CN111499738B - 一种抗艰难梭菌肠毒素a的抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请属于抗体制备技术领域，具体涉及一种抗艰难梭菌肠毒素A的抗体。该抗体为结合艰难梭菌毒素A的全人源抗体，由人源轻链可变区VL和重链可变区VH构成。基于现有噬菌体抗体库技术的成熟发展，本申请筛选获得了一个对艰难梭菌毒素A(TcdA)有很高的亲和力、在噬菌体表面展示的抗体序列，进一步获得了对应的ScFv‑Fc抗体。初步实验验证表明，所获得艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv‑Fc抗体可以特异性的识别并结合艰难梭菌毒素A(TcdA)，而利用该抗体，可为艰难梭菌毒素A(TcdA)的检测、相关疾病治疗药物筛选、药物开发奠定一定技术基础，因此具有较好的应用开发价值。

Description

一种抗艰难梭菌肠毒素A的抗体
技术领域
本申请属于抗体制备技术领域，具体涉及一种抗艰难梭菌肠毒素A的抗体。
背景技术
艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种专性厌氧的革兰阳性菌，该菌对氧气十分敏感，因很难从标本中分离培养而得名。艰难梭菌属于一种正常的肠道菌群，但在患者出现肠道菌群失调时，能够引起艰难梭菌感染进而引发疾病。艰难梭菌感染是一种由产毒型艰难梭菌在肠道过度增殖并大量释放毒素引起的感染性疾病，轻可引起腹泻，重则导致爆发性伪膜性肠炎，甚至死亡。
艰难梭菌主要产生2种大分子梭菌毒素：肠毒素A（TcdA）和细胞毒素B（TcdB），此外还有二元毒素(CDT)。肠毒素A（TcdA）和细胞毒素B（TcdB），两者均能灭活GTP结合蛋白，引发一系列反应最终导致腹泻和肠炎。研究表明，肠毒素A（TcdA）容易使肠壁的中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起机体液体大量分泌和出血性坏死。
由于肠毒素A对人体的潜在危害性，由此如能开发一种针对肠毒素A（TcdA）的抗体，则可为相关疾病的诊断和治疗奠定良好的技术基础。
发明内容
本申请主要目的在于提供一种针对肠毒素A（TcdA）的抗体，从而可为相关疾病的诊断和治疗奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
抗艰难梭菌肠毒素A的抗体，该抗体为结合艰难梭菌毒素A(TcdA)的全人源抗体，由人源轻链可变区VL和重链可变区VH构成；
所述轻链可变区VL，长度为339bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
GAGCTCGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAGGCTGCTCATTCACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAACAATATTATAGTATTCCGGTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
轻链可变区VL所编码氨基酸序列，由113个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示；具体为：
ELVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLAWYQQKPGQPPRLLIHWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPVTFGPGTKVDIK
该轻链可变区VL含有三个高变区，对应碱基序列分别为：
79~114位处的：CAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTAC（对应编码氨基酸序列为：QSVLWNSNNKNY）；
166~174位处的：TGGGCATCT（对应编码氨基酸序列为：WAS）；
283~309位处的：CAACAATATTATAGTATTCCGGTCACT（对应编码氨基酸序列为：QQYYSIPVT）；
所述重链可变区VH，长度为366bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
重链可变区VH所编码氨基酸序列，由122个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；具体为：
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDAYSSTLDWYFDLWGRGTLVTVSS
该重链可变区VH也含有三个高变区，对应碱基序列分别为：
76~99位处的：GGATTCACCTTTGGTGATTATGCC（对应编码氨基酸序列为：GFTFGDYA）
151~174位处的：ATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATA（对应编码氨基酸序列为：ISWNSGSI）
289~333位处的：GCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTC（对应编码氨基酸序列为：AKDAYSSTLDWYFDL）
抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体，由轻链可变区VL、重链可变区VH以及人的Fc片段构成，其碱基序列长度为1599bp，碱基序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：
GAGCTCGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAGGCTGCTCATTCACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAACAATATTATAGTATTCCGGTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGTGGTCCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCACTGAGATCCGAAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGGCAGATGTACCAGTTGCCCAATACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTCACTAGTGGCCAGGCCGGCCTGGCATCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
