JP6959011B2 - Ｂｃｍａおよびｃｄ３に対する二重特異性を有するｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクト - Google Patents

Ｂｃｍａおよびｃｄ３に対する二重特異性を有するｔ細胞エンゲージ抗体コンストラクト Download PDF

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Description

二重特異性抗体由来分子、例えばBiTE（登録商標）（二重特異性T細胞エンゲージャー）抗体コンストラクトは、2つのフレキシブルに連結された抗体由来結合ドメインから構成される組み換えタンパク質コンストラクトである。BiTE（登録商標）抗体コンストラクトの1つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり、第2の結合ドメインは、T細胞上のT細胞受容体複合体のサブユニットであるCD3に特異的である。それらの個別の設計によって、BiTE（登録商標）抗体コンストラクトは個々に、T細胞を標的細胞と一過的に結びつけ、同時に標的細胞に対するT細胞の生来的な細胞溶解能を強く活性化させるよう適合される。AMG 103およびAMG 110として臨床に移行した第一世代のBiTE（登録商標）抗体コンストラクトの重要なさらなる開発（特許文献1および2を参照のこと）は、CD3ε鎖のN末端のコンテクスト非依存的なエピトープに結合する二重特異性抗体コンストラクトの提供であった（特許文献3）。この選択されたエピトープに結合するBiTE（登録商標）抗体コンストラクトは、ヒトおよびコモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）CD3ε鎖に対する種間特異性を示さないばかりか、（二重特異性T細胞エンゲージ分子において以前に記載されたCD3結合体のエピトープに代えて）この特異的エピトープを認識するため、前世代のT細胞エンゲージ抗体で観察されたのと同程度にT細胞を非特異的に活性化しない。T細胞活性化のこの低下は、患者内でのより小さなまたは減少したT細胞再分布と相関し、後者は、副作用のリスクと判断された。
特許文献3に記載された抗体コンストラクトは、体内からのクリアランスの速さという欠点があると考えられ、したがってそれらは体内のほとんどの部分に迅速に到達することができ、かつ手早く製造でき取扱が容易であるが、それらのインビボ適用は、それらのインビボでの短い持続性によって制限され得る。この小さな単鎖分子はインビボ半減期が短いため、治療効果を達成するために連続静脈内注入による長期的投与が使用されていた。しかし、そのような連続静脈内注入は、患者にとって不便な類のものであり、したがってより便利な代替処置アプローチにおいて、それぞれの疾患の処置においてより効果的であることが実証された化合物の選択を妨げる。したがって、同様の治療効果を有し、製造が容易な形式を有し、かつより長い半減期を含む好ましい薬物動態特性を有する二重特異性治療剤が当技術分野で必要とされている。
長い半減期は、一般に、免疫グロブリン、特に抗体、特に小サイズの抗体フラグメントのインビボ適用において有用である。そのような効果を達成するために当技術分野において報告されているアプローチは、小さな二重特異性抗体コンストラクトを、好ましくはBiTE（登録商標）の治療効果と干渉しないより大きなタンパク質に融合することを含む。二重特異性T細胞エンゲージャーのそのようなさらなる開発の例は、例えば特許文献4〜8に記載される二重特異性Fc分子を含む。代替のストラテジーは、二重特異性分子に融合するHSAの使用またはヒトアルブミン結合ペプチドの単純な融合である（例えば、特許文献9および10を参照のこと）。
BCMA（B細胞成熟抗原、TNFRSF17、CD269）は、TNF受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。それは、そのリガンドであるBAFF（B細胞活性化因子、TALL-1またはTNFSF13Bとも称される）およびAPRIL（増殖誘導リガンド）とのおそらく必須である相互作用から、B細胞の発生および恒常性に必須のB細胞マーカーであることが確立されている（非特許文献1）。
BCMAの発現は、B細胞系統に限定され、主として形質細胞および形質芽球に存在し、かつ記憶B細胞にある程度存在するが、末梢およびナイーブB細胞には実質的に存在しない。BCMAはまた、多発性骨髄腫（MM）細胞で発現され、白血病およびリンパ腫に関係する。そのファミリーメンバーであるTACI（膜貫通型活性化因子・シクロフィリンリガンド相互作用因子）およびBAFF-R（B細胞活性化因子受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー13Cとしても公知）と共に、BCMAは、液性免疫、B細胞の発達および恒常性の様々な局面を調節する。BCMAの発現は、B細胞の分化のかなり後期で見られ、骨髄における形質芽球および形質細胞の長期生存に寄与する。マウスにおけるBCMA遺伝子の特異的欠失は、骨髄における長命形質細胞の数の有意な減少をもたらし、このことはBCMAがそれらの生存にとって重要であることを示している。
この知見に沿って、BCMAはまた、多発性骨髄腫（MM）細胞の成長および生存も支援する。Novakらは、MM細胞株および新たに単離したMM細胞がそれらの細胞表面上にBCMAおよびTACIタンパク質を発現することおよびそれらの細胞表面上でのBAFF-Rタンパク質の発現にばらつきがあることを見出した（非特許文献2）。
多発性骨髄腫（MM）は、2番目に多い一般的な血液学的悪性腫瘍であり、癌による死全体の2％を占めている。MMは、不均一疾患（heterogeneous disease）であり、主として染色体転座、特にt(11;14)、t(4;14)、t(8;14)、del(13)およびdel(17)によって引き起こされる。MMに罹患した患者は、骨髄浸潤、骨破壊、腎不全、免疫不全および癌の診断の心理社会的負荷に起因する様々な疾患関連症状を経験し得る。
骨髄腫は、典型的に再発経過をたどる不治の疾患であり、多くの患者（pts）は複数系統の治療を必要とする。特にプロテアソーム阻害剤（PI）および／または免疫調節薬（IMiD）ベースの処置の失敗以降、RRMMの結果は不良である。
MMは依然として治療困難な疾患であり、不治のままである。それは典型的に再発経過をたどり、多くの患者は複数系統の治療を必要とする。化学療法および幹細胞移植アプローチ等の治療法が利用可能になり、生存率は改善されたが、これらはしばしば望ましくない副作用をもたらす。今日までに、多発性骨髄腫患者に対して最も頻繁に使用されている2つの処置選択肢は、ステロイド、サリドマイド、レナリドマイド、ボルテゾミブまたは様々な細胞傷害剤の併用、および、若年患者に対する、自家幹細胞移植を用いる高用量化学療法コンセプトである。
ほとんどの移植は自家タイプ、すなわち、患者自身の細胞を使用するものである。そのような移植は、根治的でないものの、選択された患者において寿命を延ばすことが示されている。それらは、新たに診断された患者の初期治療としてまたは再発時に行われ得る。ときには、選択された患者に対して、疾患を十分に制御するために2以上の移植が推奨され得る。幹細胞移植は、加齢、他の深刻な疾病の存在またはその他の身体的制約から、多くの患者にとっての選択肢とはなり得ない。化学療法は、多発性骨髄腫を部分的にしか制御せず、完全寛解に導くことはまれである。特にプロテアソーム阻害剤（PI）および／または免疫調節薬ベースの処置の失敗以降、再発難治性MMの結果は不良である。したがって、新しい革新的な処置に対する喫緊の要望がある。
Bellucciら（非特許文献３）は、ドナーリンパ球輸注を受けた後の多発性骨髄腫患者においてBCMA特異的抗体を同定した。これらの患者の血清は、ADCCおよびCDCによるBCMA特異的細胞溶解を媒介することができ、そしてこれは抗腫瘍応答を示す患者においてのみ検出され（4/9）、非応答患者では検出されなかった（0/6）。著者は、BCMA特異的抗体の誘導が骨髄腫細胞の排除および患者の長期的寛解に寄与すると推測している。Ryanら（非特許文献4）は、正常および悪性のB細胞における強い生存促進シグナル経路に関連するNF-κBの活性化を妨げる拮抗性のBCMA特異的抗体を生成したことを報告した。
BCMA；BAFF-RおよびTACI、すなわちTNF受容体スーパーファミリーに属するB細胞受容体ならびにそれらのリガンドであるBAFFおよびAPRILが癌および／または自己免疫障害に対抗する治療に利用されているという事実にもかかわらず、そのような医学的状態の処置のためのさらなる選択肢が利用可能となることが依然として望まれている。1つのそのようなアプローチは、二重特異性抗体由来T細胞エンゲージャーである。
WO 99/54440 WO 2005/040220 WO 2008/119567 US 2014/0302037 US 2014/0308285 WO 2014/144722 WO 2014/151910 WO 2015/048272 WO 2013/128027 WO 2014/140358
Schliemann et al., (2001) Science 293 (5537):2111-2114 Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694 Bellucci et al. Blood. 2005 May 15;105(10) Ryan et al. Mol Cancer Ther. 2007 Nov;6(11):3009-18
ヘテロFc（ヘテロ二量体Fc、hetFcまたはhFcとも称される）形式およびヒト血清アルブミン（HSAまたはhALBとも称される）の融合体を含む当技術分野で報告されているすべての半減期延長形式（HLE形式）の二重特異性T細胞エンゲージ分子は、個々に欠点、例えば非特異的なT細胞活性化、補体活性化、不安定性またはその分子の所望の半減期延長に合致しない薬物動態プロフィールを有していた。したがって、先行技術の分子で観察されたこれらの個々の欠点の少なくとも1つ、当然好ましくは2つ以上を克服する半減期延長形式のBCMAxCD3二重特異性T細胞エンゲージ分子を提供することが、本発明の目的である。したがって、本発明は、BCMAに結合する第1のドメイン、ヒトおよび／またはマカクCD3ε鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメイン、ならびに特定のFc様式である第3のドメインを含むことによって特徴づけられる、特定のFc様式の抗体コンストラクトを提供する。さらに、本発明は、該抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該コンストラクトを発現する宿主細胞およびこれらを含む薬学的組成物を提供する。
より具体的には、本発明は以下を提供する：
[1] ・BCMAに結合する第1のドメイン、
・ヒトおよび／またはマカクCD3ε鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメイン、ならびに
・ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々が含む2つのポリペプチド単量体を含む第3のドメインであって、該2つのポリペプチド単量体がペプチドリンカーを通じて相互に融合されている、第3のドメイン
を含む、抗体コンストラクト；
[2] 単鎖抗体コンストラクトである、[1]の抗体コンストラクト；
[3] 第3のドメインが、アミノからカルボキシルへの順に、
ヒンジ-CH2-CH3-リンカー-ヒンジ-CH2-CH3
を含む、[1]または[2]の抗体コンストラクト；
[4] 前記ポリペプチド単量体の各々が、SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、[1]〜[3]のいずれかの抗体コンストラクト；
[5] 前記ポリペプチド単量体の各々が、SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、[1]〜[4]のいずれかの抗体コンストラクト；
[6] CH2ドメインが、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、[1]〜[5]のいずれかの抗体コンストラクト；
[7] （i）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
（ii）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
（iii）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、または
（iv）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、
[1]〜[6]のいずれかの抗体コンストラクト；
[8] 第1および第2のドメインが、ペプチドリンカーを通じて第3のドメインに融合されている、[1]〜[7]のいずれかの抗体コンストラクト；
[9] アミノからカルボキシルへの順に、
（a）第1のドメイン、
（b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（c）第2のドメイン、
（d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（e）第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
（f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
（g）第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
を含む、[1]〜[8]のいずれかの抗体コンストラクト；
[10] アミノからカルボキシルへの順に、
（a）SEQ ID NO:53、59、71、77、89または95からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第1のドメイン、
（b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185もしくは187、またはSEQ ID NO:15からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第2のドメイン、
（d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（e）SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
（f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
（g)SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
を含む、[1]〜[9]のいずれかの抗体コンストラクト；
[11] SEQ ID NO:55、56、61、62、73、74、79、80、91、92、97および98からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、[1]〜[10]のいずれかの抗体コンストラクト；
[12] [1]〜[11]のいずれかの抗体コンストラクトをコードする、ポリヌクレオチド；
[13] [12]のポリヌクレオチドを含む、ベクター；
[14] [12]のポリヌクレオチドまたは[13]のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞；
[15] [1]〜[11]のいずれかの抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で[14]の宿主細胞を培養する工程、および産生された抗体コンストラクトを培養物から回収する工程を含む、[1]〜[11]のいずれかの抗体コンストラクトの製造のための方法；
[16] [1]〜[11]のいずれかのまたは[15]の方法により製造された抗体コンストラクトを含む、薬学的組成物；
[17] 約-20℃で少なくとも4週間安定である、[16]の薬学的組成物；
[18] BCMA発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害または自己免疫疾患から選択される疾患の予防、処置または改善において使用するための、[1]〜[11]のいずれかのまたは[15]の方法により製造された抗体コンストラクト；
[19] BCMA発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害または自己免疫疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、[1]〜[11]のいずれかのまたは[15]の方法により製造された抗体コンストラクトを投与する工程を含む、方法；ならびに
[20] [1]〜[11]のいずれかのもしくは[15]の方法により製造された抗体コンストラクト、[12]のポリヌクレオチド、[13]のベクターおよび／または[14]の宿主細胞を含む、キット。
図1aは、本発明の抗体コンストラクトの1つの態様の略図を示している。図1bは、ヘテロ二量体Fc抗体コンストラクトを示しており、図1cは当技術分野で報告されているXボディコンストラクトを示している。示されている電荷対が、ヘテロ二量体化を強化するために導入される。図1dは、抗体コンストラクトとヒト血清アルブミン（HSA/hALB）の融合体を示している。 標的A HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。2(a)ヒトPBMC（3x）を用いた48時間活性化アッセイにおける本発明の抗体コンストラクト；HLE BiTE（登録商標）連続希釈物（20 nMから開始；1:5、7x + ブランク）；FcRブロッキング［10 mg/mL huIgG（Kiovog, Baxter）］なしまたはあり；CD4+、CD8+ T細胞におけるCD69およびCD25［示さず］発現のFACS測定。2(b)ヒトPBMCおよびCD14+/CD33+細胞除去PBMC（3x）を用いた48時間活性化アッセイにおけるヘテロFc抗体コンストラクト；HLE BiTE（登録商標）連続希釈物（20nMから開始；1:5、7x + ブランク）；CD4+、CD8+ T細胞におけるCD69およびCD25［示さず］発現のFACS測定。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(a)ヒトPBMC（3x）を用いた48時間活性化アッセイにおける本発明の標的B抗体コンストラクト；HLE BiTE（登録商標）連続希釈物（20 nMから開始；1:5、7x + ブランク）；FcRブロッキング［10 mg/mL huIgG（Kiovog, Baxter）］なしまたはあり；CD4+、CD8+ T細胞におけるCD69およびCD25［示さず］発現のFACS測定。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(b)ヒトPBMCおよびCD14+/CD33+細胞除去PBMC（3x）を用いた48時間活性化アッセイにおける標的BヘテロFc抗体コンストラクト；HLE BiTE（登録商標）連続希釈物（20 nMから開始；1:5、7x + ブランク）；CD4+、CD8+ T細胞におけるCD69およびCD25［示さず］発現のFACS測定。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(c)ヒトPBMCおよびCD14+/CD33+細胞除去PBMC（3x）を用いた48時間活性化アッセイにおける標的B Xボディコンストラクト；HLE BiTE（登録商標）連続希釈物（20 nMから開始；1:5、7x + ブランク）；CD4+、CD8+ T細胞におけるCD69およびCD25［示さず］発現のFACS測定。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(d)〜3(f)3名の異なる健常ヒトドナーから単離されたPBMCを、標的Bに特異的な漸増濃度のHLE二重特異性抗体コンストラクトと共に48時間培養した。CD4+およびCD8+ T細胞における活性化マーカーCD69の発現を、CD69に特異的なPE-Cy7結合mAbを用いたフローサイトメトリー分析によって決定した。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(d)〜3(f)3名の異なる健常ヒトドナーから単離されたPBMCを、標的Bに特異的な漸増濃度のHLE二重特異性抗体コンストラクトと共に48時間培養した。CD4+およびCD8+ T細胞における活性化マーカーCD69の発現を、CD69に特異的なPE-Cy7結合mAbを用いたフローサイトメトリー分析によって決定した。 HLE BiTE（登録商標）抗体コンストラクトによる標的非依存的T細胞活性化の評価。3(d)〜3(f)3名の異なる健常ヒトドナーから単離されたPBMCを、標的Bに特異的な漸増濃度のHLE二重特異性抗体コンストラクトと共に48時間培養した。CD4+およびCD8+ T細胞における活性化マーカーCD69の発現を、CD69に特異的なPE-Cy7結合mAbを用いたフローサイトメトリー分析によって決定した。 BiTE（登録商標）Fc融合抗体コンストラクトの補体C1q結合。BiTE（登録商標）Fc融合抗体コンストラクト（BiTE（登録商標）単鎖Fc（三角）、BiTE（登録商標）ヘテロFc（四角）、カノニカルBiTE（登録商標）（丸））を（連続希釈物として）Maxisorpプレート上にコーティングし、その後にプールされたヒト血清とのインキュベーションおよびポリクローナル抗ヒトCC1qマウス抗体とのインキュベーションを行い、ヤギ抗マウスFc-APコンジュゲートによって可視化した。 カニクイザルへの単回量投与後の2つの異なるBCMA標的指向BiTE（登録商標）抗体コンストラクトの平均PKプロフィール。比較のために、血清濃度を15μg/kgに用量標準化し、これをnmolで示した。 各々scFc半減期延長部分に融合された9つの異なるBiTE（登録商標）抗体コンストラクトの平均PKプロフィール。比較のために、血清濃度を15μg/kgに用量標準化し、これをnmolで示した。 二重特異性scFc変種D9F（SEQ ID NO:105）、T2G（SEQ ID NO:106）、D3L（SEQ ID NO:107）、T7I（SEQ ID NO:108）およびK6C（SEQ ID NO:109）。本発明の抗体コンストラクトの好ましい第3のドメインは、SEQ ID NO:105に含まれる第3のドメインである。 ヒトFcRnへの結合の表面プラズモン共鳴（SPR）ベースの測定。コンストラクトD9F、T2G、D3L、T7IおよびK6Cを各々、SPR（Biacore）実験においてそれらがヒトFcRnに結合する能力について試験した。すべてのコンストラクトについて、注入フェーズにおける最大結合を、結合したコンストラクトに起因するFcRnコートCM5チップ上での分子量増加に相当する各反応単位（RU）で測定した。すべてのコンストラクトを二つ組で測定した。二つ組の測定の平均値が図8Aおよび8Bに示されている。 コンストラクトD9F、T2G、D3L、T7IおよびK6CならびにヒトIgG1カッパ抗体MT201を各々、SPR（Biacore）実験においてそれらがヒトFcRnに結合する能力について試験した。すべてのコンストラクトについて、注入フェーズにおける最大結合を、結合したコンストラクトに起因するFcRnコートCM5チップ上での分子量増加に相当する各反応単位（RU）で測定した。すべてのコンストラクトを二つ組で測定した。標準偏差エラーバーを含む、二つ組の測定の平均値が示されている。
詳細な説明
本発明の二重特異性抗体コンストラクトの有意に延長された半減期に加えて、特定のFc様式の融合はまた、本発明の抗体コンストラクトの第1および第2の結合ドメインに対して驚くべきほど有意な影響をもたらしている。したがって、他の半減期延長様式のT細胞エンゲージ抗体コンストラクトは個々に好ましい特徴を示すが、本発明の特定のFc様式の選択は、幅広い堅牢な分子形式の好ましい特徴を典型的に示す二重特異性分子の提供を可能にし、したがって見込みのある薬学的組成物の開発を可能にする。
したがって、本発明は、
・BCMAに結合する第1のドメイン、
・ヒトおよび／またはマカクCD3ε鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメイン、ならびに
・ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々が含む2つのポリペプチド単量体を含む第3のドメインであって、該2つのポリペプチド単量体がペプチドリンカーを通じて相互に融合されている、第3のドメイン
を含む、抗体コンストラクトを提供する。
「抗体コンストラクト」という用語は、その構造および／または機能が、抗体の、例えば全長もしくは全免疫グロブリン分子の構造および／もしくは機能に基づいており、ならびに／または抗体もしくはそのフラグメントの可変重鎖（VH）および／もしくは可変軽鎖（VL）ドメイン由来である分子を表す。したがって抗体コンストラクトは、その特異的標的または抗原に結合することができる。さらに、本発明にしたがう抗体コンストラクトの結合ドメインは、標的への結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも3つの軽鎖CDR（すなわち、VL領域のCDR1、CDR2およびCDR3）ならびに／または3つの重鎖CDR（すなわち、VH領域のCDR1、CDR2およびCDR3）の、好ましくは6つのCDRのすべての存在によって定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替のアプローチは、特定の標的の構造、それぞれ、エピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）内での抗体のエピトープの定義であり、または定義された抗体のエピトープと競合する特定の抗体を参照することによる。本発明にしたがうコンストラクトの元になる抗体は、例えば、モノクローナル、組み換え、キメラ、脱免疫化、ヒト化およびヒト抗体を含む。
本発明にしたがう抗体コンストラクトの結合ドメインは、例えば、上記グループのCDRを含み得る。好ましくは、これらのCDRは、抗体軽鎖可変領域（VL）および抗体重鎖可変領域（VH）のフレームワーク内に含まれるが；それは両方を含む必要はない。Fdフラグメントは、例えば、2つのVH領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体フラグメント、抗体変種または結合ドメインの形式のさらなる例は、（1）VL、VH、CLおよびCH1ドメインを有する一価のフラグメントである、Fabフラグメント；（2）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを有する二価のフラグメントである、F(ab')2フラグメント；（3）2つのVHおよびCH1ドメインを有する、Fdフラグメント；（4）抗体の1つのアームのVLおよびVHドメインを有する、Fvフラグメント、（5）VHドメインを有する、dAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；（6）単離された相補性決定領域（CDR）ならびに（7）単鎖Fv（scFv）を含み、後者が好ましい（例えば、scFVライブラリ由来のもの）。本発明にしたがう抗体コンストラクトの態様の例は、例えば、WO 00/006605、WO 2005/040220、WO 2008/119567、WO 2010/037838、WO 2013/026837、WO 2013/026833、US 2014/0308285、US 2014/0302037、WO 2014/144722、WO 2014/151910およびWO 2015/048272に記載されている。
「結合ドメイン」または「〜に結合するドメイン」の定義には、全長抗体のフラグメント、例えば、VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2または「rIgG」（「半抗体」）も含まれる。本発明にしたがう抗体コンストラクトはまた、抗体変種とも呼ばれる、抗体の修飾されたフラグメント、例えば、scFv、di-scFvまたはbi(s)-scFv、scFv-Fc、scFv-ジッパー、scFab、Fab2、Fab3、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（Tandab's）、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFv、「マルチボディ」、例えばトリアボディまたはテトラボディ、および単一ドメイン抗体、例えばナノボディまたは他のV領域もしくはドメインに非依存的に抗原もしくはエピトープに特異的に結合するVHH、VHもしくはVLであり得る1つのみの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体を含み得る。
本明細書で使用される場合、「単鎖Fv」、「単鎖抗体」または「scFv」という用語は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが定常領域を欠く単一ポリペプチド鎖抗体フラグメントを表す。通常、単鎖抗体はさらに、VHおよびVLドメインの間に、それが抗原への結合を可能にする所望の構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)においてPluckthunによって詳細に議論されている。米国特許第4,694,778号および同第5,260,203号；国際特許出願公開第WO 88/01649号；Bird (1988) Science 242:423-442；Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Ward et al. (1989) Nature 334:54454；Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041に記載されるものを含む、単鎖抗体を作製する様々な方法が公知である。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性、多重特異性、ヒトおよび／もしくはヒト化ならびに／または合成性であり得る。
さらに、「抗体コンストラクト」という用語の定義は、一価、二価および多価（polyvalent/multivalent）コンストラクト、したがって2つのみの抗原性構造に特異的に結合する二重特異性コンストラクトならびに別個の結合ドメインを通じて3つ以上の抗原性構造、例えば3つ、4つまたはそれ以上に特異的に結合する多重特異性コンストラクトを含む。さらに、「抗体コンストラクト」という用語の定義は、1つのみのポリペプチド鎖からなる分子および同一（ホモ二量体、ホモ三量体もしくはホモオリゴマー）または異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体もしくはヘテロオリゴマー）のいずれかであり得る2つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上記抗体およびその変種または誘導体の例は、特に、Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988)およびUsing Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dubel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010およびLittle, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009に記載されている。
