CN111164101A

CN111164101A - 甲状腺素视黄质运载蛋白免疫球蛋白融合体

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Publication number: CN111164101A
Application number: CN201880063927.6A
Authority: CN
Inventors: K·沃克
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2017-10-04
Filing date: 2018-10-03
Publication date: 2020-05-15
Also published as: KR20200059281A; SG11202003114UA; EP3692061A1; CA3076630A1; MA50619A; WO2019070901A1; AU2018346151A1; US20200317795A1; JP2024012336A; JP2020537506A; MX2020003549A; EA202090581A1

Abstract

本发明涉及甲状腺素视黄质运载蛋白(TTR)融合体，其可用于抗体和抗体片段例如Fab的二聚化和四聚化。本文所述的TTR融合蛋白在增加抗体亲合力和增强抗原聚簇方面特别有用。本文描述了使用本发明的融合蛋白治疗疾病的方法。

Description

甲状腺素视黄质运载蛋白免疫球蛋白融合体

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)要求2017年10月4日提交的美国临时专利申请号62/568,217的权益，将其通过引用并入本文。

技术领域

参考序列表

本申请连同序列表一起以电子格式经由ePCT提交。序列表以标题为A-2196-WO-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt的文本文件提供，该文件创建于2018年10月2日，大小为69,791字节。电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。

背景技术

甲状腺素视黄质运载蛋白(TTR)是一种非共价四聚体人血清和脑脊髓液蛋白，负责延长视黄醇结合蛋白的血清半衰期，并携带一部分循环甲状腺素。天然人单体的分子量约为14kDa，尽管TTR通常以56kDa四聚体血清蛋白存在。

TTR和TTR变体以前已与生物活性剂融合，以增加此类活性剂的血清半衰期。例如，已经开发了TTR-(或TTR变体-)生物活性剂融合体和PEG-TTR-(或PEG-TTR变体-)生物活性剂融合体的基本上均一的制剂，所述融合体与单独的生物活性剂相比显示出增加的血清半衰期。参见，例如，US20030191056，其通过引用以其全文并入本文。

另外，先前使蛋白质多聚化的努力包括使用链霉亲和素(Kipriyanov等人,Protein Engineering[蛋白工程],9(2):203-211(1996))、螺旋-转角-螺旋构建体(Kriangkum等人,Biomolecular Engineering[生物分子工程],18:31–40(2001))、亮氨酸拉链(Kruif等人,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志],271(13):7630–7634,1996(1996))、芽胞杆菌RNA酶/芽胞杆菌RNA酶抑制剂复合体(Deyev等人,Nature Biotechnology[自然生物技术],21(12):1486-1492(2003))、和对接N锁(Dock NLock)技术(蛋白激酶和A激酶锚定蛋白锚定结构域相互作用)(Goldenberg等人,Journalof Nuclear Medicine[核医学杂志],49(1):158-163(2008))。

然而，仍然需要表现出增强的生物学和治疗特性的多聚蛋白，例如多聚全抗体和抗体片段(例如Fab)。例如，仍然需要与其非多聚对应物相比具有增加的抗体亲合力和增强的抗原聚簇的多聚蛋白。

发明内容

在一个方面，本发明涉及包含两个抗原结合蛋白的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与蛋白复合体连接。在特定的方面，蛋白复合体是TTR蛋白复合体。在特定的方面，抗原结合蛋白是抗体。在另一个特定方面，抗原结合蛋白在没有接头的情况下直接融合至蛋白复合体。在另一个特定方面，抗原结合蛋白的C末端直接融合至TTR蛋白复合体中存在的N末端。在一些实施例中，抗原结合蛋白经由接头融合至蛋白复合体。在另一个特定方面，抗原结合蛋白的C末端连接至TTR蛋白复合体中存在的N末端。接头可以是氨基酸接头，例如长度为1-20个氨基酸的氨基酸接头。在特定实施例中，氨基酸接头是GGGGS、(GGGGS)₂、(GGGGS)₃、(GGGGS)₄、(GGGGS)₅或(GGGGS)₆。

在另一方面，本发明涉及包含四个抗原结合蛋白的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与蛋白复合体连接。在一个方面，蛋白复合体是TTR蛋白复合体。在另一方面，抗原结合蛋白是抗体。抗原结合蛋白可以是Fab。在一些实施例中，抗原结合蛋白在没有接头的情况下直接融合至所述蛋白复合体。在特定的实施例中，抗原结合蛋白的C末端直接融合至TTR蛋白复合体中存在的N末端。在其他实施例中，抗原结合蛋白经由接头融合至所述蛋白复合体。抗原结合蛋白的C末端可以连接至TTR蛋白复合体中存在的N末端。在一些实施例中，接头是氨基酸接头，例如长度为1-20个氨基酸的氨基酸接头。在特定实施例中，氨基酸接头是GGGGS、(GGGGS)₂、(GGGGS)₃、(GGGGS)₄、(GGGGS)₅或(GGGGS)₆。

本发明还涉及药物组合物，其包含以上讨论的任何同二聚体或同四聚体融合蛋白。

另外，本发明涉及使用上述任何同二聚体或同四聚体融合蛋白治疗癌症的方法。而且，本发明涉及以上讨论的任何同二聚体或同四聚体融合蛋白在癌症治疗中的用途。在另一方面，本发明涉及以上讨论的用于治疗癌症的任何同二聚体或同四聚体融合蛋白。

在一些方面，本发明涉及编码以上讨论的任何同二聚体或同四聚体融合蛋白的一个或多个分离的核酸。还考虑了包含此类核酸的表达载体，以及包含本文讨论的核酸和/或载体的重组宿主细胞。在特定的实施例中，重组宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、人肝细胞癌细胞或人胚肾293(HEK 293)细胞。

制备以上讨论的任何同二聚体或同四聚体融合蛋白的方法也是本发明的一部分。这样的方法可以包括：a)培养如权利要求32或33所述的重组宿主细胞；和b)从所述培养物中分离所述同二聚体或同四聚体融合蛋白。

附图说明

图1.图1是本发明的同多聚体构建体的示意图。图1a是示例性TTR抗体同二聚体融合蛋白，其中两条抗体重链的C末端均与每个TTR亚基的N末端相连。图1b是示例性TTR抗体同四聚体融合蛋白，其中每个抗体C末端的两条重链之一与每个TTR亚基的N末端相连。“+”和“-”符号表示Fc电荷对，其允许每个完整抗体始终连接一个TTR亚基。图1c是示例性的TTRFab同四聚体融合蛋白，其中每个Fab片段的C末端与每个TTR亚基的N末端连接。图1a-1c中的每一个都显示了重链和TTR之间的任选的接头。

图2.图2是一系列SDS-PAGE凝胶，其分别显示在HEK 293细胞中大量表达的以下：不带接头或带有不同长度接头的抗CB1 TTR抗体同二聚体(图2a)、不带接头的抗CB1 TTR抗体同四聚体(图2b)、和不带接头的抗CB1 TTR Fab同四聚体(图2c)。图2在实例2中进一步讨论。

图3.图3是不带接头、带(G₄S)接头、带(G₄S)₂接头、带(G₄S)₃接头、或(G₄S)₄接头的抗CB1 TTR抗体同二聚体融合蛋白的一系列HPLC尺寸排阻色谱(SEC)分析。图3在实例2中进一步讨论。

图4.图4显示，与亲本CB1 Ab相比，TTR抗CB1抗体同四聚体和TTR抗CB1Fab同四聚体融合蛋白改善了EC₅₀。图4在实例3中进一步讨论。

图5.图5是SDS-PAGE凝胶，其分别显示在HEK 293细胞中表达以下：抗GITR TTR抗体同二聚体(泳道1)、抗GITR TTR抗体同四聚体(泳道2)、和抗GITR TTR Fab同四聚体蛋白(泳道3)。泳道4-7是抗二硝基苯基(抗DNP)抗体。图5在实例4中进一步讨论。

图6.图6是SDS-PAGE凝胶，其显示抗GITR TTR抗体同二聚体(泳道1和4)、抗GITRTTR抗体同四聚体(泳道2和5)、和抗GITR TTR Fab同四聚体蛋白(泳道3和6)基于未加热的非还原性泳道正确组装。在加热和还原后，这三种蛋白融合构建体分解为它们的预期的组成链(一个或多个上部条带是重链，最低条带是轻链)。图6在实例4中进一步讨论。

图7.图7是抗GITR TTR抗体同二聚体(中间峰)、TTR抗体同四聚体(左峰)、和TTRFab同四聚体(右峰)融合蛋白中的每一种的HPLC SEC分析。图7在实例4中进一步讨论。

图8.图8是抗GITR TTR亲本mAb(“1”)、抗GITR TTR抗体同四聚体(“2”)、抗GITRTTR Fab同四聚体(“3”)、和抗GITR TTR抗体同二聚体(“4”)融合蛋白的差示扫描量热法(DSC)分析。图8显示TTR融合蛋白的解链温度与亲本Ab相当或更好，表明所形成的TTR融合蛋白是稳健的。

图9.图9a)是总抗GITR抗体种类的体内(小鼠)药代动力学(PK)分析的结果。图9b)是完整的抗GITR TTR融合蛋白的体内(小鼠)PK分析的结果。

图10.图10a)显示抗GITR TTR Fab同四聚体(“2”)、抗GITR TTR抗体同二聚体(“3”)、和抗GITR TTR抗体同四聚体(“4”)融合蛋白的结合亲和力比亲本抗GITR mAb(“1”)更好。图10b)证明在基于细胞的测定中更高的亲和力并不转化为更高的效力。

图11.图11是一系列SDS-PAGE凝胶，其分别显示抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(1)和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(2)蛋白在哺乳动物细胞中表达良好并正确组装。

图12.图12是一系列SDS-PAGE凝胶，其证明抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体在CHO-K1细胞中表达良好并正确组装。

图13.图13是一系列SDS-PAGE凝胶，其显示抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、和抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体基于未加热非还原性泳道正确组装。在加热和还原后，分子分解为它们的预期的组成链(一个或多个上部条带是重链，最低条带是轻链)。

图14.图14是抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(中间色谱图)、TTR抗体同四聚体(右色谱图)、和TTR Fab同四聚体(左色谱图)融合蛋白中的每一种的HPLC SEC分析。

图15.图15a)是总抗TRAILR2抗体种类的体内(小鼠)PK分析的结果。图15b)是完整的抗TRAILR2 TTR融合蛋白的体内(小鼠)PK分析的结果。

图16.图16示出在WM35细胞杀伤测定中，与亲本mAb(考那妥木单抗(conatumumab))相比，抗TRAILR2 TTR融合蛋白的效力。

图17.图17示出在原代人角质形成细胞杀伤测定中，与亲本mAb(考那妥木单抗；(“1”)相比，抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“2”)和TTR抗体同四聚体(“3”)的效力。

图18.图18显示了在鼠colo205模型中与亲本mAb(考那妥木单抗)相比，抗TRAILR2TTR融合蛋白抑制肿瘤生长的能力。

图19.图19显示了在鼠SW403模型中与亲本mAb(考那妥木单抗)相比，抗TRAILR2TTR融合蛋白抑制肿瘤生长的能力。

图20.图20显示了鼠colo205模型小鼠和鼠SW403模型小鼠的体重对于所有测试化合物都是相似的。

具体实施方式

本文中所使用的部分标题仅出于组织目的，而不应被视为限制所描述的主题内容。

除非本文中另外定义，否则结合本申请所使用的科学及技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。

一般而言，结合本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质及核酸化学及杂交而使用的命名法及其技术是本领域中众所周知且通常使用的那些命名法及技术。除非另外指示，否则本申请的方法及技术可根据本领域中众所周知的常规方法且如贯穿本说明书所引用及论述的各种通用及更特定参考文献中所描述来进行。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)[分子克隆:实验室手册,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约洲(2001)]；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)[分子生物学现代方法,格林出版联合公司(1992)]；以及Harlow和Lane Antibodies:ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)[抗体:实验室手册,冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(1990)]，将这些文献通过引用并入本文中。酶促反应及纯化技术是根据制造商的说明书、如本领域中通常所实现或如本文中所描述来进行。结合本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医学及药物化学而使用的术语及其实验程序及技术是本领域中众所周知且通常使用的那些术语以及实验程序及技术。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制品及递送、以及治疗患者。

应理解，本发明不限于本文中所描述的特定方法、方案及试剂等且因而可能变化。本文中所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不意欲限制本披露的范畴，本披露的范畴将仅由权利要求书来限定。

除了操作实例中或另外指示的情况，表述本文中所使用的成分的量或反应条件的所有数字均应理解为在所有情况下均由术语“约”加以修饰。术语“约”当结合百分比使用时可意指±1％。

以任何方式都比由本文特定段落所定义的变型范围更窄的所有实施例应被认为包括在本披露中。例如，某些方面被描述为一类，并且应当理解，属于一类的每个成员可以分别是实施例。同样，被描述为一类的方面或选择属于一类的成员应被理解为包括该类中两个或更多个成员的组合。还应理解，虽然说明书中的多个实施例是使用“包含”语言呈现的，但在多种情况下，也可以使用“由……组成”或“基本上由……组成”语言来描述相关的实施例。

在本申请中，“或”的使用意指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括(including)”、以及其他形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。同样，术语如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分两者，除非另外明确说明。

定义

“氨基酸”包括其在本领域中的标准含义。二十种天然氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，Immunology-A Synthesis[免疫学-A合成],第2版,(E.S.Golub和D.R.Green,编辑),斯那路联合出版社(Sinauer Associates):桑德兰(Sunderland),马萨诸塞州.(1991)，其出于任何目的通过引用并入本文。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸(例如[α]-,[α]-二取代氨基酸)、N-烷基氨基酸、和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)也可以是多肽的合适组分，并被包括在术语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸、和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。本文使用的多肽表示法中，按照标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。

本文所用的“拮抗剂”通常是指可以结合抗原并抑制、减少或消除与抗原相关的生物信号传导的分子，例如本文所提供的抗原结合蛋白。

术语“抗体”是指任何同种型的免疫球蛋白，或其可以与完整抗体竞争地结合靶抗原的片段。“抗体”是抗原结合蛋白的一个类型。术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和抗独特型(抗Id)抗体。抗体可以是任何同种型/类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一些实施例中，抗体包含至少两条全长重链和两条全长轻链。在其他实施例中，抗体包括较少的链，例如天然存在于骆驼科动物中的抗体，其可以仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可以是“嵌合”抗体，其中抗体的不同部分来源于两种不同的抗体，如以下进一步描述。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解而例如在杂交瘤中产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。

术语“抗原”是指能够由例如抗原结合蛋白(包括例如抗体)的结合剂结合且另外能够用于动物中以产生能够结合该抗原的抗体的分子或分子部分。抗原可具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的表位。

如本文所用的“抗原结合蛋白”意指任何特异性结合特定靶抗原的蛋白质。所述术语包括包含至少一个抗原结合区的多肽。所述术语还涵盖包含至少两个全长重链及两个全长轻链的完整抗体，以及其衍生物、变体、片段及突变。抗原结合蛋白还包括Fab、Fab'、F(ab’)₂、Fv片段、结构域抗体(例如

)和单链抗体，如下文更详细描述。

“抗原结合区”或“抗原结合结构域”意指蛋白质(例如抗体或其片段、衍生物或变体)的部分，所述部分特异性结合于分子(例如，抗原)上给定的表位或位点、与其相互作用、或识别其。例如，抗原结合蛋白中含有与抗原相互作用且赋予抗原结合蛋白以其对该抗原的特异性及亲和力的氨基酸残基的部分称为“抗原结合区”。抗原结合区可包括一个或多个“互补决定区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“构架”区。“框架”区可以直接有助于抗原结合蛋白的特异性结合，但是通常有助于保持CDR的适当构象，以促进抗原结合区与抗原之间的结合。

术语“癌症”、“肿瘤”、“癌性的”和“恶性的”是指或描述哺乳动物中典型地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于上皮癌，包括腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更具体的实例包括黑素瘤、肺癌、头颈癌、肾细胞癌、结肠癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠道癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(例如肝上皮癌和肝细胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌(例如肾细胞上皮癌和肾母细胞瘤)、基底细胞癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌和食道癌。

术语“CDR”及其复数“多个CDR”(也称为“高变区”)是指蛋白质例如抗体或其片段、衍生物或变体的互补决定区。轻链可变区和重链可变区各自包含三个CDR。例如，轻链可变区包含以下CDR：CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；并且重链可变区包含以下CDR：CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。CDR含有大部分负责抗体与抗原特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性。CDR是抗原特异性的主要决定簇。

准确定义的CDR边界和长度受制于不同的分类和编号系统。因此，CDR可以通过Kabat、Chothia、contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。Kabat编号方案(系统)是以一致方式对抗体可变结构域的氨基酸残基进行编号的广泛使用的标准，并且是本发明应用的优选方案，也如本文其他地方所提及。另外的结构考虑因素也可以用于确定抗体的规范结构。例如，Kabat编号未完全反映的那些差异可以通过Chothia等人的编号系统来描述，并且/或者通过其他技术(例如结晶学和二维或三维计算建模)来揭示。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一者在构成可变序列内的“CDR”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以相对于相邻框架区在长度和边界区域方面不同。参见，例如Kabat(一种基于跨物种序列变异性的方法)、Chothia(一种基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法)和/或MacCallum(Kabat等人,上述引文；Chothia等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1987,196:901-917；和MacCallum等人,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,262:732)。表征抗原结合位点的还另一标准是由牛津大学分子公司(Oxfbrd Molecular)的AbM抗体建模软件使用的AbM定义。参见例如，Protein Sequenceand Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析]在：Antibody Engineering Lab Manual[抗体工程实验室手册](编辑：Duebel,S.和Kontermann,R.，施普林格出版社(Springer-Verlag)，海德尔堡)。关于抗体结构的综述，参见Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],Cold SpringHarbor Laboratory[冷泉港实验室],Harlow等人编辑,1988。

典型地，CDR形成可以分类为规范结构的环结构。术语“规范结构”是指由抗原结合(CDR)环所使用的主链构象。从比较结构研究中，已经发现六个抗原结合环中的五个仅具有有限的可用构象组库。每个规范结构可以通过多肽骨架的扭转角来表征。因此，抗体之间的对应环可能具有非常相似的三维结构，但环的大多数部分具有高的氨基酸序列可变性(Chothia和Lesk,J.MoI.Biol.[分子生物学杂志],1987,196:901；Chothia等人,Nature[自然],1989,342:877；Martin和Thornton,J.MoI.Biol[分子生物学杂志],1996,263:800)。此外，所使用的环结构与其周围的氨基酸序列之间存在关系。特定规范类别的构象由环的长度和位于环内关键位置以及保守框架内(即，环外)的氨基酸残基决定。因此，可以基于这些关键氨基酸残基的存在来进行对特定规范类别的分配。

当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)的上下文中使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，并且通过测定进行确定，其中待测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。可以使用许多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心法竞争测定(参见，例如，Stahli等人,1983,Methods inEnzymology[酶学方法]9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Kirkland等人,1986,J.Immunol.[免疫学杂志]137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心法测定(参见，例如，Harlow和Lane,1988,Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press[抗体，实验室手册，冷泉港出版社])；使用I-125标记固相直接标记RIA(参见，例如，Morel等人,1988,Molec.Immunol.[分子免疫学]25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见，例如，Cheung,等人,1990,Virology[病毒学]176:546-552)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.[斯堪的纳维亚免疫学杂志]32:77-82)。典型地，这种测定涉及使用结合到固体表面的纯化的抗原或表达抗原的细胞、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。通过测定在测试抗原结合蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和与参考抗原结合蛋白结合的表位足够近的邻近表位结合(以发生空间位阻)的抗原结合蛋白。关于测定竞争性结合的方法的其他详情提供于本文中。例如，在一个实施例中，根据BiaCore测定确定竞争。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，其将使参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或75％。在一些情况下，抑制结合至少80％、85％、90％、95％或97％以上。

术语“控制序列”是指可影响与其链接的编码序列的表达及处理的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在特定实施例中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点及转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包括包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列及转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合配偶体序列。

多肽的“衍生物”是已用不同于插入、缺失或取代变体的某种方式，例如经由与另一化学部分结合来进行化学修饰的多肽。

“结构域抗体”是仅含有重链的可变区或轻链的可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。结构域抗体的实例包括

在一些情况下，用肽接头共价连接两个或更多个V_H区以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个V_H区可靶向相同或不同的抗原。

