JP2024012336A - トランスサイレチン免疫グロブリン融合物 - Google Patents

トランスサイレチン免疫グロブリン融合物 Download PDF

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Abstract

【課題】その非多量体化対応物と比較して抗体結合活性が増加し、抗原のクラスター化が強化されている多量体化されたタンパク質を提供する。【解決手段】トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質複合体に連結された２つの抗原結合タンパク質を含む、ホモ二量体融合タンパク質であって、抗原結合タンパク質が、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体－２（ＴＲＡＩＬＲ２）、又は抗カンナビノイド受容体－１（ＣＢ１Ｒ）に結合する抗体である、ホモ二量体融合タンパク質を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／５６８，２１７号の利益を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張するものである。
本発明は、抗体及びＦａｂなどの抗体断片の二量体化及び四量体化において有用なトランスサイレチン（ＴＴＲ）融合に関する。本明細書で記載されるＴＴＲ融合タンパク質は、抗体結合活性の増加及び抗原クラスター化の強化において特に有用である。本発明の融合タンパク質を用いた疾患治療方法が、本明細書に記載される。
配列表の参照
本願は、ｅＰＣＴを介して電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１８年１０月２日に作製されたＡ－２１９６－ＷＯ－ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイルとして提供され、サイズが６９，７９１バイトである。電子フォーマットの配列表における情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
トランスサイレチン（ＴＴＲ）は、レチノール結合タンパク質の血清半減期の延長、並びに循環チロキシンの一部の輸送を担う非共有結合性四量体のヒト血清及び脳脊髄液タンパク質である。天然ヒトモノマーは、およそ１４ｋＤａの分子量を有するが、ＴＴＲは、典型的には、５６ｋＤａの四量体血清タンパク質として存在する。
ＴＴＲ及びＴＴＲバリアントは、このような物質の血清半減期を延長するために、生物学的活性物質に前もって融合されている。例えば、生物学的活性物質単独と比較して、延長された血清半減期を示す、ＴＴＲ－（又はＴＴＲバリアント－）生物学的活性物質融合物及びＰＥＧ－ＴＴＲ－（又はＰＥＧ－ＴＴＲバリアント－）生物学的活性物質融合物の実質的に均質な製剤が開発されてきた。例えば、その全体が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００３０１９１０５６号明細書を参照されたい。
加えて、タンパク質を多量体化する以前からの試みとしては、ストレプトアビジン（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（２）：２０３－２１１（１９９６））、ヘリックスターンヘリックス構築物（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：３１－４０（２００１））、ロイシンジッパー（Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（１３）：７６３０－７６３４，１９９６（１９９６））、バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）／バースター（ｂａｒｓｔａｒ）複合体（Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１２）：１４８６－１４９２（２００３））、及びＤｏｃｋ Ｎ Ｌｏｃｋテクノロジー（プロテインキナーゼとＡ－キナーゼアンカータンパク質アンカードメイン相互作用）（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９（１）：１５８－１６３（２００８））の使用が挙げられる。
しかし、強化された生物学的及び治療的特性を示す、多量体化された全抗体及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ）などの多量体化されたタンパク質に対する必要性が依然として存在する。例えば、その非多量体化対応物と比較して抗体結合活性が増加し、抗原のクラスター化が強化されている多量体化されたタンパク質に対する必要性が依然として存在する。
米国特許出願公開第２００３０１９１０５６号明細書
Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（２）：２０３－２１１（１９９６） Ｋｒｉａｎｇｋｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１８：３１－４０（２００１） Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（１３）：７６３０－７６３４，１９９６（１９９６） Ｄｅｙｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１２）：１４８６－１４９２（２００３） Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４９（１）：１５８－１６３（２００８）
一態様では、本発明は、２つの抗原結合タンパク質を含むホモ二量体融合タンパク質であって、抗原結合タンパク質は、タンパク質複合体に連結される、ホモ二量体融合タンパク質に関する。特定の態様では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体である。特定の態様では、抗原結合タンパク質は、抗体である。別の特定の態様では、抗原結合タンパク質は、リンカーなしで、タンパク質複合体に直接融合される。別の特定の態様では、抗原結合タンパク質のＣ末端は、ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に直接融合される。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、リンカーを介して、タンパク質複合体に融合される。他の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣ末端は、ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に連結される。リンカーは、アミノ酸リンカー、例えば１～２０のアミノ酸長であるアミノ酸リンカーなどであってもよい。特定の実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又は（ＧＧＧＧＳ）６である。
別の態様では、本発明は、４つの抗原結合タンパク質を含むホモ四量体融合タンパク質であって、抗原結合タンパク質は、タンパク質複合体に連結される、ホモ四量体融合タンパク質に関する。一態様では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体である。別の態様では、抗原結合タンパク質は、抗体である。抗原結合タンパク質は、Ｆａｂであってもよい。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、リンカーなしで、上記タンパク質複合体に直接融合される。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のＣ末端は、ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に直接融合される。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、リンカーを介して、上記タンパク質複合体に融合される。抗原結合タンパク質のＣ末端は、ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸リンカー、例えば１～２０のアミノ酸長であるアミノ酸リンカーなどである。特定の実施形態では、アミノ酸リンカーは、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又は（ＧＧＧＧＳ）６である。
本発明はまた、上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかを含む医薬組成物に関する。
加えて、本発明は、上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかを用いたがん治療方法に関する。さらに、本発明は、がんの治療における、上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかの使用に関する。別の態様では、本発明は、がんの治療にて使用するための、上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかに関する。
いくつかの態様では、本発明は、上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかコードする、１つ以上の単離核酸に関する。このような核酸を含む発現ベクターはまた、上述した核酸及び／又はベクターを含む組換え宿主細胞であるとして検討される。特定の実施形態では、組換え宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞、又はヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。
上述したホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質のいずれかの作製方法もまた、本発明の一部である。このような方法は、ａ）請求項３２又は３３に記載の組換え宿主細胞を培養することと、ｂ）上記培養物からホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質を単離することと、を含み得る。
図１は、本発明のホモ多量体構築物の略図である。図１ａは、両方の抗体重鎖のＣ末端が各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結される、例示的なＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質である。図１ｂは、各抗体Ｃ末端の２つの重鎖のうちの１つが各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結される、例示的なＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質である。「＋」及び「－」の記号は、抗体全体で１つのＴＴＲサブユニットの一貫した付着を可能にするＦｃ電荷対を示す。図１ｃは、各Ｆａｂ断片のＣ末端が各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結される例示的なＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質である。図１ａ～図１ｃの各々は、重鎖とＴＴＲの間の任意選択的なリンカーを示す。 図２は、リンカーなし及びリンカー長を変化させた抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（図２ａ）、並びにリンカーなしの抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（図２ｂ）、並びにリンカーなしの抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体タンパク質（図２ｃ）が、それぞれ、ＨＥＫ ２９３細胞でしっかりと発現することを示す一連のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。図２は、さらに実施例２で議論される。 図３は、リンカーなし、（Ｇ４Ｓ）リンカーあり、（Ｇ４Ｓ）２リンカーあり、（Ｇ４Ｓ）３リンカーあり、又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーありの抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質の一連のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析である。図３は、さらに実施例２で議論される。 図４は、ＴＴＲ抗ＣＢ１抗体ホモ四量体及びＴＴＲ抗ＣＢ１ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質が、親ＣＢ１ Ａｂと比較してＥＣ５０を改善することを示す。図４は、さらに実施例３で議論される。 図５は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（レーン１）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（レーン２）、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体タンパク質（レーン３）が、それぞれ、ＨＥＫ２９３細胞で発現することを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。レーン４～７は、抗ジニトロフェニル（抗ＤＮＰ）抗体である。図５は、さらに実施例４で議論される。 図６は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（レーン１及び４）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（レーン２及び５）、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体タンパク質（レーン３及び６）が、非加熱、非還元レーンに基づいて正しく構築されることを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。加熱及び還元により、３つのタンパク質融合構築物は予想される構成要素の鎖に分解される（上の方のバンドは重鎖であり、最も低い位置のバンドは軽鎖である）。図６は、さらに実施例４で議論される。 図７は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（中央のピーク）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（左のピーク）、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（右のピーク）融合タンパク質の各々のＨＰＬＣ ＳＥＣ分析である。図７は、さらに実施例４で議論される。 図８は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ親ｍＡｂ（「１」）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「２」）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「３」）、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「４」）融合タンパク質の示差走査熱量計（ＤＳＣ）分析である。図８は、ＴＴＲ融合タンパク質の融解温度が、親Ａｂに匹敵するか又はそれより良好であることを示し、形成されたＴＴＲ融合タンパク質が強いことを示す。 図９ａ）は、抗ＧＩＴＲ抗体種全体のｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）での薬物動態（ＰＫ）解析の結果である。図９ｂ）は、インタクト抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）でのＰＫ解析の結果である。 図１０ａ）は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「２」）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「３」）、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「４」）融合タンパク質の結合親和性が、親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（「１」）よりも優れていることを示す。図１０ｂ）は、細胞系アッセイでは、親和性が高くても効力が高くならないことを示す。 図１１は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（１）及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（２）タンパク質が、それぞれ、哺乳類細胞中でよく発現し、正しく構築されることを示す一連のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。 図１２は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体が、ＣＨＯ－Ｋ１細胞中でよく発現し、正しく構築されることを示す一連のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。 図１３は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体が、非加熱、非還元レーンに基づいて正しく構築されることを示すＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルである。加熱及び還元により、分子は予想される構成要素の鎖に分解される（上の方のバンドは重鎖であり、最も低い位置のバンドは軽鎖である）。 図１４は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（中央のクロマトグラム）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（右のクロマトグラム）、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（左のクロマトグラム）融合タンパク質の各々のＨＰＬＣ ＳＥＣ分析である。 図１５ａ）は、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体種全体のｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）でのＰＫ解析の結果である。図１５ｂ）は、インタクト抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ（マウス）でのＰＫ解析の結果である。 図１６は、ＷＭ３５細胞殺傷アッセイにおける、親ｍＡｂ（コナツムマブ）と比較した抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質の効力を示す。 図１７は、一次ヒトケラチノサイト細胞殺傷アッセイにおける、親ｍＡｂ（コナツムマブ；（「１」）と比較した抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「２」）及びＴＴＲ抗体ホモ四量体（「３」）の効力を示す。 図１８は、ネズミｃｏｌｏ２０５モデルにおける、親ｍＡｂ（コナツムマブ）と比較した抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質の腫瘍増殖抑制能力を示す。 図１９は、ネズミＳＷ４０３モデルにおける、親ｍＡｂ（コナツムマブ）と比較した抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質の腫瘍増殖抑制能力を示す。 図２０は、ネズミｃｏｌｏ２０５モデルマウス及びネズミＳＷ４０３モデルマウスの体重が、試験した全ての化合物で類似していることを示す。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的に過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書では、別段の定義がない限り、本出願と関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
一般に、細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びに本明細書に記載のタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及び技術は当該技術分野でよく知られ、且つ一般に使用されているものである。別段の記載がない限り、本出願の方法及び手法は、一般に、当該技術分野においてよく知られる通常の方法に従って実施され、こうした方法及び手法は、本明細書を通して引用及び議論される様々な一般の参考文献及び特定性の高い参考文献に記載されるものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）（これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素反応及び精製手法は、製造者の説明に従って実施されるか、当該技術分野において一般に達成されるように実施されるか、又は本明細書に記載のように実施される。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、並びに医薬品化学及び製薬化学と関連して使用される専門用語、並びにそれらの実験室的な手順及び手法は、よく知られているものであり、当該技術分野において一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、並びに患者の治療に標準的な手法が使用され得る。
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬などに限定されず、したがって、変わり得るものであると理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の説明を目的としているにすぎず、開示の範囲の限定は意図されず、開示の範囲は、特許請求の範囲のみによって定義される。
実施例又は別の形で記載される場合を除き、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を示す数は全て、全ての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、割合と関連して使用されるとき、±１％を意味し得る。
より狭い範囲、具体的には本明細書の特定のパラグラフによって定義される変形よりも狭い範囲全ての実施形態は、本開示に含まれると見なされるべきである。例えば、特定の態様は類概念として説明されており、類概念の全ての構成要素は、個別に、実施形態であり得ることを理解すべきである。また、類概念として記載された態様又は類概念の構成要素を選択する態様は、類概念の２つ以上の構成要素の組み合わせを包含すると理解すべきである。また、様々な実施形態の様々な状況下で「含んでいる」という言語を使用して提示される一方、関連する実施形態はまた、「～からなっている」又は「本質的に～からなっている」という言語を使用して記載され得ると理解すべきである。
本願では、「又は」の使用は、特に断らない限り「及び／又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれる」などの他の形態の使用は、限定的ではない。また、「要素」又は「構成要素」などの用語は、特に断らない限り、１つのユニットを含む要素及び構成要素並びに２つ以上のサブユニットを含む要素及び構成要素の両方を包含する。
定義
「アミノ酸」は、当該技術分野におけるその標準の意味を含む。２０種の天然起源のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ－Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，ｅｄｓ．），Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１）（この文献は任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ－アミノ酸）、［α］－，［α］－二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、及び他の非従来型のアミノ酸もまた、ポリペプチドに好適な構成成分であり得、語句「アミノ酸」に含まれる。非従来型アミノ酸の例としては、以下：４－ヒドロキシプロリン、［γ］－カルボキシグルタミン酸、［ε］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、［ε］－Ｎ－アセチルリシン、Ｏ－ホスホセリン、Ｎ－アセチルセリン、Ｎ－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、５－ヒドロキシリシン、［σ］－Ｎ－メチルアルギニン、並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４－ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で使用されるポリペプチド表記法では、標準的な使用法及び慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシル末端方向である。
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」は、概して、分子、例えば、本明細書に提示されるような抗原結合タンパク質を指し、これは、抗原に結合でき、抗原に付随する生物学的シグナルを阻害する、低下させる、又は排除することができる。
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの免疫グロブリン、又は標的抗原への結合についてインタクトな抗体と競合することができるその断片を指す。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含むがこれらに限定されない。抗体は、任意のアイソタイプ／クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）のものであり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む。他の実施形態では、抗体は、重鎖のみを含み得るラクダ科の動物に天然に存在する抗体などのより少ない鎖を含む。抗体は、単一の供給源のみに由来し得るか、又は「キメラ」であり得、キメラは、ここで、以下にさらに記載されるように、その抗体の異なる部分が、２つの異なる抗体に由来するものである。抗原結合タンパク質、抗体、又は結合断片は、例えば、ハイブリドーマにおいて、組換えＤＮＡ手法により又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的な切断により生成してよい。
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの結合剤による結合を受ける能力を有し、さらに、その抗原に結合する能力を有する抗体を生成するために動物において使用することが可能な分子又は分子の一部を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用する能力を有する１つ以上のエピトープを有し得る。
本明細書で使用する場合、「抗原結合タンパク質」は、特定の標的抗原と特異的に結合する任意のタンパク質を意味する。本用語は、少なくとも１つの抗原結合領域を含むポリペプチドを含む。用語はまた、少なくとも２つの全長重鎖及び２つの全長軽鎖を含む抗体、並びにその誘導体、バリアント、断片及び変異体を包含する。抗原結合タンパク質としてはまた、以下でより詳細に記載されるように、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）（登録商標）などのドメイン抗体、及び一本鎖抗体が挙げられる。
「抗原結合領域」又は「抗原結合ドメイン」は、分子（例えば、抗原）上の所与のエピトープ又は部位に特異的に結合、相互作用、又はそれを認識する抗体若しくは断片、誘導体、又はこれらのバリアントなどのタンパク質の部分を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に与えるアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、１つ以上の「相補的決定領域」（「ＣＤＲ」）を含み得る。特定の抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。「フレームワーク」領域は、抗原結合タンパク質の特異的結合に直接寄与し得るが、典型的には、ＣＤＲの適切な立体構造の維持に役立つことで、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進し得る。
「がん」、「腫瘍」、「がん性」、及び「悪性」という用語は、典型的には、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類の生理条件に関するか又はそれを記載する。がんの例としては、腺癌、リンパ腫、芽腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む癌腫が挙げられるがこれらに限定されない。このようながんの更なる特定の例としては、黒色腫、肺がん、頭頚部がん、腎細胞がん、結腸がん、結腸直腸がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、消化管がん、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵がん、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、例えば肝細胞癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及びヘパトーマ（ｈｅｐａｔｏｍａ）など、膀胱がん、乳がん、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎がん、例えば腎細胞癌及びウィルムス腫瘍など、基底細胞癌、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、精巣がん、及び食道がんが挙げられる。
「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲ」（「超可変領域」とも称される）という用語は、抗体若しくは断片、誘導体、又はこれらのバリアントなどのタンパク質の相補的決定領域を指す。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、各々、３つのＣＤＲを含有する。例えば、軽鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含有し；重鎖可変領域は、以下のＣＤＲ：ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含有する。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定要因である。
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ｃｏｎｔａｃｔ又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている標準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるとおり本発明での適用に好ましいスキームである。さらなる構造的な考慮が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合がある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のＣＤＲを構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１－９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）を参照のこと。抗原結合部位を特徴付けるさらに別の標準は、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８８を参照されたい。
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することができるループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、採用されたループ構造とその周辺のアミノ酸配列との間に関連性が存在する。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さにより、及びそのループ内並びに保存的フレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
同じエピトープについて競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその断片）の文脈において使用される場合、「競合する」という用語は、抗原結合タンパク質間の競合を意味し、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその断片）が試験下で阻止又は阻害するアッセイによって決定される。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３を参照）、固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４－３６１９を参照されたい）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）；Ｉ－１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７－１５を参照されたい）；固相直接ビオチン－アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６－５５２を参照されたい）；及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７－８２）である。典型的には、そのようなアッセイでは、固体表面に結合した精製抗原又はこうした抗原を発現する細胞、非標識試験抗原結合タンパク質及び標識参照抗原結合タンパク質が使用される。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質には、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び立体障害が生じるために参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープに十分に近接する隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書において提供される。例えば、一実施形態では、競合は、ＢｉａＣｏｒｅアッセイに従って決定される。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、競合する抗原結合タンパク質は、共通の抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合が少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％阻害されることになる。いくつかの場合、結合は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９７％以上阻害される。
「制御配列」という用語は、それが連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物用制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物用制御配列は、転写因子のための認識部位を１つ又は複数含むプロモーター、転写エンハンサー配列、及び転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含み得る。