本明細書で使用される「二重特異性」という用語は、「少なくとも二重特異性」である抗体コンストラクトを表す、すなわち、それは少なくとも第1の結合ドメインおよび第2の結合ドメインを含み、第1の結合ドメインが1つの抗原または標的（ここでは、BCMA）に結合し、第2の結合ドメインが別の抗原または標的（ここでは、CD3）に結合することを表す。したがって、本発明にしたがう抗体コンストラクトは、少なくとも2つの異なる抗原または標的に対する特異性を有する。例えば、第1のドメインは、好ましくは、本明細書に記載される種の1つまたは複数のCD3εの細胞外エピトープに結合しない。「標的細胞表面抗原」という用語は、細胞によって発現され、かつ本明細書に記載される抗体コンストラクトがアクセスできるようその細胞表面上に存在する抗原構造を表す。それは、タンパク質、好ましくはタンパク質の細胞外部分、または炭水化物構造、好ましくはタンパク質、例えば糖タンパク質の炭水化物構造であり得る。それは、好ましくは腫瘍抗原である。本発明の「二重特異性抗体コンストラクト」という用語はまた、多重特異性抗体コンストラクト、例えば、3つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト、または4つ以上（例えば、4つ、5つ・・・）の特異性を有するコンストラクトを含む。
本発明にしたがう抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは自然には生じず、それらは天然産物と明確に異なる。したがって「二重特異性」抗体コンストラクトまたは免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体または免疫グロブリンである。二重特異性抗体コンストラクトは、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含む様々な方法によって製造することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990)を参照のこと。
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも2つの結合ドメインおよび可変ドメイン（VH/VL）は、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含む場合または含まない場合がある。「ペプチドリンカー」という用語は、本発明にしたがい、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変および／または結合）ドメインと他方の（可変および／または結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を含む。ペプチドリンカーは、第3のドメインを本発明の抗体コンストラクトの他のドメインに融合するためにも使用され得る。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、それがいかなる重合活性も有さないということである。特に適当なペプチドリンカーは、米国特許第4,751,180号および同第4,935,233号またはWO 88/09344に記載されるものである。ペプチドリンカーは、他のドメインまたはモジュールまたは領域（例えば、半減期延長ドメイン）を本発明の抗体コンストラクトに付加するためにも使用され得る。
本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、「インビトロ生成抗体コンストラクト」である。この用語は、可変領域のすべてまたは一部（例えば、少なくとも1つのCDR）が非免疫細胞選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップまたは抗原に結合するそれらの能力に関して候補配列を試験することができる任意の他の方法により作製される上記定義にしたがう抗体コンストラクトを表す。したがってこの用語は、好ましくは、専ら動物の免疫細胞におけるゲノム再構成によって生成される配列を除外する。「組み換え抗体」は、組み換えDNA技術または遺伝子工学の使用を通じて作製される抗体である。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（mAb）またはモノクローナル抗体コンストラクトという用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表す、すなわち、その集団を構成している個々の抗体が、微量で存在し得る潜在的な自然変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、典型的に異なる決定基（またはエピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来的な（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、単一の抗原部位または抗原上の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物によって合成される、したがって他の免疫グロブリンが混入しないという利点がある。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、その抗体が任意の特定の方法によって製造されることを必要とするものと解釈されるべきではない。
モノクローナル抗体の調製のために、継続的な細胞株培養物により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Koehler et al., Nature 256: 495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得、または、組み換えDNA法（例えば、米国特許第4,816,567号を参照のこと）によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を製造するさらなる技術の例は、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72）およびEBVハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96）を含む。
ハイブリドーマは次に、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する1つまたは複数のハイブリドーマを同定するために、標準的な方法、例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）および表面プラズモン共鳴（BIACORE（商標））分析を用いてスクリーニングされ得る。任意の形態の関連抗原、例えば、組み換え抗原、天然に存在する形態、それらの任意の変種またはフラグメントおよびそれらの抗原性ペプチド、が免疫原として使用され得る。BIAcoreシステムで用いられる表面プラズモン共鳴は、標的細胞表面抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めるために使用され得る（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13）。
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法は、タンパク質発現ライブラリ、例えばファージディスプレイまたはリボソームディプレイライブラリ、のスクリーニングを含む。ファージディスプレイは、例えば、Ladnerらの米国特許第5,223,409号；Smith (1985) Science 228: 1315-1317; Clackson et al. Nature, 352: 624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載されている。
ディスプレイライブラリの使用に加えて、関連抗原は、非ヒト動物、例えばげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ウサギまたはラット）を免疫刺激するために使用され得る。1つの態様において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部分を含む。例えば、マウス抗体産生能を欠失しているマウス系統をヒトIg（免疫グロブリン）遺伝子座の大フラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体が製造および選択され得る。例えば、XENOMOUSE（商標）、Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21、US 2003-0070185、WO96/34096およびWO96/33735を参照のこと。
モノクローナル抗体はまた、非ヒト動物から得ることができ、その後に、当技術分野で公知の組み換えDNA技術を用いて修飾、例えばヒト化、脱免疫化、キメラ化等され得る。修飾抗体コンストラクトの例は、非ヒト抗体のヒト化変種、「親和性成熟」抗体（例えば、Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992)およびLowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)を参照のこと）およびエフェクター機能が変更された抗体変異体（例えば、米国特許第5,648,260号、Kontermann and Dubel (2010), 前記およびLittle (2009), 前記を参照のこと）を含む。
免疫学において、親和性成熟は、B細胞が免疫応答の過程で抗原に対する親和性が向上した抗体を産生するプロセスである。同一の抗原に対する反復的な暴露により、宿主は親和性が段階的に向上した抗体を産生するであろう。天然のプロトタイプと同様、インビトロ親和性成熟は、成熟と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟は、抗体、抗体コンストラクトおよび抗体フラグメントを最適化するための使用に成功している。CDR内の無作為変異は、放射線照射、化学的変異誘発物質またはエラープローンPCRを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェーンシャッフリングによって増大させることができる。通常、ファージディスプレイ等のディスプレイ法を用いる2または3ラウンドの変異と選択で、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが生成される。
抗体コンストラクトの好ましいタイプのアミノ酸置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含むものである。通常、さらなる開発のために選択される得られた変種は、それらの元となった親抗体と比べて改善された生物学的特性を有するであろう。そのような置換変種を生成する簡便な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、6〜7部位）が、各部位ですべての可能性のあるアミノ酸置換が生じるよう変異される。そのようにして生成された抗体変種は、繊維状ファージ粒子から1価の形態で、各粒子内にパッケージされたM13の遺伝子III産物との融合物として提示される。ファージディプレイされた変種は次いで、本明細書に開示されるようにしてそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャン変異誘発が行われ、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基が同定され得る。あるいはまたは加えて、結合ドメインと例えばヒトBCMAの間の接触点を同定するために、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書で詳述される技術にしたがう置換の候補である。そのような変種が生成された後、変種のパネルが本明細書に記載されるスクリーニングに供され、そして1つまたは複数の関連するアッセイにおいて優れた特性を示す抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
本発明のモノクローナル抗体および抗体コンストラクトは、具体的に、重鎖および／または軽鎖の一部がある特定の種に由来するまたはある特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、その鎖の残りの部分が別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびに、所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメント、を含む（米国特許第4,816,567号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81; 6851-6855 (1984)）。本明細書における関心対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。キメラ抗体を作製する様々なアプローチが記載されている。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda et al., Nature 314: 452, 1985, Cabillyらの米国特許第4,816,567号; Bossらの米国特許第4,816,397号; TanaguchiらのEP0171496；EP0173494; およびGB2177096を参照のこと。
抗体、抗体コンストラクト、抗体フラグメント、または抗体変種はまた、例えばWO 98/52976またはWO 00/34317に開示される方法によるヒトT細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によって修飾され得る。簡潔に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインが、MHCクラスIIに結合するペプチドについて分析され得；これらのペプチドが、（WO 98/52976およびWO 00/34317で定義される）潜在的T細胞エピトープとなる。WO 98/52976およびWO 00/34317に記載されるように、潜在的T細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング（peptide threading）」と呼ばれるコンピューターモデリングアプローチが適用され得、加えて、ヒトMHCクラスII結合ペプチドのデータベースが、VHおよびVL配列に存在するモチーフについて検索され得る。これらのモチーフは、18個の主要MHCクラスII DRアロタイプのいずれかに結合し、したがって、潜在的T細胞エピトープを構成する。検出された潜在的T細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することによってまたは好ましくは単一アミノ酸置換によって除去され得る。典型的に、保存的置換が行われる。すべてではないが多くの場合、ヒト生殖系列抗体配列内の位置で一般的なアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖系列配列は、例えば、Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16(5): 237-242;およびTomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638に開示されている。V BASEディレクトリは、（Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UKによってコンパイルされた）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合的なディレクトリを提供する。これらの配列は、例えばフレームワーク領域およびCDRのための、ヒト配列の供給源として使用することができる。例えば米国特許第6,300,064号に記載されるような、コンセンサスヒトフレームワーク領域も使用され得る。
「ヒト化」抗体、抗体コンストラクト、変種、またはそれらのフラグメント（例えば、Fv、Fab、Fab'、F(ab')2または抗体の他の抗原結合性部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、大部分がヒト配列である抗体または免疫グロブリンである。その大部分に関して、ヒト化抗体は、その超可変領域（またはCDR）由来の残基が所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト（例えば、げっ歯類）種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ハムスターまたはウサギの超可変領域由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域（FR）残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、本明細書で使用される「ヒト化抗体」はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにおいても見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練および最適化するためになされる。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Fc）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、の少なくとも一部分を含み得る。さらなる詳細については、Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)を参照のこと。
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないFv可変ドメインの配列をヒトFv可変ドメイン由来の等価な配列で置き換えることによって生成され得る。ヒト化抗体またはそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Morrison (1985) Science 229: 1202-1207によって；Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214によって；ならびにUS 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205；およびUS 6,407,213によって提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも1つ由来の免疫グロブリンFv可変ドメインのすべてまたは一部分をコードする核酸配列の単離、操作および発現を含む。そのような核酸は、上記のような、既定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマから、およびその他の供給源から、取得され得る。ヒト化抗体分子をコードする組み換えDNAは、次いで、適当な発現ベクターにクローニングされ得る。
ヒト化抗体はまた、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子を発現するが内因性のマウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現することができないトランスジェニック動物、例えばマウスを用いて産生され得る。Winterは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なCDR移植法を記載している（米国特許第5,225,539号）。特定のヒト抗体のCDRのすべてが非ヒトCDRの少なくとも一部分で置き換えられることも、またはCDRの一部のみが非ヒトCDRで置き換えられることもある。既定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要となる数のCDRを置き換えることのみが必要とされる。
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖系列置換および／または復帰変異の導入によって最適化され得る。そのような変更された免疫グロブリン分子は、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982およびEP 239 400）。
「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」および「ヒト結合ドメイン」という用語は、例えば、Kabat et al. (1991)（前記）によって記載されたものを含む、当技術分野で公知のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する抗体領域、例えば可変および定常領域またはドメインを有する抗体、抗体コンストラクトおよび結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクトまたは結合ドメインは、例えばCDRに、特にCDR3に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクトまたは結合ドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置き換えられた、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上の位置を有し得る。しかし、本明細書で使用されるヒト抗体、抗体コンストラクトおよび結合ドメインの定義はまた、Xenomouse等の技術またはシステムを使用することによって得ることができる、非人工的および／または遺伝的にのみ変更された抗体のヒト配列を含む「完全ヒト抗体」も意図している。好ましくは、「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含まない。
いくつかの態様において、本発明の抗体コンストラクトは、「単離」されたまたは「実質的に純粋」な抗体コンストラクトである。「単離」または「実質的に純粋」は、本明細書に開示される抗体コンストラクトを表現するために使用される場合、その産生環境の成分から同定、分離および／または回収された抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境由来のすべての他の成分を付随しないまたは実質的に付随しない。その産生環境の混入成分、例えば、組み換えトランスフェクト細胞から発生する成分は、典型的にそのポリペプチドの診断または治療用途と干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。抗体コンストラクトは、例えば、与えられたサンプルにおいて総タンパク質の少なくとも約5重量％または少なくとも約50重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、その環境に依存して総タンパク質含量の5重量％〜99.9重量％を構成し得ることが理解される。ポリペプチドは、それが高い濃度レベルで生成されるよう、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通じて有意に高い濃度で生成され得る。この定義は、当技術分野で公知の幅広い生物および／または宿主細胞における抗体コンストラクトの産生を含む。好ましい態様において、抗体コンストラクトは、（1）スピニングカップシークエネーターの使用によりN末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで、または（2）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる非還元もしくは還元条件下でのSDS-PAGEによる均質性まで精製される。しかし、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
「結合ドメイン」という用語は、本発明との関係で、特定の標的エピトープまたは標的分子（抗原）上の特定の標的部位（ここではBCMAおよびCD3）にそれぞれ（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを特徴づける。（BCMAを認識する）第1の結合ドメインの構造および機能は、ならびに好ましくは第2の結合ドメイン（CD3を認識する）の構造および／または機能もまた、抗体の、例えば全長もしくは全免疫グロブリン分子の構造および／もしくは機能に基づき、かつ/または、抗体もしくはそのフラグメントの可変重鎖（VH）および／もしくは可変軽鎖（VL）ドメインから得られている。好ましくは、本発明にしたがい、第1の結合ドメインは、3つの軽鎖CDR（すなわち、VL領域のCDR1、CDR2およびCDR3）ならびに／または3つの重鎖CDR（すなわち、VH領域のCDR1、CDR2およびCDR3）の存在によって特徴づけられる。第2の結合ドメインはまた、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。より好ましくは、第2の結合ドメインは、少なくとも3つの軽鎖CDR（すなわち、VL領域のCDR1、CDR2およびCDR3）ならびに／または3つの重鎖CDR（すなわち、VH領域のCDR1、CDR2およびCDR3）を含む。第1および／または第2の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のCDR配列をスキャフォールドに移植する以外のファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング法によって作製されるまたは入手可能であることも想定されている。
本発明にしたがい、結合ドメインは、1つまたは複数のポリペプチドの形態である。そのようなポリペプチドは、タンパク質性部分および非タンパク質性部分（例えば、化学リンカーまたは化学架橋剤、例えばグルタルアルデヒド）を含み得る。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント、および通常30未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、（アミノ酸の鎖を形成する）共有ペプチド結合を通じて相互に連結された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、通常30超のアミノ酸からなる分子のグループを表す。ポリペプチドはさらに、多量体、例えば二量体、三量体およびより高次のオリゴマーを形成し得る、すなわち、2つ以上のポリペプチド分子からなり得る。そのような二量体、三量体等を形成するポリペプチド分子は、同一または非同一であり得る。その結果、そのような多量体の対応する高次構造は、ホモまたはヘテロ二量体、ホモまたはヘテロ三量体等と称される。ヘテロ多量体の例は、その天然形態において、2つの同一の軽ポリペプチド鎖および2つの同一の重ポリペプチド鎖からなる抗体分子である。「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質を表す。本明細書において言及される「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」はまた、化学修飾、例えばペグ化されたものであり得る。そのような修飾は、当技術分野で周知であり、本明細書の以下に記載されている。
BCMAに結合する結合ドメインおよび／またはCD3εに結合する結合ドメインは、ヒト結合ドメインであることが好ましい。少なくとも1つのヒト結合ドメインを含む抗体および抗体コンストラクトは、非ヒト、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはウサギ）可変および／または定常領域を有する抗体または抗体コンストラクトに伴う問題の一部を回避する。そのようなげっ歯類由来タンパク質の存在は、抗体もしくは抗体コンストラクトの迅速なクリアランスを引き起こし得、または患者による抗体もしくは抗体コンストラクトに対する免疫応答を発生させ得る。げっ歯類由来抗体または抗体コンストラクトの使用を回避するため、げっ歯類が完全ヒト抗体を産生するようにするげっ歯類へのヒト抗体機能の導入を通じてヒトまたは完全ヒト抗体／抗体コンストラクトが作製され得る。
YACにおいてメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローン化および再構築するならびにそれらをマウス生殖系に導入する能力は、非常に大きいまたは粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明およびヒト疾患の有用なモデルの作製に関する強力なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するそのような技術の利用は、発生時のヒト遺伝子産物の発現および調節、それらと他の体系とのコミュニケーションならびに疾患の誘導および進行におけるそれらの関与に関して独自の見解を提供することができる。
そのようなストラテジーの重要な応用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ig遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig)遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現および構築ならびにB細胞の発生におけるそれらの役割の根底にあるメカニズムを研究する機会を提供する。さらに、そのようなストラテジーは、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンである完全ヒトモノクローナル抗体（mAb）の産生のための理想的な供給源を提供し得る。完全ヒト抗体または抗体コンストラクトは、マウスまたはマウス由来mAbに固有の免疫原性およびアレルギー反応を最小化すること、したがって投与される抗体／抗体コンストラクトの有効性および安全性を向上させることが期待される。完全ヒト抗体または抗体コンストラクトの使用は、反復的な化合物投与を必要とする慢性および再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫および癌の処置において大きな利益を提供することが期待され得る。
