KR20200059281A - 트랜스타이레틴 면역글로불린 융합 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항체 및 항체 단편, 예컨대, Fab의 이량체화 및 사량체화에 유용한 트랜스타이레틴(TTR) 융합에 관한 것이다. 본원에 기재된 TTR 융합 단백질은 항체 결합능을 증가시키고 항원 클러스터링을 향상시키는 데 특히 유용하다. 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 질병을 치료하기 위한 방법이 본원에 기재된다.

Description

트랜스타이레틴 면역글로불린 융합
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 본원에 참조로 포함되는 2017년 10월 4일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/568,217호에 대해 35 U.S.C. 119(e) 하에 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 항체 및 항체 단편, 예컨대, Fab의 이량체화 및 사량체화에 유용한 트랜스타이레틴(transthyretin: TTR) 융합에 관한 것이다. 본원에 기재된 TTR 융합 단백질은 항체 결합능을 증가시키고 항원 클러스터링을 향상시키는 데 특히 유용하다. 본 발명의 융합 단백질을 사용하여 질병을 치료하기 위한 방법이 본원에 기재된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ePCT를 통해 전자 형식으로 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2018년 10월 2일 생성되고 크기가 69,791 바이트인 A-2196-WO-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt로 명명된 텍스트 파일로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에서의 정보는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
트랜스타이레틴(TTR)은 레티놀 결합 단백질의 혈청 반감기를 향상시킬 뿐만 아니라 순환 티록신의 일부를 운반하는 역할을 하는 비-공유 사량체성 인간 혈청 및 뇌 척수액 단백질이다. 본래의 인간 단량체는 14 kDa의 근사 분자량을 갖지만, TTR은 전형적으로 56 kDa의 사량체성 혈청 단백질로서 존재한다.
TTR 및 TTR 변이체는 종래에 생물학적 활성제에 이러한 작용제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 융합되었다. 예를 들어, 단독의 생물학적 활성제에 비해 증가된 혈청 반감기를 입증한 TTR-(또는 TTR 변이체-) 생물학적 활성제 융합 및 PEG-TTR-(또는 PEG-TTR 변이체-) 생물학적 활성제 융합의 실질적으로 동형인 제제가 개발되었다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 US20030191056호를 참조하라.
또한, 단백질을 다량체화시키고자 한 종래의 노력으로는 스트렙트아비딘(Kipriyanov et al., Protein Engineering, 9(2):203-211 (1996)), 헬릭스-턴-헬릭스 작제물(Kriangkum et al., Biomolecular Engineering, 18:31-40 (2001)), 류신 지퍼(Kruif et al., The Journal of Biological Chemistry, 271(13):7630-7634, 1996 (1996)), 바르나제/바르스타 복합체(Deyev et al., Nature Biotechnology, 21(12):1486-1492 (2003)), 및 Dock N Lock 기법(단백질 키나제 및 A-키나제 고정형 단백질 고정 도메인 상호작용)(Goldenberg et al., Journal of Nuclear Medicine, 49(1):158-163 (2008))의 이용이 포함된다.
그러나, 향상된 생물학적 및 치료학적 성질을 입증한 다량체화된 단백질, 예컨대, 다량체화된 전체 항체 및 항체 단편(예를 들어, Fab)에 대한 요구가 여전히 존재한다. 예를 들어, 비-다량체화된 대응물에 비해 증가된 항체 결합능 및 향상된 항원 클러스터링을 갖는 다량체화된 단백질에 대한 요구가 여전히 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 두 개의 항원 결합 단백질을 포함하는 동종이량체 융합 단백질로서, 항원 결합 단백질은 단백질 복합체에 연결되는 동종이량체 융합 단백질에 관한 것이다. 특정 양태에서, 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체이다. 특정 양태에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 또 다른 특정 양태에서, 항원 결합 단백질은 단백질 복합체에 링커 없이 직접적으로 융합된다. 또 다른 특정 양태에서, 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 직접적으로 융합된다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 링커를 통해 단백질 복합체에 융합된다. 다른 구현예에서, 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 연결된다. 링커는 아미노산 링커, 예컨대, 1개 내지 20개의 아미노산 길이인 아미노산 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노산 링커는 GGGGS, (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)5, 또는 (GGGGS)6이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 네 개의 항원 결합 단백질을 포함하는 동종사량체 융합 단백질로서, 항원 결합 단백질은 단백질 복합체에 연결되는 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다. 일 양태에서, 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체이다. 또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 항원 결합 단백질은 Fab일 수 있다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 상기 단백질 복합체에 링커 없이 직접적으로 융합된다. 특정 구현예에서, 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 직접적으로 융합된다. 다른 구현예에서, 항원 결합 단백질은 링커를 통해 상기 단백질 복합체에 융합된다. 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 링커, 예컨대, 1개 내지 20개의 아미노산 길이인 아미노산 링커이다. 특정 구현예에서, 아미노산 링커는 GGGGS, (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)5, 또는 (GGGGS)6이다.
본 발명은 또한 상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 사용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 암의 치료에서 상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)에 관한 것이다. 그러한 핵산을 포함하는 발현 벡터가 또한 고려되며, 본원에서 논의된 핵산 및/또는 백터를 포함하는 재조합 숙주 세포도 마찬가지로 고려된다. 특정 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, E5 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장(COS) 세포, 인간 간세포 암종 세포, 또는 인간 배아 신장 293(HEK 293) 세포이다.
상기 논의된 임의의 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 제조하는 방법은 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 방법은 a) 청구항 제32항 또는 제33항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 상기 배양물로부터 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1. 도 1은 본 발명의 동종다량체 작제물의 개략도이다. 도 1a는 예시적인 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질이고, 여기서 둘 모두의 항체 중쇄의 C-말단은 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결된다. 도 1b는 예시적인 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질이고, 여기서 각 항체 C-말단의 두 개의 중쇄 중 하나는 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결된다. "+" 및 "-" 부호는 전체 항체 당 하나의 TTR 서브유닛의 일관된 부착을 가능하게 하는 Fc 전하 쌍을 나타낸다. 도 1c는 예시적인 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질이고, 여기서 각 Fab 단편의 C-말단은 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결된다. 각각의 도 1a 내지 도 1c는 중쇄와 TTR 간의 선택적인 링커를 나타낸다.
도 2. 도 2는 링커 부재 및 다양한 링커 길이를 갖는 항-CB1 TTR 항체 동종이량체(도 2a), 링커가 없는 항-CB1 TTR 항체 동종사량체(도 2b), 및 링커가 없는 항-CB1 TTR Fab 동종사량체 단백질(도 2c)이 각각 HEK 293 세포에서 강하게 발현된다는 것을 입증하는 일련의 SDS-PAGE 겔이다. 도 2는 실시예 2에서 추가로 논의된다.
도 3. 도 3은 링커 부재, (G4S) 링커, (G4S)2 링커, (G4S)3 링커, 또는 (G4S)4 링커를 갖는 항-CB1 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질의 일련의 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석이다. 도 3은 실시예 2에서 추가로 논의된다.
도 4. 도 4는 TTR 항-CB1 항체 동종사량체 및 TTR 항-CB1 Fab 동종사량체 융합 단백질이 모 CB1 Ab에 비해 EC50을 개선한다는 것을 나타낸다. 도 4는 실시예 3에서 추가로 논의된다.
도 5. 도 5는 항-GITR TTR 항체 동종이량체(레인 1), 항-GITR TTR 항체 동종사량체(레인 2), 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 단백질(레인 3)이 각각 HEK 293 세포에서 발현된다는 것을 입증하는 SDS-PAGE 겔이다. 레인 4 내지 레인 7은 항-디니트로페닐(항-DNP) 항체이다. 도 5는 실시예 4에서 추가로 논의된다.
도 6. 도 6은 항-GITR TTR 항체 동종이량체(레인 1 및 레인 4), 항-GITR TTR 항체 동종사량체(레인 2 및 레인 5), 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 단백질(레인 3 및 레인 6)이 비-가열, 비-환원 레인을 기반으로 제대로 조립된다는 것을 입증하는 SDS-PAGE 겔이다. 가열 및 환원 시, 세 개의 단백질 융합 작제물은 이들의 예상된 구성 사슬(상단 밴드(들)는 중쇄이고 최하단 밴드는 경쇄임)로 분해된다. 도 6는 실시예 4에서 추가로 논의된다.
도 7. 도 7은 각각의 항-GITR TTR 항체 동종이량체(중앙 피크), TTR 항체 동종사량체(좌측 피크), 및 TTR Fab 동종사량체(우측 피크) 융합 단백질의 HPLC SEC 분석이다. 도 7는 실시예 4에서 추가로 논의된다.
도 8. 도 8은 항-GITR TTR 모 mAb("1"), 항-GITR TTR 항체 동종사량체("2"), 항-GITR TTR Fab 동종사량체("3"), 및 항-GITR TTR 항체 동종이량체("4") 융합 단백질의 시차 주사 열량계(differential scanning calorimetry: DSC) 분석이다. 도 8은 TTR 융합 단백질의 용융 온도가 모 Ab와 비슷하거나 이보다 우수하다는 것을 입증하는데, 이는 형성된 TTR 융합 단백질이 강성이라는 것을 지시한다.
도 9. 도 9의 a)는 전체 항-GITR 항체 종의 생체내 (마우스) 약동학적(PK) 분석의 결과이다. 도 9의 b)는 원형 항-GITR TTR 융합 단백질의 생체내 (마우스) PK 분석의 결과이다.
도 10. 도 10의 a)는 항-GITR TTR Fab 동종사량체("2"), 항-GITR TTR 항체 동종이량체("3"), 및 항-GITR TTR 항체 동종사량체("4") 융합 단백질의 결합 친화성이 모 항-GITR mAb("1")보다 우수하다는 것을 입증한다. 도 10의 b)는 더 높은 친화성이 세포 기반 검정에서 더 높은 효능을 의미하는 것이 아님을 입증한다.
도 11. 도 11은 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체(1) 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체(2) 단백질 각각이 포유동물 세포에서 잘 발현되고 제대로 조립된다는 것을 입증하는 일련의 SDS-PAGE 겔이다.
도 12. 도 12는 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체가 CHO-K1 세포에서 잘 발현되고 제대로 조립된다는 것을 입증하는 일련의 SDS-PAGE 겔이다.
도 13. 도 13은 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 및 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체가 비-가열, 비-환원 레인을 기반으로 제대로 조립된다는 것을 입증하는 일련의 SDS-PAGE 겔이다. 가열 및 환원 시, 분자는 이들의 예상된 구성 사슬(상단 밴드(들)는 중쇄이고 최하단 밴드는 경쇄임)로 분해된다.
도 14. 도 14는 각각의 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체(중앙 크로마토그램), TTR 항체 동종사량체(우측 크로마토그램), 및 TTR Fab 동종사량체(좌측 크로마토그램) 융합 단백질의 HPLC SEC 분석이다.
도 15. 도 15의 a)는 전체 항-TRAILR2 항체 종의 생체내 (마우스) PK 분석의 결과이다. 도 15의 b)는 원형 항-TRAILR2 TTR 융합 단백질의 생체내 (마우스) PK 분석의 결과이다.
도 16. 도 16은 WM35 세포 사멸 검정에서 모 mAb(코나투무맙(conatumumab))와 비교한 항-TRAILR2 TTR 융합 단백질의 효능을 나타낸 것이다.
도 17. 도 17은 일차 인간 케라티노사이트 세포 사멸 검정에서 모 mAb(코나투무맙; ("1"))과 비교한 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("2") 및 TTR 항체 동종사량체("3")의 효능을 나타낸 것이다.
도 18. 도 18은 뮤린 colo205 모델에서 모 mAb(코나투무맙)와 비교한 종양 성장을 억제하는 항-TRAILR2 TTR 융합 단백질의 능력을 나타낸 것이다.
도 19. 도 19는 뮤린 SW403 모델에서 모 mAb(코나투무맙)과 비교한 종양 성장을 억제하는 항-TRAILR2 TTR 융합 단백질의 능력을 나타낸 것이다.
도 20. 도 20은 뮤린 colo205 모델 마우스 및 뮤린 SW403 모델 마우스의 체중이 시험된 모든 화합물에 대하여 유사하다는 것을 나타낸다.
상세한 설명
본원에서 사용된 표제 부문은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 연관하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 추가로, 달리 문맥상 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수를 포함하고, 복수형 용어는 단수를 포함할 것이다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 연관하여 사용되는 명명, 및 이들의 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 흔히 사용되는 것들이다. 본 출원의 방법 및 기술은 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 및 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바와 같은 그리고 당업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), 및 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조하라. 효소 반응 및 정제 기술은, 당업계에서 흔히 완수되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이, 제조업체의 설명에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 제약 화학과 연관하여 사용되는 용어, 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당업계에서 흔히 사용되고 잘 알려진 것들이다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달 및 환자의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않고, 그와 같이 달라질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하려는 목적을 위한 것이지, 개시된 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니며, 이는 오로지 청구항에 의해서만 한정된다.
작업 실시예 이외에, 또는 달리 지시되지 않는 경우, 본원에서 사용되는 성분 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"으로 변형된 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 연관하여 사용될 때 ±1%를 의미할 수 있다.
본원에서 특정 단락에 의해 규정된 변화보다 임의의 방식으로 범위가 더 좁은 모든 구현예는 본 개시에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 소정의 양태는 속으로 기재되며, 속의 모든 일원이 개별적으로 구현예일 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 속으로 기재되거나 속의 일원을 선택하는 양태는 속의 둘 이상의 일원의 조합을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 명세서에서 다양한 구현예가 "~을 포함하는" 표현을 이용하여 제시되지만, 다양한 상황 하에, 관련된 구현예가 또한 "~로 이루어지는" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는" 표현을 이용하여 기재될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는", 뿐만 아니라 "포함하다" 및 "포함되는"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, "요소" 또는 "구성요소"와 같은 용어는 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 구성요소와 하나보다 많은 서브유닛을 포함하는 요소 및 구성요소 둘 모두를 포괄한다.
정의
"아미노산"은 당업계에서의 이의 표준 의미를 포함한다. 20개의 자연-발생 아미노산 및 이의 약어는 통상적인 용법을 따른다. 예를 들어, 임의의 목적 상 본원에 참조로 포함되는 문헌[Immunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub and D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)]을 참조하라. 20개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대, [알파]-, [알파]-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 폴리펩타이드에 적합한 구성요소일 수 있으며, 문구 "아미노산"에 포함된다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-하이드록시프롤린, [감마]-카복시글루타메이트, [엡실론]-N,N,N-트리메틸라이신, [엡실론]-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀레티오닌, 3-메틸히스틴, 5-하이드록시라이신, [시그마]-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에서 사용되는 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 용법 및 규칙에 따라 좌측 방향은 아미노산 말단 방향이고, 우측 방향은 카복실-말단 방향이다.
본원에서 사용되는 "길항제"는 일반적으로, 항원을 결합하고, 항원과 관련된 생물학적 신호를 억제하거나, 감소시키거나, 없앨 수 있는 분자, 예를 들어 본원에 제공된 바와 같은 항원 결합 단백질을 지칭한다.
용어 "항체"는 표적 항원에 결합하는 데 있어서 온전한 항체와 경쟁할 수 있는 임의의 아이소타입, 또는 이의 단편의 면역글로불린을 지칭한다. "항체"는 일종의 항원 결합 단백질이다. 용어 "항체"는 단클론성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 항체는 임의의 아이소타입/클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 또는 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 적어도 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함한다. 다른 구현예에서, 항체는 중쇄만 포함할 수 있는 낙타과에서 자연적으로 발생하는 항체와 같이 더 작은 사슬을 포함한다. 항체는 단일 공급원으로부터만 유래될 수 있거나, 이하에 추가로 기재되는 바와 같이 항체의 상이한 부분이 두 개의 상이한 항체로부터 유래되는 "키메라"일 수 있다. 항원 결합 단백질, 항체, 또는 결합 단편은, 예를 들어, 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
용어 "항원"은, 결합제, 예컨대, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 포함)에 의해 결합될 수 있고, 추가로 그러한 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 상이한 항원 결합 단백질, 예를 들어 항체와 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 지닐 수 있다.
본원에서 사용되는 "항원 결합 단백질"은 특정 표적 항원을 특이적으로 결합하는 임의의 단백질을 의미한다. 이 용어는 적어도 하나의 항원 결합 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 용어는 또한 적어도 두 개의 전장 중쇄 및 두 개의 전장 경쇄를 포함하는 항체뿐만 아니라 이의 유도체, 변이체, 단편, 및 돌연변이를 포괄한다. 항원 결합 단백질은 또한, 이하에서 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 도메인 항체, 예컨대, Nanobodies® 및 단쇄 항체를 포함한다.
"항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 도메인"은 분자(예를 들어, 항원) 상의 주어진 에피토프 또는 부위에 특이적으로 결합하거나, 이와 상호작용하거나, 이를 인식하는 단백질의 부분, 예컨대, 항체 또는 이의 단편, 유도체, 또는 변이체를 의미한다. 예를 들어, 항원과 상호작용하고 항원 결합 단백질에 항원에 대한 이의 특이성 및 친화성을 부여하는 아미노산 잔기를 함유하는 항원 결합 단백질의 부분은 "항원 결합 영역"으로 지칭된다. 항원 결합 영역은 하나 이상의 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)"("CDR")을 포함할 수 있다. 특정 항원 결합 영역은 또한 하나 이상의 "프레임워크" 영역을 포함한다. "프레임워크" 영역은 항원 결합 단백질의 특이적 결합에 직접적으로 기여할 수 있지만, 전형적으로 항원 결합 영역과 항원 간의 결합을 증진시키도록 CDR의 적절한 입체구조를 유지시키는 데 도움을 줄 수 있다.
용어 "암", "종양", "암성", 및 "악성"은 비조절된 세포 성장을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 선암종, 림프종, 아세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 포함하는 암종을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 흑색종, 폐암, 두경부암, 신장 세포 암, 결장암, 대장암, 편평 세포 암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 췌장암, 교아종, 신경교종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 예컨대, 간암종 및 간종양, 방광암, 유방암, 자궁내막 암종, 골수종(예컨대, 다발성 골수종), 침샘 암종, 신장암, 예컨대, 신세포 암종 및 빌름스 종양, 기저 세포 암종, 전립선 암, 외음암, 갑상선 암, 고환암, 및 식도암을 포함한다.
용어 "CDR" 및 이의 복수형 "CDR들"("극가변 영역(hypervariable region)"으로도 지칭됨)은 단백질, 예컨대, 항체 또는 이의 단편, 유도체, 또는 변이체의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 각각은 세 개의 CDR들을 함유한다. 예를 들어, 경쇄 가변 영역은 다음 CDR들을 함유한다: CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3. 중쇄 가변 영역은 다음 CDR들을 함유한다: CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3. CDR들은 항원과 항체의 특이적 상호작용을 담당하는 대부분의 잔기를 함유하고, 그에 따라서 항체 분자의 기능적 활성에 기여한다. CDR들은 항원 특이성의 주요 결정기이다.
정확한 정의상 CDR 경계 및 길이는 상이한 분류 및 넘버링 시스템에 따른다. 그러므로, CDR은 본원에 기재된 넘버링 시스템을 포함하여 카밧(Kabat), 코티아(Chothia), 콘택트(contact) 또는 임의의 다른 경계 정의에 의해 지칭될 수 있다. 카밧 넘버링 체계(시스템)는 일관성 있는 방식으로 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하기 위해 널리 채택되는 표준이며, 본원의 다른 곳에도 언급되는 바와 같이, 본 발명에 적용되는 바람직한 체계이다. 추가 구조적 고려사항이 또한 항체의 정규형 구조를 결정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 카밧 넘버링에 의해 충분히 반영되지 않은 그러한 구별들이 코티아 등의 넘버링 시스템에 의해 기재되고/기재되거나 다른 기법, 예를 들어, 결정학 및 2-차원 또는 3-차원 산출 모델링에 의해 밝혀질 수 있다. 상이한 경계에도 불구하고, 각각의 이러한 시스템들은 가변 서열 내에서 CDR을 구성하는 것에 어느 정도 공통점을 갖는다. 따라서, 이러한 시스템들에 따른 CDR 정의는 인접한 프레임워크 영역에 관한 길이 및 경계 영역에 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, 카밧(교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법), 코티아(항원-항체 복합체의 결정학 연구에 기초한 접근법), 및/또는 맥칼럼(MacCallum)(Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. MoI. Biol, 1987, 196: 901-917; 및 MacCallum et al., J. MoI. Biol, 1996, 262: 732)을 참조하라. 항원 결합 부위를 특징으로 하기 위한 추가의 또 다른 표준은 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용되는 AbM 정의이다. 예를 들어, 문헌[Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)]을 참조하라. 항체 구조에 대한 보고의 경우, 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988]을 참조하라.
전형적으로, CDR은 정규형 구조로 분류될 수 있는 루프 구조를 형성한다. 용어 "정규형 구조"는 항원 결합(CDR) 루프에 의해 채택되는 주 사슬 입체구조를 지칭한다. 비교 구조 연구로부터, 6개의 항원 결합 루프 중 5개가 이용 가능한 입체구조의 제한된 레퍼토리만을 갖는 것으로 밝혀졌다. 각각의 정규형 구조는 폴리펩타이드 골격의 비틀림 각을 특징으로 할 수 있다. 따라서, 항체들 간에 대응하는 루프는 대부분의 루프에서 높은 아미노산 서열 가변성에도 불구하고 매우 유사한 3차원 구조를 가질 수 있다(Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. MoI. Biol, 1996, 263: 800). 게다가, 채택된 루프 구조와 이를 둘러싼 아미노산 서열 사이에는 연관성이 있다. 특정 정규형 부류의 입체구조는 루프의 길이 및 루프 내 주요 위치에서뿐만아니라 보존된 프레임워크 내에(즉, 루프의 외부에) 존재하는 아미노산 잔기에 의해 결정된다. 따라서, 이러한 주요 아미노산 잔기의 존재를 기초로 하여 특정 정규형 부류에 대한 할당이 이루어질 수 있다.
용어 "경쟁하다"는, 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)의 문맥에서 사용될 때, 항원 결합 단백질 간의 경쟁을 의미하며, 시험 하에 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편)이 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 막거나 억제하는 검정에 의해 결정된다. 다수 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어, 고상 직접 또는 간접 방사성면역검정(radioimmunoassay: RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역검정(enzyme immunoassay: EIA), 샌드위치 경쟁 검정(예를 들어, 문헌[Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고상 직접 비오틴/아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619] 참조) 고상 직접 표지된 검정, 고상 직접 표지된 샌드위치 검정(예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 이용한 고상 직접 표지 RIA(예를 들어, 문헌[Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어, 문헌[Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA(문헌[Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82])이 이용될 수 있다. 전형적으로, 이러한 검정은 항원을 발현하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원, 비표지된 시험 항원 결합 단백질 및 표지된 참조 항원 결합 단백질의 사용을 수반한다. 경쟁적 억제는 시험 항원 결합 단백질의 존재에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상적으로, 시험 항원 결합 단백질은 과량으로 존재한다. 경쟁적 검정에 의해 확인되는 항원 결합 단백질은 참조 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질 및 입체 장애가 일어나는 참조 항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 경쟁적 결합을 결정하기 위한 방법과 관련된 추가 세부 사항이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 경쟁은 BiaCore 검정에 따라 결정된다. 통상적으로, 경쟁적 항원 결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 억제할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상 억제된다.
