CN117858904A

CN117858904A - 特异性结合cd47和pd-l1的分离的双特异性抗体

Info

Publication number: CN117858904A
Application number: CN202280044514.XA
Authority: CN
Inventors: A·K·米索林; A·K·萨比罗夫; A·D·阿扎里安; T·A·沃多皮诺娃; S·A·莱戈茨基; A·A·戈尔迪夫; A·N·多罗宁; V·V·索洛维耶夫; D·V·莫洛佐夫
Original assignee: Biocard Jsc
Current assignee: Biocard Jsc
Priority date: 2021-06-21
Filing date: 2022-06-21
Publication date: 2024-04-09
Also published as: AR126185A1; WO2022271053A1; MX2024000266A; CR20230612A; CL2023003854A1; TW202306998A; CO2023018165A2; BR112023026982A2; EP4359445A1; ECSP23097121A

Abstract

本发明涉及生物技术和医药领域，特别涉及特异性结合CD47和PD‑L1的双特异性抗体。本发明进一步涉及编码所述双特异性抗体的核酸、表达载体、用于产生所述双特异性抗体的宿主细胞和用于产生所述细胞的方法、包含根据本发明的双特异性抗体的药物组合物、包含根据本发明的双特异性抗体和其它治疗活性化合物的药物组合物、用于治疗由CD47和PD‑L1介导的疾病或病症的方法、双特异性抗体或其药物组合物用于治疗由CD47和PD‑L1介导的疾病或病症的用途、和根据本发明的双特异性抗体和其它治疗活性化合物用于治疗由CD47和PD‑L1介导的疾病或病症的用途。

Description

特异性结合CD47和PD-L1的分离的双特异性抗体

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，特别涉及特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体。本发明进一步涉及编码所述双特异性抗体的核酸、表达载体、用于产生所述双特异性抗体的宿主细胞和用于产生所述细胞的方法、包含根据本发明的双特异性抗体的药物组合物、包含根据本发明的双特异性抗体和其它治疗活性化合物的药物组合物、用于治疗由CD47和PD-L1介导的疾病或病症的方法、双特异性抗体或其药物组合物用于治疗由CD47和PD-L1介导的疾病或病症的用途、和根据本发明的双特异性抗体和其它治疗活性化合物用于治疗由CD47和PD-L1介导的疾病或病症的用途。

背景技术

嵌合、人源化或全人分子形式的单克隆抗体已被证实可用作治疗许多病症和疾病的有效药物。

天然存在的人抗体分子由两个重链同型二聚体组成，其各自与两个相同的轻链分子合作形成异二聚体。完整分子形式的常规单克隆抗体由重链和轻链的二价(″双臂″)异二聚体组成。

疾病通常由于若干病理导致，并伴有许多共存疾病。双特异性抗体能够以每个抗体分子结合并从而中和两个不同的抗原。与单克隆抗体相比，医药产品的治疗性质(以及价值)的显著改进潜力已使双特异性抗体成为活跃的研究领域。在过去的二十年里，文献已经描述了关于改造形式的双特异性抗体的许多方案，如Brinkmann，U和RE Kontermann，2017，The Making of Bispecific Antibodies，MAbs；209 Feb/Mar；9(2)：182-212，doi：10.1080/19420862.2016.1268307中所述的。

PD-1和通过与PD-1相互作用来传导信号的其它分子，例如PD-L1和PD-L2的治疗性靶向已受到强烈关注。已提议抑制PD-L1信号作为手段来增加T细胞免疫(例如，抗肿瘤免疫)以治疗癌症和感染，包括急性和慢性感染二者。阻断PD-L1/PD-1相互作用的抑制剂，例如从专利申请WO2004004771、WO2006121168、WO2007005874、WO2008156712、WO2010036959、WO2010077634和WO2011066389是已知的。

已在许多疾病和病症中观察到CD47表达和/或活性。因此，对于靶向CD47的疗法存在需要。

抑制CD47和SIRPα配体之间的相互作用的抗体已经在以下专利申请中描述：WO2014123580、WO2013119714、WO2015191861、WO2011143624、WO2014093678、WO2017053423。

具有不同形式的第一和第二抗原结合位点的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体从专利申请EA201791961(WO2019068302)是已知的。

迄今为止，世界上不存在特异性结合CD47和PD-L1并且为治疗用途而被批准的双特异性抗体。结合上述内容，产生特异性结合CD47和PD-L1并具有高的靶标亲和力，良好的胶体、热和聚集稳定性价值的新颖双特异性抗体是有重大意义的。

发明描述

本发明的作者令人惊讶地发现，与特异性结合CD47和PD-L1并具有不同形式的第一和第二抗原结合片段，例如Fab和scFv形式的双特异性抗体相比，特异性结合CD47和PD-L1并在第一和第二抗原结合片段内具有共同(相同)轻链的双特异性抗体具有更高的胶体、热和聚集稳定性。特异性结合CD47和PD-L1并在第一和第二抗原结合片段内具有共同轻链的双特异性抗体具有高的靶标亲和力。

双特异性抗体的第一和第二抗原结合部分中共同(相同)轻链的使用已描述于VanBlarcom T ET AL.，Productive common light chain libraries yield diverse panelsof high affinity bispecific antibodies，MAbs.2018 Feb/Mar；10(2)：256-268.doi：10.1080/19420862.2017.1406570。这种形式的双特异性抗体有可能为产生双特异性抗体而解决两个不同的轻链与它们的同源重链不正确配对的紧迫问题。

发明内容

在一个方面，本发明涉及分离的双特异性抗体，其特异性结合CD47和PD-L1并包括：

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3；

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体的特征在于特异性结合CD47的第一抗原结合片段是与Fc片段单体结合的Fab。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体的特征在于特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段是与Fc片段单体结合的Fab。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体的特征在于抗体是全长IgG抗体。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体是具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的全长IgG抗体。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体是具有人IgG1同种型的全长IgG抗体。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链可变结构域，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链可变结构域，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括第一和第二抗原结合片段的共同的轻链的可变结构域，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包含：

(a)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域；

和第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链，其包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括特异性结合PD-L1的抗原结合片段的重链，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括第一和第二抗原结合片段的共同的轻链，其包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

(a)具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链；

和第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体是二价抗体。

在一个方面，本发明涉及分离的核酸，其编码任何上述双特异性抗体。

在本发明的一些实施方案中，核酸是DNA。

在一个方面，本发明涉及表达载体，其包含任何上述核酸。

在一个方面，本发明涉及用于产生宿主细胞的方法，所述宿主细胞用于产生任何上述双特异性抗体，并且所述方法包括用上述表达载体转化细胞。

在一个方面，本发明涉及用于产生任何上述双特异性抗体的宿主细胞，所述宿主细胞包含任何上述核酸。

在一个方面，本发明涉及用于产生任何上述双特异性抗体的方法，其包括在足以产生所述抗体的条件下在生长培养基中培养上述宿主细胞，如果需要的话，接着分离和纯化得到的抗体。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的药物组合物，其包含治疗有效量的任何上述双特异性抗体与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合包含任何上述双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物。

在药物组合物的一些实施方案中，由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

在药物组合物的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

在药物组合物的一些实施方案中，化学治疗剂选自：多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在药物组合物的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是特异性结合HER2(人表皮生长因子受体2)的抗体。

在药物组合物的一些实施方案中，所述治疗活性化合物是曲妥珠单抗。

在药物组合物的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在一个方面，本发明涉及用于抑制需要此类抑制的受试者中PD-L1和CD47的生物活性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的任何上述双特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的任何上述双特异性抗体或任何上述药物组合物。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，其包括向需要此类治疗的受试者施用任何上述双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物。

在治疗方法的一些实施方案中，由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

在治疗方法的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

在治疗方法的一些实施方案中，所述化学治疗剂选自：多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在治疗方法的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是特异性结合HER2(人表皮生长因子受体2)的抗体。

在治疗方法的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗。

在治疗方法的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在一个方面，本发明涉及任何上述双特异性抗体或任何上述药物组合物用于治疗需要此类治疗的受试者中由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的用途。

在一个方面，本发明涉及任何上述双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物用于治疗需要此类治疗的受试者中由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的用途。

在用途的实施方案中，由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

在用途的实施方案中，所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

在用途的实施方案中，所述化学治疗剂选自：多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在用途的实施方案中，所述其它治疗活性化合物是特异性结合HER2(人表皮生长因子受体2)的抗体。

在用途的实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗。

在用途的实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

附图说明

图1是质粒载体pEE_HCknobLALA_VH_CD47的图谱。

图2是质粒载体pEE_CLC的图谱。

图3是质粒载体pEE_HCholeLALA_VH_PD-L1的图谱。

对于图1-3

图4是在蛋白A吸附剂上第一阶段纯化后在7.5％聚丙烯酰胺凝胶中在变性非还原条件下09-001的电泳图。

1-分子量标志物。

2-抗体09-001(10μg)。

3-抗体09-001(40μg)。

图5是在SP Sepharose HP吸附剂上纯化后在7.5％聚丙烯酰胺凝胶中在变性非还原条件下09-001的电泳图。

1-分子量标志物。

2-抗体09-001(10μg)。

3-抗体09-001(40μg)。

图6是在SP Sepharose HP吸附剂上纯化后在12％聚丙烯酰胺凝胶中在变性还原条件下09-001的电泳图。

1-分子量标志物。

2-抗体09-001(10μg)。

图7是特异性结合CD47和PD-L1的具有共同轻链的双特异性抗体的形式的示意图。

定义和一般方法

除非本文另外定义，结合本发明使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。

此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数术语，并且复数术语应包括单数术语。通常，本文描述的细胞培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、有机合成化学、医学和药物化学的目前分类和方法以及蛋白和核酸的杂交和化学是技术人员众所周知和本领域广泛使用的。酶反应和纯化方法根据制造商的指南进行，如本领域常见的或如本文所述的。