ポリペプチドの「誘導体」は、挿入、欠失、又は置換バリアントとは異なる何らかの様式で、例えば、別の化学的部分への結合により、化学的に改変されたポリペプチドである。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域のみ又は軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片である。ドメイン抗体の例としては、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）が挙げられる。いくつかの場合、２つ以上のＶＨ領域が、ペプチドリンカーを介して共有結合で連結されることで二価のドメイン抗体が創出される。二価のドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同一又は異なる抗原を標的とし得る。
「有効量」は、一般に、症状の重症度及び／又は頻度を低減する、症状及び／又は根本原因を排除する、症状及び／又はその根本原因の出現を予防する、及び／又はがんに起因する若しくは関連する損傷を改善させる若しくは修復するのに十分である量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、病状（例えば、がん）若しくは症状、具体的には、病状と関連する状態若しくは症状の治療に十分な量、又は方法は何であれ、病状若しくは疾患と関連する任意の他の望ましくない症状の進行の予防、防止、遅延、若しくは好転に十分な量である。「予防有効量」は、対象に投与されると、意図した予防効果、例えば、がんの発症（若しくは再発）の予防若しくは遅延、又はがん若しくはがん症状の発症（若しくは再発）の可能性の低減を有することになる医薬組成物の量である。完全な治療効果又は予防効果は必ずしも１回用量の投与によって生じる必要はなく、一連の用量の投与の後にのみ生じてもよい。したがって、治療的有効量又は予防的有効量は、１回又は複数回の投与で投与し得る。
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって認識され、特異的に結合されることができる抗原の部分を指す。ポリペプチドの文脈において、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、典型的には、特有の空間高次構造中に、少なくとも３個、より典型的には、少なくとも５個又は８～１０個のアミノ酸を含む。「線形エピトープ」又は「連続エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により、アミノ酸又は一次構造のその線形配列で認識されるエピトープである。「立体エピトープ」又は「不連続エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）により、その三次構造で認識されるエピトープである。これらのエピトープを構成する残基は、一次アミノ酸配列では隣接していない場合があるが、分子の三次構造では、互いに接近している。線形及び立体エピトープは、タンパク質が変性、断片化、又は還元される場合に、一般に、異なる動作をする。
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、そこに機能可能なように連結される１つ以上の異種性コード領域の発現を（宿主細胞と協同して）誘導及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現構築物は、限定はされないが、転写、翻訳に影響するか、又はそれを制御し、イントロンが存在するのであれば、そこに機能可能なように連結されるコード領域のＲＮＡスプライシングに影響する配列を含み得る。
「Ｆａｂ断片」又は「Ｆａｂ」は、１本の軽鎖と、１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域とからなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ’断片」又は「Ｆａｂ’」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインに加えてＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含む１つの重鎖の一部とを含み、その結果、２つのＦａｂ’断片の２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成することでＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。
「Ｆ（ａｂ’）２断片」又は「Ｆ（ａｂ’）２」は、２本の軽鎖と、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含む２本の重鎖とを含む。したがって、Ｆ（ａｂ’）２断片は、２つの重鎖の間のジスルフィド結合によって共にまとめられた２つのＦａｂ’断片から構成される。
「Ｆｃ領域」は、抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合及びＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって共にまとめられる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている。
抗原結合タンパク質、抗体、又はその断片に関して使用される「重鎖」という用語は、全長重鎖及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインは、カルボキシル末端にあり、ＣＨ３は、ポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１サブタイプ及びＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ、並びにＩｇＥなどの任意のアイソタイプのものであり得る。
「血液がん」は、骨髄などの血液形成組織、又は免疫系の細胞で生じるがんである。血液がんの例は、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫である。
「ホモ二量体融合タンパク質」という用語は、２つの同一の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を指す。例えば、抗体ホモ二量体融合タンパク質は、２つの同一の抗体を含む融合タンパク質を指す。特定の例では、ホモ二量体は、本明細書で記載されるように、ＴＴＲタンパク質を介して連結された２つの同一の抗体を含むＴＴＲホモ二量体融合タンパク質であり得る。
「ホモ四量体融合タンパク質」という用語は、４つの同一の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を指す。例えば、抗体ホモ四量体融合タンパク質は、４つの同一の抗体を含む融合タンパク質を指す。別の例では、Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、４つの同一のＦａｂ断片を含む融合タンパク質を指す。特定の例では、ホモ四量体は、本明細書で記載されるように、ＴＴＲタンパク質を介して連結された２つの同一の抗原結合タンパク質（例えば、２つの同一の抗体、又は２つの同一のＦａｂ断片）を含むＴＴＲホモ四量体融合タンパク質であり得る。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、それによって目的とする遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。
「同一性」という用語は、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、比較分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間で残基が同一であるパーセントを意味し、比較される分子の中で最小のもののサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントにおけるギャップ（もしあれば）を、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。整列させた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。
同一性パーセントを計算する際には、比較する配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法で整列させる。同一性パーセントの決定に使用されるコンピュータプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージであり、このプログラムパッケージは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む。コンピュータアルゴリズムであるＧＡＰは、配列同一性パーセントが決定されることになる２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドのアラインメントをとるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ ２５０又はＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５－３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９を参照）もまたアルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを使用し、ポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するための推奨パラメーターは、下記のものである。
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ ６２；
ギャップペナルティー：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得、この小さい整列領域は、２つの全長配列の間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望であれば、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じるように調節し得る。
「免疫調節剤」という語句は、免疫応答を引き起こす、高める、又は抑制する分子を指す。免疫活性化剤は、免疫応答を引き起こす又は増強する分子である。免疫抑制剤は、免疫応答を低下させる又は抑制する分子である。したがって、活性化免疫療法は、対象の免疫系を引き起こす又は高めるために分子を投与することを伴う治療法である。抑制免疫療法は、対象の免疫系を低下させる又は抑制するために、対象が分子で治療される治療法である。
本明細書で使用される、抗体又は免疫グロブリンの鎖（重鎖又は軽鎖）の「断片」という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠いているが、抗原に特異的に結合することができる抗体の一部（その部分がどのように得られるか、又は合成されるかは問われない）を含む抗原結合タンパク質である。そのような断片は、それが標的抗原に特異的に結合するという点で生物学的に活性であり、所与のエピトープへの結合について、インタクトな抗体を含む、他の抗原結合タンパク質と競合し得る。一態様では、このような断片は、全長軽鎖又は重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、いくつかの実施形態では、単一の重鎖及び／若しくは軽鎖又はその部分を含むであろう。こうした生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ手法によって生成してよく、又はインタクトな抗体を含む、抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的な切断によって生成してよい。免疫学的に機能性の免疫グロブリン断片としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体、及び一本鎖抗体が挙げられ、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ、又はウサギを含む任意の哺乳類源に由来し得る。例えば、１つ以上のＣＤＲなど、本明細書に開示の抗原結合タンパク質の機能性部分は、第２のタンパク質又は小分子に共有結合で結合させることで、体における特定の標的を対象とする治療剤を創出し、又は血清半減期を延長できることがさらに企図される。
「単離された核酸分子」は、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成を起源とするか、又はそれらの何らかの組み合わせであるＤＮＡ又はＲＮＡであって、単離されたポリヌクレオチドが天然に見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部を伴わないか、又はそれが天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本開示の目的では、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないと理解されるべきである。特定の核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、その特定の配列に加えて、最大で１０若しくはさらに最大で２０に及ぶ数の他のタンパク質若しくはその一部をコードする配列を含み得、又は記載の核酸配列のコード領域の発現を制御する調節配列を機能可能なように連結して含み得、及び／又はベクター配列を含み得る。
本明細書で使用する場合、用語「単離されたポリペプチド」、「精製されたポリペプチド」、「単離されたタンパク質」、又は「精製されたタンパク質」は、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、ここで、ポリペプチドは、自然界から入手可能な状態に比べて任意の程度に精製されている。そのため、精製されたポリペプチドはまた、自然に発生し得る環境から遊離されるポリペプチドを指す。一般に、「精製された」は、様々な他の成分を除去するために分留を実施したポリペプチド組成物を指し、この組成物は、その発現された生物活性を実質的に維持する。用語「実質的に精製された」が使用される場合、この表記は、例えば、組成物中の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％以上のタンパク質を構成するなど、ポリペプチド又はペプチドが組成物の主成分を形成するペプチド又はポリペプチド組成物を指す。
抗原結合タンパク質、抗体又はその断片に関して使用される「軽鎖」という用語は、全長軽鎖及び結合特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するその断片を含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン（ＶＬ）及び定常領域ドメイン（ＣＬ）を含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖には、κ鎖及びλ鎖が含まれる。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的材料に関連して本明細書を通して使用される「天然起源」という用語は、天然に見出される材料を指す。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０～６０の塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０～４０のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築において使用するための一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのための放射標識、蛍光標識、ハプテン、又は抗原性標識を含む、標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。
本明細書で使用される「作動可能に連結される」は、この用語が適用される構成要素が、適切な条件下でそれがその固有機能を実施することが可能になる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列に連結される。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖のヌクレオチドポリマーと二本鎖のヌクレオチドポリマーとの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はいずれかの型のヌクレオチドの改変形態であり得る。改変には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基改変、２’，３’－ジデオキシリボースなどのリボース改変、並びにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニラデート（ｐｈｏｓｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）及びホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間結合の改変が含まれる。
特に明記しない限り、本明細書で考察する任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の類似体又は模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然起源のアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語は、また、例えば、（糖タンパク質を形成するための）炭水化物残基の付加、又はリン酸化によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含し得る。ポリペプチド及びタンパク質は、天然起源及び非組換え細胞により、又は遺伝子操作若しくは遺伝子組換え細胞により産生することができ、天然のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、若しくは天然の配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、それへの付加及び／又はその置換を有する分子を含む。「ポリペプチド断片」という用語は、全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び／又は内部の欠失を有するポリペプチドを指す。そのような断片は、全長タンパク質と比較して改変されたアミノ酸も含み得る。特定の実施形態では、断片は、約５～５００のアミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０のアミノ酸長であり得る。
組換えＴＴＲタンパク質を含む、「組換えタンパク質」は、組換え手法の使用、すなわち本明細書に記載の組換え核酸の発現を介して作製されるタンパク質である。組換えタンパク質の生成方法及び生成技術は、当該技術分野においてよく知られている。
「一本鎖抗体」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが可動性リンカーによって連結されることで単一のポリペプチド鎖を形成しているＦｖ分子であり、この単一のポリペプチド鎖によって抗原結合領域が形成される。一本鎖抗体は、国際公開第８８／０１６４９号パンフレット、並びに米国特許第４，９４６，７７８号明細書及び同第５，２６０，２０３号明細書において詳細に議論されている。
「固形腫瘍」は、通常は、嚢胞又は液体領域を含まない組織の異常な増殖又は塊を指す。固形腫瘍は、良性（がん性ではない）又は悪性（がん性）であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプにちなんで名付けられる。固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、及びリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般に、固形腫瘍を形成しない。
抗原結合タンパク質が、抗原以外の分子にほとんど結合しないか、又は全く結合しないことを示す場合、抗原結合タンパク質は、抗原に「特異的に結合する」。しかしながら、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、異なる種に由来する抗原と交差反応し得る。典型的には、表面プラズマ共鳴技術（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅ，ＧＥ－Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により測定した際に、解離定数（ＫＤ）が≦１０－７Ｍ である場合に、抗原結合タンパク質は、抗原に特異的に結合する。抗原結合タンパク質は、（ＢＩＡＣｏｒｅなどの方法を用いて測定した際に）ＫＤ≦５×１０－８Ｍで結合する場合に「高い親和性」で、ＫＤ≦５×１０－９Ｍで結合する場合に「非常に高い親和性」で、抗原に特異的に結合する。
本明細書で使用される「対象」又は「患者」は、任意の哺乳類であり得る。典型的な実施形態では、対象又は患者は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」は、記載された分子種が、存在する優勢な種であること、すなわちモル基準で同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の実施形態では、実質的に純粋な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を含む。他の実施形態では、対象種は、従来の検出方法によって組成物中に汚染種を検出することができず、したがって組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均質性まで精製される。
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、損傷、病状、若しくは病態の治療又は改善における成功の任意の兆候を指し、こうした兆候には、症状の軽減、寛解、縮小、又は損傷、病状、若しくは病態の患者耐容性の向上；悪化速度又は衰退速度の鈍化；悪化終点の衰弱軽減；患者の身体的又は精神的な健全性の改善など、任意の客観的又は主観的なパラメーターが含まれる。症状の治療又は改善は、身体検査、神経精神医学的検査及び／又は精神医学的評価の結果を含む、客観的又は主観的なパラメーターに基づき得る。例えば、本明細書に提示されている特定の方法は、例えば、がんの進行若しくは広がりを低減すること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍の寛解を引き起こすこと、及び／又はがん若しくは腫瘍に関連する症状を改善することにより、がん及び腫瘍の治療に成功している。同様に、本明細書に提示されている他の方法は、感染症の進行若しくは広がりを低減すること、感染症の程度を低減すること、及び／又は感染症に関連する症状を改善することにより、感染症を治療する。
本明細書で使用する場合、「ＴＴＲ」という用語は、「トランスサイレチン」を指す。ヒトＴＴＲは、Ｍｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２４（２）：５５８－５６４（１９８４）（参照により本明細書に組み込まれる）で記載されている。ヒトＴＴＲに関するアミノ酸配列はまた、ｔｈｅ ＵｎｉＰｒｏｔ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０２７６６＃ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に記載されており、本明細書では、配列番号４３として引用される。ヒトＴＴＲに関する核酸はまた、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／７２７６）で記載されている。ＧｅｎＢａｎｋ ｄｅｐｏｓｉｔ Ｋ０２０９１．１もまた参照されたい。ネズミＴＴＲのアミノ酸及び核酸配列は、それぞれ、配列番号３及び４に記載されている。
「ＴＴＲバリアント」という用語は、配列番号１を有するＴＴＲと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。本発明はまた、このようなＴＴＲバリアントをコードする核酸を含む。具体的なバリアントとしては、例えば、Ｃ又はＮ末端でトランケーションを有するＴＴＲタンパク質が挙げられる。
「腫瘍」とは、がん性細胞が増殖（ｇｒｏｗ）及び増殖（ｍｕｌｔｉｐｌｙ）するときに形成される組織の塊を指し、これは、正常な隣接する組織に侵入して破壊する可能性がある。がん細胞は、悪性腫瘍から離れて血流又はリンパ系に侵入し、がん細胞が原発腫瘍から広がって他の臓器に新しい腫瘍を形成することがある。
ポリペプチドの「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比較して、アミノ酸配列に１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失及び／又は置換が生じたアミノ酸配列を含む。バリアントには、融合タンパク質が含まれる。
「ベクター」という用語は、核酸分子において、この核酸分子が連結されている別の核酸の輸送が可能な核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種である「プラスミド」は、環状２本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントがこれに連結され得る。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、このベクターが導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時にこの宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書においては、「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態である場合に、同じ意味で用いられ得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。
ホモ二量体融合タンパク質
本明細書で記載されるとおり、本発明は、部分的には、抗体などの抗原結合タンパク質の多量体化におけるＴＴＲの使用に関する。ＴＴＲは、ヒト血清中で見られるヒト細胞外タンパク質であるため、人体の全体にわたって比較的大きな量で存在する。したがって、ＴＴＲは、本発明の多量体化構築物中に存在する場合、例えば、非ヒトタンパク質、細胞内タンパク質及び希少タンパク質と比較した場合、免疫応答を誘発する可能性が低い。したがって、本発明の多量体化技術におけるその使用は有利である。
例えば、ＴＴＲは、抗体の二量体化にて使用することができる。このようなホモ二量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）、又はそのバリアントは、四量体として存在し、ここで、ＴＴＲサブユニットは、抗体重鎖のＣ末端に連結され、ＴＴＲ抗体ホモ二量体を形成する。例えば、各抗体重鎖のＣ末端（各抗体は２つのこのようなＣ末端を含有する）は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結されてもよい（図１ａ参照）。したがって、各抗体は、ＴＴＲ四量体中の２つのＴＴＲサブユニットに連結しており、ＴＴＲ抗体ホモ二量体を得る。
したがって、本発明は、２つの抗原結合タンパク質を含むホモ二量体融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体融合タンパク質は、タンパク質複合体に連結される抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体であって、ここで、ＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲ四量体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲ四量体と結合している２つの抗体を含むホモ二量体融合タンパク質に関する。抗体は、リンカーなしで、ＴＴＲ四量体と結合していてもよい（すなわち、抗体は、ＴＴＲに直接結合している）。
他の実施形態では、抗体は、リンカーを介して、ＴＴＲ四量体と結合している。例えば、アミノ酸リンカーは、抗体重鎖のＣ末端のＴＴＲサブユニットＮ末端への連結に使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、又は１～４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカーは、０、５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）５）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）６）である。他の実施形態では、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）である。
他の好適なアミノ酸リンカーとしては、例えば、ジスルフィド結合、（Ｇｌｙ）ｎ（ｎ＝１～１０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎ＝１～２０）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＦＬＧ、及びＬＥが挙げられる。好適な非アミノ酸リンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体は、リンカーあり又はリンカーなしで、トランケーションされたＴＴＲサブユニットに結合している。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を、１つ以上のＴＴＲサブユニットのＮ末端から除去してもよく、抗体をトランケーションされたＴＴＲサブユニットＮ末端に結合させてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されたホモ二量体融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。ホモ二量体融合タンパク質を生成するための例示的な方法に関する詳細は、実施例中に見出すことができる。
抗体及びＦａｂの四量体化
本明細書で記載されるとおり、本発明は、部分的には、抗体などの抗原結合タンパク質の多量体化におけるＴＴＲの使用に関する。上述のように、本発明の多量体化構築物中に存在する場合、例えば、非ヒトタンパク質、細胞内タンパク質及び希少タンパク質と比較した場合、ＴＴＲが免疫応答を誘発する可能性が低いため、本発明の多量体化技術におけるＴＴＲの使用は有利である。
本発明はまた、部分的には、抗体などの抗原結合タンパク質の四量体化におけるＴＴＲの使用に関する。このようなホモ四量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）又はそのバリアントは、やはり四量体として存在する。しかし、ＴＴＲ抗体ホモ四量体の文脈において、単一抗体重鎖（すなわち、単一抗体中に存在する２つの重鎖のうちの１つのみ）は、各ＴＴＲサブユニットに連結されており、４つの抗体のＴＴＲ四量体への連結を可能にする（図１ｂ参照）。抗体Ｃ末端の２つの重鎖のうちの１つは、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結していてもよい（図１ｂ参照）。したがって、各抗体は、ＴＴＲ四量体中の１つのＴＴＲサブユニットに連結しており、ＴＴＲ抗体ホモ四量体を得る。
このようなホモ四量体融合タンパク質において、Ｆｃホモ二量体（上述）の形成は、Ｆｃ中の突然変異により阻害される。そのような改変には、ノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、電荷対、ＨＡ－ＴＦ、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、及び異なるプロテインＡ親和性を有する改変などのＦｃ変異が挙げられる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６７（２，Ｐａｒｔ Ａ），２０１５，ｐｐ．９５－１０６を参照。ノブ－イントゥ－ホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）変異は、第１重鎖中のＴ３６６Ｗ、並びに第２重鎖中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖを含む。例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（１９９６），ｐｐ．６１７－６２１；及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０（１９９７），ｐｐ．２６－３５を参照。ＤｕｏＢｏｄｙ変異は、第１重鎖中のＦ４０５Ｌ、及び第２の重鎖中のＫ４０９Ｒを含む。例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１０（２０１３），ｐｐ．５１４５－５１５０を参照。Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ変異は、第１重鎖中のＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及び／又はＹ４０７Ｖ、並びに第２重鎖中のＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、及び／又はＴ３９４Ｗを含む。例えば、Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，５（２０１３），ｐｐ．６４６－６５４を参照。ＨＡ－ＴＦ変異は、第１重鎖中のＳ３６４Ｈ及び／又はＦ４０５Ａ、並びに第２重鎖中のＹ３４９Ｔ及び／又はＴ３９４Ｆを含む。例えば、Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，３（２０１１），ｐｐ．５４６－５５７を参照。ＳＥＥＤｂｏｄｙ変異は、第１重鎖中のＩｇＧ／Ａキメラ変異、並びに第２重鎖中のＩｇＧ／Ａキメラ変異を含む。例えば、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２３（２０１０），ｐｐ．１９５－２０２を参照。プロテインＡ親和性が異なる変異は、一方の重鎖中にＨ４３５Ｒを含み、他方の重鎖には変異がない。例えば、米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照。これらの文献の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、抗体重鎖のホモ二量体化を阻害するＦｃ電荷対の使用により、抗体のホモ四量体化を推進することが可能であり、したがって、ＴＴＲサブユニットに連結されている１つの抗体重鎖とＴＴＲに連結されていない１つの抗体重鎖間の重鎖ヘテロ二量体化を支持する（図１ｂ参照）。例えば、一組の荷電変異は、１つの重鎖に負電荷があり対応する重鎖に正電荷があるか、又は対応する重鎖上の対応する正電荷及び負電荷とペアになる１つの重鎖上の負電荷及び正電荷の混合のいずれかを有する、重鎖のＣＨ３ドメインに組み込まれている可能性がある。例示的な負電荷としては、Ｋ３９２Ｄ＆Ｋ４０９Ｄが挙げられ、例示的な正電荷としては、Ｅ３５６Ｋ＆Ｄ３９９Ｋが挙げられる。異なる電荷が引き付けられる間、ＣＨ３境界面での電荷は反発するので、ホモ二量体化は阻害されるが、ヘテロ二量体化は好まれる。ＴＴＲは、１つの電荷タイプのみの重鎖（正又は負のいずれかであるが、両方ではない）に融合される；したがって、４つの鎖（２つの軽鎖、１つの未融合重鎖、及び１つのＴＴＲ融合重鎖）で構成される完全な抗体でＴＴＲサブユニットをもたらす。さらに、電荷対変異は、例えば、米国特許第９，５４６，２０３号明細書に記載されている。第１重鎖中でＤ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、及び／又はＬ３６８Ｅ、並びに第２重鎖中でＤ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、及び／又はＫ４０９Ｒを含む電荷対変異はまた、例えば、Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４２０（２０１２），ｐｐ．２０４－２１９に記載されている。これらの文献の各々は、その全体が参照により組み込まれる。