용어 "제어 서열"은 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 가공에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이러한 제어 서열의 성질은 숙주 유기체에 좌우될 수 있다. 특정 구현예에서, 원핵생물에 대한 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 제어 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열, 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. "제어 서열"은 선도 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드의 "유도체"는, 예를 들어 또 다른 화학적 모이어티에 대한 접합을 통해 삽입, 결실, 또는 치환 변이체와 별개인 일부 방식으로 화학적 변형된 폴리펩타이드이다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편이다. 도메인 항체의 예는 Nanobodies®을 포함한다. 일부 예에서, 둘 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커로 공유 결합되어 2가 도메인 항체를 형성시킨다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
"유효량"은 일반적으로 증상의 중증도 및/또는 빈도를 감소시키고, 증상 및/또는 근원을 없애고, 증상 및/또는 이의 근원의 발생을 예방하고/예방하거나, 암으로부터 초래되는 또는 암과 관련된 손상을 개선하거나 치료하기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량"은 질병 상태(예를 들어, 암) 또는 증상, 특히, 질병 상태와 관련된 상태 또는 증상을 치료하거나, 달리 질병 상태 또는 어떠한 방식으로든 질병과 관련된 임의의 다른 바람직하지 않은 증상의 진행을 예방하거나, 저지시키거나, 지연시키거나, 역전시키기에 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때 의도된 예방 효과를 가질, 예를 들어, 암의 발병(또는 재발)을 예방하거나 지연시키거나, 암 또는 암 증상의 발병(또는 재발) 가능성을 감소시키는 효과를 가질 약제학적 조성물의 양이다. 완전한 치료 또는 예방 효과가 1회 용량의 투여에 의해 반드시 일어나는 것은 아니며, 일련의 용량의 투여 후에만 일어날 수 있다. 따라서, 치료적 또는 예방적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 폴리펩타이드의 문맥에서, 에피토프는 인접 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비-인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시에 보유되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성 시에 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유의 공간 입체구조에서 적어도 3개, 및 보다 전형적으로, 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. "선형 에피토프" 또는 "순차적 에피토프"는 아미노산의 이의 선형 서열, 또는 일차 구조에 의해 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)에 의해 인식되는 에피토프이다. "입체구조 에피토프" 또는 "비순차적 에피토프"는 이의 삼차 구조를 통해 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체)에 의해 인식되는 에피토프이다. 이들 에피토프를 구성하는 잔기는 일차 아미노산 서열에서 인접하지 않을 수 있지만, 분자의 삼차 구조에서 함께 가까워진다. 선형 및 입체구조 에피토프는 일반적으로 단백질이 변성되거나, 단편화되거나, 환원될 때 상이하게 거동한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은, 숙주 세포의 형질전환에 적합하고, 이에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 코딩 영역의 발현을 유도하고/유도하거나 제어하는(숙주 세포와 함께) 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현 작제물은 전사, 번역에 영향을 미치거나 이를 제어하고, 인트론이 존재하는 경우, 이에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 서열을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
"Fab 단편" 또는 "Fab"는 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fab' 단편" 또는 "Fab'"는 하나의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 중쇄의 일부를 함유하고, 이로써 두 개의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄 사이에 쇄간 디설파이드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편" 또는 "F(ab')2"는 두 개의 경쇄, 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 두 개의 중쇄를 함유하고, 이로써 두 개의 중쇄 사이에 쇄간 디설파이드 결합이 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 두 개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 의해 함께 고정되는 두 개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fc 영역"은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 함유한다. 두 개의 중쇄 단편은 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 그리고 둘 이상의 디설파이드 결합에 의해 함께 고정된다.
"Fv 영역"은 중쇄와 경쇄 둘 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여된다.
항원 결합 단백질, 항체, 또는 이의 단편과 관련하여 사용되는 용어 "중쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 하나의 가변 영역 도메인(VH) 및 세 개의 불변 영역 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있고, CH 도메인은 카복실-말단에 있고, 여기서 CH3는 폴리펩타이드의 카복실-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 임의의 아이소타입, 예컨대, IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브타입 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 서브타입 포함), IgM 및 IgE일 수 있다.
"혈액암"은 골수와 같이 혈액-형성 조직에서, 또는 면역계의 세포에서 시작되는 암이다. 혈액암의 예로는 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종이 있다.
용어 "동종이량체 융합 단백질"은 두 개의 동일한 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항체 동종이량체 융합 단백질은 두 개의 동일한 항체를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 특정 예에서, 동종이량체는, 본원에 기재된 바와 같이, TTR 단백질을 통해 연결된 두 개의 동일한 항체를 포함하는 TTR 동종이량체 융합 단백질일 수 있다.
용어 "동종사량체 융합 단백질"은 네 개의 동일한 항원 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 항체 동종사량체 융합 단백질은 네 개의 동일한 항체를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 또 다른 예에서, Fab 항체 동종사량체 융합 단백질은 네 개의 동일한 Fab 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭한다. 특정 예에서, 동종사량체는, 본원에 기재된 바와 같이, TTR 단백질을 통해 연결된 두 개의 동일한 항원 결합 단백질(예를 들어, 두 개의 동일한 항체, 또는 두 개의 동일한 Fab 단편)을 포함하는 TTR 동종사량체 융합 단백질일 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 핵산 서열로 형질전환되고, 이에 의해 관심 대상의 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 이 용어는, 자손이 원래의 모 세포와 형태 또는 유전적 구성에서 동일한지의 여부에 상관없이, 관심 대상의 유전자가 존재하는 한, 모 세포의 자손을 포함한다.
용어 "동일성"은, 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정하는 경우, 둘 이상의 폴리펩타이드 분자들 또는 둘 이상의 핵산 분자들의 서열들 간 상관관계를 지칭한다. "동일성 퍼센트"는 비교되는 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오타이드 간의 동일한 잔기의 퍼센트를 의미하고, 비교되는 분자의 최소치의 크기를 기초로 계산된다. 이들 계산을 위해, 정렬에서 갭(존재 시)은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")으로 다루어져야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하기 위해 이용될 수 있는 방법들은 문헌[Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073]에 기재된 것들을 포함한다.
동일성 퍼센트를 계산하는 데 있어서, 비교되는 서열은 서열 간 최대 매칭을 제공하는 방식으로 정렬된다. 동일성 퍼센트를 결정하는 데 사용되는 컴퓨터 프로그램은 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지이다(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, 위스콘신 대학교, 매디슨, WI). 컴퓨터 알고리즘 GAP는 서열 동일성 퍼센트를 결정해야 하는 두 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 정렬하기 위해 사용된다. 서열은 이들 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적의 매칭(알고리즘에 의해 결정하는 경우, "매칭 범위(matched span)")에 대하여 정렬된다. 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty)(3x 평균 대각선으로 계산됨, 여기서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 매칭에 할당된 점수 또는 수임) 및 갭 확장 페널티(gap extension penalty)(통상적으로 갭 오프닝 페널티의 1/10 배임), 뿐만 아니라 비교 매트릭스, 예컨대, PAM 250 또는 BLOSUM 62가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정의 구현예에서, 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스의 경우 문헌[Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352]; BLOSUM 62 비교 매트릭스의 경우 문헌[Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919] 참조)가 또한 알고리즘에 의해 이용된다.
GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 권장되는 파라미터는 하기와 같다:
알고리즘: 문헌[Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453];
비교 매트릭스: 상기 문헌[Henikoff et al., 1992]로부터의 BLOSUM 62;
갭 페널티: 12(그러나, 마지막 갭에 대한 페널티 없음)
갭 길이 페널티: 4
유사성의 임계치: 0
두 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정의 정렬 체계는 두 서열의 짧은 영역만의 매칭을 생성시킬 수 있고, 이러한 작은 정렬된 영역은 두 전장 서열 간에 유의한 상관관계가 없을지라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 이에 따라, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 요망되는 경우에 표적 폴리펩타이드의 적어도 50개의 인접 아미노산의 범위인 정렬을 생성시키도록 조절될 수 있다.
문구 "면역 조절제(immune modulator)"는 면역 반응을 유도하거나, 향상시키거나, 억제하는 분자를 지칭한다. 면역 활성제는 면역 반응을 유도하거나 증폭시키는 분자이다. 면역 억제제는 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 분자이다. 따라서, 활성화 면역요법은 대상체의 면역계를 유도하거나 향상시키기 위해 분자(들)를 투여하는 것을 수반하는 요법이다. 억제 면역요법은 대상체가 대상체의 면역계를 감소시키거나 억제하는 분자(들)로 치료되는 요법이다.
본원에서 사용되는 용어 항체 또는 면역글로불린 사슬(중쇄 또는 경쇄)의 "단편"은 전장 사슬에 존재하는 아미노산 중 적어도 일부가 결여되지만 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분(이러한 부분이 어떻게 얻어지거나 합성되는지는 상관 없음)을 포함하는 항원 결합 단백질이다. 이러한 단편은 이들이 표적 항원에 특이적으로 결합하고, 주어진 에피토프에 대해 결합하기 위해, 온전한 항체를 포함하여, 다른 항원 결합 단백질과 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 일 양태에서, 이러한 단편은 전장 경쇄 또는 중쇄에 존재하는 적어도 하나의 CDR을 보유할 것이고, 일부 구현예에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적 활성 단편은 재조합 DNA 기법에 의해 생산될 수 있거나, 온전한 항체를 포함하여 항원 결합 단백질의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 면역학적 기능성 면역글로불린 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단쇄 항체를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 인간, 마우스, 랫트, 낙타과 또는 토끼를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 임의의 포유동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 항원 결합 단백질의 기능성 부분, 예를 들어, 하나 이상의 CDR은 제2 단백질에 또는 소분자에 공유 결합되어 체내 특정 표적과 관련이 있거나 장기간 혈청 반감을 갖는 치료제를 생성시킬 수 있는 것으로 상정된다.
"단리된 핵산 분자"는, 단리된 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 확인되는 모든 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부와 회합되지 않거나, 자연적으로 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 연결된, 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 임의의 이들의 조합을 의미한다. 본 개시의 목적 상, 특정 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 온전한 염색체를 포괄하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 특정 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 특정 서열 외에, 10개 이하 또는 심지어 20개 이하의 다른 단백질 또는 이의 일부에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 나열된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "단리된 폴리펩타이드", "정제된 폴리펩타이드", "단리된 단백질" 또는 "정제된 단백질"은 다른 구성요소로부터 단리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되고, 여기서 폴리펩타이드는 이의 자연적으로 얻어질 수 있는 상태에 비해 임의 정도로 정제된다. 따라서, 정제된 폴리펩타이드는 또한 자연적으로 발생할 수 있는 환경에 존재하지 않는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은, 다양한 다른 구성요소를 제거하는 분별에 주어졌었고 조성물이 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는, 폴리펩타이드 조성물을 지칭할 것이다. 용어 "실질적으로 정제된"이 사용되는 경우, 이러한 명명은 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 조성물에서 단백질의 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상을 구성하는 것과 같이 조성물의 주성분을 형성시키는, 펩타이드 또는 폴리펩타이드 조성물을 지칭할 것이다.
항원 결합 단백질, 항체, 또는 이의 단편과 관련하여 사용되는 용어 "경쇄"는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인(VL) 및 불변 영역 도메인(CL)을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩타이드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파쇄 및 람다쇄를 포함한다.
생물학적 물질, 예컨대, 폴리펩타이드, 핵산, 및 숙주 세포 등과 연관하여 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "자연 발생"은 자연에서 확인되는 물질을 지칭한다.
용어 "올리로뉴클레오타이드"는 200개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개 내지 60개의 염기 길이이다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 돌연변이 유전자의 구성에서 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원 표지를 포함하여, 검출 검정을 위한 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 이 용어가 적용되는 구성요소가 이들로 하여금 적합한 조건 하에 이들의 고유 기능을 수행하는 것을 가능하게 하는 관계에 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 벡터에서 제어 서열은 단백질 코딩 서열의 발현이 제어 서열의 전사 활성과 양립 가능한 조건 하에 달성되도록 이에 결찰된다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 단일-가닥 뉴클레오타이드 폴리머와 이중-가닥 뉴클레오타이드 폴리머 둘 모두를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 변형 형태의 이 중 어느 하나의 유형의 뉴클레오타이드일 수 있다. 변형은 염기 변형, 예컨대, 브로모우리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예컨대, 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오타이드간 연결 변형, 예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 논의되는 임의의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로 지칭된다. 발생초기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로의 첨가의 방향은 전사 방향으로 지칭되고; RNA 전사체의 5'에서 5' 말단까지 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥에 대한 서열 영역은 "업스트림 서열(upstream sequence)"로 지칭되고; RNA 전사체의 3'에서 3' 말단까지 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥에 대한 서열 영역은 "다운스트림 서열(downstream sequence)"로 지칭된다.
용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 이 용어는 또한 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 폴리머의 유사체 또는 모사체인 아미노산 폴리머에 적용된다. 이 용어는 또한, 예를 들어 탄수화물 잔기(당단백질을 형성시키는)의 첨가에 의해, 또는 인산화에 의해 변형된 아미노산 폴리머를 포괄할 수 있다. 폴리펩타이드 및 단백질은 자연-발생 및 비-재조합 세포에 의해 또는 유전공학적으로-조작된 또는 재조합 세포에 의해 생산될 수 있고, 원형 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 원래의 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 이에 대한 첨가, 및/또는 이의 치환을 갖는 분자를 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩타이드 단편"은 전장 단백질과 비교할 때 아미노-말단 결실, 카복실-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이러한 단편은 또한 전장 단백질과 비교할 때 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정의 구현예에서, 단편은 약 5개 내지 500개의 아미노산 길이이다. 예를 들어, 단편은 적어도 5개, 6개, 8개, 10개, 14개, 20개, 50개, 70개, 100개, 110개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개 또는 450개의 아미노산 길이일 수 있다.
재조합 TTR 단백질을 포함하여, "재조합 단백질"은 재조합 기법을 이용하여, 즉, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법 및 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.
"단쇄 항체"는, 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성시키고, 단일 폴리펩타이드 사슬이 항원-결합 영역을 형성시키는 Fv 분자이다. 단쇄 항체는 국제 특허 출원 공개 WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호에서 상세하게 논의된다.
"고형 종양"은, 통상적으로 낭종 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적인 성장 또는 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성(암성 아님) 또는 악성(암성)일 수 있다. 여러 유형의 고형 종양이 이를 형성시키는 세포의 유형에 따라 명명된다. 고형 종양의 예로는 육종, 암종, 및 림프종이 있다. 백혈병(혈액의 암)은 일반적으로 고형 종양을 형성시키지 않는다.
항원에 "특이적으로 결합하는" 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질이 항원이 아닌 분자에 대한 결합을 보이지 않거나 조금만 보인다는 것을 나타낸다. 그러나, 항원을 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질은 상이한 종으로부터의 항원과 교차 반응할 수 있다. 전형적으로, 항원 결합 단백질은, 표면 플라즈마 공명 기법(예를 들어, BIACore, GE-Healthcare Uppsala, 스웨덴)을 통해 측정하는 경우 해리 상수(KD)가 ≤10-7 M일 때, 항원을 특이적으로 결합한다. 항원 결합 단백질은, ≤5×10-8 M의 KD로 결합할 때 "높은 친화성"으로 항원을 특이적으로 결합하고, ≤5×10-9 M의 KD로 결합할 때 "매우 높은 친화성"으로 항원을 특이적으로 결합한다(BIACore와 같은 방법을 이용하여 측정하는 경우).
본원에서 사용되는 "대상체" 또는 "환자"는 임의의 포유동물일 수 있다. 전형적인 구현예에서, 대상체 또는 환자는 인간이다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한"은 분자의 기재된 화학종이 존재하는 우세한 화학종인, 즉, 몰 기준으로, 동일한 혼합물에서 임의의 다른 개별 화학종보다 더 풍부하다는 것을 의미한다. 특정의 구현예에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 화학종이 존재하는 모든 거대분자 화학종의 적어도 50%(몰 기준으로)인 조성물이다. 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대분자 화학종을 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 대상 화학종은 필요한 동종성으로 정제되는데, 여기서 오염시키는 화학종은 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없고, 그에 따라 조성물이 단일의 검출 가능한 거대분자 화학종으로 이루어진다.
용어 "~을 치료하는"은 증상의 감퇴; 차도; 감소 또는 손상, 병변 또는 병태를 환자에게 더 용인 가능하게 만들고; 악화 또는 감소의 속도를 지연시키고; 악화의 최종 지점을 덜 약화시키고; 환자의 육체적 또는 정신적 안녕을 향상시키는 것과 같은 임의의 객관적 또는 주관적 파라미터를 포함하여 손상, 병변 또는 병태의 치료 또는 개선에서 성공의 임의의 지표를 지칭한다. 증상의 치료 또는 개선은 신체 검사, 신경정신과 검사 및/또는 정신과 평가의 결과를 포함하여 객관적 또는 주관적 파라미터에 기초할 수 있다. 예를 들어, 본원에 제시된 특정 방법은, 예를 들어 암의 진행 또는 확산을 감소시키고, 종양 성장을 억제하고, 종양의 완화를 유발하고/유발하거나 암 또는 종양과 관련된 증상을 개선함으로써 암 및 종양을 성공적으로 치료한다. 마찬가지로, 본원에 제공된 다른 방법은 감염의 진행 또는 확산을 감소시키고, 감염 정도를 감소시키고/감소시키거나 감염과 관련된 증상을 개선함으로써 감염성 질환을 치료한다.
본원에서 사용되는 용어 "TTR"은 "트랜스타이레틴"을 지칭한다. 인간 TTR은 본원에 참조로 포함되는 문헌[Mita et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 124(2):558-564 (1984)]에 기재되어 있다. 인간 TTR에 대한 아미노산 서열은 또한 UniProt Knowledgebase(www.uniprot.org/uniprot/P02766#sequences)에 기재되어 있으며, 본원에서 SEQ ID NO: 43로 기재된다. 인간 TTR에 대한 핵산 서열은 또한 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7276)에 기재되어 있다. 또한, 젠뱅크(GenBank) 기탁 K02091.1을 참조하라. 뮤린 TTR의 아미노산 및 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3 및 4에 각각 기재되어 있다.
용어 "TTR 변이체"는 SEQ ID NO: 1을 갖는 TTR과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 지칭한다. 본 발명은 또한 그러한 TTR 변이체를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 특이적인 변이체는, 예를 들어 C- 또는 N-말단에서 절단이 있는 TTR 단백질을 포함한다.
"종양"은 암성 세포가 성장하고 증식함에 따라 형성되는 조직 덩어리를 지칭하는데, 이는 정상적인 인접 조직을 침입하고 파괴할 수 있다. 암 세포는 악성 종양으로부터 나와 혈류 또는 림프계로 들어가고, 이에 따라 암 세포가 일차 종양으로부터 퍼져 다른 기관에서 새로운 종양을 형성시킬 수 있다.
폴리펩타이드의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 또 다른 펩타이드 서열에 대한 아미노산 서열로 삽입되고/삽입되거나 이로부터 결실되고/결실되거나 이로 치환되는 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 이에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 한 가지 유형의 벡터는 추가 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭할 수 있는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시에 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 효용이 있는 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 벡터의 형태로 사용되므로 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능으로 작용하는 그러한 다른 형태의 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)를 포함하는 것으로 의도된다.
동종이량체 융합 단백질
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은, 부분적으로, 항체와 같은 항원 결합 단백질의 다량체화에서 TTR의 용도에 관한 것이다. TTR은 인간 혈청에서 발견되는 인간 세포외 단백질이기 때문에, 이는 인간의 몸 전체에 걸쳐 비교적 높은 양으로 존재한다. 따라서, 이는, 예를 들어 비-인간, 세포내 및 희귀 단백질과 비교할 때, 본 발명의 다량체화 작제물에 존재하는 경우에 면역 반응을 유발할 가능성이 더 적다. 이에 따라, 본 발명의 다량체화 기법에서의 이의 사용은 유리하다.
예를 들어, TTR은 항체의 이량체화에 사용될 수 있다. 그러한 동종이량체 융합 단백질에서, TTR(SEQ ID NO: 1), 또는 이의 변이체는 사량체로서 존재하고, 여기서 TTR 서브유닛은 항체 중쇄의 C-말단에 연결되어 TTR 항체 동종이량체를 형성시킨다. 예를 들어, 각 항체 중쇄의 C-말단(각 항체가 두 개의 그러한 C-말단을 함유함)은 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1a 참조). 따라서, 각 항체는 TTR 사량체에서 두 개의 TTR 서브유닛에 연결되어 TTR 항체 동종이량체를 생성시킨다.
이에 따라, 본 발명은 두 개의 항원 결합 단백질을 포함하는 동종이량체 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 동종이량체 융합 단백질은 단백질 복합체에 연결된 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체이고, 여기서 TTR 단백질 복합체는 TTR 사량체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 TTR 사량체에 연결된 두 개의 항체를 포함하는 동종이량체 융합 단백질에 관한 것이다. 항체는 링커 없이 TTR 사량체에 연결될 수 있다(즉, 항체는 TTR에 직접적으로 연결됨).
다른 구현예에서, 항체는 TTR 사량체에 링커를 통해 연결된다. 예를 들어, 아미노산 링커는 항체 중쇄의 C-말단을 TTR 서브유닛 N-말단에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 1개 내지 5개, 1개 내지 10개, 1개 내지 15개, 1개 내지 20개, 1개 내지 25개, 1개 내지 30개, 1개 내지 35개, 또는 1개 내지 40개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 링커는 0개, 1개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 링커는 최대 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 최대 5개, 10개, 15개, 또는 20개의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 링커는 0개, 5개, 10개, 15개, 또는 20개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 링커는 GGGGS, GGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)2), GGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)4), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)5), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)6)이다. 다른 구현예에서, 링커는 GGGGS, GGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)2), GGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)3), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)4)이다.
다른 적합한 아미노산 링커는, 예를 들어 디설파이드 결합, (Gly)n(n = 1 내지 10), (EAAAK)n(n = 1 내지 5), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, PAPAP, AEAAAKEAAAKA, (Ala-Pro)n(n = 1 내지 20), VSQTSKLTRAETVFPDV, PLGLWA, RVLAEA, EDVVCCSMSY, GGIEGRGS, TRHRQPRGWE, AGNRVRRSVG, RRRRRRRRR, GFLG, 및 LE를 포함한다. 적합한 비-아미노산 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는, 링커로 또는 링커 없이, 절단된 TTR 서브유닛에 연결된다. 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산이 하나 이상의 TTR 서브유닛의 N-말단으로부터 제거될 수 있고, 항체는 절단된 TTR 서브유닛 N-말단에 부착될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 동종이량체 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 동종이량체 융합 단백질을 생산하기 위한 예시적인 방법과 관련된 세부사항은 실시예에서 찾아볼 수 있다.
항체 및 Fab의 사량체화
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은, 부분적으로, 항체와 같은 항원 결합 단백질의 다량체화에서 TTR의 용도에 관한 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 다량체화 기법에서 TTR의 사용은, TTR이, 예를 들어 비-인간, 세포내 및 희귀 단백질과 비교할 때, 본 발명의 다량체화 작제물에 존재하는 경우에 면역 반응을 유발할 가능성이 더 적기 때문에 유리하다.
본 발명은 또한, 부분적으로, 항체와 같은 항원 결합 단백질의 사량체화에서 TTR의 용도에 관한 것이다. 그러한 동종사량체 융합 단백질에서, TTR(SEQ ID NO: 1), 또는 이의 변이체는 또한 사량체로서 존재한다. 그러나, TTR 항체 동종사량체의 맥락에서, 단일 항체 중쇄(즉, 두 개의 중쇄 중 하나만 단일 항체에 존재함)는 각 TTR 서브유닛에 연결되어, TTR 사량체에 대한 네 개의 항체 연결이 가능하다(도 1b 참조). 항체 C-말단의 두 개의 중쇄 중 하나는 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결될 수 있다(도 1b 참조). 따라서, 각각의 항체는 TTR 사량체에서 하나의 TTR 서브유닛에 연결되어 TTR 항체 동종사량체를 생성시킨다.