在本说明书中术语″KD″是指亲和常数(或平衡常数或平衡解离常数)，其根据Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)计算，并且表示为摩尔浓度(M)。

″结合亲和力″通常是指在分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总计强度。除非另外说明。″结合亲和力″是指固有(特有、真实)结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其结合配偶体Y的亲和力可通常表示为亲和常数(KD)。优选的Kd值是约200nM、150nM、100nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、8nM、6nM、4nM、2nM、1nM或更小。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，包括本说明书中描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原，并且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原，并且趋于保持更久结合。本领域已知多种测量结合亲和力的方法，其任何一种都可用于本发明的目的。

术语″Kd″、″koff″或″kdis″是指在结合分子和抗原之间的特定相互作用的解离速率常数。解离速率常数koff可使用生物层干涉测量法，例如使用Octet^TM系统测量。

术语″Ka″、″kon″或″on-rate″是指结合速率常数。

术语″响应″是指抗体-抗原结合信号。

如本说明书和随后的权利要求中使用的，除非上下文另外指明，词语″包括(include)″和″包含(comprise)″或其变化例如″包括(includes)″、″包括(including)″、″包含(comprises)″或″包含(comprising)″将被理解为意指包括所述的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。

发明详述

双特异性抗体

本发明涉及特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体。

根据本发明的双特异性抗体是单克隆抗体。

术语″单克隆抗体″或″mAb″是指通过单独的细胞克隆群合成和分离的抗体。

根据本发明的双特异性抗体是重组抗体。

术语″重组抗体″是指在包含编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系中表达的抗体，其中所述核苷酸序列在自然界中与所述细胞无关联。

根据本发明的双特异性抗体是分离的抗体。

根据本说明书用于描述各种抗体的术语″分离的″是指已从在其中表达抗体的细胞或细胞培养物鉴定和分离和/或回收的抗体。来自自然环境的杂质(污染物组分)是通常干扰多肽的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶解物。分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤制备。

根据本发明的双特异性抗体具有对于第一和第二抗原结合片段共同的轻链(CLC)。

图7显示特异性结合CD47和PD-L1的具有共同轻链的双特异性抗体的形式的示意图。

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3；

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3。

CD47基因的扩增和/或其蛋白的过表达已在许多癌症中被观察到，例如在选自以下的任何疾病中：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

本说明书中使用的术语″抗体″或″免疫球蛋白″(Ig)包括完整抗体。术语″抗体″是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链包含重链可变区(本说明书中简称为VH)和重链恒定区。恒定区在相同同种型的所有抗体中是相同的，但在不同同种型的抗体中是不同的。重链γ、α和δ具有由三个恒定结构域CH1、CH2和CH3(呈线性)构成的恒定区和用于增加柔韧性的铰链区(Woof J.，Burton D.，Nat RevImmunol 4，2004，pp.89-99)。在哺乳动物中，已知仅有两种类型的轻链，称为lambda(λ)和kappa(κ)。每条轻链由轻链可变区(本说明书中简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链的近似长度是211-217个氨基酸。优选地，轻链是lambda(λ)轻链，和恒定结构域CL优选是C lambda(λ)。

VL和VH区可进一步被细分为称为互补决定区(CDR)的超变区，其位于称为框架区(FR)的更保守区域之间。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。

本说明书中使用的术语抗体的″抗原结合部分″，或″抗原结合片段″，是指保留特异性结合抗原的能力的一种或多种抗体片段。已表明抗体的抗原-结合功能可由全长抗体的片段执行。如本发明中使用的，术语″抗原结合片段″意指Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，其与Fc片段单体连接。

术语″可变″是指可变结构域的某些部分的序列在抗体之间显著不同的事实。V结构域介导抗原结合和决定每种特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度内不是均匀分布的。而是，V区由通过称为″超变区″或CDR的极度可变性的较短区域分隔的15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的不变片段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个超变区连接的主要采取β片层构型的四个FR，所述超变区形成连接β片层结构的环，并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。在每条链中超变区通过FR紧密靠近保持在一起，并且与另一条链的超变区一起，促进抗体的抗原-结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest.5 thEd.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示各种效应功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。

根据本说明书的术语″超变区″是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区通常包含来自″互补决定区″或″CDR″的氨基酸残基和/或来自″超变环″的那些残基。

本申请中使用的“Kabat编号方案”或“根据Kabat编号”是指用于编号比抗体的重链和轻链的可变区的其它氨基酸残基更加可变的(即，超变的)氨基酸残基的系统(Kabatet al.Ann.N.Y.Acad.Sci.，190：382-93(1971)；Kabat et al.Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH Publication No.91-3242(1991))。

本发明的″结合″靶抗原的抗体是指以足够的亲和力结合抗原使得抗体可用作靶向蛋白或表达所述抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，并且与其它蛋白具有轻微交叉反应的抗体。根据分析方法：荧光激活细胞分选(FACS)、放射免疫测定(RIA)或ELISA，在这样的实施方案中，抗体与非靶蛋白的结合程度小于抗体与特定靶蛋白的结合的10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合特定多肽或特定靶多肽上的表位”或“与特定多肽或特定靶多肽上的表位特异性结合”或“对特定多肽或特定靶多肽上的表位是特异性的”意指与非特异性相互作用显著(可测量地)不同的结合。

特异性结合可例如通过测定与对照分子结合相比的分子结合来测量。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的另一种分子，例如过量的未标记靶标竞争来测定。在该情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则指示特异性结合。如本说明书中使用的，术语″特异性结合特定多肽或特定靶多肽上的表位″或短语″与特定多肽或特定靶多肽上的表位特异性结合″或″对特定多肽或特定靶多肽上的表位是特异性的″可通过例如分子对靶标具有至少约200nM、或至少约150nM、或至少约100nM、或至少约60nM、或至少约50nM、或至少约40nM、或至少约30nM、或至少约20nM、或至少约10nM、或至少约8nM、或至少约6nM、或至少约4nM、或至少约2nM、或至少约1nM或更大的Kd来描述。在一个实施方案中，术语″特异性结合″是指其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而不与任何其它多肽或多肽上的表位显著结合的结合。

术语″双特异性抗体″是指具有能够与单一生物分子上的两个不同表位特异性结合或能够与两个不同生物分子上的表位特异性结合的抗原结合片段的抗体。双特异性抗体在本文亦称为具有″双重特异性″或是″双重特异性″抗体。

免疫球蛋白的片段可结晶区(″Fc区、Fc″)是免疫球蛋白分子的″尾部″区域，其与细胞表面Fc受体以及补体系统的一些蛋白相互作用。这种性质允许抗体激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD同种型中，Fc区由分别源自两条重链的第二和第三恒定结构域的两个相同的蛋白片段构成。

″Fc片段单体″是指来自两条重链的任何一条的第二和第三恒定结构域的Fc区(对于IgG、IgA和IgD同种型)。

在本发明的一些实施方案中，分离的双特异性抗体包括对于第一和第二抗原结合片段共同的轻链的可变结构域，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

(a)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域；

以及第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域。

在本发明的一些实施方案中，根据本发明的双特异性抗体包括一条重链的CH3结构域，其被修饰以形成Knob；以及另一条重链的CH3结构域，其被修饰以形成Hole；或反之亦然。

″Knobs-into-holes″(″knobs-into-holes″型的相互作用)是一种能够避免与错配副产物有关的问题的方法。这种方法的目标是通过引入突变到CH3结构域中以修饰接触界面，迫使两条不同的抗体重链配对。在一条链上，大体积氨基酸被具有短的侧链的氨基酸替换，以产生″hole″。相反地，具有大的侧链的氨基酸被引入到另一个CH3结构域中以产生″knob″。相对于同型二聚体形成(″hole-hole″或″knob-knob″)，这两条重链的共表达产生高收率的异二聚体形成(″knob-hole″)(WO9627011和WO9850431，以及Merchant AM ET ALL.，An efficient route to human bispecific IgG，Nat Biotechnol.1998 Jul；16(7)：677-81)。

在本发明的一些实施方案中，双特异性抗体包括一条重链的CH3结构域，所述结构域具有氨基酸置换S354C/T366W以形成Knob；和另一条重链的CH3结构域，所述结构域具有氨基酸置换Y349C/T366S/L368A/Y407V以形成Hole。

在本发明的一些实施方案中，双特异性抗体包括一条重链的CH3结构域，所述结构域具有氨基酸置换Y349C/T366S/L368A/Y407以形成Hole；和另一条重链的CH3结构域，所述结构域具有氨基酸置换S354C/T366W以形成Knob。

在本发明的一些实施方案中，双特异性抗体包括Fc片段单体，其中进一步引入了LALA置换(L234A和L235A)。这些突变被引入以降低抗体效应子功能。

Fc片段中的上述突变根据对于抗体氨基酸链的EU编号进行编号(Edelman，G.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)，pp.78-85；Kabat，E.A.，et al.，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，(1991)。

(a)具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同轻链；

以及第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同轻链。

在本发明的一些实施方案中，特异性结合CD47和PD-L1的分离的双特异性抗体是抗体09-001。

双特异性抗体09-001包括：

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR1(Kabat)，

(ii)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR2(Kabat)，

(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR3(Kabat)；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1(Kabat)，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2(Kabat)，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3(Kabat)；

以及

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1(Kabat)，

(ii)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR2(Kabat)，

(iii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR3(Kabat)；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1(Kabat)，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2(Kabat)，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3(Kabat)。

双特异性抗体09-001包括：

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的CDR1(Chothia)，

(ii)具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的CDR2(Chothia)，

(iii)具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的CDR3(Chothia)；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1(Chothia)，

(ii)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2(Chothia)，

(iii)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3(Chothia)；

以及

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的CDR1(Chothia)，

(ii)具有SEQ ID NO：17的氨基酸序列的CDR2(Chothia)，

(iii)具有SEQ ID NO：18的氨基酸序列的CDR3(Chothia)；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的CDR1(Chothia)，