该碱基序列对应所编码氨基酸序列，长度为533个氨基酸，氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示，具体为：
ELVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLAWYQQKPGQPPRLLIHWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPVTFGPGTKVDIKGGPSRSSSSGGGGSGGGGQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDAYSSTLDWYFDLWGRGTLVTVSSLRSEDTAVYYCAADVPVAQYWGQGALVTVSSGSASAPTLTSGQAGLASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体，具体制备步骤如下：
（一）构建获得抗艰难梭菌毒素A(TcdA)的ScFv-Fc抗体的重组质粒表达载体
将如SEQ ID NO.5所示碱基序列重组进真核表达载体中，具体而言：
以真核表达载体pFUSE-RTL1为例，利用限制性内切酶SfiI-HF分别对真核表达载体pFUSE-RTL1和含有如SEQ ID NO.5所示碱基序列的质粒进行酶切并回收酶切产物后，再利用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接；
随后，将连接产物转化入XL1-Blue感受态细胞，进行筛选、测序鉴定，确保重组正确，并提取重组后质粒表达载体备用；
（二）抗体表达
将步骤（一）中所构建重组质粒表达载体转化CHO-S细胞后进行培养，收集培养产物即为含有ScFv-Fc抗体的混合物；进一步地，利用亲和纯化技术（例如利用proteinA亲和填料）对培养产物进行纯化后，即可获得纯化的ScFv-Fc抗体。
噬菌体抗体库技术是近30年来抗体工程技术领域的重大进展之一，它集合了PCR技术、蛋白质工程技术、噬菌体展示技术等技术优点。利用该技术时，由于噬菌体抗体可以将基因型与表现型结合于一体，同时可以将选择能力与扩增能力相结合，从而扩大了筛选容量，最终能够在体外模拟抗体的生成过程。总体上，利用噬菌体抗体库进行筛选时具有诸多优点，例如： (1)由于抗体库技术不依赖细胞融合技术，因此筛选时只需通过PCR扩增得到人的全套抗体基因组即可；(2)由于抗体库技术极大地增加了筛选容量，使得从天然抗体库筛选获得高亲和力抗体成为可能；而免疫原性差、毒性抗原等可以不经过免疫即可筛选得到特异性抗体；(3)抗体库技术可以直接获得抗体基因，既没有杂交瘤丢失分泌抗体能力的困扰，又便于构建其他类型的基因工程抗体。
正是基于现有噬菌体抗体库技术的成熟发展，本申请利用该技术筛选获得了一个对艰难梭菌毒素A(TcdA)有很高的亲和力、在噬菌体表面展示的抗体序列，进一步获得了对应的ScFv-Fc抗体。初步实验验证表明，所获得艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv-Fc抗体可以特异性的识别并结合艰难梭菌毒素A(TcdA)，而利用该抗体，可为艰难梭菌毒素A(TcdA)的检测、相关疾病治疗药物筛选、药物开发奠定一定技术基础，因此具有较好的应用开发价值。
附图说明
图1是本发明三轮淘选产出噬菌体与艰难梭菌毒素A(TcdA)结合力检测结果图；
图2是本发明单克隆噬菌体与艰难梭菌毒素A(TcdA)结合力检测结果图；
图3是本发明抗艰难梭菌毒素A(TcdA)带有Fc片段的单链ScFv-Fc抗体的SDS-PAGE检测结果图；
图4是本发明抗艰难梭菌毒素A(TcdA)带有Fc片段的单链ScFv-Fc抗体与艰难梭菌毒素A(TcdA)酶联免疫吸附试验（Elisa）检测结合力结果图；
图5是本发明抗艰难梭菌毒素A(TcdA) 单链ScFv-Fc抗体与艰难梭菌毒素A(TcdA)的亲和力检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请做进一步的解释说明。在进一步介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂等背景情况简要说明如下。
生物材料：
大肠杆菌XL1-blue、pSEX载体、真核表达载体pFUSE-RTL1等，均为现有生物技术中常用材料，均可通过公开渠道或利用现有技术对现有载体改造获得；
Hyperphage，Progen公司产品；
实验试剂：
胶回收试剂盒，Qiagen公司产品；
质粒小量提取试剂盒，TRANS公司产品；
SfiI-HF限制性内切酶，NEB公司产品；
艰难梭菌毒素A(TcdA)，参考现有技术常规提取制备即可（也可采用商品化产品）；
HRP 标记的羊抗M13 抗体，GE 公司产品；
proteinA亲和填料，生工生物公司产品；
FreeStyle™ MAX CHO Expression System，Gibco公司产品；
ExpiCHO™ Expression System Kit，Gibco公司产品。
实施例1
需要解释的是，由于全人源天然免疫单链抗体(scFv)文库（所构建文库，库的靶标是抗体序列）构建是相关抗体筛选、构建的基础，因此首先就文库构建过程简要介绍如下。
首先，采集健康人体外周血（血液样本数为100份），分离单个核细胞后，参考相关试剂盒说明书，提取总RNA并逆转录成cDNA备用；
其次，以上述所制备cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增所有类型的轻链可变区和重链可变区基因后，并利用重叠延伸PCR技术（overlap-PCR）连接轻链和重链；