그러한 동종사량체 융합 단백질에서, Fc 동종이량체(상기 논의됨)의 형성은 Fc에서 돌연변이를 통해 불리해진다. 그러한 변형은 Fc 돌연변이, 예컨대, 노브즈-인투-홀즈(knobs-into-hole), 듀오바디(DuoBody), 아지메트릭(Azymetric), 전하 쌍, HA-TF, SEEDbody와 같은 Fc 돌연변이, 및 차등적 단백질 A 친화성으로의 변형을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Spiess et al., Molecular Immunology, 67(2, Part A), 2015, pp. 95-106]을 참조하라. 노브즈-인투-홀즈 돌연변이는 제1 중쇄에서 T366W를 포함하고, 제2 중쇄에서 T366S, L368A, 및/또는 Y407V를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Ridgway et al., Protein Eng., 9 (1996), pp. 617-621; 및 Atwell et al., J. Mol. Biol., 270 (1997), pp. 26-35]을 참조하라. 듀오바디 돌연변이는 제1 중쇄에서 F405L를 포함하고, 제2 중쇄에서 K409R을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 110 (2013), pp. 5145-5150]을 참조하라. 아지메트릭 돌연변이는 제1 중쇄에서 T350V, L351Y, F405A, 및/또는 Y407V를 포함하고, 제2 중쇄에서 T350V, T366L, K392L, 및/또는 T394W를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Von Kreudenstein et al., mAbs, 5 (2013), pp. 646-654]을 참조하라. HA-TF 돌연변이는 제1 중쇄에서 S364H 및/또는 F405A를 포함하고, 제2 중쇄에서 Y349T 및/또는 T394F를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Moore et al., mAbs, 3 (2011), pp. 546-557]을 참조하라. SEEDbody 돌연변이는 제1 중쇄에서 IgG/A 키메라 돌연변이를 포함하고, 제2 중쇄에서 IgG/A 키메라 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Davis et al., Protein Eng. Des. Sel., 23 (2010), pp. 195-202]을 참조하라. 차등적 단백질 A 친화성 돌연변이는 어느 하나의 중쇄에서 H435R를 포함하고, 다른 중쇄에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,713호를 참조하라. 이러한 문헌들 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 항체 중쇄의 동종이량체화를 불리하게 함으로써 TTR 서브유닛에 연결된 하나의 항체 중쇄와 TTR에 연결되지 않은 하나의 항체 중쇄 사이의 중쇄 이종이량체화를 유리하게 하는 Fc 전하 쌍의 사용을 통해 항체의 동종사량체화를 구동하는 것이 가능하다(도 1b 참조). 예를 들어, 일련의 하전된 돌연변이는, 하나의 중쇄에 대하여 음전하로 그리고 상응하는 중쇄에 대하여 양전하로, 또는 상응하는 중쇄에 대하여 이들의 상응하는 양전하 및 음전하와 쌍을 이루는 하나의 중쇄에 대하여 음전하 및 양전하의 혼합으로 중쇄의 CH3 도메인에 편입될 수 있다. 예시적인 음전하는 K392D & K409D를 포함하고, 예시적인 양전하는 E356K & D399K를 포함한다. CH3 계면에서 유사한 전하는 반발하는 반면 유사하지 않은 전하는 끌어당기기 때문에, 동종이량체화는 불리한 반면, 이종이량체화는 유리하다. TTR은 오로지 하나의 전하 유형(양이나 음 둘 모두가 아니라, 이들 중 어느 하나)의 중쇄에 융합되고; 그에 따라서 4개의 사슬(2개의 경쇄, 1개의 비융합된 중쇄 및 1개의 TTR 융합된 중쇄)로 구성된 전체 항체 당 하나의 TTR 서브유닛을 생성시킨다. 추가의 전하 쌍 돌연변이는, 예를 들어, USP 9,546,203호에서 논의된다. 제1 중쇄에서 D221E, P228E, 및/또는 L368E 및 제2 중쇄에서 D221R, P228R, 및/또는 K409R을 포함하는 전하 쌍 돌연변이는 또한, 예를 들어 문헌[Strop et al., J. Mol. Biol., 420 (2012), pp. 204-219]에 기재되어 있다. 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명은 또한, 부분적으로, Fab 단편의 사량체화에서 TTR의 용도에 관한 것이다. 그러한 동종사량체 융합 단백질에서, TTR(SEQ ID NO: 1), 또는 이의 변이체는 또한 사량체로서 존재하고, 여기서 각 TTR 서브유닛은 각 Fab 단편의 C-말단에 연결되어 TTR Fab 동종사량체를 형성시킨다(도 1c 참조). 따라서, 각각의 Fab 단편 항체는 TTR 사량체에서 단일 TTR 서브유닛에 연결되어 TTR Fab 동종사량체를 생성시킨다.
이에 따라, 본 발명은 네 개의 항원 결합 단백질(예를 들어, Fab 사량체) 또는 8개의 항원 결합 단백질(예를 들어, Ab 사량체)을 포함하는 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 동종사량체 융합 단백질은 단백질 복합체에 연결된 항원 결합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체이고, 여기서 TTR 단백질 복합체는 TTR 사량체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 항체이다. 다른 구현예에서, 항원 결합 단백질은 Fab 단편이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 TTR 사량체에 연결된 네 개의 항체를 포함하는 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 TTR 사량체에 연결된 네 개의 Fab 단편을 포함하는 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 Fab는 링커 없이 TTR 사량체에 연결된다(즉, 항체 또는 Fab는 TTR에 직접적으로 연결됨).
다른 구현예에서, 항체 또는 Fab는 TTR 사량체에 링커를 통해 연결된다. 예를 들어, 아미노산 링커는 항체 중쇄의 C-말단을 TTR 서브유닛 N-말단에 연결하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 1개 내지 5개, 1개 내지 10개, 1개 내지 15개, 1개 내지 20개, 1개 내지 25개, 1개 내지 30개, 1개 내지 35개, 또는 1개 내지 40개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19 개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 링커는 0개, 1개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 다른 구현예에서, 링커는 최대 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 또는 40개의 아미노산 길이이다. 일부 구현예에서, 링커는 최대 5개, 10개, 15개, 또는 20개의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 링커는 0개, 5개, 10개, 15개, 또는 20개의 아미노산 길이이다.
일부 구현예에서, 링커는 GGGGS, GGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)2), GGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)3), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)4), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)5), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)6)이다. 다른 구현예에서, 링커는 GGGGS, GGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)2), GGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)3), 또는 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(즉, (GGGGS)4)이다.
다른 적합한 아미노산 링커는, 예를 들어 디설파이드 결합, (Gly)n(n = 1 내지 10), (EAAAK)n(n = 1 내지 5), A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A, PAPAP, AEAAAKEAAAKA, (Ala-Pro)n(n = 1 내지 20), VSQTSKLTRAETVFPDV, PLGLWA, RVLAEA, EDVVCCSMSY, GGIEGRGS, TRHRQPRGWE, AGNRVRRSVG, RRRRRRRRR, GFLG, 및 LE를 포함한다. 적합한 비-아미노산 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 트리아진-함유 모이어티(단백질과 반응할 수 있는 말단기를 갖는 작제물에 함유됨; 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO/2017/083604호 참조)를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 Fab는, 링커로 또는 링커 없이, 절단된 TTR 서브유닛에 연결된다. 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 아미노산이 하나 이상의 TTR 서브유닛의 N-말단으로부터 제거될 수 있고, 항체 또는 Fab는 절단된 TTR 서브유닛 N-말단에 부착될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 동종이량체 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 동종사량체(TTR 및 Ab) 융합 단백질을 생산하기 위한 예시적인 방법과 관련된 세부사항은 실시예에서 찾아볼 수 있다.
항원 결합 단백질
임의의 항원 결합 단백질(예를 들어, Fab 또는 항체)은 본 발명의 TTR 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질은 항원 결합 단백질 다량체화를 가능하게 하므로, 항원 결합 단백질 클러스터링 또는 결합능이 활성에 필요한 항원을 표적화/결합하는 항원 결합 단백질은 본 발명의 융합 단백질로부터 특히 이로울 수 있다. 이에 따라서, 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fab)은 4-1BB(CD137), CD20, GITR, DR5, OX40(CD134), ICOS(CD278), 또는 CD27에 표적화/결합한다. 그러한 단백질/표적은 암 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 다른 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fab)은 ErbB-1(표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)), ErbB-2(인간에서 HER2 및 설치류에서 neu), ErbB-3(HER3), ErbB-4(HER4), FGFR(섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor)), VEGFR(혈관 내피 성장 인자(vscular endothelial growth factor)), RET 단백질 산물, EGFR, KIT 단백질 산물, Abl(아벨손 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1(Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1)), Raf(빠르게 가속화된 섬유육종(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma)) 키나제, 또는 PDGFR(혈소판-유래 성장 인자 수용체(platelet-derived growth factor receptors))을 표적화/결합한다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fab)은 CB1R(항-칸나비노이드 수용체-1; 유전자명 Cnrl)에 특이적으로 결합한다. CB1 수용체는 CNS 및 말초 신경계에서 널리 발현되는 Gi-결합 G-단백질 수용체이다. CB1 수용체의 효능제 자극은 아데닐릴 시클라제 활성의 억제 및 미토겐-활성화된 단백질(MAP) 키나제의 활성화를 야기한다. CB1 수용체의 내인성 효능제는 아난다미드 및 아라키도노일 글리세롤을 포함할 수 있다. 외인성 효능제는 A9-테트라하이드로칸나비놀을 포함할 수 있다. 길항제 또는 역효능제는 체중을 감소시키고, 대사작용 파라미터를 개선하고, 예를 들어 혈장 글루코스 및 인슐린 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 부분은 항-CB1R 항체(예를 들어, 중쇄 SEQ ID NO: 5, 및 경쇄 SEQ ID NO: 11을 갖는 항-CB1R 항체 10D10; 또는 중쇄 SEQ ID NO: 6 또는 7, 및 경쇄 SEQ ID NO: 11을 갖는 항-CB1R 항체)이다. 다른 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 항-CB1R Fab(예를 들어, 10D10로부터 유래된 Fab, 예컨대, Fab 중쇄 SEQ ID NO:44, 및 Fab 경쇄 SEQ ID NO:11)이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20160145333호를 참조하라.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fab)은 GITR에 특이적으로 결합한다(글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질; TNFRSF18). 때때로 활성화-유도성 TNFR 패밀리 일원(AITR)으로도 지칭되는 GITR은 TNF 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF)에 속하는 수용체이다. 이는 이의 동족 리간드인 GITR 리간드(GITRL, TNFSF18)에 의해 활성화된다. GITR은 TNFR 패밀리 일원의 특징인 시스테인-풍부 세포외 도메인을 함유하는 I형 막관통 단백질이다. 예를 들어, GITR의 세포질 도메인은 특정의 다른 TNFR 패밀리 일원, 예컨대, 4-1BB 및 CD27을 갖는 가까운 동족체를 공유한다(본원에 참조로 포함되는 문헌[Nocentini, et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6216-6221]). GITR 활성화는 면역 반응의 향상을 야기하고, 이러한 활성화는 감염 및 종양에 대한 면역 반응을 회복시킬 가능성을 갖는다. 이에 따라, GITR을 활성화시킬 수 있는 분자는 향상된 면역 반응을 촉발시키는 것이 요망되는 환경에서 면역자극제로서 유용할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 부분은 항-GITR 항체(예를 들어, 중쇄 SEQ ID NO: 18, 및 경쇄 SEQ ID NO: 25를 갖는 항-GITR 항체 9H6; 또는 중쇄 SEQ ID NO: 19 또는 20, 및 경쇄 SEQ ID NO: 25를 갖는 항-GITR 항체)이다. 다른 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 항-GITR Fab(예를 들어, 9H6으로부터 유래된 Fab, 예컨대, Fab 중쇄 SEQ ID NO: 21, 및 Fab 경쇄 SEQ ID NO: 26)이다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20150064204호를 참조하라.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 또는 Fab)은 TRAILR2에 특이적으로 결합한다(TRAIL 수용체 2; DR5(사멸 수용체 5)로도 지칭됨). TR-2(종양 괴사 인자(TNF)-관련 아폽토시스-유도 리간드("TRAIL") 수용체-2)와 이의 리간드인 TRAIL 간의 상호작용은 아폽토시스 유도의 역할을 한다(예를 들어, 문헌[Almasan et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 14: 337-348 (2003)] 참조). Apo2 리간드로도 알려진 TRAIL은 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 4개의 일원(TRAIL 수용체("TR") 1 내지 4), 뿐만 아니라 관련된 가용성 오스테오프로테게린("OPG") 수용체와 상호작용하는 동형 리간드이다. 세포의 표면에서 TR-1 또는 TR-2에 대한 TRAIL의 결합은 그러한 세포의 아폽토시스를 촉발시킨다. TR-1 또는 TR-2에 대한 TRAIL의 초기 결합 후, 세포내 단백질이 수용체의 세포내 사멸 도메인에 모집되어 신호전달 복합체를 형성시킨다. 특정 세포내 카스파제는 복합체로 모집되고; 여기서 이들은 자가활성화되고, 결과적으로 추가 카스파제 및 세포내 아폽토시스 캐스케이드를 활성화시킨다. TR-3 및 TR-4 및 OPG에는 아폽토시스 신호 전달을 담당하는 세포내 도메인이 결여된다. 따라서, TR-3, TR-4, 또는 OPG에 대한 TRAIL의 결합은 아폽토시스를 촉발시키지 않는다. TR-3 및 TR-4는 또한 "유인(decoy)" 수용체로도 지칭되고, 이들의 과발현은 TRAIL에 의한 아폽토시스 유도로부터 세포를 보호하는 것으로 밝혀졌다. TR-2는, 간, 뇌, 유방, 신장, 결장, 폐, 비장, 흉선, 말초 혈액 림프구, 전립선, 고환, 난소, 자궁 및 위장관을 따르는 다양한 조직을 포함하여, 다양한 세포에서 발현된다. (예를 들어, 각각 본원에 참조로 포함되는 문헌[Walczak et al., EMBO J. 16: 5386-5397 (1997); Spierings et al., J. Histochem. Cytochem. 52: 821-831 (2004)] 참조). TRAIL 및 TRAIL 수용체는 광범위하게 발현되지만, 이들은 형질전환된 세포에서 아폽토시스를 유도하는 데 가장 활성이다. (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌[Daigle et al., Swiss Med. Wkly. 131: 231-237 (2001)] 참조). 항-TRAILR2 단클론성 항체인 코나투무맙은 암의 치료용으로 개발 중에 있다. 따라서, 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 부분은 항-TRAILR2 항체(예를 들어, 중쇄 SEQ ID NO: 31, 및 경쇄 SEQ ID NO: 38을 갖는 코나투무맙; 또는 중쇄 SEQ ID NO: 32 또는 33, 및 경쇄 SEQ ID NO: 38을 갖는 항-TRAILR2 항체)이다. 다른 특정 구현예에서, TTR 융합 단백질의 항원 결합 단백질은 항-TRAILR2 Fab(예를 들어, 코나투무맙으로부터 유래된 Fab, 예컨대, Fab 중쇄 SEQ ID NO: 34, 및 Fab 경쇄 SEQ ID NO: 39)이다.
TTR 변이체
상기 논의된 바와 같이, TTR 변이체가 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 본원에서 논의된 임의의 TTR 변이체는 서로 조합하여 사용될 수 있다. TTR 변이체는, 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, 또는 SEQ ID NO: 43을 갖는 TTR 단백질과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 86%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 TTR은 인간 TTR SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 TTR은 K15, C10, 또는 둘 모두의 K15/C10(예를 들어, K15A, C10A, 또는 둘 모두의 K15A/C10A)에서 돌연변이를 갖는 SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함한다. 구체적 구현예에서, 본 발명의 TTR은 K15A 돌연변이와 C10A 돌연변이 둘 모두를 포함하고, 따라서 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는다.
인간 TTR(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 43)에 존재하는 시스테인은 항원 결합 단백질(예를 들어, 항체 및 Fab)에 대한 접합 부위로서 사용될 수 있다. 또한, 부위 특이적 접합을 가능하게 하는 TTR 변이체, 예컨대, 조작된 시스테인을 갖는 TTR 변이체는 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 USP 8,633,153호를 참조하라. 예를 들어, TTR 변이체는 다음 시스테인 돌연변이 A37C, D38C, A81C, 또는 G83C 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 유용한 추가 변이체는, 예를 들어, C- 또는 N-말단에서 절단을 갖는 TTR 단백질을 포함한다. 그러한 TTR 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 아미노산이 C- 또는 N-말단 TTR 단백질에서 제거되는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 아미노산이 TTR 단백질의 C- 또는 N-말단에서 제거되는 TTR 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 아미노산이 TTR 단백질의 N-말단에서 제거되는 TTR 단백질을 포함한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 추가의 TTR 변이체는 티록신에 대한 TTR 결합을 감소시키거나 차단하는 것들을 포함한다. 각각의 TTR 사량체는 TTR 사량체의 중심 채널에 위치한 두 개의 티록신 결합 부위를 함유한다. 그러한 변이체는, 예를 들어 환자에서 티록신 생물학의 방해를 막을 수 있고, 티록신 대사 경로에 따라 작용되는 TTR 융합을 갖는 것을 막을 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 추가의 다른 TTR 변이체는 TTR의 단백질분해 활성을 감소시키거나 없애는 것들을 포함한다.
또한, TTR-His 태그 융합은 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, TTR-His 태그 융합은 Fab에 Fc가 결여된 TTR Fab 작제물의 정제에서, 또는 단백질 A 친화성 컬럼의 저 pH 정제 환경을 막기에 이로운 TTR Ab 작제물의 정제를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, His 태그는 정제 후에 제거된다. His 태그는 또한 최종 치료적 분자에 존재할 수 있다(즉, 태그는 정제 후에 보유될 수 있다). 일부 구현예에서, His 태그는 His, (His)2, (His)3, (His)4, (His)5, (His)6, (His)7, (His)8, (His)9, 또는 (His)10 태그이다. 특정 구현예에서, His 태그는 (His)6 또는 (His)7 태그이다. 구체적 구현예에서, His 태그는 (His)6 태그이다. 일부 구현예에서, His 태그는 링커로서 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 글리신 아미노산을 포함한다. 특정 구현예에서, His 태그는 두 개의 글리신(예를 들어, GGHHHHHH)을 포함한다.
일부 구현예에서, 두 개의 글리신 아미노산 링커는 TTR 변이체와 중쇄 또는 경쇄 사이에 삽입될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 TTR 변이체는 TTR 융합의 PK 또는 가용성 성질을 조정하는 데 도움을 줄 수 있는 글리코실화 부위를 편입한 변이체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 TTR 변이체 또는 TTR 융합 단백질은 유리한 PK 성질을 주는 모이어티, 예를 들어 트리아진-함유 모이어티(단백질과 반응할 수 있는 말단 기를 갖는 작제물 내에 함유됨; 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 WO/2017/083604호 참조)를 포함하도록 변형될 수 있다.
동종이량체 및 동종사량체 융합 단백질을 제조하는 방법
본 발명의 동종이량체 및 동종사량체 융합을 제조하는 방법은 실시예에서 논의된다.
일반적으로, 본 발명의 동종이량체 및 동종사량체 융합은 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 이에 따라서, 본 발명은 동종이량체 및 동종사량체 융합을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 동종이량체 및 동종사량체 융합을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 특정의 구현예에서, 발현 벡터는 적합한 숙주 세포에서 발현을 보조하기 위해 동종이량체 및 동종사량체 융합을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 제어 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서)을 포함한다. 특정의 구현예에서, 발현 벡터는 또한 숙주 세포에서 염색체-독립적 복제를 가능하게 하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예시적인 벡터는 플라스미드, 코스미드, 및 YACS를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 벡터는 pTT5이다.
일반적으로, 포유동물 숙주 세포는 Ab TTR 동종이량체 또는 Ab TTR 동종사량체 융합 작제물을 생성시킬 때 이용된다. 포유동물 숙주 세포는 또한 Fab TTR 동종사량체 융합 작제물을 생성시키기에 적합하지만, 비-포유동물 세포, 예컨대, 원핵생물(박테리아) 및 비-포유동물(예를 들어, 효모) 숙주 세포가 또한 사용될 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 발현 백터로 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질감염된 숙주 세포를 동종이량체 및 동종사량체 융합의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 이용되는 형질감염 절차는 형질전환시키고자 하는 숙주에 좌우될 수 있다. 포유동물 세포로의 이종 폴리뉴클레오타이드의 도입을 위한 특정 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜에서 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 및 핵으로 DNA의 직접 마이크로주입을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 특정 포유동물 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 중국 햄스터 난소(CHO; 예를 들어, CHO-K1) 세포, E5 세포, 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), 인간 배아 신장 세포 293(HEK 293), 및 다수의 다른 세포주를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수 가능한 다수의 불멸 세포주를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정의 구현예에서, 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 동종이량체 및 동종사량체 융합을 생성시키는지를 결정함으로써 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 동종이량체 및 동종사량체 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 동종이량체 및 동종사량체 융합 단백질은
a) 동종이량체 및 동종사량체 융합을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
b) 상기 배양물로부터 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 단리하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 유효한 희석제, 담체, 가용화제, 에멀젼화제, 보존제, 및/또는 애주번트와 함께 치료적 유효량의 본 발명의 동종다량체 융합 단백질(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 액체, 냉동, 및 동결건조 조성물을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
바람직하게는, 제형화 물질은 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다. 구체적 구현예에서, 치료적 유효량의 동종다량체 융합 단백질(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
특정의 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 조성물의 pH, 삼투압, 점도, 선명도, 색, 등장성, 향, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡수 또는 침투를 변형시키거나, 유지하거나, 보존시키기 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다. 그러한 구현예에서, 적합한 제형화 물질은 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 프롤린, 또는 라이신); 항균제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로젠-설파이트); 완충제(예컨대, 보레이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 기타 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신); 킬레이팅제(예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물(예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글루불린); 착색제, 향미제 및 희석제; 에멀젼화제; 친수성 폴리머(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염-형성 상대이온(예컨대, 나트륨); 보존제(예컨대, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 하이드로젠 퍼옥사이드); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 증진제(예컨대, 수크로스 또는 소르비톨); 강장성 증진제(예컨대, 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 소듐 또는 포타슘 클로라이드, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 애주번트를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company]을 참조하라.
특정의 구현예에서, 최적의 약제학적 조성물은, 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 방식 및 요망되는 투여량에 좌우하여 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]을 참조하라. 특정의 구현예에서, 그러한 조성물은 본 발명의 항원 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소 속도에 영향을 미칠 수 있다. 특정의 구현예에서, 약제학적 조성물에서 일차 비히클 또는 담체는 성질이 수성 또는 비수성일 수 있다. 예를 들어, 적합한 비히클 또는 담체는, 가능하게는 비경구 투여용 조성물에 흔한 다른 물질이 보충된, 주사용수, 생리 식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 구체적 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 트리스 완충액, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충액을 포함하고, 추가로 소르비톨 또는 이에 대한 적합한 대체물을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정의 구현예에서, 동종다량체 조성물(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)은 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 선택적인 제형화제(상기 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)와 요망되는 순도를 갖는 선택된 조성물을 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다. 추가로, 특정의 구현예에서, 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)는 수크로스와 같은 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한, 예컨대, 경구로의 전달을 위해 선택될 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용되는 조성물의 제조는 당업자의 기술 범위 내에 있다. 제형 성분은 바람직하게는 투여 부위에 허용 가능한 농도로 존재한다. 특정의 구현예에서, 완충제는 생리학적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 조성물을 유지하기 위해 사용된다.
비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 비히클 중에 요망되는 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)을 포함하는 발열원-비함유의 비경구적으로 허용 가능한 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주입에 특히 적합한 비히클은 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)가 적절히 보존된 멸균 등장액으로서 제형화되는 멸균 증류수이다. 특정의 구현예에서, 제조는 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 제품의 제어형 또는 지속형 방출을 제공할 수 있는 주사 가능한 미소구체, 생침식성 입자, 폴리머 화합물(예컨대, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드 또는 리포솜과 같은 작용제와 요망되는 분자의 제형화를 수반할 수 있다. 특정의 구현예에서, 순환의 지속 기간을 증진시키는 효과를 갖는 히알루론산이 또한 사용될 수 있다. 특정의 구현예에서, 이식 가능한 약물 전달 장치는 요망되는 항원 결합 단백질을 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 이러한 구현예에서, 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)는 유리하게는 건조한 흡입용 분말로서 제형화된다. 구체적 구현예에서, 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 흡입 용액이 또한 에어로졸 전달을 위해 추진제와 제형화될 수 있다. 특정의 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다. 따라서, 폐 투여 및 제형화 방법은, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달이 기재되어 있고, 본원에 참조로 포함되는, 국제 특허 출원 PCT/US94/001875호에 추가로 기재되어 있다.
또한, 제형은 경구로 투여될 수 있는 것으로 상정된다. 이러한 방식으로 투여되는 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투여형의 컴파운딩에서 관례적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 특정의 구현예에서, 캡슐은 위장관에서 생체 이용률이 최대화되고 사전-전신 분해가 최소화될 때의 시점에 제형의 활성 부분을 방출하도록 구성될 수 있다. 추가 작용제는 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)의 흡수를 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
지속형- 또는 제어형- 전달 제형에서 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)를 수반하는 제형을 포함하는 추가의 약제학적 조성물은 당업자에게 자명할 것이다. 다양한 다른 지속형- 또는 제어형- 전달 수단, 예컨대, 리포솜 담체, 생침식성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하기 위한 기술이 또한 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물의 전달을 위한 다공성 폴리머 마이크로입자의 제어형 방출이 기재되어 있고, 참조로 포함되는, 국제 특허 출원 PCT/US93/00829호를 참조하라. 지속형-방출 제제는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속형 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락타이드(각각 참조로 포함되는 미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 출원 공개 EP 058481호에 개시된 바와 같은), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머(Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer et al., 1981) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허 출원 공개 EP 133,988호)을 포함할 수 있다. 지속형 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 여러 방법들에 의해 제조될 수 있는 리포솜을 포함할 수 있다. 예를 들어, 참조로 포함되는, 문헌[Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692]; 유럽 특허 출원 공개 EP 036,676호; EP 088,046호 및 EP 143,949호를 참조하라.
생체내 투여용으로 사용되는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균 제제로 제공된다. 멸균은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이러한 방법을 이용한 멸균은 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에 실시될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액으로 저장될 수 있다. 비경구용 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥 용액 백 또는 바이알에 넣어진다.
