en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-33-gen og en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkL19-gen. Antistoffet 1B11 omfatter en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-33-gen og en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkL6-gen. 33,3H2-antistoffet omfatter en tung kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VH 3-33-gen og en lett kjede variabel region som er produktet av eller avledet fra et humant VkLI 5-gen.
Antistoffene 3D8 og 1B11 uttrykker human IgGl konstante regioner og antistoff 33,3H2 uttrykker human IgG3 konstante regioner. Antistoffene beskrevet i Eksemplene 2-7 ble isolert fra disse hybridomene og uttrykker følgelig de variable sekvensene vist i Figur 1 sammen med humane konstante regioner. DNA som koder for den antigenbindende delen av hver klon ble klonet inn i en vektor for å uttrykkes som et humant antistoff for administrering til mennesker.
Eksempel 2 . Bindingsaktivitet av anti - toksin A antistoffer
Binding av hvert antistoff til toksin A ble bestemt ved ELISA ved anvendelse av standardteknikker. Resultatene av denne analysen er vist i Figur 5. Antistoffer produsert av 3D8, 1B11 og 33,3H2 ble sammenlignet med et fjerde humant monoklonalt antistoff med toksin A-bindingsaktivitet, 8E6. Figur 5 viser at antistoffene binder toksin A med komparable affiniteter.
Affiniteten av 3D8 og IB 11-antistoffene til toksin A ble også målt med Biacore® instrument, som detekterer biomolekylære bindingsinteraksjoner med overflate plasmonresonans-teknologi. Hvert antistoff ble tilsatt til protein A-belagte sensor chips og toksin A fikk strømme over chipen for å måle binding. 3D8 hadde en KDpå 14,6 x 10"<10>M. 1B11 hadde en KDpå 7,38 x 10"<10>M. Følgelig binder antistoffene med høy affinitet til toksin A. Disse bindingskonstantene indikerer at antistoffene har affiniteter egnet for anvendelse i human terapi.
Eksempel 3 . Nøytralisering av toksin ved anti - toksin A - antisto ffer
Antistoffer uttrykt ved 1B11, 3D8 og 33,3H2-hybridomer ble testet for toksin A-nøytraliseringsaktivitet in vitro. Celler ble inkubert i nærvær av varierende konsentrasjoner av toksin A, hvilket bevirker at celler blir rundere og mister adherens til celledyrkingsplatene. Cytopatisk effekt (CPE) ble bestemt ved visuell inspeksjon av celler. En CPE-score fra 0-4 ble bestemt, basert på resultatene av den visuelle inspeksjonen
(4=100% cytotoksisitet, 0=0% toksisitet). Resultatene av disse analysene er vist i Figurene 6A og 6B. Nøytralisering av toksisitet mot en human lunge fibroblastcellelinje, IMR-90 og en human tarmepitelcellelinje, T-84, ble bestemt. Figur 6A viser at alle antistoffene hadde nøytraliserende kapasitet mot IMR-90-celler. Den relative nøytraliserende aktiviteten av toksin A-cytotoksisitet på IMR-90-celler var 1B11 > 3H2 > 3D8. Interessant nok var den relative nøytraliserende aktiviteten 3D8 > 1B11 > 3H2 mot T-84 celler, som er humane colon epitelceller (Fig. 6A). T-84-celler er antatt å være mer sensitive for toksin A enn andre celletyper. T-84-celler kan tilveiebringe en mer relevant målcelle for å bestemme toksin A-cytotoksisitet.
Eksempel 4 . Epitop - kartlegging av anti - toksin - antistoffer
Epitopen av toksin A bundet av hvert monoklonale antistoff ble bestemt ved western blotting. Rekombinante E. co//'-kloner ble konstruert hvilke uttrykker fire fragmenter av toksin A som representerer det enzymatiske domenet ( dvs., aminosyrene 1-659 av toksin A), det reseptorbindende domenet ( dvs., aminosyrene 1853-2710 av toksin A) og de to regionene i mellom ( dvs., aminosyrene 660-1255 og 1256-1852 av toksin A). De passende segmentene av toksin A-genet ble PCR-amplifisert fra genomisk DNA fremstilt fra C. difficile stamme ATCC 43255. Fragmentene ble klonet ved anvendelse av en pET-vektor og transformert inn i BL21 DE3-celler for ekspresjon. Vektoren tilveiebringer induserbar ekspresjon og affinitetsdomener for rensing ( dvs., et His-merke) og deteksjon ( dvs., et V5 epitop-merke). Ekspresjon ble indusert med IPTG og fragmenter ble renset ved affinitetskromatografi. Binding til fire forskjellige fragmenter av toksin A ble målt: fragment 1 svarte til aminosyrene 1-659; fragment 2 svarte til aminosyrene 660-1255; fragment 3 svarte til aminosyrene 1256-1852; og fragment 4 svarte til aminosyrene 1853-2710 (Figur 7). 1B11 reagerte med fragmentene 1 og 2. 33,3H2 reagerte med fragment 2. 3D8 og et annet humant monoklonalt antistoff, 6B4, reagerte med fragment 4 (reseptorbindings-domenet). Et polyklonalt antiserum fra kaniner immunisert med toksoid A reagerte med alle fire fragmenter.
1B11 og 33,3H2-epitopene ble kartlagt mer detaljert. For å kartlegge 1B11-epitopen, ble subfragmenter av fragment 1 (aminosyrene 1-659) svarende til aminosyrene 1-540, 1-415, 1-290 og 1-165, fremstilt (Figur 8A). 1B11 ble bundet til fragment 1 og til fragmentet inneholdende aminosyrene 1-540. 1B11 bandt ikke til de andre subfragmentene. Derfor finnes epitopen bundet av 1B11 mellom aminosyrene 415-540 av toksin A.
For å kartlegge 33,3H2-epitopen, ble subfragmenter av fragment 2 (aminosyrene 660-1255) svarende til aminosyrene 660-1146, 660-1033, 660-920 og 660-807, fremstilt (Figur 8B). 33,3H2 ble bundet til fragmentene svarende til aminosyrene 660-1255, 660-1146 og 660-1033. 33,3H2 ble ikke bundet til de andre subfragmentene. Derfor er epitopen bundet av 33,3H2 mellom aminosyrene 920-1033 av toksin A.
Eksempel 5 . Beskyttelse av mus fra letalt toksin A - provokasjon ved administrering av anti - toksin A - antistoffer
Hvert antistoff ble testet for evnen til å beskytte mus fra provokasjon med en letal dose av toksin A. Swiss Webster hunnmus, som hver veier 10-20 gram, ble injisert intraperitonealt med opptil 250 \ ig av 3D8,1B11 eller 33,3H2 eller et kontrollantistoff (anti-respiratorisk syncytialvirus-antistoff, Medlmmune) før provokasjon med toksin A. Omtrent 24 timer etter injeksjon, ble mus utsatt for provokasjon med en dose av toksin A høyere enn 10 ganger den letale dosen (LD50), typisk 100 ng. Dyr ble observert for tegn på toksisitet i de neste 7 dagene. Resultatene av disse forsøkene er oppsummert i Figur 9. Dataene er uttrykt som prosentandel overlevelse. Antall i parentes refererer til antistoff dose, dersom en dose forskjellig fra 250 ug ble gitt. Figur 9 viser at hvert av antistoffene var i stand til å beskytte mus fra letalt toksin A-provokasjon til en viss grad. Prosentandelen av mus som overlever ved behandling med 3D8 varierte fra 10-100 prosent. Prosentandelen av mus som overlever ved behandling med 33,3H2 varierte fra 20-100 prosent. Prosentandelen av mus som overlever ved behandling med IB 11 varierte fra 0-60 prosent. Den relative evnen for disse monoklonale antistoffene til å beskytte mus var 3H2>3D8> 1B11.
Eksempel 6 . Nøytralisering av toksin A - enterotoksisitet i ligerte løkker av musetarm med anti - toksin A - antistoffer
3D8 og 33,3H2-antistoffer ble testet for nøytralisering av toksin A-enterotoksisitet i en mus ileum løkke-modell. Denne modellen måler toksin A-indusert akkumulering av