(ii)具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的CDR2(Chothia)，

(iii)具有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的CDR3(Chothia)。

双特异性抗体09-001包括：

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR1(IMGT)，

(ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR2(IMGT)，

(iii)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR3(IMGT)；

以及

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：19的氨基酸序列的CDR1(IMGT)，

(ii)具有SEQ ID NO：20的氨基酸序列的CDR2(IMGT)，

(iii)具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列的CDR3(IMGT)。

双特异性抗体09-001包括第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包含：

(a)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域；

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域；

以及第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域。

双特异性抗体09-001包括：

第一Fc片段单体，其包含重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3)，其与野生型人IgG1的CH2和CH3相比具有LALA突变(根据从链开始的顺序编号L251A、L252A(根据EU为L234A、L235A，或根据kabat为L247A、L248A))和根据从链开始的顺序编号突变S371C、T383W(根据EU为S354C、T366W或根据kabat为S375C、T389W)，

以及

第二Fc片段单体，其包含重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3)，

其与野生型人IgG1的CH2和CH3相比具有LALA突变(根据从链开始的顺序编号L240A、L241A(根据EU为L234A、L235A，或根据kabat为L247A、L248A))和根据从链开始的顺序编号突变Y355C、T372S、L374A、Y413V(根据EU为Y349C、T366S、L368A、Y407V或根据kabat为Y370C、T389S、L391A、Y438V)。

(a)具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链；

以及第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链。

双特异性抗体09-001基于来自专利文件EA201791961A1的抗体BCD106-02-001而开发，因此在实施例中将09-001与BCD106-02-001比较。将抗体BCD106-02-001的特异性结合CD47的scFv形式的抗原结合片段的序列重新克隆成Fab形式，以产生09-001。此外，对于双特异性抗体09-001，我们选择对于第一和第二抗原结合片段具有共同的轻链(CLC)的新形式。

来自专利文件EA201791961A1的抗体BCD106-02-001包括第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并以scFv形式提供；和第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并以Fab形式提供。

来自专利文件EA201791961A1的抗体BCD106-02-001包括第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包含：

(a)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域；

以及第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包含：

(a)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域。

核酸分子

在一个方面，本发明涉及编码任何上述双特异性抗体的核酸。

在任何上述实施方案中，可以分离核酸分子。

术语″核酸″、″核序列″、″核酸序列″、″多核苷酸″、″寡核苷酸″、″多核苷酸序列″和″核苷酸序列″，在本说明书中可互换使用，意指准确的核苷酸序列，其经修饰或未修饰，决定核酸的片段或区域，包含或不包含非天然核苷酸，并且是双链DNA或RNA、单链DNA或RNA、或所述DNA的转录产物。

此处还应包括的是，本发明不涉及在其天然染色体环境中，即呈天然状态的核苷酸序列。本发明的序列已被分离和/或纯化，即它们例如通过复制来直接或间接采样，它们的环境已至少部分地被改变。因此，借助于例如宿主细胞通过重组遗传学获得的或通过化学合成获得的分离的核酸也应该在此处被提及。

对核苷酸序列的提及包括其互补序列，除非另外指明。因此，对具有特定序列的核酸的提及应被理解为包括具有其互补序列的其互补链的核酸。

″分离的″核酸分子是从至少一种核酸分子杂质中鉴定和分离的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中所述核酸分子与所述核酸分子杂质结合。分离的核酸分子不同于其在天然条件下存在的形式或设置。因此，分离的核酸分子不同于在天然条件下在细胞中存在的核酸分子。

在一个方面，本发明涉及包含编码选自SEQ ID NO：1-27的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。核酸分子还可包含所述核苷酸序列的任何组合。

如本领域技术人员所理解的，因为遗传密码子的冗余性，各种不同的DNA序列可编码根据本发明的上述双特异性抗体的轻链或重链或其片段(VH、VL、CDR等)的氨基酸序列。产生编码所述氨基酸序列的这些可选的DNA序列是本领域技术人员众所周知的。这样的变体DNA序列在本发明的范围内。

在本发明的一些实施方案中，分离的核酸是DNA。

本发明的核酸分子可从产生根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体的任何来源分离。在本发明的某些实施方案中，本发明的核酸分子可以是合成的，而不是分离的。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ IDNO：28的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ ID NO：29的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ IDNO：30的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ ID NO：31的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的第一和第二抗原结合片段的轻链的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ ID NO：32的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，所述核酸是编码双特异性抗体09-001的特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的氨基酸序列的核酸，并包括具有SEQ ID NO：33的核苷酸序列。

核酸分子可用于表达根据本发明的双特异性抗体。

表达载体

在一个方面，本发明涉及包含任何上述核酸的表达载体。本发明涉及适合于表达本文所述的任何核苷酸序列的载体。

本文使用的术语″载体″意指能够转运已与它连接的另一核酸的核酸分子。在本发明的一些实施方案中，载体是质粒，即环状双链DNA段，其中可连接另外的DNA区段。在本发明的一些实施方案中，载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可连接到病毒基因组中。在本发明的一些实施方案中，载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离体哺乳动物载体)。在本发明的进一步的实施方案中，载体(例如，非游离体哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中之后可被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因一起被复制。此外，某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文被称为″重组表达载体″(或简称为″表达载体″)。

本发明涉及包含编码上述双特异性抗体或其选自以下的结构部分的上述核酸分子的载体：

如本文所述的具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域，

具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同轻链可变结构域，

具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同轻链，

具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链。

表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、植物病毒例如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、YAC、EBV衍生的游离体等。DNA分子可连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节DNA转录和翻译的预期功能。表达载体和表达控制序列可经选择与使用的表达宿主细胞相容。部分或完全编码第一和第二结合结构域(例如，重链和轻链序列，其中结合结构域包含重链和轻链序列)的序列的DNA分子可引入到单独的载体中。在一个实施方案中，所述DNA分子的任何组合被引入到相同的表达载体中。DNA分子可通过标准方法(例如，抗体基因片段和载体上互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，平端连接)引入到表达载体中。

在本发明的一些实施方案中，合适的载体是包括限制位点使得任何VH或VL序列可容易插入和表达的载体，如上所述。多聚腺苷酸化和转录终止可发生在编码区下游的天然染色体位点。重组表达载体还可编码信号肽，其利于抗体链从宿主细胞的分泌。抗体链基因可被克隆到载体中，使得信号肽在框内连接至免疫球蛋白链的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

在本发明的一些实施方案中，除了抗体链基因之外，本发明的重组载体表达可携带调节序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于例如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。在哺乳动物中对于表达宿主细胞优选的控制序列包括在哺乳动物细胞中确保高水平蛋白表达的病毒元件，例如源自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如主要晚期启动子腺病毒(AdMLP))、多瘤病毒的启动子和/或增强子，和强哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白启动子或肌动蛋白启动子。用于在细菌细胞或真菌细胞，例如酵母细胞中表达多肽的方法也是本领域众所周知的。

在本发明的一些实施方案中，除了抗体链基因和调节序列之外，本发明的重组表达载体可携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和可选择标记基因。可选择标记基因有助于选择其中已引入载体的宿主细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述载体可包括表达控制序列。本说明书中使用的术语″表达控制序列″是指为实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白分泌的序列。这样的控制序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物中，这样的控制序列通常包括核糖体结合位点的启动子和转录终止序列；在真核生物中，通常这样的控制序列包括启动子和转录终止序列。术语″控制序列″至少包括其存在对于表达和加工是必需的所有元件，并且还可包括其存在是有利的另外元件，例如前导序列和融合配偶体序列。

宿主细胞

在一个方面，本发明涉及产生用于产生任何上述双特异性抗体的宿主细胞的方法，所述方法包括用上述表达载体转化细胞。

本文使用的术语″重组宿主细胞″(或简称″宿主细胞″)是指其中已引入了重组表达载体的细胞。本发明涉及宿主细胞，其可包括例如上述根据本发明的载体。

本发明进一步涉及宿主细胞，其包括例如编码根据本发明的双特异性抗体的第一重链的核苷酸序列、编码根据本发明的双特异性抗体的共同轻链的核苷酸序列或编码根据本发明的双特异性抗体的第二重链的核苷酸序列，或所有上述三种序列。应理解，″重组宿主细胞″和″宿主细胞″不仅指特定的主题细胞，而且也指这样的细胞的子代。因为在持续传代中由于突变或环境影响可发生修饰，这样的子代实际上可能与亲本细胞不一样；然而，这样的细胞仍包括在本文使用的术语″宿主细胞″的范围内。

核酸分子包含编码上述双特异性抗体的轻链或重链的氨基酸序列的核苷酸序列，所述轻链或重链选自：

具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同轻链，

具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链。

用作宿主来转化的哺乳动物细胞系是本领域众所周知的，并包括多种可利用的永生细胞系。这些包括，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、FreeStyle 293细胞(Invitrogen)、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞和许多其它细胞系。通过确定什么细胞系具有高表达水平和提供产生的蛋白的必要特征来选择细胞系。可使用的其它细胞系是昆虫细胞系，例如Sf9或Sf21细胞。当编码上述双特异性抗体或其部分的重组表达载体被引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞足以在宿主细胞中表达根据本发明的上述双特异性抗体或其部分，或更优选地，分泌上述双特异性抗体到培养宿主细胞的培养基中的一段时间，产生上述双特异性抗体。上述双特异性抗体可使用标准蛋白纯化技术从培养基分离。植物宿主细胞包括例如，烟草(Nicotiana)、拟南芥(Arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括埃希氏菌属(Escherichia)和链霉菌属(Streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

此外，本发明的双特异性抗体从生产细胞系的产生水平可使用许多已知的技术提高。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)是用于在某些条件下提高表达的常见方法。GS系统在整体上或部分地与EP号0216846、0256055、0323997和0338841结合讨论。