本発明はまた、部分的には、Ｆａｂ断片の四量体化におけるＴＴＲの使用に関する。このようなホモ四量体融合タンパク質において、ＴＴＲ（配列番号１）、又はそのバリアントはまた、四量体として存在し、ここで、各ＴＴＲサブユニットは、各Ｆａｂ断片のＣ末端に連結されＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体を形成する（図１ｃ参照）。したがって、各Ｆａｂ断片抗体は、ＴＴＲ四量体中の単一のＴＴＲサブユニットに連結しており、ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体を得る。
したがって、本発明は、４つの抗原結合タンパク質（例えば、Ｆａｂ四量体）又は８つの抗原結合タンパク質（例えば、Ａｂ四量体）を含むホモ四量体融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、ホモ四量体融合タンパク質は、タンパク質複合体に連結される抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質複合体は、ＴＴＲタンパク質複合体であって、ここで、ＴＴＲタンパク質複合体は、ＴＴＲ四量体である。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体である。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆａｂ断片である。
特定の実施形態では、本発明は、ＴＴＲ四量体に連結される４つの抗体を含むホモ四量体融合タンパク質に関する。他の実施形態では、本発明は、ＴＴＲ四量体に連結される４つのＦａｂ断片を含むホモ四量体融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、抗体又はＦａｂは、リンカーなしで、ＴＴＲ四量体と結合している（すなわち、抗体又はＦａｂは、ＴＴＲに直接結合している）。
他の実施形態では、抗体又はＦａｂは、リンカーを介して、ＴＴＲ四量体と結合している。例えば、アミノ酸リンカーは、抗体重鎖のＣ末端のＴＴＲサブユニットＮ末端への連結に使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、１～３５、又は１～４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、０、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。他の実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、最大５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。特定の実施形態では、リンカーは、０、５、１０、１５、又は２０のアミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）５）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）６）である。他の実施形態では、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）３）、又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（すなわち、（ＧＧＧＧＳ）４）である。
他の好適なアミノ酸リンカーとしては、例えば、ジスルフィド結合、（Ｇｌｙ）ｎ（ｎ＝１～１０）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～５）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ、ＰＡＰＡＰ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ（ｎ＝１～２０）、ＶＳＱＴＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦＰＤＶ、ＰＬＧＬＷＡ、ＲＶＬＡＥＡ、ＥＤＶＶＣＣＳＭＳＹ、ＧＧＩＥＧＲＧＳ、ＴＲＨＲＱＰＲＧＷＥ、ＡＧＮＲＶＲＲＳＶＧ、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＧＦＬＧ、及びＬＥが挙げられる。好適な非アミノ酸リンカーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びトリアジン含有部分（タンパク質と反応することができる末端基を有する構築物内に含まれる；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８３６０４号パンフレットを参照）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗体又はＦａｂは、リンカーあり又はリンカーなしで、トランケーションされたＴＴＲサブユニットと結合している。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のアミノ酸を、１つ以上のＴＴＲサブユニットのＮ末端から除去してもよく、抗体又はＦａｂをトランケーションされたＴＴＲサブユニットＮ末端に結合させてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載されたホモ二量体融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。ホモ四量体（ＴＴＲ及びＡｂ）融合タンパク質を生成するための例示的な方法に関する詳細は、実施例中に見出すことができる。
抗原結合タンパク質
任意の抗原結合タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を、本発明のＴＴＲ融合タンパク質で使用することができる。本発明の融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の多量体化を可能にするので、抗原結合タンパク質クラスター化又は結合活性が活性に必要とされる抗原を標的とする／に結合する抗原結合タンパク質は、本発明の融合タンパク質から特に利益を得ることができる。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はＦａｂ）は：４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２０、ＧＩＴＲ、ＤＲ５、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、又はＣＤ２７を標的とする／に結合する。このようなタンパク質／標的は、がん経路で役割を果たすことが示されている。他の実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はＦａｂ）は：ＥｒｂＢ－１（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））、ＥｒｂＢ－２（ヒト及びげっ歯類中のＨＥＲ２）、ＥｒｂＢ－３（ＨＥＲ３）、ＥｒｂＢ－４（ＨＥＲ４）、ＦＧＦＲ（線維芽細胞増殖受容体）、ＶＥＧＦＲ（血管内皮細胞増殖因子）、ＲＥＴタンパク質産物、ＥＧＦＲ、ＫＩＴタンパク質産物、Ａｂｌ（Ａｂｅｌｓｏｎネズミ白血病ウイルス腫瘍遺伝子ホモログ（Ａｂｅｌｓｏｎ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）１）、Ｒａｆ（急速に加速された線維肉腫（Ｒａｐｉｄｌｙ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ））キナーゼ、又はＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）を標的とする／に結合する。
一実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はＦａｂ）は、ＣＢ１Ｒ（抗カンナビノイド受容体－１；遺伝子名Ｃｎｒｌ）に特異的に結合する。ＣＢ１受容体は、ＣＮＳ及び末梢神経系で広く発現しているＧｉ結合Ｇタンパク質受容体である。ＣＢ１受容体のアゴニスト刺激は、アデニリルシクラーゼ活性の阻害及びマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼの活性化につながる。ＣＢ１受容体の内因性アゴニストは、アナンダミド及びアラキドノイルグリセロールを含み得る。外因性アゴニストは、Ａ９－テトラヒドロカンナビノールを含み得る。アンタゴニスト又は逆アゴニストは、体重を減らし、代謝パラメーターを改善することが示されている（例：血漿グルコース及びインスリンレベルの低減）。したがって、特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合部分は、抗ＣＢ１Ｒ抗体（例えば、重鎖配列番号５、及び軽鎖配列番号１１を有する抗ＣＢ１Ｒ抗体１０Ｄ１０；又は重鎖配列番号６若しくは７、及び軽鎖配列番号１１を有する抗ＣＢ１Ｒ抗体）である。他の特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、抗ＣＢ１Ｒ Ｆａｂ（例えば、Ｆａｂ重鎖配列番号４４、及びＦａｂ軽鎖配列番号１１などの１０Ｄ１０に由来するＦａｂ）である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６０１４５３３３号明細書を参照されたい。
一実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はＦａｂ）は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質；ＴＮＦＲＳＦ１８）に特異的に結合する。ＧＩＴＲは、活性化誘導性ＴＮＦＲファミリーメンバー（ＡＩＴＲ）と呼ばれることもあり、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する受容体である。これは、その同族リガンドのＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ、ＴＮＦＳＦ１８）によって活性化される。ＧＩＴＲは、ＴＮＦＲファミリーメンバーの特徴である、システインに富む細胞外ドメインを含有するＩ型膜貫通タンパク質である。例えば、ＧＩＴＲの細胞質ドメインは、４－１ＢＢ及びＣＤ２７などの特定の他のＴＮＦＲファミリーメンバーと密接な相同性を共有する（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：６２１６－６２２１（参照により本明細書に組み込まれる））。ＧＩＴＲの活性化により免疫応答が強化され、そのような活性化により、感染症及び腫瘍に対する免疫応答が回復する可能性を有する。したがって、ＧＩＴＲを活性化することができる分子は、免疫応答の増強を誘発させることが望ましい状況において免疫刺激剤として有用であり得る。したがって、特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合部分は、抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、重鎖配列番号１８、及び軽鎖配列番号２５を有する抗ＧＩＴＲ抗体９Ｈ６；又は重鎖配列番号１９若しくは２０、及び軽鎖配列番号２５を有する抗ＧＩＴＲ抗体）である。他の特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、抗ＧＩＴＲ Ｆａｂ（例えば、Ｆａｂ重鎖配列番号２１、及びＦａｂ軽鎖配列番号２６などの９Ｈ６に由来するＦａｂ）である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５００６４２０４号明細書を参照されたい。
一実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はＦａｂ）は、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＲＡＩＬ受容体２；ＤＲ５（細胞死受容体５）とも称される）に特異的に結合する。ＴＲ－２（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（「ＴＲＡＩＬ」）受容体－２）とそのリガンドであるＴＲＡＩＬの間の相互作用は、アポトーシスの誘導に役割を果たす（例えば、Ａｌｍａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４：３３７－３４８（２００３）を参照）。Ａｐｏ２リガンドとも呼ばれるＴＲＡＩＬは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＩＬ受容体（「ＴＲ」）１～４）の４つのメンバー、並びに関連する可溶性のオプテオプロテゲリン（「ＯＰＧ」）受容体と相互作用するホモマーリガンドである。細胞表面でのＴＲＡＩＬのＴＲ－１又はＴＲ－２との結合は、その細胞のアポトーシスを引き起こす。最初にＴＲＡＩＬがＴＲ－１又はＴＲ－２に結合した後、細胞内タンパク質は受容体の細胞内死ドメインにリクルートされ、シグナル複合体を形成する。特定の細胞内カスパーゼが複合体にリクルートされる；ここで、それらは自己活性化し、順次追加のカスパーゼと細胞内アポトーシスカスケードを活性化する。ＴＲ－３及びＴＲ－４及びＯＰＧには、アポトーシスシグナルの伝達に関与する細胞内ドメインがない。したがって、ＴＲＡＩＬのＴＲ－３、ＴＲ－４、又はＯＰＧとの結合は、アポトーシスを引き起こさない。ＴＲ－３及びＴＲ－４は、「デコイ」受容体とも称され、それらの過剰発現は、ＴＲＡＩＬによるアポトーシス誘導から細胞を保護することが示される。ＴＲ－２は、肝臓、脳、乳房、腎臓、結腸、肺、脾臓、胸腺、末梢血リンパ球、前立腺、精巣、卵巣、子宮、及び胃腸管に沿った様々な組織を含む様々な細胞で発現している（例えば、Ｗａｌｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１６：５３８６－５３９７（１９９７）；Ｓｐｉｅｒｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．５２：８２１－８３１（２００４）（その各々が参照により組み込まれる）を参照）。ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ受容体は広く発現しているが、形質転換細胞でアポトーシスを誘導するのに最も活発である（例えば、Ｄａｉｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｗｉｓｓ Ｍｅｄ．Ｗｋｌｙ．１３１：２３１－２３７（２００１）（その各々が参照により組み込まれる）を参照）。コナツムマブ、抗ＴＲＡＩＬＲ２ モノクローナル抗体は、がんの治療のために開発されている。したがって、特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合部分は、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体（例えば、重鎖配列番号３１、及び軽鎖配列番号３８を有するコナツムマブ；又は重鎖配列番号３２若しくは３３、及び軽鎖配列番号３８を有する抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体）である。他の特定の実施形態では、ＴＴＲ融合タンパク質の抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ Ｆａｂ（例えば、Ｆａｂ重鎖配列番号３４、及びＦａｂ軽鎖配列番号３９などのコナツムマブに由来するＦａｂ）である。
ＴＴＲバリアント
上述のように、ＴＴＲバリアントもまた、本発明で使用され得る。本明細書で議論されるＴＴＲバリアントのいずれかは、互いに組み合わせて使用してもよい。ＴＴＲバリアントは、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４３を有するＴＴＲタンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＴＴＲは、ヒトＴＴＲ配列番号４３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＴＲは、Ｋ１５、Ｃ１０、又はＫ１５／Ｃ１０の両方（例えば、Ｋ１５Ａ、Ｃ１０Ａ、又はＫ１５Ａ／Ｃ１０Ａの両方）での突然変異を有する配列番号４３のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＴＲは、Ｋ１５Ａ及びＣ１０Ａ突然変異の両方を含み、そのため、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
ヒトＴＴＲ（例えば、配列番号１又は配列番号４３）に存在するシステインは、抗原結合タンパク質（例えば、抗体及びＦａｂ）への結合の部位として使用され得る。加えて、本発明では、遺伝子操作されたシステインを有するＴＴＲバリアントなどの、部位特異的結合を可能にするＴＴＲバリアントを使用してもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６３３，１５３号明細書を参照されたい。例えば、ＴＴＲバリアントは、以下のシステイン突然変異：Ａ３７Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ａ８１Ｃ、又はＧ８３Ｃのうちの１つ以上を含み得る。
本発明において有用なさらなるバリアントとしては、例えば、Ｃ又はＮ末端でトランケーションを有するＴＴＲタンパク質が挙げられる。このようなＴＴＲタンパク質としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸が、Ｃ又はＮ末端ＴＴＲタンパク質から除去されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸が、ＴＴＲタンパク質のＣ又はＮ末端から除去されるＴＴＲタンパク質を含む。他の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸が、ＴＴＲタンパク質のＮ末端から除去されるＴＴＲタンパク質を含む。
本発明で使用できるさらなるＴＴＲバリアントとしては、チロキシンへのＴＴＲの結合を低減又はブロックするものが挙げられる。２つチロキシン結合部位を含有する各ＴＴＲ四量体は、ＴＴＲ四量体の中央チャネルに配置される。このようなバリアントは、例えば、患者のチロキシン生物学への干渉を回避でき、ＴＴＲ融合物がチロキシン代謝経路で作用するのを回避する場合がある。本発明で使用できるさらに他のＴＴＲバリアントとしては、ＴＴＲのタンパク質分解活性を低下又は排除するものが挙げられる。
加えて、ＴＴＲ－Ｈｉｓタグ融合物を本発明で使用してもよい。例えば、ＴＴＲ－Ｈｉｓタグ融合物は、ＦａｂがＦｃを欠いているＴＴＲ Ｆａｂ構築物の精製で、又はプロテインＡアフィニティカラムの低ｐＨ精製環境を回避することが有益なＴＴＲ Ａｂ構築物の精製に使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、精製後に除去される。Ｈｉｓタグはまた、最終的な治療分子に存在していてもよい（すなわち、タグが精製後に残っていてもよい）。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、Ｈｉｓ、（Ｈｉｓ）２、（Ｈｉｓ）３、（Ｈｉｓ）４、（Ｈｉｓ）５、（Ｈｉｓ）６、（Ｈｉｓ）７、（Ｈｉｓ）８、（Ｈｉｓ）９、又は（Ｈｉｓ）１０タグである。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグは、（Ｈｉｓ）６又は（Ｈｉｓ）７タグである。具体的な実施形態では、Ｈｉｓタグは、（Ｈｉｓ）６タグである。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓタグは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のグリシンアミノ酸をリンカーとして含む。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグは、２つのグリシン（例えば、ＧＧＨＨＨＨＨＨ）を含む。
いくつかの実施形態では、２つのグリシンアミノ酸リンカーは、ＴＴＲバリアントと重鎖又は軽鎖との間に挿入され得る。
さらに、本発明のＴＴＲバリアントは、ＴＴＲ融合物のＰＫ又は溶解度特性を調節するのに役立ち得るグリコシル化部位を組み込んだバリアントを含み得る。加えて、本発明のＴＴＲバリアント又はＴＴＲ融合タンパク質は、有益なＰＫ特性を付与する部分、例えば、トリアジン含有部分（タンパク質と反応することができる末端基を有する構築物内に含まれる；例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０８３６０４号パンフレットを参照）を含むように改変されてもよい。
ホモ二量体及びホモ四量体融合タンパク質の作製方法
本発明のホモ二量体及びホモ四量体融合物の作製方法は、実施例で議論される。
一般に、本発明のホモ二量体及びホモ四量体融合物は、組換え法を用いて生成することができる。したがって、本発明は、ホモ二量体及びホモ四量体融合物をコードするポリヌクレオチドを含む。別の態様では、本発明は、ホモ二量体及びホモ四量体融合物をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。特定の実施形態では、発現ベクターは、好適な宿主細胞における発現を支援するために、ホモ二量体及びホモ四量体融合物をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を含む。特定の実施形態では、発現ベクターはまた、宿主細胞における染色体非依存性複製を可能にするポリヌクレオチド配列を含む。例示的なベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びＹＡＣＳが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、ベクターはｐＴＴ５である。
一般に、Ａｂ ＴＴＲホモ二量体又はＡｂ ＴＴＲホモ四量体融合構築物を生成する場合、哺乳類宿主細胞が利用される。哺乳類宿主細胞もまた、Ｆａｂ ＴＴＲホモ四量体融合構築物を生成するのに好適であるが、原核生物（バクテリア）などの非哺乳類細胞及び非哺乳類（例えば、酵母菌）宿主細胞もまた、使用され得る。
更に別の実施形態では、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を含む。宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、ホモ二量体及びホモ四量体融合物の発現に好適な条件下でトランスフェクションされた宿主細胞を培養する方法は、当技術分野において既知である。使用されるトランスフェクション手順は、形質転換される宿主に依存し得る。哺乳類細胞への異種性ポリヌクレオチドの特定の導入方法は当該技術分野において既知であり、こうした導入方法としては、限定はされないが、デキストラン介在型遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン介在型遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、及び核へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。発現のための宿主として利用可能な特定の哺乳類細胞株は、当該技術分野において既知であり、こうした哺乳類細胞株としては、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株（限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ；例えばＣＨＯ－Ｋ１）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、及び多くの他の細胞株を含む）が挙げられる。特定の実施形態では、ホモ二量体及びホモ四量体融合物をどの細胞株が高レベルで発現し、産生するかを決定することによって細胞株を選択してもよい。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されるホモ二量体及びホモ四量体融合タンパク質の作製方法に関する。例えば、ホモ二量体及びホモ四量体融合タンパク質は：
ａ）ホモ二量体及びホモ四量体融合物をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養することと；
ｂ）上記培養物からホモ二量体又はホモ四量体融合タンパク質を単離することと、
によって作製され得る。
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又はアジュバントを伴って、本発明のホモ多量体融合タンパク質（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）のうちの１つ以上の治療有効量を含む医薬品組成物を提供する。本発明の医薬組成物としては液体、凍結及び凍結乾燥組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、製剤材料は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに無毒なものである。具体的な実施形態では、治療有効量のホモ多量体融合タンパク質（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）を含む医薬組成物が提供される。
特定の実施形態では、医薬組成物は、組成物の、例えば、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明性、色調、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解速度若しくは放出速度、吸収性、又は透過性の改変、維持、又は保存を目的とする製剤材料を含み得る。このような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、又はリジンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又は他の有機酸など）；充填剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；注入剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（ベンザルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定化促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；等張性促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物など、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式及び所望の投与量に応じて当業者によって決定されることになる。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（前掲）を参照されたい。特定の実施形態では、そのような組成物は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ ｖｉｖｏでの放出速度及びｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス速度に影響し得る。特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクル又は担体は、水性又は非水性のいずれかの性質を有し得る。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液又は人工脳脊髄液であり得、場合により非経口投与用組成物で一般的な他の材料が補充される。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水もさらなる例示的なビヒクルである。具体的な実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含み、ソルビトール又はその適切な代替物をさらに含んでよい。本発明の特定の実施形態では、ホモ多量体組成物（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）は、凍結乾燥ケーキ又は水性溶液の形態において、所望の度合いの純度を有する選択された組成物を任意選択的に配合剤（前掲のＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保管のために調製され得る。さらに、特定の実施形態では、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）を、スクロースなどの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として配合してもよい。
本発明の医薬組成物は、非経口送達を目的として選択することができる。あるいは、組成物は、吸入、又は経口など、消化管を介した送達を目的として選択してよい。そのような医薬的に許容可能な組成物の調製は、当該技術分野の範囲内である。製剤成分は、好ましくは投与部位に許容される濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝剤は、組成物を生理学的ｐＨ又は僅かに低いｐＨ、典型的には、約５～約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
非経口投与が考えられる場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に、所望のホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）を含み、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態で提供し得る。非経口注射のための特に好適なビヒクルは、無菌の蒸留水であり、その中でホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）は、適切に保存された無菌の等張溶液として処方される。特定の実施形態では、調製は、蓄積注射を介して送達され得る生成物の徐放的又は持続的放出を提供し得る、注射可能なマイクロスフェア、生分解性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなどの薬剤を含む所望の分子の処方を含むことができる。特定の実施形態では、循環中の持続期間を増進する効果を有するヒアルロン酸も使用し得る。特定の実施形態では、所望の抗原結合タンパク質を導入するために埋め込み可能な薬物送達デバイスを使用してもよい。
本発明の医薬組成物は、吸入を目的として配合することができる。これらの実施形態では、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）は、有利には、乾燥した、吸入可能な粉末として配合される。具体的な実施形態では、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）吸入溶液は、エアゾール送達のための噴射剤とともに配合されてもよい。特定の実施形態では、溶液を噴霧してよい。経肺の投与、ひいては製剤化方法は、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号明細書（参照により組み込まれる）にさらに記載されており、この文献では、化学的に改変されたタンパク質の経肺送達について記載されている。
製剤は経口投与可能であるとも考えられる。この様式で投与されるホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）は、錠剤及びカプセルなどの固形剤形の配合において習慣的に使用される担体と共に、又はこうした担体を使用せずに製剤化することができる。特定の実施形態では、消化管において生物学的利用率が最大化し、全身循環前分解（ｐｒｅ－ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化する時点で製剤の活性部分が放出されるようにカプセルを設計してよい。ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）の吸収を促進するために、更なる薬剤が含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を用いてもよい。
持続送達製剤又は制御送達製剤において、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）を伴う製剤を含む更なる医薬組成物は、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生物侵食性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポ注射など、様々な他の持続送達手段又は制御送達手段の製剤化手法も当業者に知られている。例えば、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号明細書（参照によって組み込まれる）を参照されたい。この文献では、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載されている。持続放出調製物は、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成形物品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（その各々が参照により組み込まれる、米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許出願公開第０５８４８１号明細書に開示される）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、前掲）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）を含み得る。持続放出組成物は、当該技術分野において既知のいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含み得る。例えば、参照により組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号明細書；同第０８８，０４６号明細書及び同第１４３，９４９号明細書を参照されたい。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌調製物として提供される。無菌化は、無菌濾過膜を介す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する無菌化は、凍結乾燥及び再構成の前又は後のいずれかに実施してよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態又は溶液で保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器に充填され、こうした容器は、例えば、静脈注射用溶液バッグ、又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルである。
本発明の態様は、自己緩衝性ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）を含み、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第０６１３８１８１Ａ２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）に記載されているような医薬組成物として使用できる。