“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或潜在病因，预防症状和/或其潜在病因的发生，和/或改善或治愈由癌症引起或与之相关的损伤的量。在一些实施例中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足以治疗疾病状态(例如癌症)或症状、尤其与该疾病状态相关的状态或症状，或者以其他方式预防、阻碍、延迟或逆转该疾病状态或以任何方式与该疾病相关的任何其他不理想症状的进展的量。“预防有效量”是当向受试者施用时将具有预定预防效应，例如预防或延迟癌症的发作(或复发)，或者降低癌症或癌症症状的发作(或复发)可能性的药物组合物的量。施用一次剂量未必会出现完全治疗或预防作用，且可能仅在施用一系列剂量之后才发生。因此，治疗或预防有效量可以一次或多次施用进行施用。

术语“表位”是指能够被抗原结合蛋白(例如抗体)识别并特异性结合的抗原部分。在多肽的情况下，表位可以从连续的氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少3个，更通常至少5或8-10个氨基酸。“线性表位”或“顺序表位”是抗原结合蛋白(例如抗体)通过其氨基酸的线性序列或一级结构识别的表位。“构象表位”或“非顺序表位”是抗原结合蛋白(例如抗体)通过其三级结构识别的表位。构成这些表位的残基在一级氨基酸序列中可能不连续，但在分子的三级结构中彼此靠近。当蛋白质变性、断裂或还原时，线性和构象表位通常表现不同。

术语“表达载体”或“表达构建体”是指适用于对宿主细胞进行转化且含有指导和/或控制(连同宿主细胞一起)与其可操作地连接的一个或多个异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译且在存在内含子时影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。

“Fab片段”或“Fab”由一条轻链以及一条重链的C_H1和可变区构成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。

“Fab'片段”或“Fab”含有一条轻链及一条重链的含有V_H结构域及C_H1结构域以及介于C_H1与C_H2结构域之间的区域的部分，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab’)₂分子。

“F(ab’)₂片段”或“F(ab’)₂”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有C_H1与C_H2结构域之间的一部分恒定区，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)₂片段因而由介于两个重链之间的二硫键维持在一起的两个Fab'片段构成。

“Fc”区含有两个包含抗体的C_H2及C_H3结构域的重链片段。这两个重链片段由两个或更多个二硫键及C_H3结构域的疏水性相互作用维持在一起。

“Fv区”包含来自于重链及轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。

术语“重链”在关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用时包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包括可变区结构域(V_H)和三个恒定区结构域(C_H1、C_H2、和C_H3)。V_H结构域位于多肽的氨基末端，并且C_H结构域位于羧基末端，其中C_H3最接近多肽的羧基末端。重链可属于任何同种型，例如IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4亚型)、IgA(包括IgA1及IgA2亚型)、IgM及IgE。

“血液学癌症”是始于形成血液的组织(如骨髓)或免疫系统细胞中的癌症。血液癌症的实例是白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

术语“同二聚体融合蛋白”是指包含两个相同抗原结合蛋白的融合蛋白。例如，抗体同二聚体融合蛋白是指包含两个相同抗体的融合蛋白。在特定的实例中，同二聚体可以是TTR同二聚体融合蛋白，其包含经由如本文所述的TTR蛋白连接的两个相同抗体。

术语“同四聚体融合蛋白”是指包含四个相同抗原结合蛋白的融合蛋白。例如，抗体同四聚体融合蛋白是指包含四个相同抗体的融合蛋白。在另一个实例中，Fab同四聚体融合蛋白是指包含四个相同Fab片段的融合蛋白。在特定的实例中，同四聚体可以是TTR同四聚体融合蛋白，它包含经由如本文所述的TTR蛋白连接的两个相同的抗原结合蛋白(例如，两个相同的抗体、或两个相同的Fab片段)。

术语“宿主细胞”意指已用核酸序列进行转化且从而表达感兴趣的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，无论该子代是否在形态或遗传组成上与原始亲本细胞一致，只要存在该感兴趣的基因即可。

术语“同一性”意指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的通过比对和比较序列来确定的关系。“同一性百分比”意指所比较的分子中的氨基酸或核苷酸之间一致的残基的百分比，并且基于所比较的分子中的最小者的大小来计算。对于这些计算，须利用特定数学模型或计算器程序(即，“算法”)解决比对中的空位(若存在的话)。可以用于计算所比对的核酸或多肽的一致性的方法包括以下中所描述的方法：Computational Molecular Biology[计算分子生物学],(Lesk,A.M.编辑),1988,NewYork:Oxford University Press[纽约：牛津大学出版社]；Biocomputing Informaticsand Genome Projects[生物计算信息学和基因组计划],(Smith,D.W.编辑),1993,NewYork:Academic Press[纽约：学术出版社]；Computer Analysis of Sequence Data[序列数据的计算机分析],Part I[第I部分],(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑),1994,NewJersey:Humana Press；von Heinje[新泽西：胡玛纳出版社],von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology[分子生物学中的序列分析],New York:Academic Press[纽约：学术出版社]；Sequence Analysis Primer[序列分析入门],(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑),1991,New York:M.Stockton Press[纽约：M.Stockton出版社]；以及Carillo等人,1988,SIAM J.Applied Math.[工业与应用数学学会]48:1073。

在计算一致性百分比时，以实现各序列间最大匹配的方式比对所比较的序列。用于测定同一性百分比的计算机程序是GCG软件包，其包括GAP(Devereux等人,1984Nucl.Acid Res.[核酸研究]12:387；遗传学计算机公司(Genetics Computer Group),威斯康星大学,麦迪逊市,威斯康星州)。使用计算机算法GAP来比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。这些序列经比对用于最佳匹配其各自氨基酸或核苷酸(如由算法所确定的“匹配范围”)。空位开放罚分(以3x对角线平均值计算，其中「对角线平均值」是所用比较矩阵的对角线的平均值；「对角线」是由特定比较矩阵赋予每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(通常为空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵，例如PAM 250或BLOSUM 62，是与该算法结合使用。在某些实施例中，该算法还使用标准比较矩阵(有关PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure[蛋白质序列和结构图集]5:345-352；有关BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院报]89:10915-10919)。

用于使用GAP程序来测定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数如下：

算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453；

比较矩阵：BLOSUM 62，来自于Henikoff等人,1992,同上；

空位罚分：12(但末端空位不罚分)

空位长度罚分：4

相似性阈值：0

用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以使这两个序列中仅较短区域匹配，且此较小比对区可以具有极高序列同一性，即使该两个全长序列之间并无明显关系。因此，必要时，可以调整所选比对方法(GAP程序)以在靶多肽的至少50个连续氨基酸范围内进行比对。

短语“免疫调节剂”是指诱导、增强或抑制免疫应答的分子。免疫激活剂是诱导或放大免疫应答的分子。免疫抑制剂是降低或抑制免疫应答的分子。因此，激活免疫疗法是涉及施用一种或多种分子以诱导或增强受试者免疫系统的疗法。抑制免疫疗法是用一种或多种分子治疗受试者以降低或抑制受试者免疫系统的疗法。

如本文中所使用的术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“片段”是一种抗原结合蛋白，其包含抗体中缺乏全长链中所存在的至少一些氨基酸但能够特异性结合抗原的部分(不考虑如何获得或合成该部分)。此类片段具有生物学活性，因为其特异性结合靶抗原并且可与其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争结合给定表位。在一个方面，此类片段将保留存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施例中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物学活性片段可通过重组DNA技术来产生，或可通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解来产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)₂、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以衍生自任何哺乳动物来源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔。进一步设想本文中所披露的抗原结合蛋白的功能部分，例如一个或多个CDR，可与第二蛋白质或小分子共价结合，以产生针对体内特定标靶或具有延长血清半衰期的治疗剂。

“分离的核酸分子”意指具有基因组、mRNA、cDNA或合成来源或其某一组合的DNA或RNA，其不与全部或部分多核苷酸缔合(其中该分离的多核苷酸发现于自然界中)或与在自然界中不与其连接的多核苷酸连接。出于本披露的目的，应理解，“包含”特定核苷酸序列的“核酸分子”不涵盖完整染色体。“包含”规定核酸序列的分离的核酸分子除这些规定序列以外还可以包括针对多达十种或甚至多达二十种其他蛋白质或其部分的编码序列，或可以包括控制所叙述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调节序列，和/或可以包括载体序列。

如本文所用，术语“分离的多肽”、“纯化的多肽”、“分离的蛋白质”或“纯化的蛋白质”旨在指从其他组分分离的组合物，其中多肽相对于其天然可获取状态被纯化至任何程度。因此，纯化的多肽还指没有在其天然存在的环境中的多肽。通常，“纯化的”将指已经过分部分离以去除各种其他组分并且基本上保留了其表达的生物学活性的多肽组合物。当使用术语“基本上纯化的”时，该名称将指这样的肽或多肽组合物，其中所述多肽或肽形成所述组合物的主要组分，例如构成所述组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、或更多。

术语“轻链”在关于抗原结合蛋白、抗体或其片段使用时包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包括可变区结构域(V_L)和恒定区结构域(C_L)。轻链的可变区结构域处于多肽的氨基末端。轻链包括κ链及λ链。

如贯穿本说明书结合例如多肽、核酸、宿主细胞及其类似物的生物学物质所使用的术语“天然存在”是指在自然界中发现的物质。

术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸的长度是10至60个碱基。在其他实施例中，寡核苷酸的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链，例如，以用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包括标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记，以用于检测测定。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。

如本文中所使用，“可操作地连接”意指该术语所适用的组分呈允许其在适合条件下执行其固有功能的关系。例如，载体中“可操作地连接”至蛋白质编码序列的控制序列是与该编码序列连接以使得在与控制序列的转录活性相适应的条件下实现该蛋白质编码序列的表达。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链及双链核苷酸聚合物两者。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者任一类型核苷酸的经修饰形式。修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修饰，例如2’,3’-二脱氧核糖；及核苷酸间键修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯氨基硫代磷酸酯、苯氨基磷酸酯及氨基磷酸酯。

除非另外说明，否则本文所论述的任何单链多核苷酸序列的左手端是5’端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5’。新生RNA转录物的5’至3’添加方向称为转录方向；在序列与RNA转录物相同的DNA链上作为RNA转录物5’端的5’端的序列区称为“上游序列”；在序列与RNA转录物相同的DNA链上作为RNA转录物3’端的3’端的序列区称为“下游序列”。

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。这些术语还可涵盖已例如通过添加碳水化合物残基(以形成糖蛋白)或通过磷酸化而经修饰的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可以由天然存在的和非重组的细胞或由基因工程化的或重组的细胞产生，并且可以包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽片段”是指与全长蛋白质相比具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。与全长蛋白质相比，此类片段还可含有经修饰的氨基酸。在某些实施例中，片段的长度约为5到500个氨基酸。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。

“重组蛋白”，包括重组TTR蛋白，是使用重组技术，即，通过表达如本文中所描述的重组核酸而制造的蛋白质。用于产生重组蛋白质的方法及技术在本领域中是众所周知的。

“单链抗体”是指Fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接形成单个多肽链，其形成抗原结合区。在国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体。

“实体瘤”是指通常不包含囊肿或液体区域的异常生长或组织块。实体瘤可以是良性的(非癌性)或恶性的(癌性)。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名。实体瘤的实例是肉瘤、上皮癌和淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不形成实体瘤。

当抗原结合蛋白表现出与抗原以外的分子很少结合至没有结合时，所述抗原结合蛋白“特异性结合”所述抗原。然而，特异性结合抗原的抗原结合蛋白可能与来自不同的物种的抗原交叉反应。典型地，如经由表面等离子共振技术(例如BIACore，GE医疗集团(GE-Healthcare)，乌普萨拉(Uppsala)，瑞典)测量的解离常数(K_D)≤10^-7M时，抗原结合蛋白特异性结合抗原。当抗原结合蛋白以K_D≤5x10^-8 M结合抗原时，所述抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合所述抗原，并且当抗原结合蛋白以K_D是≤5x 10^-9M结合抗原时，所述抗原结合蛋白以“非常高亲和力”特异性结合所述抗原(如使用例如BIACore的方法测量)。

如本文中所使用的“受试者”或“患者”可以是任何哺乳动物。在一典型实施例中，该受试者或患者是人类。

如本文中所使用，“基本上纯的”意指所描述种类的分子是所存在的主要种类，即，在摩尔基础上，其比同一混合物中的任何其他个别种类更丰富。在某些实施例中，基本上纯的分子是组合物，其中目标种类包括所存在的所有大分子种类的至少50％(在摩尔基础上)。在其他实施例中，基本上纯的组合物将构成存在于组合物中的所有大分子种类的至少80％、85％、90％、95％、或99％。在其他实施例中，将目标种类纯化至基本均质，其中通过常规检测方法在该组合物中无法检测到污染种类且因而该组合物由单一可检测大分子种类组成。

术语“治疗”是指损伤、病变或病症的成功治疗或改善的任何征候，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓解；削弱症状或使损伤、病变或病症对患者更可耐受；减缓退化或衰弱速率；使退化终点不那么令人虚弱；改良患者的身体或精神健康。症状的治疗或缓解的依据可以是客观或主观参数；包括身体检查、神经精神病学检查和/或精神病学评估的结果。例如，本文提出的某些方法通过例如减少癌症的进展或扩散、抑制肿瘤生长、引起肿瘤的缓解和/或减轻与癌症或肿瘤有关的症状来成功治疗癌症和肿瘤。同样，本文提供的其他方法通过减少感染的进展或传播、降低感染的程度和/或减轻与感染有关的症状来治疗传染病。

如本文所用，术语“TTR”是指“甲状腺素视黄质运载蛋白”。人TTR描述在Mita等人,Biochem.Biophys.Res.Commun[生物化学与生物物理学研究通讯].,124(2):558-564(1984)(其通过引用并入本文)中。人TTR的氨基酸序列也描述在UniProt知识库(www.uniprot.org/uniprot/P02766#sequences)中，并在本文中以SEQ ID NO:43引述。人TTR的核酸序列也在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7276)中描述。另参见GenBank保藏号K02091.1。鼠TTR的氨基酸和核酸序列分别在SEQ ID NO:3和4中列出。

术语“TTR变体”是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有SEQ IDNO:1的TTR至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。本发明还包括编码此类TTR变体的核酸。特定的变体包括例如在C末端或N末端截短的TTR蛋白。

“肿瘤”是指随着癌细胞的生长和繁殖而形成的组织块，其可以侵入并破坏正常的相邻组织。癌细胞可以脱离恶性肿瘤而进入血液或淋巴系统，从而使癌细胞从原发性肿瘤扩散而在其他器官中形成新的肿瘤。

多肽的“变体”包含如下氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基插入至所述氨基酸序列中、从所述氨基酸序列缺失和/或被取代至所述氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。

如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，在所述环中可以连接另外的DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。可以将其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

同二聚体融合蛋白

如本文所述，本发明部分涉及TTR在抗原结合蛋白例如抗体的多聚化中的用途。因为TTR是人血清中发现的人细胞外蛋白，所以它在人体中的含量相对较高。因此，当与例如非人、细胞内和稀有蛋白质相比时，当存在于本发明的多聚构建体中时，TTR不太可能引发免疫应答。因此，其在本发明的多聚技术中的使用是有利的。

例如，TTR可以用于抗体的二聚化。在这样的同二聚体融合蛋白中，TTR(SEQ IDNO:1)或其变体以四聚体形式存在，其中TTR亚基与抗体重链的C末端连接以形成TTR抗体同二聚体。例如，每个抗体重链的C末端(每个抗体包含两个这样的C末端)可以连接到每个TTR亚基的N末端(见图1a)。因此，每个抗体与TTR四聚体中的两个TTR亚基连接，产生TTR抗体同二聚体。

因此，本发明涉及包含两个抗原结合蛋白的同二聚体融合蛋白。在一些实施例中，同二聚体融合蛋白包含与蛋白复合体连接的抗原结合蛋白。在一些实施例中，蛋白复合体是TTR蛋白复合体，其中TTR蛋白复合体是TTR四聚体。在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体。

在特定的实施例中，本发明涉及同二聚体融合蛋白，其包含两个与TTR四聚体连接的抗体。抗体可以在没有接头的情况下与TTR四聚体相连(即，抗体直接与TTR相连)。

在其他实施例中，抗体经由接头连接至TTR四聚体。例如，氨基酸接头可用于将抗体重链的C末端连接至TTR亚基N末端。在一些实施例中，接头的长度是1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35或1-40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度是0、1、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度多达5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度多达5、10、15或20个氨基酸。在特定的实施例中，接头的长度是0、5、10、15或20个氨基酸。

在一些实施例中，接头是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)₂)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)3)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)₄)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)₅)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)₆)。在其他实施例中，是GGGGS、GGGGSGGGGS(即(GGGGS)₂)、GGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)₃)、或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(即(GGGGS)₄)。

其他合适的氨基酸接头包括，例如二硫键、(Gly)_n(n＝1-10)、(EAAAK)_n(n＝1-5)、A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A、PAPAP、AEAAAKEAAAKA、(Ala-Pro)_n(n＝1-20)、VSQTSKLTRAETVFPDV、PLGLWA、RVLAEA、EDVVCCSMSY、GGIEGRGS、TRHRQPRGWE、AGNRVRRSVG、RRRRRRRRR、GFLG和LE。合适的非氨基酸接头包括聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，将抗体在有或没有接头的情况下连接至截短的TTR亚基。例如，可以从一个或多个TTR亚基的N末端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，并且抗体可以附接至截短的TTR亚基N末端。

本发明还涉及编码本文所述的同二聚体融合蛋白的核酸分子。关于产生同二聚体融合蛋白的示例性方法的细节可以在实例中找到。

抗体和Fab的四聚化

如本文所述，本发明部分涉及TTR在抗原结合蛋白例如抗体的多聚化中的用途。如上所述，在本发明的多聚化技术中使用TTR是有利的，因为当与例如非人的细胞内的和稀有的蛋白质相比时，当存在于本发明的多聚化构建体中时，TTR不太可能引起免疫应答。

本发明还部分涉及TTR在抗原结合蛋白例如抗体的四聚化中的用途。在此类同四聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO:1)或其变体再次以四聚体形式存在。但是，在TTR抗体同四聚体的情况下，将单个抗体重链(即，在单个抗体中仅存在两条重链中的一条)连接到每个TTR亚基，从而允许将四个抗体连接到TTR四聚体(参见图1b)。抗体C末端的两条重链之一可与每个TTR亚基的N末端连接(见图1b)。因此，每个抗体与TTR四聚体中的一个TTR亚基连接，产生TTR抗体同四聚体。

在这种同四聚体融合蛋白中，通过Fc中的突变不利于Fc同二聚体(如上所述)的形成。此类修饰包括Fc突变，诸如杵-臼、DuoBodies、Azymetric、电荷对、HA-TF、SEEDbody和具有差别蛋白A亲和力的修饰。参见例如Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学],67(2,部分A),2015,第95-106页。杵-臼突变包括第一重链中的T366W，和第二重链中的T366S、L368A和/或Y407V。参见，例如，Ridgway等人,Protein Eng.[蛋白质工程],9(1996),第617-621页；和Atwell等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],270(1997),第26-35页。DuoBody突变包括第一重链中的F405L和第二重链中的K409R。参见例如Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],110(2013),第5145-5150页。Azymetric突变包括第一重链中的T350V、L351Y、F405A和/或Y407V和第二重链中的T350V、T366L、K392L和/或T394W。参见例如Von Kreudenstein等人,mAbs,5(2013),第646-654页。HA-TF突变包括第一重链中的S364H和/或F405A，和第二重链中的Y349T和/或T394F。参见例如Moore等人,mAbs,3(2011),第546-557页。SEEDbody突变包括第一重链中的IgG/A嵌合体突变和第二重链中的IgG/A嵌合体突变。参见例如Davis等人,Protein Eng.Des.Sel.[蛋白质工程化设计与选择],23(2010),第195-202页。差别蛋白A亲和力突变在一个重链中包括H435R且另一重链中无突变。参见例如美国专利第8,586,713号。这些文件中的每一个均通过引用整体并入。

在特定的实施例中，有可能通过使用Fc电荷对来驱动抗体的同四聚化，所述Fc电荷对不利于抗体重链的同二聚化，因此有利于连接至TTR亚基的一条抗体重链与未连接至TTR的一条抗体重链之间的重链异二聚化(参见图1b)。例如，可以将一组带电荷的突变并入重链的C_H3结构域中，其中一条重链上带负电荷并且相应重链上带正电荷，或者一条重链上的负电荷和正电荷的混合物(其与其在相应的重链上相应的正电荷和负电荷配对)。示例性的负电荷包括K392D和K409D，示例性的正电荷包括E356K和D399K。由于在C_H3界面上的类似电荷相斥而异种电荷吸引，因此同二聚作用不利，而异二聚作用则有利。TTR仅与一种电荷类型(正电荷或者负电荷，但不能同时存在)的重链融合，因此，这导致一个TTR亚基/个由4条链(两条轻链、一条未融合的重链和一条TTR融合的重链)组成的完整抗体。另外的电荷对突变在例如USP 9,546,203中讨论。电荷对突变(包括第一重链中的D221E、P228E、和/或L368E和第二重链中的D221R、P228R、和/或K409R)还描述于例如，Strop等人,J.Mol.Biol[分子生物学杂志].,420(2012),第204-219页。这些文件中的每一个均通过引用整体并入。