この目的に対する1つのアプローチは、マウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体の大レパートリーを産生することを期待して、マウス抗体産生性を欠くマウス系統をヒトIg遺伝子座の大フラグメントを用いて操作することであった。大きなヒトIgフラグメントは、幅の大きな遺伝子多様性ならびに抗体産生および発現の適切な調節を保存するであろう。抗体の多様化および選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することによって、これらのマウス系統において再現されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む関心対象の任意の抗原に対する高親和性抗体を生成するはずである。ハイブリドーマ技術を使用することで、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトmAbを容易に製造および選択することができる。この一般的なストラテジーは、最初のXenoMouseマウス系統の生成と関連して実証された（Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)を参照のこと）。このXenoMouse系統は、それぞれコア可変および定常領域配列を含むヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座の245 kbおよび190 kbサイズの生殖系構成フラグメントを含む酵母人工染色体（YAC）を用いて操作された。このヒトIg含有YACは、抗体の再構成および発現の両方に関してマウスシステムと適合することが証明され、不活性化されたマウスIg遺伝子と置き換わることが可能であった。このことは、B細胞の発生を誘導し、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを生成し、そして抗原特異的なヒトmAbを生成するそれらの能力によって実証された。これらの結果はまた、多数のV遺伝子、追加の調節エレメントおよびヒトIg定常領域を含むヒトIg遺伝子座の大きな部分の導入が、感染および免疫刺激に対するヒト液性応答に特徴的な実質的に完全なレパートリーを再現し得ることを示唆した。Greenらの成果は、最近、ヒト重鎖遺伝子座およびカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガ塩基サイズの生殖系構成YACフラグメントの導入を通じたヒト抗体レパートリーのおよそ80％超の導入に拡張された。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)および米国特許出願第08/759,620号を参照のこと。
XenoMouseマウスの製造はさらに、米国特許出願第07/466,008号、同第07/610,515号、同第07/919,297号、同第07/922,649号、同第08/031,801号、同第08/112,848号、同第08/234,145号、同第08/376,279号、同第08/430,938号、同第08/464,584号、同第08/464,582号、同第08/463,191号、同第08/462,837号、同第08/486,853号、同第08/486,857号、同第08/486,859号、同第08/462,513号、同第08/724,752号および同第08/759,620号ならびに米国特許第6,162,963号、同第6,150,584号、同第6,114,598号、同第6,075,181号および同第5,939,598号ならびに日本国特許第3 068 180 B2号、同第3 068 506 B2号および同第3 068 507 B2号で議論され輪郭が描かれている。Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997)およびGreen and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)、EP 0 463151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310およびWO 03/47336も参照のこと。
代替のアプローチにおいて、GenPharm International, Inc.,を含む他社は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用した。このミニ遺伝子座アプローチにおいては、外因性のIg遺伝子座が、このIg遺伝子座由来の細片（個々の遺伝子）を含めることを通じて模倣される。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、ミュー定常領域および第2の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物に挿入するためのコンストラクトを形成する。このアプローチは、Suraniらに対する米国特許第5,545,807号ならびに各々LonbergおよびKayに対する米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、同第5,814,318号、同第5,877,397号、同第5,874,299号および同第6,255,458号、KrimpenfortおよびBernsに対する米国特許第5,591,669号および同第6,023.010号、Bernsらに対する米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号および同第5,789,215号ならびにChoiおよびDunnに対する米国特許第5,643,763号、ならびにGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号、同第07/575,962号、同第07/810,279号、同第07/853,408号、同第07/904,068号、同第07/990,860号、同第08/053,131号、同第08/096,762号、同第08/155,301号、同第08/161,739号、同第08/165,699号、同第08/209,741号に記載されている。EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852およびWO 98/24884ならびに米国特許第5,981,175号も参照のこと。さらに、Taylor et al. (1992)、Chen et al. (1993)、Tuaillon et al. (1993)、Choi et al. (1993)、Lonberg et al. (1994)、Taylor et al. (1994)およびTuaillon et al. (1995)、Fishwild et al. (1996)を参照のこと。
Kirinもまた、ミクロセル融合を通じて大きな染色体片または染色体全体が導入されたマウスからのヒト抗体の生成を実証した。欧州特許出願第773 288号および同第843 961号を参照のこと。Xenerex Biosciencesは、ヒト抗体の潜在的生成のための技術を開発している。この技術において、SCIDマウスは、ヒトリンパ細胞、例えばBおよび／またはT細胞で再構成される。次いでマウスは抗原で免疫刺激され、その抗原に対する免疫応答を生じ得る。米国特許第5,476,996号、同第5,698,767号および同第5,958,765号を参照のこと。
ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答は、産業界がキメラまたはそれ以外の方法でヒト化された抗体を調製する要因となった。しかし、特定のヒト抗キメラ抗体（HACA）応答が、特にこの抗体の慢性的なまたは多用量の利用において観察されるであろうと予想される。したがって、HAMAまたはHACA応答の懸念および／または影響を取り除くために、BCMAに対するヒト結合ドメインおよびCD3εに対するヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいであろう。
「（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）〜に対する」および「（特異的に）反応する」という用語は、本発明にしたがい、結合ドメインが、標的分子（抗原）（ここではBCMAおよびCD3ε）上の所与のエピトープまたは所与の標的部位とそれぞれ相互作用または特異的に相互作用することを意味する。
「エピトープ」という用語は、結合ドメイン、例えば抗体もしくは免疫グロブリンまたは抗体もしくは免疫グロブリンの誘導体、フラグメント、もしくは変種が特異的に結合する抗原上の部位を表す。「エピトープ」は抗原性であり、したがってエピトープという用語は本明細書においてときに「抗原構造」または「抗原性決定基」も表す。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。この結合／相互作用はまた、「特異的認識」を定義することが理解されている。
「エピトープ」は、連続アミノ酸またはタンパク質の三次元折り畳みによって近接することになる非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「直線状エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が認識されるエピトープを含んでいるエピトープである。直線状エピトープは、典型的に、特有の配列内に、少なくとも3つまたは少なくとも4つ、およびより通常は少なくとも5つまたは少なくとも6つまたは少なくとも7つ、例えば約8〜約10のアミノ酸を含む。
「立体構造エピトープ」は、直線状エピトープに対して、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープの唯一の定義要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープよりも多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチドもしくはタンパク質またはそれらのフラグメント、の3次元構造を認識する（本発明の場合、結合ドメインの1つに対する抗原構造が標的細胞表面抗原タンパク質内に含まれている）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれ三次元構造が形成される場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は近接した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法は、x線結晶解析、二次元核磁気共鳴（2D-NMR）分光分析および部位特異的スピンラベルおよび電子常磁性共鳴（EPR）分光分析を含むがこれらに限定されない。
エピトープマッピングの方法を以下に記載する。ヒトBCMAタンパク質内の領域（連続アミノ酸ストレッチ）が非ヒトおよび非霊長類BCMA（例えば、マウスBCMAであるが、ニワトリ、ラット、ハムスター、ウサギ等の他のものも想定され得る）の対応する領域と交換／置換される場合、使用される非ヒト、非霊長類BCMAに対してその結合ドメインが交差反応性でない限り、結合ドメインの結合性の減少が起こり得る。その減少は、ヒトBCMAタンパク質内の各領域に対する結合を100％として、ヒトBCMAタンパク質内の各領域との比較で、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％または50％；より好ましくは少なくとも60％、70％または80％、最も好ましくは90％、95％または100％でさえある。上記のヒトBCMA／非ヒトBCMAキメラをCHO細胞において発現させることが想定されている。ヒトBCMA／非ヒトBCMAキメラを、異なる膜結合タンパク質、例えばEpCAM、の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインと融合させることも想定されている。
エピトープマッピングの代替または追加の方法において、結合ドメインによって認識される特定領域を決定するために、ヒトBCMA細胞外ドメインの様々な短縮バージョンが作製され得る。これらの短縮バージョンにおいて、異なる細胞外BCMAドメイン／サブドメインまたは領域がN末端側から段階的に除去される。短縮BCMAバージョンがCHO細胞において発現され得ることが想定されている。短縮BCMAバージョンが、異なる膜結合タンパク質、例えばEpCAM、の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインと融合され得ることも想定されている。短縮BCMAバージョンがそれらのN末端にシグナルペプチドドメイン、例えばマウスIgG重鎖シグナルペプチド由来のシグナルペプチドを含み得ることも想定されている。短縮BCMAバージョンが、それらのN末端に（シグナルペプチドの後に）、細胞表面上でのそれらの正確な発現の検証を可能にするv5ドメインを含み得ることもさらに想定されている。結合性の減少または消失は、結合ドメインによって認識されるいかなるBCMA領域も含まない短縮BCMAバージョンにおいて起こると考えられる。結合性の減少は、ヒトBCMAタンパク質全体（またはその細胞外領域もしくはドメイン）に対する結合を100として、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％；より好ましくは少なくとも60％、70％、80％、最も好ましくは90％、95％または100％でさえある。
抗体コンストラクトまたは結合ドメインによる認識に対するBCMAの特定の残基の寄与を決定するさらなる方法は、分析したい各残基を例えば部位特異的変異誘発を通じてアラニンで置き換えるアラニンスキャン（例えば、Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun; 5(3): 302-7を参照のこと）である。アラニンが使用される理由は、かさ高くなく、化学的に不活性であり、にもかかわらず多くの他のアミノ酸が有している参照2次構造を模倣するメチル官能基を有しているためである。ときどき、変異させる残基のサイズを保存することが望まれる例では、かさ高いアミノ酸、例えばバリンまたはロイシンが使用され得る。アラニンスキャンは、長い時間使用されている成熟した技術である。
結合ドメインとそのエピトープまたはエピトープを含む領域の間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質または抗原（ここでは、それぞれ、BCMAおよびCD3）上のエピトープ／エピトープを含む領域に対して感知できる親和性を示すこと、および通常、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に対して有意な反応性を示さないことを暗示する。「感知できる親和性」は、約10-6 M（KD）またはそれより強い親和性の結合を含む。好ましくは、結合は、結合親和性が約10-12〜10-8 M、10-12〜10-9 M、10-12〜10-10 M、10-11〜10-8 M、好ましくは約10-11〜10-9 Mである場合に特異的とみなされる。結合ドメインが標的に特異的に反応または結合するかどうかは、特に、標的タンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応を、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に対するその結合ドメインの反応と比較することによって、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に本質的または実質的に結合しない（すなわち、第1の結合ドメインは、BCMA以外のタンパク質に結合することができず、第2の結合ドメインは、CD3以外のタンパク質に結合することができない）。他のHLE形式と比較して優れた親和性を有することが、本発明にしたがう抗体コンストラクトの想定される特徴である。そのような優れた親和性は、結果として、インビボでの延長された半減期を示唆する。本発明にしたがう抗体コンストラクトのより長い半減期は、投与期間および頻度を減少させ得、これらは典型的に患者のコンプライアンスの改善に寄与する。これは、本発明の抗体コンストラクトが非常に衰弱したまたは多疾患でさえある癌患者に特に有益であることから、特に重要である。
「本質的／実質的に結合しない」または「結合することができない」という用語は、本発明の結合ドメインが、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に結合しない、すなわち、BCMAまたはCD3のそれぞれに対する結合を100％として、BCMAまたはCD3以外のタンパク質または抗原に対して30％超の反応性を示さないこと、好ましくは20％を超えないこと、より好ましくは10％を超えないこと、特に好ましくは9％、8％、7％、6％または5％を超えないことを意味する。
特異的な結合は、結合ドメインおよび抗原のアミノ酸配列内の特定のモチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次および／または三次構造の結果としてならびにこれらの構造の二次的修飾の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原に対する該部位の単純な結合をもたらし得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、代替的にまたは付加的に、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化等により、シグナルを開始させ得る。
「可変」という用語は、それらの配列内で可変性（variability）を示し、個々の抗体の特異性および結合親和性の決定に関与する、抗体または免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち、「可変ドメイン」）を表す。可変重鎖（VH）と可変軽鎖（VL）の対は、一体となって単一の抗原結合部位を形成する。
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく；それは重鎖および軽鎖の各々の可変領域の部分ドメインに集中している。これらの部分ドメインは、「超可変領域」または「相補性決定領域」（CDR）と呼ばれる。可変ドメインのより保存された（非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（FRMまたはFR）と呼ばれ、6つのCDRが三次元空間内で抗原結合表面を形成するための土台を提供する。天然に存在する重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβシート配置をとる4つのFRM領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）を含み、これらが、ループ接続を形成し、いくつかの例ではβシート構造の一部を形成する3つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、FRMによって近接状態となって一体的に保持されており、他の鎖の超可変領域と共に、抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat et al., 前記を参照のこと）。
「CDR」およびその複数形である「CDRs」という用語は、相補性決定領域を表し、そのうちの3つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（CDR-L1、CDR-L2およびCDR-L3）、3つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3）。CDRは、抗体と抗原の特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与し、それらは抗原特異性の主たる決定基である。
厳密なCDRの境界および長さの定義は、分類および番号付け体系によって異なる。したがってCDRは、本明細書に記載される番号付け体系を含む、Kabat、Chothia、接触（contact）または任意のその他の境界の定義によって表され得る。境界が異なるとしても、これらの体系の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分に関してある程度重複している。したがって、これらの体系にしたがうCDRの定義は、長さおよび隣接するフレームワーク領域との境界領域の点で異なり得る。例えば、Kabat（種間配列変動性に基づくアプローチ）、Chothia（抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ）および／またはMacCallum（Kabat et al., 前記; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; およびMacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732）を参照のこと。抗原結合部位を特徴づけるさらに別の標準は、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されるAbM定義である。例えば、Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)を参照のこと。2つの残基同定技術が同一の領域ではなく重複する領域を定義する程度まで、それらはハイブリッドCDRを定義するために組み合わされ得る。しかし、いわゆるKabat体系にしたがう番号付けが好ましい。
典型的に、CDRは、カノニカル構造に分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（CDR）ループによって採用される主鎖の立体構造を表す。比較構造研究から、6つの抗原結合ループのうちの5つが、利用可能な立体構造に関して限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴づけることができる。したがって抗体間で対応するループは、それらのループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性がみられるにもかかわらず、非常によく似た三次元構造を有し得る（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800）。さらに、採用されるループ構造とその周囲のアミノ酸配列の間に関連性がみられる。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さならびにそのループ内および保存されたフレームワーク内（すなわち、ループ外）の鍵となる位置に存在するアミノ酸残基によって決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの鍵となるアミノ酸残基の存在に基づいてなされ得る。
「カノニカル構造」という用語はまた、例えばKabat（Kabat et al., 前記）によりカタログ化されたように、抗体の直線配列に対する考慮を含み得る。Kabatの番号付けスキーム（体系）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基の番号付けを共通の様式で行うために広く採用されている標準であり、本明細書の他所でも述べられているように本発明に適用される好ましいスキームである。さらなる構造の考慮も、抗体のカノニカル構造を決定するために使用され得る。例えば、Kabatの番号付けによっては十分に反映されない違いは、Chothiaらの番号付け体系によって説明され得および／またはその他の技術、例えば結晶学および二次元もしくは三次元コンピューターモデリング、によって明らかにされ得る。したがって、所定の抗体配列は、特に、（例えば、様々なカノニカル構造をライブラリに含めたいという要望に基づき）適当なシャーシ（chassis）配列の同定を可能にするカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のKabatの番号付けおよびChothia et al., 前記により記載される構造の考慮ならびに抗体構造のカノニカルな局面の構築に関するそれらの示唆は、文献に記載されている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構成は、当技術分野で周知である。抗体構造のレビューについては、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988を参照のこと。
軽鎖のCDR3および特に重鎖のCDR3は、軽鎖および重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定要因を構成し得る。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖CDR3が、抗原と抗体の間の主要接触領域を構成するようである。抗体の結合特性を変化させるためおよびどの残基が抗原の結合に寄与するかを決定するために、CDR3のみを変化させるインビトロ選択スキームが使用され得る。したがってCDR3は典型的に、抗体結合部位における分子的多様性の最大の供給源である。例えば、H3は、2アミノ酸残基程度の短さであっても、または26アミノ酸超であってもよい。
古典的な全長抗体または免疫グロブリンにおいて、各軽（L)鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重（H）鎖に連結され、2つのH鎖は、H鎖のアイソタイプに依存して1つまたは複数のジスルフィド結合によって相互に連結される。VHに最も近位のCHドメインは通常、CH1と呼ばれる。定常（「C」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存的な細胞媒介性の細胞傷害性および補体活性化などの様々なエフェクター機能を示す。抗体のFc領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、かつ例えば、細胞表面に位置するFc受容体と相互作用することができる。
抗体遺伝子の配列は組み合わせおよび体細胞変異後に高度な多様性を示し、これらの多様化した遺伝子は1010個の異なる抗体分子をコードすると見積もられる（Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995）。免疫系はそのようにして免疫グロブリンのレパートリーを提供する。「レパートリー」という用語は、全体または一部が少なくとも1つの免疫グロブリンをコードする少なくとも1つの配列に由来する少なくとも1つのヌクレオチド配列を表す。これらの配列は、インビボでの重鎖のV、DおよびJセグメントならびに軽鎖のVおよびJセグメントの再配置によって生成され得る。あるいは、これらの配列は、再配置を起こさせるもの、例えばインビトロ刺激、に応じて細胞から生成され得る。あるいは、これらの配列の一部またはすべてが、DNAスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発およびその他の方法によって取得され得る、例えば、米国特許第5,565,332号を参照のこと。レパートリーは、1つのみの配列を含み得、または遺伝的に多様なコレクションの中の配列を含む、複数の配列を含み得る。
「Fc部分」または「Fc単量体」という用語は、本発明との関係で、免疫グロブリン分子のCH2ドメインの機能を有する少なくとも1つのドメインおよびCH3ドメインの機能を有する少なくとも1つのドメインを含むポリペプチドを意味する。「Fc単量体」という用語から明らかなように、これらのCHドメインを含むポリペプチドは、「ポリペプチド単量体」である。Fc単量体は、少なくとも重鎖の第1の定常領域免疫グロブリンドメイン（CH1）を除く免疫グロブリンの定常領域のフラグメントを含むが、少なくとも1つのCH2ドメインの機能的部分および1つのCH3ドメインの機能的部分を維持しており、CH2ドメインがCH3ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチドであり得る。この定義の好ましい局面において、Fc単量体は、Ig-Fcヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域の一部を含み、ヒンジ領域がCH2ドメインのアミノ末端側にあるポリペプチド定常領域であり得る。本発明のヒンジ領域が二量体化を促進することが想定される。そのようなFcポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン領域のパパイン消化（当然、2つのFcポリペプチドの二量体を生じる）によって取得され得るがこれに限定されない。この定義の別の局面において、Fc単量体は、CH2領域およびCH3領域の一部を含むポリペプチド領域であり得る。そのようなFcポリペプチド分子は、例えば、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって取得され得るがこれに限定されない。1つの態様において、Fc単量体のポリペプチド配列は、IgG1 Fc領域、IgG2 Fc領域、IgG3 Fc領域、IgG4 Fc領域、IgM Fc領域、IgA Fc領域、IgD Fc領域およびIgE Fc領域のFcポリペプチド配列と実質的に類似する（例えば、Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)を参照のこと）。免疫グロブリン間には一定のばらつきが存在するため、および単に明確性のために、Fc単量体は、IgA、IgDおよびIgGの少なくとも2つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインならびにIgEおよびIgMの少なくとも3つの重鎖定常領域免疫グロブリンドメインを表す。記載されているように、Fc単量体はまた、これらのドメインのN末端側にフレキシブルヒンジを含み得る。IgAおよびIgMの場合、Fc単量体は、J鎖を含み得る。IgGの場合、Fc部分は、免疫グロブリンドメインCH2およびCH3ならびに最初の2つのドメインとCH2の間のヒンジを含む。Fc部分の境界は異なり得るが、機能的ヒンジ、CH2およびCH3ドメインを含むヒトIgG重鎖Fc部分の例は、例えば、Kabatにしたがう番号で、CH3ドメインのカルボキシル末端の残基D231（ヒンジドメインの - 以下の表1のD234に対応）〜P476、それぞれL476（IgG4の場合）を含むことで定義され得る。ペプチドリンカーを通じて相互に融合される2つのFc部分またはFc単量体は、本発明の抗体コンストラクトの第3のドメインを定義し、これはまたscFcドメインと定義され得る。
本発明の1つの態様において、本明細書に開示されるscFcドメイン、それぞれ相互に融合されるFc単量体は、抗体コンストラクトの第3のドメインにのみ含まれることが想定される。