上述のように、特定の実施形態は、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）組成物、特に医薬のホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）組成物を提供し、これは、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）に加えて、本節及び本明細書の他の箇所に例示的に記載されるものなどの１つ以上の賦形剤を含む。賦形剤は、粘度の調整などの製剤の物理的、化学的又は生物学的特性の調整及び／若しくは有効性を向上させ、並びに／又はこのような製剤を安定化するための本発明の方法並びに例えば製造、輸送、保管、使用前の調製、投与中及びこれらの後に生じるストレスに起因する劣化及び損傷に対する方法など、広範囲の目的を考慮して本発明で使用することができる。
タンパク質の安定化並びにこれに関して有用な製剤材料及び方法に対して様々な説明が利用可能であり、例えばＡｒａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｏｌｖｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．８（３）：２８５－９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ」：ＲＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥＳＩＧＮ ＯＦ ＳＴＡＢＬＥ ＰＲＯＴＥＩＮ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１－８４（２００２）及びＲａｎｄｏｌｐｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９－７５（２００２）（各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、特に獣医学的及び／又はヒト医療用途のタンパク質医薬品及びプロセスに関して、特に本発明による自己緩衝性タンパク質製剤と同じ賦形剤及びプロセスに関する部分を参照されたい。
塩は、本発明の特定の実施形態に従って、例えば製剤のイオン強度及び／若しくは等張性を調整するため、並びに／又は本発明による組成物のタンパク質若しくは他の成分の溶解度及び／若しくは物理的安定性を向上させるために使用され得る。
よく知られているとおり、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することにより、且つタンパク質中の荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電気相互作用、引力及び反発相互作用の強度を低減することにより、天然状態のタンパク質を安定化することができる。イオンは、特にタンパク質の変性ペプチド結合（－－ＣＯＮＨ）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化することもできる。さらに、タンパク質中の荷電基及び極性基とのイオン相互作用は、分子間静電相互作用を低減し、それによりタンパク質の凝集及び不溶化を防止又は低減することもできる。
イオン種によってタンパク質に及ぼすそれらの効果は、著しく異なる。イオン及びタンパク質に対するその効果の分類上の順位付けがいくつか立案されており、これを本発明による医薬組成物の製剤化に使用することができる。一例は、イオン性溶質及び極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対する効果によって順位付けするホフマイスター系列である。安定化する溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化する溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは、一般に、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞１モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは、一般に、タンパク質を変性及び／又は可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な効果により、ホフマイスター系列でのイオンの位置が定義される。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤及び酸化防止剤として、並びに他の標準的用途として、本発明の様々な実施形態によるホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）製剤に使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは、製剤中のタンパク質を安定化するために使用することができる。グリシンは、凍結乾燥において適切なケーキ構造及び特性を確保するのに有用である。アルギニンは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質の凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは、酸化防止剤として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロース及びソルビトール並びに多価アルコール、例えばグリセロール及びプロピレングリコール並びに本明細書での議論を目的としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連物質を含む。ポリオールは、コスモトロピックである。それらは、液体及び凍結乾燥のいずれの製剤でもタンパク質を物理的及び化学的劣化過程から保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは、製剤の等張性を調整するのにも有用である。
ポリオールの中で本発明の選択された実施形態において有用なのは、マンニトールであり、これは、凍結乾燥製剤においてケーキの構造安定性を確保するために一般に使用される。マンニトールは、ケーキの構造安定性を確保する。一般に、これは、凍結乾燥保護剤、例えばスクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための薬剤及び輸送中又は製造工程でのバルク調製時の凍結解凍ストレスから保護するための安定化剤として好ましいものの中に含まれる。還元糖（遊離アルデヒド基又はケトン基を含有する）、例えばグルコース及びラクトースは、表面のリジン及びアルギニン残基を糖化することができる。したがって、それらは、一般に、本発明による使用のための好ましいポリオールの中に含まれない。加えて、そのような反応種を形成する糖、例えばスクロースも、酸性条件下でフルクトース及びグルコースに加水分解され、その結果糖化を生じさせる点で本発明の好ましいポリオールの中に含まれない。ＰＥＧは、タンパク質を安定化すること及び凍結保護物質として有用であり、この点に関して本発明に使用することができる。
ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）製剤の実施形態は、界面活性剤を更に含む。タンパク質分子は、表面への吸着並びに気体－液体界面、固体－液体界面及び液体－液体界面での変性及びその結果としての凝集を引き起こしやすいことがある。これらの効果は、一般にタンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は、一般に、タンパク質濃度と反比例し、典型的には、例えば製品の輸送及び取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。
界面活性剤は、慣例的に、表面吸着を防止するか、最小化するか、又は低減するために使用される。この点に関して本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル及びポロキサマー１８８が挙げられる。
界面活性剤は、タンパク質の立体構造安定性を制御するためにも一般に使用される。任意の所与の界面活性剤は、典型的には、一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するため、この点において、界面活性剤の使用は、タンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化劣化を起こしやすく、多くの場合、供給されるとき、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすほど十分な過酸化物量を含有している。したがって、ポリソルベートは、注意して使用すべきであり、使用時には最小影響濃度で用いなければならない。この点で、ポリソルベートは、賦形剤を最小影響濃度で用いるべきとする一般通則を例示している。
ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）製剤の実施形態は、１種以上の酸化防止剤を更に含む。適切なレベルの周囲酸素及び周囲温度を維持することにより、且つ光への暴露を回避することにより、医薬製剤中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防止することができる。酸化防止賦形剤を、タンパク質の酸化劣化を防止するためにも同様に使用することができる。この点で特に有用な酸化防止剤には、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤及びキレート剤が含まれる。本発明による治療用タンパク質製剤に使用するための酸化防止剤は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間にわたって活性を維持する。この点で、ＥＤＴＡが本発明による好ましい酸化防止剤である。
酸化防止剤は、タンパク質を損傷することがある。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは、特に分子内ジスルフィド結合を破壊し得る。したがって、本発明に使用するための酸化防止剤は、とりわけ、それ自体が製剤中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するか又はその可能性を十分に低減するように選択される。
本発明による製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質配位化合物を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要とされる亜鉛を含み得る。金属イオンは、タンパク質を分解するいくつかの過程も阻害することができる。しかしながら、金属イオンは、タンパク質を分解する物理的及び化学的過程も触媒する。
マグネシウムイオン（１０～１２０ｍＭ）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増大させ得る。しかしながら、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２は、ｒｈＤＮａｓｅを不安定化し得る。同様に、Ｃａ＋２及びＳｒ＋２は、第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、これは、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２及びＺｎ＋２、Ｃｕ＋２及びＦｅ＋２によって不安定化されることがあり、その凝集は、Ａｌ＋３イオンによって増大し得る。
ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）製剤の実施形態は、１種以上の防腐剤を更に含む。保存剤は、同じコンテナからの２回以上の取り出しを伴う複数回用量の非経口製剤を開発する際に必要となる。その主な機能は、製剤の貯蔵寿命又は使用期間にわたって微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確保することである。一般に使用される防腐剤としては、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ－クレゾールが挙げられる。保存剤は、低分子の非経口薬との使用において長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有しており、これが複数回用量のタンパク質製剤における使用を制限する主要な要因となっている。現在に至るまで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用用としてのみ製剤化されている。しかしながら、複数回用量製剤が可能である場合、患者の利便性及び高い市場性を実現するという利点が加わる。防腐処理された製剤の開発により、より便利な複数回使用の注射ペンの提案が製品化に至ったヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、その良い例である。ｈＧＨの保存処理された製剤を含有するそのようなペンデバイスは、少なくとも４つが現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥－デュアルチャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）は、フェノールを含有する一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）は、ｍ－クレゾールで製剤化されている。
保存処理された剤形の製剤化及び開発中、いくつかの態様を考慮する必要がある。製剤中の効果的な防腐剤濃度を最適化しなければならない。これには、剤形中の所与の防腐剤を、タンパク質の安定性を損なうことなく抗微生物効果を付与する濃度範囲で試験することが必要となる。
予想され得るように、防腐剤を含有する液体製剤の開発は凍結乾燥製剤よりも困難である。フリーズドライ製品は、防腐剤なしで凍結乾燥され、使用時に希釈剤を含有する防腐剤で再構成することができる。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性のリスクが大幅に最小化される。液体製剤の場合、保存剤の有効性及び安定性は、製品有効期間全体（約１８～２４か月）にわたって維持されるべきである。注意すべき重要な点として、保存剤の有効性は、活性薬物及び全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において実証される必要がある。
ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）製剤は、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。したがって、製剤は、経口、聴覚、眼、直腸、及び膣を含むがこれらに限定されない任意の好適な経路による、並びに静脈内及び動脈内注射、筋肉内注射、並びに皮下注射を含む非経口経路による送達のために、本発明に従って設計され得る。
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶、又は脱水粉末若しくは凍結乾燥粉末として無菌バイアルにおいてそれを保存してもよい。そのような製剤は、即時使用が可能な形態か、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥品）のいずれで保存してもよい。本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキットも提供する。本発明のキットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を各々含む。本発明の特定の実施形態では、単一及び多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ及び溶解シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
使用される治療有効量のホモ多量体含有（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体含有、ＴＴＲ抗体ホモ四量体含有、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体含有融合タンパク質）医薬組成物は、例えば、治療の状況及び目的に依存するであろう。治療に適した投与量レベルは、送達される分子、ホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）が使用される徴候、投与経路、並びに患者のサイズ（体重、体表、若しくは臓器サイズ）及び／又は状態（年齢及び総体的な健康）に一部は応じて変わることになると当業者であれば理解するであろう。特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量の力価を判断し、投与経路を改変してもよい。典型的な投与量は、上記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇ～最大約３０ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ～最大約２０ｍｇ／ｋｇ、任意選択的に１０μｇ／ｋｇ～最大約１０ｍｇ／ｋｇ又は１００μｇ／ｋｇ～最大約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量のホモ多量体（例えば、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又はＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質）は、好ましくは、疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度若しくは期間の増加、又は疾患の苦痛による障害若しくは無能の防止をもたらす。
医薬組成物は、医療デバイスを使用して投与されてもよい。医薬組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書（全てが本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている。
ホモ二量体及びホモ四量体融合タンパク質の治療的使用
実施例中で示されるように、ＴＴＲホモ二量体融合タンパク質を生成するためのＴＴＲを用いた抗体の二量体化、並びにＴＴＲホモ四量体融合タンパク質を生成するためのＴＴＲを用いた抗体及びＦａｂ断片の四量体化により、個々の抗体及び／又はＦａｂ断片と比較して、結合活性が増大したＴＴＲ含有融合タンパク質がもたらされることが見出された。
加えて、ＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体融合タンパク質は、個々の抗体及び／又はＦａｂ断片と比較して、改善された抗原クラスター化を示す。抗体（ＩｇＧ抗体など）が標的細胞（腫瘍細胞など）の抗原に結合すると、得られたクラスター化Ｆｃドメインは、ＮＫ細胞及びマクロファージなどの免疫エフェクター細胞に見られるＦｃγＲと結合する。このクラスター化は、ＦｃγＲを介したシグナル伝達を助け、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び抗体依存性細胞性貪食（ＡＤＣＰ）などの細胞媒介エフェクター機能の開始をもたらす。したがって、ＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体融合タンパク質は、高い抗体又はＦａｂの親和性／結合活性が生物学的効果の強化につながるリガンドのターゲッティングに特に有用である。本発明のＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体構築物による細胞媒介エフェクター機能の強化により、例えば、がんの治療に有用な、細胞を殺す能力の増加がもたらされる。
本発明のＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体融合タンパク質は、様々な標的／抗原に結合するために使用することができる。例えば、ＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ２Ｒ．ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＧＬＰ１、ＴＲＥＭ２、及び４－１ＢＢを標的とする際のアゴニストとして使用することができる。加えて、ＴＴＲホモ二量体及びＴＴＲホモ四量体融合タンパク質は、ＧＩＰＲ、ＴＮＦＲ、インテグリン受容体、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、及びＴＩＭ－３を標的とする際のアンタゴニストとして使用することができる。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されるホモ二量体融合タンパク質及びホモ四量体融合タンパク質を用いたがんの治療方法に関する。
他の実施形態では、本発明は、がんの治療における、本明細書に記載されるホモ二量体融合タンパク質及びホモ四量体融合タンパク質の使用に関する。
更に他の実施形態では、本発明は、がんの治療にて使用するための、本明細書に記載されるホモ二量体融合タンパク質及びホモ四量体融合タンパク質に関する。
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態又は特徴を例示する目的で提供されるものであり、その範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：生成されたＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のまとめ
ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング
以下のハイブリドーマ由来抗体及びＦａｂを使用して、融合タンパク質を生成した：
・ハイブリドーマＣＢ１０（ハイブリドーマ１０Ｄ１０とも称される）由来の抗ＣＢ１Ｒ抗体及びＦａｂ
・ハイブリドーマ９Ｈ６由来の抗ＧＩＴＲ抗体及びＦａｂ
・抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体コナツムマブ及び対応するコナツムマブＦａｂ
以下のＴＴＲ融合タンパク質を生成した。［ＴＴＲ］＝ＴＴＲ四量体。簡略化のために、Ｈｉｓタグ（Ｆａｂ構築物のための）は、実施例１の概要には示されていない。
具体的には、以下のＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質を構築した。これらの構築物では、両方の抗体重鎖のＣ末端は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結された。
ａ．［抗ＣＢ１Ｒ抗体］２－［ＴＴＲ］
・「ＣＢ１Ｒ ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000002
ｂ．［抗ＧＩＴＲ抗体］２－［ＴＴＲ］
・「ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000003
ｃ．［抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体］２－［ＴＴＲ］
・「コナツムマブＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000004
加えて、以下のＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質を構築した。これらの構築物では、電荷対変異Ｄ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ（配列番号６、１９、又は３２）を含有する、抗体Ｃ末端の２つの重鎖のうちの１つは、（リンカーあり又はリンカーなしで）ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結していた。Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄ電荷対変異（配列番号７、２０、又は３３）の相補的なセットを含有する残りの重鎖は、連結された重鎖を伴った。実施例中の構築物の議論において、Ｅ４１６Ｋ及びＤ４５９Ｋの議論は、それぞれ、ＥＵ Ｅ３５６Ｋ及びＥＵ Ｄ３９９Ｋを指すことに留意。同様に、実施例中の構築物の議論について、Ｋ４２０Ｄ及びＫ４３７Ｄの議論は、それぞれ、ＥＵ Ｋ３９２Ｄ及びＥＵ Ｋ４０９Ｄを指すことに留意。
ａ．［抗ＣＢ１Ｒ抗体］４－［ＴＴＲ］
・「ＣＢ１Ｒ ＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000005
ｂ．［抗ＧＩＴＲ抗体］４－［ＴＴＲ］
・「ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000006
ｃ．［抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体］４－［ＴＴＲ］
・「コナツムマブＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000007
加えて、以下のＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質が構築された。これらの構築物では、各Ｆａｂ断片のＣ末端は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結された。
ａ．［抗ＣＢ１Ｒ Ｆａｂ］４－［ＴＴＲ］
・「ＣＢ１Ｒ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質」
・実施例中の構築物の議論において、Ｓ２１５Ｅの議論は、ＥＵ Ｓ１８３Ｅを指すことに留意。同様に、実施例中の構築物の議論について、Ｓ２０３Ｋの議論は、ＥＵ Ｓ１７６Ｋを指すことに留意。
・［配列番号４４］４－［配列番号１］４＋配列番号１１融合物において、電荷対変異は使用されなかった。［配列番号４５］４－［配列番号１］４＆配列番号４６融合物において、配列番号４５は、Ｓ２１５Ｅ電荷対変異を含有し、配列番号４６は、電荷対Ｓ２０３Ｋ変異を含有し、両方ともＥＵ系に従ってナンバリングされた。
・生成した配列対：
Figure 2024012336000008
ｂ．［抗ＧＩＴＲ Ｆａｂ］４－［ＴＴＲ］
・「ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000009
ｃ．［抗ＴＲＡＩＬＲ２ Ｆａｂ］４－［ＴＴＲ］
・「コナツムマブＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質」
・生成した配列対：
Figure 2024012336000010
ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質について、各抗体重鎖のＣ末端は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結された。ＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質について、抗体Ｃ末端の２つの重鎖のうちの１つは、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結された。ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質について、各Ｆａｂ断片のＣ末端は、各ＴＴＲサブユニットのＮ末端に連結された。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発、制限エンドヌクレアーゼ消化、及び哺乳類発現プラスミドへの酵素的連結を含む標準的な分子生物学技術を使用して、融合タンパク質を生成した。Ｆａｂ Ｃ－末端に（Ｈｉｓ）６タグを付加した、ポリヒスチジンタグ付きＦａｂ－ＴＴＲ分子もまた、生成された。
それぞれのクローニングした抗ＣＢ１、抗ＧＩＴＲ及び抗ＴＲ２抗体軽鎖（ＬＣ）ＤＮＡと組み合わせたクローニングしたＴＴＲ融合バリアント重鎖及びＦａｂ ＤＮＡを使用して、ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の発現のための哺乳類細胞にトランスフェクションした。これらの手法は一般に、分子クローニングで参照できる方法に従って実行された：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕｅｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ。
実施例２：抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング、発現、及び精製
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体は、概して、以下のようにクローニングされた。ｐＴＴ５－ｄｅｌ－Ｂｓｍ－ＢＩ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ 抗＜ｈｕＣＢ１＞ １０Ｄ１０．１ ＶＨ］：：ｈｕＩｇＧ２ＴＯ（構築物Ｃ５９４７７）を、以下の構築物用の鋳型として使用した。ｐＴＴ５－ｄｅｌ－Ｂｓｍ－ＢＩベクターは、ＢｓｍＢＩ制限部位が除去されたｐＴＴ５ベクターの誘導体である。
［配列番号５］２－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１：鋳型としてＣ５９４７７を使用し、シグナル配列のアミノ末端、ＳａｌＩ制限酵素部位、及び最適化されたコザック配列をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、Ｃ５９４７７内の既存のＢａｍＨＩ制限部位を排除するように設計された３’プライマー（５’－ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＡＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＣＡ ＡＴＡ ＧＴＣ ＡＣＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１によりおよそ２２０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ２ａ：鋳型としてＣ５９４７７を使用し、既存のＢａｍＨＩ制限部位を排除するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＡＧＧ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）及びＴＴＲ（配列番号１）のアミノ末端をコードする３’プライマー（５’－ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２ａによりおよそ１２５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ３ａ：鋳型としてＴＴＲ（配列番号１）を使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）及びＴＴＲのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＴＣＣ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ Ｇ－３’）を、ＴＴＲ（配列番号１）のカルボキシル末端、終止コドン及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３ａによりおよそ４００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１、２ａ、及び３ａをゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３４９４：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：ＴＴＲ３と名付けた。
［［配列番号５］－［ＧＧＧＧＳ］］２－［配列番号１］４を上記に記載したように、ＰＣＲ１を使用して構築した。ＰＣＲ２ｂ：鋳型としてＣ５９４７７を使用し、既存のＢａｍＨＩ制限部位を排除するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＡＧＧ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）、Ｇ４Ｓリンカー、及びＴＴＲ（配列番号１）のアミノ末端をコードする３’プライマー（５’－ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２ｂによりおよそ１２５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ３ｂ：鋳型としてＴＴＲ（配列番号１）を使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）、Ｇ４Ｓリンカー、及びＴＴＲのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ Ｇ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３ｂによりおよそ４００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１、２ｂ、及び３ｂをゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３４９９：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：Ｇ４Ｓ：：ＴＴＲ３と名付けた。
［［配列番号５］－［（ＧＧＧＧＳ）２］］２－［配列番号１］４を上記に記載したように、ＰＣＲ１を使用して構築した。ＰＣＲ２ｃ：鋳型としてＣ５９４７７を使用し、既存のＢａｍＨＩ制限部位を排除するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＴＣＧ ＣＣＡ ＧＣＡ ＣＣＣ ＡＧＧ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）、（ＧＧＧＧＳ）２リンカー、及びＴＴＲ（配列番号１）のアミノ末端をコードする３’プライマー（５’－ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ Ｇ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２ｃによりおよそ１２５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ３ｃ：鋳型としてＴＴＲを使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）、（ＧＧＧＧＳ）２リンカー、及びＴＴＲのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＧＡＧ ＧＧＴ ＣＣＧ ＧＣＣ ＣＴＡ ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＧＴＧ ＡＡＴ ＣＣＡ ＡＧＧ ＣＴＣ ＣＴ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３ｃによりおよそ４００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１、２ｃ、及び３ｃをゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３５００：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：（Ｇ４Ｓ）２：：ＴＴＲ３と名付けた。
［［配列番号５］－［（ＧＧＧＧＳ）３］］２－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ４：鋳型としてＣ７３５００を使用し、５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）、（ＧＧＧＧＳ）３リンカー及びＴＴＲ（配列番号１）のアミノ末端をコードする３’プライマー（５’－ＣＧＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＣＣＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ４によりおよそ１５００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ５：鋳型としてＣ７３５００を使用し、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーをコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＧ Ｔ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ５によりおよそ４５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物４及び５をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３６９０：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：（Ｇ４Ｓ）３：：ＴＴＲ３と名付けた。