væske i musetarm. For å utføre disse forsøkene, ble hver mus sultet i 16 timer, anestesert og ileum nærmest ved cecum ble eksponert. En løkke på 3 til 5 centimeter ble dobbelt ligert ved hver ende og injisert med 10 ug toksin A. Ileum-løkken ble returnert til bukhulen, såret ble lukket og dyret fikk rekonvalesere. Fire timer etter kirurgi, ble dyret avlivet og løkken ble fjernet fra dyret. Lengden av hvert segment ble målt igjen og den intraluminale væsken ble ekstrahert. Volumet av væsken og volum-til-lengde (V:L)-forholdet i milliliter pr. centimeter ble beregnet for hver løkke. Testmus ble injisert med antistoff parenteralt 1-2 dager før kirurgi. Resultatene av disse forsøkene er vist i Figur 10. Injeksjon med toksin A økte vekt til lengde-forholdet av intestinal væske med 50%. Både 3D8 og 33,3H2 forhindret denne økning i akkumulering av væske. Mus administrert et antistoff hadde et vekt til lengde-forhold komparabelt med mus som ikke mottok noen toksin A-injeksjon. Derfor beskytter 3D8 og 33,3H2 mot intestinal akkumulering av væske in vivo.
Disse resultatene indikerer at de anti-toksin A monoklonale antistoffene beskytter mot toksin A-mediert enterotoksisitet in vivo. Mus ligert løkke-data viser at disse monoklonale antistoffene kan beskytte mot mukosal skade når administrert systemisk.
Eksempel 7 . Beskyttelse av hamstere mot C . difficile - tilbakefall med anti - toksin A-antistoffer
3D8 ble testet i en hamster tilbakefall-modell. Hamstere er sensitive for de toksiske
effektene av C. difficile- toksmer og dør typisk innen 2-3 dager fra mottak av en enkelt dose av klindamycin i nærvær av C. difficile. For å teste effektiviteten av 3D8 i hamstere, ble en tilbakefall-modell anvendt. I denne modellen, ble hamstere gitt en dose av klindamycin og en dose av C. difficile Bl-sporer én dag senere. Ett sett av kontrollhamstere mottok intet ytterligere antibiotika eller antistoff. Et andre sett av kontrollhamstere ble behandlet med 10 mg/kg/dag vankomycin. Vankomycin er et antibiotikum anvendt ved behandling av C. difficile- sykdom. Som vist i Figur 1 IA, mottok et test-sett av hamstere 10 mg/kg/dag vankomycin og 2 mg/kg/dag av et kanin polyklonalt antiserum fremkalt mot toksin A hver dag i syv dager etter C. difficile- eks<p>onenng, som angitt ved pilene i figuren. Et andre test-sett av hamstere mottok 10 mg/kg/dag vankomycin og 50 mg/kg/dag 3D8 ved de samme tidsintervallene. Overlevelse av hamstere ble plottet versus tid og er vist i Figur 1 IB.
Figur 1 IB viser at alle hamsterene som mottok kun klindamycin og C. difficile (diamanter) døde innen to dager etter provokasjon med bakteriene. Tolv prosent (2/17) av hamstere behandlet med vankomycin (kvadrater) overlevde provokasjon med bakterier; åttiåtte prosent (15/17) døde innen åtte dager. Førtién prosent (7/17) av hamstere behandlet med vankomycin og 3D8 (kryss) overlevde provokasjon; femtini (10/17) prosent døde innen syv dager. Sekstifire prosent (7/11) av hamstere behandlet med vankomycin og polyklonalt kaninserum (triangler) overlevde provokasjonen med bakterier; trettiseks prosent (4/11) døde innen ni dager. Disse data er også vist i Figur 12 som prosentandelen av totale overlevende i hver behandlingsgruppe. Som vist i figuren, var prosentandelen av overlevende høyest (sekstifire prosent) i gruppen som mottar vankomycin og polyklonalt kaninserum. Gruppen som mottar 3D8 og vankomycin hadde den andre høyeste hyppigheten av overlevelse (førtién prosent). Bare tolv prosent av vankomycin-behandlede hamstere overlevde. Av de som var uten behandling døde alle. Disse data viser at polyklonale og monoklonale anti-toksin-antistoffer beskytter mot tilbakefall av C. difficile-sykdom in vivo når administrert etter infeksjon.
Eksempel 8 . Fremstilling av anti - toksin A - antisto ffer for administrering til mennesker
Nukleinsyresekvenser som koder for de variable tunge kjede og lette kjeder av 3D8-antistoffet ble klonet inn i en pIE-UgammalF-vektor ved anvendelse av standard rekombinant DNA-metodikk. Vektoren ble amplifisert i E. coli, renset og transfektert inn i CHO-dg44-celler. Transfekterte celler ble platet ut ved 4 x IO<5>celler pr. brønn i en 96-brønners skål og selektert for vektortransfeksjon med G418. En klon, betegnet 1D3, ble opprinnelig selektert ved G418-resistens, deretter analysert sammen med andre transfectomer for produksjon av IgG. 1D3 hadde et høyere nivå av IgG-produksjon relativt til andre transfektanter under mange runder av ekspansjon. Ekspresjon av 3D8-antistoffet ble amplifisert ved dyrking i nærvær av økende konsentrasjoner av metotreksat. En kultur i stand til å vokse i 175 nM metotreksat ble valgt for kloning av enkeltceller for videre utvikling. Utplating av kulturen i 96-brønners plater ved lav tetthet tillot fremstilling av kulturer som oppstår fra en enkeltcelle eller kloner. Kulturene ble screenet for produksjon av human IgG og cellen som produserte det høyeste nivået av IgG ble valgt for videre anvendelse. Den metotreksat-amplifiserte klonen ble utvidet for å produsere en cellebank omfattende multiple frosne medisinglass av celler.
For å fremstille antistoffer fra transfekterte celler, ble celler fra en klon isolert i det foregående trinnet dyrket og ekspandert som inokulum for en bioreaktor. Bioreaktoren inneholder typisk et 500 liters volum av dyrkningsmedium. Cellene blir dyrket i bioreaktoren inntil celleviabiliteten synker, hvilket indikerer at en maksimal antistoffkonsentrasjon er produsert i kulturen. Cellene fjernes ved filtrering. Filtratet blir påført en protein A-kolonne. Antistoffer binder til kolonnen og blir eluert med en vask med lav pH. Deretter blir antistoffene applisert i en Q-Sepharose-kolonne for å fjerne gjenværende forurensninger, slik som CHO-celleproteiner, DNA og andre forurensninger (f.eks., virale forurensninger, dersom til stede). Antistoffer blir eluert fra Q-Sepharose-kolonnen, nano-filtrert, konsentrert og vasket i en buffer slik som PBS. Fremstillingen blir deretter aseptisk delt inn i alikvoter i medisinglass for administrering.
Eksempel 9 . Fremstilling og karakterisering av polyklonale anti - toksin B - antisto ffer
To Nubian-geiter (nr.330 og nr.331) ble injisert intramuskulært med 50 \ ig UDP dialdehyd-inaktivert toksin B (Techlab) og complete Freund's adjuvans. Booster-doser på 25 ug toksoid B med Freund's incomplete adjuvans ble gitt intramuskulært ved to ukers intervaller. Test-tappinger ble oppnådd etter 4 immuniseringer. ELISA-reaktivitet og nøytralisering av cytotoksisitet mot både toksin A og toksin B ble undersøkt for å måle spesifisiteten og kryssreaktiviteten av sera.
Begge dyrene responderte godt til toksin B og i mindre grad til toksin A som målt ved ELISA. Serum fra geit nr.331 hadde mindre toksin A-kryssreaktivitet og ble valgt for de fleste av de påfølgende forsøkene. Nøytralisering av cytotoksisitet til IMR-90-celler ble bestemt som beskrevet i Eksempel 3. Resultatene av nøytralisering av cytotoksisitet er vist i Figur 13, som viser at serum fra begge dyrene viste passende toksin B-nøytraliserende antistoff-titere og svært lav, men detekterbar, toksin A nøytraliserende antistoff-titere. Evnen av geiteserum til å beskytte mus fra en letal intraperitoneal provokasjon med toksin B (100 ng) ble også bekreftet (data ikke vist).