进一步，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶（含EB）电泳,在紫外灯下切胶回收约750bp大小位置的目的条带（overlap-PCR后产物误差在几十bp左右，但总体基本一致，均在750bp左右），再用Qiagen的胶回收试剂盒回收DNA片段，纯化的DNA即为全人源天然VH基因和VL基因随机拼接成的人scFv基因文库；
再次，利用SfiI-HF限制性内切酶对所得人scFv基因文库进行双酶切，同时利用SfiI-HF限制性内切酶对噬菌体载体pSEX载体进行酶切，并分别回收酶切产物并利用T4DNA连接酶对酶切产物进行连接；
最后，采用电击转化法，将连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞，收集全部单克隆菌落并混匀，随机挑选阳性单菌落以验证scFv基因阳性克隆率，并通过测序分析scFv文库基因的多样性，以确保文库中scFv基因序列均不相同（保存时为细菌文库，使用时，在20MOI的Hyperphage辅助下，将含有噬菌体DNA的细菌文库包装成噬菌体文库）。
测定结果表明，本申请中，通过菌落计算表明所构建scFv文库容量为5×108，具有库容量好、质量好特点，可以较好满足筛选应用需要。
在上述文库基础上，下面就高亲和力（抗艰难梭菌肠毒素A抗体）噬菌体的筛选获得过程具体介绍如下。
（1）将艰难梭菌毒素A(TcdA)用PBS（pH7.4）稀释至1μg/100μL，取100μL作为抗原包被96孔酶标板的1个孔，封口后4℃孵育过夜；
弃尽孔内液体，用200μL PBS洗涤板孔1次；
再次弃尽孔内液体，加入200μL封闭液（含有2%脱脂奶粉和0.25% Tween20的PBS（pH7.4）溶液），37℃孵育板孔2h；
最后弃尽孔内液体，用200μL含0.25% Tween20的PBS（pH7.4）洗涤孔板1次；
（2）弃尽孔内液体，加入100μL用封闭液稀释的噬菌体（即所制备抗体细菌文库），37℃孵育4h；
弃尽孔内液体，用含有0.25% Tween20的PBST（pH7.4）洗涤10次；
（3）弃尽孔内液体，向孔内加入100μL浓度为1.75μg/mL的胰蛋白酶，室温孵育15min；
用移液器反复吹吸6-8次，转移所有液体至1mL新鲜的OD600吸光值为0.5的XL1-blue菌液中，37℃孵育1h；
取其中的1μL进行100倍倍比稀释后，取不同稀释度的稀释产物涂布于2×YT固体培养基（含有1%葡萄糖、100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的）平板上用于计数；
余下的全部涂布于含有2×YT固体培养基的方形平板上，倒置37℃培养16-18h；
最后收集全部菌落于10mL的2×YT液体培养基（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）中混匀，取其中一部分稀释至OD600≈0.4，再37℃、260rpm振荡培养至OD600≈0.5；
（4）在20MOI的Hyperphage辅助下，30℃、260rpm振荡培养12-16h包装噬菌体；包装完成后，4℃、4000rpm离心15min，收集培养基上清，重复离心过程三次，获得非常清亮的培养基上清；
按照培养基上清：5×PEG8000/NaCl溶液(含20% PEG800的2.5M NaCl溶液)为4:1的比例向培养基上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，4℃、12000rpm离心1h收集沉淀，充分溶解于1mLPBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀；
再次按照溶液上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向溶液上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL 的PBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀；
计数溶液中噬菌体的滴度。
再重复以上步骤（1）~（4）的亲和筛选过程2次。
ELISA试验检测每轮亲和筛选后亲合力情况。具体检测方法为：
将艰难梭菌毒素A(TcdA)用PBS稀释至3μg/mL ，按照100μL/孔的量包被ELISA板孔，4℃孵育过夜；
弃尽板孔内溶液，以200μL的PBS（pH7.4）洗涤孔板1次，每孔加入封闭液200μL，37℃孵育2h；
弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 用封闭液稀释的噬菌体（含量为5×108pfu/100μL），37℃孵育2h；
弃净板孔内溶液，以200μL的PBS（含0.25% Tween20）洗板5次后，每孔加入100μL用封闭液1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h；
弃尽板孔内溶液，以200μL的PBS（含0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL的QuantaBlue显色液，3-5分钟后读值并进行统计分析。
检测结果如图1所示。可以看出，3轮亲和淘选筛选后产出的噬菌体结合艰难梭菌毒素A(TcdA)的亲和力得到了显著提高。
3轮筛选过程中，分别在第2轮和第3轮淘选之后，随机挑选10个分隔良好的单克隆，共20个单克隆，对噬菌体活性进行测定，并进行测序分析，分析氨基酸序列和CDR 区序列，进一步排除氨基酸序列重复的单克隆，最终得到了9个可用克隆，并对其活性进行了测定。
具体噬菌体活性测定方法如下：
将9个可用克隆分别接种于2×YT液体培养基（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）中，37℃、260rpm振荡培养至OD600≈0.5，参考前述操作，利用Hyperphage将9个单克隆分别包装成噬菌体，并计数噬菌体滴度；
将艰难梭菌毒素A(TcdA)和BSA蛋白分别用PBS稀释至3μg/mL，并分别以100μL/well包被ELISA板孔，4℃孵育过夜；
弃尽板孔内溶液，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h；
弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 用封闭液稀释的噬菌体（含量为5×108pfu/100μL），37℃孵育2h；