本发明的双特异性抗体在不同的细胞系或宿主细胞中具有彼此不同的糖基化模式是可能的。然而，本文公开的双特异性抗体是本发明的一部分，不管结合分子的糖基化状态如何，并且一般而言，不管是否存在翻译后修饰。

上述宿主细胞不指使用人胚胎产生的宿主细胞。

上述宿主细胞不指通过修改人种系细胞的遗传完整性而产生的宿主细胞。

产生抗体的方法

在一个方面，本发明涉及产生任何上述双特异性抗体的方法，其包括在足以产生所述抗体的条件下在生长培养基中培养上述宿主细胞，如果需要的话，接着分离和纯化得到的抗体。

本发明涉及产生本发明的双特异性抗体的方法。本发明的一个实施方案涉及产生本文定义的双特异性抗体的方法，包括产生能够表达双特异性抗体的重组宿主细胞，在适合于表达双特异性抗体的条件下培养所述宿主细胞，和分离得到的双特异性抗体。通过在这样的重组宿主细胞中的此类表达产生的双特异性抗体在本文中称为″双特异性抗体″。

药物组合物

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的药物组合物，所述药物组合包含任何上述双特异性抗体。

“药物组合物”指包含本发明的抗体和选自以下组的至少一种组分的组合物，所述组包括药学上可接受的和药理学上相容的填料、溶剂、稀释剂、载体、助剂、分配剂和传感剂、递送剂例如防腐剂、稳定剂、填料、崩解剂、湿润剂、乳化剂、助悬剂、增稠剂、甜味剂、调味剂、芳化剂、抗菌剂、杀真菌剂、润滑剂和延长递送控制剂，其选择和合适的比例取决于给药的类型和方式以及剂量。助悬剂的实例是乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯、山梨糖醇和山梨糖醇醚、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶以及其混合物。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来提供针对微生物作用的防护，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸和类似化合物。组合物还可以含有等渗剂，例如糖、多元醇、氯化钠等等。组合物的延长作用可以通过减慢活性成分的吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例是用于注射的水、乙醇、多元醇及其混合物、天然油(例如橄榄油)和有机酯(例如油酸乙酯)。填料的实例是乳糖(lactose)、乳糖(milk-sugar)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸钙等等。崩解剂和分配剂的实例是淀粉、海藻酸及其盐、硅酸盐等。润滑剂的实例是硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石以及高分子量的聚乙二醇。用于活性成分(单独或与另一种活性化合物组合)的口服、舌下、经皮、眼内、肌内、静脉内、皮下、局部或直肠施用的药物组合物，可以以标准施用形式，在具有常规药物载体的混合物中施用于人和动物。合适的标准施用形式包括口服形式，例如片剂、明胶胶囊、丸剂、粉末、颗粒、口香糖和口服溶液或悬浮液；舌下和经颊施用形式；气溶胶；植入物；局部、经皮、皮下、肌内、静脉内、鼻内或眼内施用形式和直肠施用形式。

术语″赋形剂″在本文用于描述除了本发明的抗体之外的任何成分。这些是具有无机或有机性质的物质，其用于药物生产/制造中，以给药品提供必需的物理化学性质。

在一些实施方案中，所述组合物预期改善、预防或治疗可能与CD47和/或PD-L1有关的病症。

术语“由CD47和PD-L1介导的疾病或病症”是指与CD47和/或PD-L1直接或间接相关的任何疾病或病症，包括疾病或病症的病因、发展、进展、持续或病理学。

“治疗(Treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指减轻或消除生物学病症和/或至少一种其伴随症状的方法。如本文使用的，“减轻”疾病、病症或疾况意指减少疾病、病症或疾况的症状的严重性和/或发生频率。进一步地，本文对“治疗”的提及包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的提及。

在一个方面，治疗的受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。

术语″病症″是指将从用本发明的化合物治疗获益的任何病况。该定义包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所述病症的那些病理学状况。

“治疗有效量”是指在治疗期间给予的治疗剂的量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病的一种或多种症状。

本发明的药物组合物和其制备方法毫无疑问对于本领域技术人员而言是显而易见的。药物组合物应优选遵守GMP(良好生产实践)要求而制备。所述组合物可包含缓冲液组合物、张度剂、稳定剂和增溶剂。组合物的延长作用可通过减慢活性药物成分的吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶实现。合适的载体、溶剂、稀释剂和递送剂的实例包括用于注射的水、乙醇、多元醇和其混合物、油和有机酯。

术语″药学上可接受的″是指一种或多种相容的液体或固体组分，其适合于在哺乳动物，优选人中给药。

术语″缓冲液″、″缓冲液组合物″、″缓冲剂″是指一种溶液，其能够通过其酸碱共轭组分的作用抵抗pH变化，并且允许根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体的产品抵抗pH变化。一般而言，药物组合物优选具有范围为4.0-8.0的pH。使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲液溶液。

如本文使用的，术语“张度剂”、“渗透物”或“渗透剂”指可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗”药物是具有与人血相当的渗透压的药物。等渗药物通常具有约250至350mOsm/kg的渗透压。使用的等渗剂包括但不限于多元醇、糖和蔗糖、氨基酸、金属盐例如氯化钠等。

“稳定剂”指提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂或者两种或更多种赋形剂的混合物。稳定剂可以是氨基酸，例如但不限于精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如但不限于聚山梨醇酯20(商品名称：Tween 20)、聚山梨醇酯80(商品名称：Tween 80)、聚乙二醇-聚丙二醇及其共聚物(商品名称：泊洛沙姆、Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)；抗氧化剂，例如但不限于甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、单硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂例如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。

根据本发明的药物组合物是稳定的组合物。

如果在贮存温度例如2-8℃下，在指定的贮存期限过程中，活性剂保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，则药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保留物理和化学稳定性两者以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性测试结果来调整贮存期限。

根据本发明的药物组合物可以单一单位剂量或多个单一单位剂量的形式，呈即用制剂的形式生产，包装或广泛销售。本文使用的术语″单一单位剂量″是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于要在受试者中施用的活性成分的剂量，或这样的剂量的便利部分，例如这样的剂量的一半或三分之一。

根据本发明的药物组合物通常适合于作为意图通过皮肤或粘膜屏障中的缺口在人体中施用的无菌制剂经胃肠外施用，通过注射、输注和植入而绕过胃肠道。特别地，预期胃肠外施用特别包括皮下、腹膜内、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内、透皮注射或输注，以及肾透析输液技术。也可使用肿瘤内递送，例如肿瘤内注射。还预期区域灌注。优选的实施方案包括静脉内和皮下途径。

本领域公认的用于给予肽、蛋白或抗体的任何方法可合适用于根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体。

可注射制剂可没有限制地呈单位剂型来制备，包装或销售，例如在安瓿、小瓶、塑料容器、预填充注射器、自动注射装置中。胃肠外施用的制剂特别包括混悬剂、溶液剂、油基或水基乳剂、糊剂等。

在另一个实施方案中，本发明提供了胃肠外施用的组合物，包含以干燥(即粉末或颗粒)形式提供用于在施用之前与合适的基质(例如无菌无热源水)重构的药物组合物。这样的药物制剂可通过例如，冻干制备，即一个本领域称为冷冻干燥的过程，并且其包括将产品冷冻，接着从冷冻的物质中除去溶剂。

根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体也可单独，作为与合适的药学上可接受的赋形剂的混合物从吸入器，例如加压气溶胶容器、泵、喷雾器、雾化器(atomizer)或雾化器(nebulizer)，其中使用或不使用合适的抛射剂，或作为滴鼻剂或喷剂，经鼻内或通过吸入施用。

胃肠外施用的药物制剂可配制为立即释放或调节释放。调节释放药物制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。

在药物组合物的一些实施方案中，化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在药物组合物的一些实施方案中，治疗活性化合物是曲妥珠单抗。

在药物组合物的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合的化学治疗剂。

特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体的治疗用途

在一个方面，特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体用于治疗由CD47和PD-L1活性介导的病症。

在肿瘤(例如癌症)的情况下，治疗有效量的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体可减少癌细胞数量；减少初始肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减慢，优选地停止)癌细胞侵润至周围器官中；抑制(即在一定程度上减慢，优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与所述病症有关的一种或多种症状。本发明的双特异性抗体可在一定程度上阻止生长和/或杀死存在的癌细胞，其可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可例如通过评价存活、肿瘤进展时间(TTP)、肿瘤对治疗的响应率(RR)、响应持续时间和/或生活质量测量。

本文使用的涉及特异性结合CD47和PD-L 1的双特异性抗体与一种或多种其它治疗剂的用途或方法预期意指、提及并包括以下：

1)同时施用特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体和治疗剂的此类组合至需要治疗的患者，此时此类组分一起配制成基本同时释放所述组分至所述患者的单一剂型，

2)同时施用特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体和治疗剂的此类组合至需要治疗的患者，此时此类组分彼此分开配制成基本同时被所述患者服用的单独剂型，由此所述组分基本同时释放至所述患者，

3)序贯施用特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体和治疗剂的此类组合至需要治疗的患者，此时此类组分彼此分开配制成在每次施用之间以明显的时间间隔被所述患者在连续的时间服用的单独剂型，由此所述组分在明显不同时间释放至所述患者；和

4)序贯施用特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体和治疗剂的此类组合至需要治疗的患者，此时此类组分一起配制成以受控方式释放所述组分的单一剂型，由此它们在相同和/或不同的时间同时、连续或共同释放至所述患者，其中每个部分可通过相同或不同的途径施用。

特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体可在没有其它治疗性治疗的情况下，即作为独立疗法施用。

在一个方面，本发明涉及用于抑制需要此类抑制的受试者中的PD-L1和CD47生物活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的任何上述双特异性抗体。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的任何上述双特异性抗体或任何上述药物组合物。

在一个方面，本发明涉及用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用任何上述双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物。