Eksempel 10 . Beskyttelse av hamstere mot tilbake fall av C . difficile med anti - toksin A og anti - toksin B - antistoffer
Grupper av hamstere (n = 20) ble utsatt for provokasjon med klindamycin og C. difficile, og deretter behandlet med vankomycin som beskrevet i hamster-modellen for tilbakefall i Eksempel 7. Antistoffer (enten 3D8, serum fra geit nr.331 eller 3D8 og serum fra geit nr.331) ble gitt to ganger daglig etter vankomycin-behandling (Figur 14). Dyr ble overvåket for overlevelse (Figur 15) eller sykdom (Figur 16). Antistoffdoser var 1 ml to ganger daglig for serum fra geit nr.331 og 3 mg i 3D8 gitt to ganger daglig. Dyr som mottar kun vankomycin ( dvs., ingen antistoffbehandling) tjente som negative kontroller. Som observert tidligere, viste 3D8 og vankomycinbehandling alene en delvis beskyttende effekt, hvor 10 av 20 dyr ble beskyttet fra letalitet (Fig. 15). Femti prosent av dyrene i denne gruppen forble friske (Fig. 16). Seks av 20 dyr som mottar vankomycinbehandling alene ble beskyttet (Fig. 15). Tretti prosent forble friske (Fig. 16). Delvis beskyttelse (9/20 dyr beskyttet) ble også observert når geiteserum ble anvendt alene (Fig. 15). Førti prosent forble friske. Beskyttelse ble økt til nesten 100% når både geiteserum og 3D8 ble gitt sammen (18/20) og oppstart av sykdom ble forsinket (Fig. 15). Nitti prosent av disse dyrene forble friske (Fig. 16). Beskyttelse mot sykdom fulgte tydelig et mønster likt beskyttelse mot letalitet. Disse data viser at 3D8 kan være fullstendig beskyttende i hamster-sykdomsmodellen når toksin B også er nøytralisert.
Eksempel 11 . Beskyttelse av hamstere mot tilbakefall av C . difficile i hamstere immunisert med toksin B
Hamstere ble immunisert intraperitonealt med 10 ug av det COOH-terminale fragmentet av toksin B (svarende til aminosyrene 1777-2366 av toksin B) uttrykt i E. coli og ved anvendelse av RIBI som adjuvans. Dyr mottok 7 doser av toksin B-antigen. Nøytraliserende antistoffresponser ble observert i dyrene som ble testet. Grupper av immuniserte hamstere ble utsatt for provokasjon med klindamycin og C. difficile og deretter behandlet med vankomycin som beskrevet i hamstermodellen for tilbakefall i Eksempel 7. Antistoff (3D8, 3 mg/dose) ble gitt to ganger daglig etter vankomycinbehandling til 19 dyr og sammenlignet med en negativ kontrollgruppe (n=20) som ikke mottok noen behandling (Figurene 17 og 18). Seks dyr ble utsatt for provokasjon uten vankomycinbehandling for å sikre at hamstere immunisert med toksin B-antigen var mottagelige for C. difficile- m£eks] ovi. Dyr ble overvåket for overlevelse (Figur 17) eller sykdom (Figur 18). Figur 17 viser at immuniserte dyr som ikke ble gitt 3D8 fikk tilbakefall ved en lignende hyppighet som den observert tidligere (65% tilbakefall). Toksin B-immuniserte dyr som mottar 3D8 ble mer fullstendig beskyttet mot tilbakefall enn observert tidligere (10% tilbakefall, sammenlignet med omtrent 50% tilbakefall i dyr ikke tidligere immunisert med toksin B i andre forsøk).
Figur 18 viser at noen av de immuniserte dyrene som mottar 3D8 ble syke men kom seg igjen etter diaré. Trettifem prosent av immuniserte dyr som mottar vankomycin alene forble friske. Av de dyrene som hadde diaré, i forsøk hvor toksin B-reaktive sera ikke var til stede i dyr, døde praktisk talt alle dyrene senere. Disse data gir ytterligere bevis på at 3D8 kan være fullstendig beskyttende i hamster-sykdomsmodellen når toksin B også er nøytralisert. Nøytralisering av toksin B i tillegg til toksin A var nødvendig for optimal beskyttelse mot C. difficile- sykdom i denne modellen.
Eksempel 12 . Beskyttelse av hamstere mot primær C . difficile - provokasjon ved anvendelse av 3D8 i hamstere behandlet med geit anti - toksin B - sera
Forebygging av tilbakefall av C. difficile- sykdom i hamstrene var lettere å demonstrere enn beskyttelse mot direkte provokasjon ( dvs., provokasjon uten administrering av vankomycin). Forsøk med kaninserum viste kun svak beskyttelse mot direkte provokasjon og 3D8 hadde ingen detekterbar innvirkning på direkte provokasjon. Siden 3D8 var mer beskyttende på en bakgrunn av toksin B-nøytraliserende antistoffer, ble det bestemt hvorvidt den kombinerte administreringen av 3D8 og anti-toksin B-antisera kunne forebygge sykdom beroende på direkte provokasjon. Grupper på 5 hamstere ble utsatt for provokasjon etter å ha mottatt én gang daglige doser på 3D8 (3 mg), kombinert
3D8 (3 mg) og geit nr.331 (1 ml) sera eller ingen antistoffer i 3 dager før provokasjon som vist i Figur 19. Dataene i Figur 20 viser at dyr som ikke mottar noen antistoffer eller enten 3D8 eller geiteserum alene, alle døde etter 48 timer ved C. difficile- provokasjon. De fleste dyr (80%) som mottar både 3D8 og geiteserum overlevde og de dyrene som ble angrepet overlevde i 10 dager etter provokasjon. Figur 21 viser at dyr behandlet med 3D8 og geiteserum ble syke men frisknet til. Disse data gir ytterligere bevis for at 3D8 kan være fullstendig beskyttende i hamster-sykdomsmodellen når toksin B også er nøytralisert. Nøytralisering av toksin B i tillegg til toksin A var nødvendig for optimal beskyttelse mot C. difficile- sykdom i denne modellen.
Den vellykkede beskyttelsen av hamstere utsatt for direkte provokasjon med C. difficile gir mange fordeler for screening av nye toksin B-kandidater. Færre dyr kan anvendes siden 100% av ubehandlede dyr dør. Antistoffer, slik som monoklonale antistoffer (f.eks., humane monoklonale antistoffer) kan screenes direkte i hamstere fordi metoden krever 100 mg eller mindre av test-antistoff. Andre metoder for testing, slik som tilbakefall-modellen, krever innsats for å fremstille mengder i gram på grunn av den lave attack raten i tilbakefallsmodellen, hvilket nødvendiggjør testing av et høyere antall dyr. Direkte provokasjon-forsøk har også kortere varighet med en endelig opplesning innen 3-4 dager for C. difficile- provokasjon sammenlignet med 7-10 i tilbakefall-modellen. I tillegg reduserer eliminering av vankomycinbehandling fra screeningsmetoden, antall ganger dyr blir håndtert.
Eksepel 13 . Fremstilling av anti - toksin B monoklonale antistoffer
C. difficile toksin B ble oppnådd enten fra Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) eller ved rekombinant fremstilling. Toksinet ble renset og inaktivert før immunisering. Inaktivering ble utført ved behandling med reaktivt UDP-dialdehyd, hvilket resulterer i alkylering av katalytiske rester mens nativ toksinstruktur opprettholdes. I korthet ble renset toksin B inkubert med UDP-2',3'-dialdehyd (0,l-l,0mM) i buffer i 18 timer ved 37°C, filtrert gjennom et 100 kDa-cutoff filter for å fjerne ureagert UDP-2',3'-dialdehyd og vasket med buffer. Inaktivert toksin B (toksoid B) eller rekombinant toksin B-fragmenter ble anvendt som immunogener. Et toksin B reseptorbindende domene (aminosyrerestene 1777-2366) ble uttrykt i E. coli som et fusjonsprotein inneholdende et immun-merke (heksahistadin) for affinitetsrensing ved anvendelse av nikkelchelat affinitetskromatografi (betegnet fragment 4; se Eksempel 11).