本发明还部分涉及TTR在Fab片段四聚化中的用途。在此类同四聚体融合蛋白中，TTR(SEQ ID NO:1)、或其变体再次以四聚体形式存在，其中每个TTR亚基连接至每个Fab片段的C末端以形成TTR Fab同四聚体(参见图1c)。因此，每个Fab片段抗体都与TTR四聚体中的单个TTR亚基连接，从而产生TTR Fab同四聚体。

因此，本发明涉及同四聚体融合蛋白，其包含四个抗原结合蛋白(例如，Fab四聚体)或八个抗原结合蛋白(例如，Ab四聚体)。在一些实施例中，同四聚体融合蛋白包含与蛋白复合体连接的抗原结合蛋白。在一些实施例中，蛋白复合体是TTR蛋白复合体，其中TTR蛋白复合体是TTR四聚体。在一些实施例中，抗原结合蛋白是抗体。在其他实施例中，抗原结合蛋白是Fab片段。

在特定的实施例中，本发明涉及同四聚体融合蛋白，其包含四个与TTR四聚体连接的抗体。在其他实施例中，本发明涉及同四聚体融合蛋白，其包含连接至TTR四聚体的四个Fab片段。在一些实施例中，抗体或Fab在没有接头的情况下与TTR四聚体相连(即，抗体或Fab直接与TTR相连)。

在其他实施例中，抗体或Fab经由接头连接至TTR四聚体。例如，氨基酸接头可用于将抗体重链的C末端连接至TTR亚基N末端。在一些实施例中，接头的长度是1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35或1-40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度是0、1、5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在其他实施例中，接头的长度多达5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸。在一些实施例中，接头的长度多达5、10、15或20个氨基酸。在特定的实施例中，接头的长度是0、5、10、15或20个氨基酸。

其他合适的氨基酸接头包括，例如二硫键、(Gly)_n(n＝1-10)、(EAAAK)_n(n＝1-5)、A(EAAAK)₄ALEA(EAAAK)₄A、PAPAP、AEAAAKEAAAKA、(Ala-Pro)_n(n＝1-20)、VSQTSKLTRAETVFPDV、PLGLWA、RVLAEA、EDVVCCSMSY、GGIEGRGS、TRHRQPRGWE、AGNRVRRSVG、RRRRRRRRR、GFLG和LE。合适的非氨基酸接头包括聚乙二醇(PEG)和含三嗪的部分(包含在构建体中，所述构建体具有能够与蛋白质反应的末端基团；参见，例如PCT公开号WO/2017/083604，其通过引用整体并入本文)。

在一些实施例中，将抗体或Fab在有或没有接头的情况下连接至截短的TTR亚基。例如，可以从一个或多个TTR亚基的N末端去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，并且抗体或Fab可以附接至截短的TTR亚基N末端。

本发明还涉及编码本文所述的同二聚体融合蛋白的核酸分子。关于产生同四聚体(TTR和Ab)融合蛋白的示例性方法的细节可以在实例中找到。

抗原结合蛋白

任何抗原结合蛋白(例如Fab或抗体)均可用于本发明的TTR融合蛋白。因为本发明的融合蛋白允许抗原结合蛋白多聚化，所以靶向/结合抗原的抗原结合蛋白(其中需要抗原结合蛋白聚簇或亲合力以具有活性)可以特别受益于本发明的融合蛋白。因此，在一些实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体或Fab)靶向/结合至：4-1BB(CD137)、CD20、GITR、DR5、OX40(CD134)、ICOS(CD278)或CD27。此类蛋白质/靶标已显示在癌症途径中起作用。在其他实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体或Fab)靶向/结合至：ErbB-1(表皮生长因子受体(EGFR))、ErbB-2(人中的HER2和啮齿动物中的neu)、ErbB-3(HER3)、ErbB-4(HER4)、FGFR(成纤维细胞生长因子受体)、VEGFR(血管内皮细胞生长因子)、RET蛋白产物、EGFR、KIT蛋白产物、Abl(艾贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒癌基因同源物1)、Raf(迅速加快的纤维肉瘤)激酶、或PDGFR(血小板衍生生长因子受体)。

在一个实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体或Fab)特异性结合CB1R(抗大麻素受体-1；基因名称Cnrl)。CB1受体是在CNS和周围神经系统中广泛表达的Gi偶联的G蛋白受体。激动剂刺激CB1受体导致抑制腺苷酸环化酶活性并激活丝裂原活化蛋白(MAP)激酶。CB1受体的内源性激动剂可包含花生四烯乙醇胺和花生四烯酰基甘油。外源激动剂可包含A9-四氢大麻酚。已经显示拮抗剂或反向激动剂可减轻体重并改善代谢参数，例如降低血浆葡萄糖和胰岛素水平。因此，在特定实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合部分是抗CB1R抗体(例如，具有重链SEQ ID NO:5和轻链SEQ ID NO:11的抗CB1R抗体10D10；或具有重链SEQ IDNO:6或7和轻链SEQ ID NO:11的抗CB1R抗体)。在其他特定的实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合蛋白是抗CB1R Fab(例如，衍生自10D10的Fab，例如Fab重链SEQ ID NO:44和Fab轻链SEQ ID NO:11)。参见，例如，美国专利公开20160145333，其通过引用并入本文。

在一个实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体或Fab)特异性结合GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白；TNFRSF18)。GITR有时也称为激活诱导型TNFR家族成员(AITR)，是属于TNF受体超家族(TNFRSF)的受体。它由其同源配体GITR配体(GITRL，TNFSF18)激活。GITR是含有富半胱氨酸细胞外结构域的I型跨膜蛋白，富半胱氨酸细胞外结构域是TNFR家族成员的特征。例如，GITR的胞质结构域与某些其他TNFR家族成员(例如，4-1BB和CD27)具有紧密的同源性(Nocentini,等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci[美国科学院院报].94:6216-6221，其通过引用并入本文)。GITR激活导致增强的免疫应答，而这种激活具有恢复针对感染和肿瘤的免疫应答的潜力。因此，能够激活GITR的分子在需要触发增强的免疫应答的环境中可以用作免疫刺激剂。因此，在特定实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合部分是抗GITR抗体(例如，具有重链SEQ ID NO:18和轻链SEQ ID NO:25的抗GITR抗体9H6；或具有重链SEQ ID NO:19或20和轻链SEQ ID NO:25的抗GITR抗体)。在其他特定的实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合蛋白是抗GITR Fab(例如，衍生自9H6的Fab，例如Fab重链SEQ ID NO:21和Fab轻链SEQID NO:26)。参见，例如，美国专利公开20150064204，其通过引用并入本文。

在一个实施例中，抗原结合蛋白(例如抗体或Fab)特异性结合TRAILR2(TRAIL受体2；也称为DR5(死亡受体5))。TR-2(肿瘤坏死因子(TNF)相关的凋亡诱导配体(“TRAIL”)受体-2)与其配体TRAIL之间的相互作用在诱导凋亡中起作用(参见，例如，Almasan等人,Cytokine&Growth Factor Reviews[细胞因子与生长因子综述]14:337-348(2003))。TRAIL(也称为Apo2配体)是同聚配体，其与TNF受体超家族的四个成员(TRAIL受体(“TR”)1至4)、以及与相关的、可溶性、骨保护素(“OPG”)受体相互作用。TRAIL与细胞表面的TR-1或TR-2结合触发该细胞的凋亡。TRAIL与TR-1或TR-2初始结合后，细胞内蛋白被募集到受体的细胞内死亡结构域，形成信号传导复合体。某些细胞内胱天蛋白酶被募集到所述复合体中；在这里它们自动激活，进而激活其他的胱天蛋白酶和细胞内凋亡级联反应。TR-3和TR-4和OPG缺乏负责传递细胞凋亡信号的细胞内结构域。因此，TRAIL与TR-3、TR-4或OPG的结合不触发细胞凋亡。TR-3和TR-4也被称为“诱饵”受体，它们的过度表达已被证明可以保护细胞免受TRAIL的凋亡诱导。TR-2在各种细胞中表达，包括肝、脑、乳腺、肾、结肠、肺、脾、胸腺、外周血淋巴细胞、前列腺、睾丸、卵巢、子宫和胃肠道的各种组织。(参见例如，Walczak等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]16:5386-5397(1997)；Spierings等人,J.Histochem.Cytochem.[组织化学和细胞化学杂志]52:821-831(2004)，其每一个通过引用并入本文)。尽管TRAIL和TRAIL受体被广泛表达，但是它们在诱导转化细胞的凋亡中最活跃。(参见例如，Daigle等人,Swiss Med.Wkly.[瑞士医疗周刊]131:231-237(2001)，其通过引用并入本文)。考那妥木单抗(一种抗TRAILR2单克隆抗体)已经在开发中，用于治疗癌症。因此，在特定实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合部分是抗TRAILR2抗体(例如，具有重链SEQ ID NO:31和轻链SEQID NO:38的考那妥木单抗；或具有重链SEQ ID NO:32或33和轻链SEQ ID NO:38的抗TRAILR2抗体)。在其他特定的实施例中，TTR融合蛋白的抗原结合蛋白是抗TRAILR2 Fab(例如，衍生自考那妥木单抗的Fab，例如Fab重链SEQ ID NO:34和Fab轻链SEQ ID NO:39)。

TTR变体

如上所述，TTR变体也可以用于本发明。本文讨论的任何TTR变体可以彼此组合使用。TTR变体包括具有以下氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与具有例如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:43的TTR蛋白至少80％、81％、82％、83％、86％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在一些实施例中，本发明的TTR包含人TTR的氨基酸序列SEQ ID NO:43。在特定的实施例中，本发明的TTR包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，其中在K15、C10或K15/C10两者处具有突变(例如，K15A、C10A或K15A/C10A两者)。在具体的实施例中，本发明的TTR同时包含K15A和C10A突变，并且因此具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。

人TTR(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:43)中存在的半胱氨酸可以用作与抗原结合蛋白(例如，抗体和Fab)的缀合位点。另外，能够进行位点特异性缀合的TTR变体，例如具有工程化的半胱氨酸的TTR变体，可以用于本发明。参见，例如，USP 8,633,153，其通过引用并入本文。例如，TTR变异体可以包含以下半胱氨酸突变中的一个或多个：A37C、D38C、A81C或G83C。

可用于本发明的其他变体包括例如在C末端或N末端具有截短的TTR蛋白。这样的TTR蛋白包括其中从C末端或N末端TTR蛋白去除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸的那些。在一些实施例中，本发明的融合蛋白包含TTR蛋白，其中从TTR蛋白的C末端或N末端去除1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。在其他实施例中，本发明的融合蛋白包含TTR蛋白，其中从TTR蛋白的N末端去除1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸。

可用于本发明的其他TTR变体包括降低或阻断TTR与甲状腺素结合的那些。每个TTR四聚体包含位于TTR四聚体的中央通道中的两个甲状腺素结合位点。例如，这样的变体可以避免干扰患者的甲状腺素生物学，并且可以避免甲状腺素代谢途径对TTR融合起作用。可用于本发明的其他TTR变体包括降低或消除TTR蛋白水解活性的那些。

另外，TTR-His标签融合体可用于本发明。例如，TTR-His标签融合体可用于纯化TTR Fab构建体(其中Fab缺乏Fc)，或用于纯化TTR Ab构建体(其中有利于避免蛋白A亲和柱的低pH纯化环境)。在一些实施例中，在纯化后去除His标签。His标签也可以存在于最终的治疗分子中(即，标签可以在纯化后保留)。在一些实施例中，His标签是His、(His)₂、(His)₃、(His)₄、(His)₅、(His)₆、(His)₇、(His)₈、(His)₉或(His)₁₀标签。在特定实施例中，His标签是(His)₆或(His)₇标签。在具体的实施例中，His标签是(His)₆标签。在一些实施例中，His标签包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个甘氨酸氨基酸作为接头。在特定的实施例中，His标签包含两个甘氨酸(例如，GGHHHHHH)。

在一些实施例中，可以在TTR变体和重链或轻链之间插入两个甘氨酸氨基酸接头。

此外，本发明的TTR变体可以包括掺入糖基化位点的变体，这可以有助于调节TTR融合体的PK或溶解性。另外，本发明的TTR变体或TTR融合蛋白可以被修饰以包括赋予有益PK特性的部分，例如含三嗪的部分(包含在构建体中，所述构建体具有能够与蛋白质反应的末端基团；参见，例如PCT公开号WO/2017/083604，其通过引用整体并入本文)。

制备同二聚体和同四聚体融合蛋白的方法

在实例中讨论了制备本发明的同二聚体和同四聚体融合体的方法。

通常，本发明的同二聚体和同四聚体融合体可以使用重组方法来产生。因此，本发明包括编码同二聚体和同四聚体融合体的多核苷酸。在另一方面，本发明包括表达载体，所述表达载体包含编码同二聚体和同四聚体融合体的多核苷酸。在某些实施例中，表达载体包含控制序列(例如，启动子，增强子)，其可操作地连接至编码同二聚体和同四聚体融合体的多核苷酸，以支持在合适的宿主细胞中的表达。在某些实施例中，表达载体还包含允许在宿主细胞中染色体非依赖性复制的多核苷酸序列。示例性载体包括但不限于质粒、粘粒和YACS。在特定的实施例中，载体是pTT5。

通常，当产生Ab TTR同二聚体或Ab TTR同四聚体融合构建体时，利用哺乳动物宿主细胞。哺乳动物宿主细胞也适用于产生Fab TTR同四聚体融合构建体，尽管也可以使用非哺乳动物细胞，例如原核(细菌)和非哺乳动物(例如酵母)宿主细胞。

在另一方面，本发明包括包含本发明表达载体的宿主细胞。用表达载体转染宿主细胞并在适合于表达同二聚体和同四聚体的条件下培养转染的宿主细胞的方法是本领域已知的。使用的转染程序可能取决于要转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的某些方法是本领域已知的，并且包括但不限于：葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一个或多个多核苷酸封装于脂质体中、以及DNA到核中的直接显微注射。可用作用于表达的宿主的某些哺乳动物细胞系是本领域中众所周知的且包括但不限于可得自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO，例如CHO-K1)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人胚胎肾细胞293(HEK293)和多种其他细胞系。在某些实施例中，可以通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生同二聚体和同四聚体融合体来选择细胞系。

因此，本发明还涉及制备本文所述的同二聚体和同四聚体融合蛋白的方法。例如，同二聚体和同四聚体融合蛋白可以通过以下方法制备：

a)培养包含编码所述同二聚体和同四聚体融合体的多核苷酸的重组宿主细胞；并且

b)从所述培养物中分离所述同二聚体或同四聚体融合蛋白。

药物组合物

在一些实施例中，本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的同多聚体融合蛋白(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)中的一种或多种，以及药学上有效的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂、和/或佐剂。本发明的药物组合物包括但不限于，液体、冷冻和冻干的组合物。

优选地，可接受的配制品物质在所采用的剂量及浓度下对接受者无毒。在具体的实施例中，提供药物组合物，其包含治疗有效量的同多聚体融合蛋白(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)。

在某些实施例中，药物组合物可含有配制品物质以调节、维持或保留例如组合物的pH值、渗透性、粘度、澄明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透。在这样的实施例中，合适的配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸、或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐的抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普鲁尼克酸、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯、曲通、三甲胺、卵磷脂、胆固醇、替洛沙泊)；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见，REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明登氏药学全书]",第18版(A.R.Genrmo编),1990,马克出版公司(MackPublishing Company)。

在某些实施例中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预定施用途径、递送形式及所要剂量来确定。参见，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]，同上。在某些实施例中，此类组合物可影响本发明的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放率及体内清除率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒剂或载剂在性质上可以是水性或非水性的。例如，适合的媒剂或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性媒剂。在特定实施例中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，且可进一步包括山梨糖醇或其合适取代物。在本发明的某些实施例中，同多聚体组合物(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)可以通过将具有所希望纯度的选定成分与任选的配制剂(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES[雷明登氏药学全书]，同上)混合、以冻干饼或水性溶液的形式来制备用于储存。另外，在某些实施例中，可以使用合适的赋形剂(例如蔗糖)将同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制成冻干物。

可以选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。可替代地，可选择组合物以用于吸入或用于经由消化道(例如口服)递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的技术范围内。配制品组分优选地以对施用部位可接受的浓度存在。在某些实施例中，使用缓冲液以便将组合物维持在生理pH值或稍低pH值下，典型地在约5至约8的pH值范围内。

当考虑肠胃外施用时，用于本发明的治疗组合物能以无热原的肠胃外可接受的水性溶液的形式提供，所述水性溶液在药学上可接受的媒剂中包含所需的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)。用于肠胃外注射的特别适合的媒剂是无菌蒸馏水，其中将同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制成适当保存的无菌等渗溶液。在某些实施例中，该制备可以涉及用可以提供产物(该产物可以经由储库注射来递送)的受控或持续释放的药剂(如可注射微球体、生物可侵蚀颗粒、聚合物化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体)配制所希望分子。在某些实施例中，还可使用透明质酸，其具有促进在循环中的持续时间的效果。在某些实施例中，可使用可植入药物递送装置来引入所要抗原结合蛋白。

可以配制本发明的药物组合物用于吸入。在这些实施例中，将同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)有利地配制为干燥的、可吸入的粉末。在具体的实施例中，也可以将同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)吸入溶液与推进剂一起配制用于气雾剂递送。在某些实施例中，可以使溶液雾化。因此，国际专利申请号PCT/US 94/001875进一步描述经肺施用及配制方法，其通过引用并入且描述经化学修饰的蛋白质的经肺递送。

还预期配制品可以口服施用。以此方式施用的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体，TTR抗体同四聚体或TTR Fab同四聚体融合蛋白)可以在存在或不存在载剂的情况下配制，这些载剂常用于混配固体剂型(例如片剂和胶囊)。在某些实施例中，可设计胶囊以便在胃肠道中在生物可用性最大化且系统前降解最小化时释放配制品的活性部分。可以包括另外的试剂以促进同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、助悬剂、片剂崩解剂及粘合剂。

另外的药物组合物对本领域技术人员将是显而易见的，其包括配制品，所述配制品涉及持续递送或受控递送配制品中的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)。用于配制多种其他持续或控制递送手段(例如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠粒及贮库注射剂)的技术对于本领域技术人员也是已知的。参见，例如国际专利申请号PCT/US93/00829，其通过引用结合在此并描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包括呈成型制品(例如膜或微胶囊)形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中所披露，其每个通过引用结合在此)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman等人,1983,Biopolymers[生物聚合物]2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,J.Biomed.Mater.Res.[生物医学材料研究杂志]15:167-277和Langer,1982,Chem.Tech.[化学技术]12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP 133,988)。持续释放组合物还可以包括脂质体，其可通过本领域中已知的若干方法中的任一种来制备。参见，例如Eppstein等人,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]82:3688-3692；欧洲专利申请公开号EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949，这些参考文献通过引用并入。

用于体内施用的药物组合物典型地呈无菌制剂形式提供。可通过经无菌过滤膜过滤而实现灭菌。当将组合物冻干时，可以在冻干和重配之前或之后使用该方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可呈冻干形式或呈溶液形式储存。一般将肠胃外组合物置于具有无菌进入口的容器中，例如，静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。

本发明的方面包括自缓冲的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品，其可以用作药物组合物，如国际专利申请WO06138181A2(PCT/US2006/022599)中所述，其通过引用整体并入本文。

如上所述，某些实施例提供同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)组合物，特别是药物同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)组合物，其除了所述同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)外，还包含一种或多种赋形剂(例如本节和本文其他地方示例性描述的赋形剂)。在这方面，赋形剂在本发明中可用于多种目的，如调整配制品的物理、化学或生物特性，如调整粘度和/或本发明的方法以改善有效性和/或稳定此类配制品和方法，以对抗由于例如在制造、运输、储存、使用前准备、施用和之后过程中发生的压力而导致的降解和腐坏。