“化学治疗剂”是可用于治疗恶性肿瘤的化学化合物。化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和脲多巴(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；乙酸原化合物(acetogenin)(例如，布拉他辛和布拉他辛酮)；8-9-四氢大麻酚(屈大麻酚/>)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康/>CPT-11(伊立替康、/>)、乙酰喜树碱、东茛菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；海绵多聚乙酰(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素(例如念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氯乙胺、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫斯汀、尼莫斯汀和雷莫斯汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如加利车霉素，例如加利车霉素γII和加利车霉素ωII(参见例如，Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素A；埃波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素D、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括/>吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星、多柔比星HCl脂质体注射剂/>多柔比星脂质体TLC D-99/>和聚乙二醇化(peglylated)多柔比星脂质体/>和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素如丝裂霉素C、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、吉西他滨替加氟/>卡培他滨/>埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟鸟苷、依诺他滨、氟尿苷；抗肾上腺素，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；乙酰葡醛酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍曲布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登木素生物碱，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；/>多糖复合物(JHS NaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生；根霉素；西索菲兰；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(例如T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；尿烷；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(″Ara-C″)；噻替哌；类紫杉烷，例如紫杉醇/>白蛋白改造的紫杉醇纳米颗粒制剂/>和多西他赛/>苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂试剂，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春花生物碱，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱/>长春新碱/>长春地辛)和长春瑞滨/>依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；甲酰四氢叶酸；诺肖林；依达曲沙；道诺霉素；甲氨蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸，包括贝沙罗汀/>双膦酸盐，例如氯膦酸盐(例如/>或/>)、依替膦酸盐/>NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐/>阿仑膦酸盐/>帕米膦酸盐/>替鲁膦酸盐/>或利塞膦酸盐/>曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，例如抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Rat、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，例如/>疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、/>疫苗和/>疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如/>)；rmRH(例如/>)；BAY439006(索拉非尼；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福新、COX-2抑制剂(例如塞来昔布或依托昔布)、蛋白体抑制剂(例如PS341)；硼替佐米/>CCI-779；替匹法尼(811577)；orafenib、ABT510；Bcl-2抑制剂，例如奥利默森钠/>匹克生琼；EGFR抑制剂(参见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下文定义)；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合，例如CHOP，即关于环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙的组合疗法的缩写，以及FOLFOX，即关于用与5-FU和甲酰四氢叶酸组合的奥沙利铂(ELOXATINTM)进行的治疗方案的缩写。

激素剂是用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的试剂。这样的试剂的实例是具有混合的激动剂/拮抗剂概况的抗雌激素，包括他莫昔芬4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬/>艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬/>曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，例如SERM3；没有激动剂特性的纯抗雌激素，例如氟维司群/>和EM800(此类试剂可以阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，增加ER转换率，和/或压制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂，例如福美坦和依西美坦/>以及非甾体芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑/>来曲唑/>和氨鲁米特)，以及其它芳香酶抑制剂包括伏氯唑/>乙酸甲地孕酮/>法曲唑、咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(/>和/>)、戈舍瑞林、布舍瑞林和曲普瑞林；性类固醇，包括孕激素，例如乙酸甲地孕酮和乙酸甲羟孕酮；雌激素，例如己烯雌酚和普力马；以及雄激素/类视黄醇，例如氟甲睾酮；全反式视黄酸和芬维A胺；奥那斯酮；抗孕激素；雌激素受体下调剂(ERD)；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；睾内酯；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或更多种的组合。

在治疗方法的一些实施方案中，化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在治疗方法的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合的化学治疗剂。

在用途的一些实施方案中，由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

在用途的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

在用途的一些实施方案中，化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

在用途的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是特异性结合HER2(人表皮生长因子受体2)的抗体。

在用途的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗。

在用途的一些实施方案中，所述其它治疗活性化合物是曲妥珠单抗和选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合的化学治疗剂。

在治疗方法的一些实施方案中，根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体与紫杉醇或多西他赛或阿霉素或其变体或与卡铂组合使用，作为一线疗法来治疗具有表达PD-L1或CD47的肿瘤的局部晚期或转移性三阴性乳腺癌(TNBC)。

在治疗方法的一些实施方案中，根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体作为单一疗法或与化学疗法，包括铂剂和5-氟尿嘧啶(5-FU)组合使用，作为一线疗法来治疗局部晚期或转移性头颈癌(HNC)。

在治疗方法的一些实施方案中，根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体与标准化学疗法和/或曲妥珠单抗组合使用，在2线或更多线标准疗法后治疗具有表达HER2或PD-L1的肿瘤的局部晚期或转移性胃癌(GS)或食管胃结合部癌。

在治疗方法的一些实施方案中，根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体与酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿西替尼或另一产品)组合使用，作为一线疗法治疗具有表达CD47的肿瘤的局部晚期或转移性肾细胞癌。

在治疗方法的一些实施方案中，根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体与化学疗法，包括铂剂和紫杉醇或其变体组合使用，作为一线疗法治疗具有表达CD47的肿瘤的局部晚期或转移性宫颈癌。

给药剂量和途径

根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体以有效治疗所述病况的量，即以实现预期的结果所需要的剂量和时间施用。治疗有效量可根据因素改变，例如治疗的具体病况，患者的年龄、性别和体重，以及根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体是作为独立治疗还是与一种或多种另外的药物或治疗组合施用。

可调整剂量方案，以提供最佳所需响应。例如，可施用单次推注，可随时间施用几个分剂量，或如治疗情况的紧迫性所指示，可按比例降低或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，以单位剂型配制胃肠外组合物是特别有利的。本文使用的单位剂型是指作为单位剂量适合于待治疗的患者/受试者的物理离散单位；每个单位包含与所需的药用载体结合的预定量的活性化合物，其经计算以产生所需治疗效果。本发明的单位剂型的规格通常由以下方面指定，并且直接取决于它们：(a)治疗剂的独特性质和要实现的具体治疗或预防效果，和(b)对于受试者中敏感性的处理，本领域中配制这样的活性化合物的固有限制。

因此，技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，剂量和给药方案根据治疗领域众所周知的方法调整。即，可容易确立最大耐受剂量，并且也可确定向患者提供可检测的治疗效果的有效量，正如用于施用每种药剂以向患者提供可检测的治疗效果的时间要求。因此，尽管在本文中例举了某些剂量和给药方案，但这些实施例绝不限制在实践本发明的实施方案中可向患者提供的剂量和给药方案。

应注意，剂量值可随要减轻的病况的类型和严重性而改变，并且可包括单次或多次剂量。此外应理解，对于任何具体的受试者，应根据个体需要和施用双特异性抗体或监管双特异性抗体施用的医疗专业人员的判断，随时间调整具体的给药方案，以及本说明书中阐述的剂量范围仅仅是示例性的，并且不意图限制要求保护的双特异性抗体的范围或实践。此外，用本发明的组合物的给药方案可基于各种因素，包括疾病类型、年龄、体重、性别、患者健康状况、病况严重性、根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体的给药途径。因此，给药方案可广泛变化，但可使用标准方法常规确定。例如，可基于药代动力学和药效学参数调整剂量，所述参数包括临床效果，例如毒性效果或实验室值。因此，本发明包括患者内剂量递增，如本领域技术人员所确定的。用于确定合适的剂量和方案的方法是本领域众所周知的，并且一旦提供本文公开的理念，其将为技术人员所理解。

上文提供了合适的给药方法的实例。

认为根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体的合适剂量范围为0.1-200mg/kg，优选0.1-100mg/kg，包括约0.5-50mg/kg，例如约1-20mg/kg。根据本发明的特异性结合CD47和PD-L1的双特异性抗体可例如以至少0.25mg/kg，例如至少0.5mg/kg，包括至少1mg/kg，例如至少1.5mg/kg，例如至少2mg/kg，例如至少3mg/kg，包括至少4mg/kg，例如至少5mg/kg，和例如达到最多50mg/kg，包括达到最多30mg/kg，例如达到最多20mg/kg，包括达到最多15mg/kg的剂量施用。给药通常以合适的时间间隔，例如一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次重复，并且只要负责的医师认为合适，其在某些情况下可按需要来增加或降低剂量。

实施例

为更好理解本发明而提供以下实施例。这些实施例仅为了说明的目的，不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。尽管为了理解清楚的目的，前面提到的发明已通过举例说明和实施例进行了详细描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导显而易见的是，在不脱离所附实施方案的精神或范围的情况下可对其进行某些变化和修饰。

材料和一般方法

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下给出：Kabat，E.A.，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991).Amino acids ofantibody chains are numbered according to EU numbering(Edelman，G.M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，et al.，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，National Institutesof Health，Bethesda，MD，(1991)。

重组DNA技术

标准方法用于操纵DNA，如Sambrook，J.et al，Molecular cloning：A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述。根据生产商的方案使用分子生物学试剂。

基因合成

所需的基因区段从通过化学合成制备的寡核苷酸制备。300-1400bp长的基因区段，其侧翼为单一限制位点，通过寡核苷酸的退火和连接组装，包括PCR扩增和随后通过限制位点克隆。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序证实。

DNA序列测定

DNA序列通过Sanger测序来测定。

DNA和蛋白序列分析和序列数据管理

Unipro的UGENE套件版本1.29和SnapGene Viewer用于序列产生、映射、分析、注释和说明。

表达载体

对于申请材料中描述的抗体的表达，应用意图抗体在原核细胞(大肠杆菌)中表达、在真核细胞(例如CHO细胞)中瞬时表达的表达质粒的变体。除了抗体表达盒，载体包含：允许所述质粒在大肠杆菌中复制的复制起点，在大肠杆菌中赋予对各种抗生素(例如，氨苄青霉素、卡那霉素)的抗性的基因。

下文描述的包含所述抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成产生，并通过连接相应的核酸区段，例如使用在相应的载体中独特的限制位点，用已知的重组方法和技术组装。亚克隆的核酸序列通过DNA测序验证。对于瞬时转染，通过从转化的大肠杆菌培养物制备质粒，制备较大量的质粒。