本発明に沿って、IgGヒンジ領域は、表1に示されるKabat番号を用いた類似性によって同定され得る。上記に沿って、本発明のヒンジドメイン／領域は、Kabat番号にしたがうD234〜P243のIgG1配列ストレッチに対応するアミノ酸残基を含むことが想定される。本発明のヒンジドメイン／領域がIgG1ヒンジ配列DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 99）（以下の表1に示されるストレッチD234〜P243に対応する - ヒンジ領域が二量体化を促進する限り、この配列のバリエーションもまた想定される）を含むまたはからなることも同様に想定される。本発明の好ましい態様において、抗体コンストラクトの第3のドメイン内のCH2ドメインのKabat位置314のグリコシル化部位はN314X置換によって除去され、ここでXはQではない任意のアミノ酸である。この置換は、好ましくは、N314G置換である。より好ましい態様において、CH2ドメインはさらに、以下の置換を含む（位置はKabatにしたがう）：V321CおよびR309C（これらの置換は、Kabat位置309および321にドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
本発明の抗体コンストラクトの第3のドメインがアミノからカルボキシルの順で：
DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 99）（すなわち、ヒンジ）-CH2-CH3-リンカー- DKTHTCPPCP（SEQ ID NO: 99）（すなわち、ヒンジ）-CH2-CH3を含むまたはからなることも想定される。上記抗体コンストラクトのペプチドリンカーは、好ましい態様において、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser（SEQ ID NO: 1）またはその多量体、すなわち(Gly4Ser)xによって特徴付けられ、ここでxは5またはそれ以上の整数（例えば、5、6、7、8等またはそれ以上）であり、6が好ましい（(Gly4Ser)6）。このコンストラクトはさらに、上記の置換N314X、好ましくはN314Gならびに／またはさらなる置換V321CおよびR309Cを含み得る。本明細書に定義される本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様において、第2のドメインがヒトおよび／またはマカクCD3ε鎖の細胞外エピトープに結合することが想定される。
（表１）ヒンジ領域のアミノ酸残基のKabat番号
Figure 0006959011
本発明のさらなる態様において、ヒンジドメイン／領域は、IgG2サブタイプのヒンジ配列
Figure 0006959011
、IgG3サブタイプのヒンジ配列
Figure 0006959011
および／またはIgG4サブタイプのヒンジ配列
Figure 0006959011
を含むまたはからなる。IgG1サブタイプのヒンジ配列は、以下の配列：
Figure 0006959011
（表1およびSEQ ID NO: 104に示される）であり得る。したがって、これらのコアヒンジ領域もまた、本発明において想定されている。
IgG CH2およびIgG CH3ドメインの位置および配列は、表2に示されるKabat番号を用いる類似性によって同定され得る。
（表２）IgG CH2およびIgG CH3領域のアミノ酸残基のKabat番号
Figure 0006959011
本発明の1つの態様において、第1または両方のFc単量体のCH3ドメイン内の太字で強調表示されたアミノ酸残基は除去される。
第3のドメインのポリペプチド単量体（「Fc部分」または「Fc単量体」）を相互に融合するペプチドリンカーは、好ましくは、少なくとも25アミノ酸残基（25、26、27、28、29、30等）を含む。より好ましくは、このペプチドリンカーは、少なくとも30アミノ酸残基（30、31、32、33、34、35等）を含む。リンカーが最大40アミノ酸残基を含むことも好ましく、より好ましくは最大35アミノ酸残基、最も好ましくはちょうど30アミノ酸残基である。そのようなペプチドリンカーの好ましい態様は、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser（SEQ ID NO: 1）またはその多量体、すなわち(Gly4Ser)xによって特徴付けられ、ここでxは5またはそれ以上の整数（例えば、6、7または8）である。好ましくは、整数は6または7であり、より好ましくは整数は6である。
第1のドメインを第2のドメインと融合するために、または第1もしくは第2のドメインを第3のドメインと融合するためにリンカーが使用される場合、このリンカーは、好ましくは、第1および第2のドメインの各々が相互に独立してそれらの異なる結合特異性を保持できるのを保証する十分な長さおよび配列のものである。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも2つの結合ドメイン（または2つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、これらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば12アミノ酸残基またはそれ未満を含むものが好ましい。したがって、12、11、10、9、8、7、6または5アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。5アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、4、3、2または1アミノ酸を含み、Glyリッチリンカーが好ましい。第1および第2のドメインの融合のためのペプチドリンカーの好ましい態様は、SEQ ID NO:1に示されている。第2および第3のドメインを融合するペプチドリンカーの好ましいリンカー態様は(Gly)4リンカーであり、これはG4リンカーとも呼ばれる。
上記の「ペプチドリンカー」の1つとの関係で特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Glyである。したがって、ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Glyからなり得る。本発明の好ましい態様において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser（SEQ ID NO:1）、またはその多量体、すなわち（Gly4Ser)xによって特徴づけられ、ここでxは1またはそれより大きい整数（例えば、2または3）である。好ましいリンカーは、SEQ ID NO:1〜12に示されている。二次構造を促進しないことを含むペプチドリンカーの特徴は当技術分野で公知であり、例えばDall’Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30)およびRaag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)に記載されている。さらにいかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。ドメインの相互に対する連結は、例えば、実施例に記載されるような遺伝子工学によって提供され得る。融合され機能的に連結された二重特異性単鎖コンストラクトを調製しそれらを哺乳動物細胞または細菌において発現させる方法は、当技術分野で周知である（例えば、WO 99/54440またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001）。
抗体コンストラクトまたは本発明の好ましい態様において、第1および第2のドメインは、(scFv)2、scFv-単一ドメインmAb、ダイアボディおよびこれらの形式のいずれかのオリゴマーからなる群より選択される形式の抗体コンストラクトを形成する。
特に好ましい態様にしたがい、かつ付属の実施例において実証されているように、本発明の抗体コンストラクトの第1および第2のドメインは、「二重特異性単鎖抗体コンストラクト」、より好ましくは二重特異性「単鎖Fv」（svFv）である。Fvフラグメントの2つのドメインであるVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、本明細書上記のように、組み換え法を用いて合成リンカーによって接続し、VLおよびVH領域が対になり1価分子を形成する単一のタンパク質鎖として生成することができる；例えば、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883を参照のこと。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて取得され、そしてそのフラグメントは完全または全長抗体と同じ様式で機能について評価される。単鎖可変フラグメント（scFv）は、したがって、通常約10〜約25アミノ酸、好ましくは約15〜20アミノ酸の短いリンカーペプチドによって接続される、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（VH）および軽鎖の可変領域（VL）の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシン、および溶解性のためにセリンまたはスレオニンを豊富に含み、VHのN末端をVLのC末端に接続するかまたはその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。
二重特異性単鎖抗体コンストラクトは当技術分野で公知であり、WO 99/54440、Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970、Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025、Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197、Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103、Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426、Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56に記載されている。単鎖抗体の製造に関して記載された技術（特に、米国特許第4,946,778号、Kontermann and Dubel (2010), 前記およびLittle (2009), 前記を参照のこと）は、選択された標的を特異的に認識する単鎖抗体コンストラクトを製造するために適合させることができる。
二価（bivalent）（二価（divalent）とも呼ばれる）または二重特異性単鎖可変フラグメント（式（scFv）2を有するbi-scFvまたはdi-scFv）は、2つのscFv分子を（例えば、本明細書に記載のリンカーを用いて）連結することによって作製することができる。これらの2つのscFv分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（scFv）2分子は好ましくは二価と呼ばれるであろう（すなわち、それは同じ標的エピトープに対して2の価数を有する）。2つのscFv分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（scFv）2分子は好ましくは二重特異性であろう。連結は、タンデムscFvを生成する2つのVH領域および2つのVL領域を有する単一のペプチド鎖を作製することによって行われ得る（例えば、Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244を参照のこと）。別の可能性は、2つの可変領域をひとまとめに折り畳みscFvを二量体化させるには短すぎる（例えば、約5アミノ酸の）リンカーペプチドを用いるscFv分子の作製である。このタイプは、ダイアボディとして公知である（例えば、Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8を参照のこと）。
本発明に沿って、第1の、第2の、または第1および第2のドメインは、それぞれ、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体の可変ドメイン、または単一ドメイン抗体の少なくともCDRを含んでもよい。単一ドメイン抗体は、他のV領域またはドメインに非依存的に特定抗原に選択的に結合することができる1つのみの（単量体）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作製され、これらはVHHフラグメントと呼ばれている。軟骨魚もまた、重鎖抗体（IgNAR）を有し、そこからVNARフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替アプローチは、例えばヒトまたはげっ歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインAbとしてVHまたはVLを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディもまた、標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、sdAb、ナノボディまたは単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
（単一ドメインmAb）2は、したがって、個別にVH、VL、VHHおよびVNARからなる群より選択される（少なくとも）2つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。同様に、「scFv-単一ドメインmAb」は、少なくとも1つの上記の単一ドメイン抗体および1つの上記のscFv分子から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。ここでも、リンカーは、好ましくはペプチドリンカーの形態である。
抗体コンストラクトが別のある抗体コンストラクトと結合に関して競合するかどうかは、競合アッセイ、例えば競合ELISAまたは細胞ベースの競合アッセイにおいて測定することができる。アビジン結合マイクロ粒子（ビーズ）もまた使用され得る。アビジンコートELISAプレートと同様、ビオチニル化タンパク質と反応させる際に、これらのビーズの各々は、アッセイを実施できる基材として使用され得る。抗原がビーズ上にコーティングされ、次いで第1の抗体でプレコーティングされる。第2の抗体が添加され、付加的な結合が決定される。読み取りのための考えられる手段は、フローサイトメトリーを含む。
T細胞またはTリンパ球は、細胞媒介免疫において中心的な役割を果たすリンパ球（それ自体、白血球の一タイプである）の一タイプである。T細胞には、各々異なる機能を有するいくつかのサブセットが存在する。T細胞は、その細胞表面上にT細胞受容体（TCR）が存在する点で他のリンパ球、例えばB細胞およびNK細胞と区別され得る。TCRは、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識を担い、2つの異なるタンパク質鎖から構成される。T細胞の95％において、TCRは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖からなる。TCRが抗原ペプチドおよびMHC（ペプチド／MHC複合体）と接触すると、Tリンパ球は、関連酵素、コレセプター、専用アダプター分子および活性化もしくは放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的イベントを通じて活性化される。
CD3受容体複合体は、タンパク質複合体であり、4つの鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、CD3γ（ガンマ）鎖、CD3δ（デルタ）鎖および2つのCD3ε（イプシロン）鎖を含む。これらの鎖は、T細胞受容体（TCR）およびいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してT細胞受容体CD3複合体を形成し、Tリンパ球において活性化シグナルを生成する。CD3γ（ガンマ）、CD3δ（デルタ）およびCD3ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。CD3分子の細胞内尾部は、TCRのシグナル伝達能に必須である免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）または略してITAMとして公知の単一の保存されたモチーフを含む。CD3イプシロン分子は、ヒトにおいて第11染色体に存在するCD3E遺伝子によってコードされるポリペプチドである。CD3イプシロンの最も好ましいエピトープは、ヒトCD3イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基1〜27内に含まれる。本発明による抗体コンストラクトは典型的かつ有利なことに、特異的免疫療法において望ましくない非特異的T細胞活性化が少ないことを示すと想定される。これは、副作用のリスクが低いと言い換えることができる。
多特異性、少なくとも二重特異性抗体コンストラクトによるT細胞の動員を通じた標的細胞のリダイレクト溶解は、細胞溶解シナプスの形成ならびにパーフォリンおよびグランザイムの送達を伴う。関与するT細胞は、連続的な標的細胞溶解を行うことができ、ペプチド抗原のプロセシングおよび提示またはクローン性T細胞の分化に干渉する免疫回避機構に影響されない；例えば、WO 2007/042261を参照のこと。
本発明の抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）CD8陽性T細胞または未刺激の（ヒト）末梢血単核細胞（PBMC）であり得る。標的細胞がマカク起源である場合、または、第1のドメインに結合されるマカクBCMAを発現するかマカクBCMAでトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もまた、マカク起源、例えばマカクT細胞株、例えば4119LnPxであるべきである。標的細胞は、BCMA（の少なくとも細胞外ドメイン）、例えばヒトまたはマカクBCMAを発現するものであるべきである。標的細胞は、BCMA、例えばヒトまたはマカクBCMAで安定的または一過的にトランスフェクトされた細胞株（例えば、CHO）であり得る。あるいは、標的細胞は、BCMA陽性天然発現細胞株、例えばヒト多発性骨髄腫細胞株L363またはNCI-H929であり得る。通常、EC50値は、その細胞表面上により高レベルのBCMAを発現する標的細胞株に対してより低くなると考えられる。エフェクター 対 標的細胞（E:T）比は、通常、約10:1であるが、これは変更することもできる。BCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、51Cr放出アッセイ（インキュベート時間約18時間）においてまたはFACSベースの細胞傷害性アッセイ（インキュベート時間約48時間）において測定することができる。アッセイのインキュベート時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者に周知であり、生物発光アッセイ、スルホローダミンB（SRB）アッセイ、WSTアッセイ、クローン形成アッセイおよびECIS技術を含む、MTTまたはMTSアッセイ、ATPベースのアッセイを含む。
本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞ベースの細胞傷害性アッセイにおいて測定される。これはまた、51Cr放出アッセイにおいても測定され得る。それは、最大半量効果濃度（ベースラインと最大の間の中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体コンストラクトの濃度）に対応するEC50値によって表される。好ましくは、BCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトのEC50値は、≦5000 pMまたは≦4000 pM、より好ましくは≦3000 pMまたは≦2000 pM、さらにより好ましくは≦1000 pMまたは≦500 pM、さらにより好ましくは≦400 pMまたは≦300 pM、さらにより好ましくは≦200 pM、さらにより好ましくは≦100 pM、さらにより好ましくは≦50 pM、さらにより好ましくは≦20 pMまたは≦10 pM、そして最も好ましくは≦5 pMである。
上記のEC50値は、異なるアッセイにおいて測定され得る。当業者は、刺激／濃縮されたCD8+ T細胞がエフェクター細胞として使用される場合に、未刺激のPBMCと比較してEC50値が低くなることが期待できることを知っている。標的細胞が多数のBCMAを発現する場合に、低標的発現ラットと比較してEC50値がより低くなることがさらに期待され得る。例えば、刺激／濃縮されたヒトCD8+ T細胞がエフェクター細胞として使用される（そしてBCMAトランスフェクト細胞、例えばCHO細胞またはBCMA陽性ヒト細胞株のいずれかが標的細胞として使用される）場合、BCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトのEC50値は、好ましくは≦1000 pM、より好ましくは≦500 pM、さらにより好ましくは≦250 pM、さらにより好ましくは≦100 pM、さらにより好ましくは≦50 pM、さらにより好ましくは≦10 pM、最も好ましくは≦5 pMである。ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される場合、BCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトのEC50値は、好ましくは≦5000 pMまたは≦4000 pM（特に、標的細胞がBCMA陽性ヒト細胞株の場合）、より好ましくは≦2000 pM（特に、標的細胞がBCMAトランスフェクト細胞、例えばCHO細胞の場合）、より好ましくは≦1000 pMまたは≦500 pM、さらにより好ましくは≦200 pM、さらにより好ましくは≦150 pM、さらにより好ましくは≦100 pM、最も好ましくは≦50 pMまたはそれ以下である。マカクT細胞株、例えばLnPx4119がエフェクター細胞として使用され、マカクBCMAトランスフェクト細胞株、例えばCHO細胞が標的細胞株として使用される場合、BCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトのEC50値は、好ましくは≦2000 pMまたは≦1500 pM、より好ましくは≦1000 pMまたは≦500 pM、さらにより好ましくは≦300 pMまたは≦250 pM、さらにより好ましくは≦100 pM、最も好ましくは≦50 pMである。
好ましくは、本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトは、BCMA陰性細胞、例えばCHO細胞、またはHL60、MES-SA、もしくはSNU-16細胞の溶解を誘導／媒介しないまたは本質的に溶解を誘導／媒介しない。「溶解を誘導しない」、「本質的に溶解を誘導しない」、「溶解を媒介しない」または「本質的に溶解を媒介しない」という用語は、BCMA陽性ヒト細胞株の溶解を100％として、本発明の抗体コンストラクトがBCMA陰性細胞の30％を超える溶解を誘導または媒介せず、好ましくは20％を超えず、より好ましくは10％を超えず、特に好ましくは9％、8％、7％、6％または5％を超えないことを意味する。これは通常、500 nMまでの抗体コンストラクトの濃度に適用される。当業者は、さらなる労力なしに細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書は、細胞溶解を測定する方法の具体的な手引きを教示している。
個々のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトの単量体アイソフォームと二量体アイソフォームの間の細胞傷害活性の差は、「効力ギャップ」と称される。この効力ギャップは、例えば、その分子の単量体形態のEC50値と二量体形態のEC50値の間の比として算出され得る。本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトの効力ギャップは、好ましくは≦5、より好ましくは≦4、さらにより好ましくは≦3、さらにより好ましくは≦2そして最も好ましくは≦1である。
本発明の抗体コンストラクトの第1および／または第2の（または任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳類目のメンバーについて種間特異的である。種間特異的CD3結合ドメインは、例えば、WO 2008/119567に記載されている。1つの態様にしたがい、第1および／または第2の結合ドメインは、それぞれ、ヒトBCMAおよびヒトCD3への結合に加えて、新世界霊長類（例えば、コモンマーモセット、ワタボウシタマリンまたはコモンリスザル）、旧世界霊長類（例えば、ヒヒおよびマカク）、テナガザルおよび非ヒトのヒト亜科動物を含む（がこれらに限定されない）霊長類のBCMA／CD3にも結合するであろう。
本発明の抗体コンストラクトの1つの態様において、第1のドメインは、ヒトBCMAに結合し、さらにマカクBCMA、例えばカニクイザル（Macaca fascicularis）のBCMAおよびより好ましくは表面マカク細胞上に発現されたマカクBCMAに結合する。BCMA、好ましくはヒトBCMAに対する第1のドメインの親和性は、好ましくは≦100 nMまたは≦50 nM、より好ましくは≦25 nMまたは≦20 nM、より好ましくは≦15 nMまたは≦10 nM、さらにより好ましくは≦5 nM、さらにより好ましくは≦2.5 nMまたは≦2 nM、さらにより好ましくは≦1 nM、さらにより好ましくは≦0.6 nM、さらにより好ましくは≦0.5 nM、最も好ましくは≦0.4 nMである。親和性は、例えば、BIAcoreアッセイにおいてまたはScatchardアッセイにおいて測定することができる。親和性を決定する他の方法もまた当業者に周知である。マカクBCMAに対する第1のドメインの親和性は、好ましくは≦15 nM、より好ましくは≦10 nM、さらにより好ましくは≦5 nM、さらにより好ましくは≦1 nM、さらにより好ましくは≦0.5 nM、さらにより好ましくは≦0.1 nM、最も好ましくは≦0.05 nMまたは≦0.01 nMでさえある。
好ましくは、（例えば、BiaCoreによってまたはScatchard分析によって決定される）マカクBCMA対ヒトBCMAへの結合に関する本発明にしたがう抗体コンストラクトの親和性ギャップ［ma BCMA : hu BCMA］は、＜100、好ましくは＜20、より好ましくは＜15、さらに好ましくは＜10、さらにより好ましくは＜8、より好ましくは＜6および最も好ましくは＜2である。マカクBCMA対ヒトBCMAへの結合に関する本発明にしたがう抗体コンストラクトの親和性ギャップの好ましい範囲は、0.1〜20の間、より好ましくは0.2〜10の間、さらにより好ましくは0.3〜6の間、さらにより好ましくは0.5〜3の間または0.5〜2.5の間、最も好ましくは0.5〜2の間または0.6〜2の間である。
本発明の抗体コンストラクトの第2のドメインは、ヒトCD3イプシロンおよび／またはマカクCD3イプシロンに結合する。好ましい態様において、第2のドメインはさらに、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）、ワタボウシタマリン（Saguinus Oedipus）またはコモンリスザル（Saimiri sciureus）CD3イプシロンに結合する。コモンマーモセットおよびワタボウシタマリンは、両方ともマーモセット（Callitrichidae）科に属する新世界霊長類であり、コモンリスザルは、オマキザル（Cebidae）科に属する新世界霊長類である。
本発明の抗体コンストラクトに関して、ヒトおよび/またはマカク属CD3イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメインは、
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO:27で示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:28で示されるCDR-L2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:29で示されるCDR-L3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO:117で示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:118で示されるCDR-L2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:119で示されるCDR-L3；ならびに
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO:153で示されるCDR-L1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:154で示されるCDR-L2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:155で示されるCDR-L3
より選択されるCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVL領域を含むことが好ましい。
本発明の抗体コンストラクトのさらに好ましい態様において、ヒトおよび/またはマカク属CD3イプシロン鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメインは、