关于蛋白质稳定化和配制材料以及在这方面有用的方法，有各种论述，例如Arakawad等人,"Solvent interactions in pharmaceutical formulations[药物制剂中的溶剂相互作用],"Pharm Res[药物研究].8(3):285-91(1991)；Kendrick等人,RATIONALDESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS:THEORY AND PRACTICE[稳定蛋白质制剂的合理设计：理论与实践]中的"Physical stabilization of proteins in aqueous solution[水溶液中蛋白质的物理稳定化],",Carpenter和Manning,编辑.PharmaceuticalBiotechnology[药物生物技术].13:61-84(2002)，和Randolph等人,"Surfactant-proteininteractions[表面活性剂-蛋白质相互作用],"Pharm Biotechnol[药物生物技术].13:159-75(2002)，其每一个均通过引用整体并入本文，特别是涉及与根据本发明的自缓冲蛋白配制品的赋形剂及其制备方法有关的部分，尤其是用于兽医和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。

根据本发明的某些实施例，可以使用盐以例如调整配制品的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白质或其他成分的溶解度和/或物理稳定性。

众所周知，离子可以通过与蛋白质表面上的带电荷的残基结合并通过屏蔽蛋白质中的带电荷基团和极性基团并降低其静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度来稳定蛋白质的天然状态。离子还可以通过特别地与蛋白质的变性肽键(--CONH)结合来稳定蛋白质的变性状态。此外，与蛋白质中的带电荷基团和极性基团的离子相互作用还可以减少分子间静电相互作用，并且从而防止或减少蛋白质聚集和不溶解。

离子种类对蛋白质的作用显著不同。已经开发了多种对可用于配制根据本发明的药物组合物的离子及其对蛋白质的作用的分类评级。一个实例是Hofmeister系列，该系列通过对溶液中蛋白质的构象稳定性的作用来对离子和极性非离子溶质进行评级。稳定溶质称为“亲液的。”不稳定溶质称为“离液的。”通常使用高浓度的亲液剂(例如，>1摩尔硫酸铵)以从溶液中沉淀蛋白质(“盐析”)。通常使用离液剂来使蛋白质变性和/或溶解(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”的相对有效性限定了其在Hofmeister系列中的位置。

根据本发明的各种实施例，游离氨基酸可以用于同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品中，作为填充剂、稳定剂、和抗氧化剂、以及作为其他标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定配制品中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干以确保正确的饼结构和特性。在液体配制品和冻干配制品两者中，精氨酸均可用于抑制蛋白质聚集。蛋氨酸可用作抗氧化剂。

多元醇包括糖，例如甘露醇、蔗糖和山梨醇以及多元醇，如例如甘油和丙二醇，并且出于本文论述的目的，包括聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是亲液的。它们在液体配制品和冻干配制品两者中是有用的稳定剂，以保护蛋白质免受物理和化学降解过程的影响。多元醇也可用于调整配制品的张力。

在本发明的选择实施例中有用的多元醇是甘露醇，甘露醇通常用于确保在冻干配制品中饼的结构稳定性。它确保了饼的结构稳定性。它通常与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨醇和蔗糖是用于调整张力且作为稳定剂以防止在运输过程中的冷冻-解冻应力或防止在制造过程中制备团块的优选药剂。还原糖(含有游离醛或酮基团)，如葡萄糖和乳糖，可以使表面赖氨酸和精氨酸残基糖基化。因此，它们通常不是根据本发明使用的优选多元醇。此外，在这方面，形成此类反应性物质的糖也不是本发明优选的多元醇，该糖如蔗糖，蔗糖在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖并因此产生糖基化。PEG可用于稳定蛋白质并用作冷冻保护剂，并且在这方面可以用于本发明。

同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体，TTR抗体同四聚体或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品的实施例还包含表面活性剂。蛋白质分子可易于吸附在表面上，并且变性以及随后在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处聚集。这些效应通常与蛋白质浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白质浓度成反比，并且典型地因物理振荡(如在产品运输和处理过程中产生的物理振荡)而加剧。

常规使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、脱水山梨醇聚乙氧基化物的其他脂肪酸酯、以及泊洛沙姆188。

表面活性剂也常用于控制蛋白质构象稳定性。在这方面使用表面活性剂是蛋白质特异性的，因为任何给定的表面活性剂典型地会稳定一些蛋白质并使其他蛋白质不稳定。

聚山梨醇酯易于氧化降解，并且通常在供应时含有足够量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链，尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，应谨慎使用聚山梨醇酯，并且在使用时应以其最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨醇酯例示了赋形剂应以其最低有效浓度使用的一般规则。

同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体，TTR抗体同四聚体或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品的实施例还包含一种或多种抗氧化剂。通过保持适当水平的环境氧气和温度并避免暴露于光下，可以在某种程度上防止药物配制品中蛋白质的有害氧化。也可以使用抗氧化赋形剂来防止蛋白质的氧化降解。在这方面，有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂。用于根据本发明的治疗性蛋白质配制品中的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的储存寿命内保持其活性。在这方面，EDTA是根据本发明的优选的抗氧化剂。

抗氧化剂可以破坏蛋白质。例如，还原剂，如特别是谷胱甘肽，可以破坏分子内二硫键。因此，选择用于本发明的抗氧化剂尤其用于消除或足够降低其本身破坏配制品中的蛋白质的可能性。

根据本发明的配制品可以包含金属离子，这些金属离子是蛋白质辅助因子并且是形成蛋白质配位复合物所必需的，如形成某些胰岛素悬浮液所必需的锌。金属离子也可以抑制降解蛋白质的一些过程。然而，金属离子也催化降解蛋白质的物理和化学过程。

镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca⁺²离子(高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²可以使rhDNase去稳定。类似地，Ca⁺²和Sr⁺²可以稳定因子VIII，它可以因Mg⁺²、Mn⁺²和Zn⁺²、Cu⁺²和Fe⁺²去稳定，并且其聚集可以通过Al⁺³离子增加。

同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体，TTR抗体同四聚体或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品的实施例还包含一种或多种防腐剂。当开发涉及从同一容器提取超过一次的多剂量肠胃外配制品时，防腐剂是必需的。其主要功能是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个保质期或使用期限内的产品无菌性。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂在小分子肠胃外使用方面有着悠久的历史，但包含防腐剂的蛋白质配制品的开发可能具有挑战性。防腐剂几乎总是对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，并且这已成为限制其在多剂量蛋白质配制品中使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白质药物仅配制用于一次性使用。然而，当多剂量配制品是可能的时，它们具有使患者方便的附加优势和增加的可销售性。一个好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐配制品的开发已导致更方便、多次使用的注射笔呈现形式的商业化。至少四种含有hGH的防腐配制品的此类笔装置目前可在市场上获得。Norditropin(液体，诺和诺德公司(Novo Nordisk))、Nutropin AQ(液体，基因泰克公司(Genentech))和Genotropin(冻干的--双室药筒，法玛西亚普强公司(Pharmacia&Upjohn))含有苯酚，而Somatrope(礼来公司(Eli Lilly))用间-甲酚进行配制。

在防腐剂型的配制和开发期间需要考虑若干个方面。必须优化药物产品中有效的防腐剂浓度。这需要以赋予抗微生物有效性而不损害蛋白质稳定性的浓度范围测试剂型中给定的防腐剂。

正如可以预期的那样，含有防腐剂的液体配制品的开发比冻干配制品更具挑战性。冷冻干燥的产品可以在没有防腐剂的情况下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂重构。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，从而显著最小化相关的稳定性风险。在液体配制品的情况下，应在整个产品保质期(约18至24个月)内保持防腐剂有效性和稳定性。要指出的重要点是，防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终配制品中得到证实。

通常将根据生物可用性和持久性的范围(除了其他方面)，针对施用的具体途径和方法、针对具体施用剂量和施用频率、针对具体疾病的具体治疗，对同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)配制品进行设计。因此，可以根据本发明设计配制品，以通过任何合适的途径(包括但不限于口服、耳内、眼科、直肠、和阴道)以及通过肠胃外途径(包括静脉内和动脉内注射、肌内注射、和皮下注射)递送。

一旦已配制药物组合物后，其便可作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或者作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类配制品能以即用形式或以在施用前重构的形式(例如冻干形式)储存。本发明还提供了用于产生单剂量给予单元的药剂盒。本发明的药剂盒可各自含有具有干燥蛋白质的第一容器和具有水性配制品的第二容器。在本发明的某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器)的药剂盒。

有待使用的含同多聚体(例如，含有TTR抗体同二聚体、含有TTR抗体同四聚体或含有TTR Fab同四聚体的融合蛋白)的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗环境和目标。本领域技术人员应了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、所使用的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体或TTR Fab同四聚体融合蛋白)的适应症、施用途径及患者的体型(体重、体表面积或器官大小)和/或状态(年龄及一般健康状况)而变化。在某些实施例中，临床医师可滴定剂量且修改施用途径以获得最佳治疗效果。取决于上述因素，典型的剂量范围可以为从约0.1μg/kg至高达约30mg/kg或更高。在具体的实施例中，剂量范围可以为从1.0μg/kg至约20mg/kg，任选地为从10μg/kg至高达约10mg/kg或从100μg/kg至高达约5mg/kg。

治疗有效量的同多聚体(例如，TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、或TTR Fab同四聚体融合蛋白)优选地导致疾病症状的严重性降低、导致疾病无症状期的频率或持续时间增加、或导致预防因疾病困扰而造成的缺陷或残疾。

药物组合物可以使用医疗装置来施用。用于施用药物组合物的医疗装置的实例描述在美国专利号4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163，均通过引用并入本文。

同二聚体和同四聚体融合蛋白的治疗用途

如实例中所示，已经发现抗体与TTR二聚化(以产生TTR同二聚体融合蛋白)以及抗体和Fab片段与TTR四聚化(以产生TTR同四聚体融合蛋白)导致与个别的一个或多个抗体和/或一个或多个Fab片段相比，含有TTR的融合蛋白具有增加的亲合力。

另外，与单独的一个或多个抗体和/或一个或多个Fab片段相比，TTR同二聚体和TTR同四聚体融合蛋白表现出改善的抗原聚簇。当抗体(例如IgG抗体)与靶细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原结合时，形成的聚簇化Fc结构域就会与免疫效应细胞(例如NK细胞和巨噬细胞)上的FcγR接合。这种聚簇有助于通过FcγR进行信号传导，从而启动细胞介导的效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。因此，TTR同二聚体和TTR同四聚体融合蛋白在靶向配体中特别有用，其中高抗体或Fab亲和力/亲合力导致增强的生物学效应。本发明的TTR同二聚体和TTR同四聚体构建体增强细胞介导的效应子功能导致杀死细胞的能力增强，这可用于例如癌症的治疗。

本发明的TTR同二聚体和TTR同四聚体融合蛋白可用于结合多种靶标/抗原。例如，TTR同二聚体和TTR同四聚体融合蛋白可以在靶向以下各项中用作激动剂：TRAIL、TRAIL2R、GITR、OX40、GLP1、TREM2和4-1BB。此外，TTR同二聚体和TTR同四聚体融合蛋白可以在靶向以下各项中用作拮抗剂：GIPR、TNFR、整联蛋白受体、PD-1、PD-L1、TIGIT、LAG-3和TIM-3。

因此，本发明还涉及使用本文所述的同二聚体融合蛋白和同四聚体融合蛋白治疗癌症的方法。

在其他实施例中，本发明涉及本文所述的同二聚体融合蛋白和同四聚体融合蛋白在癌症治疗中的用途。

在其他实施例中，本发明涉及本文所述的用于治疗癌症的同二聚体融合蛋白和同四聚体融合蛋白。

实例

提供以下实例是为了说明本发明的具体实施例或特征，而不是为了限制其范围。

实例1：产生的TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的概述

TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆

以下杂交瘤衍生的抗体和Fab用于产生融合蛋白：

·来自杂交瘤CB10(也称为杂交瘤10D10)的抗CB1R抗体和Fab

·来自杂交瘤9H6的抗GITR抗体和Fab

·抗TRAILR2抗体考那妥木单抗和相应的考那妥木单抗Fab

产生以下TTR融合蛋白。[TTR]＝TTR四聚体。为了简单起见，在实例1的概述中未示出His标签(对于Fab构建体)。

具体地，构建以下TTR抗体同二聚体融合蛋白。在这些构建体中，两条抗体重链的C末端均与每个TTR亚基的N末端连接。

a.[抗CB1R抗体]₂-[TTR]

·“CB1R TTR抗体同二聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:5]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11
[[SEQ ID NO:5]–[GGGGS]]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11
		[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)<sub>2</sub>]]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11
[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)<sub>3</sub>]]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11
		[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)<sub>4</sub>]]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11

b.[抗GITR抗体]₂-[TTR]

·“GITR TTR抗体同二聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:18]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:25

c.[抗TRAILR2抗体]₂-[TTR]

·“考那妥木单抗TTR抗体同二聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:31]<sub>2</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:38

另外，构建了以下TTR抗体同四聚体融合蛋白。在这些构建体中，将抗体C末端的两条重链中一条(包含电荷对突变D399K和E356K(SEQ ID NO:6、19、或32))连接(带有或不带有接头)到TTR亚基的N末端。剩余的重链包含与连接的重链相关联的一组互补的K392D和K409D电荷对突变(SEQ ID NO:7、20或33)。注意，在对实例中的构建体的讨论中，对E416K和D459K的讨论分别指的是EU E356K和EU D399K。类似地，在对实例中的构建体的讨论中，对K420D和K437D的讨论分别指的是EU K392D和EU K409D。

a.[抗CB1R抗体]₄-[TTR]

·“CB1R TTR抗体同四聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

b.[抗GITR抗体]₄-[TTR]

·“GITR TTR抗体同四聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

c.[抗TRAILR2抗体]₄-[TTR]

·“考那妥木单抗TTR抗体同四聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

另外，构建了以下TTR Fab抗体同四聚体融合蛋白。在这些构建体中，每个Fab片段的C末端均与每个TTR亚基的N末端连接。

a.[抗CB1R Fab]₄–[TTR]

·“CB1R TTR Fab同四聚体融合蛋白”

·注意，在对实例中的构建体的讨论中，对S215E的讨论指的是EU S183E。类似地，在对实例中的构建体的讨论中，对S203K的讨论指的是EU S176K。

·在[SEQ ID NO:44]₄–[SEQ ID NO:1]₄+SEQ ID NO:11融合体中，未使用电荷对突变。在[SEQ ID NO:45]₄–[SEQ ID NO:1]₄&SEQ ID NO:46融合体中，SEQ ID NO:45包含S215E电荷对突变，并且SEQ ID NO:46包含电荷对S203K突变，两者均按照EU系统编号。

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:44]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:44	[SEQ ID NO:11]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>
		[SEQ ID NO:45]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:46
SEQ ID NO:45	[SEQ ID NO:46]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>

b.[抗GITR Fab]₄–[TTR]

·“GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:21]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:26

c.[抗TRAILR2 Fab]₄–[TTR]

·“考那妥木单抗TTR Fab同四聚体融合蛋白”

·产生的序列对：

TTR-重链融合体	轻链
		[SEQ ID NO:34]<sub>4</sub>–[SEQ ID NO:1]<sub>4</sub>	SEQ ID NO:39

对于TTR抗体同二聚体融合蛋白，每个抗体重链的C末端都与每个TTR亚基的N末端连接。对于TTR抗体同四聚体融合蛋白，抗体C末端的两条重链之一与每个TTR亚基的N末端连接。对于TTR Fab同四聚体融合蛋白，每个Fab片段的C末端都与每个TTR亚基的N末端连接。

融合蛋白是使用标准分子生物学技术产生的，所述分子生物学技术包括聚合酶链式反应(PCR)、定点PCR诱变、限制性核酸内切酶消化和酶促连接到哺乳动物表达质粒中。还产生了聚组氨酸标记的Fab-TTR分子，其中(His)₆标签添加到Fab C末端。

将克隆的TTR融合变体重链和Fab DNA与它们各自的克隆的抗CB1、抗GITR和抗TR2抗体轻链(LC)DNA组合，用于转染哺乳动物细胞以表达TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、和TTR Fab同四聚体融合蛋白。通常根据可在Molecular Cloning:A LaboratoryManuel[分子克隆：实验室手册],第3版，Sambrook等人,2001,Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社],cold Spring Harbor,N.Y.[冷泉港，纽约州]中参考的方法进行所述技术。

实例2：抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆、表达和纯化

抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆抗CB1 TTR抗体同二聚体通常如下克隆。pTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1 VH]::huIgG2TO(构建体C59477)用作下述构建体的模板。pTT5-del-Bsm-BI载体是pTT5载体的衍生物，其中BsmBI限制性位点已被去除。

[SEQ ID NO:5]₂–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR1：使用C59477作为模板，编码信号序列氨基末端、SalI限制性酶切位点和优化的科扎克序列的5'PCR引物(5’AGT TTA AACGAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC 3’)与设计用于消除C59477中现有的BamHI限制性位点的3'引物(5’GTG CTG GCG AAT CCA GCT CCA ATA GTC ACC 3’)组合。PCR1产生约220个碱基对的产物。PCR2a：使用C59477作为模板，设计用于消除现有的BamHI限制性位点的5'PCR引物(5’GAG CTG GAT TCG CCA GCA CCC AGG 3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)和TTR(SEQ ID NO:1)的氨基末端的3'引物(5’GGT GCC CGT AGG GCCACC CGG AGA CAG GGA G 3’)组合。PCR2a产生约1250个碱基对的产物。PCR3a：使用TTR(SEQID NO:1)作为模板，编码羧基末端人重链恒定区(CH3)和TTR氨基末端的5'PCR引物(5’TCCCTG TCT CCG GGT GGC CCT ACG GGC ACC G 3’)与编码TTR(SEQ ID NO:1)的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3'引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCCTTG GGA TTG GTG 3’)组合。PCR3a产生约400个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应1、2a和3a，并在凯杰公司(Qiagen)柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒(GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit)连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73494:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(huIgG2-TO desK)VH]::TTR3。

使用如上所述的PCR1组装[[SEQ ID NO:5]–[GGGGS]]₂–[SEQ ID NO:1]₄。PCR2b：使用C59477作为模板，设计用于消除现有的BamHI限制性位点的5'PCR引物(5’GAG CTG GATTCG CCA GCA CCC AGG 3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)、G4S接头和TTR(SEQ IDNO:1)的氨基末端的3'引物(5’GGA TCC GCC ACC ACC ACC CGG AGA CAG GGA G 3’)组合。PCR2b产生约1250个碱基对的产物。PCR3b：使用TTR(SEQ ID NO:1)作为模板，编码羧基末端人重链恒定区(CH3)、G4S接头和TTR的氨基末端的5'PCR引物(5’GGT GGT GGC GGA TCC GGCCCT ACG GGC ACC G 3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3'引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG3’)组合。PCR3b产生约400个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应1、2b和3b，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73499:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(huIgG2-TO desK)VH]::G4S::TTR3。

使用如上所述的PCR1组装[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)₂]]₂–[SEQ ID NO:1]₄。PCR2c：使用C59477作为模板，设计用于消除现有的BamHI限制性位点的5'PCR引物(5’GAGCTG GAT TCG CCA GCA CCC AGG 3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)、(GGGGS)₂接头和TTR(SEQ ID NO:1)的氨基末端的3'引物(5’GCC GGA CCC TCC CCC ACC GGA TCC GCC ACCTCC ACC CGG AGA CAG GGA G 3’)组合。PCR2c产生约1250个碱基对的产物。PCR3c：使用TTR作为模板，编码羧基末端人重链恒定区(CH3)、(GGGGS)₂接头和TTR的氨基末端的5’PCR引物(5’CCG GTG GGG GAG GGT CCG GCC CTA CGG GCA CCG GTG AAT CCA AGG CTC CT 3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3'引物(5’AAC GAT ATC GCT AGCGCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3’)组合。PCR3c产生约400个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应1、2c和3c，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73500:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(huIgG2-TO desK)VH]::(G4S)2::TTR3。

[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)₃]]₂–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR4：使用C73500作为模板，5’PCR引物(5’-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGGGTG CC-3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)、(GGGGS)₃接头和TTR(SEQ ID NO:1)的氨基末端的3'引物(5’CGT AGG GCC GGA CCC TCC CCC ACC GGA GCC CCC GCC CCC GGA TCCGCC ACC TCC 3’)组合。PCR4产生约1500个碱基对的产物。PCR5：使用C73500作为模板，编码(GGGGS)₃接头的5’PCR引物(5’TCC GGG GGC GGG GGC TCC GGT GGG GGA GGG T 3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCGGCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3’)组合。PCR5产生约450个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应4和5，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73690:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(huIgG2-TO desK)VH]::(G4S)3::TTR3。

[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)₄]]₂–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR6：使用C73690作为模板，5’PCR引物(5’-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGGGTG CC-3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)和(GGGGS)₄接头的3’引物(5’GGA ACC ACCTCC GCC GGA TCC GCC ACC TCC A 3’)组合。PCR6产生约1500个碱基对的产物。PCR7：使用C73690作为模板，编码(GGGGS)₄接头的一部分的5’PCR引物(5’GGC GGA GGT GGT TCC GGGGGC GGG GGC TCC G3’)与编码TTR(SEQ ID NO:1)的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG 3’)组合。PCR7产生约450个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应6和7，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73729:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(huIgG2-TO desK)VH]::(G4S)4::TTR3。