实施例1.基因构建体的合成

将来自候选物BCD106-02-001(EA201791961A1)的scFv形式的抗原结合片段的序列重新克隆成Fab。

为此，我们用包含限制位点的引物，产生了包含抗体的重链可变结构域的基因的PCR产物。

在Sal I/Nhe I限制位点将得到的重链可变结构域克隆到载体pEE_HCknobLALA中。

结果产生了质粒pEE_HCknobLALA_VH_CD47(图1)。

通过在pEE_HCholeLALA中在Sal I/Nhe I限制位点重新克隆可变片段，产生质粒pEE_HCholeLALA_VH_PD-L1(图3)。

第一和第二抗原结合片段的共同轻链使用质粒pEE_CLC产生(图2)。

抗体09-001使用表1所示的质粒产生。

表1.用于产生抗体09-001的质粒。

实施例2.抗体09-001的产生和纯化

全长抗体09-001在获自中国仓鼠卵巢细胞(CHO-T细胞系)的建立的细胞系细胞中产生。细胞在HyClone的补充有8mML-谷氨酰胺和1g/l Pluronic 68的无血清培养基HyCellTransFx-C中在baffled烧瓶中以150rpm在轨道培养箱摇床上在+37℃的温度、70％的湿度下和在5％CO₂的存在下培养。细胞每3-4天以0.3*10⁶个细胞/ml的密度传代。

转染前一天，来自第3天的细胞以0.9*10⁶个细胞/ml的密度接种。以1.9-2.1*10⁶个细胞/ml的浓度进行瞬时转染。RPMI-1640培养基用于制备转染混合物。在RPMI-1640种子材料的总体积的5％中，我们分别以DNA∶PEI重量比率1∶7稀释0.75μg/ml载量的质粒和转染试剂聚乙烯亚胺(PEI)。使用编码蛋白生产增强子XBP-1S的共转染载体E2.60和编码RFP的共转染载体E2.13制备混合物，每反应总DNA载量的5％。目标质粒以相等比率使用。在RPMI-1640中稀释的质粒和PEI合并，和孵育10分钟，之后将转染混合物引入至细胞。在1000mlbaffled烧瓶中在+37℃下，在5％CO₂和70％湿度的存在下以150rpm在轨道培养箱摇床上进行悬浮培养。转染后次日，将30％Trypton(最高1％浓度)和200mM L-谷氨酰胺(最高4mM)加入至细胞，在Guava流式细胞仪上测量荧光参数，通过荧光蛋白的表达评价转染效率。转染后第二天，将培养液转移至2000ml baffled烧瓶，然后加入12％Boost 4至0.4％浓度和等于接种物的体积的BalanCD GrowthA。在培养第10天取出对于抗体09-001得到的产物。将培养液体过滤通过具有0.22μm孔径的过滤器模块，然后在ForteBio上测量蛋白浓度。

抗体09-001从培养液分离和使用具有蛋白A亲和色谱吸附剂的柱纯化。将净化的培养液体以载量10-20mg蛋白/ml吸附剂通过柱，所述柱用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)预平衡。柱然后用PBS洗涤以除去非特异性结合的组分。结合的抗体使用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 3.5)洗脱。为了病毒灭活的目的，将收集的洗出液暴露于酸性pH持续30min，然后用1MTris-HCl溶液中和至pH 7.0。然后使用透析盒将蛋白转移至20mM乙酸盐缓冲液pH 5.0以在SP Sepharose HP阳离子交换吸附剂上进行另外的纯化，以除去抗体的聚集体和片段。具有吸附剂的柱用20mM乙酸盐缓冲液pH 5.0平衡。然后将抗体以载量10-20mg蛋白/ml吸附剂应用到柱上。与吸附剂结合的抗体使用20mM NaAcO+1M NaCl pH 5.0溶液在盐梯度中洗脱。纯化后，使用透析盒将蛋白转移至补充有100mM海藻糖的20mM乙酸盐缓冲液(pH 5.0)，过滤通过0.22μm Millex GP，转移至试管并在-70℃下储存。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和尺寸排阻HPLC用于监测候选物的纯度。在7.5％聚丙烯酰胺凝胶中在变性非还原条件下(图4、图5)和在12％聚丙烯酰胺凝胶中在变性还原条件下(图6)进行电泳。以蛋白载量40μg/泳道通过条带染色强度测定蛋白纯度。尺寸排阻HPLC在流动相0.05M NaH₂PO₄，0.3M NaCl pH＝7.0中进行。对于抗体09-001生产的结果显示于表2。

表2.对于抗体09-001生产的概述表。

实施例3.在Forte Bio Octet RED 384上测定抗体09-001对人CD47抗原的亲和力

抗体09-001和人CD47抗原之间的相互作用亲和力在Octet Red384仪器(ForteBio)上通过生物层干涉测量法研究。CD47-FcLama抗原用于该研究。

在AR2G生物传感器(Amine Reactive Second-Generation(AR2G)Biosensors，ForteBio)上使用蛋白(抗原)的共价固定进行研究。动力学常数实验包括以下主要步骤：激活传感器，将蛋白加载到传感器上，淬灭未反应的活化基团，记录基线，记录分析物缔合，记录解离。传感器在包含20mM EDC和10mM sNHS的水性溶液中激活300s。在乙酸钠缓冲液pH5.0中将抗原加载到生物传感器的表面上300s。对于人CD47抗原(CD47-FcLama)的加载蛋白浓度是20μg/ml。传感器表面上的未反应活性中心在1M乙醇胺水溶液pH 8.5中淬灭300s。为了检查分析物和传感器之间的非特异性相互作用，我们使用无抗原传感器(在加载步骤中，将传感器浸入乙酸钠缓冲液pH 5.0中；所有其它步骤类似于用于加载抗原的传感器的步骤)。实验的基线和所有后续步骤在动力学缓冲液中进行。在缔合步骤中(步长为300s)，将具有加载蛋白的传感器浸入具有在动力学缓冲液中制备的分析物溶液(抗体09-001)的孔中。选择如下3个浓度的抗体用于分析：68.9nM、34.4nM、17.2nM。在解离步骤中(步长为600s)，将传感器浸入具有动力学缓冲液的孔中，其中记录基线。在30℃的温度下进行测量；在所有步骤中我们使用1000rpm切向搅拌。参考传感器通过所有步骤，如用于记录分析物传染图的传感器一样，例外之处是缔合步骤-在缔合步骤中，将传感器浸入不含分析物的动力学缓冲液中(与主传感图的记录平行测量参考传感器信号)。在传感图的加工期间，从与分析物相互作用的传感器上接收的信号减去参考信号。

测量后，在含HCl(pH 1.8)的10mM甘氨酸溶液中再生传感器以除去结合的抗体(3个再生循环-5s再生，接着5s在动力学缓冲液中的中和)。然后重复基线、缔合、解离和再生步骤。如下产生总共4组传感图：再生前1组和再生后3组。发现再生对常数值没有显著影响，因此我们获得再生后的三次测量的平均值。

为了获得动力学常数的数值(kon是on/结合速率常数，kdis是解离速率常数，KD是平衡解离常数)，使用ForteBio Octet Data Analysis 9.0软件的Global Fit(选择一组kon、kdis、KD常数以分析不同浓度的数个传感图)，根据1∶1相互作用模型处理得到的传感图。结果显示在表3。

表3.在与人CD47抗原的相互作用中最终候选物的动力学分析结果。

抗体名称	KD	kon	kdis
				09-001	8.25E-08	5.98E+04	4.78E-03

结论

抗体09-001与人CD47抗原相互作用，KD值为83nM。

实施例4.在Forte Bio Octet RED 384上测定抗体09-001对人CD47抗原的亲和力

类似于实施例3中所述进行研究。获得3组传感图。通过从三次测量平均这些值获得最终kon、kdis、KD值。结果显示在表4。

表4.在与人PD-L1抗原的相互作用中抗体09-001的动力学分析结果。

抗体名称	KD	kon	kdis
				09-001	2.54E-09	3.96E+05	1.00E-03

结论

抗体09-001与人PD-L1抗原相互作用，亲和力为大约3nM。

实施例5.在Forte Bio Octet RED 384上测定抗体09-001对食蟹猴CD47抗原的亲和力

抗体09-001和食蟹猴CD47抗原之间的相互作用亲和力在Octet Red384仪器(ForteBio)上通过生物层干涉测量法来研究。食蟹猴CD47抗原(cynoCD47(ARCO)，ARCOBioSystems，目录号：CD7-C5252；食蟹猴/恒河猴CD47蛋白，Fc Tag)用于研究。

类似于实施例3中所述进行研究。获得3组传感图。通过从三次测量平均这些值，获得最终的kon、kdis、KD值。结果显示于表5。

表5.在与食蟹猴CD47抗原的相互作用中最终候选物的动力学分析结果。

抗体名称	KD	kon	kdis
				09-001	5.70E-08	9.01E+04	5.13E-03

结论

抗体09-001与食蟹猴CD47抗原(cynoCD47(ARCO))相互作用，KD值为57nM。

实施例6.在Forte Bio Octert RED 384上两种PD-L1和CD47抗原与抗体09-001之间的同时相互作用的测试

两种不同抗原(PD-L1和CD47)与09-001抗体之间的同时相互作用在Octet Red384仪器(ForteBio)上通过生物层干涉测量法研究。专有PD-L1和CD47抗原用于研究。

在AR2G生物传感器(Amine Reactive Second-Generation(AR2G)Biosensors，ForteBio)上使用蛋白(抗原)的共价固定进行研究。该实验包括以下主要步骤：将PD-L1加载到传感器上，将抗体09-001加载到具有PD-L1的传感器上，与CD47(分析物)相互作用。因此，在实验最后一步的相互作用信号在能够同时结合传感器上存在的PD-L1和溶液中存在的CD47的双特异性抗体的存在下检测。表6显示步骤(阶段)的完整列表。