［［配列番号５］－［（ＧＧＧＧＳ）４］］２－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ６：鋳型としてＣ７３６９０を使用し、５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）及び（ＧＧＧＧＳ）４リンカーをコードする３’プライマー（５’－ＧＧＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ Ａ－３’）と組み合わせた。ＰＣＲ６によりおよそ１５００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ７：鋳型としてＣ７３６９０を使用し、（ＧＧＧＧＳ）４リンカーの部分をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＣＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＴＣＣ Ｇ－３’）を、ＴＴＲ（配列番号１）のカルボキシル末端領域、終止コドン及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ７によりおよそ４５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物６及び７をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３７２９：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：（Ｇ４Ｓ）４：：ＴＴＲ３と名付けた。
［配列番号６］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ８：鋳型としてＣ７３４９４を使用し、５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基グルタミン酸３５６（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された３’プライマー（５’－ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＣＡＧ Ｇ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ８によりおよそ１２００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ９：鋳型としてＣ７３４９４を使用し、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基グルタミン酸３５６（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＣＡ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基アスパラギン酸３９９（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された３’プライマー（５’－ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＧ ＡＧＧ ＴＧＴ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ９によりおよそ１６０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ１０：鋳型としてＣ７３４９４を使用し、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基アスパラギン酸３９９（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＴＣ Ｔ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマーと組み合わせる。ＰＣＲ１０によりおよそ６００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物８、９及び１０をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３７３０：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（Ｅ４１６Ｋ，Ｄ４５９Ｋ）（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：ＴＴＲ３と名付けた。
［［配列番号６］－［ＧＧＧＧＳ］］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１１：鋳型としてＣ７３４９９を使用し、５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基グルタミン酸３５６（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された３’プライマー（５’－ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＴＴ ＣＣＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＣＡＧ Ｇ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１１によりおよそ１２００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ１２：鋳型としてＣ７３４９９を使用し、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基グルタミン酸３５６（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＴＧ ＣＣＣ ＣＣＡ ＴＣＣ ＣＧＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＣＡ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基アスパラギン酸３９９（ＥＵ）をリジンに変換するように設計された３’プライマー（５’－ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＧ ＡＧＧ ＴＧＴ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１２によりおよそ１６０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ１３：鋳型としてＣ７３４９９を使用し、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基アスパラギン酸３９９をリジンに変換するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＡＡＧ ＴＣＣ ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＴＴＣ Ｔ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１３によりおよそ６００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１１、１２、及び１３をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。アミノ酸のナンバリングと命名規則は、先の構築物の説明と同じである。得られた構築物を、Ｃ７３７３１：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（Ｅ４１６Ｋ，Ｄ４５９Ｋ）（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］：：Ｇ４Ｓ：：ＴＴＲ３と名付けた。
配列番号７を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１４：鋳型としてＣ７３４９４を使用し、５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基リジン３９２（ＥＵ）をアスパラギン酸に変換するように設計された３’プライマー（５’－ＧＧＧ ＡＧＧ ＴＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＣＴＣ ＣＧＧ ＣＴＧ Ｃ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１４によりおよそ１３００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ１５：鋳型としてｐＴＴ５－ｄｅｌ－Ｂｓｍ－ＢＩ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：ｈｕＦｃ＿（ＩｇＧ２）（Ｋ３９２Ｄ Ｋ４０９Ｄ）（「Ｃ５９５４１」）を使用し、ｈｕＩｇＧ２ ＣＨ３内の残基リジン３９２（ＥＵ）をアスパラギン酸に変換するように設計された５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＣＣＣ ＡＴＧ Ｃ－３’）を、ｈｕＩｇＧ２のカルボキシル末端領域からカルボキシル末端リジンを除いたもの、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１５によりおよそ２００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１４及び１５をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ１５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ７３５１３：ｐＴＴ１５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１（Ｋ４２０Ｄ，Ｋ４３７Ｄ）（ｈｕＩｇＧ２－ＴＯ ｄｅｓＫ）ＶＨ］と名付けた。
配列番号１１を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１６：可変領域のアミノ末端及びＢｓｓＨＩＩ制限部位をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＧ ＣＧＣ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＴＧＡ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＧＴ－Ｃ）を、可変領域のカルボキシル末端及びＢｓｉＷＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣ）と組み合わせる。ＰＣＲ１６を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、断片をＢｓｓＨＩＩ及びＢｓｉＷＩで消化し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、断片を混合し、シグナルペプチド及びκ定常領域を含有するＢｓｓＨＩＩ及びＢｓｉＷＩ消化線形哺乳類発現ベクターｐＴＴ５－ｄｅｌ－Ｂｓｍ－ＢＩに連結した。得られた構築物をＣ５９４７４：ｐＴＴ５－ｄｅｌ－Ｂｓｍ－ＢＩ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ 抗＜ｈｕＣＢ１＞１０Ｄ１０．１ ＶＬ］：：ｈｕＫＬＣと名付けた。
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の発現
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体タンパク質は、一般に、以下のように発現された。
ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞を、１２０ＲＰＭで回転させた加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中のプラットフォームシェーカー上の懸濁液中で増殖させた。細胞培養継代培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７＋０．１％（１０％の１０ｍＬ／Ｌ）Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８＋５００μＬ／Ｌ Ｇ４１８＋６ｍＭ（３０ｍＬ／Ｌ）Ｌ－グルタミンであった。トランスフェクションの１～２日前に細胞を継代し、トランスフェクション時の細胞密度が約１．５ｅ６ＶＣ／ｍＬになるようにした。トランスフェクション複合体を、最終培養量の１０％の容量でサプリメントなしのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地中で混合した。培養物１ｍＬ当たり０．５μｇのＤＮＡをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地に添加し、次いで培養物１ｍＬ当たり１．５μＬのＰＥＩｍａｘ試薬を添加した。次いで培地を混合し、室温で１０分間インキュベーションし、次いで細胞培養物に添加し、インキュベーター内のシェーカープラットフォームにフラスコを戻した。トランスフェクションの１～４時間後に、培養物１ｍＬ当たり２５μＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ溶液を添加した。条件培地をトランスフェクションの６日後に回収した。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ－１７（カタログ番号１３８３５）、Ｌ－グルタミン（（カタログ番号２５０３０）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８（カタログ番号１０１３１０２７、液体）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８（カタログ番号Ｋ４８９４）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｄｉｆｃｏ ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ（カタログ番号２９２８０５）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＰＥＩ Ｍａｘ（カタログ番号２４７６５－２）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。
図２ａ、図２ｂ、及び図２ｃのゲルにおいて、１０μＬの試料（非加熱）を４～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥの各レーン内に入れ、クマシーブルー系染料システムで展開した。図２ａ及び図２ｂは、抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及び抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ四量体タンパク質が、それぞれ、ＨＥＫ２９３細胞でしっかりと発現することを示す。図２ａは、抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（［配列番号５］２－［配列番号１］４及び［［配列番号５］－［（ＧＧＧＧＳ）１－４］］２－［配列番号１］４）がＳＤＳ変性に耐性があり、そのため強力な非共有結合複合体を形成することを示す。様々なリンカー長（レーン２の最も短いもの（［ＧＧＧＧＳ］１から）からレーン５の最も長いもの（［ＧＧＧＧＳ］４）まで）；リンカー長は、発現に実質的に影響を与えるようには見えなかった。図２ｂは、Ｖ１ Ｆｃ電荷対変異（１つの重鎖中のＫ４０９Ｄ＆Ｋ３９２Ｄ、並びにＤ３９９Ｋ＆Ｅ３５６Ｋ）（配列番号６及び７）を用いた、抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ四量体の形成もまた、ＳＤＳ耐性であるように見えることを示す。様々な重鎖及び軽鎖ＤＮＡのトランスフェクション比を示す（レーン２のＬＣ：ＨＣが１：９～レーン１０のＬＣ：ＨＣが９：１まで）。ＬＣ：ＨＣ比が１：１（レーン６）及び９：１（レーン１０）のものが、最も強力な発現をもたらした。
図２ｃは、抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体構築物がＨＥＫ２９３細胞でしっかりと発現し、ＳＤＳ耐性があることを示す。ＴＴＲ融合物は、軽鎖Ｃ末端（レーン３、５、７、及び９－より多くのバンド）と比較して、重鎖Ｃ末端（レーン２、４、６、及び８－より少ないバンド）でより耐性を示した。Ｈｉｓタグの位置は、融合に影響を与えるようには見えなかった。レーン２及び４で使用した重鎖－ＴＴＲは、［配列番号４４］４－［配列番号１］４であり、軽鎖は、配列番号１１である。レーン３及び５で使用した重鎖は、配列番号４４であり、軽鎖－ＴＴＲは、［配列番号１１］４－［配列番号１］４である。レーン６及び８で使用した重鎖－ＴＴＲは、［配列番号４５］４－［配列番号１］４であり、軽鎖は、配列番号４６である。レーン７及び９で使用した重鎖は、配列番号４５であり、軽鎖－ＴＴＲは、［配列番号４６］４－［配列番号１］４である。レーン６～９（配列番号４５を有する重鎖、及び配列番号４６を有する軽鎖）で試験された抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体構築物において、電荷対変異が含まれた。配列番号４５は、Ｓ２１５Ｅ電荷対変異を含有し、配列番号４６は、電荷対Ｓ２０３Ｋ変異を含有する。Ｈｉｓタグもまた使用した（図２ｃ参照）。
抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の精製
抗ＣＢ１ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体タンパク質は、一般に、以下のように精製された。
細胞培養培地を、１０ｋＤａのＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２回、最短２時間の間、２Ｌの５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０に対して透析した。第１カラムとして１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカートリッジ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、及び第２カラムとして５ｍＬのＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）タンデム液体クロマトグラフィーシステムを使用して、バッファー交換細胞培養培地から分子を精製した。培地を、Ｎｉ－ＮＴＡカラム上に直接ロードし、８ＣＶの５０ｍＭリン酸Ｎａ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄し、２ＣＶの５０ｍＭのリン酸Ｎａ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０で溶離した。Ｎｉ－ＮＴＡカラム溶出液を自動的に脱塩カラムに送り、そこでタンパク質は４ＣＶの１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．２で均一濃度で溶離した。試料を、３．０μｍのガラス繊維／０．２μｍＳｕｐｏｒメンブレン（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ））に通して滅菌濾過した。
ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））を使用して、各精製分子のタンパク質濃度を２８０ｎＭ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度によって測定した。ＭＥＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して、製造元の指示に従って、変性、非還元４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル上の各最終精製分子３μｇで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。各最終精製分子２０μｇでＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析を行い、これを、１ｍＬ／分で、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ３０００カラム、７．８×３００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））で流し、２８０ｎｍでの吸光度を観察した。
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質の精製
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように精製された。
第１カラムとして１ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＭＳＳ）ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び第２カラムとして５ｍＬのＤｅｓａｌｔｉｎｇ ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ））タンデム液体クロマトグラフィーシステムを使用して、細胞培養培地から最初に融合タンパク質を精製した。培地を直接ＭＳＳカラムにロードし、８カラム容量（ＣＶ）の２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄し、２ＣＶの１００ｍＭ酢酸で溶離した。ＭＳＳカラム溶出液を自動的に脱塩カラムに送り、そこでタンパク質は４ＣＶの１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．２で均一濃度で溶離した。試料を、３．０μｍのガラス繊維／０．２μｍＳｕｐｏｒメンブレン（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ））に通して滅菌濾過した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））を使用して、各精製分子のタンパク質濃度を２８０ｎＭ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度によって測定した。ＭＥＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して、製造元の指示に従って、変性、非還元４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルに各最終精製分子３μｇを流して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。各最終精製分子３０μｇでＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析を行い、これを、１ｍＬ／分で、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ３０００カラム、７．８×３００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））で流し、２８０ｎｍでの吸光度を観察した。図３は、リンカーなし、（Ｇ４Ｓ）リンカーあり、（Ｇ４Ｓ）２リンカーあり、（Ｇ４Ｓ）３リンカーあり、又は（Ｇ４Ｓ）４リンカーありの抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質の代表的なＨＰＬＣ ＳＥＣ分析を示す。
実施例３：抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性
抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性を、ＣＢ１ ｃＡＭＰアッセイによりアクセスした。
ｈＣＢ１（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）を安定して発現するＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ－グルタミン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭで増殖させた。抗体活性を測定するために、０．５％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／Ｌ－グルタミン、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、及び４００μｇ／ＬのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ８０μＬの１ウェル当たり１０，０００細胞の密度で、細胞を９６ウェルプレートに播種した。一晩インキュベーションした後、培地を除去し、５μＬの新鮮な培地、続いて５μＬの培地＋１５μＭフォルスコリン（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ カタログ番号３４４２７３）及び２５０ｐＭ ＣＰ５５，９４０（ＴＯＣＲＩＳ カタログ番号０９４９）、その後１０ｍＭの酢酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０中の抗体４０μＬで置き換えた。次いで細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで培地を吸引し、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ ＸＳ＋ｃＡＭＰアッセイキット（９０－００７５－０３）を使用して製造元のプロトコルに従ってｃＡＭＰレベルを測定した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＶｉｅｗＬｕｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｉｍａｇｅｒでプレートを３０秒間読み取った。
アッセイの結果を表４に示す。ＴＴＲ抗体ホモ四量体は、ＣＢ１親抗体よりも３．９倍優れたＥＣ５０を有する。いくつかのＦａｂは電荷対変異を使用したが、その他は使用しなかった（実施例２の図２の議論参照）。これらの結果は、ＴＴＲ抗体ホモ四量体及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質が、親ＣＢ１ Ａｂと比較してＥＣ５０を改善することを示す。興味深いことに、抗ＣＢ１ ＴＴＲ抗体ホモ二量体は、ＣＢ１親抗体よりもＥＣ５０が好ましくなく、リンカーの長さが長くなるとＥＣ５０が悪化するように見える。
実施例４：抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング、発現、及び精製
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のようにクローニングされた。構築物Ｃ７４２０１（ｐＳＬＸ２４０ｐ：Ｎａｔｉｖｅ：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｄ７２（６２）Ｅ）ＶＨ］：：ｈｕＩｇＧ１ｚ－Ｎ２９７Ｇ）；Ｃ１４３０４６（ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｓ１８３Ｅ，Ｎ２９７Ｇ，Ｅ３５６Ｋ，Ｄ３９９Ｋ）ＶＨ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）；Ｃ１４３０４８（ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｓ１８３Ｋ，Ｎ２９７Ｇ，Ｋ３９２Ｄ，Ｋ４０９Ｄ）ＶＨ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）；Ｃ１３７３２４（ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６ＶＬ］）及びＣ７３８７７（ｐＴＴ５：Ｎａｔｉｖｅ：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６ＶＬ］：：ｈｕＫＬＣ）を、以下に記載する全ての構築物用の鋳型として使用した。
［配列番号１８］２－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１７：鋳型としてＣ７４２０１を使用し、抗ＧＩＴＲ ＭＡｂ ９Ｈ６（ｗ／Ｎ２９７Ｇ）のシグナルペプチドを、３ステップのオーバーラップＰＣＲ伸長により、ＶＫ１シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ）で置換し、次いでその最終ＰＣＲの産物を、５’シグナルペプチドプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ－３’）及び３’Ｃ－末端重鎖／Ｎ－末端ＴＴＲプライマー（ＧＧＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＡＧ Ｇ）を使用して増幅させ、１４５０塩基対産物を得た。ＰＣＲ１８：鋳型としてＴＴＲ（配列番号１）を使用し、ＴＴＲのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＣＣ Ｇ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５’－ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ１８によりおよそ４００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１７及び１８をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ１４３０４３：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｎ２９７Ｇ）ＶＨ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）と名付けた。
［配列番号２１］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ１９：鋳型としてＣ７４２０１を使用し、抗ＧＩＴＲ ＭＡｂ ９Ｈ６（Ｃ７４２０１）のシグナルペプチドを、３ステップのオーバーラップＰＣＲ伸長により、ＶＫ１シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ）で置換し、次いでその最終ＰＣＲの産物を、５’シグナルペプチドプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ－３’）及び３’Ｃ－末端重鎖／Ｎ－末端ＴＴＲプライマー（５’－ＧＣＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＴＡ ＧＡＧ ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＣＴＧ ＴＡＧ Ｇ－３’）を使用して増幅させ、６５０塩基対産物を得た。ＰＣＲ２０：鋳型としてＣ７４２０１を使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＴＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＡＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＣ－３’）を、ヒト重鎖定常領域をコードする３’プライマー（５’－ＣＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＡ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＣＴ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２０によりおよそ１３０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ２１：鋳型としてＴＴＲ３を使用し、ＴＴＲのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＡＡ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＡＣ ＧＧＧ ＣＡＣ ＣＧ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする２つの３’プライマー（５’－ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＴ ＧＧＧ ＡＴＴ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＡＣ Ａ－３’）及び（５’－ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２１によりおよそ４５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物１９、２０、及び２１をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物は、Ｃ１４４１３２：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｓ１８３Ｅ）ｓｃＦａｂ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）：：Ｇ：：Ｇ：：６ｘＨｉｓ（（Ｈｉｓ）６タグは、精製目的のために含まれたことに留意）と名付けた。
［配列番号１９］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ２２：鋳型としてＣ７４２０１を使用し、抗ＧＩＴＲ ＭＡｂ ９Ｈ６（Ｃ７４２０１）のシグナルペプチドを、３ステップのオーバーラップＰＣＲ伸長により、ＶＫ１シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ）で置換し、次いでその最終ＰＣＲの産物を、５’シグナルペプチドプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ－３’）及び３’Ｃ－末端重鎖／Ｎ－末端ＴＴＲプライマー（５’－ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＴＴ－３’）を使用して増幅させ、９９０塩基対産物を得た。ＰＣＲ２３：鋳型としてＣ１４３０４６を使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＣＣ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）をコードする３’プライマー（５’－ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＴＴ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２３によりおよそ３７０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ２４：鋳型としてＴＴＲ３を使用し、ＴＴＲのカルボキシル末端領域をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＡＧ ＴＡＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＣ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５－ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２４によりおよそ９００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物２２、２３、及び２４をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ１４４１２７：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｎ２９７Ｇ，Ｅ３５６Ｋ，Ｄ３９９Ｋ）ＶＨ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ， Ｋ１５Ａ）と名付けた。