[SEQ ID NO:6]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR8：使用C73494作为模板，5’PCR引物(5’-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC-3’)与设计用于在huIgG2 CH3中将谷氨酸残基356(EU)转换为赖氨酸的3'引物(5’CTT GGT CATCTC CTT CCG GGA TGG GGG CAG G 3’)组合。PCR8产生约1200个碱基对的产物。PCR9：使用C73494作为模板，设计用于在huIgG2CH3中将谷氨酸残基356(EU)转换为赖氨酸的5’PCR引物(5’-CTG CCC CCA TCC CGG AAG GAG ATG ACC AAG AAC CA-3’)与设计用于在huIgG2CH3中将天冬氨酸残基399(EU)转换为赖氨酸的3’引物(5’GAA GGA GCC GTC GGA CTT CAGCAT GGG AGG TGT 3’)组合。PCR9产生约160个碱基对的产物。PCR10：使用C73494作为模板，设计用于在huIgG2 CH3中将天冬氨酸残基399(EU)转换为赖氨酸的5’PCR引物(5’CCT CCCATG CTG AAG TCC GAC GGC TCC TTC T 3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物组合。PCR10产生约600个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应8、9和10，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。产生的构建体称为C73730:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(E416K,D459K)(huIgG2-TO desK)VH]::TTR3。

[[SEQ ID NO:6]–[GGGGS]]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR11：使用C73499作为模板，5’PCR引物(5’-AGT TTA AAC GAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTGCC-3’)与设计用于在huIgG2 CH3中将谷氨酸残基356(EU)转换为赖氨酸的3’引物(5’CTTGGT CAT CTC CTT CCG GGA TGG GGG CAG G 3’)组合。PCR11产生约1200个碱基对的产物。PCR12：使用C73499作为模板，设计用于在huIgG2 CH3中将谷氨酸残基356(EU)转换为赖氨酸的5’PCR引物(5’CTG CCC CCA TCC CGG AAG GAG ATG ACC AAG AAC CA 3’)与设计用于在huIgG2CH3中将天冬氨酸残基399(EU)转换为赖氨酸的3’引物(5’GAA GGA GCC GTC GGACTT CAG CAT GGG AGG TGT 3’)组合。PCR12产生约160个碱基对的产物。PCR13：使用C73499作为模板，设计用于在huIgG2 CH3中将天冬氨酸残基399转化为赖氨酸的5’PCR引物(5’CCTCCC ATG CTG AAG TCC GAC GGC TCC TTC T3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3'引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTGGTG 3’)组合。PCR13产生约600个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应11、12和13，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。氨基酸编号和命名惯例与先前构建体描述中的相同。所得的构建体称为C73731:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(E416K,D459K)(huIgG2-TO desK)VH]::G4S::TTR3。

SEQ ID NO:7如下构建。PCR14：使用C73494作为模板，5’PCR引物(5’-AGT TTA AACGAA TTC GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CC-3’)与设计用于在huIgG2 CH3中将赖氨酸残基392(EU)转换为天冬氨酸的3’引物(5’GGG AGG TGT GGT ATC GTA GTT GTTCTC CGG CTG C 3’)组合。PCR14产生约1300个碱基对的产物。PCR15：使用pTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::huFc_(IgG2)(K392D K409D)(“C59541”)作为模板，设计用于在huIgG2 CH3中将残基赖氨酸392(EU)转换为天冬氨酸的5’PCR引物(5’CCG GAG AAC AAC TAC GAT ACCACA CCT CCC ATG C 3’)与编码减去羧基末端赖氨酸的huIgG2羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3'引物(5’AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CCC GGA GAC AGGGAG 3’)组合。PCR15产生约200个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应14和15，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT15d中。所得的构建体称为C73513:pTT15d:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1(K420D,K437D)(huIgG2-TO desK)VH]。

SEQ ID NO:11如下构建。PCR16：编码可变区的氨基末端和BssHII限制性位点的5’PCR引物(5’-TTT TTT TTG CGC GCT GTG ATA TTG TGA TGA CTC AGT C)与编码可变区的羧基末端和BsiWI限制性位点的3'引物(5’-AAA AAA CGT ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGTCC)组合。PCR16通过凯杰公司柱纯化。然后将片段用BssHII和BsiWI消化，并在凯杰公司柱上纯化。然后将片段混合并连接到包含信号肽和κ恒定区的、BssHII和BsiWI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5-del-Bsm-BI中。所得的构建体称为C59474:pTT5-del-Bsm-BI:VK1O2O12::[hu抗<huCB1>10D10.1VL]::huKLC。

抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和抗CB1 TTR Fab同四聚体融合蛋白的表达

抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和抗CB1 TTR Fab同四聚体蛋白通常如下表达。

将HEK 293 6E细胞在悬浮液中在平台振荡器上在加湿的37℃的5％CO₂培养箱中以120RPM旋转生长。细胞培养传代培养基是FreeStyle F-17+0.1％(10mL/L的10％)Kolliphor P188+500μL/L G418+6mM(30mL/L)L-谷氨酰胺。转染前1-2天传代细胞，以使转染时的细胞密度约为1.5e⁶ VC/mL。将转染复合体在不含补充剂的Freestyle F17培养基中以最终培养物体积的10％的体积混合。每mL培养物将0.5μg DNA添加到Freestyle F17培养基中，然后每mL培养物添加1.5μl PEImax试剂。然后将培养基混合并在室温下孵育10分钟，然后添加到细胞培养物中，并返回在培养箱中的振荡器平台上的烧瓶。转染后1-4小时，每mL培养物中添加25μL Yeastolate溶液。转染后第6天收获条件化的培养基。

Freestyle F-17(目录号13835)，L-谷氨酰胺((目录号25030)、遗传霉素G418(目录号10131027，液体)获自生命科技公司(Life Technologies)。Kolliphor P 188(目录号K4894)获自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)。Difco TC Yeastolate UF(目录号292805)获自BD生物科学公司(BD Biosciences)。PEI Max(目录号24765-2)获自聚科学公司(Polysciences)。

在图2a、2b和2c的凝胶中，将10μl样品(未加热)加载到4-20％SDS-PAGE的每个泳道中，并用考马斯蓝为基础的染料体系显影。图2a和2b显示了抗CB1 TTR抗体同二聚体和抗CB1 TTR抗体同四聚体蛋白分别在HEK 293细胞中稳健表达。图2a显示了抗CB1 TTR抗体同二聚体([SEQ ID NO:5]₂–[SEQ ID NO:1]₄和[[SEQ ID NO:5]–[(GGGGS)_1-4]]₂–[SEQ ID NO:1]₄)抗SDS变性，因此可形成强的非共价复合体。各种接头长度(从泳道2中的最短([GGGGS]₁)到泳道5中的最长([GGGGS]₄))；接头长度似乎没有实质性影响表达。图2b显示，抗CB1 TTR抗体同四聚体的形成(使用V1 Fc电荷对突变(一条重链中的K409D和K392D，以及D399K和E356K)(SEQ ID NO:6和7))似乎也具有SDS抗性。显示了各种重链和轻链DNA转染率(从泳道2的1:9LC:HC到泳道10的9:1LC:HC)。LC:HC比为1:1(泳道6)和9:1(泳道10)导致最稳健表达。

图2c显示抗CB1 TTR Fab同四聚体构建体在HEK 293细胞中稳健表达并且对SDS具有抗性。与轻链C末端(泳道3、5、7、和9–更多条带)相比，在重链C末端(泳道2、4、6、和8–更少条带)处TTR融合耐受性更好。His标签的位置似乎并未影响融合。泳道2和4中使用的重链-TTR是[SEQ ID NO:44]₄–[SEQ ID NO:1]₄，并且轻链是SEQ ID NO:11。泳道3和5中使用的重链是SEQ ID NO:44，并且轻链-TTR是[SEQ ID NO:11]₄–[SEQ ID NO:1]₄。泳道6和8中使用的重链-TTR是[SEQ ID NO:45]₄–[SEQ ID NO:1]₄，并且轻链是SEQ ID NO:46。泳道7和9中使用的重链是SEQ ID NO:45，并且轻链-TTR是[SEQ ID NO:46]₄–[SEQ ID NO:1]₄。在泳道6-9中测试的抗CB1 TTR Fab同四聚体构建体(重链具有SEQ ID NO:45，并且轻链具有SEQ ID NO:46)中包含电荷对突变。SEQ ID NO:45包含S215E电荷对突变，并且SEQ ID NO:46包含电荷对S203K突变。还使用了His标签(参见图2c)。

抗CB1 TTR Fab同四聚体融合蛋白的纯化

通常如下纯化抗CB1 TTR Fab同四聚体蛋白。

使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将细胞培养基用2L的50mMNaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM咪唑、pH 8.0透析至少2小时，两次。使用AKTA纯化器(通用医疗集团)串联液相色谱系统(具有1mL Ni-NTA Superflow筒(凯杰公司，希尔登，德国)作为第一柱，以及5mL脱盐HiTrap(通用医疗集团)作为第二柱)从缓冲液交换的细胞培养基中纯化分子。将培养基直接加载到Ni-NTA柱上，用8CV的50mM磷酸钠、300mM NaCl、10mM咪唑、pH 8.0洗涤，并用2CV的50mM磷酸钠、300mM NaCl、250mM咪唑、pH 8.0洗脱。将Ni-NTA柱洗脱液自动引入脱盐柱中，在其中通过4CV的10mM乙酸钠、150mM NaCl(pH 5.2)对蛋白质进行等度洗脱。再通过3.0μm玻璃纤维/0.2μm Supor膜(颇尔公司(Pall Corporation),华盛顿港(PortWashington),纽约,美国)对样品进行过滤灭菌。

使用NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，罗克福德，伊利诺伊州，美国)，通过在280nM(A280)处的UV吸光度确定每种纯化的分子的蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用MES运行缓冲液(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)，在变性的非还原性4-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶上，对3μg的每种最终纯化的分子进行SDS-PAGE分析。对20μg的每种最终纯化的分子进行HPLC尺寸排阻色谱分析，其如下运行：在菲罗门SEC 3000柱(7.8x 300mm)(菲罗门公司，托伦斯，加利福尼亚州，美国)上，在50mMNaH2PO4、250mM NaCl、pH 6.9中以1mL/min，在280nm处观察吸光度。

抗CB1 TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白的纯化

通常如下纯化抗CB1 TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白。

首先使用将1mL MabSelect SuRe(MSS)HiTrap(通用医疗集团(GE HealthcareLife Sciences))作为第一柱、并且将5mL Desalting HiTrap(通用医疗集团(GEHealthcare Life Sciences))作为第二柱的AKTA纯化器(通用(GE)医疗集团(GEHealthcare Life Sciences),小查尔方特(Little Chalfont),白金汉郡(Buckinghamshire),英国)串联液相色谱系统从细胞培养基中纯化融合蛋白。将培养基直接加载到MSS柱上，用8个柱体积(CV)的25mM Tris-HCl、100mM NaCl(pH 7.4)进行洗涤，并且用2CV的100mM乙酸进行洗脱。将MSS柱洗脱液自动引入脱盐柱中，在其中通过4CV的10mM乙酸钠、150mM NaCl(pH 5.2)对蛋白质进行等度洗脱。再通过3.0μm玻璃纤维/0.2μm Supor膜(颇尔公司(Pall Corporation),华盛顿港(Port Washington),纽约,美国)对样品进行过滤灭菌。使用NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，罗克福德，伊利诺伊州，美国)，通过在280nM(A280)处的UV吸光度确定每种纯化的分子的蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用MES运行缓冲液(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)，在变性的非还原性4％-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶上运行，对3μg的每种最终纯化的分子进行SDS-PAGE分析。对30μg的每种最终纯化的分子进行HPLC尺寸排阻色谱分析，其如下运行：在菲罗门SEC 3000柱(7.8x 300mm)(菲罗门公司，托伦斯，加利福尼亚州，美国)上，在50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、pH 6.9中以1mL/min，在280nm处观察吸光度。图3示出不带接头、带(G₄S)接头、带(G₄S)₂接头、带(G₄S)₃接头、或带(G₄S)₄接头的抗CB1 TTR抗体同二聚体融合蛋白的代表性HPLC SEC分析。

实例3：抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性

抗CB1 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性可通过CB1 cAMP测定获得。

稳定表达hCB1的CHO细胞(欧洲筛选公司(Euroscreen))在DMEM中生长，所述DMEM含有10％FBS、1％Pen/Strep/L-谷氨酰胺、25mM Hepes、0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、和400μg/ml G418。为了确定抗体活性，将细胞以10,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中的80μlDMEM中，所述DMEM包含0.5％FBS、1％Pen/Strep/L-谷氨酰胺、25mM Hepes、0.1mM NEAA、1mM丙酮酸钠、和400μg/ml G418。过夜孵育后，去除培养基，并替换以5μl新鲜培养基，随后是5μl培养基加15μM福司可林(EMD化学公司(EMD Chemicals)Cat#344273)和250pM CP55,940(TOCRIS公司Cat#0949)，随后是40μl的抗体(于10mM乙酸、150mM NaCl、pH 5.0中)。然后将细胞在37℃下孵育30分钟。然后吸出培养基，并按照制造商的方案使用DiscoverX XS+cAMP测定试剂盒(90-0075-03)测量cAMP水平。在珀金埃尔默ViewLux微孔板成像仪(PerkinElmer ViewLux Microplate Imager)上读板30秒。

测定结果如图4所示。TTR抗体同四聚体的EC₅₀优势比CB1亲本抗体高3.9倍。一些Fab使用电荷对突变，而另一些则不使用(参见实例2中图2的讨论)。这些结果证明，与亲本CB1 Ab相比，TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白改善了EC₅₀。有趣的是，抗CB1TTR抗体同二聚体的EC₅₀似乎不如CB1亲本抗体有利，其中随着接头长度的增加，EC₅₀变得更差。

实例4：抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆、表达和纯化

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆

通常如下克隆抗GITR TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白。构建体C74201(pSLX240p:天然::[hu抗<huGITR>9H6(D72(62)E)VH]::huIgG1z-N297G)；C143046(pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(S183E,N297G,E356K,D399K)VH]::TTR(C10A,K15A)；C143048(pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(S183K,N297G,K392D,K409D)VH]::TTR(C10A,K15A)；C137324(VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6 VL])和C73877(pTT5:天然::[hu抗<huGITR>9H6 VL]::huKLC)用作以下所述的所有构建体的模板。

[SEQ ID NO:18]₂–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR17：使用C74201作为模板，通过三步重叠PCR延伸将抗GITR MAb 9H6(具有N297G)的信号肽替换为VK1信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)，然后使用5'信号肽引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GACATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3’)和3’C末端重链/N末端TTR引物(GGT GCCCGT AGG GCC ACC CGG AGA CAG GGA GAG G)扩增最终PCR的产物以产生1450个碱基对的产物。PCR18：使用TTR(SEQ ID NO:1)作为模板，编码TTR的氨基末端的5’PCR引物(5’-GGC CCTACG GGC ACC G-3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物(5’-TCG CTA GCG CGG CCG CTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3’)组合。PCR18产生约400个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应17和18，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C143043:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(N297G)VH]::TTR(C10A,K15A)。

[SEQ ID NO:21]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR19：使用C74201作为模板，通过三步重叠PCR延伸将抗GITR MAb 9H6(C74201)的信号肽替换为VK1信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)，然后使用5'信号肽引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GACATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3’)和3’C末端重链/N末端TTR引物(5’-GCTCTC GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA CTG TAG G-3’)扩增最终PCR的产物以产生650个碱基对的产物。PCR20:使用C74201作为模板，编码羧基末端人重链恒定区的5’PCR引物(5’-CTCTAC TCC CTC GAG AGC GTG GTG ACC GTG CC-3’)与编码人重链恒定区的3’引物(5’-CCTCCT CCA CAA GAT TTG GGC TCA ACT TTC TTG TC-3’)组合。PCR20产生约130个碱基对的产物。PCR21：使用TTR3作为模板，编码TTR的氨基末端的5’PCR引物(5’-CAA ATC TTG TGG AGGAGG CCC TAC GGG CAC CG-3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的两个3’引物(5’-ATG GTG ATG GTG ACC GCC TTC CTT GGG ATT GGT GAC GAC A-3’)和(5’-ATC GCT AGC GCG GCC GCC TAG TGG TGA TGG TGA TGG TGA CC-3’)组合。PCR21产生约450个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应19、20和21，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C144132:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(S183E)scFab]::TTR(C10A,K15A)::G::G::6xHis(注意，出于纯化目的包含(His)₆标签)。

[SEQ ID NO:19]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR22：使用C74201作为模板，通过三步重叠PCR延伸将抗GITR MAb 9H6(C74201)的信号肽替换为VK1信号肽(MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC)，然后使用5'信号肽引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GACATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGG CT-3’)和3’C末端重链/N末端TTR引物(5’-TAGGTG CTT CCG TAC TGT TCC TCC CGG GGC TT-3’)扩增最终PCR的产物以产生990个碱基对的产物。PCR23：使用C143046作为模板，编码羧基末端人重链恒定区(CH3)的5’PCR引物(5’-CCT GAG CAG CGT CGT CAC CGT CCC-3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)的3’引物(5’-TAG GTG CTT CCG TAC TGT TCC TCC CGG GGC TT-3’)组合。PCR23产生约370个碱基对的产物。PCR24：使用TTR3作为模板，编码TTR的羧基末端区的5’PCR引物(5’-CAG TAC GGAAGC ACC TAC CGG GTG GTG TC-3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物(5’-TCG CTA GCG CGG CCG CTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3’)组合。PCR24产生约900个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应22、23和24，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C144127:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(N297G,E356K,D399K)VH]::TTR(C10A,K15A)。

SEQ ID NO:20如下组装。PCR25：使用C143048作为模板，编码信号肽的氨基末端的5’PCR引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTG GGGCT)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)的3’引物(5’-ACG GTG ACG ACG CTG CTC AGG CTGTAC AGG CCG CTG-3’)组合。PCR25产生约650个碱基对的产物。PCR26：使用C143048作为模板，编码羧基末端人重链恒定区(CH3)的5’PCR引物(5’-CCT GAG CAG CGT CGT CAC CGTCCC-3’)与编码羧基末端人重链恒定区(CH3)的3’引物(5’-TAG GTG CTT CCG TAC TGT TCCTCC CGG GGC TT-3’)组合。PCR26产生约370个碱基对的产物。PCR27：使用TTR3作为模板，编码TTR的羧基末端区的5’PCR引物(5’-CAG TAC GGA AGC ACC TAC CGG GTG GTG TC-3’)与编码TTR的羧基末端区、终止密码子和NotI限制性位点的3’引物(5’-TCG CTA GCG CGG CCGCTC ATT CCT TGG GAT TGG TGA CG-3’)组合。PCR27产生约900个碱基对的产物。凝胶分离PCR反应25、26和27，并在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C144130:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(N297G,K392D,K409D)VH]。

SEQ ID NO:25如下组装。PCR28：使用C137324作为模板，编码信号序列的氨基末端的5’PCR引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTGGGG CT)与编码羧基末端人轻链恒定区的3’引物(5’-TAT CGC TAG CGC GGC CGC-3’)组合。PCR28产生约800个碱基对的产物。凝胶分离PCR 28，并在凯杰公司柱上纯化。然后将所述片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C143044:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6 VL]。

SEQ ID NO:26如下组装。PCR29：使用C137324作为模板，编码信号序列的氨基末端的5’PCR引物(5’-GTC GAC TAG GCC ACC ATG GAC ATG AGG GTG CCC GCT CAG CTC CTGGGG CT)与编码羧基末端人轻链恒定区的3’引物(5’-TGG TGC AGC CAC CGT ACG TTT GATTTC CAC CTT GGT CC-3’)组合。PCR29产生约400个碱基对的产物。PCR30：使用C73877作为模板，编码羧基末端人轻链恒定区的5’PCR引物(5’-ACG GTG GCT GCA CCA TCT G-3’)与编码羧基末端人轻链恒定区的3’引物(5’-TAT CGC TAG CGC GGC CGC-3’)组合。凝胶分离PCR反应29和30，并在凯杰公司柱上纯化。然后将所述片段混合并使用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒连接到SalI和NotI消化的线性化哺乳动物表达载体pTT5d中。所得的构建体称为C143049:pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6(S176K)VL]。

