PT2270045E - Anticorpos contra toxinas de clostridium difficile e utilizações dos mesmos - Google Patents

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Hector Javier Hernandez
Israel Lowy
Deborah Molrine
Hui-Fen Zhang
Donna Ambrosino
Robert Mandell
Gregory J Babcock
William D Thomas
Theresa Broering
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Univ Massachusetts
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS CONTRA TOXINAS DE CLOSTRIDIUM DIFFICILE E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
Antecedentes da invenção
Clostridium difficile (C. difficile) é uma bactéria gram positiva que causa doença gastrointestinal em seres humanos. C. difficile é a causa mais comum de diarreia infeciosa em pacientes de hospital, e é uma das mais comuns infeções nosocomiais globais (Kelly et ai., New Eng. J. Med., 330: 257-62, 1994). De facto, a doença associada a este patogénio pode chegar a afetar três milhões de pacientes hospitalizados por ano nos Estados Unidos (McFarland et ai., New Eng. J. Med., 320: 204-10, 1989;
Johnson et ai., Lancet, 336: 97-100, 1990). O tratamento com antibióticos como ampicilina, amoxicilina, cefalosporinas e clindamicina que afetam a flora intestinal normal pode permitir a colonização do intestino com C. difficile, resultando em doença de C. difficile (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998). O aparecimento de doença de C. difficile tipicamente ocorre quatro a nove dias após o inicio do tratamento com antibiótico, mas também pode ocorrer após a descontinuação de terapêutica com antibiótico. C. difficile pode produzir sintomas que variam de diarreia e colite moderada a grave, incluindo colite pseudomembranosa (PMC), uma forma grave de colite caracterizada por dor abdominal, diarreia aquosa, e doença sistémica (por exemplo, febre, náusea). Nesta doença a recaída pode ocorrer em até 20% dos pacientes tratados para um primeiro episódio de doença, e aqueles que têm uma recaída estão em maior risco de novas recaídas (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998).
Acredita-se que a doença de C. difficile seja causada pelas acções de duas exotoxinas, toxina A e toxina B, no epitélio do intestino. Ambas as toxinas são proteínas de alto peso molecular (280-300 kDa) que catalisam a modificação covalente de proteínas Rho, pequenas proteínas de ligação a GTP envolvidas na polimerização de actina, em células hospedeiras. A modificação de proteínas Rho pelas toxinas inativa-as, levando a despolimerização de filamentos de actina e morte celular. Ambas as toxinas são letais para ratinhos quando injectadas por via parentérica (Kelly e Lamont, Annu. Rev. Med., 49: 375-90, 1998) . A doença de C. difficile pode ser diagnosticada por meio de ensaios que detetam a presença ou atividade de toxina A ou toxina B em amostras de fezes, por exemplo, imunoensaios enzimáticos. Os ensaios de citotoxina podem ser utilizados para detectar a actividade de toxina. Para realizar um ensaio de citotoxina, as fezes são filtradas para retirar bactérias, e os efeitos citopáticos de toxinas sobre as células cultivadas são determinados (Merz et ai., J. Clin. Microbiol., 32: 1142-47, 1994). O tratamento de C. difficile é complicado pelo facto de que antibióticos provocam doença associada a C. difficile. Não obstante, os antibióticos são actualmente a opção de tratamento primário. Os antibióticos menos prováveis de causar a doença associada a C. difficile tal como vancomicina e metronidazol são com frequência utilizados. O desenvolvimento de resistência a vancomicina em outros microrganismos é uma causa de preocupação em relação à utilização deste antibiótico para tratamento, já que é o único tratamento eficaz para infecção com outros microrganismos (Gerding, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 250: 127-39, 2000) . As abordagens probióticas, em que se administram a uma pessoa microrganismos não patogénicos que competem presumivelmente por nichos com as bactérias patogénicas, são também utilizadas. Por exemplo, o tratamento com uma combinação de vancomicina e Saccharomyces boulardii foi relatado (McFarland et ai, JAMA., 271(24): 1913-8, 1994. Erratum em: JAMA, 272(7): 518, 1994) .
Desenvolveram-se vacinas que protegem animais da inoculação letal em modelos infeciosos da doença (Torres et al., Infect. Immun. 63(12) : 4619-27,1995) . Além disso, estudos mostraram que os anticorpos policlonais protegem hamsters da doença quando são administrados por meio de injeção ou alimentação (Giannasca et al., Infect. Immun. 67(2): 527-38, 1999; Kink e Williams, Infect. Immun., 66(5): 2018-25, 1998). Isolaram-se anticorpos monoclonais murinos que se ligam a toxinas de C. difficile e neutralizam as suas atividades in vivo e in vitro (Corthier et al., Infect. Immun., 59(3) : 1192-5, 1991) . Existem alguns estudos que mostram que os anticorpos policlonais humanos contendo anticorpos de neutralização de toxina podem prevenir a recaída de C. difficile (Salcedo et al., Gut., 41(3) : 366-70, 1997) . A resposta de anticorpo contra a toxina A tem sido correlacionada com o resultado da doença, o que indica a eficácia das respostas humorais no controle da infecção. Os indivíduos com respostas fortes de ELISA a toxina A apresentaram doença menos grave em comparação com indivíduos com baixos níveis de anticorpo contra a toxina A (Kyne et al., Lancet, 357 (9251): 189-93, 2001) . O papel individual de toxina A e toxina B na patogénese da doença, e o papel de anticorpos antitoxina na protecção contra a doença de C. difficile são controversos e podem depender do hospedeiro. Em seres humanos, a resposta de anticorpo antitoxina A foi correlacionada com o resultado (outcome) da doença, o que sugere um requisito para a resposta protectora da antitoxina A. Esta observação é em contraste com relatos de organismos C. difficile causadores de doença que expressam somente toxina B, implicando que a toxina B pode contribuir para a doença em seres humanos. Estas estirpes toxina A negativas podem também causar a doença em hamsters (Sambol et al., J. Infect. Dis., 183(12): 1760-6, 2001).
Sabe-se que o antissoro policlonal contra a toxina B de C. difficile inibe o domínio catalítico da toxina B (Genth et al., Inf. and Immun., 68(3): 1094-1101, 2000) . Sabe-se que os anticorpos de fragmento variável de cadeia única recombinantes direcionados contra a toxina B do C. difficile se ligam aos antigénios com alta afinidade (Deng et al., Clin. Diagn. Lab. Immun., 10(4): 587-595, 2003) .
Sumário da invenção
Esta invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que a administração de anticorpos contra a toxina A de C. difficile a um indivíduo pode proteger o indivíduo contra a recaída da doença mediada por C. difficile in vivo. A administração de anticorpos a uma ou tanto a toxina A como a toxina B pode prevenir doença primária mediada por C. difficile. Os anticorpos de alta afinidade contra as toxinas de C. difficile podem ser produzidos, por exemplo, em ratinhos, tais como ratinhos transgénicos que expressam segmentos de gene da imunoglobulina humana. Estes anticorpos podem neutralizar a citotoxicidade da toxina in vitro, e neutralizar a enterotoxicidade da toxina in vivo. Os anticorpos que reconhecem a toxina A e/ou a toxina B podem inibir e proteger contra a doença in vivo. A invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) com uma KD de menos de 10 x 10~10 M conforme medido através de ressonância do plasmão de superfície e neutraliza a toxina B de C. difficile, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs: 62, 64 e 66; e (b) uma região variável de cadeia leve que compreende as sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs: 68, 70 e 72.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos neutralizam a toxina B in vitro, inibem a ligação de toxina B às células de mamíferos, e/ou inibem a doença mediada por C. difficile in vivo.
Em várias formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos têm uma ou mais das seguintes características: quando são administrados a um ratinho, protegem o ratinho contra a administração de uma toxina de C. difficile numa quantidade que seria fatal a um ratinho de controlo que não se administrou o anticorpo; protegem contra ou inibem colite medida por C. difficile, colite associada a antibiótico, ou colite pseudomembranosa (PMC) num indivíduo; protegem contra ou inibem a diarreia num indivíduo; e/ou inibem a recaída da doença mediada por C. difficile.
Numa forma de realização, a invenção proporciona um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção, em que a região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54 e a região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58. O anticorpo da invenção pode ser um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico ou a porção de ligação a antigénio da invenção pode compreender um Fab, F (ab' ) 2t ScFv ou Fv. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer uma das reivindicações seguintes num portador farmaceuticamente aceitável e uma composição terapêutica compreendendo: (a) o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de qualquer um da invenção; e (b) um o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina A de C. difficile.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A podem ligar-se especificamente a um epítopo dentro da metade do terminal N de toxina A, por exemplo, um epitopo entre os aminoácidos 1-1256 de toxina A. Em outras formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A ligam-se especificamente a um epitopo dentro do domínio de ligação do recetor do terminal C da toxina A, por exemplo, um epítopo entre os aminoácidos 1852-2710 da toxina A, ou um epítopo entre os aminoácidos 659-1852, por exemplo, um epítopo dentro de resíduos de aminoácidos 900-1852, 900-1200, ou 920-1033 da toxina A. Em outras formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A ligam-se especificamente a um epítopo dentro de aminoácidos 1-600, 400-600, ou 415-540 da toxina A. Outros anticorpos particulares, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A podem ligar-se especificamente a um epítopo dentro de resíduos de aminoácidos 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800, 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 ou 2200-2300, 2300-2400, 2400-2500, 2500-2600, 2600-2710 da toxina A, ou qualquer intervalo, porção ou série dos mesmos.
Em certas formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A, ligam-se com uma KD de menos de aproximadamente 20 x 10~6 M. Numa forma de realização particular, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se ligam especificamente à toxina A, ligam-se com uma KD de menos de aproximadamente 10 x 10~7 M, menos de aproximadamente 10 x 10~8 M, menos de aproximadamente 10 x 10~9 M, ou menos de aproximadamente 10 x 10~10 M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se ligam especificamente à toxina A, ligam-se com uma KD de menos de aproximadamente 50 x 10~10 M, menos de aproximadamente 20 x 10~10 M, menos de aproximadamente 15 x 10~10 M, menos de aproximadamente 8 x 10~10 M, ou menos de aproximadamente 5 x 10~10 M.
Em várias outras formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A incluem uma região de cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 1), 1B11 (SEQ ID NO: 2), ou 3H2 (SEQ ID NO: 3).
Em certas formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A incluem uma região de cadeia leve variável que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma região de cadeia leve variável sequência de aminoácidos do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), ou 3H2 (SEQ ID NO: 6).
Em certas formas de realização, cada um dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente à toxina A incluem cada tanto uma região de cadeia pesada variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos da região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 1), 1B11 (SEQ ID NO: 2), ou 3H2 (SEQ ID NO: 3), como uma região de cadeia leve variável que inclui uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de cadeia leve variável do clone 3D8 SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 5), ou 3H2 (SEQ ID NO: 6).
Em várias formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A, ligam-se especificamente a um epitopo que se sobrepõe a um epitopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11 ou 3H2 e/ou compete para ligar-se à toxina A com um anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11 ou 3H2.
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7- 9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15) (também mostradas no Quadro 1).
Uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especif icamente à toxina A pode incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região variável de cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24) (também mostradas no Quadro 2).
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A pode incluir uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), 3H2 (SEQ ID Nos: 13-15) e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos pode incluir uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de um região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24).
Uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A pode incluir três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9), 1B11 (SEQ ID Nos: 10-12) ou 3H2 (SEQ ID Nos: 13-15).
Em algumas formas de realização, uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24).
Em algumas formas de realização, uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A inclui uma ou mais CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18, 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21, ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24), e uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15). A região de cadeia leve variável pode incluir três CDRs que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99%, ou mais idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24).
Em certas formas de realização, uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos que se ligam especificamente à toxina A inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 7-9), 1B11 (SEQ ID NOs: 10-12), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 13-15), e uma região de cadeia leve variável dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos inclui três CDRs que são idênticas a uma CDR de uma região de cadeia leve variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NOs: 16-18), 1B11 (SEQ ID NOs: 19-21), ou 3H2 (SEQ ID NOs: 22-24), por exemplo, uma região de cadeia leve variável e uma região de cadeia pesada variável do anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo são idênticas a uma região de cadeia leve variável e a uma região de cadeia pesada variável do anticorpo produzido pelo clone 3D8 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4), 1B11 (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5), ou 3H2 (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6).
Numa forma de realização, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina A de C. difficile: (a) compete pela ligação à toxina A com um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, tendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que compreendem as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 1 e 4, SEQ ID NOs: 2 e 5 ou SEQ ID NOs: 3 e 6, respetivamente; ou (b) liga-se especificamente à toxina A com uma KD de menos do que 20 x 10~6 M, tal como medido por ressonância de plasmão de superfície. O anticorpo que se liga especificamente à toxina A de C. difficile pode ser um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico ou a porção de ligação a antigénio que se liga especificamente à toxina A de C. difficile pode compreender um Fab, F(ab')2f ScFv ou Fv.
Em algumas formas de realização, os anticorpos porções de ligação a antigénio dos mesmos, ligam-se especificamente a um epitopo na porção C-terminal da toxina B (por exemplo, entre os aminoácidos 1777-2366 da toxina B) . Outros anticorpos particulares, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, podem ligar-se especificamente a um epitopo entre os resíduos de aminoácidos 1-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-500, 500-600, 600-700, 700-800 , 900-1000, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500-1600, 1600-1700, 1800-1900, 1900-200, 2100-2200 ou 2200-2366 da toxina B, ou qualquer intervalo, porção ou série dos mesmos.
Os anticorpos porções de ligação a antigénio dos mesmos, da invenção ligam-se especificamente à toxina B com uma KD de menos de 10 x 10~10 M. Em outras formas de realização particulares, o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina B com uma KD de menos do que cerca de 8 x 10~10 M, ou menos do que cerca de 5 x 10~10 M.
Em várias outras formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, incluem uma região variável da cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54) .
Em certas formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, incluem uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58).
Em certas formas de realização, os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos incluem cada, tanto uma região variável da cadeia pesada incluindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de região variável de cadeia pesada do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 54), e uma região variável de cadeia leve incluindo uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, ou mais idêntica a uma sequência de aminoácidos de região variável da cadeia leve do anticorpo produzido pelo clone 124-152 (isto é, a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 58) .
Em várias formas de realização, a anticorpos ou porções de ligação a antigénio ligam-se especificamente a um epitopo que se sobrepõem com um epitopo ligado por um anticorpo produzido pelo clone 124-152 e/ou compete pela ligação à toxina B com um anticorpo produzido pelo clone 124-152 .
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, podem ser anticorpos de comprimento completo, podem incluir um domínio efetor, por exemplo, um domínio Fc, podem ser anticorpos do isotipo de imunoglobulina gama, anticorpos de cadeia única, ou fragmentos Fab. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, podem ainda incluir um portador farmaceuticamente aceitável e/ou um marcador.
Em várias formas de realização, composições incluindo os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, são livres de outros polipéptidos humanos (por exemplo, eles contêm menos do que 5% de polipéptidos humanos diferentes dos anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos).
Ainda noutro aspeto, a divulgação apresenta composições incluindo: (a) um anticorpo monoclonal humano isolado ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile; e (b) um anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio ou do mesmo, que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile. 0 anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da presente invenção liga-se especificamente à toxina B de C. difficile, e o anticorpo policlonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina A de C. difficile. Os anticorpos podem incluir outras caracteristicas descritas no presente documento.
Noutro aspeto, a invenção apresenta anticorpos monoclonais humanos isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivada de um gene VH 3-33 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene VK humano selecionado a partir do grupo que consiste em VK L19, VK L6 e VK L15. Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, podem incluir outras caracteristicas descritas no presente documento.
Noutro aspeto, a invenção apresenta anticorpos monoclonais humanos isolados ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, que se ligam especificamente a uma exotoxina de Clostridium difficile (C. difficile) em que os anticorpos: (a) incluem uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivada de um gene VH 5-51 humano; e/ou (b) incluem uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene VK A27 humano.