본 발명의 양태는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 WO 06138181A2호(PCT/US2006/022599호)에 기재된 바와 같은, 약제학적 조성물로서 사용될 수 있는, 자가-완충 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 특정의 구현예는 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 조성물, 특히, 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 외에, 이 섹션에서 그리고 본원의 다른 곳에서 예시적으로 기재된 것들과 같은 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제학적 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 조성물을 제공한다. 부형제는 이와 관련하여 광범위하게 다양한 목적을 위해, 예컨대, 제형의 물리적, 화학적, 또는 생물학적 성질의 조절, 예컨대, 점도의 조절, 및 또는 유효성의 개선, 및 또는, 예를 들어, 제조, 운반, 보관, 사용전 제조, 투여 중에, 및 그 이후에 발생하는 스트레스로 인한 분해 및 부패에 대항하는 이러한 제형 및 공정의 안정화를 위한 본 발명의 공정을 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
이와 관련하여 유용한 단백질 안정화 및 제형화 물질 및 방법에 대하여 다양한 설명이, 구체적으로, 본 발명에 따른 자가-완충 단백질 제형을 위한 부형제 및 이의 공정, 특히, 동물 및/또는 인간 의학적 용도를 위한 단백질 약제학적 제품 및 공정에 관한 부분에서, 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 문헌[Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), 및 Randolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)]와 같이 입수 가능하다.
염은, 예를 들어 제형의 이온 강도 및/또는 등장성을 조절하고/조절하거나 본 발명에 따른 조성물의 단백질 또는 다른 성분의 가용성 및/또는 물리적 안정성을 개선하기 위해 본 발명의 특정의 구현예에 따라 사용될 수 있다.
잘 알려져 있는 바와 같이, 이온은 단백질의 표면 상에 하전된 잔기에 결합함으로써, 그리고 단백질에서 하전 및 극성 기를 차폐하고, 이들의 정전기적 상호작용, 끌어당기고 반발하는 상호작용의 강도를 감소시킴으로써 단백질의 원래의 상태를 안정화시킬 수 있다. 이온은 또한, 특히, 단백질의 변성된 펩타이드 연결(--CONH)에 결합함으로써 단백질의 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 게다가, 단백질에서 하전된 및 극성 기와의 이온 상호작용은 또한 분자간 정전기적 상호작용을 감소시키고, 이에 의해 단백질 응집 및 불용성을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
이온성 화학종은 단백질에 대한 이들의 영향이 상당히 상이하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제형화하는 데 사용될 수 있는, 이온, 및 단백질에 대한 이들의 영향에 대해 다수의 단정적 순위표가 개발되었다. 일 예로는 용액에서 단백질의 입체구조적 안정성에 대한 이들의 영향에 의해 이온성 및 극성의 비-이온성 용질에 대하여 순위를 매긴 호프마이스터 시리즈(Hofmeister series)가 있다. 안정화 용질은 "코스모트로픽(kosmotropic)"으로 지칭된다. 탈안정화 용질은 "카오트로픽(chaotropic)"으로 지칭된다. 코스모트로프(Kosmotrope)는 흔히 고농도(예를 들어, 1 몰 초과의 암모늄 설페이트)로 사용되어 용액으로부터 단백질을 침전시킨다("염석(salting-out)"). 카오트로프는 흔히 단백질을 교합시키고/교합시키거나 가용화시키기 위해 사용된다("염용(salting-in)"). "염용" 및 "염석"에 대한 이온의 상대적인 효과가 Hofmeister 시리즈에서 이들의 위치를 규정한다.
유리 아미노산은 증량제, 안정화제 및 항산화제, 뿐만 아니라 다른 표준 용도로 본 발명의 다양한 구현예에 따라 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형에서 사용될 수 있다. 라이신, 프롤린, 세린, 및 알라닌은 제형에서 단백질을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 글리신은 올바른 케이크 구조 및 성질을 보장하기 위해 동결건조에서 유용하다. 아르기닌은 액체 제형과 동결건조 제형 둘 모두에서 단백질 응집을 억제하는 데 유용할 수 있다. 메티오닌은 항산화제로서 유용하다.
폴리올은 당, 예를 들어, 만니톨, 수크로스, 및 소르비톨, 및 예를 들어, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜과 같은 다가 알코올, 및 본원에서 논의의 목적 상, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련 물질을 포함한다. 폴리올은 코스모트로픽이다. 이들은 물리적 및 화학적 분해 과정으로부터 단백질을 보호하는 데 액체 제형과 동결건조 제형 둘 모두에서 유용한 안정화제이다. 폴리올은 또한 제형의 강장성을 조절하는 데 유용하다.
본 발명의 구현예를 선택하는 데 유용한 폴리올들 중에는 동결건조 제형에서 케이크의 구조적 안정성을 보장하기 위해 흔히 사용되는 만니톨이 있다. 이는 케이크에 대한 구조적 안정성을 보장한다. 이는 일반적으로 동결건조보호제, 예를 들어, 수크로스와 사용된다. 소르비톨 및 수크로스는 강장성을 조절하기 위해, 및 생산 공정 중 대량 제조 또는 수송 중 냉동-해동 스트레스에 대항하여 보호하는 안정화제로서 바람직한 작용제이다. 환원당(유리 알데하이드 또는 케톤 기를 함유함), 예컨대, 글루코스 및 락토스는 표면 라이신 및 아르기닌 잔기를 당화시킬 수 있다. 따라서, 이들은 일반적으로 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 폴리올이 아니다. 또한, 산성 조건 하에 프룩토스 및 글루코스로 가수분해되고, 결과적으로 당화를 일으키는 수크로스와 같은 그러한 반응성 화학종을 형성시키는 당은 또한 이와 관련하여 본 발명의 바람직한 폴리올이 아니다. PEG는 단백질을 안정화시키는 데 그리고 동결보호제로서 유용하고, 이와 관련하여 본 발명에서 사용될 수 있다.
동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형의 구현예는 계면활성제를 추가로 포함한다. 단백질 분자는 공기-액체, 고체-액체, 및 액체-액체 계면에서 표면 상 흡착, 변성, 및 그에 따른 응집에 민감할 수 있다. 이들 영향은 일반적으로 단백질 농도와 반비례한다. 이들 유해한 상호작용은 일반적으로 단백질 농도와 반비례하고, 전형적으로 제품의 운반 및 취급 중에 발생되는 것과 같은 물리적 교반에 의해 악화된다.
계면활성제는 보통 표면 흡착을 방지하거나, 최소화하거나, 감소시키기 위해 사용된다. 이와 관련하여 본 발명에 유용한 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 다른 지방산 에스테르, 및 폴록사머 188을 포함한다.
계면활성제는 또한 단백질 입체구조적 안정성을 제어하기 위해 흔히 사용된다. 이와 관련하여 계면활성제의 사용은, 임의의 주어진 계면활성제가 전형적으로 일부 단백질을 안정화시키고 다른 것들을 탈안정화시킬 것이기 때문에, 단백질-특이적이다.
폴리소르베이트는 산화성 분해에 민감하고, 흔히, 공급된 대로, 단백질 잔기 측쇄, 특히, 메티오닌의 산화를 일으키기에 충분한 양의 과산화물을 함유한다. 결과적으로, 폴리소르베이트는 주의하여 사용되어야 하며, 사용 시, 이의 최저 유효 농도로 사용되어야 한다. 이와 관련하여, 폴리소르베이트는 부형제가 이의 최저 유효 농도로 사용되어야 한다는 일반적인 규칙을 예시한다.
동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형의 구현예는 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함한다. 단백질의 유해한 산화는 적절한 수준의 주위 산소 및 온도를 유지함으로써 그리고 광에 대한 노출을 방지함으로써 약제학적 제형에서 어느 정도 방지될 수 있다. 항산화제 부형제가 마찬가지로 단백질의 산화성 분해를 방지하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여 유용한 항산화제들 중에는 환원제, 산소/자유-라디칼 스캐빈저, 및 킬레이팅제가 있다. 본 발명에 따른 치료학적 단백질 제형에서 사용하기 위한 항산화제는 바람직하게는 수용성이고, 제품의 유효 기간 내내 이의 활성을 유지한다. EDTA는 이와 관련하여 본 발명에 따라 바람직한 항산화제이다.
항산화제는 단백질을 손상시킬 수 있다. 예를 들어, 특히 글루타티온과 같은 환원제는 분자내 디설파이드 연결을 방해할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 항산화제는, 특히, 그 자체로 제형에서 단백질을 손상시킬 가능성을 없애거나 충분히 감소시키기 위해 선택된다.
본 발명에 따른 제형은, 단백질 보조 인자이고, 특정 인슐린 현탁액을 형성시키는 데 필요한 아연과 같이 단백질 배위 착물을 형성시키는 데 필요한 금속 이온을 포함할 수 있다. 금속 이온은 또한 단백질을 변성시키는 일부 과정을 억제할 수 있다. 그러나, 금속 이온은 또한 단백질을 변성시키는 물리적 및 화학적 과정을 촉매작용한다.
마그네슘 이온(10 mM 내지 120 mM)은 아스파트산의 이소아스파트산으로의 이성질체화를 억제하기 위해 사용될 수 있다. Ca+2 이온(최대 100 mM)은 인간 데옥시리보뉴클레아제의 안성정을 증가시킬 수 있다. 그러나, Mg+2, Mn+2, 및 Zn+2는 rhDNase를 탈안정화시킬 수 있다. 유사하게, Ca+2 및 Sr+2는 인자 VIII를 안정화시킬 수 있고, 이는 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2에 의해 탈안정화될 수 있고, 이의 응집은 Al+3 이온에 의해 증가될 수 있다.
동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형의 구현예는 하나 이상의 보존제를 추가로 포함한다. 보존제는 동일한 용기로부터 하나보다 많은 추출을 수반하는 다회-용량 비경구 제형을 개발할 때 필요하다. 이들의 주요 기능은 미생물 생장을 억제하고, 완제 의약품의 유효 기간 또는 사용 기간 내내 제품 멸균성을 보장하는 것이다. 흔히 사용되는 보존제는 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제는 소분자 비경구제로 오랜 사용 역사를 갖지만, 보존제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 난제일 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대하여 탈안정화 효과(응집)를 갖고, 이는 다회-용량 단백질 제형에서 이들의 사용을 제한하는 주요 요인이 되었다. 지금까지, 대부분의 단백질 약물은 일회용으로만 제형화되었다. 그러나, 다회-용량 제형이 가능한 경우, 이들은 환자 편의성, 및 시장성 증가를 가능하게 하는 추가 이점을 갖는다. 보존성 있는 제형의 개발로 보다 편리한 다회용 인젝션 펜(multi-use injection pen) 방식의 상업화를 일으킨 인간 성장 호르몬(human growth hormone: hGH)이 좋은 예이다. 보존성 있는 hGH 제형을 함유하는 적어도 4개의 그러한 펜 장치가 시중에서 현재 입수 가능하다. Norditropin(액체, Novo Nordisk), Nutropin AQ(액체, Genentech) & Genotropin(동결건조--이중 챔버 카트리지, Pharmacia & Upjohn)은 페놀을 함유하는 반면, Somatrope(Eli Lilly)는 m-크레졸로 제형화된다.
보존성 있는 투여형의 제형화 및 개발 중에는 여러 측면이 고려되어야 한다. 완제 의약품에서 유효한 보존제 농도가 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성을 저해하지 않으면서 항균 효과를 주는 농도 범위로 투여형에서 주어진 보존제를 시험하는 것을 필요로 한다.
예상될 수 있는 바와 같이, 보존제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조 제형보다 더 난제이다. 냉동-건조 제품은 보존제 없이 동결건조되고, 사용 시점에 보존제 함유 희석제로 재구성될 수 있다. 이는 보존제가 단백질과 접촉되는 시간을 단축시켜 관련된 안정성 위험을 상당히 최소화한다. 액체 제형의 경우, 보존제 유효성 및 안정성은 전체 제품 유효 기간(약 18개월 내지 24개월) 넘게 유지되어야 한다. 주목할 중요한 점은 보존제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 입증되어야 한다는 것이다.
동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질) 제형은, 일반적으로, 특히, 투여의 특정 경로 및 방법을 위해, 특정 투여 용량 및 투여 빈도를 위해, 특정 질병의 특정 치료를 위해 생체 이용률 및 지속성의 범위로 구성될 것이다. 이에 따라 제형은 경구로, 귀로, 안구로, 직장으로, 및 질로를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 경로에 의해서, 및 정맥내 및 동맥내 주사, 근내 주사, 및 피하 주사를 포함하는 비경구 경로에 의해서 전달을 위해 본 발명에 따라 구성될 수 있다.
약제학적 조성물은 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 결정으로서, 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 그러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태로 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예를 들어, 동결건조된)로 저장될 수 있다. 본 발명은 또한 단일-용량 투여 단위를 생성시키기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 각각 건조된 단백질을 갖는 제1 용기와 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 모두를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정의 구현예에서, 단일 및 다중-챔버형 예비-충전 시린지(예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지)를 함유하는 키트가 제공된다.
사용하고자 하는 치료적 유효량의 동종다량체-함유(예를 들어, TTR 항체 동종이량체-함유, TTR 항체 동종사량체-함유, 또는 TTR Fab 동종사량체-함유 융합 단백질) 약제학적 조성물은, 예를 들어 치료학적 맥락 및 목적에 좌우될 것이다. 당업자는 치료를 위한 적절한 투여량 수준이, 부분적으로, 전달된 분자, 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)가 사용되는 지시, 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 기관 크기) 및/또는 상태(나이 및 일반 건강)에 좌우하여 달라질 것이라는 점을 인지할 것이다. 특정의 구현예에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경할 수 있다. 전형적인 투여량은, 상기 언급된 인자들에 좌우하여, 약 0.1 μg/kg 내지 최대 약 30 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 구체적 구현예에서, 투여량은 1.0 μg/kg 내지 최대 약 20 mg/kg, 선택적으로 10 μg/kg 내지 최대 약 10 mg/kg 또는 100 μg/kg 내지 최대 약 5 mg/kg의 범위일 수 있다.
치료적 유효량의 동종다량체(예를 들어, TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 또는 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질)는 바람직하게는 질병 증상의 중증도 감소, 질병 무증상 기간의 빈도 또는 지속 기간 증가, 또는 질병 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 야기한다.
약제학적 조성물은 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하기 위한 의료 장치의 예는 모두 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제4,475,196호; 제4,439,196호; 제4,447,224호; 제4,447,233호; 제4,486,194호; 제4,487,603호; 제4,596,556호; 제4,790,824호; 제4,941,880호; 제5,064,413호; 제5,312,335호; 제5,312,335호; 제5,383,851호; 및 제5,399,163호에 기재되어 있다.
동종이량체 및 동종사량체 융합 단백질의 치료 용도
실시예에서 예시되는 바와 같이, TTR 동종이량체 융합 단백질을 생성시키기 위한 TTR과 항체의 이량체화, 뿐만 아니라 TTR 동종사량체 융합 단백질을 생성시키기 위한 TTR과 항체 및 Fab 단편의 사량체화가 개별 항체(들) 및/또는 Fab 단편(들)에 비해 증가된 결합능을 갖는 TTR-함유 융합 단백질을 야기한다는 것이 발견되었다.
또한, TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 융합 단백질은 개별 항체(들) 및/또는 Fab 단편(들)에 비해 개선된 항원 클러스터링을 입증하였다. 항체(예를 들어, IgG 항체)가 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)에서 항원을 결합할 때, 얻어지는 클러스터링된 Fc 도메인은 NK 세포 및 대식세포와 같은 면역 이펙터 세포 상에서 발견되는 FcγR과 맞물린다. 이러한 클러스터링은 FcγR을 통한 신호전달을 도와 세포-매개 이펙터 기능, 예컨대, 항체-의존성 세포의 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity: ADCC) 및 항체-의존성 세포의 식균작용(antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP)의 개시를 야기한다. 따라서, TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 융합 단백질은 높은 항체 또는 Fab 친화성/결합능이 향상된 생물학적 효과를 야기하는 리간드를 표적화하는 데 특히 유용하다. 본 발명의 TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 작제물에 의한 세포-매개 이펙터 기능의 향상은, 예를 들어 암의 치료에 유용한, 세포 사멸 능력의 증가를 야기한다.
본 발명의 TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 융합 단백질은 다양한 표적/항원을 결합하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 융합 단백질은 TRAIL, TRAIL2R, GITR, OX40, GLP1, TREM2, 및 4-1BB를 표적화하는 데 있어서 효능제로서 사용될 수 있다. 또한, TTR 동종이량체 및 TTR 동종사량체 융합 단백질은 GIPR, TNFR, 인테그린 수용체, PD-1, PD-L1, TIGIT, LAG-3, 및 TIM-3을 표적화하는 데 있어서 길항제로서 사용될 수 있다.
이에 따라서, 본 발명은 또한 본원에 기재된 동종이량체 융합 단백질 및 동종사량체 융합 단백질을 사용하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 암의 치료에서 본원에 기재된 동종이량체 융합 단백질 및 동종사량체 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
추가의 다른 구현예에서, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 본원에 기재된 동종이량체 융합 단백질 및 동종사량체 융합 단백질에 관한 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 또는 특징을 예시하려는 목적으로 제공된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하려고 의도된 것이 아니다.
실시예 1: 생성된 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 요약
TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝
하기 하이브리도마 유래 항체 및 Fab를 사용하여 융합 단백질을 생성시켰다:
● 하이브리도마 CB10(하이브리도마 10D10으로도 지칭됨)로부터의 항-CB1R 항체 및 Fab
● 하이브리도마 9H6으로부터의 항-GITR 항체 및 Fab
● 항-TRAILR2 항체 코나투무맙 및 상응하는 코나투무맙 Fab
하기 TTR 융합 단백질을 생성시켰다. [TTR] = TTR 사량체이다. 간결함을 위해, His 태그(Fab 작제물의 경우)는 실시예 1 요약에 예시되어 있지 않다.
구체적으로, 하기 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질을 구성하였다. 이러한 작제물에서, 항체 중쇄 둘 모두의 C-말단을 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다.
a. [항-CB1R 항체]2-[TTR]
● "CB1R TTR 항체 동종이량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00001
b. [항-GITR 항체]2-[TTR]
● "GITR TTR 항체 동종이량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00002
c. [항-TRAILR2 항체]2-[TTR]
● "코나투무맙 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00003
또한, 하기 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질을 구성하였다. 이러한 작제물에서, 전하 쌍 돌연변이 D399K 및 E356K(SEQ ID NO: 6, 19, 또는 32)를 함유하는 항체 C-말단의 두 개의 중쇄 중 하나를 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다(링커로 또는 링커 없이). 상보적 세트의 K392D 및 K409D 전하 쌍 돌연변이(SEQ ID NO: 7, 20, 또는 33)를 함유하는 남은 중쇄를 연결된 중쇄와 회합하였다. 실시예에서 작제물의 논의에서, E416K 및 D459K의 논의는 각각 EU E356K 및 EU D399K를 나타낸다는 것을 주지하라. 마찬가지로, 실시예에서 작제물의 논의에서, K420D 및 K437D의 논의는 각각 EU K392D 및 EU K409D를 나타낸다.
a. [항-CB1R 항체]4-[TTR]
● "CB1R TTR 항체 동종사량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00004
b. [항-GITR 항체]4-[TTR]
● "GITR TTR 항체 동종사량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00005
c. [항-TRAILR2 항체]4-[TTR]
● "코나투무맙 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00006
또한, 하기 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 구성하였다. 이러한 작제물에서, 각각의 Fab 단편의 C-말단을 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다.
a. [항-CB1R 항체]4-[TTR]
● "CB1R TTR Fab 동종사량체 융합 단백질"
● 실시예에서 작제물의 논의에서, S215E의 논의는 EU S183E를 나타낸다는 것을 주지하라. 마찬가지로, 실시예에서 작제물의 논의에서, S203K의 논의는 EU S176K를 나타낸다.
● [SEQ ID NO: 44]4-[SEQ ID NO: 1]4 + SEQ ID NO: 11 융합에서, 전하 쌍 돌연변이는 이용되지 않았다. [SEQ ID NO: 45]4-[SEQ ID NO: 1]4 & SEQ ID NO: 46 융합에서, SEQ ID NO: 45는 S215E 전하 쌍 돌연변이를 함유하고, SEQ ID NO: 46은 전하 쌍 S203K 돌연변이를 함유하며, 둘 모두 EU 시스템에 따라 넘버링되었다.
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00007
b. [항-GITR Fab]4-[TTR]
● "GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00008
c. [항-TRAILR2 Fab]4-[TTR]
● "코나투무맙 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질"
● 생성된 서열 쌍:
Figure pct00009
TTR 항체 동종이량체 융합 단백질의 경우, 각 항체 중쇄의 C-말단을 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다. TTR 항체 동종사량체 융합 단백질의 경우, 항체 C-말단의 두 개의 중쇄 중 하나를 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다. TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 경우, 각 Fab 단편의 C-말단을 각 TTR 서브유닛의 N-말단에 연결하였다.
포유동물 발현 플라스미드에 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 위치 지정 PCT 돌연변이(site-directed PCR mutagenesis), 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 효소적 결찰을 포함하는 표준 분자 생물학 기법을 이용하여 융합 단백질을 생성시켰다. (His)6 태그를 Fab C-말단에 첨가한 폴리-히스티딘 태그 Fab-TTR 분자를 또한 생성시켰다.
클로닝된 TTR 융합된 변이체 중쇄 및 Fab DNA를 이들의 각각 클로닝된 항-CB1, 항-GITR 및 항-TR2 항체 경쇄(LC) DNA와 조합하여 사용하여 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 발현을 위한 포유동물 세포를 형질감염시켰다. 일반적으로, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Sambrook et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y]에서 참조될 수 있는 방법에 따라 기법을 수행하였다.
실시예 2: 항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝, 발현, 및 정제
항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝
항-CB1 TTR 항체 동종이량체를 일반적으로 다음과 같이 클로닝하였다. PTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 VH]::huIgG2TO(작제물 C59477)을 후술되는 작제물에 대한 주형으로서 사용하였다. pTT5-del-Bsm-BI 벡터는 BsmBI 제한 부위를 제거한 pTT5 벡터의 유도체이다.
[SEQ ID NO: 5]2-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR1: 주형으로서 C59477 사용, 신호 서열의 아미노 말단, SalI 제한 효소 부위, 및 최적화된 코작(Kozak) 서열을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5' AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC 3')와 C59477 내 기존 BamHI 제한 부위를 없애도록 설계된 3' 프라이머(5' GTG CTG GCG AAT CCA GCT CCA ATA GTC ACC 3') 조합. PCR1은 대략 220개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR2a: 주형으로서 C59477 사용, 기존 BamHI 제한 부위를 없애도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' GAG CTG GAT TCG CCA GCA CCC AGG 3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3) 및 TTR(SEQ ID NO: 1)의 아미노 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5' GGT GCC CGT AGG GCC ACC CGG AGA CAG GGA G 3') 조합. PCR2a는 대략 1250개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR3a: 주형으로서 TTR(SEQ ID NO: 1) 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3) 및 TTR의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5' TCC CTG TCT CCG GGT GGC CCT ACG GGC ACC G 3')와 TTR(SEQ ID NO: 1)의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR3a는 대략 400개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 1, 2a 및 3a를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트(GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit)를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73494: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (huIgG2-TO desK) VH]::TTR3라고 명명하였다.
[[SEQ ID NO: 5]-[GGGGS]]2-[SEQ ID NO: 1]4를 상술된 바와 같이 PCR1을 사용하여 조립하였다. PCR2b: 주형으로서 C59477 사용, 기존 BamHI 제한 부위를 없애도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' GAG CTG GAT TCG CCA GCA CCC AGG 3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3), G4S 링커, 및 TTR(SEQ ID NO: 1)의 아미노 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5' GGA TCC GCC ACC ACC ACC CGG AGA CAG GGA G 3') 조합. PCR2b는 대략 1250개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR3b: 주형으로서 TTR(SEQ ID NO: 1) 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3), G4S 링커 및 TTR의 아미노 말단을 인코딩하는 5' RCR 프라이머(5' GGT GGT GGC GGA TCC GGC CCT ACG GGC ACC G 3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR3b는 대략 400개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 1, 2b 및 3b를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73499: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (huIgG2-TO desK) VH]::G4S::TTR3라고 명명하였다.