Hcol2 transgene mus, fremstilt som beskrevet ovenfor i avsnittet betegnet "Fremstilling av humane monoklonale antistoffer i HuMAb-mus" og levert av Medarex, Milpitas, CA, ble immunisert intraperitonealt 6-12 ganger hver med 10 \ ig toksoid i RIBI-adjuvans. I Hcol2 transgene mus, er den endogene mus kappa lett kjede-genet homozygot forstyrret som beskrevet i Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 og det endogene mus tung kjede genet er homozygot forstyrret som beskrevet i Eksempel 1 i PCT-publikasjon WO 01/09187. De Hcol2 transgene musene inneholder et humant kappa lett kjede transgen, KCo5, som beskrevet i Fishwild etal. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 og Hcol2 human tung kjede transgenet som beskrevet i U.S. Patent nr. 5,545,806; 5,625,825; og 5,545,807. Serum ble oppsamlet fra hver mus og testet for reaktivitet mot toksin B ved ELISA og nøytralisering av cytotoksisitet i IMR-90-celler. Mus som testet positivt for toksin B-reaktivt og nøytraliserende antiserum ble injisert med 5-10 ug toksoid B eller fragment 4 gjennom halevenen. Mus ble avlivet og milter ble isolert for fusjon til hybridomer omtrent 3 dager etter at halevene-injeksjon ble utført.
Klonale hybridomer ble fremstilt og screenet ved ELISA. Tre hybridomkloner ble selektert for videre analyse: 124-152; 2A11; og 1G10. Spesielt ble cDNA fra 124-152-klonen amplifisert ved RT-PCR fra mRNA, klonet og sekvensert. Tung kjede V-regionen ble bestemt å være avledet fra kjønnscellesekvensen VH 5-51, D-regionen avledet fra kjønnscellesekvensen 7-27 og J-sekvensen fra kjønnscelleregionen JH3b. Lett kjede
(kappa)-regionene ble bestemt å være avledet fra A27 og J-regionen fra JK1. Isotypen av 124-152-klonen ble bestemt å være IgGl. Aminosyresekvensene av VH og VL-regionene av 124-152-klonen er vist i Figurene 27-28. De komplementaritetsbestemmende regionene
(CDR'ene) er angitt i figurene. De relaterte kjønnscellesekvensene av VH og VL-regionene er vist i Figurene 30-31.
Antistoffene 124-152; 2A11; og 1G10 ble isolert fra tilsvarende hybridomer og testet for deres bindingsegenskaper (infra). DNA som koder for 124-152-klonen ble klonet inn i en vektor for å uttrykkes som et humant antistoff for administrering til mennesker.
Eksempel 14 . Bindingsaktivitet av anti - toksin B - antistoffer
Binding av hvert antistoff til toksin B ble bestemt ved Biacore ved anvendelse av standardteknikker. Resultatene av dette forsøket er vist i Tabell 6. Antistoffer produsert av 124-152; 2A11; og 1G10 ble sammenlignet med passende kontroller.
Spesielt ble affiniteten av 124-152; 2A11; og lGlO-antistoffene for toksin B målt med Biacore®-instrument, hvilket detekterer biomolekylære bindingsinteraksjoner med overflate plasmonresonans-teknologi. Hvert antistoff ble tilsatt til protein A-belagte sensorchips og toksin B fikk strømme over chipen for å måle binding. 124-152 hadde en KDpå 1,64 x 10-<10>M; 2A11 hadde en KDpå 0,24 x 10-10M; og 1G10 hadde en KDpå 2,98 x 10"<10>M. Følgelig binder antistoffene med høy affinitet til toksin B. Disse bindingskonstantene indikerer at antistoffene har affiniteter egnet for anvendelse in vivo, for eksempel human terapi.
Eksempel 15 . Nøytralisering av toksin ved anti - toksin B - antistoffer
Antistoffer uttrykt av 124-152; 2A11; og lGlO-hybridomer ble testet for toksin B-nøytraliseringsaktivitet in vitro. Celler ble inkubert i nærvær av varierende konsentrasjoner av et monoklonalt antistoff spesifikt for toksin B som ville forhindre celler fra å bli rundere etter eksponering for toksin B. Cytopatisk effekt (CPE) ble bestemt ved visuell inspeksjon av celler. Et CPE-score fra 0-4 ble bestemt, basert på resultatene av den visuelle inspeksjonen (4=100% cytotoksisitet, 0=0% toksisitet). Resultatene av disse forsøkene er vist i Figur 27. Nøytralisering av toksisitet mot en human lunge fibroblastcellelinje, IMR-90. Figur 27 viser at alle antistoffene hadde nøytraliserende kapasitet mot IMR-90-celler. Den relative nøytraliserende aktiviteten av toksin A-cytotoksisitet på IMR-90-celler var 124-152 >1G10>2A11.
Eksempel 16 . Beskyttelse av hamstere mot primær C . difficile - provokasion ved anvendelse av anti - toksin B - antistoffer
Beskyttelse mot direkte provokasjon ved et inokulum av C. difficile (klindamycin ved dag -1 og C. difficile-sporer ved dag O (1/100,000 fortynning) ble utført over en periode på 4 til 10 dager i nærvær eller fravær av anti-toksin B-antistoffer. Grupper på 5 hamstere ble utsatt for provokasjon etter å ha mottat én gang daglige doser på 3D8 (20 mg totalt over 4 dager), kombinert 3D8 (Id.) og geit nr.331 (3 ml)-serum, 3D8 i kombinasjon med anti-toksin B-antistoffer 124-152 (18 mg totalt over 4 dager), 2A11 (20 mg totalt over 4 dager) eller 1G10 (20 mg totalt over 4 dager) eller ingen antistoffer i 3 dager før provokasjon som vist i Figur 24. Dataene i Figur 24 viser at dyr som ikke mottar noen antistoffer eller enten 3D8 eller geiteserum alene alle døde innen 72 timer etter C. difficile-provokasjon mens dyr som mottar 3D8 og et anti-toksin B-antistoff og fortrinnsvis i kombinasjon med 124-152, hadde en overlevelsesrate på 40% (Figur 24). Et 10 dagers studie lik det foregående (men ved anvendelse av et mer fortynnet C. difficile-inokulum) ble utført med økende mengder av anti-toksin B-antistoffet 124-152 (0,56 mg, 1,7 mg eller 5,0 mg gitt ved dagene -3, -2, -1 og 0). Dyr som mottar både 3D8 og geiteserum overlevde og de fleste dyr (60%-70%) overlevde i 10 dager etter provokasjon dersom de ble gitt 3D8 i kombinasjon med 124-152. Selv den laveste dosen av anti-toksin B-antistoffet 124-152 (0,56 mg i kombinasjon med 3D8) var svært effektiv (70% overlevelse; se Figur 25). Resultater viser at 124-152 og 3D8, alene, er mindre effektive da når anvendt i kombinasjon hvor et mer enn additivt, faktisk, synergistisk terapeutisk resultat blir oppnådd (Fig. 24-26). Disse data gir ytterligere bevis for at anti-toksin B-antistoffet er svært effektivt, spesielt i kombinasjon med anti-toksin A-antistoffet 3D8. Nøytralisering av toksin B i tillegg til toksin A ble bestemt å gi beskyttelse mot C. difficile-sykdom i denne modellen.
Eksempel 17 . Epitop kartlegging av anti - toksin B - antistoffer
Epitopen av toksin B bundet av hvert monoklonalt antistoff ble bestemt ved western blotting. Rekombinante E. co//'-kloner ble konstruert hvilke uttrykker fragmenter av toksin B som representerer forskjellige domener av toksin B. De passende segmentene av toksin B-genet ble PCR-amplifisert fra DNA fremstilt fra en passende C. d/$5cz7e-stamme. Fragmentene ble klonet inn i en ekspresjonsvektor og uttrykt i E. coli. Humant monoklonalt antistoff 152 ble anvendt for å probe toksin B-fragment i western blot for å kartlegge epitopen for binding. Toksin B-proteinfragmenter ble isolert fra E. coli inneholdende en del av toksin B-genene og separert ved anvendelse av SDS-PAGE. Etter elektroforese ble toksin B-fragmentene overført til nitrocellulose og probet med monoklonalt antistoff 152 fulgt av alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-human for å detektere MAb 152-binding. HuMab 152 ble bestemt å binde til -COOH-fragment-delen av toksin B mellom aminosyrene 1777 og 2366 (se for eksempel Fig. 32).