弃净板孔内溶液，以200μL PBS（含0.25% Tween20）洗板5次后，每孔加入100μL 用封闭液1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h；
弃尽板孔内溶液，以200μL PBS（含0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL的QuantaBlue显色液， 3-5分钟后读值并进行统计分析。
部分活性检测结果如图2所示。结果表明有5个克隆有较好的亲和活力，可以特异性识别并结合艰难梭菌毒素A(TcdA)。根据测序结果分析这5个克隆的CDR区，对应的氨基酸序列如下表1所示（表格中Colony Number（菌落编码），仅是实验过程中自行计数式编码，不具有特殊含义）。
表1，与艰难梭菌毒素A(TcdA)高结合单克隆CDR区氨基酸序列信息：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
实施例2
在实施例1基础上，可以看出，噬菌体22具有最强结合力，因此进一步地，发明人将该噬菌体所对应轻链、重链序列导入真核表达载体pFUSE-RTL1中，并进一步转染到CHO-S悬浮细胞中进行表达，最后利用Protein A获得纯化的全人源抗艰难梭菌毒素A(TcdA)的带有Fc标签的单链ScFv-Fc抗体。具体制备过程介绍如下。
（一）对真核表达载体pFUSE-RTL1进行重组
首先，将保存的噬菌体22对应的22号单克隆接种于1mL的2×YT液体培养基（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）中，37℃、260rpm振荡培养过夜，利用TRANS公司的质粒小提试剂盒（参考说明书进行操作即可）对所得培养物进行质粒提取，所得质粒命名为pTcdA-22，利用NanoDrop2000紫外分光光度计对提取物中质粒浓度进行测定。
随后，用限制性内切酶SfiI-HF 分别酶切pTcdA-22和表达载体pFUSE-RTL1，分别对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收酶切产物，并用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接。
操作过程中，10μL酶切体系设计如下：
pTcdA-22（或者pFUSE-RTL1），1μg；
SfiI-HF，0.5μL；
10×CutSmart Buffer，1μL；
ddH2O补足10μL；
50℃条件下酶切2h。
T4 DNA连接酶连接时，10μL连接体系设计如下：
TcdA-22酶切产物，100ng；
pFUSE-RTL1酶切产物，80ng；
T4 DNA ligase，0.5µl；
10×T4 DNAligase Buffer，1µl；
ddH2O补足10μL；
16℃条件下连接3h。
再后，采用热激法，将连接产物转化入XL1-Blue感受态细胞，具体为：将10μL连接产物加入到XL1-Blue感受态中，冰上孵育30min后42℃热激85s，再冰上孵育2min；加入1ml预热的2×YT液体培养基，37℃、260rpm复苏1h后涂布于2×YT（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）平板上，37℃培养过夜。
最后，取培养过夜阳性单克隆进行测序确保重组正确，对测序正确的单克隆进一步扩大培养，具体操作参考如下：将测序正确阳性克隆接种于1mL 的2×YT液体培养基（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）中，37℃、260rpm振荡培养至OD600≈0.5作为种子液，将种子液接种于100mL 的2×YT液体培养基（含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素）中，37℃、260rpm振荡培养过夜；利用Qiagen公司的质粒提取试剂盒大量提取质粒（参考说明书操作即可）备用，所获得重组质粒表达载体命名为：pFUSE-RTL1- TcdA-22。
（二）单链ScFv-Fc抗体表达
参照Gibco的FreeStyle™ MAX CHO Expression System说明，利用ExpiCHO™Expression System Kit试剂，将上述所构建重组质粒表达载体pFUSERTL1- TcdA-22转化入CHO-S细胞，具体而言：将CHO-S细胞复苏后，连续传代3-5代至细胞状态良好，再将20μg的pFUSERTL1- TcdA-22转染进细胞，培养7天后收集培养产物。
（三）纯化获得单链ScFv-Fc抗体
将步骤（二）所得培养产物在100g条件下离心10min，收集上清，再4000rpm离心10min，弃去沉淀后，所得上清即为表达后含有单链ScFv-Fc抗体的溶液，进一步参照proteinA亲和填料说明书，利用proteinA亲和填料获得纯化的ScFv-Fc抗体。
对所得纯化后ScFv-Fc抗体进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。从图中可以看出，在天然状态下ScFv-Fc抗体在Fc的作用下以多聚体的形态存在；而使用还原剂（DTT）后，以单链形式存在，且大小符合预期。
进一步地，利用ELISA的方法，鉴定此ScFv-Fc抗体与艰难梭菌毒素A(TcdA)结合情况。具体检测方法为：
艰难梭菌毒素A(TcdA)和BSA蛋白分别用PBS稀释至3μg/mL，并分别以100μL/well包被ELISA板孔，4℃孵育过夜；
弃尽板孔内溶液，每孔加入200μL封闭液，37℃封闭2h；
弃尽板孔内溶液，用封闭液稀释艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv-Fc抗体至300ng/100μL，每孔加入100μL稀释好的ScFv-Fc抗体作为一抗，37℃孵育2h；
弃净板孔内溶液，以200μL PBS（含0.25% Tween20）洗板5次后，每孔加入100μL 用封闭液1:5000稀释的 HRP 标记的羊抗人IgG抗体，37℃孵育1h；