表6.测试抗体09-001和两种不同抗原(PD-L1和CD47)之间的同时相互作用的实验步骤。

传感器在包含20mM EDC和10mM sNHS的水性溶液中激活300s。在乙酸钠缓冲液pH5.0中将PD-L1抗原加载到生物传感器表面上300s。用于加载的PD-L1蛋白浓度是20μg/ml。传感器表面上的未反应活性中心在1M乙醇胺水性溶液pH 8.5中淬灭300s。淬灭步骤后的所有实验步骤在动力学缓冲液中进行。将抗体09-001加载到具有固定的PD-L1的传感器上300s，抗体浓度是20μg/ml(137.7nM)。在缔合阶段(与CD47相互作用)，将传感器浸入CD47浓度为100μg/ml(1280nM)的溶液。为了测试CD47分析物的非特异性相互作用(阴性对照)，使用未加载有抗体09-001的具有固定的PD-L1的传感器(在抗体加载步骤，将传感器浸入动力学缓冲液中，所有其它步骤类似于用分析的传感器进行的那些步骤)。传感图使用ForteBioOctet Data Analysisn 9.0软件处理。与两种不同抗原的同时相互作用通过在CD47相互作用步骤结束时分析信号水平(响应参数)来测定。结果显示在表7。

表7.测试抗体09-001与两种抗原PD-L1和CD47之间的同时相互作用的实验结果。

在实验最后一步(CD47缔合)，对于抗体09-001我们观察到0.6088nm的相互作用信号，而未检出CD47结合至未加载有抗体的传感器的非特异性信号。

结论

抗体09-001证实与两种不同抗原PD-L1和CD47同时结合。

实施例7.在Forte Bio Octert RED 384上测试通过抗体09-001阻断CD47和SIRPa之间相互作用

通过抗体09-001阻断CD47和SIRPa(信号调节蛋白α)之间的相互作用在OctetRed384仪器(ForteBio)上通过生物层干涉测量法研究。专有的人CD47和SIRPα抗原用于研究。

使用在AR2G生物传感器(Amine Reactive Second-Generation(AR2G)Biosensors，ForteBio)上蛋白(抗原)的共价固定进行研究。该实验包括以下主要步骤：将SIRPa抗原加载到传感器上，测试SIRPa抗原与CD47/抗体09-001混合物(预混物)的结合。无抗体的CD47溶液用作阳性对照。相互作用的阻断通过比较预混物信号(响应)和阳性对照信号来检测。表8显示了实验步骤列表。

表8.测试通过抗体09-001阻断CD47和SIRPa之间相互作用的实验步骤。

传感器在包含20mM EDC和10mM sNHS的水性溶液中激活300s。在乙酸钠缓冲液pH5.0中将SIRPα抗原加载到生物传感器表面上600s。用于加载的SIRPa蛋白浓度是20μg/ml。为了检查分析物和传感器之间的非特异性相互作用，我们使用无抗原传感器(在加载步骤，将传感器浸入乙酸钠缓冲液pH 5.0中；所有其它步骤类似于用于加载有抗原的传感器的那些步骤)。传感器表面上的未反应的活性中心在1M乙醇胺水性溶液pH 8.5中淬灭300s。淬灭步骤后的所有实验步骤在动力学缓冲液中进行。在缔合步骤(步长是1200s)，将具有加载蛋白的传感器浸入具有分析物溶液的孔中。在缔合步骤，在动力学缓冲液中包含250nM抗体09-001和50nM CD47的溶液用作分析物。CD47浓度为50nM的溶液(分析物)用作阳性对照。在30℃的温度下进行测量；在所有步骤中我们使用1000rpm切向搅拌。如用于记录分析物传感图的传感器一样，参考传感器通过所有步骤，不同之处在于缔合步骤-在缔合步骤，将传感器浸入无分析物的动力学缓冲液中(与主传感图的记录平行测量参考传感器信号)。在传感图处理期间，从与分析物相互作用的传感器上接收的信号减去参考信号。使用ForteBioOctet Data Analysisn 9.0软件处理传感图。实验结果显示于表9。

在缔合步骤，阳性对照显示结合至SIRPa的信号为0.297nm，而包含CD47和抗体09-001的分析物显示没有结合至SIRPa的信号。

表9.测试通过抗体09-001阻断CD47和SIRPa之间的相互作用的实验结果。

结论

抗体09-001阻断CD47和SIRPa之间的相互作用。

实施例8.在Forte Bio Octert RED 384上测试通过抗体09-001阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用

通过抗体09-001阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用在Octet Red384仪器(ForteBio)上通过生物层干涉测量法研究。人PD-1和PD-L1抗原用于研究。

在AR2G生物传感器(Amine Reactive Second-Generation(AR2G)Biosensors，ForteBio)上使用蛋白(抗原)的共价固定进行研究。实验包括以下主要步骤：将PD-1抗原加载到传感器上，测试PD-1抗原与PD-L1/抗体09-001混合物(预混物)的结合。无抗体的PD-L1溶液用作阳性对照。相互作用的阻断通过比较预混物信号(响应)和阳性对照信号测定。表10显示实验步骤列表。

表10.测试通过抗体09-001阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的实验步骤。

传感器在包含20mM EDC和10mM sNHS的水性溶液中激活300s。在乙酸钠缓冲液pH5.0中将PD-1抗原加载到生物传感器表面300s。用于加载的PD-1蛋白浓度是20μg/ml。为了检查分析物和传感器之间的非特异性相互作用，我们使用无抗原传感器(在加载步骤，将传感器浸入乙酸钠缓冲液pH 5.0中；所有其它步骤类似于用于加载有抗原的传感器的那些步骤)。传感器表面上的未反应活性中心在1M乙醇胺水性溶液pH 8.5中淬灭300s。淬灭步骤后的所有实验步骤在动力学缓冲液中进行。在缔合步骤(步长是300s)，将具有加载蛋白的传感器浸入具有分析物溶液的孔中。在缔合步骤，在动力学缓冲液中包含250nM抗体09-001和50nM PD-L1的溶液用作分析物。PD-L1浓度为50nM的溶液(分析物)用作阳性对照。

在30℃的温度下进行测量；在所有步骤中我们使用1000rpm切向搅拌。如用于记录分析物传感图的传感器一样，参考传感器通过所有步骤，不同之处在于缔合步骤-在缔合步骤，将传感器浸入无分析物的动力学缓冲液(与主传感图的记录平行测量参考传感器信号)。在处理传感图期间，从与分析物相互作用的传感器上接收的信号减去参考信号。传感图使用ForteBio Octet Data Analysisn 9.0软件处理。实验结果显示在表11。在缔合步骤，阳性对照显示分析物结合至PD-1的信号(1,429nm)，而对于包含PD-L1和抗体09-001的分析物，未检出结合至PD-1的信号(0.007nm，背景信号值)。

表11.测试通过抗体09-001阻断PD1和PD-L1之间的相互作用的实验结果。

结论

抗体09-001阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用。

实施例9.检测在50℃热应力下的热稳定性

将试验样品置于恒温空气浴中并在50℃恒温48小时。加热后，将未经处理和经受应力的样品转移，用于通过具有UV检测器的尺寸排阻HPLC分析。在Agilent 1100 HPLC系统上进行色谱，在220nm和280nm的波长下进行检测。

在50℃孵育下对于09-001得到的稳定性数据显示于表12。

总体结论：样品显示高水平的热稳定性。

表12.对于抗体09-001通过SE HPLC的热稳定性检测结果。

实施例10.使用动态光散射通过蛋白聚集点检测胶体和热稳定性

为了在通过动态光散射(DLS)的研究下检测样品的聚集温度，使用Plate Reader II，从25℃逐步加热至80℃，获得在介质中粒径对温度的依赖性。结果显示在表13。

该分析研究了抗体09-001和来自EA201791961A1的抗体BCD106-02-001。

表13.BCD106-02-001和09-001的聚集点。

可得出结论，09-001显示高水平的热胶体稳定性(在20mM乙酸钠缓冲液pH＝5.0中聚集点高于60.0℃)。与09-001相比，抗体BCD106-02-001显示较低水平的热胶体稳定性。

实施例11.呈scFv-Fab形式的初始双特异性抗体和呈CLC形式的双特异性抗体(具有共同轻链的双特异性抗体)的比较。

表14显示对于抗体BCD106-02-001和09-001的比较数据。

表14.对于抗体BCD106-02-001和09-001通过SE HPLC的聚集稳定性的检测结果。

这些结果显示根据SE HPLC纯度研究，与抗体BCD106-02-001相比，抗体09-001具有更高的聚集稳定性。此外，与BCD106-02-001相比，抗体09-001具有更高的聚集温度，该事实表明相对于抗体BCD106-02-001更大的热胶体稳定性。

序列表

<110> JSC "BIOCAD"

<120> 特异性结合CD47和PD-L1的分离的双特异性抗体

<160> 35

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列CDR1(Kabat)

<400> 1

Arg Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列CDR2(Kabat)

<400> 2

Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr Thr

1 5 10 15

Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly

20

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列CDR3(Kabat)

<400> 3

Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR1(Kabat)

<400> 4

Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr Pro Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR2(Kabat)

<400> 5

Asn Thr Asn Thr Arg His Ser

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR3(Kabat)

<400> 6

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的氨基酸序列CDR1(Kabat)

<400> 7

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的氨基酸序列CDR2(Kabat)

<400> 8

Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的氨基酸序列CDR3(Kabat)

<400> 9

Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的CDR1(Chothia)氨基酸序列

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

1 5

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的CDR2(Chothia)氨基酸序列

<400> 11

Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的CDR3(Chothia)氨基酸序列

<400> 12

Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR1(Chothia)

<400> 13

Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr Pro Gly

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR2(Chothia)

<400> 14

Asn Thr Asn Thr Arg His Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR3(Chothia)