Os anticorpos ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, podem incluir outras caracteristicas descritas no presente documento.
Noutro aspeto, a invenção apresenta um ácido nucleico de vetor de expressão compreendendo: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 54; e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 58. A invenção também proporciona uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor de expressão da invenção e uma célula hospedeira isolada compreendendo: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 54; e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 58.
As células hospedeiras podem também ser células eucarióticas, por exemplo, células de levedura, células de mamíferos, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células NSO, ou células de mieloma.
Noutro aspeto, a invenção apresenta um kit que compreende: (a) o anticorpo monoclonal ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção; e (b) (i) um marcador; (ii) um agente terapêutico; (iii) um agente para acoplar o anticorpo a um marcador ou agente terapêutico; ou (iv) um dispositivo para administrar o anticorpo a um indivíduo. 0 kit pode incluir instruções para utilização na prevenção ou tratamento de doença por C. difficile. 0 kit pode incluir adicionalmente um anticorpo policlonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile. Numa forma de realização, o anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina A de C. difficile. Numa forma de realização, o anticorpo policlonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, liga-se especificamente à toxina B de C. difficile. A invenção proporciona o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção ou a composição da invenção para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por meio de terapêutica ou num método de diagnóstico levado a cabo no corpo humano ou animal e o anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção ou a composição da invenção para utilização num método de tratamento da doença mediada por C. difficile num indivíduo, em que opcionalmente: (a) o indivíduo é humano; e/ou (b) o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, é administrada ao indivíduo por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea.
Exemplos de doença por C. difficile incluem colite mediada por C. difficile, colite associada a antibiótico, colite pseudomembranosa (PMC) medida por C. difficile, ou diarreia, ou recaída da doença mediada por C. difficile. 0 anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, podem ser administrados em separado ou em combinação com outro agente terapêutico, por exemplo, um segundo anticorpo monoclonal humano ou porção de ligação a antigénio do mesmo. 0 agente terapêutico pode ser: um antibiótico, gama-globulina policlonal, agente probióticos ou vacina de C. difficile; vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii ou uma vacina de toxoide de C. difficile; ou um anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina A de C. difficile.
Numa forma de realização, um anticorpo ou porção de ligação a antigénio, produzido pelo clone 3D8 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 4 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a SEQ ID NO: 1 é administrado em combinação com um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, produzido pelo clone 124-152 (isto é, que inclui uma sequência da região de cadeia leve variável idêntica a SEQ ID NO: 58 e uma sequência da região de cadeia pesada variável idêntica a SEQ ID NO: 54). São descritos métodos para o fabrico de um anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especif icamente a uma exotoxina de C. difficile, por meio da imunização de um animal transgénico não humano que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve humano com uma composição que inclui uma exotoxina inativada, e isolamento de um anticorpo do animal. A exotoxina pode ser inactivada, por exemplo, por tratamento com UDP-dialdeído ou por mutação (por exemplo, utilizando métodos recombinantes). 0 método pode incluir ainda avaliar a ligação do anticorpo à exotoxina. São descritos métodos para o fabrico de um anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pela provisão de um ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal humano, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especif icamente a uma exotoxina de C. difficile, e expressa o ácido nucleico numa célula hospedeira.
Também descrito no presente documento é um hibridoma ou transfectoma que inclui um ácido nucleico que codifica porções de ligação a antigénio (por exemplo, CDRs, ou regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 3D8, 1B11, ou 3H2.
Também descrito no presente documento é um hibridoma ou transfectoma que inclui um ácido nucleico que codifica porções de liqação a antiqénio (por exemplo, CDRs, ou regiões variáveis) do anticorpo produzido pelo clone 124-152, 2A11, ou 1G10.
Também descrito no presente documento é um método para o fabrico de um hibridoma que expressa um anticorpo que se liga especificamente a uma exotoxina de C. difficile por meio da imunização de um animal transgénico não humano que tem um genoma que inclui um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia leve humano, com uma composição que inclui a exotoxina, em que a toxina é inativada; isolamento de esplenocitos do animal; geração de hibridomas a partir dos esplenocitos; e selecção de um hibridoma que produz um anticorpo que se liga especificamente à exotoxina. 0 tratamento de seres humanos com anticorpos monoclonais humanos oferece diversas vantagens. Por exemplo, os anticorpos são provavelmente menos imunogénicos em seres humanos que anticorpo não humanos. A terapêutica é rápida; a inativação da toxina pode ocorrer tão logo o anticorpo alcance os locais de infeção e neutralize diretamente a(s) toxina (s) que causa(m) a doença. Os anticorpos humanos localizam locais apropriados em seres humanos mais eficientemente que os anticorpos não humanos. Além disso, o tratamento é especifico para C. difficile, e é improvável que destrua a flora intestinal normal, ao contrário da terapêutica tradicional com antibióticos.
Outras caracteristicas e vantagens da invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada, e a partir das reivindicações.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um quadro que faz uma lista das sequências de aminoácidos das cadeias VH e VL codificadas pelas sequências de ARNm de cada clone.
As letras em minúsculas representam aminoácidos no péptido líder. As CDRs são sublinhadas. 0 clone 3D8, que expressa 6 regiões V de cadeia leve únicas, somente expressou a sequência de aminoácidos do grupo I. A Figura 2Ά é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 3D8. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 2B é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 3D8. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 3Ά é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 1B11. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 3B é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 1B11. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 4A é uma representação das sequências de
aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 33.3H2 (denominado no presente documento como 3H2; 33.3H2 e 3H2 são utilizados intercambiavelmente no presente documento). Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 4B é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 33.3H2. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 5 é um gráfico que representa os resultados de ensaios ELISA, que mediram a ligação de anticorpos monoclonais antitoxina A à toxina A.
As Figuras 6A-B são um conjunto de gráficos que representa os resultados de ensaios de neutralização in vitro na presença e ausência de anticorpos monoclonais antitoxina A. A FIG. 6A representa os resultados para ensaios realizados com células IMR-90. A FIG. 6B representa os resultados para ensaios realizados com células T-84. A Figura 7 é uma representação esquemática da toxina A polipéptido, que indicam fragmentos que foram analisados para estudos de mapeamento de epítopos. A Figura 8A-B são representações esquemáticas dos fragmentos de toxina A analisados para estudos de mapeamento de epítopos. A Figura 9 é um quadro que faz uma lista dos resultados de ensaios in vivo para determinar a proteção de ratinho contra inoculação letal com toxina A por anticorpos monoclonais antitoxina A. A Figura 10 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de acumulação de fluidos na alça ileal de ratinhos para medir a eficácia de neutralização de anticorpo antitoxina in vivo. A Figura 11A é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de recaída em hamsters. A Figura 11B é um gráfico que representa os resultados dos ensaios como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. A Figura 12 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. A Figura 13 é um gráfico que representa os resultados de ensaios em que a neutralização in vitro da toxina A e toxina B foi medida na presença e ausência de anti-soros policlonais de cabras imunizadas com toxóide B. "G330" refere-se a amostras em que soros de cabra #330 foram testados. "G331" refere-se a amostras em que soros de cabra #331 foram testados. A Figura 14 é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de recaída em hamsters. A Figura 15 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8, vancomicina e anti-soros de cabra #331, ou vancomicina, 3D8, e anti-soros de cabra #331. A Figura 16 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de animais saudáveis após tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. "Cabra 331" refere-se a anti-soros de cabra #331. A Figura 17 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de hamsters que sobrevivem ao tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile.
Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina. Os hamsters foram tratados com vancomicina, vancomicina e 3D8, ou não receberam tratamento. A Figura 18 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de recaída em hamsters como a percentagem de animais saudáveis após tratamento com clindamicina seguido por inoculação com C. difficile. Os hamsters foram imunizados com um fragmento da toxina B antes do tratamento com clindamicina. A Figura 19 é um diagrama esquemático da cronologia de administração de vários agentes a hamsters num modelo de inoculação direta com C. difficile. "331" refere-se a anti-soros de cabra #331. "Clinda" refere-se a tratamento com clindamicina. A Figura 20 é um gráfico que representa os resultados de modelo de inoculação direta como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. difficile. A Figura 21 é um gráfico que representa os resultados de modelo de inoculação direta como a percentagem de animais saudáveis após inoculação direta com C. difficile. A Figura 22 é uma representação da sequência de aminoácidos da toxina A de C. difficile. A Figura 23 é uma representação da sequência de aminoácidos da toxina B de C. difficile. A Figura 24 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. di ff idle. A Figura 25 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. di ff idle. A Figura 26 é um gráfico que representa os resultados de ensaios de inoculação primária como a percentagem de hamsters que sobrevivem à inoculação direta com C. di ff idle. A Figura 27 é um gráfico que representa os resultados de ensaios em que a neutralização in vitro da toxina A e toxina B foi medida na presença de anticorpos monoclonais contra a toxina B ou soros policlonais de cabra contra a toxina B. A Figura 28 é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VH expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 29 é uma representação das sequências de aminoácidos e de ácido nucleico da cadeia VL expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos e de ácido nucleico. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 30 é uma representação da sequência germinal relacionada e aminoácido da cadeia VH expressa pelo clone 124-152. Os genes de segmento V, segmento D e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 31 é uma representação das sequências germinais relacionadas e aminoácido da cadeia VL expressas pelo clone 124-152. Os genes de segmento V e segmento J são postos em lista com as sequências de aminoácidos. As CDRs são sobrelinhadas. A Figura 32 é uma representação esquemática do polipéptido da toxina B, que indica os fragmentos que foram analisados para estudos de mapeamento de epitopos. Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.
Descrição detalhada da invenção A fim de proporcionar um entendimento claro da memória descritiva e reivindicações, as seguintes definições são convenientemente proporcionadas a seguir.
Definições 0 termo "toxina A" refere-se à proteína de toxina A codificada por C. difficile. A sequência de aminoácidos da toxina A de C. difficile (SEQ ID NO: 41) é proporcionada em GenBank® sob número de acesso A37052, versão GI 98593 (veja-se também Figura 22). "Toxina B" refere-se à proteína de toxina B codificada por C. difficile. A sequência de aminoácidos da toxina B de C. difficile (SEQ ID NO: 42) é proporcionada em GenBank® sob número de acesso S70172, versão GI 7476000 (veja-se também Figura 23). "Proteína" é utilizada intercambiavelmente com "polipéptido."
Um "anticorpo anti-C. difficile" é um anticorpo que interage com (por exemplo, liga-se a) uma proteína ou outro componente produzido por bactérias C. difficile. Um "anticorpo antitoxina" é um anticorpo que interage com uma toxina produzida por C. difficile (por exemplo, toxina A ou toxina B) . Um anticorpo de proteína antitoxina pode ligar-se a um epítopo, por exemplo, um epítopo conformacional ou um epítopo linear, ou a um fragmento da proteína de toxina de comprimento completo.
Um "anticorpo humano", é um anticorpo que tem regiões variáveis e constantes derivadas de sequências germinais de imunoglobulina humana. Os anticorpos humanos descritos no presente documento podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências germinais de imunoglobulina humana (por exemplo, mutações introduzidas por meio de mutagénese aleatória ou específica de um locus in vitro ou por meio de mutação somática in vivo).
Um anticorpo antitoxina, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pode ser administrado em separado ou em combinação com um segundo agente. 0 indivíduo pode ser um paciente infetado com C. difficile, ou que tem um sintoma de doença associada a C. difficile ("CDAD"; por exemplo, diarreia, colite, dor abdominal) ou uma predisposição para a doença associada a C. difficile (por exemplo, que está a passar por tratamento com antibióticos, ou que sofreu da doença associada a C. difficile e em risco de recaída da doença). 0 tratamento pode ser para curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, paliar, recuperar, ou afetar a infeção e a doença associada à infeção, os sintomas da doença, ou a predisposição para a doença.
Uma quantidade de um anticorpo antitoxina eficaz para tratar uma CDAD, ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz", é uma quantidade do anticorpo que é eficaz, em administração de dose única ou doses múltiplas a um indivíduo, na inibição de CDAD num indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode variar de acordo com fatores tais como a estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma em que os efeitos terapeuticamente benéficos têm mais importância que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo ou porção de anticorpo. A capacidade de um anticorpo de inibir um parâmetro mensurável pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo de eficácia em seres humanos. Por exemplo, a capacidade de um anticorpo antitoxina de proteger os ratinhos contra a inoculação letal com C. difficile pode predizer a eficácia em seres humanos. Outros modelos animais predicativos de eficácia são descritos no presente documento, tais como o modelo de ligação intestinal descrito nos Exemplos. Alternativamente, esta propriedade de um anticorpo ou composição de anticorpo pode ser avaliada por meio do exame da capacidade do composto de modulação, tal modulação in vitro pode ser avaliada por meio de ensaios conhecidos do perito na especialidade. Os ensaios in vitro incluem ensaios de ligação, tais como ELISA, e ensaios de neutralização.
Uma quantidade de um anticorpo antitoxina eficaz para prevenir um distúrbio, ou "uma quantidade profilaticamente eficaz", do anticorpo é uma quantidade que é eficaz, em administração de dose única ou doses múltiplas ao indivíduo, na prevenção ou atraso da ocorrência do aparecimento ou recorrência de CDAD, ou inibição de um sintoma da mesma. No entanto, se intervalos de tempo mais longos de proteção são desejados, doses aumentadas podem ser administradas.
Os termos "agonizar", "induzir", "inibir", "potencializar", "elevar", "aumentar", "diminuir", ou semelhantes, por exemplo, que denotam diferenças quantitativas entre dois estados, referem-se a uma diferença, por exemplo, uma diferença estatisticamente ou clinicamente significativa, entre os dois estados.
Como é utilizado no presente documento, "ligação especifica" ou "liga-se especificamente a" refere-se à capacidade de um anticorpo de: (1) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade de pelo menos 1 x ΙΟ7 M_1, e (2) ligar-se a uma toxina de C. difficile com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que a sua afinidade para um antigénio não específico.
Um "anticorpo" é uma proteína que inclui pelo menos uma ou duas regiões variáveis da cadeia pesada (H) (abreviadas no presente documento como VHC) e pelo menos uma ou duas regiões variáveis da cadeia leve (L) (abreviadas no presente documento como VLC). As regiões VHC e VLC podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, denominadas "regiões de determinação de complementaridade" ("CDR, interpoladas com regiões que são mais conservadas, denominadas "regiões framework" (FR) . A extensão da região framework e das CDRs foi definida com exatidão (veja-se, Rabat, E. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242, 1991, e Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987,) . Preferentemente, cada VHC e VLC está composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas desde o terminal amino até o terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A cadeia VHC ou VLC do anticorpo pode incluir ainda toda ou parte de uma região constante de cadeia leve ou pesada. Numa forma de realização, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, em que as cadeias leves e pesadas de imunoglobulina são interligadas por meio de, por exemplo, ligações de dissulfeto. A região constante de cadeia pesada inclui três domínios, CHI, CH2 e CH3. A região constante de cadeia leve está compreendida de um domínio, CL. A região variável das cadeias leves e pesadas contém um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos tipicamente medeiam a ligação do anticorpo to tecidos ou fatores do hospedeiro, que inclui várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complemento clássico. O termo "anticorpo" inclui imunoglobulinas intactas dos tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (bem como subtipos dos mesmos), em que as cadeias leves da imunoglobulina podem ser de tipos capa ou lambda. "Imunoglobulina" refere-se a uma proteína que consiste num ou mais polipéptidos substancialmente codificados pelos genes da imunoglobulina. Os genes da imunoglobulina humana reconhecidos incluem os genes da região constante capa, lambda, alfa (IgAl e IgA2), gama (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon, e mu, bem como os genes da região variável da imunoglobulina miríades. As "cadeias leves" da imunoglobulina de comprimento completo (aproximadamente 25 KD e 214 aminoácidos) são codificadas por um gene da região variável no terminal NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) e um gene da região constante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" da imunoglobulina de comprimento completo (aproximadamente 50 KD e 446 aminoácidos), são codificadas de maneira similar por um gene da região variável (aproximadamente 116 aminoácidos) e um dos outros genes da região constante mencionados anteriormente, por exemplo, gama (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). O termo "imunoglobulina" inclui uma imunoglobulina que tem: CDRs a partir de uma fonte humana ou não humana. O framework da imunoglobulina pode ser humano, humanizado, ou não humano, por exemplo, um framework murino modificado para diminuir a antigenicidade em seres humanos, ou um framework sintético, por exemplo, uma sequência consenso.