配列番号２０を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ２５：鋳型としてＣ１４３０４８を使用し、シグナルペプチドのアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）をコードする３’プライマー（５’－ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＡＣＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＧＧ ＣＣＧ ＣＴＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２５によりおよそ６５０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ２６：鋳型としてＣ１４３０４８を使用し、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＣＴ ＧＡＧ ＣＡＧ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＣＣ－３’）を、カルボキシル末端ヒト重鎖定常領域（ＣＨ３）をコードする３’プライマー（５’－ＴＡＧ ＧＴＧ ＣＴＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＴＴ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２６によりおよそ３７０塩基対産物が得られた。ＰＣＲ２７：鋳型としてＴＴＲ３を使用し、ＴＴＲのカルボキシル末端領域をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＡＧ ＴＡＣ ＧＧＡ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＣ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端領域、終止コドン、及びＮｏｔＩ制限部位をコードする３’プライマー（５－ＴＣＧ ＣＴＡ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＣ ＡＴＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２７によりおよそ９００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物２５、２６、及び２７をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、これらの断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ１４４１３０：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｎ２９７Ｇ，Ｋ３９２Ｄ，Ｋ４０９Ｄ）ＶＨ］と名付けた。
配列番号２５を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ２８：鋳型としてＣ１３７３２４を使用し、シグナル配列のアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ）を、カルボキシル末端ヒト軽鎖定常領域をコードする３’プライマー（５’－ＴＡＴ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２８によりおよそ８００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ反応物２８をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ１４３０４４：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６ ＶＬ］と名付けた。
配列番号２６を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ２９：鋳型としてＣ１３７３２４を使用し、シグナル配列のアミノ末端をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴ）を、カルボキシル末端ヒト軽鎖定常領域をコードする３’プライマー（５’－ＴＧＧ ＴＧＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ２９によりおよそ４００塩基対産物が得られた。ＰＣＲ３０：鋳型としてＣ７３８７７を使用し、カルボキシル末端ヒト軽鎖定常領域をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＴＣＴ Ｇ－３’）を、カルボキシル末端ヒト軽鎖定常領域をコードする３’プライマー（５’－ＴＡＴ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ反応物２９及び３０をゲル分離し、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いで、断片を混合し、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔを用いて、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ消化線状哺乳類発現ベクターｐＴＴ５ｄに連結した。得られた構築物を、Ｃ１４３０４９：ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｓ１７６Ｋ）ＶＬ］と名付けた。
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の発現
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように発現された。
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ－１７（カタログ番号１３８３５）、Ｌ－グルタミン（（カタログ番号２５０３０）、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ４１８（カタログ番号１０１３１０２７、液体）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８（カタログ番号Ｋ４８９４）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。Ｄｉｆｃｏ ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ（カタログ番号２９２８０５）は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＰＥＩ Ｍａｘ（カタログ番号２４７６５－２）は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＨＥＫ２９３ ６Ｅ細胞を、１２０ＲＰＭで回転させた加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中のプラットフォームシェーカー上の懸濁液中で増殖させた。細胞培養継代培地は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ－１７＋０．１％（１０％の１０ｍＬ／Ｌ）のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８＋５００μＬ／ＬのＧ４１８＋６ｍＭ（３０ｍＬ／Ｌ）のＬ－グルタミンであった。トランスフェクションの１～２日前に細胞を継代し、トランスフェクション時の細胞密度が約１．５ｅ６ＶＣ／ｍＬになるようにした。トランスフェクション複合体を、最終培養容量の１０％の容量でサプリメントなしのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地中で混合した。培養物１ｍＬ当たり０．５μｇのＤＮＡをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地に添加し、次いで培養物１ｍＬ当たり１．５μＬのＰＥＩｍａｘ試薬を添加した。培養物を混合し、室温で１０分間インキュベーションし、次いで細胞培養物に添加した。次いで培養フラスコを、インキュベーター内のシェーカープラットフォームに戻した。トランスフェクションの１～４時間後に、培養物１ｍＬ当たり２５μＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ溶液を添加した。次いで条件培地をトランスフェクションの６日後に回収した。
あるいは、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体は、以下のように発現された。ＨＥＫ２９３細胞を、対応するｃＤＮＡで一過性にトランスフェクションした。１．０×１０６細胞／ｍＬのＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞懸濁液を、４ｍｇのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む０．５ｍｇ／ＬのＤＮＡ（ｐＴＴ５ｄベクター中０．２５ｍｇ／Ｌ ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６（Ｎ２９７Ｇ）ＶＨ］：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）及びｐＴＴ５ｄベクター中０．２５ｍｇ／Ｌのｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６ＶＬ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．ＮＲＣＣ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（２００２）３０，ｅ９）で、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中１ｍｇのＤＮＡにトランスフェクションし、及び振盪フラスコ中１５０ＲＰＭで３６℃にてインキュベーションした。最終０．５％のトランスフェクション用のＹｅａｓｔｏｌａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、トランスフェクションの４時間後に培養物に添加した。０．１％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８及び５０μｇ／ｍＬ Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎが補充されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７培地の懸濁液中で、細胞を６日間増殖させ、精製のために回収した。
４～２０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＱｕｉｃｋ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎゲルを使用して、条件培地を分析した。図５は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞で発現され得ることを示す。抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体に関して、発現が最も強力であった。レーン１は、１０．３ｍｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（３５６ＫＤａ）である；レーン２は、２９．３ｍｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（６５６ＫＤａ）である；レーン３は、１４３．６ｍｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（２５６ＫＤａ）である；レーン４は、１００ｎｇの抗ＤＮＰ抗体である；レーン５は、２５０ｎｇの抗ＤＮＰ抗体である；レーン６は、５００ｎｇの抗ＤＮＰ抗体である；レーン７は、１０００ｎｇの抗ＤＮＰ抗体である。抗ＤＮＰ抗体は、このアッセイで非標識抗体がどのように機能するかについての情報を提供する。非還元ローディングバッファー中のタンパク質１０μＬを、各レーンに添加した。加熱することなくゲルを泳動した。
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の精製及び特性評価
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように精製され、特性評価された。
２つの順次接続された１ｍＬ ｒプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＰｒｏＡ ＦＦ）ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）液体クロマトグラフィーシステムを使用して、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質を細胞培養培地から精製した。培地を直接ＰｒｏＡ ＦＦカラム上にロードし、５ＣＶのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、８ＣＶの１００ｍＭ酢酸で溶離した。精製した試料を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．２に対して２回透析した。
５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを備えたＡＫＴＡ精製装置液体クロマトグラフィーシステムを使用して、ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質を細胞培養培地から精製した。培地を、ＨｉｓＴｒａｐカラム上に直接ロードし、次いで２０ＣＶの２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄し、２０ＣＶイミダゾール勾配１０ｍＭ～５００ｍＭで溶離した。前者の方法ではクロマトグラフ分離能がないため、勾配溶出の代わりに８ＣＶの２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４の段階溶出を採用することを除いては、通過画分の再精製は、前述と同じ条件で実施された。精製した試料を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓを使用して、２Ｌの１０ｍＭ酢酸ナトリウム、９％スクロース、ｐＨ５．２に対して２回透析した。
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のタンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））を使用して、２８０ｎＭでのＵＶ吸光度（Ａ２８０）により測定した。
ＭＥＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して、製造元の指示に従って、変性、非還元４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルで、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（３μｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の各々で実施）を行った。図６参照。レーン１及び４は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体である；レーン２及び５は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体である；レーン３及び６は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体である。図６は、３つ全てのタンパク質融合構築物に関する部分精製産物が、非加熱、非還元レーンに基づいて正しく構築されることを示す。加熱及び還元により、３つのタンパク質融合構築物は予想される構成要素の鎖に分解される（上の方のバンドは重鎖であり、最も低い位置のバンドは軽鎖である）。
３０μｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の各々で、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析を実施した。クロマトグラフィーは、１ｍＬ／分で、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ３０００カラム、７．８×３００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用し、２８０ｎｍでの吸光度を観察した。
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、還元ＬＣＭＳ分析で分析した。２０μｇの物質を８ＭグアニジンＨＣｌ／ＴＲＩＳ ｐＨ８．０（Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ））中で変性させ、１０ｍＭ ＤＴＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で５０℃にて２０分間還元した。試料をトリフルオロ酢酸で酸性化し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を用いたＺｏｒｂａｘ逆相Ｃ８カラム上に１０μｇ注いだ。カラム溶離液を、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２３０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））のエレクトロスプレー源に導入し、質量スペクトルを収集した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアパッケージ内のＭａｘＥｎｔアルゴリズムを使用して、関連するスペクトルをデコンボリューションした。ＬＣとＨＣについて得られた質量スペクトルを、各鎖の理論的に計算された質量と比較した。
精製した抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体を、３２０ｍＬのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、１．４ＣＶの１０ｍＭ酢酸Ｎａ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０で一定濃度でさらに精製した（時間の経過とともに蓄積された凝集物を除去するため）。ＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度により、プールのために画分を選択した。ＳｕｐｅｒｄｅｘプールをＶｉｖａＳｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濃縮し、次いで０．２μｍ Ｓｕｐｏｒシリンジフィルタ（Ｐａｌｌ）に通して滅菌濾過した。１ｍＬ／分で、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．９のＳｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ，７．８×３００ｍＭカラム（Ｓｅｐａｘ（Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ））でＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー分析を実施し、２８０ｎｍでの吸光度を観察した。
図７は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（中央のピーク）、ＴＴＲ抗体ホモ四量体（左のピーク）、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（右のピーク）融合タンパク質の各々のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。ＳＥＣクロマトグラムは、メインピークが、正しく構築された分子と一致する予想位置で溶出することを示している。さらに、非変性ＳＥＣ精製（ＳＤＳ－ＰＡＧＥとは異なる）は、融合タンパク質が凝集しないという概念を支持する。
再精製された抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体の還元ＬＣＭＳ再分析を実施した。約１０μｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体をＳｐｅｅｄ－Ｖａｃで乾燥させ、次いで２０ｍＭ ＤＴＴを含む８Ｍ Ｇｕ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０の溶液２０μＬ中に再懸濁させた。試料を３７℃で１時間インキュベーションし、各試料を個々のタンパク質鎖成分に還元した。次いで各還元試料を０．１％ＴＦＡを添加することにより酸性化した。ＬＣ－ＭＳについて、約５μｇの還元試料をＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００キャピラリーＨＰＬＣに注入し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６２２４ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計に噴霧した。キャピラリーＨＰＬＣは、流速５０μＬ／分及びカラム温度７５℃を有する１．０ｍＭ×５０ｍＭ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ ３００ＳＢＣ８カラムを使用した。ＨＰＬＣは以下の緩衝液を使用した：緩衝液Ａ－０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ－０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／９０％ ｎ－プロパノール。勾配は、５分間２％Ｂで初期条件、２０分かけて４５％Ｂまで増加、３分かけて９５％Ｂまで、４分間９５％Ｂで一定、その後１分かけて２％に減少Ｂまで減少からなる。ＥＳＩ－ＴＯＦ装置のＭＳ法は、１スペクトル／秒の速度でｍ／ｚ［７５０～６０００］をスキャンした。その他のＭＳ機器パラメーターには、キャピラリー電圧（ＶＣａｐ）＝３２００Ｖ、フラグメンター電圧＝２２５Ｖ、スキマー＝６０Ｖ、及びＯＣＴ １ＲＦ Ｖｐｐ＝８００Ｖが含まれる。ＬＣ－ＭＳデータのデータ分析に関して、各タンパク質鎖についての適切なＬＣ－ＭＳスペクトルを組み合わせ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアを使用してデコンボリューションした。デコンボリューションした出力質量範囲は、［１５，０００－７５，０００］であり、質量ステップは１．０Ｄａ、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）閾値は３０．０であった。各試料で正しく還元された鎖質量が観察された。７５℃の分析温度を使用した結果、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体のホモ二量体重鎖でＡｓｐ－Ｐｒｏの切断が確認された。
抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ親ｍＡｂ ９Ｈ６（「１」）、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「４」）、ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「２」）、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「３」）融合タンパク質の示差走査熱量計（ＤＳＣ）を、Ｍａｌｖｅｒｎ ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ－キャピラリーＤＳＣで実施した。図８参照。以下のパラメーターを使用した。走査範囲：１０～１００℃；走査速度：１℃／分；前走査サーモスタット１５分。典型的には、４００μＬの１ｍｇ／ｍＬ試料は、各分析ごとに消費される。Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウェアでデータを加工する。分析されたタンパク質を、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞で発現させた。親Ａｂ（「１」）はグリコシル化されているが、ＴＴＲ融合物は、Ｎ２９７Ｇ ａ－グリコバリアントである。図８の結果は、ＴＴＲ融合タンパク質の融解温度が、親Ａｂに匹敵するか又はそれより良好であり、見出されたＴＴＲ融合タンパク質が強いことを示す。予想される熱誘導遷移順は、ＣＨ２、Ｆａｂ、ＣＨ３であった。
実施例５：抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性及びＰＫプロファイル
親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性及びＰＫプロファイルを評価した。
活性評価
親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の結合及び効力活性を、以下のアッセイにより評価した。これらのアッセイの結果を図１０に示す。
架橋を用いたアッセイ。９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３３６９）を、抗ＣＤ３ Ａｂ（ＯＫＴ３）及びｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ Ａｂ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ａｂ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３１１２５）又はヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ３１１１９）のいずれか）で、それぞれ１及び０．３μｇ／ｍＬで、４℃にて一晩コーティングした。次の日、Ａｂｓを洗い流し、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質ＴＴＲ、又はアイソタイプ対照ｍＡｂを、捕捉用プレートに３７℃で１時間添加した。インキュベーション後、プレートを洗い流し、ナイーブＴ細胞（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、及び５０μＭ ２ＭＥを補充したＲＰＭＩ１６４０の５０Ｋ／ウェル）をウェルに添加し、４日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、増殖を測定した。
架橋を用いないアッセイ。９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３３６９）を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ Ａｂで４℃にて一晩コーティングした。次の日、抗ＣＤ３ Ａｂを洗い流し、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質ＴＴＲ、又はアイソタイプ対照ｍＡｂを、プレートに添加し、続いてナイーブＴ細胞（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－Ｇｌｕｔ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＮａＰｙｒ、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ、及び５０μＭ ２ＭＥを補充したＲＰＭＩ１６４０の５０Ｋ／ウェル）を添加した。４日間の培養後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、増殖を測定した。
ＰＫプロファイルの評価
８．７５ｍｇ／ｋｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、４．７５ｍｇ／ｋｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、３．４ｍｇ／ｋｇの抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体、及び２ｍｇ／ｋｇの抗ＧＩＴＲ抗体で正規化されたオスのＣＤ－１マウス（１グループ当たりｎ＝３）モル当量の静脈内注射により、ＰＫプロファイルを測定した。投与から０．５、２、８、２４、４８、７２、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、及び８４０時間後に収集された７５μＬの血液試料から、血清試料を収集した。収集後、各血液試料を室温で維持し、３０～４０分の凝固時間の後、較正済みのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７Ｒ遠心分離システム（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））を使用して、試料を２～８℃、１１，５００ＲＰＭで約１０分間遠心分離した。次いで収集した血清を事前にラベルを付けた（各ラットについて）低温保存チューブに移し、後々のバイオ分析のために－６０℃～－８０℃で保存した。
以下のＰＫアッセイを使用して、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイにより、マウス血清中の親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の全抗ＧＩＴＲ種（すなわち、存在する任意の抗ＧＩＴＲ結合種）を測定した。通常の結合９６ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのマウス抗イディオタイプ抗ＧＩＴＲ抗体、Ｍａｂ１．２．１（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ））でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベーションした。次いでプレートを洗浄し、Ｉ－Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で４℃にて一晩ブロックした。標準及び品質管理（ＱＣ）はマウス血清で調製し、希釈が必要な場合はＰＫ試料をナイーブＣＤ－１マウス血清で希釈した。次いで標準、ＱＣ、及び試料を、ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液で１：２０に希釈した。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ緩衝液（ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））で３回洗浄し、続いて５０μＬの希釈された標準試料、ＱＣ、及び試料をＭａｂ１．２．１抗体コーティングプレートに移し、室温（およそ２５℃）で１．５時間インキュベーションした。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで５０μＬの２５０ｎｇ／ｍＬのマウス抗イディオタイプ抗ＧＩＴＲ抗体、Ｍａｂ１．１．１をビオチンに結合したものを添加し、１．５時間インキュベーションした。プレートを１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に結合した１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン５０μＬを添加し、１５分間インキュベーションした。プレートを、およそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて１５０μＬ１ｘＲｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、ＭＳＤ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光シグナルを測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）（Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４，Ｂｕｉｌｄ ６．４．０．７６８，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））で、ノンコンパートメント法を使用して血清濃度データを分析した。
以下のＰＫアッセイを使用して、マウス血清試料のＭＳＤアッセイにより、マウス血清中の抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の抗ＧＩＴＲ結合種及びＴＴＲ種の両方の存在を測定した。通常の結合９６ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのウサギ抗ＴＴＲポリクローナル抗体（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ））でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベーションした。次いでプレートを洗浄し、Ｉ－Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で４℃にて一晩ブロックした。標準及び品質管理（ＱＣ）はマウス血清で調製し、希釈が必要な場合はＰＫ試料をナイーブＣＤ－１マウス血清で希釈した。次いで標準、ＱＣ、及び試料を、ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１％ウシ血清アルブミン緩衝剤を含有する緩衝液で１：２０に希釈した。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ緩衝液（ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））で３回洗浄し、続いて５０μＬの希釈された標準試料、ＱＣ、及び試料を抗ＴＴＲ抗体コーティングプレートに移し、室温で１．５時間インキュベーションした。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで５０μＬの２５０ｎｇ／ｍＬのマウス抗イディオタイプ抗ＧＩＴＲ抗体、Ｍａｂ１．１．１をビオチンに結合したものを添加し、１．５時間インキュベーションした。プレートを１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に結合した１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン５０μＬを添加し、１５分間インキュベーションした。プレートを、およそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて１５０μＬ１ｘＲｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、ＭＳＤ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光シグナルを測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）（Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４，Ｂｕｉｌｄ ６．４．０．７６８，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））で、ノンコンパートメント法を使用して血清濃度データを分析した。