[[SEQ ID NO: 5]-[(GGGGS)2]]2-[SEQ ID NO: 1]4를 상술된 바와 같이 PCR1을 사용하여 조립하였다. PCR2c: 주형으로서 C59477 사용, 기존 BamHI 제한 부위를 없애도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' GAG CTG GAT TCG CCA GCA CCC AGG 3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3), (GGGGS)2 링커, TTR(SEQ ID NO: 1)의 아미노 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5' GCC GGA CCC TCC CCC ACC GGA TCC GCC ACC TCC ACC CGG AGA CAG GGA G 3') 조합. PCR2c는 대략 1250개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR3c: 주형으로서 TTR 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3), (GGGGS)2 링커 및 TTR의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5' CCG GTG GGG GAG GGT CCG GCC CTA CGG GCA CCG GTG AAT CCA AGG CTC CT 3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR3c는 대략 400개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 1, 2c 및 3c를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73500: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1(huIgG2-TO desK) VH]::(G4S)2::TTR3라고 명명하였다.
[[SEQ ID NO: 5]-[(GGGGS)3]]2-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR4: 주형으로서 C73500 사용, 5' PCR 프라이머(5' AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC 3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3), (GGGGS)3 링커, 및 TTR(SEQ ID NO :1)의 아미노 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5' CGT AGG GCC GGA CCC TCC CCC ACC GGA GCC CCC GCC CCC GGA TCC GCC ACC TCC 3') 조합. PCR4는 대략 1500개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR5: 주형으로서 C73500 사용, (GGGGS)3 링커를 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5' TCC GGG GGC GGG GGC TCC GGT GGG GGA GGG T 3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR5은 대략 450개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 4 및 5를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73690: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (huIgG2-TO desK) VH]::(G4S)3::TTR3라고 명명하였다.
[[SEQ ID NO: 5]-[(GGGGS)4]]2-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR6: 주형으로서 C73690 사용, 5' PCR 프라이머(5'-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC-3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3) 및 (GGGGS)4 링커를 인코딩하는 3' 프라이머(5' GGA ACC ACC TCC GCC GGA TCC GCC ACC TCC A 3') 조합. PCR6은 대략 1500개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR7: 주형으로서 C73690 사용, (GGGGS)4 링커의 일부를 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5' GGC GGA GGT GGT TCC GGG GGC GGG GGC TCC G 3')와 TTR(SEQ ID NO: 1)의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR7은 대략 450개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 6 및 7을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73729: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (huIgG2-TO desK) VH]::(G4S)4::TTR3라고 명명하였다.
[SEQ ID NO: 6]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR8: 주형으로서 C73494 사용, 5' PCR 프라이머(5'-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC-3')와 huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 글루타메이트 356(EU)를 변환시키도록 설계된 3' 프라이머(5' CTT GGT CAT CTC CTT CCG GGA TGG GGG CAG G 3') 조합. PCR8은 대략 1200개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR9: 주형으로서 C73494 사용, huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 글루타메이트 356(EU)를 변환시키도록 설계된 5' PCR 프라이머(5'-CTG CCC CCA TCC CGG AAG GAG ATG ACC AAG AAC CA-3')와 huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 아스파테이트 399(EU)를 변환시키도록 설계된 3' 프라이머(5' GAA GGA GCC GTC GGA CTT CAG CAT GGG AGG TGT 3') 조합. PCR9는 대략 160개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR10: 주형으로서 C73494 사용, huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 아스파테이트 399(EU)를 변환시키도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' CCT CCC ATG CTG AAG TCC GAC GGC TCC TTC T 3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머 조합. PCR10은 대략 600개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 8, 9 및 10을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73730: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (E416K,D459K)(huIgG2-TO desK) VH]::TTR3라고 명명하였다.
[[SEQ ID NO: 6]-[GGGGS]]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR11: 주형으로서 C73499 사용, 5' PCR 프라이머(5'-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC-3')와 huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 글루타메이트 356(EU)를 변환시키도록 설계된 3' 프라이머(5' CTT GGT CAT CTC CTT CCG GGA TGG GGG CAG G 3') 조합. PCR11은 대략 1200개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR12: 주형으로서 C73499 사용, huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 글루타메이트 356(EU)를 변환시키도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' CTG CCC CCA TCC CGG AAG GAG ATG ACC AAG AAC CA 3')와 huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 아스파테이트 399(EU)를 변환시키도록 설계된 3' 프라이머(5' GAA GGA GCC GTC GGA CTT CAG CAT GGG AGG TGT 3') 조합. PCR12는 대략 160개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR13: 주형으로서 C73499 사용, huIgG2 CH3 내에서 라이신으로 잔기 아스파테이트 399를 변환시키도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' CCT CCC ATG CTG AAG TCC GAC GGC TCC TTC T 3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3') 조합. PCR13은 대략 600개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 11, 12 및 13을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 아미노산 넘버링 및 명명 규칙은 이전 작제물 설명과 동일하다. 생성된 작제물을 C73731: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (E416K,D459K)(huIgG2-TO desK) VH]::G4S::TTR3라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 7을 다음과 같이 구성하였다. PCR14: 주형으로서 C73494 사용, 5' PCR 프라이머(5' AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC -3')와 huIgG2 CH3 내에서 아스파테이트로 잔기 라이신 392(EU)를 변환시키도록 설계된 3' 프라이머(5' GGG AGG TGT GGT ATC GTA GTT GTT CTC CGG CTG C 3') 조합. PCR14는 대략 1300개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR15: 주형으로서 pTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::huFc_(IgG2)(K392D K409D)("C59541") 사용, huIgG2 CH3 내에서 아스파테이트로 잔기 라이신 392(EU)를 변환시키도록 설계된 5' PCR 프라이머(5' CCG GAG AAC AAC TAC GAT ACC ACA CCT CCC ATG C 3')와 huIgG2의 카복실 말단 영역 -(마이너스) 카복실 말단 라이신, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5' AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CCC GGA GAC AGG GAG 3') 조합. PCR15는 대략 200개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 14 및 15를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해된 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT15d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C73513: pTT15d:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 (K420D,K437D)(huIgG2-TO desK) VH]라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 11을 다음과 같이 구성하였다. PCR16: 가변 영역의 아미노 말단 및 BssHII 제한 부위를 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-TTT TTT TTG CGC GCT GTG ATA TTG TGA TGA CTC AGT C)와 가변 영역의 카복실 말단 및 BsiWI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-AAA AAA CGT ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CC)와 조합. PCR16을 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 단편을 이후 BssHII 및 BsiWI로 분해하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 단편을 이후 혼합하고, 신호 펩타이드 및 카파 불변 영역을 함유하는 BssHII 및 BsiWI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5-del-Bsm-BI에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C59474: pTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::[hu 항-<huCB1> 10D10.1 VL]::huKLC라고 명명하였다.
항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 항-CB1 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 발현
항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 항-CB1 TTR Fab 동종사량체 단백질을 일반적으로 하기와 같이 발현시켰다.
HEK 293 6E 세포를 120 RPM의 회전으로 5% CO2와 37℃ 가습의 인큐베이터에서 플랫폼 진탕기 상에 현탁시켜 성장시켰다. 세포 배양 계대 배지는 FreeStyle F-17 + 0.1%(10 mL/L의 10%) Kolliphor P188 + 500 μL/L의 G418 + 6 mM(30 mL/L)의 L-글루타민이었다. 세포를 형질감염 시 세포 밀도가 대략 1.5 e6 VC/mL가 되도록 형질감염 1일 내지 2일 전에 계대 배양하였다. 형질감염 복합체를 10% 부피의 최종 배양물 부피에서 보충물이 없는 Freestyle F17 배지에서 혼합하였다. 배양물 mL 당 0.5 μg의 DNA를 Freestyle F17 배지에 첨가하고, 이후 배양물 mL 당 1.5 μl의 PEImax 시약을 첨가하였다. 그 후에, 배지를 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양물에 첨가하고, 인큐베이터에서 진탕 플랫폼 상에 플라스크를 다시 두었다. 형질감염시킨 지 1시간 내지 4시간 후, 배양물 mL 당 25 μL의 이스톨레이트(Yeastolate) 용액을 첨가하였다. 형질감염시킨 지 6일 후에 컨디셔닝된 배지를 수확하였다.
Freestyle F-17(Cat# 13835), L-글루타민((Cat# 25030), Geneticin G418(Cat# 10131027, 액체)을 Life Technologies로부터 입수하였다. Kolliphor P 188(Cat# K4894)을 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. Difco TC 이스톨레이트 UF(Cat# 292805)를 BD Biosciences로부터 입수하였다. PEI Max(Cat# 24765-2)를 Polysciences로부터 입수하였다.
도 2a, 도 2b, 및 도 2c의 겔에서, 10 μl의 샘플(비가열)을 4% 내지 20% SDS-PAGE의 각 레인에 로딩하고, 쿠마시 블루 계열 염료 시스템(Coomassie blue based dye system)으로 현상하였다. 도 2a 및 도 2b는 항-CB1 TTR 항체 동종이량체 및 항-CB1 TTR 항체 동종사량체 단백질 각각이 HEK 293 세포에서 강하게 발현된다는 것을 입증한다. 도 2a는 항-CB1 TTR 항체 동종이량체([SEQ ID NO: 5]2-[SEQ ID NO: 1]4 및 [[SEQ ID NO: 5]-[(GGGGS)1-4]]2-[SEQ ID NO: 1]4)이 SDS 변성에 저항성이고, 그에 따라 강한 비-공유 복합체를 형성시킨다는 것을 입증한다. 다양한 링커 길이(레인 2에서의 최단([GGGGS]1)에서 레인 5에서의 최장([GGGGS]4)까지)의 경우; 링커 길이는 유의하게 강력한 발현을 나타내지 않았다. 도 2b는 V1 Fc 전하 쌍 돌연변이(하나의 중쇄에서 K409D & K392D 및 D399K & E356K)(SEQ ID NO: 6 및 7)를 사용한 항-CB1 TTR 항체 동종사량체의 형성이 또한 SDS 저항성을 나타낸다는 것을 입증한다. 다양한 중쇄 및 경쇄 DNA 형질감염 비가 나타나 있다(레인 2에서 1:9의 LC:HC 내지 레인 10에서 9:1의 LC:HC). 1:1(레인 6) 및 9:1(레인 10)의 LC:HC 비가 가장 강한 발현을 야기하였다.
도 2c는 항-CB1 TTR Fab 동종사량체 작제물이 HEK 293 세포에서 강하게 발현되고, SDS 저항성이라는 것을 입증한다. TTR 융합은 경쇄 C-말단(레인 3, 5, 7, 및 9 - 더 밴딩)과 비교하여 중쇄 C-말단(레인 2, 4, 6, 및 8 - 덜 밴딩)에서 더 잘 허용되었다. His 태그의 위치는 융합에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다. 레인 2 및 레인 4에서 사용된 중쇄-TTR은 [SEQ ID NO: 44]4-[SEQ ID NO: 1]4이고, 경쇄는 SEQ ID NO: 11이었다. 레인 3 및 레인 5에서 사용된 중쇄는 SEQ ID NO: 44이고, 경쇄-TTR은 [SEQ ID NO: 11]4-[SEQ ID NO: 1]4였다. 레인 6 및 레인 8에서 사용된 중쇄-TTR은 [SEQ ID NO: 45]4-[SEQ ID NO: 1]4이고, 경쇄는 SEQ ID NO: 46이었다. 레인 7 및 레인 9에서 사용된 중쇄는 SEQ ID NO: 45이고, 경쇄-TTR은 [SEQ ID NO: 46]4-[SEQ ID NO: 1]4였다. 전하 쌍 돌연변이는 레인 6 내지 레인 9(SEQ ID NO: 45를 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO: 46을 갖는 경쇄)에서 시험된 항-CB1 TTR Fab 동종사량체 작제물에 포함되었다. SEQ ID NO: 45는 S215E 전하 쌍 돌연변이를 함유하고, SEQ ID NO: 46은 전하 쌍 S203K 돌연변이를 함유하였다. His 태그가 또한 사용되었다(도 2c 참조).
항-CB1 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 정제
항-CB1 TTR Fab 동종사량체 단백질을 일반적으로 하기와 같이 정제하였다. 세포 배양 배지를 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 최소 2시간 동안 pH 8.0로 2 L의 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸에 대해 2회 투석하였다. 제1 컬럼으로서 1 mL Ni-NTA 초유동 카트리지(Superflow cartridge)(Qiagen, 힐덴, 독일), 및 제2 컬럼으로서 5 mL 탈염 HiTrap(GE Healthcare Life Sciences)로 AKTA 정제기(GE Healthcare Life Sciences) 탠덤 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 완충액 교환 세포 배양 배지로부터 분자를 정제하였다. 배지를 Ni-NTA 컬럼 상에 바로 로딩하고, 8 CV의 50 mM Na-포스페이트, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0으로 세척하고, 2 CV의 50 mM Na-포스페이트, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0으로 용리시켰다. Ni-NTA 컬럼 용리액을 탈염 컬럼에 자동으로 채널링시키고, 여기서 단백질을 4 CV의 10 mM Na-아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.2 상에 등용매 용리시켰다. 샘플을 3.0 μm의 유리 섬유/0.2 μm의 Supor 막(Pall Corporation, 포트 워싱턴, 뉴욕, USA)을 통해 멸균 여과하였다.
각각의 정제된 분자의 단백질 농도를 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 록퍼드, 일리노이, USA)을 사용하여 280 nM(A280)에서 UV 흡광도에 의해 결정하였다. SDS-PAGE 분석을 제조업체 지시에 따라 MES 러닝 완충액(running buffer)(Life Technologies, 칼즈배드, 캘리포니아, USA)을 사용하여 변성, 비-환원 4% 내지 12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 상에서 3 μg의 각 최종 정제된 분자에 대하여 실시하였다. HPLC 크기 배제 크로마토그래피 분석을 20 μg의 각 최종 정제된 분자에 대하여 실시하였고, 이를 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9로 1 mL/min에서 Phenomenex SEC 3000 컬럼, 7.8 x 300 mm(Phenomenex, 토런스, 캘리포니아, USA)에서 작동시켜 280 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
항-CB1 TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질의 정제
항-CB1 TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 하기와 같이 정제하였다.
융합 단백질을 먼저 제1 컬럼으로서 1 mL MabSelect SuRe(MSS) HiTrap(GE Healthcare Life Sciences), 및 제2 컬럼으로서 5 mL 탈염 HiTrap(GE Healthcare Life Sciences)로 AKTA 정제기(GE Healthcare Life Sciences, 리틀 찰폰트, 버킹엄셔, UK) 탠덤 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 세포 배양 배지로부터 정제하였다. 배지를 MSS 컬럼 상에 바로 로딩하고, 8 컬럼 부피(CV)의 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4로 세척하고, 2 CV의 100 mM 아세트산으로 용리시켰다. MSS 컬럼 용리액을 탈염 컬럼에 자동으로 채널링시키고, 여기서 단백질을 4 CV의 10 mM Na-아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.2로 등용매 용리시켰다. 샘플을 3.0 μm의 유리 섬유/0.2 μm의 Supor 막(Pall Corporation, 포트 워싱턴, 뉴욕, USA)을 통해 멸균 여과하였다. 각각의 정제된 분자의 단백질 농도를 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 록퍼드, 일리노이, USA)을 사용하여 280 nM (A280)에서 UV 흡광도에 의해 결정하였다. SDS-PAGE 분석을, 제조업체 지시에 따라, 3 μg의 각 최종 정제된 분자에 대하여 실시하고, 이를 MES 러닝 완충액(Life Technologies, 칼즈배드, 캘리포니아, USA)을 사용하여 변성, 비-환원 4% 내지 12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 상에서 작동시켰다. HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 30 μg의 각 최종 정제된 분자에 대하여 실시하였고, 이를 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9로 1 mL/min에서 Phenomenex SEC 3000 컬럼, 7.8 × 300 mm(Phenomenex, 토런스, 캘리포니아, USA)에서 작동시켜 280 nm에서 흡광도를 관찰하였다. 도 3은 링커 부재, (G4S) 링커, (G4S)2 링커, (G4S)3 링커, 또는 (G4S)4 링커를 갖는 항-CB1 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질의 대표적인 HPLC SEC 분석을 나타낸 것이다.
실시예 3: 항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성
항-CB1 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성을 CB1 cAMP 검정을 통해 접근하였다.
hCB1(Euroscreen)을 안정하게 발현하는 CHO 세포를 10% FBS, 1% Pen/Strep/L-글루타민, 25 mM Hepes, 0.1 mM NEAA, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 400 μg/ml의 G418을 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. 항체 활성을 결정하기 위해, 0.5% FBS, 1% Pen/Strep/L-글루타민, 25mM Hepes, 0.1 mM NEAA, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 400 μg/ml의 G418를 함유하는 80 μl의 DMEM에서 96-웰 플레이트에 웰 당 10,000개 세포의 밀도로 세포를 시딩하였다. 밤새 인큐베이션 후, 배지를 꺼내고, 5 μl의 새로운 배지 이어서 5 μl의 배지에 더하여 15 μM의 포스콜린(EMD Chemicals Cat # 344273) 및 250 pM의 CP55,940(TOCRIS Cat # 0949) 이어서 10 mM 아세트산, 150 mM NaCl(pH 5.0) 중의 40 μl의 항체로 교체하였다. 세포를 이후 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 배지를 흡인하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 DiscoverX XS+ cAMP 검정 키트(90-0075-03)를 사용하여 cAMP 수준을 측정하였다. 플레이트를 30초 동안 PerkinElmer ViewLux 마이크로플레이트 영상기에서 판독하였다.
검정 결과는 도 4에 나타나 있다. TTR 항체 동종사량체는 CB1 모 항체보다 3.9 배 더 유리한 EC50를 가졌다. 일부 Fab에는 전하 쌍 돌연변이가 이용된 반면, 다른 것들은 그렇지 않았다(실시예 2에서 도 2의 논의 참조). 이들 결과는 TTR 항체 동종사량체 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질이 모 CB1 Ab에 비해 EC50을 개선한다는 것을 입증한다. 흥미롭게도, 항-CB1 TTR 항체 동종이량체는 링커의 길이가 증가함에 따라 EC50이 저하되면서 CB1 모 항체보다 덜 유리한 EC50을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 4: 항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝, 발현, 및 정제
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝
항-GITR TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 다음과 같이 클로닝하였다. 작제물 C74201(pSLX240p:네이티브::[hu 항-<huGITR> 9H6 (D72(62)E) VH]::huIgG1z-N297G); C143046 (pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (S183E, N297G, E356K, D399K) VH]::TTR(C10A, K15A); C143048(pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (S183K, N297G, K392D, K409D) VH]::TTR(C10A, K15A); C137324(VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 VL]) 및 C73877(pTT5:네이티브::[hu 항-<huGITR> 9H6 VL]::huKLC)을 후술되는 모든 작제물에 대한 주형으로서 사용하였다.
[SEQ ID NO: 18]2-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR17: 주형으로서 C74201을 사용하고, 항-GITR MAb 9H6(w/N297G)의 신호 펩타이드를 3 단계 중복 PCR 신장에 의해 VK1 신호 펩타이드(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)로 교체하고, 최종 PCR의 산물을 이후 5' 신호 펩타이드 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3') 및 3' C-말단 중쇄/N-말단 TTR 프라이머(GGT GCC CGT AGG GCC ACC CGG AGA CAG GGA GAG G)를 사용하여 증폭시켜 1450개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR18: 주형으로서 TTR(SEQ ID NO: 1) 사용, TTR의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-GGC CCT ACG GGC ACC G-3')와 TTR의 카복실 말단, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TCG CTA GCG CGG CCG CTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3' 조합. PCR18은 대략 400개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 17 및 18을 겔 분리시키고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C143043: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (N297G) VH]::TTR(C10A, K15A)라고 명명하였다.
[SEQ ID NO: 21]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR19: 주형으로서 C74201을 사용하고, 항-GITR MAb 9H6(C74201)의 신호 펩타이드를 3 단계 중복 PCR 신장에 의해 VK1 신호 펩타이드(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)로 교체하고, 최종 PCR의 산물을 이후 5' 신호 펩타이드 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3') 및 3' C-말단 중쇄/N-말단 TTR 프라이머(5'- GCT CTC GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG TAG G-3')를 사용하여 증폭시켜 650개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR20: 주형으로서 C74201 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CTC TAC TCC CTC GAG AGC GTG GTG ACC GTG CC-3')와 인간 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-CCT CCT CCA CAA GAT TTG GGC TCA ACT TTC TTG TC-3') 조합. PCR20은 대략 130개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR21: 주형으로서 TTR3 사용, TTR의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CAA ATC TTG TGG AGG AGG CCC TAC GGG CAC CG-3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 두 개의 3' 프라이머(5'-ATG GTG ATG GTG ACC GCC TTC CTT GGG ATT GGT GAC GAC A-3') 및 (5'-ATC GCT AGC GCG GCC GCC TAG TGG TGA TGG TGA TGG TGA CC-3') 조합. PCR21은 대략 450개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 19, 20 및 21을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C144132: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (S183E) scFab]::TTR(C10A, K15A)::G::G::6xHis(정제 목적 상 (His)6 태그가 포함되었다는 것을 주지하라)라고 명명하였다.
[SEQ ID NO: 19]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR22: 주형으로서 C74201 사용, 항-GITR MAb 9H6(C74201)의 신호 펩타이드를 3 단계 중복 PCR 신장에 의해 VK1 신호 펩타이드(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)로 교체하고, 최종 PCR의 산물을 이후 5' 신호 펩타이드 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3') 및 3' C-말단 중쇄/N-말단 TTR 프라이머(5'-TAG GTG CTT CCG TAC TGT TCC TCC CGG GGC TT-3')를 사용하여 증폭시켜 990개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR23: 주형으로서 C143046 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3)을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CCT GAG CAG CGT CGT CAC CGT CCC-3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3)을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TAG GTG CTT CCG TAC TGT TCC TCC CGG GGC TT-3') 조합. PCR23은 대략 370개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR24: 주형으로서 TTR3 사용, TTR의 카복실 말단 영역을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CAG TAC GGA AGC ACC TAC CGG GTG GTG TC-3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TCG CTA GCG CGG CCG CTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3') 조합. PCR24는 대략 900개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 22, 23 및 24를 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C144127: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (N297G, E356K, D399K) VH]::TTR(C10A, K15A)라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 20을 다음과 같이 조립하였다. PCR25: 주형으로서 C143048 사용, 신호 펩타이드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT)와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3)을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-ACG GTG ACG ACG CTG CTC AGG CTG TAC AGG CCG CTG-3') 조합. PCR25는 대략 650개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR26: 주형으로서 C143048 사용, 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3)을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CCT GAG CAG CGT CGT CAC CGT CCC-3')와 카복실 말단 인간 중쇄 불변 영역(CH3)를 인코딩하는 3' 프라이머(5' TAG GTG CTT CCG TAC TGT TCC TCC CGG GGC TT-3') 조합. PCR26은 대략 370개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR27: 주형으로서 TTR3 사용, TTR의 카복실 말단 영역을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CAG TAC GGA AGC ACC TAC CGG GTG GTG TC-3')와 TTR의 카복실 말단 영역, 종결 코돈 및 NotI 제한 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TCG CTA GCG CGG CCG CTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3') 조합. PCR27은 대략 900개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 25, 26 및 27을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C144130: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (N297G, K392D, K409D) VH]라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 25를 다음과 같이 조립하였다. PCR28: 주형으로서 C137324 사용, 신호 서열의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT)와 카복실 말단 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TAT CGC TAG CGC GGC CGC-3') 조합. PCR28은 대략 800개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 28을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 단편들을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C143044: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 VL]라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 26을 다음과 같이 조립하였다. PCR29: 주형으로서 C137324 사용, 신호 서열의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT)와 카복실 말단 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TGG TGC AGC CAC CGT ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CC-3') 조합. PCR29는 대략 400개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR30: 주형으로서 C73877 사용, 카복실 말단 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-ACG GTG GCT GCA CCA TCT G-3')와 카복실 말단 인간 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TAT CGC TAG CGC GGC CGC-3') 조합. PCR 반응 29 및 30을 겔 분리하고, Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 단편을 이후 혼합하고, 유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트를 사용하여 SalI 및 NotI 분해 선형화 포유동물 발현 벡터 pTT5d에 결찰시켰다. 생성된 작제물을 C143049: pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 (S176K) VL]라고 명명하였다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 발현
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 하기와 같이 발현시켰다.