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的表达

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白通常如下表达。

Freestyle F-17(目录号13835)，L-谷氨酰胺((目录号25030)、遗传霉素G418(目录号10131027，液体)获自生命科技公司(Life Technologies)。Kolliphor P 188(目录号K4894)获自西格玛奥德里奇公司。Difco TC Yeastolate UF(目录号292805)获自BD生物科学公司。PEI Max(目录号24765-2)获自聚科学公司(Polysciences)。将HEK 293 6E细胞在悬浮液中在平台振荡器上在加湿的37℃的5％CO₂培养箱中以120RPM旋转生长。细胞培养传代培养基是FreeStyle F-17+0.1％(10mL/L的10％)Kolliphor P188+500uL/L G418+6mM(30mL/L)L-谷氨酰胺。转染前1-2天传代细胞，以使转染时的细胞密度约为1.5e⁶ VC/mL。将转染复合体在不含补充剂的Freestyle F17培养基中以最终培养物体积的10％的体积混合。每mL培养物将0.5μg DNA添加到Freestyle F17培养基中；然后每mL培养物中添加1.5μlPEImax试剂。混合培养物并在室温下孵育10分钟，然后添加到细胞培养物中。然后将培养瓶返回培养箱中的振荡器平台。转染后1-4小时，每mL培养物中添加25μL Yeastolate溶液。然后在转染后第6天收获条件化的培养基。

抗GITR TTR抗体同二聚体可替代地如下表达。用相应的cDNA瞬时转染HEK293细胞。在FreeStyle F17培养基(生命科技公司)中，将1.0x10⁶个细胞/mL的悬浮HEK 293-6E细胞用0.5mg/L DNA(pTT5d载体中的0.25mg/L hu抗<huGITR>9H6(N297G)VH]::TTR(C10A，K15A)和pTT5d载体中的0.25mg/L hu抗<huGITR>9H6VL)(Durocher等人,NRCC,NucleicAcids.Res.[核酸研究](2002)30,e9)(具有4mg PEI(聚科学公司))至1mg DNA进行转染，并在摇瓶中以150RPM于36℃孵育。转染后4小时，将用于最后0.5％的转染的Yeastolate(BD生物科学公司)添加到培养物中。使细胞在FreeStyle F17培养基(补充有0.1％普朗尼克F68和50μg/ml遗传霉素)中的悬浮液中生长6天，并收获用于纯化。

使用4％-20％SDS-PAGE和快速蓝染(Quick Blue Stain)凝胶分析条件化的培养基。图5显示抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白可以在HEK 293细胞中表达。抗GITR TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体的表达最稳健。泳道1是10.3mg抗GITR TTR抗体同二聚体(356KDa)；泳道2是29.3mg抗GITR TTR抗体同四聚体(656KDa)；泳道3是143.6mg抗GITR TTR Fab同四聚体(256KDa)；泳道4是100ng抗DNP抗体；泳道5是250ng抗DNP抗体；泳道6是500ng抗DNP抗体；并且泳道7是1000ng抗DNP抗体。抗DNP抗体提供未缀合的抗体在此测定中表现如何的信息。将非还原性上样缓冲液中的10μl蛋白添加到每个泳道中。凝胶在不加热情况下运行。

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的纯化和表征

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白通常如下纯化和表征。

使用具有两个顺序连接的1mL r蛋白A琼脂糖快流(rProtein A Sepharose FastFlow，ProA FF)HiTrap(通用医疗集团)柱的AKTA纯化器(通用医疗集团)液相色谱系统从细胞培养基中纯化抗GITR TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白。将培养基直接上样到ProA FF柱上，然后用5CV的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(生命科技公司)洗涤，并用8CV的100mM乙酸洗脱。使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将纯化的样品用2L的10mM乙酸钠、9％蔗糖，pH 5.2透析两次。

使用AKTA纯化器液相色谱系统(具有5mL HisTrap excel HiTrap(通用医疗集团)柱)从细胞培养基中纯化TTR Fab同四聚体融合蛋白。将培养基直接上样到HisTrap柱上，然后用20CV的20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、10mM咪唑、pH 7.4洗涤，并用从10mM到500mM梯度的20CV咪唑洗脱。在相同的上述条件下对流出级分进行重新纯化，除了采用8CV 20mMNaH2PO4、0.5M NaCl、500mM咪唑、pH 7.4的步骤洗脱而不是梯度洗脱(由于在之前的方法中缺乏色谱分离)。使用10kDa MWCO滑动式分析仪将纯化的样品用2L的10mM乙酸钠、9％蔗糖，pH 5.2透析两次。

使用NanoDrop 2000(赛默飞世尔科技公司，洛克福德，伊利诺斯州，美国)通过在280nM(A280)的UV吸光度确定抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的蛋白质浓度。

根据制造商的说明，使用MES运行缓冲液(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)，在变性的非还原性4％-12％Bis-Tris NuPAGE凝胶上运行SDS-PAGE分析(对抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、和TTR Fab同四聚体融合蛋白中每种的3μg进行)。参见图6。泳道1和4是抗GITR TTR抗体同二聚体；泳道2和5是抗GITR TTR抗体同四聚体；泳道3和6是抗GITR TTR Fab同四聚体。图6显示了所有三种蛋白质融合构建体的部分纯化的产物均基于未加热的非还原性泳道正确组装。在加热和还原后，这三种蛋白融合构建体分解为它们的预期的组成链(上部条带是重链，最低条带是轻链)。

对抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白中的每一者的30μg进行HPLC尺寸排阻色谱分析。色谱法使用菲罗门SEC 3000柱(7.8x 300mm)(菲罗门公司，托伦斯，加利福尼亚州，美国)(在50mM NaH₂PO₄、250mM NaCl、pH 6.9中，以1mL/min)，在280nm处观察吸光度。

抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白通过还原性LCMS分析进行了分析。在8M胍HCl/TRIS(pH 8.0，天惠华公司(Teknova),霍利斯特,加利福尼亚州)中对20μg材料进行变性，并使用10mM DTT(EMD密理博公司(EMD Millipore),达姆施塔特,德国)在50℃下还原20分钟。用三氟乙酸酸化样品，并使用安捷伦(Agilent)1260HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，圣塔克拉拉，加拿大)在Zorbax反相C8色谱柱上注入10μg。将柱流出物引入到安捷伦6230ESI-TOF质谱仪(安捷伦科技公司，圣塔克拉拉，加利福尼亚州)的电喷雾源中，并收集质谱。在安捷伦MassHunter软件包内，使用MaxEnt算法对相关的质谱进行去卷积。再将所得LC和HC的质谱与每个链的理论计算质量进行比较。

在320mL Superdex 200(通用医疗集团)上，用1.4CV的10mM乙酸钠、150mM NaCl、pH 5.0，对纯化的抗GITR TTR抗体同二聚体进一步等度纯化(以除去随时间累积的聚集物)。通过HPLC-SEC纯度选择级分以池化。将Superdex池使用VivaSpin10kDa MWCO离心过滤装置(赛多利斯公司(Sartorius))进行浓缩，然后通过0.2μm Supor注射器过滤器(颇尔公司(Pall))进行无菌过滤。HPLC尺寸排阻色谱分析是如下进行：在Sepax Zenix-C、7.8x300mm柱(赛芬公司(Sepax)，纽瓦克，特拉华州，美国)上，在50mM NaH2PO4、250mM NaCl、pH6.9中以1mL/min，在280nm处观察吸光度。

图7示出抗GITR TTR抗体同二聚体(中间峰)、TTR抗体同四聚体(左峰)、和TTR Fab同四聚体(右峰)融合蛋白中的每者的HPLC尺寸排阻色谱(SEC)分析的结果。SEC色谱图显示，主峰在与正确组装的分子一致的预期位置处洗脱。而且，非变性SEC纯化(与SDS-PAGE不同)支持融合蛋白不聚集的观点。

对再纯化的抗GITR TTR抗体同二聚体进行了还原性LCMS再分析。在Speed-Vac中干燥约10μg抗GITR TTR抗体同二聚体，然后重悬浮于pH 8.0、具有20mM DTT的8M Gu-HCl的20μL溶液中。将样品在37℃下孵育1小时，以将每个样品还原为单独的蛋白质链组分。然后通过添加0.1％TFA将每个还原的样品酸化。对于LC-MS，将约5μg的还原样品注射到安捷伦科技1100毛细管HPLC上，并喷到安捷伦科技6224ESI-TOF质谱仪中。毛细管HPLC使用1.0mmX 50mm安捷伦Zorbax 300SBC8柱，流速是50μL/min，柱温度是75℃。HPLC使用以下缓冲液：缓冲液A-0.1％TFA/H2O；缓冲液B-0.1％TFA/H2O/90％正丙醇。梯度由以下组成：初始条件是2％B，持续5分钟；经20分钟斜升达到45％B；经3分钟达到95％B；在95％B等度，持续4分钟；然后经1分钟回落至2％B。ESI-TOF仪器的MS方法以1光谱/秒的速率扫描m/z[750-6000]。其他MS仪器参数包括毛细管电压(VCap)＝3200V，碎裂电压＝225V，分离器(skimmer)＝60V和OCT 1RF Vpp＝800V。为了对LC-MS数据进行数据分析，使用安捷伦MassHunter软件对每个蛋白质链的适当LC-MS光谱进行合并和去卷积。去卷积的输出质量范围是[15,000-75,000]，其中质量步长是1.0Da，并且信/噪(S/N)阈值是30.0。对于每个样品，观察到正确的还原链质量。在抗GITR TTR抗体同二聚体重链中观察到微量的Asp-Pro切割，这是使用75℃的分析温度的结果。

在马尔文微量热仪VP-毛细管DSC上进行抗GITR TTR亲本mAb 9H6(“1”)、抗GITRTTR抗体同二聚体(“4”)、TTR抗体同四聚体(“2”)和TTR Fab同四聚体(“3”)融合蛋白的差示扫描量热法(DSC)。参见图8.使用以下参数：扫描范围：10-100℃；扫描速度：1℃/min；预扫描恒温器15分钟。每次分析通常消耗400μL的1mg/mL样品。数据在Origin 7软件中处理。分析的蛋白质在HEK 293-6E细胞中表达。尽管亲本Ab(“1”)被糖基化，但是TTR融合体是N297Ga-糖基变体。图8中的结果显示，TTR融合蛋白的解链温度与亲本Ab相当或更好，表明所形成的TTR融合蛋白是稳健的。预期的热诱导的转变顺序是CH2、Fab、CH3。

实例5：抗GITR TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性和PK谱

评估了亲本抗GITR mAb、抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体和抗GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性和PK谱。

活性评估

亲本抗GITR mAb、抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体和抗GITRTTR Fab同四聚体融合蛋白的结合和效力活性经由以下测定进行评估。这些测定的结果如图10所示。

在交联情况下的测定。用抗CD3 Ab(OKT3)和交联剂Ab(山羊抗人IgG Fc交叉吸附Ab(赛默飞世尔公司31125)或山羊抗人IgG(H+L)(皮尔斯公司31119))，分别以1μg/ml和0.3μg/ml，对96孔高结合板(康宁公司3369)在4℃下进行包被过夜。第二天，将Ab洗出，并且将抗GITR mAb、抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体、抗GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白TTR或同种型对照mAb加入板中以在37℃下捕获1小时。孵育后，将板洗净，并且将原初T细胞添加到孔中(在补充有10％FBS、2mM L-Glut、10mM HEPES、1mM NaPyr、0.1mMNEAA和50μM 2ME的RPMI1640中为50K/孔)并培养4天。使用CellTiterGlo(普洛麦格公司(Promega))测量增殖。

在没有交联的情况下的测定。将96孔高结合板(康宁公司(Corning)3369)在4℃下用1μg/ml的抗CD3 Ab包被过夜。第二天，将抗CD3 Ab洗出，并将抗GITR mAb、抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体、抗GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白TTR、或同种型对照mAb添加到板中，然后添加原初T细胞(在补充有10％FBS、2mM L-Glut、10mM HEPES、1mMNaPyr、0.1mM NEAA、和50μM2ME的RPMI1640中50K/孔)。培养4天后，使用CellTiterGlo(普洛麦格公司)测量增殖。

PK谱评估

通过在雄性CD-1小鼠(n＝3/组)中静脉内注射在8.75mg/kg的抗GITR TTR抗体同四聚体、4.75mg/kg的抗GITR TTR抗体同二聚体、3.4mg/kg的抗GITR TTR Fab同四聚体、和2mg/kg抗GITR抗体处归一化的摩尔当量来确定PK谱。在给药后0.5、2、8、24、48、72、96、168、336、504、672和840小时处从75μl血液样品中收集血清样品。采集后将每个血液样品保持在室温下，并在30-40分钟的凝结期后，使用校准的Eppendorf 5417R离心系统(布林克曼仪器公司(Brinkmann Instruments,Inc.)，韦斯特伯利，纽约州)在2-8℃以11,500RPM离心约10分钟。然后将收集的血清转移到预先标记的(对于每只大鼠)低温存储管中，并在-60℃至-80℃下存储，以备将来进行生物分析。

通过中尺度发现公司(MSD)测定，以下PK测定用于在小鼠血清中测量亲本抗GITRmAb、抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体、和抗GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白的总抗GITR种类(即，存在的任何抗GITR结合种类)。常规的结合性96孔MSD板(中尺度发现公司(Meso Scale Discovery)，盖瑟斯堡(Gaithersburg)，马里兰州)用在PBS中的2μg/ml的小鼠抗独特型抗GITR抗体、Mab 1.2.1(美商安进公司(Amgen Inc.)，千橡市，加利福尼亚州)包被并且然后在4℃孵育过夜。然后将板洗涤并用I-Block^TM(生命科技公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)在4℃下封闭过夜。在小鼠血清中制备标准品和质量对照(QC)，如果需要稀释，可在原初CD-1小鼠血清中稀释PK样品。然后将标准品、QC和样品在含有PBS、1M NaCl、0.5％Tween 20和1％牛血清白蛋白的缓冲液中以1:20稀释。用约200μl的1X KPL缓冲液(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州)将板洗涤3次，然后将稀释的标准品、QC和样品的50μl样本转移到Mab 1.2.1抗体包被的板中，并室温(大约25℃)孵育1.5小时。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板3次，然后添加缀合生物素的50μl的250ng/ml的小鼠抗独特型抗GITR抗体，Mab 1.1.1，并孵育1.5小时。用1X KPL洗涤缓冲液洗涤板3次后，添加缀合MSDSULFO-标签(美商安进公司)的50μl的100ng/ml的链霉亲和素并孵育或15分钟。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板六次，然后添加150μl 1x读取缓冲液T(中尺度发现公司)，并使用MSD 6000读板器(中尺度发现公司)测量电化学发光信号。使用

(Phoenix64，版本6.4.0.768，药物视野公司(Pharsight Corp.)山景城(Mountain View)，加利福尼亚州)的非隔室方法分析血清浓度数据。

通过小鼠血清样品的MSD测定，采用以下PK测定来测量小鼠血清中抗GITR TTR抗体同二聚体、抗GITR TTR抗体同四聚体和抗GITR TTR Fab同四聚体融合蛋白中的抗GITRTTR结合种类和TTR种类的存在。常规的结合性96孔MSD板(中尺度发现公司，盖瑟斯堡，马里兰州)用在PBS中的2μg/ml的兔抗TTR多克隆抗体(美商安进公司(Amgen Inc.)，千橡市，加利福尼亚州)包被并且然后在4℃孵育过夜。然后将板洗涤并用I-BlockTM(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在4℃下封闭过夜。在小鼠血清中制备标准品和质量对照(QC)，如果需要稀释，可在原初CD-1小鼠血清中稀释PK样品。然后将标准品、QC和样品在含有PBS、1M NaCl、0.5％Tween 20和1％牛血清白蛋白缓冲液的缓冲液中以1:20稀释。用约200μl的1X KPL缓冲液(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州)将板洗涤3次，然后将稀释的标准品、QC和样品的50μl样本转移到抗TTR抗体包被的板中，并室温孵育1.5小时。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板3次，然后添加缀合生物素的50μl的250ng/ml的小鼠抗独特型抗GITR抗体，Mab1.1.1，并孵育1.5小时。用1X KPL洗涤缓冲液洗涤板3次后，添加缀合MSD SULFO-标签(美商安进公司)的50μl的100ng/ml的链霉亲和素并孵育或15分钟。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板六次，然后添加150μl 1x读取缓冲液T(中尺度发现公司)，并使用MSD 6000读板器(中尺度发现公司)测量电化学发光信号。使用

(Phoenix 64，版本6.4.0.768，药物视野公司(Pharsight Corp.)山景城(Mountain View)，加利福尼亚州)的非隔室方法分析血清浓度数据。

PK分析的结果可以在图9中找到。如图9a)所示(测量任何抗GITR结合种类的存在)：[1]抗GITR TTR抗体同二聚体(“1”)的PK比亲本Ab(“2”)的PK更理想；[2]抗GITR TTRFab同四聚体(“4”)的PK不太理想，并且这可能归因于Fab缺乏Fc区并且因此缺乏介导/延长其半衰期的能力；[3]抗GITR TTR抗体同四聚体(“3”)的PK尽管不如亲本mAb稳健，但与Fab相比，其显示出显著增强的PK。图9b)(测量抗GITR结合种类和TTR种类的存在)显示，完整的抗GITR TTR融合蛋白的PK与图9a)中观察到的一致，这表明体内蛋白水解不能从每个TTR融合蛋白中释放出抗GITR结合部分。

如图10所示，亲本抗GITR mAb 9H6的多聚化(经由TTR融合)改善结合力，但不改善效力。已知GITR的激活阻止了调节性T细胞的抑制。还已知抗GITR抗体介导的细胞增殖、细胞因子产生和CD4+Th9细胞的诱导需要聚簇和FcγR结合。图10a)表明抗GITR TTR抗体同二聚体(“3”)、TTR抗体同四聚体(“4”)和TTR Fab同四聚体(“2”)融合蛋白的结合亲和力比亲本抗GITR mAb 9H6(“1”)更理想。值得注意的是，在基于细胞的测定中，较高的亲和力并未转化为较高的效力，如图10b)所示。图10b)中的对照Ab是抗GITR mAb的非结合对照版本。

图9a和9b中数据的比较表明，几乎不存在TTR构建体的部分分子降解。

实例6：抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆、表达和纯化

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的克隆

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白通常如下克隆。在这些实验中，抗TRAILR2抗体是考那妥木单抗(AMG 655)，标签抗TRAILR2Fab是考那妥木单抗的Fab部分。

GITR TTR表达质粒(参见实例4)用作构建这些抗TRAILR2 TTR融合体的模板。构建体C36606(pTT5:天然::[hu抗<huTRAILR2>XG1048(W)VH]::huIgG1(f))和C9448(VK3_A27L::[hu抗<huTRAILR2>XG1048 VL]::huKLC)是分别用于抗TRAILR2重链和轻链可变区序列的模板。在这些实验中，抗TRAILR2抗体是考那妥木单抗(AMG 655)。由于抗TRAILR2序列模板没有VK1(VK1O2O12)信号肽，因此发现pSLX240puro、pSLX240hygro和pSLX240neo构建体包含在信号肽序列的羧基末端带有BssHII位点的VK1。

[SEQ ID NO:31]₂–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。PCR31：使用C36606作为模板，编码重链序列的氨基末端和VK1(VK1O1O12)信号序列的5’PCR引物(5’-CTG CTG TGG CTG AGAGGT GCG CGC TGT CAG GTG CAG CTG CAG GAG-3’)与设计用于扩增抗TRAILR2可变重链区的3’引物(5’-GCT GAG GAG ACG GTG ACC GT-3’)组合。PCR31产生395个碱基对的产物。PCR32：使用C-143043作为模板，编码重链恒定区的氨基末端和抗TRAILR2可变重链的最后18个碱基的5’引物(5’-GGT CAC CGT CTC CTC AGC TAG CAC CAA GGG CCC A-3’)与编码TTR的羧基末端、终止密码子、NotI位点和编码线性化pSLX240p质粒氨基末端的18个碱基突出端的3’引物(5’-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAT TCC TTG GGA TTG GTG ACG-3’)组合。PCR 32产生1390个碱基的产物。PCR反应31和32在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(Geneart无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240p:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150225:pSLX240p:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG 655VH]::IgG1z_SEFL(desK)::TTR(C10A,K15A)。