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO:12で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:13で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:14で示されるCDR-H3；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO:30で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:31で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:32で示されるCDR-H3；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO:48で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:49で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:50で示されるCDR-H3；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO:66で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:67で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:68で示されるCDR-H3；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO:84で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:85で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:86で示されるCDR-H3；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO:102で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:103で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:104で示されるCDR-H3；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO:120で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:121で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:122で示されるCDR-H3；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO:138で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:139で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:140で示されるCDR-H3；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO:156で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:157で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:158で示されるCDR-H3；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO:174で示されるCDR-H1、WO 2008/119567のSEQ ID NO:175で示されるCDR-H2、およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:176で示されるCDR-H3
より選択されるCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3を含むVH領域を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様において、第2の結合ドメイン内で上記3群のVL CDRを上記10群のVH CDRと組み合わせ、CDR-L1〜3およびCDR-H1〜3をそれぞれ含む(30)群を形成する。
本発明の抗体コンストラクトに関して、CD3に結合する第2のドメインは、WO 2008/119567のSEQ ID NO:17、21、35、39、53、57、71、75、89、93、107、111、125、129、143、147、161、165、179、もしくは183で示されるものからなる群より選択されるかまたはSEQ ID NO: 13で示されるVL領域を含むことが好ましい。
また、CD3に結合する第2のドメインは、WO 2008/119567のSEQ ID NO:15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177、もしくは181で示されるものからなる群より選択されるかまたはSEQ ID NO: 14で示されるVH領域を含むことも好ましい。
より好ましくは、本発明の抗体コンストラクトは、
（a）WO 2008/119567のSEQ ID NO:17または21で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:15または19で示されるVH領域；
（b）WO 2008/119567のSEQ ID NO:35または39で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:33または37で示されるVH領域；
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO:53または57で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:51または55で示されるVH領域；
（d）WO 2008/119567のSEQ ID NO:71または75で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:69または73で示されるVH領域；
（e）WO 2008/119567のSEQ ID NO:89または93で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:87または91で示されるVH領域；
（f）WO 2008/119567のSEQ ID NO:107または111で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:105または109で示されるVH領域；
（g）WO 2008/119567のSEQ ID NO:125または129で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:123または127で示されるVH領域；
（h）WO 2008/119567のSEQ ID NO:143または147で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:141または145で示されるVH領域；
（i）WO 2008/119567のSEQ ID NO:161または165で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:159または163で示されるVH領域；ならびに
（j）WO 2008/119567のSEQ ID NO:179または183で示されるVL領域およびWO 2008/119567のSEQ ID NO:177または181で示されるVH領域
からなる群より選択されるVL領域およびVH領域を含む、CD3に結合する第2のドメインによって特徴づけられる。
SEQ ID NO: 13で示されるVL領域およびSEQ ID NO:14で示されるVH領域を含む、CD3に結合する第2のドメインもまた、本発明の抗体コンストラクトとの関係で好ましい。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様によると、第1および/または第2のドメインは以下の形式を有する: VH領域およびVL領域の対は、短鎖抗体（scFv）の形式である。VHおよびVL領域は、VH-VLまたはVL-VHの順に配置される。VH領域がリンカー配列のN末端側に配置され、VL領域が該リンカー配列のC末端側に配置されることが好ましい。
本発明の上記の抗体コンストラクトの好ましい態様は、WO 2008/119567のSEQ ID NO:23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185、もしくは187からなる群より選択されるかまたはSEQ ID NO: 15で示されるアミノ酸配列を含む、CD3に結合する第2のドメインによって特徴づけられる。
本発明の抗体コンストラクトの第1の結合ドメインが、
（a）SEQ ID NO:48で示されるCDR-L1、SEQ ID NO:49で示されるCDR-L2、SEQ ID NO:50で示されるCDR-L3、SEQ ID NO:45で示されるCDR-H1、SEQ ID NO:46で示されるCDR-H2、およびSEQ ID NO:47で示されるCDR-H3；
（b）SEQ ID NO:66で示されるCDR-L1、SEQ ID NO:67で示されるCDR-L2、SEQ ID NO:68で示されるCDR-L3、SEQ ID NO:63で示されるCDR-H1、SEQ ID NO:64で示されるCDR-H2、およびSEQ ID NO:65で示されるCDR-H3；ならびに
（c）SEQ ID NO:84で示されるCDR-L1、SEQ ID NO:85で示されるCDR-L2、SEQ ID NO:86で示されるCDR-L3、SEQ ID NO:81で示されるCDR-H1、SEQ ID NO:82で示されるCDR-H2、およびSEQ ID NO:83で示されるCDR-H3
からなる群より選択される、CDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3を含むVL領域ならびにCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-3を含むVH領域を含むことも想定されている。
本発明の抗体コンストラクトの第1の結合ドメインが、
（a）SEQ ID NO:51で示されるVH領域およびSEQ ID NO:52で示されるVL領域；
（b）SEQ ID NO:57で示されるVH領域およびSEQ ID NO:58で示されるVL領域；
（c）SEQ ID NO:69で示されるVH領域およびSEQ ID NO:70で示されるVL領域；
（d）SEQ ID NO:75で示されるVH領域およびSEQ ID NO:76で示されるVL領域；
（e）SEQ ID NO:87で示されるVH領域およびSEQ ID NO:88で示されるVL領域；ならびに
（f）SEQ ID NO:93で示されるVH領域およびSEQ ID NO:94で示されるVL領域
からなる群より選択されるVH領域およびVL領域を含むことがさらに想定されている。
本発明の抗体コンストラクトの第1の結合ドメインが、SEQ ID NO:53、59、71、77、89、または95で示されるものからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことがさらに想定されている。
抗体コンストラクトの共有結合修飾もまた、本発明の範囲に含まれ、そしてそれは、常にではないが通常、翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトのいくつかのタイプの共有結合修飾は、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはNもしくはC末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、分子内に導入される。
システイニル残基は、最も一般的には、α-ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル 2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ水銀安息香酸、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノールまたはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるジエチルピロカーボネートとのpH 5.5〜7.0での反応によって誘導体化される。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；この反応は、好ましくは、pH 6.0の0.1M カコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニルおよびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬は、イミドエステル、例えばピコリンイミド酸メチル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソウレア；2,4-ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。
アルギニル残基は、1つまたは複数の従来的な試薬、特にフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのためにこの反応がアルカリ条件下で行われることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基およびアルギニンイプシロン-アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特定の修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入のために、行われ得る。最も一般的には、N-アセチルイミジゾール（N-acetylimidizole）およびテトラニトロメタンが、それぞれ、O-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、放射免疫アッセイにおいて使用するための標識化タンパク質を調製するために、125Iまたは131Iを用いてヨウ素添加され、上記のクロラミンT法が適している。
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（R'-N=C=N-R'）との反応によって選択的に修飾され、ここで、RおよびR'は任意で異なるアルキル基、例えば1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドである。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
二官能性の剤を用いる誘導体化は、様々な方法において使用するために本発明の抗体コンストラクトを水不溶性の支持マトリクスまたは表面に架橋するのに有用である。広く使用されている架橋剤は、例えば、1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば3,3'-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むホモ二官能性イミドエステル、および二官能性マレイミド、例えばビス-N-マレイミド-1,8-オクタンを含む。誘導体化剤、例えばメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化可能な中間体を生成する。あるいは、反応性水不溶性マトリクス、例えば臭化シアン活性化炭水化物ならびに米国特許第3,969,287号；同第3,691,016号；同第4,195,128号；同第4,247,642号；同第4,229,537号；および同第4,330,440号に記載される反応性基質が、タンパク質の固定化のために使用される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば脱アミド化され、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基にされる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に含まれる。
他の修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86）、N末端アミンのアセチル化ならびに任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲に含まれる抗体コンストラクトの別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの変更を含む。当技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在もしくは非存在）またはそのタンパク質を産生する宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現システムが、以下で議論されている。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的に、N結合型またはO結合型のいずれかである。N結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付加を表す。Xがプロリン以外の任意のアミノ酸である3ペプチド配列アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素付加における認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらの3ペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。O結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの糖N-アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの1つの付加を表すが、5-ヒドロキシプロリンまたは5-ヒドロキシリジンも使用され得る。
抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、従来法により、（N結合型グリコシル化部位のための）上記の3ペプチド配列の1つまたは複数を含むようアミノ酸配列を変更することによって達成される。変更はまた、（O結合型グリコシル化部位のための）開始配列への1つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基の付加または置換によって行われ得る。簡潔には、抗体コンストラクトのアミノ酸配列は、好ましくは、DNAレベルでの変化を通じて、特に所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるようポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基で変異させることによって、変更される。
抗体コンストラクト上の炭水化物部分の数を増やす別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的連結による。これらの手順は、NおよびO結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有するタンパク質を宿主細胞において産生する必要がない点で有利である。使用される連結の様式に依存して、糖は、（a)アルギニンおよびヒスチジン、（b）遊離カルボキシル基、（c）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのそれら、（d）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのそれら、（e）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのそれら、または（f）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、WO 87/05330およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306に記載されている。
出発抗体コンストラクト上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドをインタクトな状態で維持しつつ、連結糖（N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン）を除くほとんどまたはすべての糖を切断する。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52によっておよびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131によって記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載されるような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的グリコシル化部位におけるグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105によって記載されるような化合物ツニカマイシンの使用によって防止され得る。ツニカマイシンは、タンパク質-N-グリコシド連結の形成を阻止する。
抗体コンストラクトの他の修飾も、本明細書で意図されている。例えば、抗体コンストラクトの別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号または同第4,179,337号に示される様式での様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールもしくはポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーへの抗体コンストラクトの連結を含む。加えて、当技術分野で公知のように、アミノ酸置換は、ポリマー、例えばPEGの付加を容易にするよう抗体コンストラクト内の様々な位置で行われ得る。
いくつかの態様において、本発明の抗体コンストラクトの共有結合修飾は、1つまたは複数の標識の付加を含む。標識基は、潜在的な立体障害を減らすために、様々な長さのスペーサーアームを通じて抗体コンストラクトに連結される。タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で公知であり、本発明を実施する上で使用され得る。「標識」または「標識基」という用語は、任意の検出可能な標識を意味する。一般に、標識は、それらを検出するアッセイに依存して様々なクラスに分類され、以下の例は：
a）放射性同位体または重同位体であり得る同位体標識、例えば、放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、89Zr、90Y、99Tc、111In、125I、131I）
b）磁気標識（例えば、磁気粒子）
c）酸化還元活性部分
d）光学色素（発色体、リン光体および蛍光体を含むがこれらに限定されない）、例えば、蛍光基（例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体）、化学発光基および「低分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得る蛍光体
e）酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
f）ビオチニル化基
g）2次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）
を含むがこれらに限定されない。
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性を通じて検出され得る任意の分子を意味する。適当な蛍光標識は、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル-クマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーJ、テキサスレッド、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LCレッド640、Cy 5、Cy 5.5、LCレッド705、オレゴングリーン、Alexa-Fluor色素（Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680）、カスケードブルー、カスケードイエローおよびR-フィコエリトリン（PE）（Molecular Probes, Eugene, OR）、FITC、ローダミンおよびテキサスレッド（Pierce, Rockford, IL）、Cy5、Cy5.5、Cy7（Amersham Life Science, Pittsburgh, PA）を含むがこれらに限定されない。蛍光体を含む適当な光学色素は、Molecular Probes Handbook by Richard P. Hauglandに記載されている。
適当なタンパク質性蛍光標識はまた、レニラ（Renilla）、プチロサーカス（Ptilosarcus）またはエクオレア（Aequorea）種のGFP（Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805）、EGFP（Clontech Laboratories, Inc., Genbankアクセッション番号U55762）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182）、強化型黄色蛍光タンパク質（EYFP, Clontech Laboratories, Inc.）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417）、βガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607）およびレニラ（WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、米国特許第5292658号、同第5418155号、同第5683888号、同第5741668号、同第5777079号、同第5804387号、同第5874304号、同第5876995号、同第5925558号）を含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトはまた、例えばその分子の単離を助けるまたはその分子の適合された薬物動態プロフィールに関連する追加ドメインを含み得る。抗体コンストラクトの単離を助けるドメインは、単離方法、例えば単離用カラムにおいて捕捉され得るペプチドモチーフまたは二次的に導入される部分から選択され得る。そのような追加ドメインの非限定的な態様は、Mycタグ、HATタグ、HAタグ、TAPタグ、GSTタグ、キチン結合ドメイン（CBDタグ）、マルトース結合タンパク質（MBPタグ）、Flagタグ、Strepタグおよびその変種（例えば、StrepIIタグ）ならびにHisタグとして公知のペプチドモチーフを含む。本明細書に開示される抗体コンストラクトはすべて、ある分子のアミノ酸配列中の連続するHis残基、好ましくは5、より好ましくは6つのHis残基（ヘキサヒスチジン）の反復として一般に知られているHisタグドメインを含み得る。Hisタグは、抗体コンストラクトの例えばNまたはC末端に位置し得、C末端に位置することが好ましい。より好ましくは、ヘキサヒスチジンタグ（HHHHHH）(SEQ ID NO:16)は、ペプチド結合を通じて本発明による抗体コンストラクトのC末端に連結される。さらに、持続放出用途および薬物動態プロフィール改善のために、PLGA-PEG-PLGAのコンジュゲートシステムをポリヒスチジンタグと組み合わせてもよい。
本明細書に記載される抗体コンストラクトのアミノ酸配列修飾もまた意図されている。例えば、それが抗体コンストラクトの結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望まれる場合がある。抗体コンストラクトのアミノ酸配列変種は、抗体コンストラクトの核酸に適当なヌクレオチド変化を導入することによってまたはペプチド合成によって調製される。以下に記載されるアミノ酸配列修飾のすべてが、未修飾の親分子の所望の生物学的活性（BCMAおよびCD3に結合する活性）を依然として保持している抗体コンストラクトを生成するはずである。
「アミノ酸」または「アミノ酸残基」という用語は、典型的に、その当技術分野で認められている定義を有するアミノ酸、例えば、アラニン（AlaまたはA）；アルギニン（ArgまたはR）；アスパラギン（AsnまたはN）；アスパラギン酸（AspまたはD）；システイン（CysまたはC）；グルタミン（GlnまたはQ）；グルタミン酸（GluまたはE）；グリシン（GlyまたはG）；ヒスチジン（HisまたはH）；イソロイシン（HeまたはI）；ロイシン（LeuまたはL）；リジン（LysまたはK）；メチオニン（MetまたはM）；フェニルアラニン（PheまたはF）；プロリン（ProまたはP）；セリン（SerまたはS）；スレオニン（ThrまたはT）；トリプトファン（TrpまたはW）；チロシン（TyrまたはY）；およびバリン（ValまたはV）からなる群より選択されるアミノ酸を表すが、望ましい場合は修飾、合成または希少アミノ酸も使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val）；負荷電側鎖（例えば、Asp、Glu）；正荷電側鎖（例えば、Arg、His、Lys）；または非荷電極性側鎖（例えば、Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、TrpおよびTyr）を有する点でグループ化され得る。
アミノ酸修飾は、例えば、抗体コンストラクトのアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体コンストラクトのアミノ酸配列への挿入、および／または抗体コンストラクトのアミノ酸配列内の残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を保持している限り、最終コンストラクトに達するために欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが行われる。アミノ酸変化、例えばグリコシル化部位の数または位置の変化はまた、抗体コンストラクトの翻訳後プロセスを変更し得る。
例えば、1、2、3、4、5または6個のアミノ酸が各CDRにおいて（当然ながらそれらの長さに依存して）挿入、置換、または欠失されてもよく、一方、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸が各FRにおいて挿入、置換、または欠失されてもよい。好ましくは、抗体コンストラクトへのアミノ酸配列の挿入は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10残基から100またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。また、本発明の抗体コンストラクトの第3のドメインにおいて、対応する修飾を実施してもよい。本発明の抗体コンストラクトの挿入変種は、抗体コンストラクトのN末端もしくはC末端への酵素の融合またはポリペプチドへの融合を含む。