Freestyle F-17(Cat# 13835), L-글루타민((Cat# 25030), Geneticin G418(Cat# 10131027, 액체)을 Life Technologies로부터 입수하였다. Kolliphor P 188(Cat# K4894)을 Sigma-Aldrich로부터 입수하였다. Difco TC 이스톨레이트 UF(Cat# 292805)를 BD Biosciences로부터 입수하였다. PEI Max(Cat# 24765-2)를 Polysciences로부터 입수하였다. HEK 293 6E 세포를 120 RPM의 회전으로 5% CO2와 37℃ 가습의 인큐베이터에서 플랫폼 진탕기 상에 현탁시켜 성장시켰다. 세포 배양 계대 배지는 FreeStyle F-17 + 0.1%(10 mL/L의 10%) Kolliphor P188 + 500 μL/L의 G418 + 6 mM(30 mL/L)의 L-글루타민이었다. 세포를 형질감염 시 세포 밀도가 대략 1.5 e6 VC/mL가 되도록 형질감염 1일 내지 2일 전에 계대 배양하였다. 형질감염 복합체를 10% 부피의 최종 배양물 부피에서 보충물 없이 Freestyle F17 배지에서 혼합하였다. 배양물 mL 당 0.5 μg의 DNA를 Freestyle F17 배지에 첨가하고; 배양물 mL 당 1.5 μl의 PEImax 시약을 첨가하였다. 배양물을 혼합하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양물에 첨가하였다. 그 후에, 인큐베이터에서 진탕 플랫폼으로 배양 플라스크를 다시 두었다. 형질감염시킨 지 1시간 내지 4시간 후, 배양물 mL 당 25 μL의 이스톨레이트 용액을 첨가하였다. 이후, 형질감염시킨 지 6일 후에 컨디셔닝된 배지를 수확하였다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체를 대안적으로 다음과 같이 발현시켰다. HEK 293 세포를 상응하는 cDNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 1.0×106 개 세포/mL의 현탁 HEK 293-6E 세포를 4 mg의 PEI(Polysciences)와 함께 0.5 mg/L의 DNA(pTT5d 벡터에서 0.25 mg/L의 hu 항-<huGITR> 9H6 (N297G) VH]::TTR(C10A, K15A) 및 pTT5d 벡터에서 0.25 mg/L의 hu anti-<huGITR> 9H6 VL)(Durocher et al. NRCC, Nucleic Acids. Res. (2002) 30, e9) 내지 FreeStyle F17 배지(Life Technologies) 중의 1 mg의 DNA로 형질감염시키고, 36℃에서 150 RPM으로 진탕 플라스크에서 인큐베이션하였다. 최종 0.5%의 형질감염을 위한 이스톨레이트(BD Biosciences)를 형질감염시킨 지 4시간 후에 배양물에 첨가하였다. 세포를 0.1% Pluronic F68 및 50 μg/ml의 Geneticin이 보충된 FreeStyle F17 배지에 6 일 동안 현탁시켜 성장시키고, 정제를 위해 수확하였다.
컨디셔닝된 배지를 4% 내지 20% SDS-PAGE 및 Quick 청색 염색 겔을 사용하여 분석하였다. 도 5는 항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질이 HEK 293 세포에서 발현될 수 있다는 것을 입증한다. 발현은 항-GITR TTR 항체 동종사량체 및 TTR Fab 동종사량체에서 가장 강했다. 레인 1은 10.3 mg의 항-GITR TTR 항체 동종이량체(356 KDa)이고; 레인 2는 29.3 mg의 항-GITR TTR 항체 동종사량체(656KDa)이고; 레인 3은 143.6 mg의 항-GITR TTR Fab 동종사량체(256KDa)이고; 레인 4는 100 ng의 항-DNP 항체이고; 레인 5는 250 ng의 항-DNP 항체이고; 레인 6은 500 ng의 항-DNP 항체이고; 레인 7은 1000 ng의 항-DNP 항체였다. 항-DNP 항체는 이 검정에서 어떻게 비접합된 항체가 수행될 것인지에 대한 정보를 제공한다. 비-환원 로딩 완충액 중의 10 μl의 단백질을 각 레인에 첨가하였다. 겔을 가열 없이 작동시켰다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 정제 및 특징화
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 하기와 같이 정제하고, 특징으로 하였다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질을 순차적으로 연결된 두 개의 1 mL r단백질 A 세파로스 고속 유량(ProA FF) HiTrap(GE Healthcare Life Science) 컬럼으로 AKTA 정제기(GE Healthcare Life Sciences) 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 세포 배양 배지로부터 정제하였다. 배지를 ProA FF 컬럼 상에 바로 로딩하고, 5 CV의 둘베코 포스페이트 완충 식염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline: DPBS)(Life Technologies)로 세척하고, 8 CV의 100 mM 아세트산으로 용리시켰다. 정제된 샘플을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 2 L의 10 mM Na-아세테이트, 9% 수크로스, pH 5.2에 대해 2회 투석하였다.
세포 배양 배지로부터 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 5 mL HisTrap 엑셀 HiTrap(GE Healthcare Life Sciences) 컬럼으로 AKTA 정제기 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 정제하였다. 배지를 HisTrap 컬럼 상에 바로 로딩한 후, 20 CV의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척하고, 10 mM 내지 500 mM의 20 CV의 이미다졸 구배로 용리시켰다. 이전 방법에서 크로마토그래피 분리의 부족으로 인해 구배 용리 대신 8 CV의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 7.4 단계 용리를 이용한 점을 제외하고, 통과 분획의 재정제를 동일한 상기 언급된 조건하에 수행하였다. 정제된 샘플을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 2 L의 10 mM Na-아세테이트, 9% 수크로스, pH 5.2에 대해 2회 투석하였다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 단백질 농도를 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 록퍼드, 일리노이, USA)을 사용하여 280 nM(A280)에서 UV 흡광도에 의해 결정하였다.
SDS-PAGE 분석(3 μg의 각각의 항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질에 대하여 수행됨)을 제조업체 지시에 따라 MES 러닝 완충액(Life Technologies, 칼즈배드, 캘리포니아, USA)을 사용하여 변성, 비-환원 4% 내지 12% 비스-트리스 NuPAGE 겔 상에서 실시하였다. 도 6을 참조하라. 레인 1 및 레인 4는 항-GITR TTR 항체 동종이량체이고; 레인 2 및 레인 5는 항-GITR TTR 항체 동종사량체이고; 레인 3 및 레인 6은 항-GITR TTR Fab 동종사량체였다. 도 6은 비-가열, 비-환원 레인을 기반으로 한 모든 세 개의 단백질 융합 작제물에 대한 부분 정제된 산물이 제대로 조립된다는 것을 입증한다. 가열 및 환원 시, 세 개의 단백질 융합 작제물은 이의 예상된 구성 사슬로 분해되었다(상단 밴드는 중쇄이고, 최하단 밴드는 경쇄임).
HPLC 크기 배제 크로마토그래피 분석을 30 μg의 각각의 항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질에 대하여 수행하였다. 크로마토그래피에 1 mL/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9에서 Phenomenex SEC 3000 컬럼, 7.8 × 300 mm(Phenomenex, 토런스, 캘리포니아, USA)를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질를 환원 LCMS 분석을 통해 분석하였다. 20 μg의 물질을 8 M 구아니딘 HCl/트리스 pH 8.0(Teknova, 홀리스터, CA)에서 변성시키고, 50℃에서 20분 동안 10 mM DTT(EMD Millipore, 다름슈타트, 독일)로 환원시켰다. 샘플을 트리클로로아세트산으로 산성화시키고, 10 μg을 Agilent 1260 HPLC(Agilent Technologies, 산타 클라라, CA)를 사용하여 Zorbax 역상 C8 컬럼 상에 주입하였다. 컬럼 용리액을 Agilent 6230 ESI-TOF 질량 분광기(Agilent Technologies, 산타 클라라, CA)의 전자분무 소스에 도입하고, 질량 스펙트럼을 수집하였다. 관련 스펙트럼을 Agilent MassHunter 소프트웨어 패키지 내에서 MaxEnt 알고리즘을 이용하여 분리하였다. LC 및 HC에 대하여 얻어진 질량 스펙트럼을 각 사슬에 대해 이론적으로 계산된 질량과 비교하였다.
정제된 항-GITR TTR 항체 동종이량체를 1.4 CV의 10 mM Na-아세테이트, 150 mM NaCl, pH 5.0에 걸쳐 등용매로 320 mL Superdex 200(GE Healthcare Life Science) 상에서 정제하였다(시간 경과에 따라 축적된 응집물을 제거하기 위해). 분획을 HPLC-SEC 순도에 의해 풀링하기 위해 선택하였다. Superdex 풀을 VivaSpin 10 kDa MWCO 원심분리 여과 장치(Sartorius)를 사용하여 농축시킨 후, 0.2 μm Supor 시린지 여과기(Pall)를 통해 멸균 여과하였다. HPLC 크기 배제 크로마토그래피 분석을 1 mL/min으로 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9에서 Sepax Zenix-C, 7.8 × 300 mm 컬럼(Sepax, 뉴어크, 델라웨어, USA)에서 수행하여 280 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
도 7은 각각의 항-GITR TTR 항체 동종이량체(중앙 피크), TTR 항체 동종사량체(좌측 피크), 및 TTR Fab 동종사량체(우측 피크) 융합 단백질의 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 결과를 나타낸 것이다. SEC 크로마토그램은 주요 피크가 제대로 조립된 분자와 일치하는 예상된 위치에서 용리한다는 것을 입증한다. 더욱이, 비-변성 SEC 정제(SDS-PAGE와 달리)는 융합 단백질이 응집되지 않는다는 개념을 뒷받침한다.
재정제된 항-GITR TTR 항체 동종이량체의 환원 LCMS 재분석을 수행하였다. 약 10 μg의 항-GITR TTR 항체 동종이량체를 Speed-Vac에서 건조시킨 후, 20 mM DTT와 함께 8M Gu-HCl의 용액 20 μL, pH 8.0에 재현탁시켰다. 샘플을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 각 샘플을 개별 단백질 사슬 구성요소로 환원시켰다. 각각의 환원된 샘플을 이후 0.1% TFA의 첨가에 의해 산성화시켰다. LC-MS를 위해, 약 5 μg의 환원된 샘플을 Agilent Technologies 1100 캐필러리 HPLC 상에 주입하여 Agilent Technologies 6224 ESI-TOF 질량 분광기에 분무하였다. 캐필러리 HPLC에 50 μL/min의 유량 및 75℃의 컬럼 온도로 1.0 mm × 50 mm Agilent Zorbax 300SBC8 컬럼을 사용하였다. HPLC에 다음 완충제를 사용하였다: 완충제 A- 0.1% TFA/H2O; 완충제 B- 0.1% TFA/H2O/90% n-프로판올. 구배는 2% B에서 5분 동안, 20분에 걸쳐 45% B까지 램핑, 3분에 걸쳐 95% B까지, 4분 동안 95% B에서 등용매, 및 이후 다시 1분에 걸쳐 2% B 아래로의 개시 조건으로 이루어졌다. ESI-TOF 기기에 대한 MS 방법으로 1 스펙트럼/초의 속도에서 m/z [750-6000]로 스캐닝하였다. 다른 MS 기기적 파라미터는 캐필러리 전압(VCap) = 3200V, 단편 또는 전압 = 225V, 스키머 = 60V, 및 OCT 1 RF Vpp = 800V를 포함한다. LC-MS 데이터의 데이터 분석을 위해, 각 단백질 사슬에 대한 적절한 LC-MS 스펙트럼을 합하고, Agilent MassHunter 소프트웨어를 사용하여 분리하였다. 분리된 출력 질량 범위는 1.0 Da의 질량 단계 및 30.0의 신호/잡음(S/N) 임계치와 함께 [15,000-75,000]였다. 정확한 환원된 사슬 질량을 각 샘플에 대하여 관찰하였다. 75℃의 분석 온도를 사용한 결과 항-GITR TTR 항체 동종이량체 중쇄에서 미량의 Asp-Pro 절단이 관찰되었다.
항-GITR TTR 모 mAb 9H6("1"), 항-GITR TTR 항체 동종이량체("4"), TTR 항체 동종사량체("2"), 및 TTR Fab 동종사량체("3") 융합 단백질의 시차 주사 열량계(Differential Scanning Calorimetry: DSC)를 Malvern MicroCal VP-Capillary DSC에서 수행하였다. 도 8을 참조하라. 다음 파라미터를 이용하였다: 스캐닝 범위 10℃ 내지 100℃; 스캐닝 속도: 1 ℃/min; 스캔전 서모스탯 15 min. 전형적으로, 각 분석을 위해 1 mg/mL의 샘플 중 400 μL를 소비하였다. 데이터를 Origin 7에 프로세싱하였다. 분석된 단백질을 HEK 293-6E 세포에서 발현시켰다. 모 Ab("1")는 글리코실화되었지만, TTR 융합은 N297G a-글리코 변이체였다. 도 8의 결과는 TTR 융합 단백질의 용융 온도가 모 Ab와 비슷하거나 더 우수하다는 것을 입증하는데, 이는 형성된 TTR 융합 단백질이 강하다는 것을 지시한다. 예상된 열 유도 전이 순서는 CH2, Fab, CH3였다.
실시예 5: 항-GITR TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성 및 PK 프로파일
모 항-GITR mAb, 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성 및 PK 프로파일을 평가하였다.
활성 평가
모 항-GITR mAb, 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 결합 및 효능 활성을 하기 검정을 통해 평가하였다. 이들 검정으로부터의 결과는 도 10에 예시되어 있다.
가교가 있는 검정. 96-웰 고-결합 플레이트(Corning 3369)를 각각 1 μg/ml 및 0.3 μg/ml에서 항-CD3 Ab(OKT3) 및 가교제 Ab(염소 항-인간 IgG Fc 가교흡착된 Ab(Thermo Scientific 31125) 또는 염소 항-인간 IgG(H+L)(Pierce 31119))로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음 날, Ab를 세척하고, 항-GITR mAb, 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질 TTR, 또는 아이소타입 대조 mAb를 37℃에서 1시간 동안 포집을 위해 플레이트에 첨가하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 미접촉 T 세포를 웰에 첨가하고(10% FBS, 2 mM L-Glut, 10 mM HEPES, 1 mM NaPyr, 0.1 mM NEAA, 및 50 μM 2ME가 보충된 RPMI1640에서 50 K/웰), 4일 동안 배양하였다. 세포역가글로(CellTiterGlo)(Promega)를 사용하여 증식을 측정하였다.
가교가 없는 검정. 96-웰 고-결합 플레이트(Corning 3369)를 1 μg/ml의 항-CD3 Ab로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 다음 날, 항-CD3 Ab를 세척하고, 항-GITR mAb, 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질 TTR, 또는 아이소타입 대조 mAb를 플레이트에 첨가하고, 이어서, 미접촉 T 세포를 첨가하였다(10% FBS, 2 mM L-Glut, 10 mM HEPES, 1 mM NaPyr, 0.1 mM NEAA, 및 50 μM 2ME가 보충된 RPMI1640에서 50 K/웰). 4일의 배양 후, 증식을 세포역가글로(Promega)를 이용하여 측정하였다.
PK 프로파일 평가
8.75 mg/kg의 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 4.75 mg/kg의 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 3.4 mg/kg의 항-GITR TTR Fab 동종사량체, 및 항-GITR 항체의 경우 2 mg/kg로 표준화된 몰 당량으로 수컷 CD-1 마우스(n= 그룹 당 3마리)에서 정맥내 주사에 의해 PK 프로파일을 결정하였다. 투약 후 0.5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 168, 336, 504, 672, 및 840시간째에 채취한 75 μl의 혈액 샘플로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 각 혈액 샘플을 채취 후 실온에서 유지하고, 30분 내지 40분의 응고 기간 후, 샘플을 보정된 Eppendorf 5417R 원심분리 시스템(Brinkmann Instruments, Inc., 웨스트버리, NY)을 사용하여 약 10분 동안 11,500 RPM으로 2℃ 내지 8℃에서 원심분리하였다. 채취된 혈청을 이후 미리 표지된(각 랫트에 대해) 극저온 저장 튜브로 옮기고, 추후 생분석을 위해 -60℃ 내지 -80℃에서 저장하였다.
Meso Scale Discovery(MSD) 검정에 의해 마우스 혈청에서 모 항-GITR mAb, 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 총 항-GITR 종(즉, 존재하는 임의의 항-GITR 결합 종)을 측정하기 위해 다음 PK 검정을 이용하였다. 일반 결합 96 웰 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, 게이더스버그, MD)를 PBS에서 2 μg/ml의 마우스 항-이디오타입 항-GITR 항체, Mab 1.2.1(Amgen Inc., 사우전드 오크스, CA)로 코팅한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 세척하고, I-Block™(Life Technologies, 칼스배드, CA)로 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 마우스 혈청에서 표준 및 품질 대조군(QC)을 제조하고, PK 샘플을 희석이 필요한 경우 순수한 CD-1 마우스 혈청에서 희석하였다. 표준, QC, 및 샘플을 이후 PBS, 1M NaCl, 0.5% Tween 20 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 완충액에 1:20으로 희석하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 완충액(KPL, 게이더스버그, MD)으로 3회 세척하고, 이어서 희석된 표준, QC, 및 샘플의 50 μl의 샘플을 Mab 1.2.1 항체 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온(대략 25℃)에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액로 3회 세척하고, 이후 비오틴에 접합된 250 ng/ml의 마우스 항-이디오타입 항-GITR 항체, Mab 1.1.1을 50 μl 첨가하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1XKPL 세척 완충액으로 3회 세척한 후, MSD SULFO-TAG(Amgen, Inc.)에 접합된 100 ng/ml의 스트렙트아비딘을 50 μl 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액으로 6회 세척하고, 이어서 150 μl의 1x Read 완충액 T(Meso Scale Discovery)를 첨가하고, MSD 6000 플레이트 리더(Meso Scale Discovery)를 사용하여 전기화학발광성 신호를 측정하였다. 혈청 농도 데이터를 Phoenix®(Phoenix 64, Build 6.4.0.768, Pharsight® Corp. 마운틴 뷰, CA)로 비-컴파트먼트법을 이용하여 분석하였다.
마우스 혈청 샘플의 MSD 검정에 의해 마우스 혈청 내 항-GITR TTR 항체 동종이량체, 항-GITR TTR 항체 동종사량체, 및 항-GITR TTR Fab 동종사량체 융합 단백질에서 항-GITR 결합 종과 TTR 종 둘 모두의 존재를 측정하기 위해 다음 PK 검정을 이용하였다. 일반 결합 96 웰 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, 게이더스버그, MD)를 PBS에서 2 μg/ml의 토끼 항-TTR 다클론성 항체(Amgen Inc., 사우전드 오크스, CA)로 코팅한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 세척하고, I-Block™(Life Technologies, 칼스배드, CA)로 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 마우스 혈청에서 표준 및 품질 대조군(QC)을 제조하고, PK 샘플을 희석이 필요한 경우 순수한 CD-1 마우스 혈청에서 희석하였다. 표준, QC, 및 샘플을 이후 PBS, 1 M NaCl, 0.5% Tween 20 및 1% 소 혈청 알부민 완충제를 함유하는 완충액에 1:20으로 희석하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 완충액(KPL, 게이더스버그, MD)으로 3회 세척하고, 이어서 희석된 표준, QC, 및 샘플의 대략 50 μl의 샘플을 항-TTR 항체 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 완충액으로 3회 세척한 후, 비오틴에 접합된 250 ng/ml의 마우스 항-이디오타입 항-GITR 항체, Mab 1.1.1을 50 μl 첨가하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 1XKPL 세척 완충액으로 3회 세척한 후, MSD SULFO-TAG(Amgen, Inc.)에 접합된 100 ng/ml의 스트렙트아비딘을 50 μl 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액으로 6회 세척하고, 이어서 150 μl의 1x Read 완충액 T(Meso Scale Discovery)를 첨가하고, MSD 6000 플레이트 리더(Meso Scale Discovery)를 사용하여 전기화학발광성 신호를 측정하였다. 혈청 농도 데이터를 Phoenix®(Phoenix 64, Build 6.4.0.768, Pharsight® Corp. 마운틴 뷰, CA)로 비-컴파트먼트법을 이용하여 분석하였다.
PK 분석의 결과는 도 9에서 찾아볼 수 있다. 도 9의 a)(존재하는 임의의 항-GITR 결합 종의 측정)에 의해 입증되는 바와 같이: [1] 항-GITR TTR 항체 동종이량체("1")의 PK는 모 Ab("2")의 PK보다 더 바람직하고; [2] 항-GITR TTR Fab 동종사량체("4")의 PK는 덜 바람직하고, Fab에서 Fc 영역이 결여되고, 그에 따라 이의 반감기를 매개하는/연장하는 능력이 결여된다는 사실에 기여할 가능성이 있고; [3] 항-GITR TTR 항체 동종사량체("3")의 PK는 모 mAb만큼 강하지는 않지만, Fab에 비해 유의하게 향상된 PK를 입증하였다. 도 9의 b)(항-GITR 결합 종과 TTR 종 둘 모두의 존재 측정)는 원형 항-GITR TTR 융합 단백질의 PK가 도 9의 a)에서 관찰된 것에 따른다는 것을 입증하는데, 이는 생체내 단백질분해가 각 TTR 융합 단백질에서 항-GITR 결합 부분을 유리시키지 않는다는 것을 지시한다.
도 10에서 입증되는 바와 같이, 모 항-GITR mAb 9H6의 TTR 융합을 통한 다량체화는 효능이 아니라 결합을 개선한다. GITR의 활성화는 조절 T 세포에 의한 억제를 막는 것으로 알려져 있다. 또한, 클러스터링 및 FcγR 결합은 세포 증식, 사이토카인 생산 및 CD4+ Th9 세포의 유발의 항-GITR 항체 매개 활성화에 필요한 것으로 알려져 있다. 도 10의 a)는 항-GITR TTR 항체 동종이량체("3"), TTR 항체 동종사량체("4"), 및 TTR Fab 동종사량체("2") 융합 단백질의 결합 친화성이 모 항-GITR mAb 9H6("1")보다 바람직하다는 것을 지시한다. 특히, 도 10의 b)에 의해 입증되는 바와 같이, 더 높은 친화성이 세포 기반 분석에서 더 높은 효능을 의미하지는 않았다. 도 10의 b)에서 대조 Ab는 항-GITR mAb의 비-결합 대조 버전이다.
도 9a 및 도 9b의 데이터의 비교는 TTR 작제물의 부분 분자 분해가 거의 없다는 것을 지시한다.
실시예 6: 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝, 발현, 및 정제
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 클로닝
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 다음과 같이 클로닝하였다. 이러한 실험들에서, 항-TRAILR2 항체는 코나투무맙(AMG 655)이고, 항-TRAILR2 Fab는 코나투무맙의 Fab 부분이다.
GITR TTR 발현 플라스미드(실시예 4 참조)를 이러한 항-TRAILR2 TTR 융합의 구성을 위한 주형으로서 사용하였다. 작제물 C36606(pTT5:네이티브::[hu 항-<huTRAILR2> XG1048 (W) VH]::huIgG1(f)) 및 C9448(VK3_A27L::[hu 항-<huTRAILR2> XG1048 VL]::huKLC)은 각각 항-TRAILR2 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에 대하여 사용된 주형이었다. 이들 실험에서, 항-TRAILR2 항체는 코나투무맙(AMG 655)이었다. 항-TRAILR2 서열 주형은 VK1(VK1O2O12) 신호 펩타이드를 갖지 않았으므로, 신호 펩타이드 서열의 카복시 말단에 BssHII 부위와 VK1을 함유하는 pSLX240puro, pSLX240hygro, 및 pSLX240neo 작제물이 확인되었다.
[SEQ ID NO: 31]2-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR31: 주형으로서 C36606 사용, 중쇄 서열 및 VK1(VK1O1O12) 신호 서열의 아미노 말단을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCG CGC TGT CAG GTG CAG CTG CAG GAG -3')와 항-TRAILR2 가변 중쇄 영역을 증폭시키도록 설계된 3' 프라이머(5'-GCT GAG GAG ACG GTG ACC GT-3') 조합. PCR31은 395개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 32: 주형으로서 C-143043 사용, 중쇄 불변 영역의 아미노 말단 및 항-TRAILR2 가변 중쇄의 마지막 18개 염기를 인코딩하는 5' 프라이머(5'-GGT CAC CGT CTC CTC AGC TAG CAC CAA GGG CCC A-3')와 TTR의 카복실 말단, 종결 코돈, NotI 부위, 및 18개 염기 돌출을 인코딩하고 선형화 pSLX240p 플라스미드의 아미노 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG ACG-3') 조합. PCR 32는 1390개의 염기 산물을 생성시켰다. PCR 반응 31 및 32를 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240p:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150225: pSLX240p:VK1O2O12::[hu 항-<huTRAILR2> AMG 655 VH]::IgG1z_SEFL(desK)::TTR(C10A,K15A)라고 명명하였다.