Como é utilizado no presente documento, "isotipo" refere-se à classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGi) que é codificada pela região constante de cadeia pesada genes. O termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo", ou "porção"), como é utilizado no presente documento, refere-se a uma porção de um anticorpo que se liga especificamente a uma toxina de C. difficile (por exemplo, toxina A), por exemplo, uma molécula em que uma ou mais cadeias de imunoglobulina não são de comprimento completo, mas que se liga especificamente a uma toxina. Os exemplos de porções de ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VLC, VHC, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VHC e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VLC e VHC de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. , Nature 341: 544-546, 1989), que consiste num domínio VHC; e (vi) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR) que tem suficiente framework para ligar-se especificamente a, por exemplo, uma porção de ligação a antigénio de uma região variável. Uma porção de ligação a antigénio de uma região variável de cadeia leve e uma porção de ligação a antigénio de uma região variável de cadeia pesada, por exemplo, os dois domínios do fragmento Fv, VLC e VHC, podem se juntados, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que o par de regiões VLC e VHC forma moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja-se, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; e Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883) . Tais anticorpos de cadeia única são também abrangidos dentro do termo "porção de ligação a antigénio" de um anticorpo. Estas porções de anticorpo são obtidas utilizando técnicas convencionais conhecidas daqueles peritos na especialidade, e as porções são rastreadas para utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos. 0 termo "anticorpo monoespecífico" refere-se a um anticorpo que mostra uma afinidade e especificidade de ligação única para um alvo particular, por exemplo, epítopo. Este termo inclui um "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", que como é utilizado no presente documento refere-se a uma preparação de anticorpos ou porções dos mesmos com uma composição molecular única. 0 termo anticorpo "recombinante", como é utilizado no presente documento, refere-se a anticorpos que são preparados, expressos, criados, ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressos utilizando um vetor de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo recombinante, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgénico para genes da imunoglobulina humana ou anticorpos preparados, expressos, criados, ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem excisão-reparação de sequências de gene da imunoglobulina humana a outras sequências de ADN. Tais anticorpos recombinantes incluem anticorpos humanizados, enxertados com CDR, quiméricos, gerados in vitro (por exemplo, por meio de apresentação em fagos), e podem opcionalmente incluir regiões constantes derivadas de sequências germinais de imunoglobulina humana.
Como é utilizado no presente documento, o termo "substancialmente idêntica" (ou "substancialmente homóloga") refere-se a uma primeira sequência de nucleótido ou aminoácido que contém um número suficiente de resíduos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com uma cadeia lateral similar, por exemplo, substituições de aminoácidos conservados) de aminoácidos ou nucleótidos a uma segunda sequência de nucleótido ou aminoácido tal que as primeira e segunda sequências de nucleótido ou aminoácido têm atividades similares. No caso de anticorpos, o segundo anticorpo tem a mesma especificidade e tem pelo menos 50% da afinidade do primeiro anticorpo.
Os cálculos de "homologia" entre duas sequências são realizados como segue. As sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótimos (por exemplo, espaços podem ser introduzidos numa ou ambas de uma primeira e uma segunda sequência de ácido nucleico ou aminoácido para o alinhamento ótimo e sequências não homólogas podem ser desconsideradas para propósitos de comparação). O comprimento de uma sequência de referência alinhada para propósitos de comparação é pelo menos 50% do comprimento da sequência de referência. Os resíduos de aminoácidos ou nucleótidos em posições de aminoácido ou posições de nucleótido correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleótido como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição (como é utilizado no presente documento aminoácido ou ácido nucleico "identidade" é equivalente a "homologia" de aminoácido ou ácido nucleico). A percentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências, levando em consideração o número de espaços, e o comprimento de cada espaço, que é necessário que seja introduzido para o alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de percentagem de homologia entre duas sequências podem ser conseguidas utilizando um algoritmo matemático. A percentagem de homologia entre duas sequências de aminoácidos é determinada utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 444-453, 1970, que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG, utilizando uma matriz de pontuação de Blossum 62 com uma penalidade de espaço de 12, um penalidade de extensão de espaço de 4, e uma penalidade de espaço de alteração de grelha de leitura de 5.
Como é utilizado no presente documento, o termo "hibridiza sob condições de restringência baixa, restringência média, restringência alta, ou restringência muito alta" descreve condições para hibridação e lavagem. Orientação para realizar reações de hibridação pode ser encontrada em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989. Os métodos aquosos e não aquosos são descritos nessa referência e podem ser utilizados. As condições de hibridação específicas denominadas no presente documento são como segue: 1) condições de hibridação de restringência baixa: 6X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por duas lavagens em 0,2X de SSC, 0,1% de SDS pelo menos a 50 °C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada até 55°C para condições de restringência baixa); 2) condições de hibridação de restringência média: 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1% de SDS a 60°C; 3) condições de hibridação de restringência alta: 6X de SSC a aproximadamente 45°C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X de SSC, 0,1% de SDS a 65°C; e 4) condições de hibridação de restringência muito alta: 0,5 M sódio fosfate, 7% de SDS a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens a 0,2X de SSC, 1% de SDS a 65°C.
Entende-se que os anticorpos e porções de ligação a antigénio dos mesmos descritos no presente documento podem ter substituições de aminoácidos não essenciais ou conservativas adicionais, que não têm um efeito substancial sobre as funções de polipéptido. Se uma substituição particular será tolerada ou não, isto é, não afetará adversamente propriedades biológicas desejadas, tais como atividade de ligação, pode ser determinada como foi descrito em Bowie et al., Science, 247: 1306-1310, 1990. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma em que um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos que têm cadeias laterais similares foram definidas no estado da técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência do tipo selvagem de um polipéptido, tal como um agente de ligação, por exemplo, um anticorpo, sem substancialmente alterar uma atividade biológica, ao passo que um resíduo de aminoácido "essencial" resulta em tal mudança. A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado que comummente entendido por um perito médio na especialidade à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles descritos no presente documento podem ser utilizados na prática ou realização de testes da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos a seguir. No caso de conflito, a presente memória descritiva, a qual inclui definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não são destinados a serem limitativos.
Visão global 0 C. difficile é uma bactéria gram positiva produtora de toxinas, que causa colite e diarreia associada a antibiótico em seres humanos. Proporcionam-se no presente documento anticorpos e composições para o tratamento e a prevenção de doença associada a C. difficile (CDAD). As composições incluem anticorpos que reconhecem proteínas e outros componentes moleculares (por exemplo, lípidos, hidratos de carbono, ácidos nucleicos) de bactérias C. difficile, que incluem anticorpos que reconhecem toxinas produzidas por C. difficile (por exemplo, toxina A e toxina B). Em particular, proporcionam-se os anticorpos monoclonais humanos. Em certas formas de realização, estes anticorpos monoclonais humanos são produzidos em ratinhos que expressam segmentos de gene da imunoglobulina humana (descritas a seguir). Também se proporcionam combinações de anticorpos antitoxina.
Os anticorpos descritos no presente documento (e porções de ligação a antigénio dos mesmos) que se ligam a uma toxina de C. difficile podem inibir CDAD num indivíduo. Por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina A humanos descritos no presente documento podem neutralizar a toxina A e inibir a recaída da doença mediada por C. difficile. Em outros exemplos, as combinações de anticorpos antitoxina A (por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina A) e anticorpos antitoxina B podem ser para utilização na inibição de doença primária e redução da incidência da doença recaída. Os anticorpos monoclonais humanos podem localizar a locais da doença (por exemplo, o intestino) in vi vo. 1. Geração de Anticorpos
Imunogénios
Em geral, os animais são imunizados com antigénios expressos por C. difficile para produzir anticorpos. Para produzir anticorpos antitoxina, os animais são imunizados com toxinas inativadas, ou toxoides. As toxinas podem ser inativadas, por exemplo, por tratamento com formaldeído, glutaraldeído, peróxido, ou tratamento com oxigénio (veja-se, por exemplo, Relyveld et al., Methods in Enzymology, 93: 24, 1983; Woodrow e Levine, eds., New Generation
Vaccines, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1990). As toxinas mutantes de C. difficile com toxicidade reduzida podem ser produzidas utilizando métodos recombinantes (veja-se, por exemplo, Patentes US 5.085.862; 5.221.618; 5.244.657; 5.332.583; 5.358.868; e 5.433.945). Por exemplo, mutantes que contêm deleções ou mutações pontuais no local ativo da toxina podem ser feitas. Os fragmentos recombinantes das toxinas podem ser utilizados como imunogénios. Outro enfoque é inativar a toxina por tratamento com UDP-dialdeído (Genth et ai., Inf. and Immun, 68(3) : 1094-1101, 2000) . Este método preserva a estrutura nativa da toxina mais prontamente que outros tratamentos, e assim pode provocar anticorpos mais reativos à toxina nativa. Este método é também descrito no Exemplo 1, a seguir.
Os anticorpos antitoxina que se ligam e neutralizam a toxina A podem interagir com epitopos específicos da toxina A. Por exemplo, um anticorpo antitoxina A pode ligar-se a um epítopo numa região N-terminal da toxina A (por exemplo, entre os aminoácidos 1-1033 da toxina A) , ou uma região exterminai (por exemplo, entre os aminoácidos 1853-2710 da toxina A) . Num exemplo, um anticorpo que se liga a e neutraliza a toxina A liga-se a um epítopo, dentro dos aminoácidos 1853-2710 da toxina A.
De maneira similar, os anticorpos antitoxina B podem reconhecer um epítopo especifico da toxina B, por exemplo, um epítopo N-terminal, ou um epítopo C-terminal. Num exemplo, um anticorpo que se liga a e neutraliza a toxina B liga-se a um epítopo dentro de aminoácidos 1777-2366 da toxina B.
Geração de Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos de uma maneira não possível com anticorpos policlonais. Os anti-soros policlonais variam de animal a animal, ao passo que preparações monoclonais exibem uma especificidade antigénica uniforme. Os sistemas de animais murinos são úteis para gerar anticorpos monoclonais, e protocolos de imunização, técnicas para isolar e fusionar esplenocitos, e métodos e reagentes para produzir hibridomas são bem conhecidos. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, que inclui metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica de hibridação de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Veja-se geralmente, Harlow, E. e Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NI, 1988 .
Embora estas técnicas padrão sejam conhecidas, é desejável utilizar anticorpos humanos ou humanizados ao invés de anticorpos murinos para tratar indivíduos humanos, porque os seres humanos montam uma resposta imune a anticorpos de ratinhos e outras espécies. A resposta imune a anticorpos murinos é chamada uma resposta de anticorpo anti-ratinho humano ou resposta FMA (Schroff, R. et ai., Cancer Res., 45, 879-885, 1985) e é uma condição que causa a doença do soro em seres humanos e resulta em rápida depuração dos anticorpos murinos da circulação do indivíduo. A resposta imune em seres humanos mostrou-se ser contra ambas as regiões variáveis e constantes de imunoglobulinas murinas. Os anticorpos monoclonais humanos são mais seguros para administração a seres humanos que os anticorpos derivados de outros animais e anticorpos policlonais humanos.
Um tipo de animal no qual é útil gerar anticorpos monoclonais humanos é um ratinho transgénico que expressa genes da imunoglobulina humana ao invés dos seus próprios genes da imunoglobulina de ratinho. Tais ratinhos transgénicos, por exemplo, ratinhos "HuMAb™", contêm miniloci de gene da imunoglobulina humana que codificam sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) e leve K humana não rearranjadas, juntamente com mutações alvo que inativam os loci de cadeia μ e K endógena (veja-se, por exemplo, Lonberg, N. et al., Nature 368(6474) : 856-859, 1994, e Patente US 5.770.429). Consequentemente, os ratinhos exibem expressão reduzida de IgM ou K de ratinho, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeia leve e pesada humanos introduzidos passam por comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGK humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al., supra; revisto em Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101, 1994; Lonberg, N. e Huszar, D. ,
Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995, e Harding, F. e
Lonberg, N. , Ann. N.Y. Acad. Sei., 764: 536-546, 1995) . A preparação de tais ratinhos transgénicos é descrita em mais detalhe em Tailor, L. et al., Nucleic Acids Research, 20: 6287-6295, 1992; Chen, J. et al.,
International Immunology 5: 647-656, 1993; Tuaillon et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 90: 3720-3724, 1993; Choi et al. , Nature Genetics, 4: 117-123, 1993; Chen, J. et al. , EMBO J., 12: 821-830, 1993; Tuaillon et al. , J. Immunol., 152: 2912-2920, 1994; Tailor, L. et al., International
Immunology, 6: 579-591, 1994; e Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996. Veja-se ainda, Patente US 5.545.806; Patente US 5.569.825, Patente US 5.625.126, Patente US 5.633.425, Patente US 5.661.016, Patente US 5.770.429, Patente US 5.789.650, Patente US 5.814.318, Patente US 5.874.299 e Patente US 5.877.397, todos por Lonberg e Kay, e Publicação PCT N° WO 01/14424, Publicação PCT N° WO 98/24884, Publicação PCT N° WO 94/25585, Publicação PCT N° WO 93/1227, e Publicação PCT N° WO 92/03918.
Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos a um antigénio, os ratinhos HuMAb podem ser imunizados com um imunogénio, como foi descrito por Lonberg, N. et al. Nature, 368(6474): 856-859, 1994;
Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851, 1996 e documento WO 98/24884. Preferentemente, os ratinhos terão 6-16 semanas de idade na primeira imunização. Por exemplo, uma preparação purificada de toxina A inativada pode ser utilizada para imunizar os ratinhos HuMAb intraperitonealmente. Para gerar anticorpos contra proteínas, lípidos, e/ou moléculas de hidrato de carbono de C. difficile, os ratinhos podem ser imunizados com organismos C. difficile mortos ou não viáveis.
Os ratinhos transgénicos HuMAb respondem melhor quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antigénio em adjuvante de Freund completo, seguido por imunizações IP semana sim, semana não (até um total de 6) com antigénio em adjuvante de Freund incompleto. A resposta imune pode ser monitorizada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma que estão a ser obtidas por sangramentos retroorbitais. 0 plasma pode ser rastreado, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo, e ratinhos com titulações suficientes de imunoglobulina antitoxina humana pode ser utilizado para fusões. Os ratinhos podem ser reforçados intravenosamente com antigénio 3 dias antes de sacrifício e retirada do baço. Espera-se que 2-3 fusões para cada antigénio possam ser necessárias de serem realizadas. Diversos ratinhos são tipicamente imunizados para cada antigénio.