Claims (41)

1. Et isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, som spesifikt binder til et eksotoksin av Clostridium difficile ( C. difficile) omfattende tung og lettkjede variabel region CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser valgt fra gruppen bestående av: (i) en tungkj ede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 7; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:8; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:9; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 16; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 17; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 18; (ii) en tungkj ede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 10; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 11; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 12; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 19; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR20; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR21; (iii) en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 13; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 14; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 15; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR22; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR23; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR24; og (iv) en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:62; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:64; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:66; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR68; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:70; en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:72.
2. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter: en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:7; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:8; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:9; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 16; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 17; og en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 18.
3. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 10; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 11; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 12; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 19; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR20; og en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR21.
4. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter: en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR: 13; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR: 14; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR: 15; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR22; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR23; og en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR24.
5. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter: en tungkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:62; en tungkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:64; en tungkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:66; en lettkjede variabel region CDR1 angitt i SEKV ID NR:68; en lettkjede variabel region CDR2 angitt i SEKV ID NR:70; og en lettkjede variabel region CDR3 angitt i SEKV ID NR:72.
6. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 1, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter: (a) en tungkjede variabel region omfattende en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NRl, SEKV ID NR2 eller SEKV ID NR:3 og/eller en lettkjede variabel region omfattende en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR:4, SEKV ID NR: 5 eller SEKV ID NR: 6; eller (b) en tungkjede variabel region omfattende en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 54 og/eller en lettkjede variabel region omfattende en aminosyresekvens ifølge SEKV ID NR: 5 8 .
7. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 6, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variabel regioner som angitt i SEKV ID NRs: 1 og 4.
8. Isolert monoklonalt antistoff ifølge krav 6, hvor antistoffet omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs: 1 og 4.
9. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 6, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs:2 og 5.
10. Isolert monoklonalt antistoff ifølge krav 6, hvor antistoffet omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs:2 og 5.
11. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 6, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs:3 og 6.
12. Isolert monoklonalt antistoff ifølge krav 6, hvor antistoffet omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs:3 og 6.
13. Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav ifølge krav 6, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs:54 og 58.
14. Isolert monoklonalt antistoff ifølge krav 6, hvor antistoffet omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i SEKV ID NRs: 54 og 58.
15. Isolert monoklonalt antistoff ifølge hvilket som helst av kravene 2-4 eller 7-12, hvor antistoffet er en IgGl eller IgG3 isotype.
16. Isolert monoklonalt antistoff ifølge krav 5, 13 eller 14, hvor antistoffet er en IgGl isotype.
17. Antistoff eller antigen bindende del derav, som konkurrerer for binding med antistoffet eller antistoff bindende del derav, ifølge hvilket som helst av de foregående kravene.
18. Antistoff eller antigen bindende del derav, ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, spesifikt binder til eksotoksinet med en KDpå mindre enn 20 x IO"<6>M.
19. Antigen bindende del ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor den antigen bindende delen omfatter en Fab, Fab'2, ScFv, Fd, Fv eller dAb.
20. Antistoff ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor antistoffet er et full lengde antistoff.
21. Et farmasøytisk preparat omfattende antistoffet eller antigen bindende del derav, iføgle hvilken som helst av de foregående kravene i en farmasøytisk akseptabel bærer.
22. En isolert nukleinsyre omfattende en sekvens som koder for et polypeptid som angitt i SEKV ID NR: 1, SEKV ID NR2, SEKV ID NR3, SEKV ID NR:4, SEKV ID NR:5, SEKV ID NR:6, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 56, SEKV ID NR: 58 eller SEKV ID NR: 60.
23. En ekspresjonsvektor omfattende nukleinsyren ifølge krav 22.
24. En vertscelle omfattende nukleinsyren ifølge krav 22.
25. Et sett omfattende et isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene og instruksjoner for anvendelse for behandling av C. difficile- mediert sykdom.
26. Et preparat omfattende et første monoklonalt antistoff et andre monoklonalt antistoff, hvor: (a) det første antistoffet eller antigen bindende delen derav, som omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs: 1 og 4, SEKV ID NRs:2 og 5 eller SEKV ID NRs:3 og 6, og (b) den andre antistoff eller antigen bindende delen derav, som omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs:54 og 58.
27. Preparat ifølge krav 26, hvor det første antistoff eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs:l og 4.
28. Preparat ifølge krav 26, hvor det første antistoff eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs:2 og 5.
29. Preparat ifølge krav 26, hvor det første antistoff eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs:3 og 6.
30. Preparat ifølge krav 26, hvor det andre antistoff eller antigen bindende del derav, omfatter tung og lettkjede variable regioner som angitt i henholdsvis SEKV ID NRs:54 og 58.
31. Preparatet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det første antistoff eller antigen bindende del derav, binder til en epitope mellom aminosyrene 1853-2710 av C. difficile toksin A.
32. Preparatet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det andre antistoff eller antigen bindende del derav, binder til en epitope mellom aminosyrene 1777-2366 av C. difficile toksin B.
33. Preparatet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det første eller andre antistoff er et humant antistoff, et humanisert antistoff eller et kimært antistoff.
34. Preparatet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor den antigen bindende porsjonen av det første eller andre antistoffet er en Fab, Fab'2, ScFv, Fd, Fv eller dAb.
35. Preparatet ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvor KDtil det første eller andre antistoff eller antigen bindende del derav, er mindre enn 20 x IO"6 M.
36. Preparatet ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det første og andre antistoffet eller antigen bindende deler derav, nøytralisere C. difficile toksin A og C. difficile toksin B in vitro eller in vivo.
37. Preparatet ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det første og andre antistoffet eller antigen bindende deler derav, er formulert sammen.
38. Preparatet ifølge hvilket som helst av de foregående kravene, hvor det første og andre antistoffet eller antigen bindende deler derav, er formulert separat.
39. Anvendelse av et antistoff eller antigen bindende del derav, ifølge hvilke som helst av de foregående kravene for å produsere et farmasøytisk preparat for behandling av C. difficile sykdom ved å hemme symptomene på sykdommen eller forhindre tilbakekomst av C. difficile- mediert sykdom.
40. Anvendelse ifølge krav 39, hvor individet er humant.
41. Anvendelse ifølge krav 39, hvor antistoffet eller antigen bindende del derav, blir administrert intravenøst, intramuskulært eller subkutant til individet.
NO20063767A 2004-02-06 2006-08-23 Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat. NO340300B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54235704P 2004-02-06 2004-02-06
US61385404P 2004-09-28 2004-09-28
PCT/US2005/003725 WO2006121422A2 (en) 2004-02-06 2005-02-04 Antibodies against clostridium difficile toxins and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20063767L NO20063767L (no) 2006-10-02
NO340300B1 true NO340300B1 (no) 2017-03-27