<400> 15

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的CDR1(Chothia)的氨基酸序列

<400> 16

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

1 5

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的CDR2(Chothia)的氨基酸序列

<400> 17

Ser Trp Ser Gly Ser Asn

1 5

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的可变重链结构域的CDR3(Chothia)的氨基酸序列

<400> 18

Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR1(IMG)

<400> 19

Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile Asn Tyr

1 5

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR2(IMG)

<400> 20

Asn Thr Asn

1

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列CDR3(IMG)

<400> 21

Ala Leu Tyr Met Gly Asn Gly Gly His Met

1 5 10

<210> 22

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

50 55 60

Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr

100 105 110

Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser

130

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 23

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile

20 25 30

Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Asn

85 90 95

Gly Gly His Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 24

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 25

<211> 464

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的氨基酸序列

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Glu Asp Ser Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Thr Glu Thr

50 55 60

Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Asp Tyr Tyr Cys Thr Thr

100 105 110

Tyr Glu Cys Gln His Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

130 135 140

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

145 150 155 160

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

165 170 175

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

180 185 190

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

195 200 205

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

210 215 220

Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

225 230 235 240

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 26

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一和第二抗原结合片段的共同轻链的氨基酸序列

<400> 26

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Thr Val Thr Ala Ile

20 25 30

Asn Tyr Pro Gly Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Ser Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Tyr Met Gly Asn

85 90 95

Gly Gly His Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 27

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的氨基酸序列

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Ser Trp Ser Gly Ser Asn Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Leu Leu Leu Ala Met Thr Phe Gly Val Gly Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Gly Pro Gly Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

225 230 235 240

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 28

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列的核酸

<400> 28

caagtacagt tggtagagtc tggaggtgga ttagtgcagc ccggagggag cctgcgattg 60

tcatgtgccg caagcggttt caccttctcc cgctattgga tgtattgggt tagacaggct 120

cctgggaagg gtcttgagtg ggtttcctcc atcgaggact cttcaattaa cacaggagga 180

gggacggaaa caacttacta cactgatagc gtgaaaggac ggtttaccat ctctcgcgac 240

aacgcgaaga acaccttata cctccagatg aattccctca gggcagaaga caccgcagtc 300

tattattgcg ctaaagggga ctactactgc accacatatg agtgtcagca ctattatggc 360

atggattatt ggggccaagg tactacagtg actgtttcga gt 402

<210> 29

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagactgtgg tgacccagga gccatccctg tcagtgtctc caggagggac ggtcaccctc 60

acctgcggcc tcagttctgg gactgtcact gccattaact accctggttg gtaccagcag 120

acgccaggcc aggctccccg aacccttatc tacaacacaa acacccgaca ctccggcgtc 180

cccgatcgct tctccggatc catctctggt aacaaagccg ccctcaccat cacaggagcc 240

caggccgagg acgaggccga ctattactgt gctctgtaca tgggtaatgg tggccacatg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

<210> 30

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的可变结构域的氨基酸序列的核酸

<400> 30

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgaggc ctggtgggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagctgga gtggtagtaa cacaaactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccctgt atcactgtgc aagagccccc 300

ttgctcctgg ctatgacttt tggggttggt tcctggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 31

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链的氨基酸序列的核酸

<400> 31

caagtacagt tggtagagtc tggaggtgga ttagtgcagc ccggagggag cctgcgattg 60

tcatgtgccg caagcggttt caccttctcc cgctattgga tgtattgggt tagacaggct 120

cctgggaagg gtcttgagtg ggtttcctcc atcgaggact cttcaattaa cacaggagga 180

gggacggaaa caacttacta cactgatagc gtgaaaggac ggtttaccat ctctcgcgac 240

aacgcgaaga acaccttata cctccagatg aattccctca gggcagaaga caccgcagtc 300

tattattgcg ctaaagggga ctactactgc accacatatg agtgtcagca ctattatggc 360

atggattatt ggggccaagg tactacagtg actgtttcga gtgctagcac caagggccca 420

tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 480

tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 540

accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 600

agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 660

cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 720

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcagggg gaccgtcagt cttcctcttc 780

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 840

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 900

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 960

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1020

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1080

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 1140

agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1200

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1260

ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1320

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1380

tccccgggta aa 1392

<210> 32

<211> 648

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码第一和第二抗原结合片段的共同轻链的氨基酸序列的核酸

<400> 32

cagactgtgg tgacccagga gccatccctg tcagtgtctc caggagggac ggtcaccctc 60

acctgcggcc tcagttctgg gactgtcact gccattaact accctggttg gtaccagcag 120

acgccaggcc aggctccccg aacccttatc tacaacacaa acacccgaca ctccggcgtc 180

cccgatcgct tctccggatc catctctggt aacaaagccg ccctcaccat cacaggagcc 240

caggccgagg acgaggccga ctattactgt gctctgtaca tgggtaatgg tggccacatg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctccgtcact 360

ctgttccctc cctcctctga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcatc 420

agtgacttct accctggagc cgtgacagtg gcttggaaag cagatagcag ccccgtcaag 480

gccggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc tgccagcagc 540

tatctgagcc tgacccctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648

<210> 33

<211> 1359

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链的氨基酸序列的核酸

<400> 33

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtgaggc ctggtgggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacttttgat gattatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagat attagctgga gtggtagtaa cacaaactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccctgt atcactgtgc aagagccccc 300

ttgctcctgg ctatgacttt tggggttggt tcctggggcc aggggaccct ggtcaccgtc 360

tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc tgtccttcag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccaaat cttgtgacgg tcctggaggc acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc 720

gcagggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtgcaccct gcccccatcc 1080

cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtcctgcg ccgtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct cccgggaaa 1359

<210> 34

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体BCD106-02-001特异性结合CD47的第一抗原结合片段的轻链的可变结构域的氨基酸序列

<400> 34

Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Val

1 5 10 15

Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Asn

35 40 45

Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100

<210> 35

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗体BCD106-02-001特异性结合CD47的第一抗原结合片段的轻链的氨基酸序列

<400> 35

Glu Leu Thr Gln Pro Ser Ala Val Ser Val Ser Leu Gly Gln Thr Val

1 5 10 15

Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Ile Glu Asn Tyr Tyr Thr Ser Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Asn

35 40 45

Ala Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

50 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Ser Ser Thr Glu Asn Ile Phe Gly

85 90 95

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala

115 120 125

Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val

130 135 140

Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr

145 150 155 160

Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu

165 170 175

Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln

180 185 190

Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu

195 200 205

Cys Ser

210

Claims

1.一种分离的双特异性抗体，其特异性结合CD47和PD-L1并包括：

1)第一抗原结合片段，其特异性结合CD47并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3；

2)第二抗原结合片段，其特异性结合PD-L1并包括：

(a)重链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的CDR3；和

(b)共同的轻链可变结构域，其包含：

(i)具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的CDR1，

(ii)具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的CDR2，

(iii)具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的CDR3。

2.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其特征在于特异性结合CD47的第一抗原结合片段是与Fc片段单体结合的Fab。

3.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其特征在于特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段是与Fc片段单体结合的Fab。

4.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是全长IgG抗体。

5.根据权利要求4所述的分离的双特异性抗体，其中所述全长IgG抗体具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。

6.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链可变结构域包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链可变结构域包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合片段的共同的轻链的可变结构域包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，

其中特异性结合CD47的第一抗原结合片段包括：

(a)具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域；

其中特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段包括：

(a)具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的重链可变结构域，

(b)具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列的共同的轻链可变结构域。

10.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中特异性结合CD47的第一抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。

11.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段的重链包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其中第一和第二抗原结合片段的共同的轻链包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。

13.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，

其中特异性结合CD47的第一抗原结合片段包括：

(a)具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链；

其中特异性结合PD-L1的第二抗原结合片段包括：

(a)具有SEQ ID NO：27的氨基酸序列的重链，

(b)具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的共同的轻链。

14.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体，其是二价抗体。

15.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体。

16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述核酸是DNA。

17.一种表达载体，其包含根据权利要求15-16中任一项所述的核酸。

18.一种用于产生宿主细胞以产生根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体的方法，包括通过根据权利要求17所述的表达载体转化所述细胞。

19.一种用于产生根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体的宿主细胞，其包含根据权利要求15-16中任一项所述的核酸。

20.一种用于产生根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体的方法，包括在培养基中在足以产生所述抗体的条件下培养根据权利要求19所述的宿主细胞，如果需要的话，接着分离和纯化得到的抗体。

21.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。

22.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自：多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合；其中所述抗体是曲妥珠单抗；其中所述组合是曲妥珠单抗和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。

25.一种用于抑制需要此类抑制的受试者中PD-L1和CD47的生物活性的方法，包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体。

26.根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求22-24中任一项所述的药物组合物，其用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的用途。

27.用于根据权利要求30所述的用途的根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求22-24中任一项所述的药物组合物，其中由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

28.根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体或根据权利要求22-24中任一项所述的药物组合物用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的用途。

29.根据权利要求28所述的用途，其中由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

30.根据权利要求1-14中任一项所述的双特异性抗体和至少一种其它治疗活性化合物用于治疗由PD-L1和CD47介导的疾病或病症的用途。

31.根据权利要求30所述的用途，其中由PD-L1和CD47介导的疾病或病症选自：三阴性乳腺癌(TNBC)、头颈癌(HNC)、胃癌(GC)、食管胃结合部癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、急性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征、高微卫星不稳定性恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌。

32.根据权利要求30-31中任一项所述的用途，其中所述其它治疗活性化合物是抗体、化学治疗剂、激素治疗剂或其任何组合。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述化学治疗剂选自：多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合；其中所述抗体是曲妥珠单抗；其中所述组合是曲妥珠单抗和化学治疗剂，所述化学治疗剂选自多西他赛、紫杉醇、阿霉素、铂剂、卡铂、5-氟尿嘧啶、酪氨酸激酶抑制剂、阿西替尼、脂质体阿霉素、脂质体紫杉醇或其任何组合。