Os esplenocitos de ratinhos podem ser isolados e fusionados com PEG a uma linha de célula de mieloma de ratinhos com base em protocolos padrão. Os hibridomas resultantes são então rastreados para a produção de anticorpos específicos a antigénio. Por exemplo, as suspensões de célula única de linfócitos esplénicos de ratinhos imunizados são fusionadas a um sexto do número de células de mieloma de ratinho não secretor P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50% de PEG. As células são colocadas em placa a aproximadamente 2xl05 em placa para microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo que contém 20% de Soro fetal de Clone, 18% de meios condicionados "653", 5% de Origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de L-glutamina, 1 mM piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e lx de HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão) . Após duas semanas, as células são cultivadas em meio no qual o HAT é substituído por HT. Os sobrenadantes de poços individuais são então rastreados por ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais de célula antitoxina humanos. 0 anticorpo, que secreta hibridomas, é colocado em placa de novo, rastreado de novo, e se ainda for positivo para IgG humana, os anticorpos monoclonais antitoxina, podem ser subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitativa. Os subclones estáveis são então cultivados in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Numa forma de realização, o animal transgénico utilizado para gerar anticorpos humanos contra a toxina contém pelo menos uma, tipicamente 2-10, e algumas vezes 25-50 ou mais cópias do transgene descrito no Exemplo 12 do documento WO 98/24884 (por exemplo, pHCl ou pHC2) criados com um animal que contém uma cópia única de um transgene de cadeia leve descrito nos Exemplos 5, 6, 8, ou 14 do documento WO 98/24884, e a criação da progénie com o animal JH deletado descrito no Exemplo 10 do documento WO 98/24884. Os animais são criados à homozigosidade para cada um destes três traços. Tais animais têm o seguinte genótipo: uma cópia única (por conjunto haploide de cromossomas) de um mini-locus não rearranjado de cadeia pesada humana (descrito no Exemplo 12 do documento WO 98/24884), uma cópia única (por conjunto haploide de cromossomas) de uma construção de cadeia leve K rearranjada humana (descrita no Exemplo 14 do documento WO 98/24884), e uma deleção em cada locus de cadeia pesada endógena de ratinho que retira todos os segmentos JH funcionais (descritos no Exemplo 10 do documento WO 98/24884) . Tais animais são criados com ratinhos que são homozigóticos para a deleção dos segmentos JH (Exemplo 10 do documento WO 98/24884) para produzir a progénie que são homozigóticos para a deleção JH e hemizigóticos para as construções de cadeia pesada e leve humana. Os animais resultantes são injetados com antigénios e utilizados para a produção de anticorpos monoclonais humanos contra estes antigénios.
As células B isoladas de tal animal são monoespecificas com relação às cadeias leves e pesadas humanas porque contêm somente uma cópia única de cada gene. Além disso, serão monoespecificas com relação a cadeias pesadas humanas ou de ratinhos porque ambas cópias de gene de cadeia pesada endógena de ratinho são não funcionais por virtude da abrangência da deleção a região JH introduzida como foi descrita nos Exemplos 9 e 12 do documento WO 98/24884. Além disso, uma fração substancial das células B serão monoespecificas com relação às cadeias leves humanas ou de ratinho, porque a expressão da cópia única do gene de cadeia leve rearranjada capa humana excluirá alelicamente e isotipicamente o rearranjo dos genes de cadeia capa e lambda endógena de ratinho numa fração significativa de células B.
Numa forma de realização, o ratinho transgénico exibirá produção de imunoglobulina com um repertório significativo, de maneira ideal substancialmente similar a essa de um ratinho nativo. Assim, por exemplo, nas formas de realização onde os genes Ig endógenos foram inativados, os níveis de imunoglobulina total variarão desde aproximadamente 0,1 até 10 mg/ml de soro, por exemplo, 0,5 a 5 mg/ml, ou pelo menos aproximadamente 1,0 mg/ml. Quando um transgene capaz de efetuar uma comutação a IgG a partir de IgM foi introduzido no ratinho transgénico, a razão de ratinho adulto de soro IgG a IgM é preferentemente aproximadamente 10:1. A razão IgG a IgM será muito menor no ratinho imaturo. Em geral, superior a aproximadamente 10%, por exemplo, aproximadamente 40 a 80% do baço e as células B de nódulos linfáticos expressarão exclusivamente proteína IgG humana. 0 repertório no ratinho transgénico será aproximado de maneira ideal a esse mostrado num ratinho não transgénico, usualmente pelo menos aproximadamente 10% como máximo, preferentemente 25 a 50% ou mais como máximo. Geralmente, pelo menos aproximadamente mil imunoglobulinas diferentes (de maneira ideal IgG), preferentemente 104 a 106 ou mais, serão produzidas, dependendo primariamente do número de regiões V, J, e D diferentes introduzidas no genoma do ratinho. Tipicamente, as imunoglobulinas exibirão uma afinidade para os antigénios pré-selecionados de pelo menos aproximadamente 107 M_1, ΙΟ9 M_1, IO10 M_1, 1011 NT1 1012 M_1, ou mais, por exemplo, até 1013 ΝΓ1 ou mais.
Os ratinhos HuMAb podem produzir células B que passam por comutação de classe via recombinação de comutação intratransgene (comutação cis) e expressam imunoglobulinas reativas com a toxina. As imunoglobulinas podem ser anticorpos de sequência humana, em que os polipéptidos de cadeia pesada e leve são codificados por sequências de transgene humana, que podem incluir sequências derivadas por meio de mutação somática e juntas de recombinação de região V, bem como sequências codificadas por linhas germinais. Estas imunoglobulinas de sequência humana podem ser denominadas como sendo substancialmente idênticas a uma sequência de polipéptido codificada por um segmento de gene VL ou VH humano e um segmento JL ou JL humano, mesmo embora outras sequências não de linhas germinais podem estar presentes como um resultado de mutação somática e juntas de recombinação V-J e V-D-J diferencial. Com relação a tais anticorpos de sequência humana, as regiões variáveis de cada cadeia são tipicamente pelo menos 80 porcento codificadas pela linha germinal humana V, J, e, no caso de cadeias pesadas, D, segmentos de gene. Com frequência pelo menos 85% das regiões variáveis são codificadas pelas sequências de linhas germinais humanas presentes no transgene. Com frequência 90 ou 95% ou mais das sequências de região variável são codificadas por sequências de linhas germinais humanas presentes no transgene. No entanto, uma vez que as sequências não de linhas germinais são introduzidas por meio de mutação somática e junção VJ e VDJ, os anticorpos de sequência humana terão com frequência algumas sequências de região variável (e com menos frequência sequências de região contante) que não são codificadas pelos segmentos de gene humano V, D, ou J como encontrado no(s) transgene(s) humano(s) na linha germinal dos ratinhos. Tipicamente, tais sequências não de linhas germinais (ou posições de nucleótido individuais) agruparão em ou próximas às CDRs, ou em regiões onde mutações somáticas são conhecidas para agrupar.
Os anticorpos de sequência humana que se ligam à toxina podem resultar da comutação de isotipo, tal que os anticorpos humanos que compreendem uma cadeia gama de sequência humana (tal como gama 1, gama 2, ou gama 3) e uma cadeia leve de sequência humana (tal como K) são produzidas. Tais anticorpos de sequência humana de isotipo comutado com frequência contêm uma ou mais mutações somáticas, tipicamente na região variável e com frequência em ou dentro de aproximadamente 10 resíduos de uma CDR) como um resultado de maturação de afinidade e seleção de células B por antigénio, particularmente subsequente à inoculação de antigénio secundário (ou subsequente). Estes anticorpos de sequência humana de alta afinidade têm afinidades de ligação de pelo menos aproximadamente lxlO9 M-1, tipicamente pelo menos 5xl09 M_1, com frequência maior que lxlO10 M_1, e algumas vezes 5xl010 NT1 a lxlO11 ΝΓ1 ou mais.
Os anticorpos antitoxina podem também ser originados em outros mamíferos, que incluem ratinhos não transgénicos, seres humanos, coelhos, e cabras.
Anticorpos antitoxina A
Os anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente à toxina A incluem anticorpos produzidos pelos clones 3D8, 1B11, e 3H2 descritos no presente documento. Os anticorpos com regiões de cadeia leve variável e de cadeia pesada variável que são pelo menos 80%, ou mais, idênticas às regiões de cadeia leve e pesada variáveis 3D8, 1B11, e 3H2 podem também ligar-se a toxina A. Os anticorpos antitoxina A incluem, por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de 3D8, 1B11, ou 3H2. As CDRs das regiões variáveis da cadeia pesada destes clones são apresentadas no Quadro 1, a seguir Quadro 1. Sequências de Aminoácidos de CDR de Cadeia Pesada
Variável
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas, no Quadro 2, a seguir.
Quadro 2. Sequências de aminoácidos de CDR de Cadeia Leve
Variável
As CDRs são as porções de imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antigénio particular. As CDRs correspondentes às CDRs nos quadros 1 e 2 com variações de sequência (por exemplo, substituições conservadoras) podem ligar-se à toxina A. Por exemplo, CDRs, em que 1, 2 3, 4 ou 5 resíduos, ou menos do que 20% do total de resíduos da CDR, são substituídos ou removidos podem estar presentes num anticorpo (ou porção de ligação a antigénio do mesmo) que se liga à toxina A.
Do mesmo modo, os anticorpos antitoxina podem ter CDRs contendo uma sequência de consenso, uma vez que os motivos de sequência conservados entre vários anticorpos podem ser importantes para a atividade de ligação. Por exemplo, a CDR1 da região de cadeia leve variável dos anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, pode incluir a sequência de aminoácidos R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A (SEQ ID NO: 25) , a CDR2 da região variável de cadeia leve dos anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, pode incluir a sequência de aminoácidos A-S-X-X-X-S/T (SEQ ID NO: 26), e/ou a CDR3 da região variável de cadeia leve dos anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, pode incluir a sequência de aminoácidos Q-Q-X-X-S/N-X-P/S (SEQ ID NO: 27) em que X é qualquer aminoácido. A CDR1 de uma região da cadeia pesada variável de anticorpos antitoxina A, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, pode incluir a sequência de aminoácidos Y-G-M-H (SEQ ID NO: 28), e/ou a CDR2 de uma região de cadeia pesada variável dos anticorpos, ou porções de ligação a antigénio dos mesmos, inclui a sequência de aminoácidos I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G (SEQ ID NO: 29), em que X é qualquer aminoácido.
Os anticorpos antitoxina humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto de, ou derivados de, genes da imunoglobulina humana específicos. Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto de, ou derivada de um gene VH3-33 humano. Numerosas sequências para anticorpos derivados deste gene estão disponíveis no GenBank® (veja-se, por exemplo, N° de acesso: AJ555951, N° GI: 29836865; N° de acesso: AJ556080, N° GI: 29837087; N° de acesso: AJ556038, N° GI: 29837012, e outros segmentos de gene VH3-33 humano rearranjados proporcionados no GenBank®). Os anticorpos podem também, ou alternativamente, incluir uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene VK L19 humano (veja-se, por exemplo, N° de acesso do GenBank® AJ556049, N° GI: 29837033 para uma sequência parcial de um segmento de gene rearranjado VK LI9 humano) . Como é conhecido no estado da técnica, e descrito nesta secção, acima, regiões de imunoglobulina variáveis de anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo em que a variabilidade é introduzida a segmentos genómicos que codificam as regiões. Consequentemente, as regiões variáveis derivadas de um gene VH-33 ou VK L19 humano podem incluir nucleótidos que são diferentes daqueles no gene encontrado em tecidos não linfoides. Estas diferenças de nucleótido são tipicamente concentradas nas CDRs.
Anticorpos antitoxina B
Os anticorpos monoclonais humanos que se ligam especificamente à toxina B incluem anticorpos produzidos pelos clones 124-152, 2A11, e 1G10 descritos no presente documento. Os anticorpos com regiões de cadeia leve variável e de cadeia pesada variável que são pelo menos 80%, ou mais, idênticas às regiões de cadeia leve e pesada variáveis de -152, 2A11, e 1G10 podem também ligar-se a toxina B. Em formas de realização relacionadas, os anticorpos antitoxina B incluem, por exemplo, as regiões de determinação de complementaridade (CDR) de cadeias pesadas variáveis e/ou cadeias leves variáveis de -152, 2A11, ou 1G10. As CDRs das regiões de cadeia pesada variáveis destes clones são mostradas no Quadro 3, a seguir.
As CDRs das regiões de cadeia leve variável destes clones são mostradas no Quadro 4, a seguir.
As CDRs são as porções de imunoglobulinas que determinam a especificidade para um antigénio particular. Em certas formas de realização, as CDRs correspondentes às CDRs nos Quadros 3 e 4 que têm variações de sequência (por exemplo, substituições conservativas) podem ligar-se a toxina B. Por exemplo, as CDRs, em que 1, 2, 3, 4, ou 5 resíduos, ou menos de 20% de resíduos totais na CDR, são substituídas ou deletadas podem estar presentes num anticorpo (ou porção de ligação a antigénio do mesmo) que se liga à toxina B.
Os anticorpos antitoxina B humanos podem incluir regiões variáveis que são o produto de, ou derivadas de, genes da imunoglobulina humana específicos (veja-se Figs. 28-31). Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma região de cadeia pesada variável que é o produto de, ou derivada de um gene VH 5-51 humano. Os anticorpos podem também, ou alternativamente, incluir uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivada de um gene VK A27 humano e/ou gene JK1. Como é conhecido no estado da técnica, e descrito nesta secção, acima, regiões de imunoglobulina variáveis de anticorpos recombinados são derivadas por um processo de recombinação in vivo em que a variabilidade é introduzida a segmentos genómicos que codifica as regiões. Consequentemente, as regiões variáveis derivadas de um VH-5-51 humano ou gene VK A27/JK1 podem incluir nucleótidos que são diferentes daqueles no gene encontrado em tecidos não linfoides. Estas diferenças de nucleótido são tipicamente concentradas nas CDRs. 2. Produção e Modificação de Anticorpos
Muitas formas diferentes de anticorpos antitoxina podem ser úteis na inibição de CDAD. Os anticorpos podem ser dos vários isotipos, que incluem: IgG (por exemplo,
IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgAl, IgA2, IgD, ou IgE. Preferentemente, o anticorpo é um isotipo IgG, por exemplo, IgGl. As moléculas de anticorpo podem ser de comprimento completo (por exemplo, um anticorpo IgGl ou IgG4) ou podem incluir somente um fragmento de ligação a antigénio (por exemplo, um Fab, F(ab')2, Fv ou um Fv de fragmento de cadeia única). Estes incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos), os anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados, bem como porções de ligação a antigénio dos anteriores.
Os anticorpos antitoxina ou porções dos mesmos úteis na presente invenção podem também ser anticorpos recombinantes produzidos por células hospedeiras transformadas com ADN que codifica as cadeias pesadas e leves da imunoglobulina de um anticorpo desejado. Os anticorpos recombinantes podem ser produzidos por meio de técnicas de engenharia genética conhecidas. Por exemplo, os anticorpos recombinantes podem ser produzidos por meio de clonagem de uma sequência de nucleótidos, por exemplo, um ADNc ou ADN genómico, que codifica as cadeias pesadas e leves da imunoglobulina do anticorpo desejado. A sequência de nucleótidos que codifica aqueles polipéptidos é então inserida num vetor de expressão de modo que ambos genes são operativamente ligados às suas próprias sequências de controlo de expressão transcripcional e traducional. 0 vetor de expressão e sequências de controlo de expressão são escolhidas para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. Tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas podem ser utilizadas. A expressão em células hospedeiras eucarióticas é preferida porque tais células são mais prováveis de montar e secretar um anticorpo imunologicamente ativo apropriadamente dobrado que células procarióticas. No entanto, qualquer anticorpo produzido que é inativo devido a dobragem imprópria pode ser renaturada de acordo com métodos bem conhecidos (Kim e Baldwin, Ann. Rev. Biochem., 51: 459-89, 1982) . É possível que as células hospedeiras produzissem porções de anticorpos intactos, tais como dímeros de cadeia leve ou dímeros de cadeia pesada, que também são homólogos de anticorpo de acordo com a presente invenção.
Os anticorpos descritos no presente documento também podem ser produzidos num transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de ADN recombinante e métodos de transfecção de genes como são bem conhecidos no estado da técnica (Morrison, S., Science, 229: 1202, 1985) . Por exemplo, numa forma de realização, o(s) gene (s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpo humano, podem ser ligados num vetor de expressão tal como um plasmideo de expressão eucariótico tal como é utilizado num sistema de expressão GS revelado no documento WO 87/04462, documento WO 89/01036 e documento EP 338 841, ou em outros sistemas de expressão bem conhecidos no estado da técnica. O plasmideo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas tais como células CHO ou células NSO ou alternativamente outras células eucarióticas como células derivadas de plantas, fungos ou células de levedura. O método utilizado para introduzir estes genes pode ser qualquer método descrito no estado da técnica, tal como electroporação, lipofectina, lipofectamina ou transfecção balística, em que células são bombardeadas com microparticulas que portam o ADN de interesse (Rodin, et al. Immunol. Lett., 74(3): 197-200, 2000). Após a introdução destes genes de anticorpo nas células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados para o seu nível de expressão e aumentados em escala para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e/ou células utilizando técnicas padrão.