Family

ID=36928722

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20063767A NO340300B1 (no) 2004-02-06 2006-08-23 Isolert monoklonalt antistoff eller antigen bindende del derav, samt anvendelse derav og farmasøytisk preparat, isolert nukleinsyre, ekspresjonsvektor, vertscelle, sett og preparat.
NO2017032C NO2017032I1 (no) 2004-02-06 2017-07-07 bezlotoksumab

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO2017032C NO2017032I1 (no) 2004-02-06 2017-07-07 bezlotoksumab

Country Status (28)

Country Link
US (8) US7625559B2 (no)
EP (3) EP2857418B1 (no)
JP (3) JP4588763B2 (no)
KR (3) KR20120083534A (no)
CN (1) CN101014620B (no)
AT (1) ATE512986T1 (no)
AU (1) AU2005320349C1 (no)
BE (1) BE2017C023I2 (no)
BR (1) BRPI0507433C1 (no)
CA (1) CA2553946C (no)
CY (3) CY1111860T1 (no)
DK (3) DK2270045T3 (no)
ES (3) ES2643760T3 (no)
HK (3) HK1152048A1 (no)
HR (1) HRP20110599T1 (no)
HU (3) HUE034552T2 (no)
LT (2) LT2857418T (no)
LU (1) LUC00025I2 (no)
MX (1) MXPA06008839A (no)
NL (1) NL300881I2 (no)
NO (2) NO340300B1 (no)
NZ (2) NZ580828A (no)
PL (3) PL2270045T3 (no)
PT (3) PT2857418T (no)
RS (1) RS51908B (no)
SI (3) SI2857418T1 (no)
WO (1) WO2006121422A2 (no)
ZA (1) ZA200606516B (no)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR045563A1 (es) * 2003-09-10 2005-11-02 Warner Lambert Co Anticuerpos dirigidos a m-csf
RS51908B (en) * 2004-02-06 2012-02-29 University Of Massachusetts CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXIN ANTIBODIES AND THEIR USES
CN101068560B (zh) * 2004-06-28 2011-03-09 独立行政法人科学技术振兴机构 毒素中和性肽的筛选方法和STX2抑制性肽以及Vero毒素中和剂
EP1833510A4 (en) * 2004-12-27 2010-02-10 Progenics Pharmaceuticals Neva ORAL ADMINISTRATION ANTITOXIN ANTIBODIES AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME
AU2007280861B2 (en) * 2006-08-02 2013-02-07 Johannes Gutenberg-Universitat Mainz Medicament for LCT poisoning
AU2014201846B2 (en) * 2007-01-30 2016-07-07 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
EP2450366A1 (en) 2007-01-30 2012-05-09 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
US20080188007A1 (en) * 2007-02-06 2008-08-07 Meridian Life Science, Inc. Fluorescent single chain antibody and its use in detection of analytes
CN101363867B (zh) * 2008-05-26 2012-12-19 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种艰难梭菌a、b毒素胶体金检测试纸条及其制备方法
WO2009154995A2 (en) * 2008-05-27 2009-12-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Interleukin 10 receptor (il-10r) antibodies and methods of use
DE102008029688B4 (de) * 2008-06-24 2016-06-23 Biodics Gmbh Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation eines varianten C. difficile Stammes in einer Probe
JP5740714B2 (ja) * 2009-02-20 2015-06-24 ヘルス プロテクション エージェンシー クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する抗体
JP5591332B2 (ja) * 2009-07-27 2014-09-17 バイオディクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 試料中における変異したｃ．ディフィシル菌株を検出および同定するための方法
US8889363B2 (en) 2009-07-27 2014-11-18 Biodics Method for the detection and identification of a variant C. difficile strain in a sample
US20120282274A1 (en) * 2009-11-20 2012-11-08 Northshore University Health System Research Institute Targeting of the c-terminal segment of c.difficile toxin b for improved clinical diagnosis, prevention, and treatment
GB0921288D0 (en) * 2009-12-04 2010-01-20 Health Prot Agency Therapies for preventing or suppressing clostridium difficile infection
EP2558493B1 (en) * 2010-04-15 2019-09-18 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Antibodies for the treatment of clostridium difficile-associated infection and disease
RU2630663C9 (ru) * 2010-04-15 2017-11-29 Проджиникс Фармасьютикалс, Инк. Антитела для лечения ассоциированных с clostridium difficile инфекции и заболеваний
EP2753352B2 (en) * 2010-09-03 2022-08-10 Valneva Austria GmbH Isolated polypeptide of the toxin a and toxin b proteins of c. difficile and uses thereof
GB201016742D0 (en) * 2010-10-05 2010-11-17 Health Prot Agency Clostridium difficile antigens
US9771416B2 (en) * 2010-10-25 2017-09-26 National Research Council Of Canada Clostridium difficile-specific antibodies and uses thereof
EP2661500A2 (en) * 2010-12-29 2013-11-13 Cangene Corporation Clostridium difficile antigens
US8906635B2 (en) 2011-02-28 2014-12-09 Northshore University Healthsystem Methods of diagnosing Clostridium difficile infection
BR112013027229B1 (pt) 2011-04-22 2020-10-27 Wyeth Llc polipeptídeo imunogênico isolado e seu uso, composição imunogênica e seu uso, célula recombinante ou progênie da mesma, e método de produção de uma toxina de clostridium difficile mutante
EP2741785B1 (en) * 2011-07-12 2018-09-05 Philadelphia Health and Education Corporation Novel clostridium difficile dna vaccine
US9505847B2 (en) 2011-08-22 2016-11-29 Cnj Holdings Inc Clostridium difficile antibodies
EA032475B1 (ru) * 2011-09-16 2019-06-28 Юсб Фарма С.А. Фармацевтическая композиция для снижения продолжительности и/или тяжести диареи, заболеваемости и/или смертности пациента, инфицированного clostridium diffcile или имеющего риск указанного заражения, и ее применение
US10364298B2 (en) 2011-11-18 2019-07-30 National Research Council Of Canada Clostridium difficile lipoteichoic acid and uses thereof
ES2704069T3 (es) 2011-12-08 2019-03-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna basada en toxinas de Clostridium difficile
DE102011121238A1 (de) * 2011-12-14 2013-06-20 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Einzeldomänen-antikörper gegen clostridium difficile toxine
AR089797A1 (es) 2012-01-27 2014-09-17 Merck Sharp & Dohme Vacunas contra clostridum difficile que comprenden toxinas recombinantes
RU2017127772A (ru) * 2012-03-02 2019-02-04 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Человеческие антитела к токсинам clostridium difficile
GB201206070D0 (en) 2012-04-04 2012-05-16 Health Prot Agency Clostridium difficile antigens
JPWO2014061783A1 (ja) * 2012-10-19 2016-09-05 株式会社イーベック クロストリジウム・ディフィシルの毒素に特異的なヒト抗体もしくはその抗原結合性断片
BR122016023101B1 (pt) * 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
JP2016501877A (ja) * 2012-11-28 2016-01-21 シーエヌジェー ホールディングス，インコーポレイテッド クロストリジウム・ディフィシルに対する抗体
EP2968508B1 (en) 2013-03-15 2022-04-27 Sanofi Pasteur Biologics, LLC Antibodies against clostridium difficile toxins and methods of using the same
US10144775B2 (en) * 2013-04-19 2018-12-04 Immuron Limited Methods and compositions for the treatment and/or prophylaxis of Clostridium difficile associated disease
US9181632B1 (en) 2013-09-09 2015-11-10 Merck Sharp & Dohme Corp. C.difficile toxin B CROP domain peptides, antibodies and complexes thereof
WO2015100409A2 (en) * 2013-12-26 2015-07-02 Tufts University Methods, compositions and kits for treating a subject using a recombinant neutralizing binding protein
BR112016018313A8 (pt) 2014-02-10 2018-06-12 Igm Biosciences Inc Moléculas de ligação multiespecíficas iga
WO2015127140A2 (en) 2014-02-19 2015-08-27 Jody Berry Marburg monoclonal antibodies
BR112016020009A2 (pt) 2014-04-10 2017-10-17 Obi Pharma Inc anticorpo, composição farmacêutica, método para inibir a proliferação de células cancerígenas, hibridoma
WO2015184454A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Case Western Reserve University Clostridium difficile culture medium
EP2957570B1 (en) 2014-06-20 2019-04-17 Immunimed Inc. Polyclonal antibodies against clostridium difficile and uses thereof
US10513552B2 (en) 2014-06-20 2019-12-24 Immunimed Inc. Use of polyclonal antibodies against clostridium difficile for treatment of inflammatory bowel disease
WO2016131157A1 (en) * 2015-02-19 2016-08-25 Immune Biosolutions Inc Clostridium difficile toxins a and/or b antigen and epitope antibody, and pharmaceutical uses thereof
WO2016156474A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin a
WO2016156475A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptide comprising an immunoglobulin chain variable domain which binds to clostridium difficile toxin b
CN105039262B (zh) * 2015-07-10 2018-07-03 北京科兴中维生物技术有限公司 破伤风类毒素单克隆抗体及其应用
SI3307322T1 (sl) 2015-09-04 2021-08-31 Primatope Therapeutics Inc. Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
KR102165120B1 (ko) 2015-12-15 2020-10-13 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 인간 면역결핍 바이러스 중화 항체
US11299751B2 (en) 2016-04-29 2022-04-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2018035407A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Enbiotix, Inc. Bacteriophages for neutralizing toxins and methods of use thereof
WO2018237148A1 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Gilead Sciences, Inc. MULTISPECIFIC ANTIBODIES TARGETING HIV GP120 AND CD3
JP7347849B2 (ja) * 2018-04-19 2023-09-20 ファースト ライト ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 標的の検出
WO2020231930A1 (en) * 2019-05-11 2020-11-19 The Texas A&M University System Protein inhibitors of clostridium difficile toxin b
WO2021219786A1 (en) * 2020-04-30 2021-11-04 Gottfried Himmler Anti-toxin secretory iga2 preparation
CN111499738B (zh) * 2020-06-03 2022-04-05 郑州师范学院 一种抗艰难梭菌肠毒素a的抗体
CN114853896B (zh) * 2020-11-30 2023-05-09 四川大学华西医院 一种抗糖基转移酶a亚单位的纳米抗体及其应用
CN117720651B (zh) * 2023-12-13 2024-05-31 北京新兴四寰生物技术有限公司 抗艰难梭菌毒素b的单克隆抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092340A2 (en) * 2000-05-26 2001-12-06 Immunex Corporation Use of interleukin-4 antagonists and compositions thereof