置換変異における最も関心対象となる部位は、重鎖および／または軽鎖のCDR、特に超可変領域を（非限定的に）含むが、重鎖および／または軽鎖におけるFRの変更もまた意図されている。置換は好ましくは、本明細書に記載される保存的置換である。好ましくは、CDRまたはFRの長さに依存して、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸がCDRにおいて置換され得、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または25個のアミノ酸がフレームワーク領域（FR）において置換され得る。例えば、CDR配列が6個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの1、2または3個が置換されることが想定される。同様に、CDR配列が15個のアミノ酸を含む場合、これらのアミノ酸のうちの1、2、3、4、5または6個が置換されることが想定される。
変異に好ましい位置である抗体コンストラクトの特定の残基または領域の同定に有用な方法は、Science, 244: 1081-1085 (1989)においてCunninghamおよびWellsによって記載された「アラニンスキャン変異誘発」と呼ばれるものである。この方法では、抗体コンストラクト内の残基または標的残基群が同定され（例えば、荷電残基、例えばarg、asp、his、lysおよびglu）、そしてエピトープに対するそのアミノ酸の相互作用に影響を与える中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えられる。
この置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置は、次いで、その置換部位にまたは置換部位のためにさらなるまたはその他の変異を導入することによって厳選される。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位または領域は予め決定されるが、変異の性質自体は予め決定される必要はない。例えば、所定部位における変異の働きを分析または最適化するため、アラニンスキャンまたは無作為変異誘発が標的のコドンまたは領域において行われ、そして発現される抗体コンストラクトの変種が所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。既知の配列を有するDNA内の既定部位において置換変異を行う技術は周知であり、例えば、M13プライマー変異誘発およびPCR変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、BCMAまたはCD3結合などの抗原結合活性のアッセイを用いて行われる。
一般に、重鎖および／または軽鎖のCDRの1つもしくは複数またはすべてにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列が「当初の」CDR配列と少なくとも60％または65％、より好ましくは70％または75％、さらにより好ましくは80％または85％、および、特に好ましくは90％または95％同一であることが好ましい。これは、それがどの程度「置換された」配列と同一であるのかがCDRの長さに依存することを意味する。例えば、5個のアミノ酸を有するCDRは、少なくとも1つの置換されたアミノ酸を有するために、好ましくはその置換されたアミノ酸配列と少なくとも80％同一である。したがって、抗体コンストラクトのCDRは、それらの置換された配列に対して異なる程度の同一性を有し得る、例えば、CDRL1は80％を有し得、CDRL3は90％を有し得る。
好ましい置換（または置き換え）は、保存的置換である。しかし、抗体コンストラクトが第1のドメインを通じてBCMAに結合し第2のドメインを通じてCD3イプシロンに結合する能力を保持している限りおよび／またはそのCDRがそのように置換される配列に対して同一性を有している（「当初」のCDR配列に対して少なくとも60％または65％、より好ましくは70％または75％、さらにより好ましくは80％または85％、および、特に好ましくは90％または95％同一である）限り、任意の置換（非保存的置換または以下の表3に列挙される「例示的な置換」の1つもしくは複数を含む）が想定されている。
保存的置換は、表3の「好ましい置換」という見出しの下に示されている。そのような置換が生物学的活性を変化させる場合、表3で「例示的な置換」として挙げられたまたはアミノ酸クラスに関連して以下にさらに記載されるようなより実質的な変更が導入され得、そしてその産物が所望の特性についてスクリーニングされ得る。
（表３）アミノ酸置換
Figure 0006959011
本発明の抗体コンストラクトの生物学的特性の実質的修飾は、（a）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシートもしくはらせん立体構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づくグループ：（1）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；（2）中性親水性：cys、ser、thr、asn、gln；（3）酸性：asp、glu；（4）塩基性：his、lys、arg；（5）鎖の配向性に影響する残基：gly、pro；および（6）芳香族：trp、tyr、phe、に分類される。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーから別のクラスのメンバーへの交換を伴うものであろう。抗体コンストラクトの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基は、その分子の酸化安定性を改善し異常な架橋を防ぐために、通常セリンで置換され得る。逆に、システイン結合は、その安定性（特にその抗体が抗体フラグメント、例えばFvフラグメントである場合）を改善するために抗体に添加され得る。
アミノ酸配列に関して、配列同一性および／または類似性は、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の部分配列同一性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395により記載された、好ましくはデフォルト設定を使用するBest Fit配列プログラムを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の標準的技術を使用することによってまたは目視によって決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータに基づきFastDBによって計算される：ミスマッチペナルティー 1；ギャップペナルティー 1；ギャップサイズペナルティー 0.33；および接続ペナルティー（joining penalty） 30、"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc。
有用なアルゴリズムの例はPILEUPである。PILEUPは、プログレッシブ、ペアワイズなアラインメントを使用して関連配列群から複数の配列アラインメントを生成する。それはまた、アラインメントを生成するために使用されたクラスター化関係を示すツリーをプロットすることができる。PILEUPは、Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する；この方法はHiggins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153により記載されたものに類似する。有用なPILEUPパラメータは、デフォルトギャップウェイト 3.00、デフォルトギャップ長ウェイト 0.10およびウェイテッドエンドキャップ（weighted end gap）を含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; およびKarin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787に記載されるBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480から得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分はデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される：オーバーラップスパン＝1、オーバーラップフラクション＝0.125、ワードしきい値（T）＝11。HSP SおよびHSP S2パラメータは動的な値であり、個々の配列の組成および関心対象の配列を検索する特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって決定されるが；この値は感度を高めるために調節され得る。
さらなる有用なアルゴリズムは、Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402によって報告されたギャップドBLASTである。ギャップドBLASTは、BLOSUM-62置換スコアを使用し；しきい値Tパラメータは9に設定され；ギャップなし伸長をもたらすツーヒット法は、ギャップ長kに10+kのコストをかけ；Xuは16に設定され、そしてXgはデータベース検索段階では40におよびアルゴリズムの出力段階では67に設定される。ギャップありアラインメントは、約22ビットに相当するスコアによってもたらされる。
一般に、個々の変種CDRまたはVH／VL配列間のアミノ酸相同性、類似性または同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも60％であり、より典型的には相同性または同一性が少なくとも65％または70％に増加することが好ましく、より好ましくは少なくとも75％または80％、さらにより好ましくは少なくとも85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％およびほぼ100％である。同様の様式で、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、抗体コンストラクトのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の百分率と定義される。特定の方法は、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションがそれぞれ１および0.125に設定されたデフォルトパラメータに設定されたWU-BLAST-2のBLASTNモジュールを利用する。
一般に、個々の変種CDRまたはVH／VL配列をコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列の間の核酸配列相同性、類似性または同一性は、少なくとも60％であり、より典型的には相同性または同一性が少なくとも65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％およびほぼ100％に増加することが好ましい。したがって、「変種CDR」または「変種VH／VL領域」は、本発明の親CDR／VH／VLに対する指定された相同性、類似性または同一性を有するものであり、かつ親CDRまたはVH／VLの特異性および／または活性の少なくとも60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％を含むがこれらに限定されない生物学的機能を共有している。
1つの態様において、本発明にしたがう抗体コンストラクトのヒト生殖系列に対する同一性の比率は、≧70％または≧75％、より好ましくは≧80％または≧85％、さらにより好ましくは≧90％、最も好ましくは≧91％、≧92％、≧93％、≧94％、≧95％、あるいは≧96％でさえある。ヒト抗体生殖系列遺伝子産物に対する同一性は、治療タンパク質が処置中に患者内でその薬物に対する免疫応答を誘発する危険を減らすために重要な特徴であると考えられる。HwangおよびFoote（"Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10）は、薬物抗体コンストラクトの非ヒト部分の減少が処置中に患者内で抗薬物抗体を誘導する危険を減らすことを実証している。膨大な数の臨床的に評価された抗体薬および各々の免疫原性データを比較することによって、抗体のV領域のヒト化が、非変更非ヒトV領域を有する抗体（平均で患者の23.59％）よりもそのタンパク質を低免疫原性にする（平均で患者の5.1％）傾向が示される。したがって抗体コンストラクトの形態のV領域ベースのタンパク質治療にとって、ヒト配列に対するより高度の同一性が望ましい。この生殖系列同一性を決定する目的で、VLのV領域が、Vector NTIソフトウェアを用いてヒト生殖系列VセグメントおよびJセグメントのアミノ酸配列（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）とアラインメントされ得、そしてアミノ酸配列が、同一アミノ酸残基をVLの総アミノ酸残基数で割ることによって百分率で計算され得る。VHセグメントについても、VH CDR3がその高い多様性および既存のヒト生殖系列VH CDR3アラインメントパートナーの欠如に起因して除外され得ることを除いて同じことが行われ得る（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）。次いで、ヒト抗体生殖系列遺伝子に対する配列同一性を増加させるために組み換え技術が使用され得る。
本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトは、ヒトBAFF-Rおよび／またはヒトTACIとは（本質的に）結合せず交差反応もしないことが、さらに想定されている。さらに、本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトは、マカク／カニクイザルBAFF-Rおよび／またはマカク／カニクイザルTACIと（本質的に）結合せず交差反応もしないことが想定されている。
さらなる態様において、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、標準的な研究スケールの条件下で、例えば、標準的な二段階精製方法において、高い単量体収量を示す。好ましくは、本発明にしたがう抗体コンストラクトの単量体収量は、≧0.25 mg/L上清、より好ましくは≧0.5 mg/L、さらにより好ましくは≧1 mg/L、最も好ましくは≧3 mg/L上清である。
同様に、この抗体コンストラクトの二量体抗体コンストラクトアイソフォームの収量およびしたがって単量体率（すなわち、単量体：（単量体＋二量体））が決定され得る。単量体および二量体抗体コンストラクトの生産性および算出される単量体率は、例えば、ローラーボトル中での標準化された研究スケールでの産生からの培養上清のSEC精製工程において取得され得る。1つの態様において、抗体コンストラクトの単量体率は、≧80％、より好ましくは≧85％、さらにより好ましくは≧90％、最も好ましくは≧95％である。
1つの態様において、抗体コンストラクトは、≦5または≦4の好ましい血漿安定性（血漿非存在下でのEC50に対する血漿存在下でのEC50の比）を有し、より好ましくは≦3.5または≦3、さらにより好ましくは≦2.5または≦2、最も好ましくは≦1.5または≦1である。抗体コンストラクトの血漿安定性は、コンストラクトをヒト血漿中、37℃で24時間インキュベートし、その後に51クロム放出細胞傷害性アッセイにおいてEC50を決定することによって試験され得る。細胞傷害性アッセイにおいてエフェクター細胞は、濃縮ヒトCD8陽性T細胞で刺激され得る。標的細胞は、例えば、ヒトBCMAでトランスフェクトされたCHO細胞であり得る。エフェクター対標的細胞（E:T）比は、10：1が選択され得る。この目的で使用されるヒト血漿プールは、EDTAコーティングされたシリンジによって回収された健常ドナーの血液から得られる。細胞成分が遠心分離によって除去され、上部血漿相が回収され、その後にプールされる。対照として、抗体コンストラクトが、細胞傷害性アッセイの直前にRPMI-1640培地で希釈される。血漿安定性は、EC50（対照）に対するEC50（血漿インキュベート後）の比として計算される。
本発明の抗体コンストラクトの単量体から二量体への変換率は低いことが、さらに好ましい。変換率は、異なる条件下で測定され得、高性能サイズ排除クロマトグラフィーによって分析され得る。例えば、抗体コンストラクトの単量体アイソフォームのインキュベートは、インキュベーター内、37℃で7日間、例えば100 μg/mlまたは250μg/mlの濃度で行われ得る。これらの条件下で、本発明の抗体コンストラクトは、≦5％の二量体率を示すことが好ましく、より好ましくは≦4％、さらにより好ましくは≦3％、さらにより好ましくは≦2.5％、さらにより好ましくは≦2％、さらにより好ましくは≦1.5％、最も好ましくは≦1％または≧0.5％、あるいは0％でさえある。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトが多数回の凍結／解凍サイクル後に非常に低い二量体変換率で存在することも好ましい。例えば、抗体コンストラクトの単量体は、例えばジェネリック製剤緩衝液中、250μg/mlの濃度に調節され、3回の凍結／解凍サイクル（-80℃で30分間の凍結、その後に室温で30分間の解凍）に供され、その後に二量体抗体コンストラクトに変換された初期単量体抗体コンストラクトの百分率を決定するために高性能SECに供される。好ましくは、二重特異性抗体コンストラクトの二量体率は、例えば3回の凍結／解凍サイクル後に≦5％であり、より好ましくは≦4％、さらにより好ましくは≦3％、さらにより好ましくは≦2.5％、さらにより好ましくは≦2％、さらにより好ましくは≦1.5％、最も好ましくは≦1％、あるいは≦0.5％でさえある。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、≧45℃または≧50℃、より好ましくは≧52℃または≧54℃、さらにより好ましくは≧56℃または≧57℃、最も好ましくは≧58℃または≧59℃の凝集温度の良好な熱安定性を示す。熱安定性パラメータは、以下のようにして、抗体の凝集温度の点で決定され得る：250μg/mlの濃度の抗体溶液を使い捨てキュベットに移し、これを動的光散乱（DLS）装置に設置する。サンプルを0.5℃/分の加熱速度で40℃から70℃に加熱しつつ、測定される粒径を継続的に取得する。タンパク質の溶解および凝集を示す粒径の増加を使用して、抗体の凝集温度を計算する。
あるいは、抗体コンストラクトの固有の生物物理学的タンパク質安定性を決定するため、融解温度曲線を示差走査熱量測定（DSC）により決定することができる。これらの実験は、MicroCal LLC（Northampton, MA, U.S.A）VP-DSCデバイスを用いて行う。抗体コンストラクトを含むサンプルのエネルギー取り込みを、配合緩衝液のみを含むサンプルとの比較で、20℃から90℃まで記録する。抗体コンストラクトを、例えばSEC泳動緩衝液中、終濃度250μg/mlに調節する。それぞれの融解曲線の記録のために、サンプルの全体温度を段階的に上昇させる。各温度Tで、サンプルおよび配合緩衝液参照のエネルギー取り込みを記録する。サンプルから参照を差し引いたエネルギー取り込みCp（kcal/mole/℃）の差を、それぞれの温度に対してプロットする。融解温度は、エネルギー取り込みが最初に最大となる温度と定義される。
本発明のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトはまた、≦0.2、好ましくは≦0.15、より好ましくは≦0.12、さらにより好ましくは≦0.1、最も好ましくは≦0.08の混濁度（精製単量体抗体コンストラクトを2.5 mg/mlまで濃縮して一晩インキュベーションした後にOD340で測定される）を有することも想定されている。
さらなる態様において、本発明にしたがう抗体コンストラクトは、生理学的pHまたはそれよりわずかに低いpH、すなわちおよそpH7.4〜6.0で安定である。非生理学的pH、例えば約pH6.0で抗体コンストラクトがより大きな耐性を示すほど、充填されたタンパク質の総量に対するイオン交換カラムから溶出する抗体コンストラクトの回収率が高くなる。約pH6.0でのイオン（例えば、カチオン）交換カラムからの抗体コンストラクトの回収率は、好ましくは≧30％、より好ましくは≧40％、より好ましくは≧50％、さらにより好ましくは≧60％、さらにより好ましくは≧70％、さらにより好ましくは≧80％、さらにより好ましくは≧90％、さらにより好ましくは≧95％、最も好ましくは≧99％である。
本発明の二重特異性抗体コンストラクトが治療効果または抗腫瘍活性を示すことがさらに想定される。これは、例えば、以下の進行段階のヒト腫瘍異種移植モデルの実施例に開示される研究において評価され得る。
研究第1日目に、5 x 106細胞のヒト標的細胞抗原（ここではBCMA）陽性癌細胞株を、メスNOD/SCIDマウスの右背側面に皮下注射する。平均腫瘍容積が約100mm3に達したときに、インビトロで拡張したヒトCD3陽性T細胞を、この動物の腹腔への約2 x 107細胞の注射によりマウスに移植する。ビヒクル対照グループ1のマウスにはエフェクター細胞を与えず、腫瘍成長に対するT細胞単独の影響をモニタリングするためのビヒクル対照グループ2（エフェクター細胞を与える）と共に比較のための未移植対照として使用する。抗体処置は、平均腫瘍容積が約200mm3に達したときに開始する。処置開始日における各処置グループの平均腫瘍サイズは、任意の他のグループと統計的に相違しないはずである（分散分析）。マウスを、0.5 mg/kg/日のBCMAxCD3二重特異性抗体コンストラクトを用いて、約15〜20日間の静脈内ボーラス注射により処置する。研究中、腫瘍はカリパスによって測定し、進行は腫瘍容積（TV）のグループ間比較によって評価する。腫瘍成長阻害T/C［％］は、T/C% = 100 x (分析グループのTV中央値)/(対照グループ2のTV中央値)としてTVを計算することによって決定する。
当業者は、この研究の特定のパラメータ、例えば、注射する腫瘍細胞の数、注射部位、移植するヒトT細胞の数、投与する二重特異性抗体コンストラクトの量およびタイムラインを変更しつつまたは適合させつつ、なおも有意義かつ再現性のある結果に到達する方法に通じている。好ましくは、腫瘍成長阻害T/C［％］は≦70もしくは≦60であり、より好ましくは≦50もしくは≦40であり、さらにより好ましくは≦30もしくは≦20であり、最も好ましくは≦10もしくは≦5であり、または≦2.5でさえある。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様において、抗体コンストラクトは、単鎖抗体コンストラクトである。
また、本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様において、第3のドメインは、アミノからカルボキシルへの順に、
ヒンジ-CH2-CH3-リンカー-ヒンジ-CH2-CH3
を含む。
本発明の1つの態様において、第3のドメインのポリペプチド単量体の各々は、SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する。好ましい態様または本発明において、ポリペプチド単量体の各々は、SEQ ID NO:17〜24から選択されるアミノ酸配列を有する。
また、本発明の1つの態様において、第3のドメインの1つまたは好ましくは各々（両方）のポリペプチド単量体のCH2ドメインは、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む。当技術分野で公知のように、「システインジスルフィド架橋」という用語は、一般構造R-S-S-Rを有する官能基を表す。この連結はまた、SS結合またはジスルフィド架橋とも呼ばれ、システイン残基の2つのチオール基のカップリングによってもたらされる。本発明の抗体コンストラクトにおいて、成熟抗体コンストラクト内でシステインジスルフィド架橋を形成するシステインが309および321（Kabat番号）に対応するCH2ドメインのアミノ酸配列に導入されることが特に好ましい。
本発明の1つの態様において、CH2ドメインのKabat位置314のグリコシル化部位は除去される。このグリコシル化部位の除去はN314X置換によって達成されることが好ましく、ここでXはQではない任意のアミノ酸である。この置換は好ましくはN314G置換である。より好ましい態様において、CH2ドメインはさらに、以下の置換、（Kabatにしたがう位置で）V321CおよびR309Cを含む（これらの置換はKabat位置309および321にドメイン内システインジスルフィド架橋を導入する）。
例えば当技術分野で公知の二重特異性ヘテロFc抗体コンストラクト（図1b）と比較しての本発明の抗体コンストラクトの好ましい特徴は、特に、CH2ドメインへの上記の修飾の導入に関連すると考えられる。したがって、本発明のコンストラクトにおいて、本発明の抗体コンストラクトの第3のドメイン内のCH2ドメインがKabat位置309および321にドメイン内システインジスルフィド架橋を含むことならびに／またはKabat位置314のグリコシル化部位が上記のようにN314X置換によって、好ましくはN314G置換によって除去されることが好ましい。
本発明のさらに好ましい態様において、本発明の抗体コンストラクトの第3のドメイン内のCH2ドメインは、Kabat位置309および321にドメイン内システインジスルフィド架橋を含み、かつKabat位314のグリコシル化部位がN314G置換によって除去されている。最も好ましくは、本発明の抗体コンストラクトの第3のドメインのポリペプチド単量体は、SEQ ID NO:17および18からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
1つの態様において、本発明は、
（i）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
（ii）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
（iii）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、または
（iv）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、
抗体コンストラクトを提供する。
したがって、第1および第2のドメインは、各々2つの抗体可変ドメイン、例えばVHおよびVLドメインを含む結合ドメインであり得る。本明細書で上記されている2つの抗体可変ドメインを含むそのような結合ドメインの例は、例えば、上記のFvフラグメント、scFvフラグメントまたはFabフラグメントを含む。あるいは、これらの結合ドメインのいずれか一方または両方は、単一の可変ドメインのみを含み得る。本明細書で上記されているそのような単一ドメイン結合ドメインの例は、例えば、他のV領域またはドメインに非依存的に抗原またはエピトープに特異的に結合するVHH、VHまたはVLであり得る1つのみの可変ドメインを含むナノボディまたは単一可変ドメイン抗体を含む。
本発明の抗体コンストラクトの好ましい態様において、第1および第2のドメインは、ペプチドリンカーを通じて第3のドメインに融合される。好ましいペプチドリンカーは本明細書で上記されており、アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、すなわちGly4Ser（SEQ ID NO:1）、またはその多量体、すなわち（Gly4Ser)xによって特徴づけられ、ここでxは1またはそれより大きい整数（例えば、2または3）である。第3のドメインに対する第1および第2のドメインの融合において特に好ましいリンカーは、SEQ ID NO:1に示されている。
好ましい態様において、本発明の抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルへの順に、
（a）第1のドメイン、
（b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（c）第2のドメイン、
（d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（e）第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
（f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
（g)第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
を含むことで特徴付けられる。
本発明の抗体コンストラクトは、BCMAに、好ましくはBCMAの細胞外ドメイン（ECD）に結合する第1のドメインを含む。「BCMAの細胞外ドメインに結合する」という用語は、本発明との関係で、その結合ドメインが標的細胞の表面上に発現されたBCMAに結合することを暗示していることが理解される。したがって本発明にしたがう第1のドメインは、好ましくは、天然発現細胞もしくは細胞株によって、および／またはBCMAで形質転換もしくは（安定的／一過的に）トランスフェクトされた細胞もしくは細胞株によって発現されたBCMAに結合する。好ましい態様において、第1の結合ドメインはまた、BCMAがインビトロ結合アッセイ、例えばBIAcoreまたはScatchardにおいて「標的」または「リガンド」分子として使用される場合に、BCMAに結合する。「標的細胞」は、その表面上にBCMAを発現する任意の原核生物または真核生物細胞であり得；好ましくは標的細胞はヒトまたは動物の身体の一部である細胞、例えば特定のBCMA発現癌または腫瘍細胞である。
好ましくは、第1のドメインは、ヒトBCMA/BCMA ECDに結合する。好ましいヒトBCMA配列はSEQ ID NO:41に示され、好ましいヒトBCMA ECD配列はSEQ ID NO:42に示される。さらなる好ましい態様において、それはマカクBCMA/BCMA ECDに結合する。好ましいマカクBCMA配列はSEQ ID NO:43に示され、好ましいマカクBCMA ECD配列はSEQ ID NO:44に示される。最も好ましい態様にしたがい、第1のドメインは、ヒトおよびマカクBCMA/BCMA ECDの両方に結合する。「BCMA細胞外ドメイン」または「BCMA ECD」は、BCMAの膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まないBCMA領域または配列を表す。本発明のBCMAポリペプチドにおいて同定される膜貫通ドメインは、そのタイプの疎水性ドメインを同定する当技術分野で慣用的に用いられている基準にしたがい同定されることが当業者に理解されるであろう。膜貫通ドメインの正確な境界は異なり得るが、本明細書で具体的に言及されているドメインのいずれかの末端の約5アミノ酸以下である可能性が非情に高い。好ましい全長BCMAアミノ酸配列は、SEQ ID NO:41に示される。好ましいBCMA ECDは、SEQ ID NO:42に示される。
BCMAに結合する好ましい結合ドメインは、WO 2013/072406、WO 2013/072415およびWO 2014/140248に開示されている。これらの出願に記載されるBCMAのあらゆる結合ドメインが、本発明に関連して使用され得る。
本発明の1つの局面において、抗体コンストラクトは、アミノからカルボキシルへの順に、
（a）SEQ ID NO:53、59、71、77、89または95からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第1のドメイン、