Será entendido que variações nos procedimentos anteriores são úteis na presente invenção. Por exemplo, pode ser desejado transformar uma célula hospedeira com ADN que codifica a cadeia leve ou a cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo. A tecnologia de ADN recombinante pode também ser utilizada para retirar algum ou todo o ADN que codifica qualquer ou ambas as cadeias leves e pesadas que não são necessárias para ligar, por exemplo, a região constante pode ser modificada por meio de, por exemplo, deleção de aminoácidos específicos. As moléculas expressas a partir de tais moléculas de ADN truncadas são úteis nos métodos descritos no presente documento. Além disso, os anticorpos bifuncionais podem ser produzidos em que uma cadeia pesada e uma cadeia leve ligam-se a uma toxina, e a outra cadeia pesada e cadeia leve são específicas para um antigénio diferente da toxina, ou outro epítopo da toxina.
Os anticorpos quiméricos podem ser produzidos por meio de técnicas de ADN recombinante conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, um gene que codifica a região constante Fc de uma molécula de anticorpo monoclonal murino (ou outras espécies) é digerida com enzimas de restrição para retirar a região que codifica a Fc murina, e a porção equivalente de um gene que codifica uma região constante Fc humana é substituída (veja-se Robinson et al., Publicação de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., Pedido de Patente Europeia 184.187; Taniguchi, M., Pedido de Patente Europeia 171.496; Morrison et al., Pedido de Patente Europeia 173.494; Neuberger et al., Pedido de Patente Internacional WO 86/01533; Cabilly et al. Patente US 4.816.567; Cabilly et al., Pedido de Patente Europeia 125.023; Better et al. (1988 Science, 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS, 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol., 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al, 1987, Cane. Res., 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature, 314: 446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst., 80: 1553-1559). Os anticorpos quiméricos podem também ser criados por meio de técnicas de ADN recombinante onde o ADN que codifica regiões V murinas podem ser ligadas ao ADN que codifica as regiões constantes humanas.
Um anticorpo ou uma cadeia de imunoglobulina pode ser humanizado por métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma vez que os anticorpos murinos sejam obtidos, as regiões variáveis podem ser sequenciadas. A localização das CDRs e resíduos framework pode ser determinada (veja-se, Rabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH N° 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917). As regiões variáveis de cadeia pesada e leve podem, opcionalmente, ser ligadas às correspondentes regiões constantes. De facto, entende-se que qualquer dos anticorpos descritos no presente documento, que incluem anticorpos completamente humanos, podem ser alterados (por exemplo, por mutação, substituição) para conter uma região constante substituta, por exemplo, região Fc, ou porção (s) da mesma para alcançar, por exemplo, uma estrutura de anticorpo, função (por exemplo, função efetora), subtipo, alotipo, subclasse desejadas, ou similares. Os anticorpos antitoxina podem ser sequenciados utilizando técnicas reconhecidas na especialidade. As moléculas enxertadas com CDR de anticorpo ou imunoglobulinas podem ser produzidas por enxerto de CDR ou substituição de CDR, em que uma, dois, ou todas as CDRs de uma cadeia de imunoglobulina podem ser substituídas. Veja-se, por exemplo, a Patente US 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature, 321: 552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science, 239: 1534; Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 4053-4060; e Winter, Patente US 5.225.539.
Winter descreve um método de enxerto de CDR que pode ser utilizado para preparar os anticorpos da presente invenção (Pedido de Patente UK GB 2188638A, depositado em 26 de Março de 1987; Patente US 5.225.539 de Winter) . Por exemplo, todas as CDRs de um anticorpo particular podem ser substituídas por pelo menos uma porção de uma CDR humana (por exemplo, uma CDR do clone 3D8, como é mostrado nos Quadros 1 e 2, e/ou clone 124-152, como é mostrado nos
Quadros 3 e 4, acima) ou somente algumas das CDRs podem ser substituídas. É somente necessário substituir o número de CDRs requerido para a ligação do anticorpo a um antigénio predeterminado (por exemplo, uma exotoxina de C. difficile) .
Os anticorpos humanizados podem ser gerados por meio da substituição de sequências da região variável Fv que não estão diretamente envolvidas na ligação a antigénio com sequências equivalentes de regiões variáveis Fv humanas. Os métodos gerais para gerar anticorpos humanizados são proporcionados por Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202-1207, por Oi et ai., 1986, BioTechniques, 4: 214, e por Queen et ai. Patente US 5.585.089, Patente US 5.693.761 e Patente US 5.693.762. Aqueles métodos incluem o isolamento, manejo, e expressão de sequências de ácido nucleico que codificam toda ou parte dos átomos das regiões variáveis Fv da imunoglobulina em pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. As fontes de tal ácido nucleico são bem conhecidas a aqueles peritos na especialidade e, por exemplo, podem ser obtidos de um hibridoma que produz um anticorpo contra um alvo predeterminado, como foi descrito anteriormente. O ADN recombinante que codifica o anticorpo humanizado, ou fragmento do mesmo, pode então ser clonado num vetor de expressão apropriado. Outras técnicas para humanizar anticorpos são descritas em Padlan et ai. documento EP 519596 Al, publicado em 23 de Dezembro de 1992 .
Também dentro do âmbito da invenção são anticorpos nos quais os aminoácidos específicos foram substituídos, deletados, ou adicionados. Em particular, os anticorpos preferidos têm substituições de aminoácidos na região framework, tal como para melhorar a ligação ao antigénio. Por exemplo, um número pequeno selecionado de resíduos framework de aceitador da cadeia de imunoglobulina pode ser substituído pelos aminoácidos dadores correspondentes. As localizações preferidas das substituições incluem resíduos de aminoácidos adjacentes à CDR, ou que são capazes de interagir com uma CDR (veja-se, por exemplo, Patente US 5.585.089) . Os critérios para selecionar aminoácidos a partir de dador são descritos na Patente US 5.585.089 (por exemplo, colunas 12-16) . O framework aceitador pode ser uma sequência framework de anticorpo maduro humano ou uma sequência consenso.
Uma "sequência consenso" é uma sequência formada a partir de aminoácidos de ocorrência mais frequente (ou nucleótidos) numa família de sequências relacionadas (Veja-se, por exemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1987) . Numa família de proteínas, cada posição na sequência consenso é ocupada pelo aminoácido de ocorrência mais frequente nessa posição na família. Se dois aminoácidos ocorrem igualmente com frequência, podem ser incluídos na sequência consenso. Um "framework consenso" de uma imunoglobulina refere-se a uma região framework na sequência consenso da imunoglobulina.
Um anticorpo antitoxina, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional (por exemplo, outro péptido ou proteína) . Por exemplo, um anticorpo pode ser funcionalmente ligado (por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tais como outro anticorpo, um agente detetável, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ou uma proteína ou péptido que pode mediar a associação com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavidina ou uma cauda de polihistidina).
Um tipo de proteína derivatizada é produzido por ligação cruzada de duas ou mais proteínas (do mesmo tipo ou de tipos diferentes). Os agentes de ligação cruzada adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, que tem dois grupos reativos distintos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo, disuccinimidil suberato). Tais ligantes estão disponíveis de Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Os agentes detetáveis úteis com os quais uma proteína pode ser derivatizada (ou marcada) incluem compostos fluorescentes, várias enzimas, grupos protéticos, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, e materiais radioativos. Os agentes detetáveis fluorescentes exemplares incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, e, ficoeritrina. Uma proteína ou anticorpo pode também ser derivatizada com enzima detetável, tal como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano picante, p-galactosidase, acetilcolinesterase, glucose oxidase e similares. Quando uma proteína é derivatizada com uma enzima detetável, é detetada pela adição dos reagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de reação detetável. Por exemplo, quando o agente detetável peroxidase de rábano picante está presente, a adição de peróxido de hidrogénio e diaminobenzidina leva a um produto de reação corado, que é detetável. Uma proteína pode também ser derivatizada com um grupo protético (por exemplo, estreptavidina/biotina e avidina/biotina). Por exemplo, um anticorpo pode ser derivatizado com biotina, e detetado através de medição indireta de ligação a avidina ou estreptavidina.
As proteínas marcadas e anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, diagnosticamente e/ou experimentalmente num número de contextos, que inclui (i) isolar um antigénio predeterminado por meio de técnicas padrão, tais como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação; e (ii) detetar um antigénio predeterminado (por exemplo, uma toxina, por exemplo, num lisado celular ou uma amostra de paciente) a fim de monitorizar niveis de proteína em tecido como parte de um procedimento de ensaios clínicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Um anticorpo antitoxina ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo pode ser conjugado a outra entidade molecular, tal como um marcador. 3. Métodos de Rastreio
Os anticorpos antitoxina podem ser caracterizados para ligar-se à toxina por uma variedade de técnicas conhecidas. Os anticorpos são tipicamente caracterizados por ELISA primeiro. De maneira breve, as placas de microtitulação podem ser revestidas com o antigénio da toxina ou toxoide em PBS, e então blogueadas com proteínas irrelevantes tais como albumina de soro bovino (BSA) diluída em PBS. As diluições de plasma de ratinhos imunizados com toxina são adicionadas a cada poço e incubadas durante 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/ Tween 20 e então incubadas com um reagente policlonal específico para Fc de IgG anti-humana de cabra conjugado a fosfatase alcalina durante 1 hora a 37 °C. Após a lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato ABTS, e analisadas em OD de 405. Preferentemente, os ratinhos que desenvolvem as titulações mais altas serão utilizados para as fusões.
Um ensaio ELISA como foi descrito anteriormente pode ser utilizado para rastrear para anticorpos e, assim, hibridomas que produzem anticorpos que mostram reatividade positiva com a toxina. Os hibridomas que produzem anticorpos que se ligam, preferentemente com alta afinidade, à toxina podem ser subclonados então e caracterizados adicionalmente. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células originais (por ELISA), pode então ser escolhido para o fabrico de um banco de células, e para purificação de anticorpo.
Para purificar os anticorpos antitoxina de hibridomas selecionado podem ser crescidos em garrafas rolantes, balões centrifugadores de dois litros ou outros sistemas de cultura. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes de cromatografia por afinidade com Sepharose-proteína A (Pharmacia, Piscataway, N.J.) para purificar a proteína. Após permuta de tampão para PBS, a concentração pode ser determinada por métodos espectrofotométricos.
Para determinar se os anticorpos monoclonais selecionados ligam-se a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilados utilizando reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, III). A ligação de MAb biotinilados pode ser detetada com uma sonda marcada com estreptavidina. Os anticorpos antitoxina podem ser testados ainda para a reatividade com a toxina por meio de Western blotting.
Outros ensaios para medir a atividade dos anticorpos antitoxina incluem ensaios de neutralização. Os ensaios de neutralização in vitro podem medir a capacidade de um anticorpo de inibir um efeito citopático sobre células em cultura (veja-se Exemplo 3, a seguir). Os ensaios in vivo para medir a neutralização de toxina são descritos nos Exemplos 5, 6, e 7, a seguir. 4. Composições Farmacêuticas e Kits
Em outro aspeto, a presente invenção proporciona composições, por exemplo, composições farmaceuticamente aceitáveis, que incluem uma molécula de anticorpo descrita no presente documento ou porção de ligação a antigénio do mesmo da presente invenção que se liga especificamente a e neutraliza a toxina A de C. difficile, formulada juntamente com um portador farmaceuticamente aceitável. "Portadores farmaceuticamente aceitáveis" incluem quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, agentes de atraso de absorção e isotónicos, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Os portadores podem ser adequados para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, rectal, espinhal, ou epidérmica (por exemplo, por meio de injeção ou infusão).
As composições desta invenção podem ser numa variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, lipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. As composições úteis são na forma de soluções injetáveis e infusíveis. Um modo útil de administração é a parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Por exemplo, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo pode ser para administração por infusão ou injeção intravenosa. Em outra forma de realização, o anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo é para administração por injeção intramuscular ou subcutânea.
As frases "administração parentérica" e "administrados parentericamente" como é utilizado no presente documento significam modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por meio de injeção, e incluem, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra-espinhal, epidural, e intra-esternal.
As composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrico e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para concentração de anticorpo alta. As soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas por meio da incorporação do composto ativo (isto é, anticorpo ou porção de anticorpo) na quantidade requerida num solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, como for requerido, seguido por esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas por meio da incorporação do composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis, os métodos de preparação úteis são secagem por vácuo e liofilização que rende um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser ocasionada pela inclusão na composição de um agente que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
Os anticorpos e porções de anticorpo descritos no presente documento podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos no estado da técnica, e para utilização em muitas aplicações terapêuticas. Como será apreciado pelo perito na especialidade, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.
Em certas formas de realização, um anticorpo, ou porção de anticorpo do mesmo pode ser para administração oral, por exemplo, com um diluente inerte ou um portador comestível assimilável. 0 composto (e outros ingredientes, se for desejado) pode também ser incluído numa cápsula de gelatina de cobertura dura ou mole, comprimido em comprimidos, ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração oral terapêutica, os compostos podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de comprimidos ingeriveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, hóstias, e similares. Para administrar um composto da invenção por via outra que não a administração parentérica, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material para prevenir sua inativação. As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos no estado da técnica.
Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, um bolus único pode ser administrado, diversas doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como for indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma de dosagem unitária para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária como é utilizada no presente documento refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portador farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e dependentes diretamente de (a) as caracteristicas únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes no estado da técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Um intervalo exemplar, não limitativo para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é 0,1-60 mg/kg, por exemplo, 0,5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg, ou 0,75-10 mg/kg. Entende-se ainda que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o critério profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que os intervalos de dosagem indicados no presente documento são exemplares somente e não pretende-se que limitem o âmbito ou prática da composição reivindicada.
Também dentro do âmbito da invenção estão kits que incluem um anticorpo antitoxina B da invenção ou porção de ligação a antigénio do mesmo. Os kits podem incluir um ou mais outros elementos que incluem: instruções para utilização; outros reagentes, por exemplo, um marcador, um agente terapêutico, ou um agente útil para quelar, ou de outro modo acoplar, um anticorpo a um marcador ou agente terapêutico, ou outros materiais para preparar o anticorpo para administração; portadores farmaceuticamente aceitáveis; e dispositivos ou outros materiais para administração a um indivíduo. Várias combinações de anticorpos podem ser embaladas juntas. Por exemplo, um kit pode incluir anticorpos que se ligam à toxina A (por exemplo, anticorpos que incluem as regiões de cadeia leve e pesada variáveis de 3D8) e anticorpos da invenção que se ligam à toxina B por exemplo, 124-152, e opcionalmente outros anticorpos que se ligam à toxina B (por exemplo, anticorpos monoclonais antitoxina B humanos, por exemplo, 2A11, e/ou 1G10, ou anti-soros policlonais reativos com toxina B). Os anticorpos podem ser misturados juntos, ou embalados separadamente dentro do kit.