ＰＫ分析の結果は、図９で見出すことができる。図９ａ）（任意の抗ＧＩＴＲ結合種存在の測定）により示されるように：［１］抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「１」）のＰＫは、親Ａｂ（「２」）のＰＫよりも望ましい；［２］抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「４」）のＰＫは、あまり望ましくなく、これはおそらく、ＦａｂにＦｃ領域がなく、したがってその半減期を媒介／延長する能力がないという事実に起因する；及び［３］抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「３」）のＰＫは、親ｍＡｂほど強力ではないが、Ｆａｂと比較して大幅に強化されたＰＫを示す。図９ｂ）（抗ＧＩＴＲ結合種及びＴＴＲ種の両方の存在の測定）は、インタクトな抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ融合タンパク質のＰＫが、図９ａ）で観察されたものと一致していることを示し、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解によって各ＴＴＲ融合タンパク質から抗ＧＩＴＲ結合部分が遊離されていないことを示している。
図１０で示されるように、親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ ９Ｈ６の－ＴＴＲ融合物による－多量体化は、結合を向上させるが、効力は向上させない。ＧＩＴＲの活性化は制御性Ｔ細胞による抑制を妨げることが知られている。クラスター化及びＦｃγＲ結合が、細胞増殖の抗ＧＩＴＲ抗体媒介活性化、サイトカイン生成及びＣＤ４＋ Ｔｈ９細胞の導入に必要であることもまた公知である。図１０ａ）は、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「３」）、ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「４」）、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「２」）融合タンパク質の結合親和性が、親抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ ９Ｈ６（「１」）よりも望ましいことを示す。特に、図１０ｂ）により示されるように、細胞系アッセイでは、親和性が高くても効力が高くならないことを示す。図１０ｂ）の対照Ａｂは、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂの非結合対照バージョンである。
図９ａ及び図９ｂにおけるデータの比較は、ＴＴＲ構築物の部分的な分子分解がほとんどないことを示す。
実施例６：抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング、発現、及び精製
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のクローニング
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のようにクローニングされた。これらの実験では、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体は、コナツムマブ（ＡＭＧ６５５）であり、抗ＴＲＡＩＬＲ２ Ｆａｂは、コナツムマブのＦａｂ部分である。
ＧＩＴＲ ＴＴＲ発現プラスミド（実施例４参照）は、これらの抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合物の構築用の鋳型として、使用された。構築物Ｃ３６６０６（ｐＴＴ５：Ｎａｔｉｖｅ：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＸＧ１０４８（Ｗ）ＶＨ］：：ｈｕＩｇＧ１（ｆ））及びＣ９４４８（ＶＫ３＿Ａ２７Ｌ：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＸＧ１０４８ＶＬ］：：ｈｕＫＬＣ）は、それぞれ、抗ＴＲＡＩＬＲ２重鎖及び軽鎖可変領域配列に使用される鋳型であった。これらの実験では、抗ＴＲＡＩＬＲ２抗体は、コナツムマブ（ＡＭＧ６５５）である。抗ＴＲＡＩＬＲ２配列鋳型には、ＶＫ１（ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２）シグナルペプチドがないため、シグナルペプチド配列のカルボキシ末端にＢｓｓＨＩＩ部位を有するＶＫ１を含有するｐＳＬＸ２４０ｐｕｒｏ、ｐＳＬＸ２４０ｈｙｇｒｏ、及びｐＳＬＸ２４０ｎｅｏ構築物が見出された。
［配列番号３１］２－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３１：鋳型としてＣ３６６０６を使用し、重鎖配列のアミノ末端及びＶＫ１（ＶＫ１Ｏ１Ｏ１２）シグナル配列をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＧ－３’）を、抗ＴＲＡＩＬＲ２可変重鎖領域を増幅するように設計された３’プライマー（５’－ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３１により３９５塩基対産物が得られた。ＰＣＲ３２：鋳型としてＣ－１４３０４３を使用し、重鎖定常領域のアミノ末端及び抗ＴＲＡＩＬＲ２可変重鎖の最後の１８塩基をコードする５’プライマー（５’－ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＡＧ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ Ａ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端、終止コドン、ＮｏｔＩ部位、及び線形化ｐＳＬＸ２４０ｐプラスミドのアミノ末端をコードする１８塩基のオーバーハングをコードする３’プライマー（５’－ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＣＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３２により１３９０塩基産物が得られた。ＰＣＲ反応物３１及び３２を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２２５：ｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ ６５５ ＶＨ］：：ＩｇＧ１ｚ＿ＳＥＦＬ（ｄｅｓＫ）：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）と名付けた。
配列番号３８を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３３：鋳型としてＣ９４４８を使用し、抗ＴＲＡＩＬＲ２軽鎖可変領域のアミノ末端及びシグナル配列をコードする５’ＰＣＲプライマー（５’－ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＧＴ ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＧＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＣＧ ＣＡＧ －３’）を、３’プライマー（５’－ＡＧＣ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＣＡＣ ＣＴＴ－３’）と組み合わせて、抗ＴＲＡＩＬＲ２軽鎖可変領域を増幅し、３６３塩基対産物を生成する。ＰＣＲ３４、鋳型としてＣ－１４３０４４（ｐＴＴ５ｄ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＧＩＴＲ＞９Ｈ６ＶＬ］）を使用し、κ軽鎖定常領域のアミノ末端及び抗ＴＲＡＩＬＲ２可変領域の最後の９塩基をコードする５’プライマー（５’－ＡＴＣ ＡＡＡ ＣＧＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＣＡ ＴＣＴ－３’）を、ヒトκ軽鎖定常領域のカルボキシル末端、終止コドン及びＮｏｔＩ制限酵素をコードする３’プライマー（５’－ＴＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡＧ－３’）と組み合わせる。ＰＣＲ３４によりおよそ３３０塩基対産物が生成された。ＰＣＲ反応物３３及び３４を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｈ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２２６：ｐＳＬＸ２４０ｈ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ６５５ ＶＬ］：：ｈｕＫＬＣと名付けた。
［配列番号３２］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３１を上記のように利用した。ＰＣＲ３５：鋳型としてＣ－１４４１２７を使用し、重鎖定常領域のアミノ末端及び抗ＴＲＡＩＬＲ２重鎖可変領域の最後の１８塩基をコードする５’プライマー（５’－ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ Ｃ－３’）を、ＴＴＲのカルボキシル末端をコードする３’プライマー（５’－ＴＴＡＡＡＣＧＡＴＡＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＧ－３’）と組み合わせて、およそ１３９０塩基対産物を生成する。ＰＣＲ反応物３１及び３５を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２２７：ｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ ６５５ ＶＨ］：：ＩｇＧ１ｚ（Ｎ２９７Ｇ，ＫＫ）：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）と名付けた。
配列番号３３を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３１を上記のように利用した。ＰＣＲ３６：鋳型としてＣ－１４４１３０を使用し、５’プライマー（５’－ＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣ－３’）を、重鎖定常領域のカルボキシル末端、終止コドン、及びＮｏｔＩ部位をコードする３’プライマー（５’－ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＡＧ ＡＧＧ ＣＴＣ Ａ－３’）と組み合わせることにより、およそ１ｋｂサイズの産物が得られた。ＰＣＲ反応物３１及び３６を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｎ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２２８：ｐＳＬＸ２４０ｎ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ ６５５ ＶＨ］：：ＩｇＧ１ｚ（Ｎ２９７Ｇ，ＤＤ）と名付けた。
［配列番号３４］４－［配列番号１］４を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３１を上記のように利用した。ＰＣＲ３７：鋳型としてＣ１４４１３２を使用し、５’プライマー（５’－ＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡ－３’）を、６ｘＨｉｓ、終止コドン、及びＮｏｔＩ部位をコードする３’プライマー（５’－ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＡＧ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＣＣ－３’）と組み合わせ、およそ７４０塩基対産物を生成した。ＰＣＲ反応物３１及び３７を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２３７：ｐＳＬＸ２４０ｐ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ６５５（Ｓ１８３Ｅ）ｓｃＦａｂ］：：Ｇ２：：ＴＴＲ（Ｃ１０Ａ，Ｋ１５Ａ）：：Ｇ２：：６ｘＨｉｓ（（Ｈｉｓ）６タグは、精製目的のために含まれたことに留意）と名付けた。
配列番号３９を、以下のとおり構築した。ＰＣＲ３３を上記のように利用した。ＰＣＲ３８：鋳型としてＣ－１４３０４９を使用し、５’プライマー（６１８６－６５）を、κ軽鎖定常領域のカルボキシル末端、終止コドン、及びＮｏｔＩ部位をコードする３’プライマー（５’－ＴＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＣＴ ＡＧＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡ－３’）と組み合わせ、およそ３３０塩基対産物を生成した。ＰＣＲ反応物３３及び３８を、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。次いでこれらの断片を、連結非依存のクローニング反応（Ｇｅｎｅａｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ）でＢｓｓＨＩＩ及びＮｏｔＩ部位で線形化されたｐＳＬＸ２４０ｈ：ＶＫ１プラスミドと組み合わせた。得られた構築物は、Ｃ－１５０２３８：ｐＳＬＸ２４０ｈ：ＶＫ１Ｏ２Ｏ１２：：［ｈｕ抗＜ｈｕＴＲＡＩＬＲ２＞ＡＭＧ ６５５ ＶＬ］：：ｈｕＫＬＣ－Ｓ１７６Ｋと名付けた。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の発現
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように発現された。
ＴＴＲ融合タンパク質は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を添加した懸濁液中で安定に発現した。製造元のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用してトランスフェクションを実施した。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体についいて１：１（１ＨＣ又はＦａｂ－ＨＣ対１ＬＣ）の比で、又はＴＴＲ抗体ホモ四量体について１：１：１（１ＨＣ＋対１ＨＣ－対１ＬＣ）の比で、合計３０～３６μｇの哺乳類発現プラスミドＤＮＡを使用した。各々について、プラスミドＤＮＡを３～４ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に添加し、混合した。別のチューブで、７２～７５μＬのリポフェクタミンＬＴＸを、３～４ｍＬのＯＰＴＩ－ＭＥＭに添加した。溶液を室温で５分間インキュベーションした。トランスフェクション複合体を形成するために、ＤＮＡ及びリポフェクタミンＬＴＸ混合物を各々について組み合わせ、室温でさらに２０分間インキュベーションした。対数期ＣＨＯ－Ｋ１細胞を遠心分離（１２００～１５００ＲＰＭ５分間）によりペレット化し、１ＸＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄し、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ中の１．５－２ｅ６生存細胞／ｍＬに再懸濁させた。各トランスフェクションについて、５～６ｍＬの洗浄した細胞を、１２５ｍＬ容量の振盪フラスコに添加した。ＤＮＡトランスフェクション複合体を各々の細胞に添加した。フラスコを３６℃、５％ＣＯ２でインキュベーションし、１５０ＲＰＭで６時間振盪した。トランスフェクションを止めるために、９～１２ｍＬの増殖培地を各フラスコに添加し、４８～７２時間インキュベーションした。
選択を始めるため、トランスフェクションの７２時間後、細胞を遠心分離（１２００～１５００ＲＰＭ５分間）によりペレット化し、培地を抗生物質を補充した２３～２５ｍＬの増殖培地と交換した。選択培地を１週間に２～３回交換し、細胞の生存率及び密度が回復するまで、培養物が過剰に増殖しないように（＜５－６ｅ６ｖｃ／ｍＬ）必要なときに培養液を希釈した。
振盪フラスコで３６℃にて大規模製造（２．３Ｌ～２．５Ｌ）を実施した。製造は、製造媒体中、２ｅ６ｖｃ／ｍＬで播種された。５日目に、条件培地を、遠心分離、続いて濾過（０．４５μｍ）により回収した。
図１１で示されるように、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、よく発現し、正しく構築される（図１１ａ）参照）。図１１ｂ）は、予想される融合タンパク質成分が、加熱及び還元時に存在することを示す。レーンごとに５μＬの条件培地をロードし、４～２０％ＴＧゲルで泳動した。図１１ａ）で見られるように、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ Ｆａｂ四量体は、完全に構築された複合体について予想される標準的な抗体よりも大きい複合体としてＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で移動する。図１１ｂ）で見られるように、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体は、重鎖（上の方のバンド）並びに遊離軽鎖（下の方のバンド）を有する融合分子について予想されるように、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で移動する。
図１２で示されるように、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体は、よく発現し（約１５０ｍｇ／Ｌで）、ＣＨＯ－Ｋ１細胞で正しく構築する（図１２ａ）参照、最上部バンド）。図１２ｂ）は、ホモ四量体複合体が、加熱すると、その予想された構成要素に分解されることを示し、図１２ｃ）は、ホモ四量体複合体が、加熱及び還元すると、その予想された構成要素に分解されることを示す。レーンごとに２～５μＬの条件培地をロードし、４～２０％ＴＧゲルで泳動した。
図１３は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体が正しく構築され、加熱及び還元により、分子は予想される構成要素の鎖に分解される（上の方のバンドは重鎖であり、最も低い位置のバンドは軽鎖である）ことを示す。図１３は、ＴＴＲ構築物が様々な抗体で生成できることを示す。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の精製及び特性評価
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように精製された。２つの順次接続された５ｍＬ ＰｒｏＡ ＦＦ ＨｉＴｒａｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）液体クロマトグラフィーシステムを使用して、分子を細胞培養培地から精製した。培地を直接ＰｒｏＡ ＦＦカラム上にロードし、５ＣＶのＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、８ＣＶの５０ｍＭ酢酸、ｐＨ３．２で溶離した。ＰｒｏＡ ＦＦ溶出プールを、２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．２を使用して、ｐＨ５．０まで滴定し、次いで９容量の滅菌水で希釈した。調節したＰｒｏＡ ＦＦプールを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して２回透析した。透析したプールを、１８ｍＬ ＳＰセファロース高性能（ＳＰ ＨＰ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムで精製し、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で５ＣＶ洗浄を採用し、２０ＣＶ ＮａＣｌ 勾配０ｍＭ～５００ｍＭで溶離した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度により、プールのために画分を選択した。ＳＰ ＨＰプールを、ＶｉｖａＳｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いて濃縮し、次いで３２０ｍＬ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、１．４ＣＶの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．０で一定濃度で精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度により、プールのために画分を選択した。ＳＰ ＨＰプールを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの１０ｍＭＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して２回透析した。透析した試料をＶｉｖａＳｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濃縮し、次いで０．２μｍ Ｓｕｐｏｒシリンジフィルタ（Ｐａｌｌ）に通して滅菌濾過した。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質は、一般に、以下のように精製された。５０ｍＬ Ｎｉセファロースｅｘｃｅｌ（Ｎｉ ｅｘｃｅｌ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを備えたＡＫＴＡ精製装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）液体クロマトグラフィーシステムを使用して、分子を細胞培養培地から精製した。培地を、ＨｉｓＴｒａｐカラム上に直接ロードし、次いで１０ＣＶの２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄し、８ＣＶイミダゾール 勾配１０ｍＭ～５００ｍＭで溶離した。Ｎｉ ｅｘｃｅｌプールを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して２回透析した。透析したプールを、１８ｍＬ ＳＰセファロース高性能（ＳＰ ＨＰ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）カラムで精製し、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０で５ＣＶ洗浄を採用し、２０ＣＶ ＮａＣｌ 勾配０ｍＭ～５００ｍＭで溶離した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ－ＳＥＣ純度により、プールのために画分を選択した。ＳＰ ＨＰプールを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、２Ｌの１０ｍＭＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して２回透析した。透析した試料をＶｉｖａＳｐｉｎ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心分離濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して濃縮し、次いで０．２μｍ Ｓｕｐｏｒシリンジフィルタ（Ｐａｌｌ）に通して滅菌濾過した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ））を使用して、タンパク質濃度を２８０ｎＭ（Ａ２８０）でのＵＶ吸光度によって測定した。製造元の指示に従って、ＭＥＳランニングバッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して、変性、非還元４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲルにより、試料を分析した。試料を、１ｍＬ／分で、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．９のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＳＥＣ３０００カラム、７．８×３００ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））で分析し、２８０ｎｍでの吸光度を観察した。
図１４は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（中央のクロマトグラム）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（右のクロマトグラム）、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（左のクロマトグラム）融合タンパク質の各々のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析の結果を示す。ＳＥＣクロマトグラムは、メインピークが、正しく構築された分子と一致する予想位置で溶出することを示している。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の還元ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。試料を２００ｍＭ酢酸アンモニウムにバッファー交換し、ｎａｔｉｖｅ ＭＳ研究用の最終的なＭＳ作動溶液として５μＭに作製した。試料をまた、８ＭグアニジンＨＣｌで変性させ、ＬＣ－ＭＳ分析のために２０ｍＭ ＤＤＴで還元させた。次いで２μｇの材料をＬＣ－ＭＳシステムに注入した。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のＮａｔｉｖｅ ＭＳ分析及びイオン移動度分析を、ポジティブナノフローＥＳＩモードで操作される、修正されたＳｙｎａｐｔ Ｇ１ ＨＤＭＳ装置を使用して、高周波閉じ込めドリフトチューブで実行した。重要な機器電圧及び圧力は以下のとおりであった：キャピラリー電圧 ０．８～１．０ｋＶ；試料コーン ４０Ｖ、抽出コーン １Ｖ；ソースブロック温度 ３０℃；トラップ衝突エネルギー ４．０Ｖ；移動衝突エネルギー ６０～２００Ｖ、高周波閉じ込めドリフトセル全体に適用される３．３Ｖ～１１．１Ｖ／ｃｍに相当する；トラップ入口 ３．０Ｖ；トラップバイアス １６Ｖ（Ｎ２；Ｎ２で操作される場合にドリフトセルにイオンを注入するには、電位を上げる必要がある）；ＩＭＳ ＤＣ入口 ５．０Ｖ；ＩＭＳ ＤＣ出口 ０．０Ｖ；移動ＤＣ入口 ０．０Ｖ；移動ＤＣ出口 ２．０Ｖ；移動波速度 ７０ｍ／秒；移動波振幅 ４．０Ｖ；モビリティトラッピング解放時間 ２５０μｓｅｃ；トラップ高 ２０．０Ｖ；抽出高 ０．０Ｖ；ソースＲＦ振幅（最大振幅）４５０Ｖ；Ｔｒｉｗａｖｅ ＲＦ振幅（最大振幅）、トラップ３８０Ｖ、ＩＭＳ １５０Ｖ、移動３８０Ｖ；ソースバッキング圧力 ６．０ｍｂａｒ；トラップ／移動圧力ＳＦ６、３．３ｅ－２ｍｂａｒ（ピラニ真空計表示：流速３．０ｍＬ／分）；ＩＭＳ圧力 Ｎ２ ２．０５ｍｂａｒ（１．５４Ｔｏｒｒ；流速３８ｍＬ／分）；ＩＭＳ圧力 Ｈｅ ２．７０ｍｂａｒ（２．０３Ｔｏｒｒ；流速７０ｍＬ／分）。ＭＫＳ Ｂａｒａｔｒｏｎキャパシタンスマノメータ、タイプ６２６（範囲１０Ｔｏｒｒ；０．２５％まで正確）及びＭＫＳ ＰＤＲ２０００電源を使用して、高周波閉じ込めドリフトセル内の圧力を正確に測定した。周囲温度は、Ｏａｋｔｏｎ Ｔｅｍｐ１０Ｔ熱電対を使用して測定した。キャパシタンスマノメータのイオン光学系蓋に接続されているポイントで、温度を測定した。機器制御及びデータの獲得を、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１ ＳＣＮ ６３９，ＳＣＮ７４４により実施した。そのため、移動度及びΩ値は、ドリフトセルデバイス内の圧力及びドリフトセルの周囲温度を正確に測定し、異なるドリフトセル電圧（６０Ｖ～２００Ｖ）で最大１０回の移動度測定を行うことによって、作成された。個々の温度及び圧力測定を、各収集及び最終Ω値計算について行い、平均温度及び圧力値を使用した。１０分にわたる典型的な温度及び圧力変化は、≦０．２℃及び≦０．００２Ｔｏｒｒであった。
２μｇの変性及び還元タンパク質を直接、４５℃及び流速４００μＬ／分で操作される、Ｃ４ ＢＥＨ ２．１×５０ｍＭ分析カラムに注入することにより、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の変性ＬＣ－ＭＳ分析を実施した。ＭＳ－検出は、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏＱ－ＴｏＦ質量分析計で実施した。試料コーン及び抽出コーンを、それぞれ、３５Ｖ及び１Ｖに設定した。
質量分析及びイオン移動度の結果：抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体：ｎａｔｉｖｅ－ＭＳ測定ＭＷは６４５．９ｋＤａであり、イオン移動度測定Ｎ２－ＣＣＳ値は１９０．１ｎｍ２であり、サブユニットの変性及び還元ＭＷは、２３，３８８Ｄａ、４９，１８０Ｄａ、及び６２，８７２Ｄａであった。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質：ｎａｔｉｖｅ－ＭＳ測定ＭＷは２５０．５ｋＤａであり、イオン移動度測定Ｎ２－ＣＣＳ値は１３０．３ｎｍ２であり、サブユニットの変性及び還元ＭＷは、２３，４２９Ｄａ及び３８，５８２Ｄａであった。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体融合タンパク質ｎａｔｉｖｅ－ＭＳ測定ＭＷは３４７．２ｋＤａであり、イオン移動度測定Ｎ２－ＣＣＳ値は１２４．０ｎｍ２であり、サブユニットの変性及び還元ＭＷは、２３，３９１Ｄａ及び６２，８６７Ｄａであった。
抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のＳＥＣ－多角光散乱（ＭＡＬＳ）を、Ｗｙａｔｔ Ｈｅｌｅｏｓ ＩＩ及びＯｐｔｉＬａｂ－ＴｒＥＸ検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで実施した。使用したカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１０／３００ＧＬ）であった。移動相は、０．４ｍＬ／分の流速を有する２×ＰＢＳであった。分析時間は１試料につき７０分であった。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体及びＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質の４つのＳＰ画分（Ａ３、Ａ８、Ａ１２及びＣ１）についての注入量は、それぞれ、８１、６３、７５、及び７５μｇであるとともに、抗ＴＲＡＩＬＲ２－ＴＴＲの最終プールについての注入量は７７μｇであった。実行設定、データ収集、分析手順は、Ａｇｉｌｅｎｔ’ｓ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（ｖ Ｂ．０４．０２ ９６）及びＷｙａｔｔ’ｓ ＡＳＴＲＡ（ｖ６．１．１．１７）ソフトウェアで実行された。
実施例７：抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性及びＰＫプロファイル
親抗ＴＲＡＩＬＲ２ ｍＡｂ（コナツムマブ）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性及びＰＫプロファイルを評価した。
ＰＫプロファイル
６．５ｍｇ／ｋｇのＴＴＲ抗体ホモ四量体、３．５ｍｇ／ｋｇのＴＴＲ抗体ホモ二量体、２．５ｍｇ／ｋｇのＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体、及び１．５ｍｇ／ｋｇのコナツムマブ及びコナツムマブ－３４１－Ｇ１（コナツムマブ－３４１－Ｇ１は、ＴＲＡＩＬＲ２に結合しないように設計されたＡｂである）抗体で正規化された雄のＣＤ－１マウス（１グループ当たりｎ＝３）モル当量の静脈内注射により、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及びＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質のＰＫプロファイルを測定した。投与から０．５、２、８、２４、４８、７２、９６、１９２、３３６、５０４、６７２、及び８４０時間後に収集された７５μＬの血液試料から、血清試料を収集した。収集後、各血液試料を室温で維持し、３０～４０分の凝固時間の後、較正済みのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１７Ｒ遠心分離システム（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））を使用して、試料を２～８℃、１１，５００ｒｐｍで約１０分間遠心分離した。次いで収集した血清を事前にラベルを付けた（各ラットについて）低温保存チューブに移し、後々のバイオ分析のために－６０℃～－８０℃で保存した。
以下のＰＫアッセイを使用して、メソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイにより、マウス血清中のコナツムマブ、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の全抗ＴＲＡＩＬＲ２種（すなわち、存在する任意の抗ＴＲＡＩＬＲ２結合種）を測定した。マウス血清試料中のコナツムマブの総量を測定するために、通常の結合９６ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのウサギ抗コナツムマブポリクローナル抗体（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ））でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベーションした。次いでプレートを洗浄し、Ｉ－Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で４℃にて一晩ブロックした。標準及び品質管理（ＱＣ）はマウス血清で調製し、希釈が必要な場合はＰＫ試料をナイーブＣＤ－１マウス血清で希釈した。次いで標準、ＱＣ、及び試料を、ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１％ウシ血清アルブミンを含有する緩衝液で１：２０に希釈した。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ緩衝液（ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））で３回洗浄し、続いて５０μＬの希釈された標準試料、ＱＣ、及び試料を抗コナツムマブ抗体コーティングプレートに移し、室温（およそ２５℃）で１．５時間インキュベーションした。プレートをおよそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで５０μＬの１００ｎｇ／ｍＬのマウス抗－ｈｕ Ｆｃ抗体、クローン１．３５．１をＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ））にＩ－ Ｂｌｏｃｋ（商標）含有５％ＢＳＡ中で結合したものを添加し、室温で１．５時間インキュベーションした。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体構築物について、５０μＬの２５０ｎｇ／ｍＬのマウス抗κＬＣ、クローンＫＣＦ－９をビオチンに結合させたものを添加し、１．５時間インキュベーションした；次いで、プレートを１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で洗浄した後、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に結合した１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン５０μＬを添加し、１５分間インキュベーションした。プレートを、およそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて１５０μＬ １ＸＲｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、ＭＳＤ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光シグナルを測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）（Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４，Ｂｕｉｌｄ ６．４．０．７６８，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））で、ノンコンパートメント法を使用して血清濃度データを分析した。