弃尽板孔内溶液，以200μL PBS（含0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL的QuantaBlue显色液， 3-5分钟后读值并进行统计分析。
结果如图4所示。结果显示此抗体可以特异性识别并结合艰难梭菌毒素A(TcdA)。
在确认该抗体可以特异性识别并结合艰难梭菌毒素A(TcdA)后，进一步利用ELISA方法检测ScFv-Fc抗体与TcdA亲和能力的强弱。具体而言，在上述ELISA实验的基础上，将艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv-Fc抗体的使用浓度按照5倍比稀释后，检测不同浓度梯度下其亲和能力。
实验中，艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv-Fc的抗体浓度分别为0.032nM、0.16 nM、0.80nM、4.00 nM、20.00 nM和100.00 nM。
结果如图5所示。结果表明，所制备艰难梭菌毒素A(TcdA)ScFv-Fc抗体即使在较低浓度时，依旧保持与艰难梭菌毒素A(TcdA)较好的亲和能力，具有较好的检测应用前景。
序列表
<110> 郑州师范学院
<120> 一种抗艰难梭菌肠毒素A的抗体
<130> none
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gagctcgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tggaactcca ataataagaa ttacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aggctgctca ttcactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtatt 300
ccggtcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaa 339
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Trp Asn
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ile Pro Val Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 366
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttggt gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120
ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atagtggtag cataggctat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatgcg 300
tatagcagca ccttagactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360
tcctca 366
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Thr Leu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 1599
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gagctcgtga tgactcagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tggaactcca ataataagaa ttacttagct 120
tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aggctgctca ttcactgggc atctacccgg 180
gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcaacaata ttatagtatt 300
ccggtcactt tcggccctgg gaccaaagtg gatatcaaag gtggtccctc tagatcttcc 360
tcctctggtg gcggtggctc gggcggtggt gggcaggtgc agctggtgca gtctggggga 420
ggcttggtac agcctggcag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt 480
ggtgattatg ccatgcactg ggtccggcaa gctccaggga agggcctgga gtgggtctca 540
ggtattagtt ggaatagtgg tagcataggc tatgcggact ctgtgaaggg ccgattcacc 600
atctccagag acaacgccaa gaactccctg tatctgcaaa tgaacagtct gagagctgag 660
gacacggcct tgtattactg tgcaaaagat gcgtatagca gcaccttaga ctggtacttc 720
gatctctggg gccgtggcac cctggtcact gtctcctcac tgagatccga agacacggcc 780
gtttattact gtgcggcaga tgtaccagtt gcccaatact ggggccaggg agccctggtc 840
accgtctcct cagggagtgc atccgcccca accctcacta gtggccaggc cggcctggca 900
tctgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 960
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1020
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1080