As instruções para utilização podem incluir instruções para a aplicação terapêutica que inclui dosagens sugeridas e/ou modos de administração, por exemplo, num paciente com um sintoma de CDAD. Outras instruções podem incluir instruções sobre o acoplamento do anticorpo a um quelante, um marcador ou um agente terapêutico, ou para a purificação de um anticorpo conjugado, por exemplo, a partir de componentes de conjugação não reagidos. 0 kit pode incluir um marcador detetável, um agente terapêutico, e/ou um reagente útil para quelar ou de outro modo acoplar um marcador ou agente terapêutico ao anticorpo. Os agentes de acoplamento incluem agentes tais como N-hidroxisuccinimida (NHS). Em tais casos, o kit pode incluir um ou mais de um recipiente de reação para levar a cabo a reação ou um dispositivo de separação, por exemplo, uma coluna cromatográfica, para utilização na separação do produto acabado a partir de materiais de partida ou intermediários de reação. 0 kit pode conter ainda pelo menos um reagente adicional, tal como um agente de diagnóstico ou terapêutico, por exemplo, um agente de diagnóstico ou terapêutico como é descrito no presente documento, e/ou um ou mais anticorpos anti-C. difficile (ou porções do mesmo) ou antitoxina adicionais, formulados conforme for apropriado, numa ou mais preparações farmacêuticas separadas,
Outros kits podem incluir ácidos nucleicos otimizados que codificam anticorpos antitoxina, e instruções para a expressão dos ácidos nucleicos. 5. Composições e Métodos Terapêuticos
As novas proteínas e anticorpos têm utilidades terapêuticas, profilática, e de diagnóstico in vitro e in vivo. Por exemplo, estes anticorpos podem ser administrados às células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo. A invenção também proporciona anticorpos para utilização in vivo, para tratar, inibir, prevenir a recaída, e/ou diagnosticar C. difficile e doença associada a C. difficile num indivíduo.
Como é utilizado no presente documento, o termo "indivíduo" pretende-se que inclua animais humanos e não humanos. 0 termo "animais não humanos" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, galinhas, ratinhos, cães, gatos, porcos, vacas, e cavalos.
As proteínas e anticorpos podem ser utilizados em células em cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo. Por exemplo, as células podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura e a etapa de colocar em contacto pode ser efetuada pela adição do anticorpo antitoxina ou fragmento do mesmo, ao meio de cultura. Os métodos podem ser realizados em viriões ou células presentes num indivíduo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ou profilático). Onde os anticorpos são para utilização in vivo, a etapa de colocar em contacto é efetuada num indivíduo e inclui administrar um anticorpo antitoxina ou porção do mesmo ao indivíduo sob condições eficazes para permitir a ligação do anticorpo, ou porção, a gualguer toxina expressa pelas bactérias no indivíduo, por exemplo, no intestino.
Os métodos de administração de moléculas de anticorpo são descritos no presente documento. As dosagens adeguadas das moléculas utilizadas dependerão da idade e peso do indivíduo e o fármaco particular utilizado. As moléculas de anticorpo podem ser utilizadas como agentes competitivos para ligar ligando para inibir ou reduzir uma interação indesejável, por exemplo, para inibir a ligação de toxinas a o epitélio gastrointestinal.
Os anticorpos antitoxina (ou porções de ligação a antigénio dos mesmos) podem ser administrados em combinação com outros anticorpos anti-C. difficile (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, gama-globulina policlonal). Combinações de anticorpos gue podem ser utilizados incluem um anticorpo antitoxina A, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, e um anticorpo antitoxina B, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, da invenção. 0 anticorpo antitoxina A pode ser 3D8, um anticorpo que inclui as regiões variáveis de 3D8, ou um anticorpo com regiões variáveis pelo menos 90% idênticas às regiões variáveis de 3D8. O anticorpo antitoxina B pode ser 124-152. As combinações de antitoxina A (por exemplo, 3D8) e anticorpos antitoxina B (por exemplo, 124-152) podem proporcionar uma inibição potente de CDAD.
Entende-se que quaisquer dos agentes descritos no presente documento, por exemplo, anticorpos antitoxina A ou antitoxina B, ou fragmentos dos mesmos, podem ser combinados, por exemplo, em razões ou quantidades diferentes, para efeito terapêutico melhorado. De facto, os agentes podem ser formulados como uma mistura, ou ligados quimicamente ou geneticamente utilizando técnicas reconhecidas na especialidade pela presente resultando assim em anticorpos ligados covalentemente (ou fragmentos de anticorpo ligados covalentemente), que tem ambas as propriedades de ligação antitoxina A e antitoxina B. A formulação combinada pode ser guiada por uma determinação de um ou mais parâmetros tais como a afinidade, avidez, ou eficácia biológica do agente em separado ou em combinação com outro agente. Os agentes descritos no presente documento podem também ser administrados em combinação com outros agentes que aumentam o acesso, semivida, ou estabilidade do agente terapêutico em alvejar, eliminar, e/ou sequestrar C. difficile ou um antigénio do mesmo.
Tais terapêuticas de combinação são preferentemente aditivas e incluso sinergisticas em sua atividade terapêutica, por exemplo, na inibição, prevenção (por exemplo, de recaída), e/ou tratamento de doenças ou distúrbios relacionados com C. difficile (veja-se, por exemplo, o Exemplo 16 que mostra a eficácia de terapêuticas de anticorpo único e combinado). A administração de tais terapêuticas de combinação podem diminuir a dosagem do agente terapêutico (por exemplo, anticorpo ou mistura de fragmento de anticorpo, ou anticorpo ou fragmento de anticorpo biespecifico de ligação cruzada ou geneticamente fusionado) necessário para alcançar o efeito desejado.
Composições imunogénicas que contêm uma quantidade imunogenicamente eficaz de uma toxina, ou fragmentos da mesma, são descritas no presente documento, e podem ser utilizadas na geração de anticorpos antitoxina. Epítopos imunogénicos numa sequência de toxina podem ser identificados de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica, e proteínas, ou fragmentos que contêm aqueles epítopos podem ser distribuídos por vários meios, numa composição de vacina. Composições adequadas podem incluir, por exemplo, lipopéptidos (por exemplo, Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95: 341 (1995)), composições de péptido encapsuladas em poli(DL-lactida-co-glicolida) ("PLG") microesferas (veja-se, por exemplo, Eldridge et al., Molec. Immunol. 28: 287-94 (1991); Alonso et al., Vaccine 12: 299-306 (1994); Jones et al., Vaccine 13: 675-81 (1995)), composições de péptido contidas em complexos imunoestimuladores (ISCOMS) (veja-se, por exemplo, Takahashi et al., Nature 344: 873-75 (1990); Hu et al., Clin. Exp. Immunol. 113: 235-43 (1998)), e sistemas de péptido de antigénio múltiplos (MAPs) (veja-se, por exemplo, Tam, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Um. 85: 5409-13 (1988); Tam, J. Immunol. Methods 196: 17-32 (1996)).
Portadores úteis que podem ser utilizados com composições imunogénicas da invenção são bem conhecidos, e incluem, por exemplo, tiroglobulina, albuminas tais como humano albumina de soro, toxoide do tétano, poliaminoácidos tais como poli L- lisina, ácido poli L-glutâmico, influenza, proteína de núcleo do vírus da hepatite B, e similares. As composições podem conter um diluente fisiologicamente tolerável (isto é, aceitável) tal como água, ou solução salina, tipicamente solução salina tamponada com fosfato. As composições e vacinas também tipicamente incluem um adjuvante. Os adjuvantes tais como adjuvante de Freund incompleto, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio, ou alúmen são exemplos de materiais bem conhecidos no estado da técnica. Adicionalmente, respostas CTL podem ser iniciadas por meio da conjugação de toxinas (ou fragmentos, derivados inativos ou análogos das mesmas) a lípidos, tais como tripalmitoil- S-glicerilcisteinil-seril- serina (P3CSS).
Os anticorpos antitoxina podem ser administrados em combinação com outros agentes, tais como composições para tratar CDAD. Por exemplo, as terapêuticas que podem ser administradas em combinação com anticorpos antitoxina incluem antibióticos utilizados para tratar CDAD, tais como vancomicina, metronidazol, ou bacitracina. Os anticorpos podem ser para utilização em combinação com agentes probióticos tais como Saccharomyces boulardii. Os anticorpos podem também ser administrados em combinações com uma vacina de C. difficile, por exemplo, uma vacina de toxoide. 6. Outros Métodos
Um anticorpo antitoxina (por exemplo, anticorpo monoclonal) pode ser utilizado para isolar toxinas por meio de técnicas padrão, tais como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação. Além disso, um anticorpo antitoxina pode ser utilizado para detetar a toxina (por exemplo, numa amostra de fezes), por exemplo, para rastrear amostras para a presença de C. difficile. Os anticorpos antitoxina podem ser utilizados diagnosticamente para monitorizar os níveis da toxina em tecido como parte de um procedimento de ensaios clínicos, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento.
Exemplificação
Ao longo dos exemplos, os seguintes materiais e métodos foram utilizados a não ser que de outro modo indicado.
Materiais e Métodos
Em geral, a prática da presente invenção utiliza, a não ser que de outro modo indicado, técnicas convencionais de química, biologia molecular, tecnologia de ADN recombinante, imunologia (especialmente, por exemplo, tecnologia de anticorpo), e técnicas padrão em preparação de polipéptidos. Veja-se, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical
Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al. , C.S.H.L.
Press, Pub. (1999); e Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992). EXEMPLOS A invenção é descrita ainda nos seguintes exemplos, que não limitam o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
Exemplo 1. Geração de Anticorpos Monoclonais Antitoxina Ά A toxina A de C. difficile foi obtida de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) , ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com UDP- dialdeído reativo, que resulta em alquilação de resíduos catalíticos ao mesmo tempo em que preserva a estrutura da toxina nativa. Para o protocolo detalhado, veja-se Genth et al., Inf e Immun. 68(3) : 1094-1101, 2000. De maneira breve, a toxina A purificada foi incubada com UDP-2', 3'-dialdeído (0,1-10 mM) em tampão durante 18 horas a 37°C, filtrada através de um filtro de corte de 100 kDa para retirar UDP-2', 3'-dialdeído não reagido, e lavada com tampão. A toxina A inativada (toxoide A) foi utilizada para a imunização.
Os ratinhos transgénicos HCo7, gerados como foi descrito anteriormente na secção intitulada "Geração de
Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb" e fornecidos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes cada um com 10 μρ de toxoide em adjuvante RIBI. Nos ratinhos transgénicos HCo7, o gene capa de cadeia leve endógena foi quebrado homozigoticamente como foi descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820 e o gene de cadeia pesada endógena de ratinho foi quebrado homozigoticamente como foi descrito no Exemplo 1 de Publicação PCT WO 01/09187. Os ratinhos transgénicos HCo7 portam um transgene capa de cadeia leve humano, KCo5, como foi descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e o transgene de cadeia pesada humano HCo7 como foi descrito nas Patentes US N° 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. O soro foi colhido de cada ratinho e testado para a reatividade à toxina A por ELISA e neutralização de citotoxicidade em células IMR-90.. Os ratinhos que deram positivo no teste para toxina A-reativo e neutralização de anti-soro foram injetados com 5-10 μρ de toxoide A através da veia da cauda. Os ratinhos foram sacrificados e os baços foram isolados para a fusão a hibridomas aproximadamente 3 dias após a injeção na veia da cauda ter sido realizada.
Os hibridomas clonais foram gerados e rastreados por ELISA. Percentagens de cadeia leve capa/gama positivo, especifico a antigénio, e neutralização de clones identificados por rastreio de clones gerados a partir de quatro fusões de hibridoma separadas são indicadas no Quadro 5.
Três clones de hibridoma foram selecionados para análise adicional: 3D8, 1B11, e 33.3H2. Os ADNc de cada clone foram amplificados por RT-PCR a partir de ARNm, clonado, e sequenciado. Uma sequência consenso de região V de cadeia pesada foi encontrada para cada clone. Todos os três clones utilizaram uma região VH derivada do mesmo gene de região V de linha germinal (VH 3-33), mas utilizaram sequências J diferentes. As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de cada clone são mostradas na Figura 1 (SEQ ID NOs: 1-6) . As regiões de determinação de complementaridade (CDR) são sobrelinhadas na Figura. A análise da sequência dos genes de capa V (cadeia leve VK) revelou que cada um de HuMAb 1B11 e 33.3H2 expressa uma sequência consenso da cadeia V capa. 0 hibridoma 1B11 expressou uma cadeia leve VK derivada do gene da linha germinal VK L6, ao passo que o hibridoma 33.3H2 expressa uma cadeia leve VK derivada do gene de linha germinal VK L15. Na análise dos clones VK de HuMAb 3D8, 6 (I-VI) cadeias leves foram expressas no nível de ARNm (Figura 1) . Para determinar quais das cadeias leves foram expressas no nível de proteína, espectroscopia de massa e sequenciamento N-terminal do anticorpo 3D8 purificado foram realizados. Quando cadeias leves foram isoladas da proteína celular e analisadas por espectroscopia de massa, uma cadeia leve única foi vista com uma massa de 23,569 Daltons. Isto correspondeu à cadeia leve com a sequência de aminoácidos do grupo I representada na Figura 1, que é derivada do gene de linha germinal VK L19. 0 sequenciamento N-terminal da cadeia leve continha este resultado. As Figuras 2A, 3A, e 4A representam o nucleótido e as sequências de aminoácidos da VK de cada 3D8 (grupo I; SEQ ID NOs: 4, e 30-34), 1B11 (SEQ ID NO: 5), e 33.3H2 (SEQ ID NO: 6) respetivamente. As CDRs são sobrelinhadas e as VK e Jk de linha germinal são mostradas.
Assim, o anticorpo 3D8 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VK LI 9 humano. 0 anticorpo 1B11 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VK L6 humano. 0 anticorpo 33.3H2 compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivada de um gene VH 3-33 humano e uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivada de um gene VK L15 humano.
Os anticorpos 3D8 e 1B11 expressam regiões constantes de IgGl humana, e anticorpo 33.3H2 expressa regiões constantes de IgG3 humana. Os anticorpos descritos nos Exemplos 2-7 foram isolados destes hibridomas, e assim expressam as sequências variáveis mostradas na Figura 1 juntamente com regiões constantes humanas. 0 ADN que codifica a porção de ligação a antigénio de cada clone foi clonado num vetor a ser expresso como um anticorpo humano para administração a seres humanos.
Exemplo 2. Atividade de ligação de Anticorpos Antitoxina A A ligação de cada anticorpo à toxina A foi determinada por ELISA utilizando técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados na Figura 5. Os anticorpos produzidos por 3D8, 1B11, e 33.3H2 foram comparados a um quarto anticorpo monoclonal humano com atividade de ligação a toxina A, 8E6. A Figura 5 mostra que os anticorpos se ligam à toxina A com afinidades comparáveis. A afinidade dos anticorpos 3D8 e 1B11 para a toxina A foi também medida com instrumento Biacore®, que deteta interações de ligação biomolecular com tecnologia de ressonância do plasmão de superfície. Cada anticorpo foi adicionado a chips de sensor revestido com proteína A, e a toxina A foi permitida que flua sobre o chip para medir a ligação. 3D8 teve uma KD de 14,6 x 1CT10 Μ. 1B11 teve uma KD de 7,38 x 1CT10M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina A. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para utilização em terapêutica humana.
Exemplo 3. Neutralização de toxina por Anticorpos Antitoxina A
Os anticorpos expressos por hibridomas 1B11, 3D8, e 33.3H2 foram testados para atividade de neutralização de toxina A in vitro. As células foram incubadas na presença de concentrações variadas da toxina A, o que faz com que as células se reúnam e ocorra a perda da aderência às placas de cultura de células. 0 efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual de células. Uma pontuação de CPE desde 0-4 foi determinada, com base nos resultados da inspeção visual (4 = 100% de citotoxicidade, 0 = 0% de toxicidade). Os resultados destes ensaios são representados nas Figuras 6A e 6B. A neutralização de toxicidade contra uma linha de células de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90, e uma linha de células epiteliais de intestino humano, T-84, foi determinada. A Figura 6A mostra que todos os anticorpos tiveram capacidade de neutralização para as células IMR-90. A atividade de neutralização relativa da citotoxicidade de toxina A em células IMR-90 foi 1B11 > 3H2 > 3D8. De maneira interessante, a atividade de neutralização relativa foi 3D8 >1B11 > 3H2 contra células T-84, que são células epiteliais colónicas humanas (Fig. 6A). Acredita-se que as células T-84 sejam mais sensíveis à toxina A que outros tipos de células. As células T- 84 podem proporcionar uma célula alvo mais relevante para determinar a citotoxicidade de toxina A.