SEQ ID NO:38을 다음과 같이 조립하였다. PCR33: 주형으로서 C9448을 사용하고, 항-TRAILR2 경쇄 가변 영역의 아미노 말단 및 신호 서열을 인코딩하는 5' PCR 프라이머(5'-CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCG CGC TGT GAA ATT GTG TTG ACG CAG-3')와 항-TRAILR2 경쇄 가변 영역을 증폭시키는 3' 프라이머(5'-AGC CAC CGT TCG TTT GAT TTC CAC CTT-3')를 조합하여 363개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR34, 주형으로서 C-143044(pTT5d:VK1O2O12::[hu 항-<huGITR> 9H6 VL]) 사용, 카파 경쇄 불변 영역의 아미노 말단 및 항-TRAILR2 가변 영역의 마지막 9 개의 염기를 인코딩하는 5' 프라이머(5'-ATC AAA CGA ACG GTG GCT GCA CCA TCT-3')와 인간 카파 경쇄 불변 영역의 카복실 말단, 종결 코돈, 및 NotI 제한 효소를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TGT TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG-3') 조합. PCR 34는 대략 330개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 33 및 34를 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240p:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150226: pSLX240h:VK1O2O12::[hu 항-<huTRAILR2> AMG655 VL]::huKLC라고 명명하였다.
[SEQ ID NO: 32]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR 31을 상술된 바와 같이 사용하였다. PCR35: 주형으로서 C-144127을 사용하고, 중쇄 불변 영역의 아미노 말단 및 항-TRAILR2 중쇄 가변 영역의 마지막 18 개 염기를 인코딩하는 5' 프라이머(5'-GGT CAC CGT CTC CTC AGC CTC CAC CAA GGG CCC C-3')와 TTR의 카복실 말단을 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TTAAACGATATCGCTAGCGCGGCCGCTCATTCCTTGGGATTGGTGACG-3')를 조합하여 대략 1390개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 31 및 35를 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240p:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150227: pSLX240p:VK1O2O12::[hu 항-<huTRAILR2> AMG 655 VH]::IgG1z(N297G,KK)::TTR(C10A,K15A)라고 명명하였다.
SEQ ID NO: 33을 다음과 같이 조립하였다. PCR31을 상술된 바와 같이 사용하였다. PCR36: 주형으로서 C-144130을 사용하고, 5' 프라이머(5'-GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCC-3')와 중쇄 불변 영역의 카복실 말단, 종결 코돈, 및 NotI 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CCC GGG GAG AGG CTC A-3')를 조합하여 대략 1 kb 크기의 산물을 생성시켰다. PCR 반응 31 및 36을 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240p:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150228: pSLX240n:VK1O2O12::[hu 항-<huTRAILR2> AMG 655 VH]::IgG1z(N297G,DD)라고 명명하였다.
[SEQ ID NO: 34]4-[SEQ ID NO: 1]4를 다음과 같이 조립하였다. PCR31을 상술된 바와 같이 사용하였다. PCR37: 주형으로서 C144132를 사용하고, 5' 프라이머(5'-GGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA-3')와 6xHis, 종결 코돈, 및 NotI 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCC TAG TGG TGA TGG TGA TGG TGA CC-3')를 조합하여 대략 740개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 31 및 37을 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240p:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150237: pSLX240p :VK1O2O12 ::[hu 항- <huTRAILR2> AMG 655 (S183E) scFab]::G2::TTR(C10A,K15A)::G2::6xHis라고 명명하였다((His)6 태그는 정제 목적 상 포함되었다는 것을 주지하라).
SEQ ID NO: 39를 다음과 같이 조립하였다. PCR33을 상술된 바와 같이 사용하였다. PCR38: 주형으로서 C-143049를 사용하고, 5' 프라이머(6186-65)와 카파 경쇄 불변 영역의 카복실 말단, 종결 코돈, 및 NotI 부위를 인코딩하는 3' 프라이머(5'-TGT TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3')를 조합하여 대략 330개의 염기 쌍 산물을 생성시켰다. PCR 반응 33 및 38을 Qiagen 컬럼 상에서 정제하였다. 이들 단편을 이후 결찰 독립적 클로닝 반응(유전자기술 심리스 클로닝 및 조립 키트)에서 BssHII 및 NotI 부위에 선형화된 pSLX240h:VK1 플라스미드와 조합하였다. 생성된 작제물을 C-150238: pSLX240h:VK1O2O12::[hu 항-<huTRAILR2> AMG 655 VL]::huKLC-S176K라고 명명하였다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 발현
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 하기와 같이 발현시켰다.
TTR 융합 단백질을 현탁 적응형 CHO-K1 세포에서 안정하게 발현시켰다. 형질감염을 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 LTX(Invitrogen™)를 사용하여 수행하였다. 총 30 μg 내지 36 μg의 포유동물 발현 플라스미드 DNA를 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR Fab 동종사량체의 경우에 1:1 비(1 HC 또는 Fab-HC 대 1 LC), 또는 TTR 항체 동종사량체의 경우에 1:1:1 비(1 HC+ 대 1 HC- 대 1 LC)로 사용하였다. 각각에 대하여, 플라스미드 DNA를 3 ml 내지 4 ml의 OPTI-MEM(Gibco)에 첨가하고, 혼합하였다. 별개의 튜브에서, 72 μl 내지 75 μl의 리포펙타민 LTX를 3 ml 내지 4 ml의 OPTI-MEM에 첨가하였다. 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 형질감염 복합체를 형성시키기 위해, 각각에 대한 DNA 및 리포펙타민 LTX 혼합물을 합하고, 실온에서 추가 20분 동안 인큐베이션하였다. 로그 기 CHO-K1 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고(5 분 동안 1200 RPM 내지 1500 RPM), 1X PBS(Gibco)로 1회 세척하고, OPTI-MEM에서 1.5 내지 2 e6 생세포/mL로 재현탁시켰다. 각각의 형질감염을 위해, 5 mL 내지 6 mL의 세척된 세포를 125 mL 부피 진탕 플라스크에 첨가하였다. DNA 형질감염 복합체를 각각에 대한 세포에 첨가하였다. 플라스크를 36℃, 5% CO2에서 인큐베이션하여 150 RPM에서 6시간 동안 진탕시켰다. 형질감염을 중단하기 위해, 9 ml 내지 12 ml의 성장 배지를 각 플라스크에 첨가하고, 48시간 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다.
선별을 시작하기 위해, 형질감염 후 72시간째에 원심분리(5분 동안 1200 RPM 내지 1500 RPM)에 의해 펠렛화시키고, 배지를 항생제가 보충된 23 mL 내지 25 mL의 성장 배지로 교체하였다. 선별 배지를 주당 2회 내지 3회 바꿔서, 필요 시 배지가 확실히 과성장(5 내지 6 e6 vc/mL 미만)되지 않도록 세포 생존율 및 밀도가 회복될 때까지 배양물을 희석하였다.
대규모 생산(2.3 L 내지 2.5 L)을 36℃로 진탕 플라스크에서 수행하였다. 산물을 생산 배지에 2 e6 vc/mL로 시딩하였다. 컨디셔닝된 배지를 원심분리 그리고 이어서 여과(0.45 μm)에 의해 5일째에 수확하였다.
도 11에서 입증되는 바와 같이, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질는 잘 발현되고 제대로 조립된다(도 11의 a) 참조). 도 11의 b)는 예상된 융합 단백질 구성요소가 가열 및 환원 시에 존재한다는 것을 입증한다. 레인 당 5 μl의 컨디션 배지를 로딩하고, 4% 내지 20% TG 겔 상에 흐르게 하였다. 도 11의 a)에서 알 수 있는 바와 같이, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR Fab 사량체는 완전 조립된 복합체에 대하여 예상되는 바와 같이 표준 항체보다 더 큰 복합체로서 SDS-PAGE 상에서 이동하였다. 도 11의 b)에서 알 수 있는 바와 같이, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR Fab 동종사량체는 중쇄(상단 밴드)뿐만 아니라 유리 경쇄(하단 밴드)를 갖는 융합 분자에 대하여 예상되는 바와 같이 환원 SDS-PAGE 상에서 이동하였다.
도 12에서 입증되는 바와 같이, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체는 잘 발현되고(~150 mg/L에서), CHO-K1 세포에서 제대로 조립되었다(도 12의 a) 참조, 상단 밴드). 도 12의 b)는 동종사량체 복합체가 가열 시 이들의 예상된 구성요소로 분해된다는 것을 나타내고, 반면에 도 12의 c)는 동종사량체 복합체가 가열 및 환원 시 이들의 예상된 구성요소로 분해된다는 것을 나타낸다. 레인 당 2 μl 내지 5 μl의 컨디션 배지를 로딩하고, 4% 내지 20% TG 겔 상에 흐르게 하였다.
도 13은 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 및 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체가 제대로 조립되고, 가열 및 환원 시 분자가 이들의 예상된 구성 사슬(상단 밴드(들)는 중쇄이고, 최하단 밴드는 경쇄임)로 분해된다는 것을 나타낸다. 도 13은 TTR 작제물이 다양한 항체로 생성될 수 있다는 것을 입증한다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 정제 및 특징화
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 다음과 같이 정제하였다. 순차적으로 연결된 두 개의 5 mL ProA FF HiTrap(GE Healthcare Life Science) 컬럼으로 AKTA 정제기(GE Healthcare Life Sciences) 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 세포 배양 배지로부터 분자를 정제하였다. 배지를 ProA FF 컬럼 상에 바로 로딩한 후, 5 CV의 DPBS(Life Technologies)로 세척하고, 8 CV의 50 mM 아세트산, pH 3.2로 용리시켰다. ProA FF 용리 풀을 2 M 트리스-HCl, pH 9.2를 사용하여 pH 5.0으로 적정한 후, 9 부피의 멸균수로 희석하였다. 컨디셔닝된 ProA FF 풀을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 2 L의 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0에 대해 2회 투석하였다. 투석된 풀을 20 mM NaH2PO4, pH 7.0로 5 CV의 세척을 사용하여 18 mL SP Sepharose 고 성능(SP HP)(GE Healthcare Life Science) 컬럼에서 정제하고, 0 mM 내지 500 mM의 20 CV의 NaCl 구배로 용리시켰다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 순도에 의해 풀링을 위해 선별하였다. SP HP 풀을 VivaSpin 10 kDa MWCO 원심분리 여과 장치(Sartorius, 괴팅겐, 독일)를 사용하여 농축한 후, 1.4 CV의 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, pH 7.0에 걸쳐 등용매로 320 mL Superdex 200(GE Healthcare Life Science) 상에서 정제하였다. SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 순도로 풀링을 위해 분획을 선택하였다. SP HP 풀을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 2 L의 10 mM MES, 150 mM NaCl, pH 7.0에 대해 2회 투석하였다. 투석된 샘플을 VivaSpin 10 kDa MWCO 원심분리 여과 장치(Sartorius)를 사용하여 농축한 후, 0.2 μm Supor 시린지 필터(Pall)를 사용하여 멸균 여과하였다.
항-TRAILR2 Fab 동종사량체 융합 단백질을 일반적으로 다음과 같이 정제하였다. 50 mL Ni Sepharose 엑셀(Ni 엑셀)(GE Healthcare Life Sciences) 컬럼으로 AKTA 정제기(GE Healthcare Life Sciences) 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 세포 배양 배지로부터 분자를 정제하였다. 배지를 HisTrap 컬럼 상에서 바로 로딩한 후, 10 CV의 20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 7.4로 세척하고, 10 mM 내지 500 mM의 8 CV의 이미다졸 구배로 용리시켰다. Ni 엑셀 풀을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 2 L의 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0에 대해 2회 투석하였다. 투석된 풀을 20 mM NaH2PO4, pH 7.0로 5 CV의 세척을 이용하여 18 mL SP Sepharose 고 성능(SP HP)(GE Healthcare Life Science) 컬럼에서 정제하고, 0 mM 내지 500 mM의 20 CV의 NaCl 구배로 용리시켰다. 분획을 SDS-PAGE 및 HPLC-SEC 순도에 의해 풀링을 위해 선별하였다. SP HP 풀을 10 kDa MWCO Slide-a-lyzer(Thermo Fisher Scientific)를 2 L의 10 mM MES, 150 mM NaCl, pH 7.0에 대해 2회 투석하였다. 투석된 샘플을 VivaSpin 10 kDa MWCO 원심분리 여과 장치(Sartorius)를 사용하여 농축한 후, 0.2 μm Supor 시린지 필터(Pall)를 사용하여 멸균 여과하였다. 단백질 농도를 NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, 록퍼드, 일리노이, USA)을 사용하여 280 nM(A280)에서 UV 흡광도에 의해 결정하였다. 제조업체 지시에 따라 MES 러닝 완충제(Life Technologies, 칼즈배드, 캘리포니아, USA)를 사용하여 변성, 비-환원 4% 내지 12% 비스-트리스 NuPAGE 겔에 의해 샘플을 분석하였다. 샘플을 50 mM NaH2PO4, 250 mM NaCl, pH 6.9로 1 mL/min에서 Phenomenex SEC 3000 컬럼, 7.8 × 300 mm(Phenomenex, 토런스, 캘리포니아, USA)에서 분석하여 280 nm에서 흡광도를 관찰하였다.
도 14는 각각의 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체(중앙 크로마토그램), TTR 항체 동종사량체(우측 크로마토그램), 및 TTR Fab 동종사량체(좌측 크로마토그램) 융합 단백질의 HPLC 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석의 결과를 나타낸 것이다. SEC 크로마토그램은 주요 피크가 제대로 조립된 분자와 일치하는 예상된 위치에서 용리한다는 것을 입증한다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 환원 LC/MS 분석을 수행하였다. 샘플을 200 mM 암모늄 아세테이트로 완충액 교환하고, 미처리 MS 연구를 위해 최종 MS-작업 용액으로서 5 μM로 제조하였다. 샘플을 또한 LC-MS 분석을 위해 8 M 구아니딘 HCl에서 변성시키고, 20 mM DDT에서 환원시켰다. 2 μg의 물질을 이후 LC-MS 시스템에 주입하였다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 미처리 MS 및 이온 이동도 분석을 포지티브 나노플로우 ESI 모드(positive nanoflow ESI mode)로 작동되는 변형 Synapt G1 HDMS 기기를 사용하여 RF-컨파이닝 드리프트-튜브(RF-confining drift-tube)에서 수행하였다. 임계 기기 전압 및 압력은 다음과 같았다: 모세관 전압 0.8 내지 1.0 kV; 샘플 콘 40 V, 추출 콘 1 V; 소스 차단 온도 30℃; 포집 충돌 에너지 4.0 V; RF-컨파이닝 드리프트 셀에 걸쳐 가해진 3.3 V 내지 11.1 V/cm에 상응하는 이동 충돌 에너지 60 V 및 200 V; 포집 입구 3.0 V; 포집 바이어스 16 V(N2; N2로 작동 시 드리프트 셀에 이온을 주입하기 위해서는 증가된 전위가 필요함); IMS DC 입구 5.0 V; IMS DC 출구 0.0 V; 전달 DC 입구 0.0 V; 전송 DC 출구 2.0 V; 전달 파속 70 m/sec; 전달 파 진폭 4.0 V; 이동 포집 방출 시간 250 μsec; 포집 높이 20.0 V; 추출 높이 0.0 V; 소스 RF 진폭(피크-대-피크) 450 V; 삼중파 RF 진폭(피크-대-피크), 포집 380 V, IMS 150 V, 전달 380 V; 소스 배압 6.0 mbar; 포집/전달 압력 SF6, 3.3e-2 mbar(표시된 피라니 게이지; 유량 3.0 mL/min); IMS 압력 N2 2.05 mbar(1.54 Torr; 유량 38 mL/min); IMS 압력 He 2.70 mbar(2.03 Torr; 유량 70 mL/min). RF-컨파이닝 드리프트 셀 내 압력을 MKS Baratron 커패시턴스 나노미터, 타입 626(범위 10 Torr; 0.25%로 정확) 및 MKS PDR2000 전원 공급기를 사용하여 정확하게 측정하였다. 주위 온도를 Oakton Temp10T 서모커플을 사용하여 측정하였다. 온도를 커패시턴스 나노미터가 기기 이온 광학 리드(instrument ion optics lid)에 연결되는 지점에서 측정하였다. 기기 제어 및 데이터 획득을 MassLynx 4.1 SCN 639, SCN744를 통해 수행하였다. 드리프트-셀 장치 내 압력 및 드리프트 셀의 주위 온도를 정확히 측정하고, 상이한 드리프트-셀 전압(60 V 내지 200 V)에서 최대 10회의 이동도 측정을 구성함으로써 이동도, 및 이에 따른 Ω 값을 만들었다. 각각의 획득을 위해 개별 온도 및 압력 측정을 수행하고, 최종 Ω 값 계산을 위해, 평균 온도 및 압력 값을 이용하였다. 10분에 걸친 전형적인 온도 및 압력 차이는 0.2℃ 이하 및 0.002 Torr 이하였다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 변성 LC-MS 분석의 실시를 45℃ 및 400 μL/min의 유량에서 작동되는 C4 BEH 2.1 × 50 mm 분석용 컬럼 상에 바로 2 μg의 변성되고 환원된 단백질을 주입함으로써 수행하였다. MS-검출을 Waters XevoQ-ToF 질량 분광기에서 수행하였다. 샘플 콘 및 추출 콘을 각각 35 V 및 1 V로 설정하였다.
질량 분석 및 이온 이동도 결과: 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체: 미처리-MS 측정 MW는 645.9 kDa이고, 이온 이동도 측정 N2-CCS 값은 190.1 nm2이고, 서브유닛의 변성 및 환원 MW는 23,388 Da, 49,180 Da 및 62,872 Da이었다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질: 미처리-MS 측정 MW는 250.5 kDa이고, 이온 이동도 측정 N2-CCS 값은 130.3 nm2이고, 서브유닛의 변성 및 환원 MW는 23,429 Da 및 38,582 Da이었다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 융합 단백질 미처리-MS 측정 MW는 347.2 kDa이고, 이온 이동도 측정 N2-CCS 값은 124.0 nm2이고, 서브유닛의 변형되고 감소된 MW는 23,391 Da 및 62,867 Da이었다.
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 SEC-배각 광 산란(Multiple Angle Light Scattering: MALS)을 Wyatt Heleos II 및 OptiLab-TrEX 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC에서 수행하였다. 사용된 컬럼은 Superdex 200(10/300GL)이었다. 이동상은 0.4 ml/min의 유량으로 2X PBS였다. 작동 시간은 샘플 당 70분이었다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 및 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질의 네 개의 SP 분획(A3, A8, A12 및 C1)의 주입량은 각각 81 μg, 63 μg, 75 μg 및 75 μg인 반면, 항-TRAILR2-TTR의 최종 풀에 대한 주입량은 77 ug이었다. 작동 설정, 데이터 수집 및 분석 절차를 Agilent의 Chemstation(v B.04.02 96) 및 Wyatt의 ASTRA(v 6.1.1.17) 소프트웨어에서 수행하였다.
실시예 7: 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성 및 PK 프로파일
모 항-TRAILR2 mAb(코나투무맙), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성 및 PK 프로파일을 평가하였다.
PK 프로파일
항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, TTR 항체 동종사량체, 및 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 PK 프로파일을 6.5 mg/kg의 TTR 항체 동종사량체, 3.5 mg/kg의 TTR 항체 동종이량체, 2.5 mg/kg의 TTR Fab 동종사량체, 및 코나투무맙 및 코나투무맙-341-G1(코나투무맙-341-G1은 TRAILR2를 더 이상 결합하지 않도록 조작된 Ab임) 항체의 경우 1.5 mg/kg으로 표준화된 몰 당량으로 수컷 CD-1 마우스(n= 그룹 당 3마리)에서 정맥내 주사에 의해 결정하였다. 투약 후 0.5, 2, 8, 24, 48, 72, 96, 192, 336, 504, 672, 및 840시간째에 채취한 75 μl의 혈액 샘플로부터 혈청 샘플을 채취하였다. 각 혈액 샘플을 채취 후 실온에서 유지하고, 30분 내지 40분의 응고 기간 후, 샘플을 보정된 Eppendorf 5417R 원심분리 시스템(Brinkmann Instruments, Inc., 웨스트버리, NY)을 사용하여 약 10분 동안 11,500 RPM으로 2℃ 내지 8℃에서 원심분리하였다. 채취된 혈청을 이후 미리 표지된(각 랫트에 대해) 극저온 저장 튜브로 옮기고, 추후 생분석을 위해 -60℃ 내지 -80℃에서 저장하였다.
Meso Scale Discovery(MSD) 검정에 의해 마우스 혈청에서 코나투무맙, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 총 항-TRAILR2 종(즉, 존재하는 임의의 항-TRAILR2 결합 종)을 측정하기 위해 다음 PK 검정을 이용하였다. 마우스 혈청 샘플에서 코나투무맙의 총량을 측정하기 위해, 일반 결합 96 웰 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, 게이더스버그, MD)를 PBS에서 2 μg/ml의 토끼 항-코나투무맙 다클론성 항체, Mab 1.2.1(Amgen Inc., 사우전드 오크스, CA)로 코팅한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 세척하고, I-Block™(Life Technologies, 칼스배드, CA)로 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 마우스 혈청에서 표준 및 품질 대조군(QC)을 제조하고, PK 샘플을 희석이 필요한 경우 순수한 CD-1 마우스 혈청에서 희석하였다. 표준, QC, 및 샘플을 이후 PBS, 1M NaCl, 0.5% Tween 20 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 완충액에 1:20으로 희석하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 완충액(KPL, 게이더스버그, MD)로 3회 세척하고, 이어서 희석된 표준, QC, 및 샘플의 50 μl의 샘플을 항-코나투무맙 항체 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온(대략 25℃)에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액으로 3회 세척하고, 이후 5% BSA를 함유하는 I-Block™ 중의 MSD SULFO-TAG(Amgen Inc., 사우전드 오크스, CA)에 접합된 100 ng/ml의 마우스 항-hu Fc 항체, 클론 1.35.1을 50 μl 첨가하고, 실온에서 1.5 h 동안 인큐베이션하였다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 작제물의 경우, 비오틴에 접합된 250 ng/ml의 마우스 항-카파 LC, 클론 KCF-9를 50 μl 첨가하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하고; 이후, 1XKPL 세척 완충액으로 플레이트를 세척한 후, MSD SULFO-TAG(Amgen, Inc.)에 접합된 100 ng/ml의 스트렙타비딘을 50 μl 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액으로 6회 세척하고, 이어서 150 μl의 1X Read 완충액 T(Meso Scale Discovery)를 첨가하고, MSD 6000 플레이트 리더(Meso Scale Discovery)를 사용하여 전기화학발광성 신호를 측정하였다. 혈청 농도 데이터를 Phoenix®(Phoenix 64, Build 6.4.0.768, Pharsight® Corp. 마운틴 뷰, CA)로 비-컴파트먼트법을 이용하여 분석하였다.
마우스 혈청 샘플의 MSD 검정에 의해 마우스 혈청 내 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질에서 항-TRAILR2 TTR 결합 종과 TTR 종 둘 모두의 존재를 측정하기 위해 다음 PK 검정을 이용하였다. 일반 결합 96 웰 MSD 플레이트(Meso Scale Discovery, 게이더스버그, MD)를 PBS에서 2 μg/ml의 토끼 항-TTR 다클론성 항체(Amgen Inc., 사우전드 오크스, CA)로 코팅한 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 이후 세척하고, I-Block™(Life Technologies, 칼스배드, CA)로 4℃에서 밤새 블로킹하였다. 마우스 혈청에서 표준 및 품질 대조군(QC)을 제조하고, PK 샘플을 희석이 필요한 경우 순수한 CD-1 마우스 혈청에서 희석하였다. 표준, QC, 및 샘플을 이후 PBS, 1M NaCl, 0.5% Tween 20 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 완충액에 1:20으로 희석하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 완충액(KPL, 게이더스버그, MD)으로 3회 세척하고, 이어서 희석된 표준, QC, 및 샘플의 50 μl의 샘플을 항-TTR 항체 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액로 3회 세척하고, 이후 비오틴에 접합된 250 ng/ml의 토끼 항-코나투무맙 다클론성 항체를 50 μl 첨가하고, 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1XKPL 세척 완충액으로 3회 세척한 후, MSD SULFO-TAG(Amgen, Inc.)에 접합된 100 ng/ml의 스트렙트아비딘을 50 μl 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 대략 200 μl의 1X KPL 세척 완충액으로 6회 세척하고, 이어서 150 μl의 1x Read 완충액 T(Meso Scale Discovery)를 첨가하고, MSD 6000 플레이트 리더(Meso Scale Discovery)를 사용하여 전기화학발광성 신호를 측정하였다. 혈청 농도 데이터를 Phoenix®(Phoenix 64, Build 6.4.0.768, Pharsight® Corp. 마운틴 뷰, CA)로 비-컴파트먼트법을 이용하여 분석하였다.