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4879218A (en) * 1982-09-13 1989-11-07 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Antibody for C.difficile
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
JPS61134325A (ja) 1984-12-04 1986-06-21 Teijin Ltd ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5358868A (en) 1987-11-24 1994-10-25 Connaught Laboratories Limited Genetic detoxification of pertussis toxin
GB8727489D0 (en) 1987-11-24 1987-12-23 Connaught Lab Detoxification of pertussis toxin
US5221618A (en) 1987-11-24 1993-06-22 Connaught Laboratories Limited Genetic detoxification of pertussis toxin
US5332583A (en) 1987-11-24 1994-07-26 Connaught Laboratories Limited Vaccine containing genetically-detoxified pertussis holotoxin
US5244657A (en) 1987-11-24 1993-09-14 Connaught Laboratories Limited Genetic detoxification of pertussis toxin
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5601823A (en) 1989-10-31 1997-02-11 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Avian antitoxins to clostridium difficle toxin A
US5736139A (en) * 1989-10-31 1998-04-07 Ochidian Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Clostridium difficile induced disease
US5919665A (en) * 1989-10-31 1999-07-06 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Vaccine for clostridium botulinum neurotoxin
US5231003A (en) 1990-05-11 1993-07-27 Cambridge Bioscience Corporation Monoclonal antibodies specific for toxin b of clostridium difficile
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) * 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) * 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) * 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
WO1993001227A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 University Of Massachusetts At Amherst Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
JPH08503121A (ja) * 1991-12-10 1996-04-09 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート 中和反応性ヒト抗−ｇｐ１２０組換え抗体、それをコードするｄｎａおよびその使用
US5466672A (en) 1992-12-04 1995-11-14 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic use of clostridium difficile toxin A
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
AU709586B2 (en) 1994-10-24 1999-09-02 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Vaccine and antitoxin for treatment and prevention of C. difficile disease
GB9621295D0 (en) * 1995-12-07 1996-11-27 Cambridge Antibody Tech Specific binding members,materials and methods
WO1998059053A1 (en) 1997-06-20 1998-12-30 Queen Mary & Westfield College Immonogenic fragments of toxin a of clostridium difficile
DE19739685A1 (de) 1997-09-10 1999-03-11 Eichel Streiber Christoph Von Monoklonale Antikörper zur Therapie und Prophylaxe von Erkrankungen durch Clostridium difficile
EP1024826B1 (en) * 1997-10-20 2005-03-16 Acambis, Inc. Passive immunization against clostridium difficile disease
US6733760B1 (en) 1999-04-09 2004-05-11 Techlab, Inc. Recombinant toxin A/toxin B vaccine against Clostridium difficile
DE60037896D1 (de) 1999-07-29 2008-03-13 Medarex Inc Menschliche antikörper gegen her2/neu
KR100942863B1 (ko) 1999-08-24 2010-02-17 메다렉스, 인코포레이티드 인간 씨티엘에이-4 항체 및 그의 용도
GB0001448D0 (en) * 2000-01-21 2000-03-08 Novartis Ag Organic compounds
UA81743C2 (uk) * 2000-08-07 2008-02-11 Центокор, Инк. МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ЛЮДИНИ, ЩО СПЕЦИФІЧНО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З ФАКТОРОМ НЕКРОЗУ ПУХЛИН АЛЬФА (ФНПα), ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ, ЩО ЙОГО МІСТИТЬ, ТА СПОСІБ ЛІКУВАННЯ РЕВМАТОЇДНОГО АРТРИТУ
TWI327597B (en) * 2001-08-01 2010-07-21 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
AU2003224604B2 (en) * 2002-01-28 2007-06-14 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to prostate specific membrane antigen (PSMA)
US7498414B2 (en) * 2002-03-04 2009-03-03 Imclone Systems Incorporated Human antibodies specific to KDR and uses thereof
JP2005520523A (ja) * 2002-03-21 2005-07-14 イーライ・リリー・アンド・カンパニー アンタゴニスト的抗ｈＦａｓリガントヒト抗体およびそのフラグメント
WO2003092630A2 (en) * 2002-05-06 2003-11-13 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries
US7396913B2 (en) * 2002-10-14 2008-07-08 Abbott Laboratories Erythropoietin receptor binding antibodies
TWI320716B (en) * 2002-10-14 2010-02-21 Abbott Lab Erythropoietin receptor binding antibodies
DE60333228D1 (de) * 2002-12-02 2010-08-12 Amgen Fremont Inc Gegen den tumor nekrose faktor gerichtete antikörper und deren verwendungen
CA2507924A1 (en) 2002-12-10 2004-07-01 Endocube Sas Thap proteins as nuclear receptors for chemokines and roles in transcriptional regulation, cell proliferation and cell differentiation
US20070003561A1 (en) * 2003-07-08 2007-01-04 Sorensen Anders P Binding member towards pneumococcus surface adhesin a protein (psaa)
PL1691837T3 (pl) * 2003-12-10 2012-11-30 Squibb & Sons Llc IP-10 przeciwciała i ich zastosowanie
RS51908B (en) * 2004-02-06 2012-02-29 University Of Massachusetts CLOSTRIDIUM DIFFICILE TOXIN ANTIBODIES AND THEIR USES
IT1395574B1 (it) 2009-09-14 2012-10-16 Guala Dispensing Spa Dispositivo di erogazione