Exemplo 4. Mapeamento de Epitopos de Anticorpos Antitoxina A O epítopo da toxina A ligado por cada anticorpo monoclonal foi determinado por western blotting. Clones recombinantes de E. coli foram construídos os quais expressam quatro fragmentos da toxina A que representam o domínio enzimático (isto é, aminoácidos 1-659 da toxina A), o domínio de ligação de recetor (isto é, aminoácidos 1853-2710 da toxina A) , e as duas regiões entre os mesmos (isto é, aminoácidos 660-1255 e 1256-1852 da toxina A). Os segmentos apropriados do gene da toxina A foram amplificados por PCR a partir de ADN genómico preparado de estirpe de C. difficile ATCC 43255. Os fragmentos foram clonados utilizando um vetor pET e transformados em células BL21 DE3 para a expressão. O vetor proporciona expressão induzível e domínios de afinidade para a purificação (isto é, uma cauda His) e deteção (isto é, uma etiqueta de epítopo V5). A expressão foi induzida com IPTG e os fragmentos foram purificados por meio de cromatografia por afinidade. A ligação a quatro fragmentos da toxina A diferentes foi medida: o fragmento 1 correspondeu a aminoácidos 1-659; o fragmento 2 correspondeu a aminoácidos 660-1255; o fragmento 3 correspondeu a aminoácidos 1256-1852; e o fragmento 4 correspondeu a aminoácidos 1853-2710 (Figura 7). 1B11 reagiu com fragmentos 1 e 2. 33.3H2 reagiu com fragmento 2. 3D8 e outro anticorpo monoclonal humano, 6B4, reagiram com fragmento 4 (o domínio de ligação de recetor). Um anti-soro policlonal de coelhos imunizados com toxoide A reagiu com todos os quatro fragmentos.
Os epítopos 1B11 e 33.3H2 foram mapeados em mais detalhe. Para mapear o epítopo 1B11, os subfragmentos de fragmento 1 (aminoácidos 1-659) correspondentes aos aminoácidos 1-540, 1-415, 1-290, e 1-165, foram gerados (Figura 8A) . 1B11 ligado ao fragmento 1 e ao fragmento que contém aminoácidos 1-540. 1B11 não ligou-se aos outros subfragmentos. Portanto, o epítopo ligado por 1B11 mapeia entre os aminoácidos 415-540 da toxina A.
Para mapear o epítopo 33.3H2, os subfragmentos de fragmento 2 (aminoácidos 660-1255) correspondentes aos aminoácidos 660-1146, 660-1033, 660-920, e 660-807, foram gerados (Figura 8B) . 33.3H2 ligado aos fragmentos correspondentes aos aminoácidos 660-1255, 660-1146, e 660- 1033. 33.3H2 não ligou-se aos outros subfragmentos.
Portanto, o epítopo ligado por 33.3H2 mapeia entre os aminoácidos 920-1033 da toxina A.
Exemplo 5. Proteção de Ratinhos Contra Inoculação Letal de Toxina A por Administração de Anticorpos Antitoxina A
Cada anticorpo foi testado para a capacidade de proteger ratinhos contra a inoculação com uma dose letal da toxina A. Os ratinhos fêmeas Swiss Webster, cada um pesando 10-20 gramas, foram injetados intraperitonealmente com até 250 μg de 3D8, 1B11, ou 33.3H2, ou um anticorpo de controlo (anticorpo anti- vírus sincicial respiratório, Medlmmune) antes de inoculação com toxina A. Aproximadamente 24 horas após a injeção, os ratinhos foram inoculados com uma dose da toxina A de mais de 10 vezes a dose letal (DL50) , tipicamente 100 ng. Os animais foram observados para sinais de toxicidade durante os 7 dias seguintes. Os resultados destas experiências são sumarizados na Figura 9. Os dados são expressos como percentagem de sobrevivência. Os números em parêntesis referem-se a dose de anticorpo, se uma dose diferente de 250 μρ foi dada. A Figura 9 mostra que cada um dos anticorpos foi capaz de proteger os ratinhos contra a inoculação letal de toxina A até certo grau. A percentagem de ratinhos que sobrevivem quando tratados com 3D8 variou desde 10-100%. A percentagem de ratinhos que sobrevivem ao serem tratados com 33.3H2 variou desde 20-100%. A percentagem de ratinhos que sobrevivem ao serem tratados com 1B11 variou desde 0-60%. A capacidade relativa destes monoclonais de proteger os ratinhos foi 3H2 > 3D8 > 1B11. Exemplo 6. Neutralização da Enterotoxicidade de Toxina A em Alças Intestinais Ligadas de Ratinho com Anticorpos Antitoxina A
Os anticorpos 3D8 e 33.3H2 foram testados para a neutralização da enterotoxicidade de toxina A num modelo de alça ileal ratinho. Este modelo mede a acumulação de fluidos induzida por toxina A em intestino de ratinho. Para realizar estas experiências, cada ratinho foi mantido em jejum durante 16 horas, anestesiado, e o íleo próximo ao ceco foi exposto. Uma alça de 3 a 5 centímetros foi ligada duplamente em cada extremidade e injetada com 10 μρ da toxina A. A alça ileal foi retornada à cavidade abdominal, a ferida foi fechada, e permitiu-se que o animal se recuperasse. Quatro horas após a cirurgia, foi feita a eutanásia do animal e a alça foi retirada do animal. O comprimento de cada segmento foi remedido, e o fluido intraluminal foi extraído. O volume do fluido e a razão de volume em relação a comprimento (V:C) em milímetros por centímetro foi calculada para cada alça. Os ratinhos de teste foram injetados com anticorpo parentericamente 1-2 dias antes da cirurgia. Os resultados destas experiências são representados na Figura 10. A injeção com toxina A aumentou a razão de peso em relação a comprimento de fluido intestinal em 50%. Ambos 3D8 e 33.3H2 preveniram este aumento em acumulação de fluidos. Os ratinhos administrados com qualquer anticorpo tiveram uma razão de peso em relação a comprimento comparável a ratinhos que não receberam qualquer injeção de toxina A. Portanto, 3D8 e 33.3H2 protegem contra acumulação de fluido intestinal in vivo.
Estes resultados indicam que os anticorpos monoclonais antitoxina A protegem contra enterotoxicidade mediada por toxina A in vivo. Os dados de alça ligada de ratinho mostram que estes anticorpos monoclonais podem proteger contra dano na mucosa quando são administrados sistematicamente.
Exemplo 7. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile com Anticorpos Antitoxina Ά 3D8 foi testado num modelo de recaída em hamsters. Os hamsters são sensíveis aos efeitos tóxicos de toxinas de C. difficile, e tipicamente morrem dentro de 2-3 dias após receber uma dose única de clindamicina na presença de C. difficile. Para testar a eficácia de 3D8 em hamsters, um modelo de recaída foi utilizado. Neste modelo, aos hamsters foram dadas uma dose de clindamicina e uma dose de esporos de C. difficile B 1 uma dia depois. Um conjunto de hamsters de controlo não recebeu nenhum antibiótico ou anticorpo adicional. Um segundo conjunto de hamsters de controlo foi tratado com 10 mg/kg/dia de vancomicina. A vancomicina é um antibiótico utilizado no tratamento de doença de C. difficile. Como é mostrado na Figura 11A, um conjunto de hamsters de teste recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 2 mg/kg/dia de um anti-soro policlonal de coelho originado contra a toxina A cada dia durante sete dias após a exposição a C. difficile, como é indicado pelas flechas na Figura. Um segundo conjunto de hamsters de teste recebeu 10 mg/kg/dia de vancomicina e 50 mg/kg/dia de 3D8 nos mesmos intervalos de tempo. A sobrevivência de hamster foi colocada em gráfico versus tempo e é mostrada na Figura 11B. A Figura 11B mostra que todos os hamsters que receberam somente clindamicina e C. difficile (diamantes) morreram dentro de dois dias após a inoculação com as bactérias. Doze porcento (2/17) de hamsters tratados com vancomicina (quadrados) sobreviveram a inoculação com bactérias; oitenta e oito porcento (15/17) morreram dentro de oito dias. Quarenta e um porcento (7/17) de hamsters tratados com vancomicina e 3D8 (cruzes) sobreviveram a inoculação; cinquenta e nove (10/17) porcento morreram dentro de sete dias. Sessenta e quatro porcento (7/11) de hamsters tratados com vancomicina e soro policlonal de coelho (triângulos) sobreviveram a inoculação com bactérias; trinta e seis porcento (4/11) morreram dentro de nove dias. Estes dados são também representados na Figura 12 como a percentagem de sobreviventes totais em cada grupo de tratamento. Como é mostrado na figura, a percentagem de sobreviventes foi a mais alta (sessenta e quatro porcento) no grupo que recebe vancomicina e soro policlonal de coelho. 0 grupo que recebe 3D8 e vancomicina tiveram a segunda mais alta taxa de sobrevivência (quarenta e um porcento). Somente doze porcento de hamsters tratados com vancomicina sobreviveram. Aqueles sem tratamento todos morreram. Estes dados mostram que anticorpos policlonal e monoclonal antitoxina protegem contra recaída de doença de C. difficile in vivo quando são administrados após a infeção.
Exemplo 8. Produção de Anticorpos Antitoxina A para administração em seres humanos
As sequências de ácido nucleico que codificam a cadeia pesada variável e cadeias leves do anticorpo 3D8 foram clonados num vetor pIE-UgamalF utilizando metodologia de ADN recombinante padrão. 0 vetor foi amplificado em E. coli, purificado, e transfectado em células CHO-dg44. As células transfectadas foram colocadas em placa a 4 x 105 células por poço numa placa de 96 poços e selecionadas para a transfecção de vetor com G418. Um clone, designado 1D3, foi selecionado originalmente por resistência a G418, então testado juntamente com outros transfectomas para a produção de IgG. 1D3 teve um nível mais alto de produção de IgG em relação a outros transfectantes durante diversas séries de expansão. A expressão do anticorpo 3D8 foi amplificada por crescimento na presença de concentrações crescentes de metotrexato. Uma cultura capaz de crescimento em 175 nM de metotrexato foi escolhida para clonar células únicas para desenvolvimento posterior. A colocação em placa da cultura em placas de 96 poços em densidade baixa permitiu a geração de culturas que surgem de uma célula única ou clones. As culturas foram rastreadas para a produção de IgG humana, e a célula que produziu o nível mais alto de IgG foi selecionada para utilização posterior. 0 clone amplificado por metotrexato foi expandido para produzir um banco de células que inclui viais congelados múltiplos de células.
Para preparar os anticorpos a partir de células transfectadas, as células de um clone isolado nas etapas anteriores são cultivadas e expandidas como inoculo para um biorreactor. 0 biorreactor tipicamente suporta um volume de 500 litros de meio de cultura. As células são cultivadas no biorreactor até viabilidade celular cair, o que indica uma concentração de anticorpo máxima foi produzida na cultura. As células são retiradas por meio de filtração. O filtrado é aplicado a uma coluna de proteína A. Os anticorpos ligam-se à coluna, e são eluídos com uma lavagem de pH baixo. Em seguida, os anticorpos são aplicados a uma coluna de Q-Sepharose para retirar contaminantes residuais, tais como proteínas de células CHO, ADN, e outros contaminantes (por exemplo, contaminantes virais, se estiverem presentes). Os anticorpos são eluídos da coluna de Q-Sepharose, nano-filtrados, concentrados, e lavados num tampão tal como PBS. A preparação é então aliquotada assepticamente em viais para administração.
Exemplo 9. Preparação e Caracterização de Anticorpos Policlonais antitoxina B
Duas cabras Nubianas (#330 e #331) foram injetadas intramuscularmente com 50 μρ de toxina B inativada por UDP dialdeído (Techlab) e adjuvante de Freund completo. Doses de reforço de 25 μρ de toxoide B com adjuvante de Freund incompleto foram dadas intramuscularmente em intervalos de duas semanas. Sangramentos de teste foram obtidos após 4 imunizações. A reatividade de ELISA e neutralização de citotoxicidade contra ambas a toxina A e a toxina B foram testadas para medir a especificidade e reatividade cruzada dos soros.
Ambos os animais responderam bem à toxina B e a um grau menor à toxina A como medido por ELISA. Soros de cabra #331 tiveram menos reatividade cruzada à toxina A e foram escolhidos para a maioria das experiências subsequentes. A neutralização de citotoxicidade às células IMR-90 foi determinada como foi descrito no Exemplo 3. Os resultados de neutralização de citotoxicidade são representados na Figura 13, que mostra que os soros de ambos os animais exibiram boas titulações de anticorpo de neutralização de toxina B e titulações de anticorpo de neutralização de toxina A muito baixas, mas detetáveis. A capacidade dos soros de cabra de proteger ratinhos de uma inoculação letal intraperitoneal com toxina B (100 ng) foi também confirmada (dados não mostrados).
Exemplo 10. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile com Anticorpos Antitoxina A e antltoxlna B
Os grupos de hamsters (n = 20) foram inoculados com clindamicina e C. difficile, e então tratados com vancomicina como foi descrito no modelo de hamster de recaída no Exemplo 7. Deram-se duas vezes ao dia aos anticorpos (ou 3D8, soro de cabra #331, ou 3D8 e soro de cabra #331) após tratamento com vancomicina (Figura 14). Os animais foram monitorizados para a sobrevivência (Figura 15) ou doença (Figura 16) . Doses de anticorpo foram 1 ml duas vezes ao dia para soro de cabra #331 e 3 mg para 3D8 dadas duas vezes ao dia. Os animais que recebem vancomicina somente (isto é, sem tratamento com anticorpo) serviram como um controlo negativo. Como foi observado anteriormente, 3D8 e tratamento com vancomicina em separado demonstraram um efeito protetor parcial, em que 10 dos 20 animais foram protegidos contra a letalidade (Fig. 15) . Cinquenta porcento de animais neste grupo permaneceram saudáveis (Fig. 16). Seis dos 20 animais que recebem tratamento com vancomicina em separado foram protegidos (Fig. 15) . Trinta porcento permaneceram saudáveis (Fig.
16) . Proteção parcial (9/20 animais protegidos) foi também observada quando o soro de cabra foi utilizado em separado (Fig. 15) . Quarenta porcento permaneceram saudáveis. A proteção foi aumentada a proximamente 100% quando ambos soro de cabra e 3D8 foram dados juntamente (18/20) e o aparecimento da doença foi atrasado (Fig. 15) . Noventa porcento destes animais permaneceram saudáveis (Fig. 16) . Claramente, proteção contra doença seguiu um padrão similar à proteção contra letalidade. Estes dados demonstram que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada.
Exemplo 11. Proteção de Hamsters Contra Recaída de C. difficile em Hamsters Imunizados com Toxina B
Os hamsters foram imunizados intraperitonealmente com 10 μρ do fragmento COOH-terminal da toxina B (correspondente aos aminoácidos 1777-2366 da toxina B) expresso em E .coli e utilizando RIBI como adjuvante. Os animais receberam 7 doses de antigénio da toxina B. Os anticorpos de resposta a neutralização foram observados nos animais que foram testados. Os grupos de hamsters imunizados foram inoculados com clindamicina e C. difficile então tratados com vancomicina como foi descrito no modelo de hamster de recaída no Exemplo 7. O anticorpo (3D8, 3 mg/dose) foi dado duas vezes ao dia após tratamento com vancomicina a 19 animais e comparou-se a um grupo de controlo negativo (n = 20) que não recebeu tratamento (Figuras 17 e 18). Seis animais foram inoculados sem tratamento com vancomicina para assegurar que os hamsters imunizados com antigénio de toxina B foram suscetíveis a infeção por C. difficile. Os animais foram monitorizados para sobrevivência (Figura 17) ou doença (Figura 18) . A Figura 17 mostra que os animais imunizados aos quais não se receberam 3D8 tiveram uma recaída em uma taxa similar a essa observada anteriormente (65% de recaída). Os animais imunizados com toxina B que recebem 3D8 foram mais completamente protegidos contra a recaída que os observados anteriormente (10% de recaída, em comparação com aproximadamente 50% de recaída em animais não previamente imunizados com toxina B em outras experiências). A Figura 18 mostra que alguns dos animais imunizados que recebem 3D8 ficaram doentes, mas recuperaram-se de sua diarreia. Trinta e cinco porcento de animais imunizados que recebem vancomicina em separado permaneceram saudáveis. Em experiências em que os soros reativos de toxina B não estavam presentes em animais, virtualmente todos os animais que tiveram diarreia depois morreram. Estes dados proporcionam evidência adicional de que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada. A neutralização da toxina B além da toxina A foi requerida para a proteção ótima contra doença de C. difficile neste modelo.