PK 분석의 결과는 도 15에서 찾아볼 수 있다. 도 15의 a)(임의의 항-TRAILR2 결합 종의 측정)에 의해 입증되는 바와 같이: [1] 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("1")의 PK는 모 Ab(코나투무맙("3"); 및 코나투무맙-341-G1("2"))의 PK보다 더 우수하고; [2] 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("5")의 PK는 불량하고, Fab에 Fc 영역이 결여되고, 그에 따라 이의 반감기를 매개하는/연장하는 능력이 결여된다는 사실에 기여할 가능성이 있고; [3] 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("4")의 PK는 모 mAb(코나투무맙)의 PK와 유사했다. 특히, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체는 이의 모체(코나투무맙)에 비해 훨씬 더 우수한 PK를 입증하였는데, 이는 항-GITR TTR 항체 동종사량체에 대하여 관찰된 것(이는 모 mAb 만큼 강하지는 않지만, Fab에 비해 여전히 유의하게 향상된 PK를 입증함)과 상이했다. 이러한 관찰은 TTR 항체 동종사량체 융합 단백질의 PK가 항체 및/또는 표적 의존성일 수 있다는 것을 시사한다. 도 15의 b)(항-TRAILR2 TTR 결합 종과 TTR 종 둘 모두의 측정)는 원형 항-GITR TTR 융합 단백질의 PK가 도 15의 a)에서 관찰된 것에 따른다는 것을 입증하는데, 이는 생체내 단백질분해가 각 TTR 융합 단백질에서 항-GITR 결합 부분을 유리시키지 않는다는 것을 지시한다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("1"); 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("2"); 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("3")는 도 15의 b)에서 평가된다.
세포-기반 활성 검정
흑색종 세포주 WM35(ATCC)에 대한 항-TRAILR2 TTR 융합 단백질 대 코나투무맙 + 단백질 G의 활성을 평가하였다. DR5를 발현하지만 DR4를 발현하지 않는 WM35를 평가하였다. TRAIL은 DR5와 DR4 둘 모두를 활성화시킨다. WM35 세포를 미량정량판(microtiter plate)의 웰 당 104개의 세포로 플레이팅한 후, 가교를 증진시키는 1 μg/ml의 단백질 G(Pierce)의 부재 또는 존재에서 코나투무맙, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 또는 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 3개씩 분석하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간의 인큐베이션 후, 세포 생존율을 세포 역가-글로 검정(Promega)을 이용하여 평가하였다. 세포 역가-글로 반응을 제조업체의 지시에 따라 수행하고, 발광을 Perkin Elmer Envision을 사용하여 측정하였다. y-축은 상대 광 단위(RLU)로서 발광 신호를 나타내고; 감소된 RLU는 ATP 생산 감소 및 감소된 생존 세포 수를 반영한다. x-축은 단백질 농도를 나타낸다.
도 16은 WM35 검정의 결과를 예시한 것이다. 코나투무맙("1")은 단백질 G(두 개의 Ig 결합 부위를 가짐; "5")로 클러스터링되지 않는 한 세포를 사멸시키는 데 비효과적이었다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("2")는 모 코나투무맙보다 WM35 세포를 사멸시키는 데 약간 더 우수했다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("4")는 코나투무맙모다 약간 더 우수한 WM35 세포 사멸 능력을 가졌다. 그러나, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("3")는 WM35 세포를 사멸시키는 데 코나투무맙보다 유의하게 더 효능이 있고, 코나투무맙/단백질 G 클러스터링 복합체보다 훨씬 더 효능이 있었다. 또한, 단백질 G와 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("6")의 클러스터링은 융합 단백질의 효능을 개선한 반면, 단백질 G("8")와 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체의 클러스터링은 더 적은 효과를 가졌다. 흥미롭게도, 단백질 G("7")와 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체의 클러스터링은 단백질 융합의 효능을 약간 저하시켰다. 이들 결과는 TTR 항체 동종사량체-매개된 클러스터링이 항-종양 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다.
일차 인간 케라티노사이트(Lonza)에 대한 항-TRAILR2 TTR 융합 대 코나투무맙 + 단백질 G의 활성을 또한 평가하였다. 일차 케라티노사이트를 미량정량판의 웰당 104 개의 세포로 플레이팅한 후, 단독의 TRAIL, 가교를 촉진하는 1 μg/ml 단백질 G(Pierce)와 코나투무맙, 또는 TRAIL에 더하여 1 ug/ml 코나투무맙과 함께 인큐베이션하였다. 샘플을 각 조건에 대하여 세 개씩 제조하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간의 인큐베이션 후, 세포 생존율을 세포 역가-글로 검정(Promega)을 이용하여 평가하였다. 일차 케라티노사이트를 또한 미량정량판의 웰당 104 개의 세포로 플레이팅한 후, 지시된 농도에서 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체, 코나투무맙, 또는 TRAIL과 함께 인큐베이션하였다. 1 μg/ml의 코나투무맙과 조합된 TRAIL을 또한 시험하였다. 샘플을 세 개씩 제조하였다. 37℃, 5% CO2에서 24시간의 인큐베이션 후, 세포 생존율을 세포 역가-글로 검정(Promega)을 이용하여 측정하였다.
도 17은 케라티노사이트 검정의 결과를 예시한 것이다. 또한, 코나투무맙("1")은 일차 인간 케라티노사이트 세포를 사멸시키는 데 비효과적이었다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("2")는 코나투무맙보다 약간 더 우수한 효능을 입증하였다. 또한, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("3")는 인간 일차 케라티노사이트 세포를 사멸시키는 데 코나투무맙보다 유의하게 더 효능이 있었다. 이들 결과는 또한 TTR 항체 동종사량체-매개 클러스터링이 시험관내 세포 사멸 검정에서 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다.
뮤린 colo 205 선암종 모델-기반 활성 검정
코나투무맙, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 융합 단백질의 활성을 뮤린 Colo205 인간 결장 선암종 모델에서 평가하였다. Colo205 인간 결장 선암종 세포를 10% FBS(Sigma, 2442-500mL), 4 mM의 L-글루타민(Hyclone, SH30034.01), 1 mM HEPES(Hyclone, SH30237.01), 1 mM의 소듐 피라베이트S(Sigma, S8636-100mL) 및 2.5 g/L의 글루코스(Sigma, G8769)가 보충된 RPMI-1640 배양 배지에서 5% CO2 중에 37℃에서 유지하였다. 3회 계대 후, 세포를 수확하고, 무혈청 배지에서 재현탁시켜 10×106 개 세포/mL의 최종 농도를 생성시켰다. 세포 생존율은 트리판-블루 배제에 의해 98%로 결정되었다.
60마리의 암컷 NU/NU 누드 마우스를, 마우스를 이소플루오란으로 마취하면서, 1×106 개의 세포로(100 μL 부피에서) 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 이식 후 7일째에, 종양 부피가 34 mm3 내지 99 mm3인 50마리의 마우스를 각 군이 40 mm3 내지 48 mm3 범위의 유사한 평균 종양 부피를 갖도록 각각 10마리의 마우스가 있는 5개의 치료군으로 분배하였다. 더 작거나 더 큰 종양이 있는 10마리의 마우스는 이 연구에서 배제하였다.
5개 그룹의 동물들은 주당 2회(b.i.w) 복강내 용량의 코나투무맙(0.69 μM/동물), 코나투무맙-341-G1(0.69 μM/동물), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체(0.34 μM/동물), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체(0.17 μM/동물), 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체(0.17 μM/동물)를 3주 동안 그리고 총 6회 치료를 받았다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체(나머지 치료에 비해 결합 부위를 절반만 가짐)를 제외하고 모두 코나투무맙과 동일한 수의 결합 부위를 갖도록 치료를 표준화하였다. 모든 치료를 종양 이식 후 8일째에 시작하고, 25일째에 종료하였다(치료는 8일째, 11일째, 15일째, 19일째, 22일째 및 25일째에 이루어짐). 모든 치료제를 주사 직전 치료 당일에 희석제(DPBS) 중에 새로 제조하였다.
종양 부피 측정: 종양의 길이 및 폭을 ABS 디지매틱 솔라 캘리퍼(Digimatic solar caliper), 모델 # Cd-S6"C(Mitutoyo Corporation, 일본)로 측정하였다. 종양 부피를 0.5 × L × W2로 계산하였고, 여기서 W는 2회의 측정 중 더 작은 것이고, mm3로 표시하였다.
체중 측정: 체중 측정을 위해, 동물들을 저울(Mettler Toledo 모델 PB602-S, 스위스) 위의 중량 접시 상에 놓았다. 3초 기간에 걸친 평균 체중을 저울의 동적 중량 기능을 이용하여 결정하였다. 체중을 100 × (Wc /Wi)로 계산되는 체중 변화로 보고하였고, 여기서 Wc는 현재 체중이고, Wi는 치료 개시 시점의 체중이다. 이 연구를 위해, 모든 동물에 대하여 4일 체중을 Wi로 이용하였다.
안락사: 종양 크기가 1500 mm3 내지 2000 mm3에 도달하였기 때문에 연구 종료 전에 5마리의 동물들을 안락사시켰다. 코나투무맙-341-G1 군: 2마리의 마우스를 25일째에 과도한 종양 부피로 인해 안락사시키고; 또 다른 2마리를 35일째에 과도한 종양 부피로 인해 안락사시켰다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 군에서 10마리의 마우스 및 코나투무맙-341-G1 군에서 나머지 6마리의 마우스를 1200 mm3 초과의 평균 종양 부피 또는 집단 내 마우스의 절반이 넘는 손실로 인해 42일째에 안락사시켰다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 군으로부터 1마리의 마우스를 42일째에 2000 mm3 초과의 종양 크기로 인해 안락사시켰다. 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 군으로부터 1마리의 마우스를 49일째에 과도한 종양 부피로 인해 안락사시켰다. 나머지 동물 모두를 연구 종료로 63일째에 안락사시켰다. 동물들을 이소플루오란 과량투여에 의해 안락사시키고, 이어서 심장 천자에 의해 혈액을 채취하였다.
종양 측정: 4일째 내지 63일째의 데이터를 평균 + 또는 - 표준 오차로 표시하고, 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 성장 곡선 간의 관찰된 차이의 통계적 유의성을 더넷(Dunnett) 조절 다중 비교로 변형된 종양 부피 데이터의 변화에 대한 반복 측정 분석에 의해 평가하였다. 변형 기준선 종양 부피, 일수(day), 치료, 및 일수별 치료 상호작용(day-by-treatment interaction)의 모델 이펙터; 일수가 반복된 값이고, 동물이 대상체이고, 퇴플리츠(Toeplitz) 공분산 구조인 REPEATED 진술; 및 대조군을 다른 치료군과 비교하는 더넷 분석을 한 LSMEANS 진술로 SAS PROC MIXED 절차를 이용하여 분석을 수행하였다. 데이터는 호르비츠(Horwitz) 방법에 따라 변환된 로그 또는 제곱근이었고, 변환된 기준선 종양 부피가 가능한 처리전 종양 부피 차이를 고려하기 위해 모델에서 공변량으로서 포함되었다. 로그 또는 제곱근 변환이 적절한 잔차 분포를 달성하는 데 실패한 경우, 분산 모델의 비모수적 반복 측정 분석을 종양 부피의 등급에 대한 동일한 모델 이펙터로 사용하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 코나투무맙(야생형) 및 코나투무맙-341-G1 군은 분석에서 대조군으로서 사용되었다.
도 18은 뮤린 colo205 모델 시험의 결과를 예시한 것이다. 코나투무맙("그룹 1"; 0.69 μM/동물), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("그룹 4"; 0.17μM/동물), 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("그룹 5"; 0.17 μM/동물) 모두는 투약 중에 생체내 종양 성장을 억제하였고, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체로 투약 중에 가장 우수한 수준의 억제가 입증되었다. 종양 성장을 억제하는 데 있어서 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("그룹 3"; 0.34 μM/동물)만이 비히클 대조군(코나투무맙-341-G1, "그룹 2"; 0.69 μM/동물)보다 미미하게 더 우수했다. 특히, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체는 투약이 중단된 후에 종양 성장을 오랫동안 계속 억제하였다. 또한, 그리고 놀랍게도, 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체는 불량한 PK 프로파일을 가졌지만(도 15), 작제물은 종양 성장을 억제하는 데 코나투무맙만큼 효과적이었다. 특정 이론으로 국한시키려는 것은 아니지만, 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체에 대한 초기 노출은 표적 세포에서 장기간 결합을 필요로 하지 않으면서 사멸을 야기하는 일련의 사건을 유발하는 것이 가능하다. 또한, 비교적 작은 크기의 Fab 작제물은 종양 환경에 대한 보다 우수한 접근을 제공하여 불량한 PK를 보상할 수 있었다. 마지막으로, Fab 작제물의 물리적 입체구조는 생체내에서 보다 효과적일 수 있다.
뮤린 SW403 선암종 모델-기반 활성 검정
SW403 인간 결장 선암종 세포를 10% FBS(Sigma, 2442-500mL), 4 mM의 L-글루타민(Hyclone, SH30034.01)이 보충된 RPMI-1640 배양 배지(Sigma R0883)에서 5% CO2 중에 37℃에서 유지하였다. 5회 계대 후, 세포를 수확하고, 무혈청 배지에서 재현탁시켜 50×106개 세포/mL의 최종 농도를 생성시켰다. 세포 생존율은 트리판-블루 배제에 의해 95%로 결정되었다.
75마리의 암컷 NU/NU 누드 마우스를, 마우스를 이소플루오란으로 마취하면서, 5×106개 세포로(100 μL 부피에서) 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 종양 이식 후 7일째에, 종양 부피가 21 mm3 내지 160 mm3인 60마리의 마우스를 각 군이 58 mm3 내지 66 mm3 범위의 유사한 평균 종양 부피를 갖도록 각각 10마리의 마우스가 있는 6개의 치료군으로 분배하였다. 더 작거나 더 큰 종양이 있는 15마리의 마우스는 이 연구에서 배제하였다.
6개 그룹의 동물들은 주당 2회(b.i.w) 복강내 용량의 코나투무맙 야생형(1.38 μM/동물), 코나투무맙-341-G1(1.38 μM/동물), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체(0.69 uM/동물), 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체(0.34 μM/동물), 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체(0.34 μM/동물), 및 DPBS(비히클 대조군)를 3주 동안 그리고 총 6회 치료를 받았다. 나머지 치료에 비해 결합 부위를 절반만 갖는 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체를 제외하고 각각이 코나투무맙 야생형과 동일한 수의 결합 부위를 갖도록 치료를 표준화하였다. 모든 치료를 종양 이식 후 15일째에 시작하고, 32일째에 종료하였다(치료는 15일째, 19일째, 22일째, 26일째, 29일째 및 32일째에 이루어짐). 모든 치료제를 주사 직전 치료 당일에 희석제(DPBS)에서 새로 제조하였다.
종양 부피 측정: 종양의 길이 및 폭을 ABS 디지매틱 솔라 캘리퍼, 모델 # Cd-S6"C(Mitutoyo Corporation, 일본)로 측정하였다. 종양 부피를 0.5 × L × W2로 계산하였고, 여기서 W는 2회의 측정 중 더 작은 것이고, mm3로 표시하였다.
체중 측정: 동물들을 저울(Mettler Toledo 모델 PB602-S, 스위스) 위의 중량 접시 상에 놓았다. 3초 기간에 걸친 평균 체중을 저울의 동적 중량 기능을 이용하여 결정하였다. 체중을 100 × (Wc/Wi)로 계산되는 체중 변화로 보고하였고, 여기서 Wc는 현재 체중이고, Wi는 치료 개시 시점 체중이다. 이 연구를 위해, 모든 동물에 대하여 4일 체중을 Wi로 이용하였다.
안락사 및 조직 채취: 종양 크기가 1500 mm3 내지 2000 mm3에 도달하였기 때문에 8마리의 동물들을 연구 종료 전에 안락사시켰다. 코나투무맙-341-G1 군으로부터 1마리의 마우스를 33일째에 과도한 종양 부피로 인해 안락사시켰다. 코나투무맙-341-G1 군으로부터 또 다른 마우스, DPBS 비히클 대조군으로부터 2마리, 및 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 군으로부터 1마리를 36일째에 안락사시켰다. 코나투무맙-341-G1, DPBS 비히클 대조군, 및 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체 군에서 나머지 동물들을 모두 39일째에 안락사시켰다. 코나투무맙 WT 군으로부터 1마리의 마우스를 39일째에 안락사시켰다. 코나투무맙 WT 군으로부터 또 다른 마우스 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 군으로부터 1마리를 46일째에 안락사시켰다. 코나투무맙 WT, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체, 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 군에서 나머지 동물들 모두를 연구 종료로 49일째에 안락사시켰다. 모든 안락사를 이소플루오란 과량투여에 의해 수행하고, 이어서 심장 천자에 의해 혈액을 채취하였다.
종양 측정: 7일째 내지 49일째의 데이터를 평균 + 또는 - 표준 오차로 표시하고, 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 성장 곡선 간의 관찰된 차이의 통계적 유의성을 더넷 조절 다중 비교로 변형된 종양 부피 데이터의 변화에 대한 반복 측정 분석에 의해 평가하였다. 변형 기준선 종양 부피, 일수, 치료, 및 일수별 치료 상호작용의 모델 이펙터; 일수가 반복된 값이고, 동물이 대상체이고, 퇴플리츠 공분산 구조인 REPEATED 진술; 및 대조군을 다른 치료군과 비교하는 더넷 분석을 한 LSMEANS 진술로 SAS PROC MIXED 절차를 이용하여 분석을 수행하였다. 데이터는 호르비츠 방법에 따라 변환된 로그 또는 제곱근이었고, 변환된 기준선 종양 부피가 가능한 처리전 종양 부피 차이를 고려하기 위해 모델에서 공변량으로서 포함되었다. 로그 또는 제곱근 변환이 적절한 잔차 분포를 달성하는 데 실패한 경우, 분산 모델의 비모수적 반복 측정 분석을 종양 부피의 등급에 대한 동일한 모델 이펙터로 사용하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계적 계산을 AMG 생물통계적 분석 툴(cld-pweb-taivd.amgen.com/biostats/ Statistics)의 이용을 통해 수행하였다. 코나투무맙 WT 군은 분석에서 대조군으로서 사용되었다.
도 19는 뮤린 SW403 모델 시험의 결과를 예시한 것이다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체("그룹 5") 및 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체("그룹 6")는 투약 중에 코나투무맙("그룹 1")보다 우수하게 생체내 종양 성장을 억제하였다. 항-TRAILR2 TTR 항체 동종이량체("그룹 4")는 코나투무맙과 대체로 동일한 수준으로 투약 중에 성장을 억제하였지만, 이 중 어느 것도 비히클 대조군("그룹 3")보다 성장 억제 시 유의하게 더 우수하지 않았다. 특히, 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체와 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체 둘 모두는 투약이 중단된 후에도 종양 성장을 지연시켰다. 또한, 항-TRAILR2 TTR Fab 동종사량체는 불량한 PK 프로파일을 가졌지만(도 15), 작제물이 투약이 중단된 후에도 종양 성장을 지연시키는 데 항-TRAILR2 TTR 항체 동종사량체 만큼 효과적인 것으로 관찰된 것이 놀라웠다.
도 20은 뮤린 colo205 모델 마우스 및 뮤린 SW403 모델 마우스의 체중이 시험된 모든 화합물들에 대하여 유사하고, 정상적인 상향 궤도에 있는 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 시험된 화합물들이 명시적으로 독성이 아니라는 것을 지시한다(마우스가 정상적으로 섭취하고 체중을 늘리기에 충분히 건강했으므로).
SEQ ID NO의 요약:
Figure pct00010
Figure pct00011
SEQUENCE LISTING <110> AMGEN Inc. <120> TRANSTHYRETIN IMMUNOGLOBULIN FUSIONS <130> IPA200312-US <150> US 62/568,217 <151> 2017-10-04 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Ala Pro Leu Met Val Ala Val 1 5 10 15 Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val 20 25 30 Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe 50 55 60 Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys 65 70 75 80 Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser 100 105 110 Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu 115 120 125 <210> 2 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggccctacgg gcaccggtga atccaaggct cctctgatgg tcgccgttct agatgctgtc 60 cgaggcagtc ctgccatcaa tgtggccgtg catgtgttca gaaaggctgc tgatgacacc 120 tgggagccat ttgcctctgg gaaaaccagt gagtctggag agctgcatgg gctcacaact 180 gaggaggaat ttgtagaagg gatatacaaa gtggaaatag acaccaaatc ttactggaag 240 gcacttggca tctccccatt ccatgagcat gcagaggtgg tattcacagc caacgactcc 300 ggcccccgcc gctacaccat tgccgccctg ctgagcccct actcctattc caccacggct 360 gtcgtcacca atcccaagga a 381 <210> 3 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gly Pro Ala Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val 1 5 10 15 Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val 20 25 30 Phe Lys Lys Thr Ser Glu Gly Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys 35 40 45 Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe 50 55 60 Val Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys 65 70 75 80 Thr Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Phe Ala Asp Val Val Phe Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser 100 105 110 Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn 115 120 125 <210> 4 <211> 615 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg 60 ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc 120 tgatggtcaa agttctagat gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg 180 tgttcagaaa ggctgctgat gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt 240 ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg 300 aaatagacac caaatcttac tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag 360 aggtggtatt cacagccaac gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga 420 gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc 480 ctccagtgga cctgaaggac gagggatggg atttcatgta accaagagta ttccattttt 540 actaaagcac tgttttcacc tcatatgcta tgttagaagt ccaggcagag acaataaaac 600 attcctgtga aaggc 615 <210> 5 <211> 452 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly 20 25 30 Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys 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10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly 210 215 220 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 47 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (34)

  1. 두 개의 항원 결합 단백질을 포함하는 동종이량체 융합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질은 단백질 복합체에 연결되는, 동종이량체 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체인, 동종이량체 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항원 결합 단백질은 항체인, 동종이량체 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 상기 단백질 복합체에 링커 없이 직접적으로 융합되는, 동종이량체 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 직접적으로 융합되는, 동종이량체 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 링커를 통해 상기 단백질 복합체에 융합되는, 동종이량체 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 연결되는, 동종이량체 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 링커는 아미노산 링커인, 동종이량체 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 1개 내지 40개의 아미노산 길이인, 아미노산 링커.
  10. 제9항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 GGGGS, (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)5, 또는 (GGGGS)6인, 아미노산 링커.
  11. 네 개의 항원 결합 단백질을 포함하는 동종사량체 융합 단백질로서, 상기 항원 결합 단백질은 단백질 복합체에 연결되는, 동종사량체 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단백질 복합체는 TTR 단백질 복합체인, 동종사량체 융합 단백질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항원 결합 단백질은 항체인, 동종사량체 융합 단백질.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항원 결합 단백질은 Fab인, 동종사량체 융합 단백질.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 상기 단백질 복합체에 링커 없이 직접적으로 융합되는, 동종사량체 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 직접적으로 융합되는, 동종사량체 융합 단백질.
  17. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질은 링커를 통해 상기 단백질 복합체에 융합되는, 동종사량체 융합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항원 결합 단백질의 C-말단은 TTR 단백질 복합체에 존재하는 N-말단에 연결되는, 동종사량체 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, 상기 링커는 아미노산 링커인, 동종사량체 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 1개 내지 40개의 아미노산 길이인, 아미노산 링커.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 링커는 GGGGS, (GGGGS)2, (GGGGS)3, (GGGGS)4, (GGGGS)5, 또는 (GGGGS)6인, 아미노산 링커.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 동종사량체 융합 단백질을 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질을 사용하여 암을 치료하는 방법.
  25. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 동종사량체 융합 단백질을 사용하여 암을 치료하는 방법.
  26. 암의 치료에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질의 용도.
  27. 암의 치료에서 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 동종사량체 융합 단백질의 용도.
  28. 암의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질.
  29. 암의 치료에서 사용하기 위한 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 동종사량체 융합 단백질.
  30. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들).
  31. 제30항의 핵산을 포함하는, 발현 벡터.
  32. 제30항의 핵산 또는 제31항의 벡터를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
  33. 제32항에 있어서, 상기 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, E5 세포, 새끼 햄스터 신장(baby hamster kidney: BHK) 세포, 원숭이 신장(monkey kidney: COS) 세포, 인간 간세포 암종 세포, 또는 인간 배아 신장 293(human embryonic kidney 293: HEK 293) 세포인, 재조합 숙주 세포.
  34. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동종이량체 융합 단백질 또는 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항의 동종사량체 융합 단백질을 제조하는 방법으로서,
    a) 제32항 또는 제33항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 배양물로부터 동종이량체 또는 동종사량체 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
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