SEQ ID NO:38如下组装。PCR33：使用C9448作为模板，编码抗TRAILR2轻链可变区的氨基末端和信号序列的5’PCR引物(5’-CTG CTG TGG CTG AGA GGT GCG CGC TGT GAAATT GTG TTG ACG CAG-3’)与3’引物(5’-AGC CAC CGT TCG TTT GAT TTC CAC CTT-3’)组合扩增抗TRAILR2轻链可变区以产生363个碱基对的产物。PCR34，使用C-143044(pTT5d:VK1O2O12::[hu抗<huGITR>9H6 VL])作为模板，编码κ轻链恒定区的氨基末端和抗TRAILR2可变区的最后9个碱基的5’引物(5’-ATC AAA CGA ACG GTG GCT GCA CCA TCT-3’)与编码人κ轻链恒定区的羧基末端、终止密码子和NotI限制酶的3’引物(5’-TGT TTA AAC GAT ATCGCT AGC GCG GCC GCC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG-3’)组合。PCR34产生约330个碱基对的产物。PCR反应33和34在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(Geneart无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240h:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150226:pSLX240h:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG655 VL]::huKLC。

[SEQ ID NO:32]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。如上所述使用PCR 31。PCR35：使用C-144127作为模板，编码重链恒定区的氨基末端和抗TRAILR2重链可变区的最后18个碱基的5’引物(5’-GGT CAC CGT CTC CTC AGC CTC CAC CAA GGG CCC C-3’)与编码TTR的羧基末端的3’引物(5’-TTAAACGATATCGCTAGCGCGGCCGCTCATTCCTTGGGATTGGTGACG-3’)组合产生约1390个碱基对的产物。PCR反应31和35在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(Geneart无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240p:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150227:pSLX240p:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG 655VH]::IgG1z(N297G,KK)::TTR(C10A,K15A)。

SEQ ID NO:33如下组装。如上所述使用PCR31。PCR36：使用C-144130作为模板，5’引物(5’–GGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCC-3’)与编码重链恒定区的羧基末端、终止密码子和NotI位点的3’引物(5’-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CCC GGGGAG AGG CTC A-3’)组合产生约1kb大小的产物。PCR反应31和36在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(GeneArt无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240n:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150228:pSLX240n:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG 655VH]::IgG1z(N297G,DD)。

[SEQ ID NO:34]₄–[SEQ ID NO:1]₄的组装如下。如上所述使用PCR31。PCR37：使用C144132作为模板，5’引物(5’-GGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCA-3’)与编码6xHis、终止密码子和NotI位点的3’引物(5’-TTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCC TAG TGGTGA TGG TGA TGG TGA CC-3’)组合产生约740个碱基对的产物。PCR反应31和37在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(Geneart无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240p:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150237:pSLX240p:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG 655(S183E)scFab]::G2::TTR(C10A,K15A)::G2::6xHis(注意，出于纯化目的包含(His)₆标签)。

SEQ ID NO:39如下组装。如上所述使用PCR33。PCR38：使用C-143049作为模板，5’引物(6186-65)与编码κ轻链恒定区的羧基末端、终止密码子和NotI位点的3’引物(5’-TGTTTA AAC GAT ATC GCT AGC GCG GCC GCT CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3’)组合产生约330个碱基对的产物。PCR反应33和38在凯杰公司柱上纯化。然后将这些片段与在连接无关的克隆反应(Geneart无缝克隆和组装试剂盒)中在BssHII和NotI位点线性化的pSLX240h:VK1质粒组合。所得的构建体称为C-150238:pSLX240h:VK1O2O12::[hu抗<huTRAILR2>AMG655VL]::huKLC-S176K。

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的表达

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白通常如下表达。

TTR融合蛋白在悬浮液适应的CHO-K1细胞中稳定表达。已根据制造商的方案使用Lipofectamine LTX(英杰^TM(Invitrogen^TM))进行转染。共使用30μg-36μg的哺乳动物表达质粒DNA，对于抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR Fab同四聚体以1:1比例(1HC或Fab-HC比1Lc)，或对于TTR抗体同四聚体以1:1:1比例(1HC+比1HC-比1LC)。在每种情况下，都将质粒DNA添加到3-4ml OPTI-MEM(Gibco公司)中并且进行混合。在一个单独的试管中，将72-75μlLipofectamine LTX添加到3-4ml OPTI-MEM中。将溶液在室温下孵育5分钟。为形成转染复合物，将每个试管的DNA和Lipofectamine LTX混合物合并，并且在室温下另外孵育20分钟。通过离心(1200-1500RPM下进行5分钟)，将对数期CHO-K1细胞沉淀，用1X PBS(Gibco公司)洗涤一次，并且然后在OPTI-MEM中再悬浮至1.5-2e⁶个活细胞/mL。对于每次转染，将5-6mL的洗涤过的细胞添加到125mL容量的摇瓶中。对于每次将DNA转染复合体添加到细胞中。在36℃、5％CO₂下孵育摇瓶，以150RPM振荡6小时。为了停止转染，在每个烧瓶中添加9-12ml生长培养基，并且孵育48-72小时。

为了开始选择，在转染后72小时通过离心(1200-1500RPM下进行5分钟)对细胞进行沉淀，并且然后将培养基替换为补充有抗生素的23-25mL生长培养基。选择培养基每周更换2-3次，在需要时稀释培养物以确保培养物不会过度生长(<5-6e⁶vc/mL)，直到细胞活力和密度恢复。

在36℃在摇瓶中进行大规模生产(2.3L-2.5L)。在生产培养基中以2e⁶ vc/mL的浓度对生产进行接种。通过离心在第5天收获条件化的培养基，随后进行过滤(0.45μm)。

如图11所示，抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白表达良好并正确组装(参见图11a)。图11b)显示在加热和还原后存在预期的融合蛋白组分。每个泳道上样5μl条件培养基，并在4％-20％TG凝胶上运行。如图11a)所示，抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR Fab四聚体以大于标准抗体的复合体的形式在SDS-PAGE上迁移，如对完全组装的复合体所预期的那样。如图11b)所示，抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR Fab同四聚体在还原性SDS-PAGE上迁移，如对具有重链(上部条带)和游离轻链(下部条带)的融合分子所预期的那样。

如图12所示，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体在CHO-K1细胞中表达良好(约150mg/L)并正确组装(参见图12a)，上部条带)。图12b)示出，在加热后同四聚体复合体分解成它们的预期组分，而图12c)示出，在加热和还原后同四聚体复合体分解成它们的预期组分。每个泳道上样2-5μl条件培养基，并在4％-20％TG凝胶上运行。

图13示出，抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、和抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体正确组装，并且在加热和还原后分子分解成其预期的组分链(一条或多条上部条带是重链，并且最低条带是轻链)。图13显示可以用多种抗体产生TTR构建体。

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的纯化和表征

通常如下纯化抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白。使用具有两个顺序连接的5mL ProA FF HiTrap(通用医疗集团)柱的AKTA纯化器(通用医疗集团)液相色谱系统从细胞培养基中纯化分子。将培养基直接上样到ProA FF柱上，然后用5CV的DPBS(生命科技公司)洗涤，并用8CV的50mM乙酸，pH 3.2洗脱。用2M Tris-HCl，pH 9.2将ProA FF洗脱池滴定至pH 5.0，然后用9个体积的无菌水稀释。使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将条件化的ProA FF池用2L的20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.0透析两次。透析池在18mL SP琼脂糖高性能(SP HP)(通用医疗集团)柱上纯化，其中使用20mMNaH2PO4、pH 7.0的5CV洗涤，并使用从0mM到500mM的20CV NaCl梯度洗脱。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC纯度选择级分用于池化。使用VivaSpin 10kDa MWCO离心过滤组件(赛多利斯公司，哥廷根，德国)浓缩SP HP池，并且然后在320mL Superdex200(通用医疗集团)上用1.4CV的20mM HEPES、300mM NaCl、pH 7.0进行等度纯化。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC纯度选择级分用于池化。使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将SP HP池用2L的10mMMES，150mM NaCl，pH 7.0透析两次。透析后的样品使用VivaSpin 10kDa MWCO离心过滤装置(赛多利斯公司(Sartorius))进行浓缩，然后通过0.2μm Supor注射器过滤器(颇尔公司(Pall))进行无菌过滤。

抗TRAILR2 Fab同四聚体融合蛋白通常如下纯化。使用带有50mL Ni Sepharoseexcel(Ni excel)(通用医疗集团)柱的AKTA纯化器(通用医疗集团)液相色谱系统从细胞培养基中纯化分子。将培养基直接上样到HisTrap柱上，然后用10CV的20mM NaH₂PO₄，0.5MNaCl，10mM咪唑，pH 7.4洗涤，并用10mM至500mM的8CV咪唑梯度洗脱。使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将Ni excel池用2L的20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.0透析两次。透析池在18mL SP琼脂糖高性能(SP HP)(通用医疗集团)柱上纯化，其中使用20mMNaH2PO4、pH 7.0的5CV洗涤，并使用从0mM到500mM的20CV NaCl梯度洗脱。通过SDS-PAGE和HPLC-SEC纯度选择级分用于池化。使用10kDa MWCO滑动式分析仪(赛默飞世尔科技公司)将SP HP池用2L的10mM MES，150mM NaCl，pH 7.0透析两次。透析后的样品使用VivaSpin10kDa MWCO离心过滤装置(赛多利斯公司)进行浓缩，然后通过0.2μm Supor注射器过滤器(颇尔公司)进行无菌过滤。使用NanoDrop2000(赛默飞世尔科技公司，罗克福德，伊利诺伊州，美国)，通过在280nM(A280)处的UV吸光度确定蛋白质浓度。根据制造商的说明，使用MES运行缓冲液(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)，通过变性的非还原性4％–12％Bis-Tris NuPAGE凝胶对样品进行分析。如下对样品进行分析：在菲罗门SEC 3000柱(7.8x 300mm)(菲罗门公司，托伦斯，加利福尼亚州，美国)上，在50mM NaH2PO4，250mMNaCl，pH 6.9中以1mL/min，在280nm处观察吸光度。

图14显示了抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(中间色谱图)、TTR抗体同四聚体(右色谱图)和TTR Fab同四聚体(左色谱图)融合蛋白中的每者的HPLC尺寸排阻色谱(SEC)分析结果。SEC色谱图显示，主峰在与正确组装的分子一致的预期位置处洗脱。

对TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白进行了还原性LC/MS分析。将样品进行缓冲液交换到200mM醋酸铵中，并且制成5μM，作为用于天然MS研究的最终MS工作溶液。样品也在8M盐酸胍中变性，并在20mM DDT中还原，用于LC-MS分析。然后将2μg的材料注入LC-MS系统。

使用改良的Synapt G1 HDMS仪器(在正纳流ESI模式下运行)在RF限制漂移管上进行抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、和TTR Fab同四聚体融合蛋白的天然MS和离子迁移率分析。临界仪器电压和压力如下：毛细管电压0.8kV至1.0kV；样品锥孔40V，提取锥孔1V；源块温度30℃；阱碰撞能量4.0V；传输碰撞能量60V至200V，相当于施加在RF限制漂移室上的3.3V至11.1V/cm；阱入口3.0V；阱偏压16V(N2；使用N2操作时，需要增加电势才能将离子注入漂移室中)；IMS DC入口5.0V；IMS DC出口0.0V；传输DC入口0.0V；传输DC出口2.0V；传输波速度70m/sec；传输波幅度4.0V；迁移率捕获释放时间250μsec；阱高度20.0V；提取高度0.0V；源RF幅度(峰到峰)450V；三波RF幅度(峰到峰)，阱380V，IMS 150V，传输380V；源背压6.0mbar；阱/传输压力SF6，3.3e^-2mbar(指示皮拉尼规；流速3.0mL/min)；IMS压力N2 2.05mbar(1.54托；流速38mL/min)；IMS压力He 2.70mbar(2.03托；流速70mL/min)。使用MKS Baratron 626型电容压力计(量程为10托；精确到0.25％)和MKS PDR2000电源，可以精确测量RF限制漂移室内的压力。使用奥可通(Oakton)Temp10T热电偶测量环境温度。在将电容压力计连接到仪器离子光学镜盖的位置测量温度。通过MassLynx 4.1SCN 639，SCN744进行仪器控制和数据采集。通过准确地测量漂移室装置内的压力和漂移室的环境温度，并在不同的漂移室电压(60V至200V)下进行多达10次迁移率测量，得出迁移率以及Ω值。每次采集均进行单独的温度和压力测量，并且对于最终的Ω值计算，使用平均温度和压力值。在10分钟内，典型的温度和压力变化为≤0.2℃和≤0.002托。

通过将2μg变性和还原的蛋白质直接注射到在45℃和400μL/mi流速下操作的C4BEH 2.1x 50mm分析柱上，对抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白进行变性LC-MS分析。MS检测是在沃特斯XevoQ-ToF质谱仪上进行的。样品锥孔和提取锥孔分别设置为35V和1V。

质谱和离子迁移率结果：抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体：天然-MS测量的MW是645.9kDa，并且离子迁移率测量的N2-CCS值是190.1nm2，并且变性和还原的亚基MW为23,388Da、49,180Da和62,872Da。抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白：天然-MS测量的MW是250.5kDa，并且离子迁移率测量的N2-CCS值是130.3nm2，并且变性和还原的亚基MW是23,429Da和38,582Da。抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体融合蛋白天然-MS测量的MW是347.2kDa，并且离子迁移率测量的N2-CCS值是124.0nm2，并且变性和还原的亚基MW是23,391Da和62,867Da。

抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的SEC多角度光散射(MALS)在配备怀雅特(Wyatt)Heleos II和OptiLab-TrEX检测器的安捷伦1100HPLC上进行。使用的柱是Superdex 200(10/300GL)。流动相是2X PBS，流速是0.4ml/min。每个样品的运行时间是70分钟。抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体和TTR抗体同四聚体融合蛋白的四个SP级分(A3、A8、A12和C1)的注射量分别是81μg、63μg、75μg和75μg，而抗TRAILR2-TTR的最终池的注射量是77ug。运行设置、数据收集和分析程序在安捷伦的Chemstation(v B.04.02 96)和怀雅特的ASTRA(v 6.1.1.17)软件上进行。

实例7：抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体和TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性和PK谱

评估了亲本抗TRAILR2 mAb(考那妥木单抗)、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性和PK谱。

PK谱

通过在雄性CD-1小鼠(n＝3/组)中静脉内注射在6.5mg/kg的TTR抗体同四聚体、3.5mg/kg的TTR抗体同二聚体、2.5mg/kg的TTR Fab同四聚体、和1.5mg/kg的考那妥木单抗与考那妥木单抗341-G1(考那妥木单抗341-G1是经工程化以不再结合TRAILR2的Ab)抗体处归一化的摩尔当量来确定抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、TTR抗体同四聚体、和TTR Fab同四聚体融合蛋白的PK谱。在给药后0.5、2、8、24、48、72、96、192、336、504、672和840小时处从75μl血液样品中收集血清样品。采集后将每个血液样品保持在室温下，并在30-40分钟的凝结期后，使用校准的Eppendorf 5417R离心系统(布林克曼仪器公司，韦斯特伯利，纽约州)在2-8℃以11,500rpm离心约10分钟。然后将收集的血清转移到预先标记的(对于每只大鼠)低温存储管中，并在-60℃至-80℃下存储，以备将来进行生物分析。

通过中尺度发现公司(MSD)测定，以下PK测定用于在小鼠血清中测量考那妥木单抗、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体、和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白的总抗TRAILR2种类(即，存在的任何抗TRAILR2结合种类)。为了在小鼠血清样品中测量考那妥木单抗的总量，将常规的结合性96孔MSD板(中尺度发现公司，盖瑟斯堡，马里兰州)用在PBS中的2μg/ml的兔抗考那妥木单抗多克隆抗体(美商安进公司(AmgenInc.)，千橡市，加利福尼亚州)包被并且然后在4℃孵育过夜。然后将板洗涤并用I-Block^TM(生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)在4℃下封闭过夜。在小鼠血清中制备标准品和质量对照(QC)，如果需要稀释，可在原初CD-1小鼠血清中稀释PK样品。然后将标准品、QC和样品在含有PBS、1M NaCl、0.5％Tween 20和1％牛血清白蛋白的缓冲液中以1:20稀释。用约200μl的1X KPL缓冲液(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州)将板洗涤3次，然后将稀释的标准品、QC和样品的50μl样本转移到抗考那妥木单抗抗体包被的板中，并室温(大约25℃)孵育1.5小时。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液将板洗涤三次，然后添加在含5％BSA的I-Block^TM中的与MSD SULFO-标签(美商安进公司，千橡市，加利福尼亚州)缀合的50μl的100ng/ml小鼠抗huFc抗体(克隆1.35.1)，并在室温下孵育1.5h。对于抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体构建体，添加50μl 250ng/ml的小鼠抗κLC、与生物素缀合的克隆KCF-9，并且孵育1.5小时；然后，用1XKPL洗涤缓冲液洗涤板后，添加缀合MSD SULFO-标签(美商安进公司)的50μl的100ng/ml的链霉亲和素并孵育或15分钟。然后用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板六次，然后添加150μl 1X读取缓冲液T(中尺度发现公司)，并使用MSD 6000读板器(中尺度发现公司)测量电化学发光信号。使用

(Phoenix 64，版本6.4.0.768，药物视野公司(PharsightCorp.)山景城(Mountain View)，加利福尼亚州)的非隔室方法分析血清浓度数据。

通过小鼠血清样品的MSD测定，采用以下PK测定来测量小鼠血清中抗TRAILR2TTR抗体同二聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白中的抗TRAILR2 TTR结合种类和TTR种类的存在。常规的结合性96孔MSD板(中尺度发现公司，盖瑟斯堡，马里兰州)用在PBS中的2μg/ml的兔抗TTR多克隆抗体(美商安进公司(AmgenInc.)，千橡市，加利福尼亚州)包被并且然后在4℃孵育过夜。然后将板洗涤并用I-Block^TM(生命科技公司，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福尼亚州)在4℃下封闭过夜。在小鼠血清中制备标准品和质量对照(QC)，如果需要稀释，可在原初CD-1小鼠血清中稀释PK样品。然后将标准品、QC和样品在含有PBS、1M NaCl、0.5％Tween 20和1％牛血清白蛋白缓冲液的缓冲液中以1:20稀释。用约200μl的1X KPL缓冲液(KPL，盖瑟斯堡，马里兰州)将板洗涤3次，然后将稀释的标准品、QC和样品的50μl样本转移到抗TTR抗体包被的板中，并室温孵育1.5小时。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板三次，然后添加50μl的250ng/ml的与生物素缀合的兔抗考那妥木单抗多克隆抗体，并孵育1.5小时。用1X KPL洗涤缓冲液洗涤板3次后，添加缀合MSD SULFO-标签(美商安进公司)的50μl的100ng/ml的链霉亲和素并孵育或15分钟。用约200μl的1X KPL洗涤缓冲液洗涤板六次，然后添加150μl 1x读取缓冲液T(中尺度发现公司)，并使用MSD 6000读板器(中尺度发现公司)测量电化学发光信号。使用

PK分析的结果可以在图15中找到。如图15a)所示(测量任何抗TRAILR2结合种类)：[1]抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(“1”)的PK比亲本Ab(考那妥木单抗(“3”)；和考那妥木单抗341-G1(“2”))的PK更好；[2]抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“5”)的PK不良，这很可能归因于Fab缺乏Fc区，因此缺乏介导/延长其半衰期的能力；以及[3]抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“4”)的PK与亲本mAb(考那妥木单抗)的PK相似。值得注意的是，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体与其亲本(考那妥木单抗)相比显示出更好的PK，这与抗GITR TTR抗体同四聚体(它不如亲本mAb稳健，尽管与Fab相比，它仍然显示显著增强的PK)所观察到的不同。该观察结果表明，TTR抗体同四聚体融合蛋白的PK可能是抗体和/或靶标依赖性的。图15b)(测量抗TRAILR2 TTR结合种类和TTR种类)显示，完整的抗TRAILR2 TTR融合蛋白的PK与图15a)中观察到的一致，这表明体内蛋白水解不能从每个TTR融合蛋白中释放出抗TRAILR2结合部分。在图15b)中评估了抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(“1”)；抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“2”)；和TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“3”)。

基于细胞的活性测定

评估了抗TRAILR2 TTR融合蛋白相比于考那妥木单抗+蛋白G对黑素瘤细胞系WM35(ATCC)的活性。评估WM35表达DR5但不表达DR4。TRAIL激活DR5和DR4两者。将WM35细胞以10⁴个细胞/孔铺板在微量滴定板中，然后在不存在或存在1μg/ml蛋白G(皮尔斯公司)(以促进交联)的条件下，与考那妥木单抗、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体、或抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白一起孵育。一式三份的样品进行了分析。在37℃，5％CO²中孵育24小时后，使用细胞滴度-glo测定(普洛麦格公司)评估细胞活力。按照制造商的说明进行细胞滴度-glo反应，并使用珀金埃尔默Envision测量发光。y轴将发光信号显示为相对光单位(RLU)；RLU的降低反映了ATP产量的减少和活细胞数量的减少。x轴显示蛋白质浓度。