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092340A2 (en) * 2000-05-26 2001-12-06 Immunex Corporation Use of interleukin-4 antagonists and compositions thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DENG XIAO K. ET AL., "Recombinant single-Chain variable fragment antibodies directed against Clostridium difficile toxin B produced by use of an optimized phage display system", Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, vol. 10, no. 4, 2003, side 587-595, Dated: 01.01.0001 *
KINK JOHN A. ET AL., "Antibodies to recombinant Clostridium difficule toxins A and B are effective treatment and prevent relapse of C. difficile-associated disease in a hamster model of infection", Infection and Immunity, American Society for Microbiology, vol. 66, no. 5, 1998, side 2018-2025, Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20110599T1 (hr) 2011-10-31
JP2011019516A (ja) 2011-02-03
US20100233181A1 (en) 2010-09-16
BRPI0507433A (pt) 2007-07-03
AU2005320349A8 (en) 2008-08-07
ES2533492T3 (es) 2015-04-10
JP5717300B2 (ja) 2015-05-13
JP2013153750A (ja) 2013-08-15
ES2643760T3 (es) 2017-11-24
ES2366626T3 (es) 2011-10-24
EP2270045A1 (en) 2011-01-05
EP2270045B1 (en) 2014-12-31
CY1111860T1 (el) 2015-11-04
NO2017032I1 (no) 2017-07-07
US9217029B2 (en) 2015-12-22
SI2270045T1 (sl) 2015-06-30
CN101014620A (zh) 2007-08-08
LUC00025I1 (no) 2017-07-06
NZ580828A (en) 2011-09-30
SI2857418T1 (en) 2018-01-31
PT2857418T (pt) 2017-10-20
US20140120614A1 (en) 2014-05-01
HUE024962T2 (en) 2016-02-29
DK2857418T3 (en) 2017-10-23
AU2005320349C1 (en) 2019-06-13
CY1119416T1 (el) 2018-03-07
EP1766093B1 (en) 2011-06-15
HK1152048A1 (en) 2012-02-17
SI1766093T1 (sl) 2011-12-30
CY2017022I2 (el) 2017-11-14
HUE034552T2 (en) 2018-02-28
BRPI0507433B1 (pt) 2018-03-20
KR20070050863A (ko) 2007-05-16
CN101014620B (zh) 2012-05-09
DK2270045T3 (en) 2015-04-07
LTPA2017022I1 (lt) 2017-09-11
AU2005320349A1 (en) 2006-08-24
AU2005320349B8 (en) 2010-04-22
PT1766093E (pt) 2011-08-24
WO2006121422A8 (en) 2007-04-26
EP2270045B8 (en) 2015-02-25
US7625559B2 (en) 2009-12-01
KR101332927B1 (ko) 2013-11-26
US20180208643A1 (en) 2018-07-26
DK1766093T3 (da) 2011-10-03
HK1102287A1 (en) 2007-11-09
WO2006121422A2 (en) 2006-11-16
BRPI0507433B8 (pt) 2018-04-10
NL300881I2 (nl) 2024-07-16
BE2017C023I2 (no) 2024-08-08
WO2006121422A3 (en) 2007-03-15
MXPA06008839A (es) 2008-03-07
EP2857418A1 (en) 2015-04-08
PT2270045E (pt) 2015-04-08
HUS1700028I1 (hu) 2017-07-28
US8257709B2 (en) 2012-09-04
CY2017022I1 (el) 2017-11-14
ZA200606516B (en) 2011-01-26
HK1208873A1 (en) 2016-03-18
PL2270045T3 (pl) 2015-06-30
US20210269511A1 (en) 2021-09-02
NZ548821A (en) 2009-12-24
ATE512986T1 (de) 2011-07-15
KR20120083534A (ko) 2012-07-25
EP2857418B1 (en) 2017-07-26
US8609111B2 (en) 2013-12-17
US20160152694A1 (en) 2016-06-02
JP5319622B2 (ja) 2013-10-16
BRPI0507433C1 (pt) 2021-05-25
KR101332994B1 (ko) 2013-11-26
LT2857418T (lt) 2017-09-25
PL1766093T3 (pl) 2011-11-30
US20050287150A1 (en) 2005-12-29
NO20063767L (no) 2006-10-02
LTC2270045I2 (lt) 2019-12-10
AU2005320349B2 (en) 2010-04-08
US8236311B2 (en) 2012-08-07
RS51908B (en) 2012-02-29
PL2857418T3 (pl) 2017-10-31
US20100233182A1 (en) 2010-09-16
LUC00025I2 (no) 2017-09-08
CA2553946C (en) 2019-02-26
KR20120003017A (ko) 2012-01-09
JP2007533330A (ja) 2007-11-22
EP1766093A2 (en) 2007-03-28
CA2553946A1 (en) 2005-08-06
JP4588763B2 (ja) 2010-12-01
US20120288508A1 (en) 2012-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210269511A1 (en) Antibodies against clostridium difficile toxins and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS, US

CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS, US

SPCF Filing of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: ZINPLAVA, BEZLOTOKSUMAB; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/16/1156 20170118; FIRST REG. NO/DATE: EU/1/16/1156/001-004 20170118

Spc suppl protection certif: 2017032

Filing date: 20170707

SPCG Granted supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: BEZLOTOKSUMAB; NAT. REG. NO/DATE: EU/1/16/1156 20170118; FIRST REG. NO/DATE: EU/1/16/1156/001-004 20170120

Spc suppl protection certif: 2017032

Filing date: 20170707

Extension date: 20300204