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1140
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1200
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1260
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1320
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1380
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1440
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1500
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1560
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa 1599
<210> 6
<211> 533
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Trp Asn
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Arg Leu Leu Ile His Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Ile Pro Val Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
145 150 155 160
Gly Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala
180 185 190
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
195 200 205
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu
210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ala Tyr Ser Ser Thr Leu Asp Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu Arg Ser
245 250 255
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Val Pro Val Ala Gln
260 265 270
Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser
275 280 285
Ala Pro Thr Leu Thr Ser Gly Gln Ala Gly Leu Ala Ser Glu Pro Lys
290 295 300
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
305 310 315 320
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
325 330 335
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
340 345 350
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
355 360 365
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
370 375 380
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
385 390 395 400
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
405 410 415
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
420 425 430
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
435 440 445
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
450 455 460
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
465 470 475 480
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
485 490 495
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
500 505 510
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
515 520 525
Leu Ser Pro Gly Lys
530

Claims (6)

1.抗艰难梭菌肠毒素A的抗体，其特征在于，该抗体为结合艰难梭菌毒素A的全人源抗体，由人源轻链可变区VL和重链可变区VH构成；
所述轻链可变区VL，长度为339bp，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，
GAGCTCGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAGGCTGCTCATTCACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAACAATATTATAGTATTCCGGTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
轻链可变区VL所编码氨基酸序列，由113个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
ELVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLAWYQQKPGQPPRLLIHWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPVTFGPGTKVDIK
该轻链可变区VL含有三个高变区，对应碱基序列分别为：
79~114位处的：CAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTAC；
166~174位处的：TGGGCATCT；
283~309位处的：CAACAATATTATAGTATTCCGGTCACT；
所述重链可变区VH，长度为366bp，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCA
重链可变区VH所编码氨基酸序列，由122个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDAYSSTLDWYFDLWGRGTLVTVSS
该重链可变区VH也含有三个高变区，对应碱基序列分别为：
76~99位处的：GGATTCACCTTTGGTGATTATGCC；
151~174位处的：ATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATA；
289~333位处的：GCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTC。
2.抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体，其特征在于，由轻链可变区VL、重链可变区VH以及人的Fc片段构成，其碱基序列长度为1599bp，碱基序列如SEQ ID NO.5所示，
GAGCTCGTGATGACTCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATGGAACTCCAATAATAAGAATTACTTAGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAGGCTGCTCATTCACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCAACAATATTATAGTATTCCGGTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAAGGTGGTCCCTCTAGATCTTCCTCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATGCGTATAGCAGCACCTTAGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTCCTCACTGAGATCCGAAGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGGCAGATGTACCAGTTGCCCAATACTGGGGCCAGGGAGCCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCGCCCCAACCCTCACTAGTGGCCAGGCCGGCCTGGCATCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
该碱基序列对应所编码氨基酸序列，长度为533个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：
ELVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLWNSNNKNYLAWYQQKPGQPPRLLIHWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPVTFGPGTKVDIKGGPSRSSSSGGGGSGGGGQVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFGDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDAYSSTLDWYFDLWGRGTLVTVSSLRSEDTAVYYCAADVPVAQYWGQGALVTVSSGSASAPTLTSGQAGLASEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
3.权利要求2中所述抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）构建获得抗艰难梭菌毒素A的ScFv-Fc抗体的重组质粒表达载体
将如SEQ ID NO.5所示碱基序列重组进真核表达载体中，确保重组正确，并提取重组后质粒表达载体备用；
（二）抗体表达
将步骤（一）中所构建重组质粒表达载体转化CHO-S细胞后进行培养，收集培养产物即为含有ScFv-Fc抗体的混合物。
4.如权利要求3所述抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，步骤（一）中，以真核表达载体pFUSE-RTL1为基础进行改造，具体操作为：利用限制性内切酶SfiI-HF分别对真核表达载体pFUSE-RTL1和含有如SEQ ID NO.5所示碱基序列的质粒进行酶切并回收酶切产物后，再利用T4 DNA连接酶对酶切产物进行连接；
随后，将连接产物转化入XL1-Blue感受态细胞，进行筛选、测序鉴定，确保重组正确，并提取重组后质粒表达载体。
5.如权利要求3所述抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体的制备方法，其特征在于，步骤（二）中，利用proteinA亲和填料对培养产物进行纯化后，即可获得纯化的ScFv-Fc抗体。
6.权利要求2中所述抗艰难梭菌肠毒素A的ScFv-Fc抗体在制备抗艰难梭菌检测试剂中的应用，其特征在于，通过检测艰难梭菌肠毒素A来检测判定是否存在艰难梭菌感染。
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