以下のＰＫアッセイを使用して、マウス血清試料のＭＳＤアッセイにより、マウス血清中の抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ結合種及びＴＴＲ種の両方の存在を測定した。通常の結合９６ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））を、ＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬのウサギ抗ＴＴＲポリクローナル抗体（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ））でコーティングし、次いで４℃で一晩インキュベーションした。次いでプレートを洗浄し、Ｉ－Ｂｌｏｃｋ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））で４℃にて一晩ブロックした。標準及び品質管理（ＱＣ）はマウス血清で調製し、希釈が必要な場合はＰＫ試料をナイーブＣＤ－１マウス血清で希釈した。次いで標準、ＱＣ、及び試料を、ＰＢＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び１％ウシ血清アルブミン緩衝剤を含有する緩衝液で１：２０に希釈した。プレートをおよそ２００μＬの１×ＫＰＬ緩衝液（ＫＰＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））で３回洗浄し、続いて５０μＬの希釈された標準試料、ＱＣ、及び試料を抗ＴＴＲ抗体コーティングプレートに移し、室温で１．５時間インキュベーションした。プレートをおよそ２００μＬの１×ＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで５０μＬの２５０ｎｇ／ｍＬのウサギ抗コナツムマブポリクローナル抗体をビオチンに結合したものを添加し、１．５時間インキュベーションした。プレートを１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ＭＳＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に結合した１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン５０μＬを添加し、１５分間インキュベーションした。プレートを、およそ２００μＬの１ＸＫＰＬ洗浄緩衝液で６回洗浄し、続いて１５０μＬ１ｘＲｅａｄ緩衝液Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加し、ＭＳＤ６０００プレートリーダー（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、電気化学発光シグナルを測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）（Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４，Ｂｕｉｌｄ ６．４．０．７６８，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ（登録商標）Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ））で、ノンコンパートメント法を使用して血清濃度データを分析した。
ＰＫ分析の結果は、図１５で見出すことができる。図１５ａ）（任意の抗ＴＲＡＩＬＲ２結合種の測定）により示されるように：［１］抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「１」）のＰＫは、親Ａｂ（コナツムマブ（「３」）；及びコナツムマブ－３４１－Ｇ１（「２」））のＰＫよりも良好である；［２］抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「５」）のＰＫは、貧弱であり、これはおそらく、ＦａｂにＦｃ領域がなく、したがってその半減期を媒介／延長する能力がないという事実に起因する；及び［３］抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「４」）のＰＫは、親ｍＡｂと類似のＰＫを示す。 特に、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体は、その親（コナツムマブ）と比較してより良好なＰＫを示し、これは、抗ＧＩＴＲ ＴＴＲ抗体ホモ四量体に関して観察されたものとは異なる（これは親ｍＡｂほど強力ではないが、Ｆａｂと比較して大幅に強化されたＰＫを示した）。この観察は、ＴＴＲ抗体ホモ四量体融合タンパク質のＰＫが、抗体及び／又は標的依存であり得ることを示唆する。図１５ｂ）（抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ結合種及びＴＴＲ種の両方の存在の測定）は、インタクト抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質のＰＫが、図１５ａ）で観察されたものと一致していることを示し、ｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解によって各ＴＴＲ融合タンパク質から抗ＴＲＡＩＬＲ２結合部分が遊離されていないことを示している。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「１」）；抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「２」）；及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「３」）を、図１５ｂ）で評価する。
細胞系活性アッセイ
メラノーマ細胞株ＷＭ３５（ＡＴＣＣ）上の抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合タンパク質対コナツムマブ＋プロテインＧの活性を評価した。ＷＭ３５はＤＲ５を発現するがＤＲ４は発現しないと、評価された。ＴＲＡＩＬは、ＤＲ５及びＤＲ４の両方を活性化する。マイクロタイタープレートの１ウェル当たり１０４個の細胞で、ＷＭ３５細胞をプレーティングし、次いでコナツムマブ、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、又は抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質と共に、架橋を促進するために、１μｇ／ｍＬのプロテインＧ（Ｐｉｅｒｃｅ）の非存在下又は存在下で、インキュベーションした。三通りの試料を分析した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。製造元の指示に従い、細胞Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏ反応を実施し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎを使用して、発光を測定した。ｙ軸は、発光シグナルを相対発光単位（ＲＬＵ）として示す；ＲＬＵの減少は、ＡＴＰ産生の減少と生存細胞数の減少を反映する。ｘ軸は、タンパク質濃度を示す。
図１６は、ＷＭ３５アッセイの結果を示す。コナツムマブ（「１」）は、プロテインＧ（Ｉｇ結合部位を２つ有する；「５」）とクラスター化されていない限り、細胞を殺す効果はない。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「２」）は、親コナツムマブよりもＷＭ３５細胞を殺すのがわずかに優れている。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「４」）は、コナツムマブよりもわずかに優れたＷＭ３５細胞殺傷能力を有する。しかし、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「３」）は、ＷＭ３５細胞の殺傷において、コナツムマブよりもはるかに強力であり、コナツムマブ／プロテインＧクラスター化複合体よりもさらに強力である。加えて、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体のプロテインＧとのクラスター化（「６」）は、融合タンパク質の効力を改善したが、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体のプロテインＧとのクラスター化（「８」）はほとんど効果がなかった。興味深いことに、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体のプロテインＧとのクラスター化（「７」）は、タンパク質融合の効力をわずかに損なった。これらの結果は、ＴＴＲ抗体ホモ四量体媒介クラスター化は、抗腫瘍活性を向上させ得ることを示す。
初代ヒトケラチノサイト（Ｌｏｎｚａ）上の抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ融合物対コナツムマブ＋プロテインＧの活性もまた、評価した。マイクロタイタープレートの１ウェル当たり１０４個の細胞で初代ケラチノサイトをプレーティングし、次いでＴＲＡＩＬ単独、架橋を促進するために１μｇ／ｍＬタンパク質Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ）を含むコナツムマブ、又はＴＲＡＩＬ＋１μｇ／ｍＬコナツムマブと共にインキュベーションした。各条件で試料を３通り準備した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。また、マイクロタイタープレートの１ウェル当たり１０４個の細胞で初代ケラチノサイトをプレーティングし、次いで抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体、コナツムマブ、又はＴＲＡＩＬと共に、示された濃度でインキュベーションした。１μｇ／ｍＬコナツムマブと組み合わせたＴＲＡＩＬもまた試験した。試料を３通り準備した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベーションした後、細胞生存率を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。
図１７は、ケラチノサイトアッセイの結果を示す。また、コナツムマブ（「１」）は、初代ヒトケラチノサイト細胞の殺傷に効果がなかった。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「２」）は、コナツムマブよりもわずかに優れた効力を示す。また、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「３」）は、ヒト初代ケラチノサイト細胞の殺傷では、コナツムマブよりもかなり強力であった。また、これらの結果は、ＴＴＲ抗体ホモ四量体媒介クラスター化が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞殺傷アッセイにおける活性を向上させ得ることを示す。
ネズミｃｏｌｏ２０５腺癌モデル系活性アッセイ
コナツムマブ、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体融合タンパク質の活性を、ネズミＣｏｌｏ２０５ヒト結腸腺癌がんモデルで評価した。１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，２４４２－５００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳＨ３００３４．０１）、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＳＨ３０２３７．０１）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓ８６３６－１００ｍＬ）、及び２．５ｇ／Ｌグルコース（Ｓｉｇｍａ，Ｇ８７６９）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培養培地中で、Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸腺癌細胞を、３７℃にて５％ＣＯ２で維持した。継代３で、細胞を回収し、無血清培地中で再懸濁させて、１０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度を得た。細胞生存率は、トリパンブルー排除により９８％であると決定された。
６０匹のメスのＮＵ／ＮＵヌードマウスの右脇腹に１×１０６個の細胞（１００μＬ容量）を皮下注射し、イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔した。腫瘍移植後７日目に、腫瘍体積が３４ｍｍ３～９９ｍｍ３の５０匹のマウスを、各グループが４０ｍｍ３～４８ｍｍ３の範囲の同様の平均腫瘍体積になるように、１０匹ずつの５つの治療グループに分けた。腫瘍が小さい又は大きい１０匹のマウスをこの研究から除外した。
５グループの動物に週２回（ｂ．ｉ．ｗ）、コナツムマブ（０．６９μＭ／動物）、コナツムマブ－３４１－Ｇ１（０．６９μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（０．３４μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（０．１７μＭ／動物）、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（０．１７μＭ／動物）を腹腔内投与し、３週間で全部で６治療行った。治療は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（残りの治療と比較して結合部位の半分のみであった）を除いて、全てがコナツムマブと同じ数の結合部位を有するように正規化された。全ての治療は腫瘍移植後８日目に開始し、２５日目に終了した（治療は、８、１１、１５、１９、２２、及び２５日目であった）。全ての治療は、注射直前の治療で希釈液（ＤＰＢＳ）中で新たに調製した。
腫瘍体積測定：腫瘍の長さと幅は、ＡＢＳ Ｄｉｇｉｍａｔｉｃソーラーキャリパー、モデル＃Ｃｄ－Ｓ６”Ｃ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）で測定された。腫瘍体積は０．５×Ｌ×Ｗ２として計算され、Ｗは２つの測定値のうち小さい方でｍｍ３で表された。
体重測定：体重測定について、動物を体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ ＴｏｌｅｄｏモデルＰＢ６０２－Ｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の皿に置いた。３秒間の平均体重は、体重計の動的重量関数を使用して決定された。体重は１００×（Ｗｃ／Ｗｉ）として計算される体重変化として報告され、ここで、Ｗｃは現在の体重、Ｗｉは治療開始時の体重である。この研究では、４日目の体重を全ての動物のＷｉとして使用した。
安楽死：腫瘍のサイズが１５００～２０００ｍｍ３に達したため、研究終了前に５匹の動物を安楽死させた。コナツムマブ－３４１－Ｇ１グループ：２５日目に腫瘍体積が過剰になったために２匹のマウスを安楽死させた。３５日目に腫瘍体積が過剰になったため、さらに２匹のマウスを安楽死させた。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体グループの１０匹のマウス及びコナツムマブ－３４１－Ｇ１グループの残りの６匹のマウスは、平均腫瘍体積＞１２００ｍｍ３又はコホートのマウスの半分以上の喪失により、４２日目に安楽死させた。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体グループ由来の１匹のマウスを、４２日目に腫瘍サイズ＞２０００ｍｍ３になったため、安楽死させた。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体グループ由来の１匹のマウスを、４９日目に腫瘍体積が過剰になったため、安楽死させた。残りの全ての動物は、研究の終了で６３日目に安楽死させた。動物をイソフルオランの過剰摂取で安楽死させた後、心臓穿刺により採血した。
腫瘍測定：４日目から６３日目までのデータは、平均±標準誤差として表され、時間の関数としてプロットされた。Ｄｕｎｎｅｔｔが調整した複数の比較を使用して、変換された腫瘍体積データの分散の反復測定分析によって、増殖曲線間の観察された差の統計的有意性を評価した。変換されたベースライン腫瘍体積、日、治療、及び日ごとの治療相互作用のモデル効果を用いたＳＡＳ ＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤ手順を使用して分析を行った：日が繰り返された値、動物対象、及びテプリッツ共分散構造であるＲＥＰＥＡＴＥＤステートメント；並びに対照グループを他の治療グループと比較するＤｕｎｎｅｔｔ分析を行うためのＬＳＭＥＡＮＳステートメント。データは、Ｈｏｒｗｉｔｚの方法に従って変換された対数又は平方根であり、変換されたベースライン腫瘍体積は、治療前の腫瘍体積の違いの可能性を考慮して、モデルの共分散として含まれた。対数変換又は平方根変換が適切な残差分布を達成できなかった場合は、ノンパラメトリック反復測定分散分析を、腫瘍体積のランクに対する同じモデルの影響とともに使用した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。コナツムマブ（野生型）及びコナツムマブ－３４１－Ｇ１グループを、分析における対照グループとして使用した。
図１８は、ネズミｃｏｌｏ２０５モデル試験の結果を示す。コナツムマブ（「グループ１」；０．６９μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「グループ４」；０．１７μＭ／動物）、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「グループ５」；０．１７μＭ／動物）は全て、投与中にｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖を抑制し、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体は、投与中に抑制の最高レベルを示す。腫瘍増殖を抑制する点では、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「グループ３」；０．３４μＭ／動物）がビヒクル対照（コナツムマブ－３４１－Ｇ１、「グループ２」；０．６９μＭ／動物）よりもわずかに優れていた。特に、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体は、投与が中止された後も長い間、腫瘍増殖を抑制し続けた。加えて、驚くべきことに、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体は、貧弱なＰＫプロファイル（図１５）を有しているが、この構築物は、腫瘍増殖を抑制する際のコナツムマブと同じくらい効果的である。特定の理論に縛られるものではないが、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体への最初の暴露が、死に至り、長期的な結合を必要とすることがない標的細胞で一連の事象を引き起こす可能性がある。加えて、比較的小さいサイズのＦａｂ構築物は、腫瘍環境へのアクセスを改善し、貧弱なＰＫを補い得る。最後に、Ｆａｂ構築物の物理的立体配置は、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的であり得る。
ネズミＳＷ４０３腺癌モデル系活性アッセイ
１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、２４４２－５００ｍＬ）、４ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００３４．０１）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０培養培地（Ｓｉｇｍａ Ｒ０８８３）中で、ＳＷ４０３ヒト結腸腺癌細胞を３７℃にて５％ＣＯ２で維持した。継代５で、細胞を回収し、無血清培地中で再懸濁させて、５０×１０６細胞／ｍＬの最終濃度を得た。細胞生存率は、トリパンブルー排除により９５％であると決定された。
７５匹のメスのＮＵ／ＮＵヌードマウスの右脇腹に５×１０６個の細胞（１００μＬ容量）を皮下注射し、イソフルオランで麻酔した。腫瘍移植後７日目に、腫瘍体積が２１ｍｍ３～１６０ｍｍ３の６０匹のマウスを、各グループが５８ｍｍ３～６６ｍｍ３の範囲の同様の平均腫瘍体積になるように、１０匹ずつの６つの治療グループに分けた。腫瘍が小さい又は大きい１５匹のマウスをこの研究から除外した。
６グループの動物に週２回（ｂ．ｉ．ｗ）、コナツムマブ野生型（１．３８μＭ／動物）、コナツムマブ－３４１－Ｇ１（１．３８μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（０．６９μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（０．３４μＭ／動物）、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（０．３４μＭ／動物）、及びＤＰＢＳ（ビヒクル対照）を腹腔内投与し、３週間で全部で６治療行った。治療は、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（残りの治療と比較して結合部位の半分のみであった）を除いて、各々がコナツムマブ野生型と等しい数の結合部位を有するように正規化された。全ての治療は腫瘍移植後１５日目に開始し、３２日目に終了した（治療は、１５、１９、２２、２６、２９、及び３２日目であった）。全ての治療は、注射直前の治療で希釈液（ＤＰＢＳ）中で新たに調製した。
腫瘍体積測定：腫瘍の長さと幅は、ＡＢＳ ｄｉｇｉｍａｔｉｃソーラーキャリパー、モデル＃Ｃｄ－Ｓ６”Ｃ（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ）で測定された。腫瘍体積は０．５×Ｌ×Ｗ２として計算され、Ｗは２つの測定値のうち小さい方でｍｍ３で表されました。
体重測定：動物を体重計（Ｍｅｔｔｌｅｒ ＴｏｌｅｄｏモデルＰＢ６０２－Ｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の皿に置いた。３秒間の平均体重は、体重計の動的重量関数を使用して決定された。体重は１００×（Ｗｃ／Ｗｉ）として計算される体重変化として報告され、ここで、Ｗｃは現在の体重、Ｗｉは治療開始時の体重である。この研究では、４日目の体重を全ての動物のＷｉとして使用した。
安楽死及び組織収集：腫瘍のサイズが１５００～２０００ｍｍ３に達したため、研究終了前に８匹の動物を安楽死させた。コナツムマブ－３４１－Ｇ１グループ由来の１匹のマウスを、３３日目に腫瘍体積が過剰になったため、安楽死させた。コナツムマブ－３４１－Ｇ１グループ由来の別のマウス、ＤＰＢＳビヒクル対照グループ由来の二匹、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体グループ由来の１匹を、３６日目に安楽死させた。コナツムマブ－３４１－Ｇ１、ＤＰＢＳビヒクル対照、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体グループにおける残りの動物は、全て、３９日目に安楽死させた。コナツムマブＷＴグループ由来の１匹のマウスを、３９日目に安楽死させた。コナツムマブＷＴグループ由来の別のマウス及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体グループ由来の一匹のマウスを、４６日目に安楽死させた。コナツムマブＷＴ、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体、及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体グループにおける残りの全ての動物を、研究の終了で４９日目に安楽死させた。イソフルオランの過剰摂取で全ての安楽死を行った後、心臓穿刺により採血した。
腫瘍測定：７日目から４９日目までのデータは、平均±標準誤差として表され、時間の関数としてプロットされた。Ｄｕｎｎｅｔｔが調整した複数の比較を使用して、変換された腫瘍体積データの分散の反復測定分析によって、増殖曲線間の観察された差の統計的有意性を評価した。変換されたベースライン腫瘍体積、日、治療、及び日ごとの治療相互作用のモデル効果を用いたＳＡＳ ＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤ手順を使用して分析を行った：日が繰り返された値、動物対象、及びテプリッツ共分散構造であるＲＥＰＥＡＴＥＤステートメント；並びに対照グループを他の治療グループと比較するＤｕｎｎｅｔｔ分析を行うためのＬＳＭＥＡＮＳステートメント。データは、Ｈｏｒｗｉｔｚの方法に従って変換された対数又は平方根であり、変換されたベースライン腫瘍体積は、治療前の腫瘍体積の違いの可能性を考慮して、モデルの共分散として含まれた。対数変換又は平方根変換が適切な残差分布を達成できなかった場合は、ノンパラメトリック反復測定分散分析を、腫瘍体積のランクに対する同じモデルの影響とともに使用した。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。全ての統計計算は、ＡＭＧ生物統計分析ツール（ｃｌｄ－ｐｗｅｂ－ｔａｉｖｄ．ａｍｇｅｎ．ｃｏｍ／ｂｉｏｓｔａｔｓ／Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を使用して行った。コナツムマブＷＴグループを、分析における対照グループとして使用した。
図１９は、ネズミＳＷ４０３モデル試験の結果を示す。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体（「グループ５」）及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体（「グループ６」）は、投与中にコナツムマブ（「グループ１」）よりもｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍増殖を抑制する。抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ二量体（「グループ４」）は、コナツムマブとほぼ同じレベルで投与中に増殖を抑制したが、増殖抑制においてビヒクル対照（「グループ３」）よりも有意に優れていない。特に、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体及び抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体の両方は、投与を停止した後でも腫瘍増殖を遅らせる。また、抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ Ｆａｂホモ四量体は、貧弱なＰＫプロファイル（図１５）を有するが、構築物は、投与を中止した後でさえも、腫瘍増殖を遅らせる点で抗ＴＲＡＩＬＲ２ ＴＴＲ抗体ホモ四量体と同じくらい効果的であることが観察されたことは驚くべきことであった。
図２０は、ネズミｃｏｌｏ２０５モデルマウス及びネズミＳＷ４０３モデルマウスの体重が、試験した全ての化合物で類似していることを示し、通常の上向きの軌道にあるように見える。この結果は、試験した化合物が、明らかな毒性はない（マウスは正常に食べて体重が増えるのに十分健康であったため）ことを示している。
Figure 2024012336000011
Figure 2024012336000012

Claims (34)

  1. ２つの抗原結合タンパク質を含むホモ二量体融合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、タンパク質複合体に連結される、ホモ二量体融合タンパク質。
  2. 前記タンパク質複合体が、ＴＴＲタンパク質複合体である、請求項１に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  3. 前記抗原結合タンパク質が、抗体である、請求項１又は２に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  4. 前記抗原結合タンパク質が、リンカーなしで、前記タンパク質複合体に直接融合される、請求項１～３のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  5. 前記抗原結合タンパク質のＣ末端が、前記ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に直接融合される、請求項４に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  6. 前記抗原結合タンパク質が、リンカーを介して、前記タンパク質複合体に融合される、請求項１～３のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  7. 前記抗原結合タンパク質のＣ末端が、前記ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に連結される、請求項６に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  8. 前記リンカーが、アミノ酸リンカーである、請求項７に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  9. 請求項８に記載のアミノ酸リンカーであって、１～４０のアミノ酸長である、アミノ酸リンカー。
  10. ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又は（ＧＧＧＧＳ）６である、請求項９に記載のアミノ酸リンカー。
  11. ４つの抗原結合タンパク質を含むホモ四量体融合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質が、タンパク質複合体に連結される、ホモ四量体融合タンパク質。
  12. 前記タンパク質複合体が、ＴＴＲタンパク質複合体である、請求項１１に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  13. 前記抗原結合タンパク質が、抗体である、請求項１１又は１２に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  14. 前記抗原結合タンパク質が、Ｆａｂである、請求項１１又は１２に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  15. 前記抗原結合タンパク質が、リンカーなしで、前記タンパク質複合体に直接融合される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  16. 前記抗原結合タンパク質のＣ末端が、前記ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に直接融合される、請求項１５に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  17. 前記抗原結合タンパク質が、リンカーを介して、前記タンパク質複合体に融合される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  18. 前記抗原結合タンパク質のＣ末端が、前記ＴＴＲタンパク質複合体中に存在するＮ末端に連結される、請求項１７に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  19. 前記リンカーが、アミノ酸リンカーである、請求項１８に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  20. 請求項１９に記載のアミノ酸リンカーであって、１～４０のアミノ酸長である、アミノ酸リンカー。
  21. 前記アミノ酸リンカーが、ＧＧＧＧＳ、（ＧＧＧＧＳ）２、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、又は（ＧＧＧＧＳ）６である、請求項２０に記載のアミノ酸リンカー。
  22. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  23. 請求項１１～２２のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質を含む、医薬組成物。
  24. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質を用いたがんの治療方法。
  25. 請求項１１～２２のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質を用いたがんの治療方法。
  26. がんの治療における、請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質の使用。
  27. がんの治療における、請求項１１～２２のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質の使用。
  28. がんの治療にて使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質。
  29. がんの治療にて使用するための、請求項１１～２２のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質。
  30. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質をコードする、１つ以上の単離核酸。
  31. 請求項３０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  32. 請求項３０に記載の核酸又は請求項３１に記載のベクターを含む、組換え宿主細胞。
  33. 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｅ５細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）細胞、ヒト肝細胞癌細胞、又はヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。
  34. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のホモ二量体融合タンパク質、又は請求項１１～２２のいずれか一項に記載のホモ四量体融合タンパク質の作製方法であって、前記方法が
    ａ）請求項３２又は３３に記載の組換え宿主細胞を培養することと、
    ｂ）前記培養物からホモ二量体融合タンパク質又はホモ四量体融合タンパク質を単離することと
    を含む方法。
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