（b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（c）WO 2008/119567のSEQ ID NO: 23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185もしくは187、またはSEQ ID NO:15からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第2のドメイン、
（d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
（e）SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるポリペプチド配列を有する第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
（f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
（g)SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
を含む。
好ましい態様に沿って、ペプチドリンカーを通じて第3のドメインに融合される第1および第2のドメインは、SEQ ID NO:53、59、71、77、89または95からなる群より選択される配列を含む。1つの局面において、本発明の抗体コンストラクトは、SEQ ID NO:55、56、61、62、73、74、79、80、91、92、97および98からなる群より選択されるアミノ酸配列を有することにより特徴付けられる。
本発明はさらに、本発明の抗体コンストラクトをコードするポリヌクレオチド／核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドは、鎖内で共有結合により結合された13個またはそれ以上のヌクレオチド単量体から構成されるバイオポリマーである。DNA（例えば、cDNA）およびRNA（例えば、mRNA）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。ヌクレオチドは、DNAまたはRNAの様な核酸分子の単量体またはサブユニットとして機能する有機分子である。核酸分子またはポリヌクレオチドは、二本鎖および一本鎖、直線状および環状であり得る。それは、好ましくは、好ましくは宿主細胞内に含まれるベクター内に含まれる。宿主細胞は、例えば、本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを用いた形質転換またはトランスフェクション後に、抗体コンストラクトを発現することができる。その目的のために、ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、制御配列に機能的に連結される。
遺伝子コードは、遺伝物質（核酸）内に暗号化されている情報をタンパク質に翻訳するルール集である。生物の細胞における生物学的解読は、アミノ酸を運搬し、mRNAに一度に3つのヌクレオチドを読み取らせるtRNA分子を用いて、mRNAによって指定される順にアミノ酸を連結するリボソームによって達成される。このコードは、どのアミノ酸がタンパク質合成の間に次に付加されるかをコドンと呼ばれるこれらの3ヌクレオチドの配列がどのように指定するかを定義する。いくつかの例外があるが、核酸配列内の3ヌクレオチドコドンは、1つのアミノ酸を指定する。大部分の遺伝子が正確に同一のコードによって暗号化されているため、この特定のコードはしばしばカノニカルまたは標準的な遺伝子コードと称される。遺伝子コードは特定の暗号化領域のタンパク質配列を決定し、他のゲノム領域はいつどこでこれらのタンパク質が産生されるかに影響し得る。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、（外来）遺伝物質を細胞内に運搬するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび人工染色体を含むがこれらに制限されない。一般に、工学ベクターは、複製起点、マルチクローニング部位および選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート（導入遺伝子）およびベクターの「骨格」の役割をするより大きな配列を含むヌクレオチド配列、通常DNA配列である。最近のベクターは、導入遺伝子インサートおよび骨格に加えて追加の特徴：プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的指向配列、タンパク質精製タグを含み得る。発現ベクター（発現コンストラクト）と呼ばれるベクターは特に、標的細胞において導入遺伝子を発現させるためのものであり、一般に、制御配列を有する。
「制御配列」という用語は、機能的に連結されたコード配列を特定の宿主生物において発現させるのに必要なDNA配列を表す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
核酸は、それが別の核酸配列との機能的関係の下に置かれている場合、「機能的に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのDNAがポリペプチドのためのDNAに機能的に連結されているのは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり；プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されているのは、それがその配列の転写に影響する場合であり；またはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されているのは、それが翻訳を促進するよう配置される場合である。一般に、「機能的に連結」は、連結されるDNA配列が連続していること、および、分泌リーダーの場合は、連続しかつリーディングフェーズ内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要がない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来の実務にしたがい、合成性のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を意図的に標的細胞に導入する方法である。この用語は、ほとんどの場合、真核生物細胞における非ウイルス的方法のために使用される。形質導入は、しばしば、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルスを介した移入を表すために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、典型的に、物質の取り込みを可能にする、細胞膜における一過的な孔または「穴」の開口を伴う。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いて、エレクトロポレーションによって、細胞スクイージング（cell squeezing）によってまたはカチオン性脂質とその物質を混合して、細胞膜と融合しそれらの内部の荷物を届けるリポソームを作製することによって行われ得る。
「形質転換」という用語は、細菌への、また、植物細胞を含む非動物真核生物細胞への核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）の非ウイルス的移入を表すために使用される。形質転換は、したがって、細胞膜を通じたその周囲からの直接的取り込みおよびその後の外因性遺伝子物質（核酸分子）の組み込みから生じる細菌または非動物真核生物細胞の遺伝的変更である。形質転換は、人為的手段によって行われ得る。形質転換を行うために、細胞または細菌は、飢餓および細胞密度等の環境条件に対する時限的応答として起こり得るコンピテントな状態でなければならない。
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチド／核酸分子またはベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」または「レシピエント細胞」という用語は、本発明の抗体コンストラクトをコードするベクター、外因性核酸分子およびポリヌクレオチドのレシピエントであり得るもしくはレシピエントであった任意の個々の細胞もしくは細胞培養物、ならびに／またはその抗体コンストラクトのレシピエントを含むことが意図されている。細胞へのそれぞれの物質の導入は、形質転換、トランスフェクション等によって行われる。「宿主細胞」という用語はまた、単一細胞の子孫または潜在的子孫を含むことも意図されている。後続世代では、自然発生的、偶発的もしくは意図的な変異のいずれかに起因してまたは環境的影響に起因して、一定の変化が生じ得るため、そのような子孫は、実際には、その親細胞と（形態学的にまたはゲノムもしくは総DNA相補体に関して）完全に同一ではないかもしれないが、そうであったとしてもそれは本明細書で使用されるこの用語の範囲に含まれる。適当な宿主細胞は、原核生物または真核生物細胞を含み、また細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞、例えば昆虫細胞および哺乳動物細胞、例えばマウス、ラット、マカクまたはヒトを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体コンストラクトは、細菌において産生され得る。発現後、本発明の抗体コンストラクトは、可溶性画分において大腸菌細胞ペーストから単離され、そして例えば親和性クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除を通じて精製され得る。最終精製は、例えばCHO細胞において発現させた抗体を精製するための方法と同様に行われ得る。
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状菌または酵母が、本発明の抗体コンストラクトに適したクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）または一般パン酵母は、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかし、多くの他の属、種および株が一般に利用可能であり、かつ本発明において有用である、例えば、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）宿主、例えばK.ラクチス（K. lactis）、K.フラジリス（K. fragilis）（ATCC 12424）、K.ブルガリクス（K. bulgaricus）（ATCC 16045）、K.ウィッカラミイ（K. wickeramii）（ATCC 24178）、K.ウォルチイ（K. waltii）（ATCC 56500）、K.ドロソフィラルム（K. drosophilarum）（ATCC 36906）、K.サーモトレランス（K. thermotolerans）およびK.マルキシアヌス（K. marxianus）；ヤロウイア（yarrowia）（EP 402 226）；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（EP 183 070）；カンジダ（Candida）；トリコダーマ・リーシア（Trichoderma reesia）（EP 244 234）；ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）；シュワンニオミセス（Schwanniomyces）、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）；ならびに糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシラム（Penicillium）、トリポクラジウム（Tolypocladium）およびアスペルギルス（Aspergillus）宿主、例えばA.ニデュランス（A. nidulans）およびA.ニガー（A. niger）。
本発明のグリコシル化抗体コンストラクトの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株および変種ならびにヨトウガ（Spodoptera frugiperde）（毛虫）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）（蚊）、ヒトスジシマカ（Aedes albopictus）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Bombyx mori）等の宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）NPVのL-1変種およびカイコNPVのBm-5株、が公的に入手可能であり、そのようなウイルスが、本発明にしたがい本明細書においてウイルスとして、特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、使用され得る。
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として使用され得る。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生に有用なクローニングおよび発現ベクターは当業者に公知である。例えば、Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986を参照のこと。
しかし、脊椎動物細胞に対する関心が最も高く、培養（組織培養）下での脊椎動物細胞の繁殖は慣用手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7、ATCC CRL 1651）；ヒト胎児腎臓株（293または懸濁培養下での成長のためにサブクローニングされた293細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-DHFR（CHO、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（TM4、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76、ATCC CRL 1587）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Hep G2、1413 8065）；マウス乳腺腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL5 1）；TRI細胞（Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68）；MRC 5細胞；FS4細胞；およびヒトヘパトーマ株（Hep G2）である。
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程、および産生された抗体コンストラクトを培養物から回収する工程を含む、本発明の抗体コンストラクトの製造のための方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、培地中での適切な条件下での細胞のインビトロ維持、分化、成長、増殖および／または繁殖を表す。「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むがこれらに限定されない、本発明の抗体コンストラクトの製造に関与する任意の工程を含む。
組み換え技術を用いる場合、抗体コンストラクトは、ペリプラズム間隙で細胞内産生され得、または培地に直接分泌され得る。抗体コンストラクトが細胞内産生される場合、最初の工程として、宿主細胞または溶解した断片のいずれかの粒状の残骸が、例えば遠心分離または限外ろ過によって除去される。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌のペリプラズム間隙に分泌された抗体を単離する手順を記載している。簡潔に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（pH 3.5）、EDTAおよびフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）の存在下で約30分間かけて解凍する。細胞の残骸は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合、通常最初に、そのような発現システムの上清が、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて濃縮される。プロテアーゼ阻害剤、例えばPMSFは、タンパク質分解を阻害するために、上記の工程のいずれかにおいて含められ得、そして抗生物質は、外来混入体の成長を防ぐために、含められ得る。
宿主細胞から調製された本発明の抗体コンストラクトは、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを用いて回収または精製され得る。他のタンパク質精製技術、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈降、逆相HPLC、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、SDS-PAGEおよび硫酸アンモニウム沈降もまた、回収される抗体に依存して利用可能である。本発明の抗体コンストラクトがCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABX樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。
親和性クロマトグラフィーが、好ましい精製技術である。親和性リガンドを付加するマトリクスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えばコントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンは、アガロースを用いて達成することができるよりも速い流速および短い処理時間を実現する。
さらに、本発明は、本発明の抗体コンストラクトまたは本発明の方法にしたがい製造された抗体コンストラクトを含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物において、抗体コンストラクトの均質性は≧80％であることが好ましく、より好ましくは≧81％、≧82％、≧83％、≧84％または≧85％、さらに好ましくは≧86％、≧87％、≧88％、≧89％または≧90%、なおさらに好ましくは≧91％、≧92％、≧93％、≧94％または≧95％、最も好ましくは≧96％、≧97％、≧98％または≧99％である。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、患者、特にヒト患者への投与に適した組成物に関連する。本発明の特に好ましい薬学的組成物は、1つまたは複数の本発明の抗体コンストラクトを、好ましくは治療有効量で含む。好ましくは、薬学的組成物はさらに、1つまたは複数の（薬学的に有効な）担体、安定化剤、賦形剤、希釈剤、可溶化剤、界面活性剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントの適切な配合物を含む。組成物の許容される成分は、好ましくは、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。本発明の薬学的組成物は、液体、凍結および凍結乾燥組成物を含むがこれらに限定されない。
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。一般に、本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与、特に非経口投与に適合する任意かつすべての水性および非水性溶液、滅菌溶液、溶媒、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液、水、懸濁物、乳化物、例えば油／水乳化物、様々なタイプの湿潤剤、リポソーム、分散媒およびコーティングを意味する。薬学的組成物におけるそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知であり、そのような担体を含む組成物は周知の従来法によって配合され得る。
特定の態様は、本発明の抗体コンストラクトおよびさらなる1つまたは複数の賦形剤、例えばこの節および本明細書の他箇所に例示されているものを含む薬学的組成物を提供する。賦形剤は、幅広い様々な目的で、例えば配合物の物理的、化学的もしくは生物学的特性を調節するために、例えば粘度の調節のために、ならびにまたは効果を改善するためおよびもしくはそのような配合物を安定化させるための本発明の方法ならびに例えば製造、輸送、保管、使用前準備、投与時およびそれ以降に発生するストレスに起因する分解および損傷に対する処理のために、本発明において使用され得る。
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば組成物のpH、オスモル濃度、粘性、清澄性、色、等張性、臭気、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出速度、吸収性または浸透性を変化、維持または保存するための配合物質を含み得る（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES 18'' Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Companyを参照のこと）。そのような態様において、適当な配合物質は、
・荷電アミノ酸、好ましくはリジン、酢酸リジン、アルギニン、グルタミン酸塩および／またはヒスチジンを含むアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、スレオニン、プロリン、2-フェニルアラニン；
・抗菌剤、例えば抗細菌剤および抗真菌剤；
・抗酸化物質、例えばアスコルビン酸、メチオニン、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム；
・組成物を生理学的pHでまたは若干低いpHで維持するために使用される緩衝液、緩衝系および緩衝化剤；緩衝液の例は、ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩またはその他の有機酸、コハク酸塩、リン酸塩およびヒスチジン；例えば、約pH 7.0〜8.5のTris緩衝液；
・非水性溶媒、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射可能有機エステル、例えばオレイン酸エチル；
・生理食塩水および緩衝化媒体を含む水、アルコール／水溶液、乳化物または懸濁物を含む水性担体；
・生分解性ポリマー、例えばポリエステル；
・充填剤、例えばマンニトールまたはグリシン；
・キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；
・等張剤および吸収遅延剤；
・錯化剤、例えばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン；
・増量剤；
・単糖；二糖；および他の炭水化物（例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン）；炭水化物は非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルファート、ソルビトールまたはキシリトールであり得る；
・（低分子量）タンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質性担体、例えばヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは、好ましくはヒト起源の、免疫グロブリン；
・着色および香味剤；
・硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム
・希釈剤；
・乳化剤；
・親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；
・塩形成対イオン、例えばナトリウム；
・保存剤、例えば抗菌剤、抗酸化物質、キレート剤、不活性ガス等；例は、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素である；
・金属錯体、例えばZn-タンパク質錯体；
・溶媒および共溶媒、例えばグリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール；
・糖および糖アルコール、例えばトレハロース、スクロース、オクタスルファート、マンニトール、ソルビトールまたはキシリトールスタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（myoinisitose）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；および多価糖アルコール；
・懸濁剤；
・界面活性剤または湿潤剤、例えばプルロニック、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート20、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal）；界面活性剤（surfactant）は、好ましくは＞1.2 KDの分子量を有する界面活性剤（detergent）および／または好ましくは＞3 KDの分子量を有するポリエーテルであり得る；好ましい界面活性剤（detergent）の非限定的な例はTween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80およびTween 85である；好ましいポリエーテルの非限定的な例はPEG 3000、PEG 3350、PEG 4000およびPEG 5000である；
・安定性向上剤、例えばスクロースまたはソルビトール；
・等張性向上剤、例えばアルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール；
・塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を含む非経口送達ビヒクル；
・体液および栄養補給液、電解質補給液（例えばリンガーデキストロースに基づくそれら）を含む静脈内送達ビヒクル
を含み得るがこれらに限定されない。
薬学的組成物の異なる成分（例えば、上記のそれら）は異なる効果を有し得ることが当業者に明らかであり、例えば、アミノ酸は緩衝液、安定化剤および／または抗酸化物質として機能し得、マンニトールは充填剤および／または等張性向上剤として機能し得；塩化ナトリウムは送達ビヒクルおよび／または等張性向上剤として機能し得る等である。
本発明の組成物は、その組成物の意図されている用途に依存して、本明細書で定義される本発明のポリペプチドに加えてさらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定されている。そのような薬剤は、胃腸系に対して作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症（hyperurikemia）を防ぐ薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に対して作用する薬物および／または当技術分野で公知の薬剤、例えばサイトカインであり得る。本発明の抗体コンストラクトが連携治療において、すなわち別の抗癌薬と併用して適用されることも想定されている。
特定の態様において、最適な薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形式および望まれる用量に基づいて、当業者によって決定されるであろう。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記を参照のこと。特定の態様において、そのような組成物は、本発明の抗体コンストラクトの物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響し得る。特定の態様において、薬学的組成物中の主たるビヒクルまたは担体は、本来的に水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適当なビヒクルまたは担体は、非経口投与用組成物において一般的な他の物質が補充され得る注射用水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンを混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。特定の態様において、本発明の組成物の抗体コンストラクトは、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で望ましい純度を有する選択された組成物を任意の配合剤（REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記）と混合することによって保管用に調製され得る。さらに、特定の態様において、本発明の抗体コンストラクトは、適当な賦形剤、例えばスクロースを用いて凍結乾燥物として配合され得る。
非経口投与が意図されている場合、本発明において使用される治療組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中に本発明の望まれる抗体コンストラクトを含む発熱物質非含有の、非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に適したビヒクルは、滅菌蒸留水であり、その中に本発明の抗体コンストラクトが滅菌性、等張性の溶液として配合され、適切に保存される。特定の態様において、調製物は、望まれる分子と、蓄積注射を通じて送達され得る製品の制御または持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射可能なマイクロスフィア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム等の薬剤との配合物を含み得る。特定の態様において、循環中での持続時間を向上させる効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。特定の態様において、移植可能な薬物送達デバイスが、望ましい抗体コンストラクトを導入するために使用され得る。