图16示出了WM35测定的结果。考那妥木单抗(“1”)在杀伤细胞方面无效，除非它与蛋白G(具有两个Ig结合位点；“5”)聚簇在一起。抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(“2”)在杀伤WM35细胞方面要稍微好于亲本考那妥木单抗。抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“4”)比考那妥木单抗具有稍微更好的WM35细胞杀伤能力。但是，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“3”)在杀伤WM35细胞方面比考那妥木单抗显著更有效，甚至比考那妥木单抗/蛋白G聚簇复合体更有效。另外，抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体与蛋白G的聚簇(“6”)改善了融合蛋白的效力，而抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体与蛋白G的聚簇(“8”)几乎没有效果。有趣的是，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体与蛋白G的聚簇(“7”)会稍微削弱蛋白质融合体的效力。这些结果显示，TTR抗体同四聚体介导的聚簇可以增强抗肿瘤活性。

还评估了抗TRAILR2 TTR融合体相比于考那妥木单抗+蛋白G对原代人角质形成细胞(龙沙集团(Lonza))的活性。将原代角质形成细胞以10⁴个细胞/孔铺板于微量滴定板中，然后与以下孵育：单独的TRAIL、考那妥木单抗(具有1μg/ml蛋白G(皮尔斯公司(Pierce))以促进交联)，或TRAIL加1ug/ml考那妥木单抗。每个条件一式三份制备样品。在37℃，5％CO2中孵育24小时后，使用细胞滴度-glo测定(普洛麦格公司)评估细胞活力。还将原代角质形成细胞以10⁴个细胞/孔铺板于微量滴定板中，然后以指定的浓度与抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体、抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体、考那妥木单抗或TRAIL孵育。还测试了TRAIL与1μg/ml考那妥木单抗的组合。一式三份制备样品。在37℃，5％CO₂中孵育24小时后，使用细胞滴度-glo测定(普洛麦格公司)测量细胞活力。

图17示出了角质形成细胞测定的结果。同样，考那妥木单抗(“1”)在杀伤原代人角质形成细胞方面无效。抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“2”)显示出比考那妥木单抗稍微更好的效力。同样，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“3”)在杀伤人原代角质形成细胞方面比考那妥木单抗显著更有效。这些结果再次显示，TTR抗体同四聚体介导的聚簇可以增强体外细胞杀伤测定中的活性。

基于鼠colo 205腺癌模型的活性测定

在鼠Colo205人结肠腺癌模型中评估了考那妥木单抗、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体融合蛋白的活性。在补充有10％FBS(西格玛公司，2442-500mL)、4mM L-谷氨酰胺(Hyclone公司，SH30034.01)、1mMHEPES(Hyclone公司，SH30237.01)、1mM丙酮酸钠(西格玛公司，S8636-100mL)和2.5g/L葡萄糖(西格玛公司，G8769)的RPMI-1640培养基中，将Colo205人结肠腺癌细胞在5％CO₂下于37℃保持。在第3代，收获细胞并将其重新悬浮在无血清培养基中，以产生10x10⁶个细胞/mL的最终浓度。通过台盼蓝拒染法测定细胞活力是98％。

六十只雌性NU/NU裸小鼠在右侧腹皮下注射1x10⁶个细胞(100μL体积)，同时用异氟烷麻醉小鼠。在肿瘤植入后第7天，将肿瘤体积在34mm³和99mm³之间的50只小鼠分配到5个处理组中，每组10只小鼠，使得每个组具有从40mm³到48mm³相似的平均肿瘤体积。该研究排除了具有较小或较大肿瘤的十只小鼠。

五组动物每周两次(b.i.w)接受腹膜内给药考那妥木单抗(0.69μM/动物)、考那妥木单抗-341-G1(0.69μM/动物)、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(0.34μM/动物)、抗TRAILR2TTR抗体同四聚体(0.17μM/动物)和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(0.17μM/动物)，持续3周，并且共进行6次处理。将治疗标准化，以使全部都具有与考那妥木单抗相同数量的结合位点，抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(与其余处理相比仅具有一半的结合位点)除外。所有治疗均在肿瘤植入后第8天开始，并且在第25天结束(处理分别在第8、11、15、19、22和25天进行)。所有处理均在注射前的处理日期在稀释剂(DPBS)中新鲜制备。

肿瘤体积测量：用型号#Cd-S6”C的ABS太阳能数显卡尺(三丰公司(MitutoyoCorporation)，日本)测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积计算为0.5×L×W2，其中W是两次测量中的较小者，并且以mm³表示。

体重测量：为了测量体重，将动物放在天平(Mettler Toledo型号PB602-S，瑞士)上的称重盘中。使用天平的动态重量功能确定3秒钟内的平均体重。体重报告为体重变化，其计算为100x(Wc/Wi)，其中Wc是当前体重，并且Wi是处理开始时的体重。对于本研究，对于所有动物将第4天体重作为Wi。

安乐死：在研究结束前对5只动物实施安乐死，因为肿瘤大小达到1500mm³-2000mm³。考那妥木单抗-341-G1组：第25天，由于肿瘤体积过大，对两只小鼠实施了安乐死；第35天，由于肿瘤体积过大，对另外两只小鼠实施了安乐死。第42天，由于平均肿瘤体积>1200mm³或该队列中一半以上的小鼠损失，对抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体组中的十只小鼠和考那妥木单抗-341-G1组中的其余六只小鼠实施了安乐死。由于第42天肿瘤大小>2000mm³，因此对来自抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体组的一只小鼠实施了安乐死。由于第49天肿瘤体积过大，因此对来自抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体组的一只小鼠实施了安乐死。在第63天在研究结束时，对所有其余的动物实施安乐死。通过过量的异氟烷对动物实施安乐死，然后通过心脏穿刺收集血液。

肿瘤测量：第4天到第63天之间的数据表示为平均值加或减标准误差，并绘制为时间的函数。通过转换后的肿瘤体积数据的重复测量方差分析，并用邓尼特(Dunnett)调整后的多重比较，从而评估生长曲线之间观察到的差异的统计显著性。使用SAS PROC MIXED程序(具有转换后的基线肿瘤体积、天数、处理和天数与处理相互作用的模型效应；重复(REPEATED)表述，其中天数是重复值，动物对象和Toeplitz协方差结构；和LSMEANS表述以进行邓尼特分析，比较对照组和其他处理组)进行分析。根据Horwitz方法对数据进行对数或平方根转换，并将转换后的基线肿瘤体积作为协变量包括在模型中，以说明可能的处理前肿瘤体积差异。如果对数或平方根转换未能获得适当的残差分布，则使用方差模型的非参数重复测量分析，其中对肿瘤体积的等级具有相同的模型效应。P值<0.05被认为具有统计学意义。考那妥木单抗(野生型)和考那妥木单抗-341-G1组用作分析的对照组。

图18示出了鼠colo205模型测试的结果。考那妥木单抗(“组1”；0.69μM/动物)、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“组4”；0.17μM/动物)和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“组5”；0.17μM/动物)均在给药期间抑制体内肿瘤生长，其中抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体在给药期间显示最佳抑制水平。抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(“组3”；0.34μM/动物)在抑制肿瘤生长方面仅略微优于媒剂对照(考那妥木单抗-341-G1，“组2”；0.69μM/动物)。值得注意的是，在停止给药后很长时间，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体继续抑制肿瘤生长。此外，令人惊讶的是，尽管抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体具有不良的PK谱(图15)，但所述构建体在抑制肿瘤生长方面与考那妥木单抗一样有效。不受特定理论的束缚，可能的是，最初暴露于抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体会在靶细胞中引发一系列事件，从而导致死亡并且不需要长期结合。另外，Fab构建体的相对较小的尺寸可以使其更好地进入肿瘤环境，从而补偿了不良的PK。最后，Fab构建体的物理构型在体内可能更有效。

基于鼠SW403腺癌模型的活性测定

将SW403人结肠腺癌细胞在37℃在5％CO₂在RPMI-1640培养基(西格玛R0883)中保持，所述培养基补充有10％FBS(西格玛，2442-500mL)、4mM L-谷氨酰胺(Hyclone公司，SH30034.01)。在第5代，收获细胞并将其重新悬浮在无血清培养基中，以产生50x10⁶个细胞/mL的最终浓度。通过台盼蓝拒染法测定细胞活力是95％。

七十五只雌性NU/NU裸小鼠在右侧腹皮下注射5x10⁶个细胞(100μL体积)，同时用异氟烷麻醉小鼠。在肿瘤植入后第7天，将肿瘤体积在21mm³和160mm³之间的60只小鼠分配到6个处理组中，每组10只小鼠，使得每个组具有从58mm³到66mm³相似的平均肿瘤体积。该研究排除了具有较小或较大肿瘤的十五只小鼠。

六组动物每周两次(b.i.w)接受腹膜内给药考那妥木单抗野生型(1.38μM/动物)、考那妥木单抗-341-G1(1.38μM/动物)、抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(0.69uM/动物)、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(0.34μM/动物)、抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(0.34μM/动物)和DPBS(媒剂对照)，持续3周，并且共进行6次处理。将治疗标准化，以使每者都具有与考那妥木单抗野生型相等数量的结合位点，抗TRAILR2TTR Fab同四聚体(与其余处理相比仅具有一半的结合位点)除外。所有治疗均在肿瘤植入后第15天开始，并且在第32天结束(处理分别在第15、19、22、26、29和32天进行)。所有处理均在注射前的处理日期在稀释剂(DPBS)中新鲜制备。

肿瘤体积测量：用型号#Cd-S6”C的ABS太阳能数显卡尺(三丰公司，日本)测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积计算为0.5×L×W2，其中W是两次测量中的较小者，并且以mm³表示。

体重测量：将动物放在天平(Mettler Toledo型号PB602-S，瑞士)上的称重盘中。使用天平的动态重量功能确定3秒钟内的平均体重。体重报告为体重变化，其计算为100x(Wc/Wi)，其中Wc是当前体重，并且Wi是处理开始时的体重。对于本研究，对于所有动物将第4天体重作为Wi。

安乐死和组织收集：在研究结束前对8只动物实施安乐死，因为肿瘤大小达到1500mm³-2000 mm³。由于第33天的肿瘤体积过大，对考那妥木单抗-341-G1组的一只小鼠实施了安乐死。在第36天，对来自考那妥木单抗-341-G1组的另一只小鼠、来自DPBS媒剂对照组的两只小鼠和来自抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体组的一只小鼠实施了安乐死。在第39天对考那妥木单抗-341-G1、DPBS媒剂对照和抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体组中的其余动物全部实施了安乐死。在第39天对来自考那妥木单抗WT组的一只小鼠实施了安乐死。在第46天对来自考那妥木单抗WT组的另一只小鼠和来自抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体组的一只小鼠实施了安乐死。第49天在研究结束时，对考那妥木单抗WT、抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体组中的所有其余动物实施了安乐死。所有的安乐死都通过过量的异氟烷进行，然后通过心脏穿刺收集血液。

肿瘤测量：第7天到第49天之间的数据表示为平均值加或减标准误差，并绘制为时间的函数。通过转换后的肿瘤体积数据的重复测量方差分析，并用邓尼特(Dunnett)调整后的多重比较，从而评估生长曲线之间观察到的差异的统计显著性。使用SAS PROC MIXED程序(具有转换后的基线肿瘤体积、天数、处理和天数与处理相互作用的模型效应；重复(REPEATED)表述，其中天数是重复值，动物对象和Toeplitz协方差结构；和LSMEANS表述以进行邓尼特分析，比较对照组和其他处理组)进行分析。根据Horwitz方法对数据进行对数或平方根转换，并将转换后的基线肿瘤体积作为协变量包括在模型中，以说明可能的处理前肿瘤体积差异。如果对数或平方根转换未能获得适当的残差分布，则使用方差模型的非参数重复测量分析，其中对肿瘤体积的等级具有相同的模型效应。P值<0.05被认为具有统计学意义。所有统计计算均使用AMG生物统计分析工具(cld-pweb-taivd.amgen.com/biostats/Statistics)进行。将考那妥木单抗WT组用作分析中的对照组。

图19示出了鼠SW403模型测试的结果。抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体(“组5”)和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体(“组6”)在给药期间比考那妥木单抗(“组1”)更好地抑制体内肿瘤生长。抗TRAILR2 TTR抗体同二聚体(“组4”)在给药期间以与考那妥木单抗大约相同的水平抑制生长，尽管两者在生长抑制方面均没有显著优于媒剂对照(“组3”)。值得注意的是，即使停止给药后，抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体和抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体也减缓肿瘤生长。再次令人惊讶地观察到，尽管抗TRAILR2 TTR Fab同四聚体具有不良的PK谱(图15)，但是即使在停止给药后，所述构建体在减缓肿瘤生长方面也与抗TRAILR2 TTR抗体同四聚体一样有效。

图20显示了鼠colo205模型小鼠和鼠SW403模型小鼠的体重对于所有测试化合物都是相似的，并且似乎处于正常的向上轨迹。该结果表明测试的化合物没有明显的毒性(因为小鼠足够健康，可以正常进食和增重)。

SEQ ID NO的概述：

序列表

<110> 安进公司

K·W·沃克

<120> 甲状腺素视黄质运载蛋白免疫球蛋白融合体

<130> A-2196-WO-PCT

<150> 62/568,217

<151> 2017-10-04

<160> 47

<170> PatentIn 版本3.5

<210> 1

<211> 127

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Ala Pro Leu Met Val Ala Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val

20 25 30

Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe

50 55 60

Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu

115 120 125

<210> 2

<211> 381

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

ggccctacgg gcaccggtga atccaaggct cctctgatgg tcgccgttct agatgctgtc 60

cgaggcagtc ctgccatcaa tgtggccgtg catgtgttca gaaaggctgc tgatgacacc 120

tgggagccat ttgcctctgg gaaaaccagt gagtctggag agctgcatgg gctcacaact 180

gaggaggaat ttgtagaagg gatatacaaa gtggaaatag acaccaaatc ttactggaag 240

gcacttggca tctccccatt ccatgagcat gcagaggtgg tattcacagc caacgactcc 300

ggcccccgcc gctacaccat tgccgccctg ctgagcccct actcctattc caccacggct 360

gtcgtcacca atcccaagga a 381

<210> 3

<211> 127

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 3

Gly Pro Ala Gly Ala Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Val Asp Val Ala Val Lys Val

20 25 30

Phe Lys Lys Thr Ser Glu Gly Ser Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ala Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Val Glu Gly Val Tyr Arg Val Glu Leu Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Thr Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu Phe Ala Asp Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly His Arg His Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Ser Asn Pro Gln Asn

115 120 125

<210> 4

<211> 615

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 4

acagaagtcc actcattctt ggcaggatgg cttctcatcg tctgctcctc ctctgccttg 60

ctggactggt atttgtgtct gaggctggcc ctacgggcac cggtgaatcc aagtgtcctc 120

tgatggtcaa agttctagat gctgtccgag gcagtcctgc catcaatgtg gccgtgcatg 180

tgttcagaaa ggctgctgat gacacctggg agccatttgc ctctgggaaa accagtgagt 240

ctggagagct gcatgggctc acaactgagg aggaatttgt agaagggata tacaaagtgg 300

aaatagacac caaatcttac tggaaggcac ttggcatctc cccattccat gagcatgcag 360

aggtggtatt cacagccaac gactccggcc cccgccgcta caccattgcc gccctgctga 420

gcccctactc ctattccacc acggctgtcg tcaccaatcc caaggaatga gggacttctc 480

ctccagtgga cctgaaggac gagggatggg atttcatgta accaagagta ttccattttt 540

actaaagcac tgttttcacc tcatatgcta tgttagaagt ccaggcagag acaataaaac 600

attcctgtga aaggc 615

<210> 5

<211> 452

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr

210 215 220

Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

225 230 235 240

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly

450

<210> 6

<211> 452

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr

210 215 220

Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro

225 230 235 240

Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Met Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly

450

<210> 7

<211> 452

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

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<212> PRT

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

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210

<210> 26

<211> 214

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp

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Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Lys

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu Gly

1 5 10

<210> 28

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Leu Gln His Asn Thr Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 30

Gly Gly His His His His His His

1 5

<210> 31

<211> 451

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu

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Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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<210> 32

<211> 451

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

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210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 33

<211> 451

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

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340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr

405 410 415

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420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

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<211> 227

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

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20 25 30

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Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

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210 215 220

Cys Gly Gly

225

<210> 35

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Ser Gly Asp Tyr Phe Trp Ser

1 5

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<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

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His Ile His Asn Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Asp Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 38

<211> 215

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 39

<211> 215

<212> PRT

<213> 智人

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 40

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 41

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 42

Gln Gln Phe Gly Ser Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 43

<211> 127

<212> PRT

<213> 智人

<400> 43

Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val

1 5 10 15

Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val

20 25 30

Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Glu Phe

50 55 60

Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys

65 70 75 80

Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr

85 90 95

Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser

100 105 110

Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu

115 120 125

<210> 44

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 44

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

145 150 155 160

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr

210 215 220

Val Glu Arg Lys Cys Gly Gly

225 230

<210> 45

<211> 231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 45

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Arg Gly

20 25 30

Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ala Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120 125

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser

130 135 140

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Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

165 170 175

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

180 185 190

Glu Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr

195 200 205

Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr

210 215 220

Val Glu Arg Lys Cys Gly Gly

225 230

<210> 46

<211> 221

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Lys Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

210 215 220

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的多肽

<400> 47

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims

1.一种同二聚体融合蛋白，所述同二聚体融合蛋白包含两个抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与蛋白复合体连接。

2.根据权利要求1所述的同二聚体融合蛋白，其中所述蛋白复合体是TTR蛋白复合体。

3.根据权利要求1或2所述的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在没有接头的情况下直接融合至所述蛋白复合体。

5.根据权利要求4所述的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的C末端直接融合至TTR蛋白复合体中存在的N末端。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白经由接头融合至所述蛋白复合体。

7.根据权利要求6所述的同二聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的C末端连接至TTR蛋白复合体中存在的N末端。

8.根据权利要求7所述的同二聚体融合蛋白，其中所述接头是氨基酸接头。

9.根据权利要求8所述的氨基酸接头，其中所述氨基酸接头的长度是1-40个氨基酸。

10.根据权利要求9所述的氨基酸接头，其中所述氨基酸接头是GGGGS、(GGGGS)₂、(GGGGS)₃、(GGGGS)₄、(GGGGS)₅或(GGGGS)₆。

11.一种同四聚体融合蛋白，所述同四聚体融合蛋白包含四个抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与蛋白复合体连接。

12.根据权利要求11所述的同四聚体融合蛋白，其中所述蛋白复合体是TTR蛋白复合体。

13.根据权利要求11或12所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。

14.根据权利要求11或12所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是Fab。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在没有接头的情况下直接融合至所述蛋白复合体。

16.根据权利要求15所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的C末端直接融合至TTR蛋白复合体中存在的N末端。

17.根据权利要求11-14中任一项所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白经由接头融合至所述蛋白复合体。

18.根据权利要求17所述的同四聚体融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白的C末端连接至TTR蛋白复合体中存在的N末端。

19.根据权利要求18所述的同四聚体融合蛋白，其中所述接头是氨基酸接头。

20.根据权利要求19所述的氨基酸接头，其中所述氨基酸接头的长度是1-40个氨基酸。

21.根据权利要求20所述的氨基酸接头，其中所述氨基酸接头是GGGGS、(GGGGS)₂、(GGGGS)₃、(GGGGS)₄、(GGGGS)₅或(GGGGS)₆。

22.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求11-22中任一项所述的同四聚体融合蛋白。

24.一种使用根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白治疗癌症的方法。

25.一种使用根据权利要求11-22中任一项所述的同四聚体融合蛋白治疗癌症的方法。

26.根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白在癌症治疗中的用途。

27.根据权利要求11-22中任一项所述的同四聚体融合蛋白在癌症治疗中的用途。

28.根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白，其用于治疗癌症。

29.根据权利要求11-22中任一项所述的同四聚体融合蛋白，其用于治疗癌症。

30.一种或多种分离的核酸，所述一种或多种分离的核酸编码根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白。

31.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求30所述的核酸。

32.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求30所述的核酸或根据权利要求31所述的载体。

33.根据权利要求32所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、E5细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾(COS)细胞、人肝细胞癌细胞或人胚肾293(HEK 293)细胞。

34.一种制备根据权利要求1-10中任一项所述的同二聚体融合蛋白或根据权利要求11-22中任一项所述的同四聚体融合蛋白的方法，所述方法包括：

a)培养根据权利要求32或33所述的重组宿主细胞；并且

b)从所述培养物中分离所述同二聚体或同四聚体融合蛋白。