Exemplo 12. Proteção de Hamsters Contra Inoculação primária de C. difficile Utilizando 3D8 em Hamsters Tratados Com Soros de Antitoxina B de Cabra A prevenção de recaída de doença de C. difficile nos hamsters foi mais fácil de demonstrar que a proteção contra a inoculação direta (isto é, a inoculação sem administração de vancomicina). As experiências com soros de coelho demonstraram somente proteção fraca contra inoculação direta e 3D8 não teve efeito detetável sobre a inoculação direta. Uma vez que 3D8 foi mais protetor num antecedente dos anticorpos de neutralização de toxina B, determinou-se se a administração combinada de 3D8 e antitoxina B anti-soros poderia prevenir a doença devido à inoculação direta. Os grupos de 5 hamsters foram inoculados após receberem doses de 3D8 (3 mg) uma vez ao dia, combinadas de soros de 3D8 (3 mg) e cabra #331 (1 ml), ou sem anticorpos para os 3 dias antes da inoculação como é representado na Figura 19. Os dados na Figura 20 mostram que os animais que não recebem nenhum anticorpo ou 3D8 ou soros de cabra em separado todos morreram com 48 horas de inoculação com C. difficile. A maioria dos animais (80%) que recebe ambos 3D8 e soros de cabra sobreviveu e os animais afetados sobreviveram durante 10 dias após inoculação. A Figura 21 mostra que os animais tratados com 3D8 e soros de cabra ficaram doentes, mas recuperaram-se. Estes dados proporcionam evidência adicional de que 3D8 pode ser completamente protetor no modelo de doença de hamster quando a toxina B é também neutralizada. A neutralização da toxina B além da toxina A foi requerida para a proteção ótima contra doença de C. difficile neste modelo. A proteção bem-sucedida de hamsters diretamente inoculados com C. difficile oferece diversas vantagens a o rastreio de novos candidatos de toxina B. Números menores de animais podem ser utilizados uma vez que 100% de animais não tratados morrem. Os anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos) podem ser rastreados diretamente em hamsters porque o procedimento requer 100 mg ou menos do anticorpo de teste. Outros modos de testes, tais como o modelo de recaída, requerem o esforço de produzir quantidades grandes devido à taxa de ataque baixo no modelo de recaída, que necessita testar maiores números de animais. As experiências de inoculação direta são também mais curtas na duração com uma leitura definitiva dentro de 3-4 dias após a inoculação com C. difficile em comparação com 7-10 no modelo de recaída. Além disso, a eliminação de tratamento com vancomicina a partir do método de rastreio reduz o número de vezes que animais são manejados.
Exemplo 13. Geração de Anticorpos monoclonais antitoxina B A toxina B de C. difficile foi obtida de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) , ou por produção recombinante. A toxina foi purificada e inativada antes da imunização. A inativação foi realizada por tratamento com UDP- dialdeído reativo, que resulta em alquilação de resíduos catalíticos ao mesmo tempo em que preserva a estrutura da toxina nativa. De maneira breve, a toxina B purificada foi incubada com UDP-2',3'-dialdeído (0,1-1,0 mM) em tampão durante 18 horas a 37°C, filtrada através de um filtro de corte de 100 kDa para retirar UDP-2' , 3' -dialdeído não reagido, e lavada com tampão. A toxina B inativada (toxoide B) ou fragmentos recombinantes de toxina B foi utilizada como imunogénios. Um domínio de ligação de recetor de toxina B (resíduos de aminoácidos 1777-2366) foi expresso em E. coli como uma proteína de fusão gue contém uma etiqueta imuno (hexahistadina) para a purificação por afinidade utilizando cromatografia por afinidade de quelato de níquel (designado fragmento 4; veja-se Exemplo 11).
Os ratinhos transgénicos Hcol2 gerados, como foi descrito anteriormente na secção intitulada "Geração de Anticorpos monoclonais humanos em Ratinhos HuMAb" e fornecidos por Medarex, Milpitas, CA, foram imunizados intraperitonealmente 6-12 vezes cada um com 10 μρ de toxoide em adjuvante RIBI. Nos ratinhos transgénicos Hcol2, o gene capa de cadeia leve endógena foi quebrado homozigoticamente como foi descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820 e o gene de cadeia pesada endógena de ratinho foi quebrado homozigoticamente como foi descrito no Exemplo 1 de Publicação PCT WO 01/09187. Os ratinhos transgénicos Hcol2 portam um transgene capa de cadeia leve humano, KCo5, como foi descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e o transgene de cadeia pesada humano Hcol2 como foi descrito nas Patentes US N° 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. O soro foi colhido de cada ratinho e testado para a reatividade à toxina B por ELISA e neutralização de citotoxicidade em células IMR-90.. Os ratinhos que deram positivo no teste para toxina B-reativo e neutralização de anti-soro foram injetados com 5-10 μρ toxoide B ou fragmento 4 através da veia da cauda. Os ratinhos foram sacrificados e os baços foram isolados para a fusão a hibridomas aproximadamente 3 dias após a injeção na veia da cauda ter sido realizada.
Os hibridomas clonais foram gerados e rastreados por ELISA. Três clones de hibridoma foram selecionados para análise adicional: 124-152; 2A11; e 1G10. Em particular, os ADNc do clone 124-152 foram amplificados por RT-PCR a partir de ARNm, clonados, e sequenciados. Determinou-se que a região V da cadeia pesada era derivada da linha germinal sequência VH 5-51, a sequência da região D derivada da linha germinal 7-27, e a sequência J da região da linha germinal JH3b. Determinou-se que as regiões de cadeia leve (capa) eram derivadas de A27 e a região J de JK1. Determinou-se que o isotipo do clone 124-152 era IgGl. As sequências de aminoácidos das regiões VH e VL do clone 124-152 são mostradas nas Figuras 27-28. As regiões de determinação de complementaridade (CDRs) são indicadas nas Figuras. As sequências germinais relacionadas das regiões VH e VL são mostradas nas Figuras 30-31.
Os anticorpos 124-152; 2A11; e 1G10 foram isolados de hibridomas correspondentes e testados para suas características (infra) de ligação. O ADN que codifica o clone 124-152 foi clonado num vetor a ser expresso como um anticorpo humano para administração a seres humanos.
Exemplo 14. Atividade de ligação de Anticorpos antitoxina B A ligação de cada anticorpo à toxina B foi determinada por Biacore utilizando técnicas padrão. Os resultados deste ensaio são representados no Quadro 6. Os anticorpos produzidos por 124-152; 2A11; e 1G10 foram comparados aos controlos apropriados.
Em particular, a afinidade dos anticorpos 124-152; 2A11; e 1G10 para a toxina B foi medida com o instrumento Biacore®, que deteta interações de ligação biomolecular com tecnologia de ressonância do plasmão de superfície. Cada anticorpo foi adicionado a chips de sensor revestido com proteína A, e a toxina B foi permitida que flua sobre o chip para medir a ligação. 124-152 teve uma KD de 1,64 x 1CT10 Μ; 2A11 teve uma KD de 0,24 x 10~10 M; e 1G10 teve uma KD de 2,98 x 10~10 M. Assim, os anticorpos ligam-se com alta afinidade à toxina B. Estas constantes de ligação indicam que os anticorpos têm afinidades adequadas para aplicação de utilização in vivo, por exemplo, terapêutica humana.
Exemplo 15. A neutralização de toxina por Anticorpos antitoxina B
Os anticorpos expressos por 124-152; 2A11; e 1G10 hibridomas foram testados para atividade de neutralização de toxina B in vitro. As células foram incubadas na presença de concentrações variadas de um anticorpo monoclonal especifico à toxina B que preveniria que as células se reunissem após a exposição à toxina B. 0 efeito citopático (CPE) foi determinado por inspeção visual de células. Uma pontuação de CPE desde 0-4 foi determinada, com base nos resultados da inspeção visual (4 = 100% de citotoxicidade, 0 = 0% de toxicidade). Os resultados destes ensaios são representados na Figura 27. A neutralização de toxicidade contra uma linha de células de fibroblasto de pulmão humano, IMR-90. A Figura 27 mostra que todos os anticorpos tiveram capacidade de neutralização para as células IMR- 90. A atividade de neutralização relativa da citotoxicidade de toxina A, em células IMR-90 foi 124-152> 1G10 >2A11.
Exemplo 16. Proteção de Hamsters Contra Inoculação primária de C. difficile Utilizando Anticorpos Antitoxina B A proteção contra a inoculação direta de um inoculo de C. difficile (clindamicina no dia -1 e esporos de C. difficile no dia O (1/100.000 de diluição) foi realizada durante um período de 4 a 10 dias na presença ou ausência de anticorpos antitoxina B. Os grupos de 5 hamsters foram inoculados após receberem uma vez ao dia doses de 3D8 (20 mg em total ao longo de 4 dias), soros de 3D8 (Id.) e cabra #331 (3 ml) combinados, 3D8 em combinação com anticorpos antitoxina B 124-152 (18 mg em total ao longo de 4 dias), 2A11 (20 mg em total ao longo de 4 dias), ou 1G10 (20 mg em total ao longo de 4 dias) ou sem anticorpos durante 3 dias antes da inoculação como é representado na Figura 24. Os dados na Figura 24 mostram que os animais que não recebem anticorpos ou 3D8 ou soros de cabra em separado todos morreram dentro de 72 horas após a inoculação com C. difficile ao passo que animais que recebem 3D8 e um anticorpo antitoxina B, e preferentemente em combinação com 124-152, tiveram uma taxa de sobrevivência de 40% (Figura 24). Um estudo de 10 dias similar ao anterior (mas utilizando um inoculo de C. difficile mais diluído) foi realizado com quantidades crescentes do anticorpo antitoxina B 124-152 (0,56 mg, 1,7 mg, ou 5,0 mg dados nos dias -3, -2, -1, e 0) . Os animais que recebem ambos 3D8 e soros de cabra sobreviveram e a maioria dos animais (60% — 70%) sobreviveram durante 10 dias após a inoculação se dado 3D8 em combinação com 124-152. Mesmo a dosagem mais baixa do anticorpo antitoxina B 124-152 (0,56 mg em combinação com 3D8) foi altamente eficaz (70% de sobrevivência; veja-se Figura 25). Os resultados mostram que 124-152 e 3D8, em separado, são menos eficazes então quando são utilizados em combinação onde um resultado mais aditivo, de facto, de terapêutica sinergística é alcançado (Figs. 24-26). Estes dados proporcionam evidência adicional de que o anticorpo antitoxina B é altamente eficaz, especialmente em combinação com o anticorpo antitoxina A 3D8. A neutralização da toxina B além da toxina A foi determinada para tratar da proteção contra doença de C. difficile neste modelo.
Exemplo 17. Mapeamento de Epitopos de Anticorpos Antitoxina
B 0 epítopo da toxina B ligado por cada anticorpo monoclonal foi determinado por western blotting. Clones recombinantes de E. coli foram construídos os quais expressam fragmentos da toxina B que representam domínios diferentes da toxina B. Os segmentos apropriados do gene da toxina B foram amplificados por PCR a partir de ADN preparado de uma estirpe de C. difficile apropriada. Os fragmentos foram clonados num vetor de expressão e expressos em E. coli. 0 anticorpo monoclonal humano 152 foi utilizado para sondar o fragmento de toxina B em western blots a fim de mapear o epítopo de ligação. Os fragmentos de proteína de toxina B foram isolados de E. coli os quais contêm uma porção de genes da toxina B e separados utilizando SDS-PAGE. Após electroforese, os fragmentos de toxina B foram transferidos a nitrocelulose e sondados com anticorpo monoclonal 152 seguido por anti humano de cabra conjugado com fosfatase alcalina para detetar a ligação de MAb 152. Determinou-se que HuMab 152 se liga à porção de fragmento -COOH da toxina B entre os aminoácidos 1777 e 2366 (veja-se, por exemplo, Fig. 32).
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
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Lisboa, 23 de Março de 2015

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) com uma KD de menos do que 10 x 1CT10 M conforme medido por ressonância de plasmão de superfície e neutraliza a toxina B de C. difficile, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, compreende: (a) uma região variável da cadeia pesada que compreende as sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs: 62, 64 e 66; e (b) uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos de CDRl, CDR2 e CDR3 de SEQ ID NOs: 68, 70 e 72.
  2. 2. O anticorpo isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, em que a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 54 e a região variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 58.
  3. 3. O anticorpo isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que: (a) o anticorpo é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico; e/ou (b) a porção de ligação a antigénio compreende um Fab, F(ab')2, ScFv, ou Fv.
  4. 4. Uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores num veículo farmaceuticamente aceitável.
  5. 5. Uma composição terapêutica que compreende: (a) o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e (b) um anticorpo ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina A de C. di ff idle.
  6. 6. A composição de acordo com a reivindicação 5, em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente à toxina A de C. difficile: (a) compete pela ligação à toxina A com um anticorpo, ou porção de ligação a anticorpo do mesmo, tendo uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve que compreende as sequências de aminoácidos mostradas em SEQ ID NO: 1 e 4, SEQ ID NOs: 2 e 5 ou SEQ ID NOs: 3 e 6 respetivamente; ou (b) se liga especificamente à toxina A com uma KD de menos do que 20 x 1CT6 M conforme medido por ressonância de plasmão de superfície.
  7. 7. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 ou 6, em que: (a) o anticorpo que se liga especif icamente à toxina A de C. difficile é um anticorpo monoclonal humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico; e/ou (b) a porção de ligação a antigénio do anticorpo que se liga especif icamente à toxina A de C. difficile compreende um Fab, F(ab')2r ScFv, ou Fv.
  8. 8. O anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7 para utilização num método de tratamento de um corpo humano ou animal através de terapêutica ou num método de diagnóstico levado a cabo no corpo humano ou animal.
  9. 9. 0 anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7 para utilização num método de tratamento de uma doença mediada por C. difficile num indivíduo, opcionalmente em que: (a) o indivíduo é humano; e/ou (b) o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, é administrado por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea ao indivíduo.
  10. 10. O anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com a reivindicação 9 em que o anticorpo, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, é administrado com outro agente terapêutico, opcionalmente em que o agente terapêutico é: (a) um antibiótico, gama-globulina policlonal, agente probiótico ou vacina de C. difficile; (b) vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii ou uma vacina de toxoide de C. difficile; ou (c) um anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, que se liga especificamente á toxina A de C. difficile.
  11. 11. Um kit que compreende: (a) o anticorpo monoclonal, ou porção de ligação a antigénio do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3; e (b) (i) um marcador; (ii) um agente terapêutico; (iii) um agente para acoplamento do anticorpo com um marcador ou agente terapêutico; ou (iv) um dispositivo para administrar o anticorpo ao indivíduo.
  12. 12. Um ácido nucleico de vetor de expressão que compreende: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 54; e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 58.
  13. 13. Uma célula hospedeira isolada compreendendo o vetor de expressão de acordo com a reivindicação 12.
  14. 14. Uma célula hospedeira isolada que compreende: (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 54; e (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 58. Lisboa, 23 de Março de 2015
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