持続または制御送達／放出配合物中に本発明の抗体コンストラクトを含む配合物を含むさらなる薬学的組成物が、当業者に明らかであろう。様々な他の持続または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性マイクロ粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射物を配合する技術もまた当業者に公知である。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマーマイクロ粒子の制御放出について記載する国際特許出願第PCT/US93/00829号を参照のこと。持続放出調製物は、成形物、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、（米国特許第3,773,919号および欧州特許出願公開第EP 058481号に記載されるような）ポリラクチド、L-グルタミン酸とガンマ エチル-L-グルタメートのコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556）、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12:98-105）、エチレンビニル酢酸（Langer et al., 1981, 前記）またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第EP 133,988号）を含み得る。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかによって調製され得るリポソームを含み得る。例えば、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；欧州特許出願公開第EP 036,676号；同第EP 088,046号および同第EP 143,949号を参照のこと。
抗体コンストラクトはまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）で、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）で、またはマクロエマルジョンで捕捉され得る。そのような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed.,(1980)に開示されている。
インビボ投与のために使用される薬学的組成物は、典型的に、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構成の前および後のいずれかで実施され得る。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保管され得る。非経口組成物は、通常、滅菌されたアクセス口を有する容器、例えば皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈内溶液用バッグまたはバイアル中に入れられる。
本発明の別の局面は、国際特許出願WO 06138181A2（PCT/US2006/022599）に記載される、薬学的組成物として使用され得る、本発明の配合物の自己緩衝性抗体コンストラクトを含む。様々な解説が、タンパク質の安定化ならびにこの点で有用な配合物質および方法に関して利用可能である、例えば、Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002)およびRandolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)、具体的には、本発明にしたがう自己緩衝性タンパク質配合物と同じ賦形剤およびプロセスに関する部分、特に、獣医学的および／またはヒト医療用途のタンパク質薬品およびプロセスに関連する部分を参照のこと。
塩は、本発明の特定の態様にしたがい、例えば配合物のイオン強度および／もしくは等張性を調節するためならびに／または本発明にしたがう組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解度および／もしくは物理的安定性を改善するために使用され得る。周知のように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電残基に結合することによってならびにタンパク質中の荷電および極性基を遮蔽しそれらの静電気相互作用、誘引および反発相互作用の強度を減少させることによってネイティブ状態のタンパク質を安定化させ得る。イオンはまた、特にタンパク質の変性したペプチド結合（--CONH）に結合することによって変性状態のタンパク質を安定化させ得る。さらにタンパク質中の荷電および極性基とのイオン相互作用はまた、分子間静電気相互作用を減少させ、それによってタンパク質の凝集および不溶化を防止または減少させ得る。
イオン種は、タンパク質に対するそれらの効果が大きく異なる。イオンとタンパク質に対するそれらの効果のカテゴリー別順位づけは多数開発されており、これらが本発明にしたがう薬学的組成物を配合する上で使用され得る。1つの例は、イオン性および極性非イオン性溶質を溶液中のタンパク質の立体構造安定性に対するそれらの効果によって順位づけするホフマイスターシリーズである。安定化させる溶質は、「コスモトロピック」と称される。不安定化させる溶質は、「カオトロピック」と称される。コスモトロープは通常、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために高濃度（例えば、＞1モル硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープは通常、タンパク質を変性および／または可溶化（「塩溶」）させるために使用される。「塩溶」および「塩析」に対するイオンの相対的な効果が、ホフマイスターシリーズにおけるそれらの位置を定義する。
遊離アミノ酸は、充填剤、安定化剤および抗酸化物質としてならびにその他の標準的用途で、本発明の様々な態様にしたがう本発明の配合物の抗体コンストラクトにおいて使用され得る。リジン、プロリン、セリンおよびアラニンは、配合物中のタンパク質を安定化させるために使用され得る。グリシンは、正確なケーク構造および特性を確保するために凍結乾燥時に有用である。アルギニンは、液体および凍結乾燥の両配合物においてタンパク質の凝集を防ぐために有用であり得る。メチオニンは、抗酸化物質として有用である。
ポリオールは、糖、例えばマンニトール、スクロースおよびソルビトールならびに多価アルコール、例えばグリセロールおよびプロピレングリコールならびに、本明細書における議論の目的で、ポリエチレングリコール（PEG）および関連物質を含む。ポリオールはコスモトロピックである。それらは、タンパク質を物理的および化学的分解プロセスから保護するために液体および凍結乾燥の両配合物において有用な安定化剤である。ポリオールはまた、配合物の等張性を調節するために有用である。本発明の選択された態様において特に有用なポリオールは、凍結乾燥配合物においてケークの構造安定性を確保するために広く使用されるマンニトールである。それは、ケークの構造安定性を確保する。それは一般に、凍結保護物質、例えばスクロースと共に使用される。ソルビトールおよびスクロースは、等張性を調節するためにおよび輸送中または製造プロセスにおけるバルク調製中の凍結-解凍ストレスから保護するための安定化剤として特に好ましい薬剤である。（遊離アルデヒドまたはケトン基を含む）還元糖、例えばグルコースおよびラクトースは、表面リジンおよびアルギニン残基を糖化し得る。したがって、それらは概ね、本発明にしたがう使用に関して特に好ましいポリオールではない。加えて、そのような反応性種を形成する糖、例えば酸性条件下でフルクトースおよびグルコースに加水分解され、その結果糖化を引き起こすスクロースもまたこの点で本発明の特に好ましいポリオールではない。PEGは、タンパク質を安定化させるためにおよび凍結保護物質として有用であり、本発明においてこの点で使用され得る。
本発明の配合物の抗体コンストラクトの態様はさらに、界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面への吸着ならびに空気-液体、固体-液体および液体-液体界面での変性およびその結果としての凝集を起こしやすいものであり得る。これらの効果は通常、タンパク質濃度に反比例する。これらの有害な相互作用は概ねタンパク質濃度と反比例し、典型的には例えば製品の輸送および取り扱い時に生じる物理的撹拌によって悪化する。界面活性剤は、慣用的に、表面吸着を防止する、最小限に抑えるまたは減少させるために使用される。この点で本発明において有用な界面活性剤は、ポリソルベート20、ポリソルベート80、ソルビタンポリエトキシレートのその他の脂肪酸エステルおよびポロキサマー188を含む。界面活性剤はまた、タンパク質の立体構造安定性を制御するために広く使用されている。任意の特定の界面活性剤は典型的に一部のタンパク質を安定化させ他を不安定化させるので、この点で界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。
ポリソルベートは、酸化的分解を起こしやすく、しばしば、供給されるときに、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに十分な量のペルオキシドを含んでいる。そのためポリソルベートは、注意深く使用されなければならず、使用される際は、それらの最低有効濃度で用いられるべきである。この点で、ポリソルベートは、賦形剤がそれらの最低有効濃度で使用されるべきとする一般的ルールの一例である。
本発明の配合物の抗体コンストラクトの態様はさらに、1つまたは複数の抗酸化物質を含む。適当なレベルの周囲酸素および温度を維持することによってならびに光への暴露を回避することによって、薬学的配合物中でのタンパク質の有害な酸化をある程度まで防ぐことができる。タンパク質の酸化分解を防ぐために、抗酸化性賦形剤も使用され得る。この点で特に有用な抗酸化物質は、還元剤、酸素／フリーラジカル消去剤およびキレート剤である。本発明にしたがう治療用タンパク質配合物において使用される抗酸化物質は、好ましくは、水溶性であり、製品の有効期間を通じてそれらの活性を維持するものである。EDTAが、この点で本発明にしたがう好ましい抗酸化物質である。抗酸化物質は、タンパク質を損傷し得る。例えば、還元剤、例えばグルタチオンは特に、分子内ジスルフィド連結を破壊し得る。したがって、本発明において使用するための抗酸化物質は、特に、それ自体が配合物中のタンパク質に損傷を与える可能性を排除するまたは十分に減少させるよう選択される。
本発明にしたがう配合物は、タンパク質補因子でありタンパク質配位錯体を形成するのに必要とされる金属イオン、例えば、特定のインスリン懸濁物を形成するのに必要とされる亜鉛、を含み得る。金属イオンはまた、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害し得る。しかし、金属イオンはまた、タンパク質を分解する物理的および化学的プロセスを触媒する。マグネシウムイオン（10〜120mM）は、アスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性化を阻害するために使用され得る。Ca+2イオン（最大100mM）は、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を向上させ得る。Mg+2、Mn+2およびZn+2は、しかし、rhDNaseを不安定化させ得る。同様にCa+2およびSr+2は、第VIII因子を安定化させ得、それはMg+2、Mn+2およびZn+2、Cu+2ならびにFe+2によって不安定化され得、そしてその凝集はAl+3イオンによって増大し得る。
本発明の配合物の抗体コンストラクトの態様はさらに、1つまたは複数の保存剤を含む。保存剤は、同じ容器からの複数回の取り出しを行うマルチドーズ非経口配合物を開発する際に必要となる。それらの主たる機能は、その医薬品の有効期間または使用期間を通じて微生物の成長を阻害し、製品の滅菌性を確保することである。広く使用されている保存剤は、ベンジルアルコール、フェノールおよびm-クレゾールを含む。保存剤は低分子非経口薬と共に使用されてきた長い歴史を有しているが、保存剤を含むタンパク質配合物の開発は、困難であり得る。保存剤は、ほぼ常に、タンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これがマルチドーズタンパク質配合物におけるそれらの使用を制限する大きな要因となっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬は、単回使用のみのために配合されている。しかし、マルチドーズ配合物が可能となれば、それらは患者の利便性および高い市場性を実現するという追加の利点を得る。良い例は、保存処理された配合物の開発がより利便性の高い複数回使用される注射ペンの提案の商業化を実現したヒト成長ホルモン（hGH）のそれである。hGHの保存処理された配合物を含む少なくとも4つそのようなペンデバイスが、現在市場で入手可能である。Norditropin（液体、Novo Nordisk）、Nutropin AQ（液体、Genentech）およびGenotropin（凍結乾燥-デュアルチャンバーカートリッジ、Pharmacia ＆ Upjohn）はフェノールを含み、Somatrope (Eli Lilly）にはm-クレゾールが配合されている。保存処理された投薬形態の配合および開発の間に様々な局面が考慮される必要がある。医薬品における効果的な保存剤濃度は、最適化されなければならない。これは、タンパク質の安定性を損なわずに抗微生物効果を付与する濃度範囲で投薬形態中の与えられた保存剤を試験すること必要とする。
予想され得るように、保存剤を含む液体配合物の開発は、凍結乾燥配合物よりも困難である。凍結乾燥製品は、保存剤なしで凍結乾燥されそして使用時に保存剤を含む希釈剤で再構成され得る。これにより保存剤がタンパク質と接触する時間が短縮され、付随する安定性リスクが大きく抑制される。液体配合物の場合、保存剤の効果および安定性が、製品有効期間全体（約18〜24ヶ月）にわったって維持されるべきである。注意すべき重要な点は、保存剤の効果は活性な薬物およびすべての賦形剤成分を含む最終配合物において実証されるべきであることである。
本明細書に開示される抗体コンストラクトはまた、免疫リポソームとして配合され得る。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物の送達に有用な様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小さな小胞である。リポソームの成分は通常、生体膜の脂質の配置と同様の二層形式で配置される。抗体コンストラクトを含むリポソームは、例えば、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号；ならびにWO 97/38731に記載されるような当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が向上したリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって作製され得る。リポソームは、所望の直径のリポソームを生成するために、規定の孔サイズのフィルターを通して押出しされる。本発明の抗体コンストラクトのFab'フラグメントは、ジスルフィド交換反応を通じてMartin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されるようなリポソームに結合され得る。場合により、化学療法剤がリポソーム内に含められる。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)を参照のこと。
薬学的組成物が配合された後、それは溶液、懸濁物、ゲル、乳化物、固体、結晶としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保管され得る。そのような配合物は、即時使用可能（ready-to-use）形態または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかで保管され得る。
本明細書で定義される薬学的組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、WO 99/54440にまたはSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）によって記載されたような、細胞傷害性アッセイによって決定され得る。本明細書で使用される「効果」または「インビボ効果」は、例えば標準化されたNCI応答基準を用いる、本発明の薬学的組成物による治療に対する応答を表す。本発明の薬学的組成物を用いる治療の成功またはインビボ効果は、その意図されている目的に対する組成物の有効性、すなわち、その所望の効果、すなわち病理学的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇をもたらす組成物の能力を表す。インビボ効果は、白血球数、差異（differentials）、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引を含むがこれらに限定されない、各々の疾患において確立されている標準的方法によってモニタリングされ得る。加えて、様々な疾患に特異的な臨床化学パラメータおよびその他の確立された標準的方法が使用され得る。さらに、コンピューター断層撮影、X線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、National Cancer Institute基準に基づく応答評価のため［Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr; 17(4): 1244］）、ポジトロン放出断層走査、白血球数、差異、蛍光活性化細胞選別、骨髄吸引、リンパ節生検／組織学、および様々なリンパ腫に特異的な臨床化学パラメータ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ）ならびにその他の確立されている標準的方法が使用され得る。
薬物、例えば本発明の薬学的組成物の開発における別の大きな課題は、薬物動態特性の予測可能な調整である。この目的で、候補薬物の薬物動態プロフィール、すなわち、特定の状態を処置する特定の薬物の能力に影響する薬物動態パラメータのプロフィールが確立され得る。特定の疾患を処置する薬物の能力に影響する薬物の薬物動態パラメータは、半減期、分布容積、肝臓の初回通過時代謝および血液血清結合度を含むがこれらに限定されない。所定の薬物の効果は、上記のパラメータの各々によって影響され得る。特定のFc様式で提供される本発明の抗体コンストラクトの想定される特徴は、それらが例えば薬物動態挙動に関して違いを有することである。本発明にしたがう半減期延長標的指向抗体コンストラクトは、好ましくは、該抗体コンストラクトの「カノニカル」な非HLE版との比較で、インビボで驚くべきほど増加した残留時間を示す。
「半減期」は、投与された薬物の50％が生物学的プロセス、例えば代謝、排出等を通じて排除される時間を意味する。「肝臓の初回通過時代謝」は、肝臓に最初に接したときに、すなわちその初回肝臓通過時に代謝される薬物の傾向を意味する。「分布容積」は、例えば細胞内および細胞外空間、組織および臓器等のような、身体の様々な区画における薬物の保持ならびにこれらの区画内での薬物の分配の程度を意味する。「血液血清結合度」は、血液血清タンパク質、例えばアルブミンに相互作用および結合してその薬物の生物学的活性を減少または喪失させる薬物の傾向を意味する。
薬物動態パラメータはまた、投与される所定量の薬物についてのバイオアベイラビリティ、ラグ時間（Tlag）、Tmax、吸収速度、より多い作用発現（more onset）および／またはCmaxを含む。「バイオアベイラビリティ」は、血液区画の薬物の量を意味する。「ラグ時間」は、薬物の投与から血液または血漿中でのその検出および測定可能化までの間の時間の遅れを意味する。「Tmax」は、それ以降に薬物の最大血中濃度が達成される時間であり、「Cmax」は、所定の薬物によって得られる最大の血中濃度である。その生物学的効果に必要とされる薬物の血中または組織濃度に達するまでの時間は、すべてのパラメータに影響される。上記のような非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験において決定され得る、種間特異性を示す二重特異性抗体コンストラクトの薬物動態パラメータは、例えばSchlerethら（Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12）による刊行物にも示されている。
本発明の好ましい局面において、薬学的組成物は、約-20℃で少なくとも4週間安定である。付属の実施例から明らかなように、対応する先行技術の抗体コンストラクトの質に対する本発明の抗体コンストラクトの質は、異なるシステムを用いて試験され得る。これらの試験は、「ICH Harmonised Tripartite Guideline: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products Q5C and Specifications: Test procedures and Acceptance Criteria for Biotech Biotechnological/Biological Products Q6B」に準拠するものであることが理解され、それによって、その産物の個性、純度および能力の変化が検出される確実性を提供する安定性指標プロフィールを提供するよう選択される。純度という用語は相対的な用語であることが十分に受け入れられている。グリコシル化、脱アミド化または他の不均質性の影響に起因して、バイオテクノロジー／生物学的産物の絶対的な純度は典型的に2つ以上の方法によって評価されるべきであり、得られる純度の値は方法依存的である。安定性試験の目的上、純度の試験は分解産物の決定方法に合わせるべきである。
本発明の抗体コンストラクトを含む薬学的組成物の質の評価のために、例えば溶液中の可溶性凝集物の量（サイズ排除あたりのHMWS）を分析することによって、分析され得る。約-20℃で少なくとも4週間の安定性は、1.5％HMWS未満、好ましくは1％HMWS未満の量によって特徴づけられる。
薬学的組成物としての抗体コンストラクトの好ましい配合物は、例えば、以下に記載される配合物の成分を含み得る：
・配合物A：
pH 6.0でリン酸カリウム、L-アルギニン塩酸塩、トレハロース二水和物、ポリソルベート80。
薬学的組成物の形態の本発明の抗体コンストラクトの安定性の評価の他の例は、付属の実施例4〜12に提供されている。これらの実施例において、本発明の抗体コンストラクトの態様は、異なる薬学的配合物において異なるストレス条件に関して試験され、その結果が当技術分野で公知の他の半減期延長（HLE)形式の二重特異性T細胞エンゲージ抗体コンストラクトと比較される。一般に、本発明にしたがう特定のFc様式で提供される抗体コンストラクトは典型的に、異なるHLE形式と共に提供されるおよびいかなるHLE形式も有さない抗体コンストラクト（すなわち、「カノニカル」な抗体コンストラクト）の両方と比較して、温度および光ストレス等の広範囲のストレス条件に対してより安定である。温度安定性は、低温（凍結温度を含む室温以下）および高温（体温までのまたは体温を超える温度を含む室温以上）の両方に関連し得る。当業者は、臨床実務において避けるのが困難なストレスに対するそのような改善された安定性が、臨床実務においてより少ない分解産物を生じさせることから、この抗体コンストラクトをより安全にすることを理解するであろう。その結果、高い安定性は高い安全性を意味する。
1つの態様は、BCMA発現またはBCMA過剰発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害および自己免疫疾患の予防、処置または改善において使用するための本発明の抗体コンストラクトまたは本発明の方法にしたがい製造された抗体コンストラクトを提供する。
本明細書に記載される配合物は、それを必要とする患者において本明細書に記載される病理学的な医学的状態を処置、改善および／または予防する薬学的組成物として有用である。「処置」という用語は、治療的処置および予防または抑止的手段の両方を表す。処置は、疾患、疾患の症状または疾患の素因を治癒する（cure）、治癒する（heal）、軽減する、解放する、変化させる、修復する、改善する（ameliorate）、改善する（improve）またはそれに影響を与える目的での、疾患／障害、疾患／障害の症状または疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織または細胞に対する配合物の適用または投与を含む。
本明細書で使用される「改善（amelioration）」という用語は、それを必要とする対象への本発明にしたがう抗体コンストラクトの投与による、本明細書で以下に記載される疾患を有する患者の疾患状態の任意の改善（improvement）を表す。そのような改善はまた、患者の疾患の進行の鈍化または停止として見られることもある。本明細書で使用される「予防」という用語は、それを必要とする対象への本発明にしたがう抗体コンストラクトの投与による、本明細書で以下に記載される腫瘍または癌または転移癌を有する患者の発生または再発の回避を意味する。
「疾患」という用語は、本明細書に記載される抗体コンストラクトまたは薬学的組成物を用いた処置から利益を得るであろう任意の状態を表す。これは、哺乳動物を問題の疾患にかかりやすくする病理学的状態を含む、慢性および急性の障害または疾患を含む。
「新生物」は、組織の異常な成長であるが、通常、細胞塊（mass）を形成するとは限らない。細胞塊も形成する場合、それは一般に、「腫瘍」と称される。新生物または腫瘍は、良性、潜在的に悪性（前癌性）または悪性であり得る。悪性新生物は、一般に癌と呼ばれる。それらは通常周辺組織に侵襲してこれらを破壊し、かつ転移を形成し得る、すなわちそれらは身体の他の部分、組織または臓器に拡散する。したがって、「転移癌」という用語は、元の腫瘍のそれ以外の他の組織または臓器への転移物を含む。リンパ腫および白血病は、リンパ系新生物である。本発明との関係で、それらは「腫瘍」または「癌」という用語にも含まれる。
「ウイルス疾患」という用語は、対象のウイルス感染の結果である疾患を表す。
本明細書で使用される「免疫学的障害」という用語は、この用語の一般的な定義に沿って、自己免疫疾患、過敏症、免疫不全等の免疫学的障害を表す。
1つの態様において、本発明は、BCMA発現もしくはBCMA過剰発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害または自己免疫疾患の処置または改善のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の抗体コンストラクトまたは本発明の方法にしたがい製造された抗体コンストラクトを投与する工程を含む方法を提供する。
形質細胞障害において、形質細胞の1つのクローンは制御されずに増加する。結果として、このクローンはMタンパク質として公知の単一の（モノクローナル）抗体を多量に産生する。単クローン性ガンマグロブリン血症等のいくつかの例において、産生される抗体は不完全であり、軽鎖または重鎖のみからなる。これらの異常な形質細胞およびそれらが産生する抗体は、通常、1つのタイプに限定される。
好ましくは、形質細胞障害は、多発性骨髄腫、形質細胞腫、形質細胞性白血病、マクログロブリン血症、アミロイド症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、孤立性形質細胞腫、髄外性形質細胞腫、骨硬化性骨髄腫、重鎖病、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症およびくすぶり型多発性骨髄腫からなる群より選択される。B細胞障害はまた、B細胞非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病およびホジキンリンパ腫からなる群より選択され得る。
自己免疫疾患は、例えば、全身性エリテマトーデス（SLE）または関節リウマチ（RA）である。
「必要とする対象」または「処置を必要とする」対象という用語は、すでにその障害を有する対象およびその障害を予防したい対象を含む。必要とする対象または「患者」は、予防的または治療的のいずれかの処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含む。
本発明の抗体コンストラクトは、通常、特に、バイオアベイラビリティおよび持続性の範囲で、特定の投与経路および投与方法のために、特定の投与用量および投与頻度のために、特定の疾患の特定の処置のために設計されるであろう。組成物は、好ましくは、その投与部位にとって許容可能な濃度で配合される。
配合物および組成物は、したがって、本発明にしたがい、任意の適当な投与経路による送達のために設計され得る。本発明との関係で、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚、吸入、鼻、眼、耳（auricular/aural）、膣、粘膜）
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、口腔、直腸）および
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋内、脳内、脳室内、硬膜外、くも膜下、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
を含むがこれらに限定されない。
本発明の薬学的組成物および抗体コンストラクトは特に、例えば注射、例えばボーラス注射による、または注入、例えば連続注入による、非経口投与、例えば皮下または静脈内送達に有用である。薬学的組成物は、医療デバイスを用いて投与され得る。薬学的組成物を投与するための医療デバイスの例は、米国特許第4,475,196号；同第4,439,196号；同第4,447,224号；同第4,447,233号；同第4,486,194号；同第4,487,603号；同第4,596,556号；同第4,790,824号；同第4,941,880号；同第5,064,413号；同第5,312,335号；同第5,312,335号；同第5,383,851号；および同第5,399,163号に記載されている。
特に、本発明は、適当な組成物の中断のない投与を提供する。非限定的な例として、中断のないまたは実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療剤の流入を計量する患者が装着する小型ポンプシステムによって行われ得る。本発明の抗体コンストラクトを含む薬学的組成物は、このポンプシステムを用いることによって投与され得る。そのようなポンプシステムは概ね当技術分野で公知であり、一般には注入される治療剤を含むカートリッジの定期的交換が必要である。そのようなポンプシステムにおいてカートリッジを交換する際、それ以外では中断されない患者体内への治療剤の流入の一時的中断が生じ得る。そのような場合であっても、カートリッジ交換前の投与フェーズとカートリッジ交換後の投与フェーズは、本発明の薬学的手段および方法の両方の意味で、依然としてそのような治療剤の一つの「中断のない投与」を構成するとみなされるであろう。
本発明の抗体コンストラクトの連続的なまたは中断のない投与は、流体をリザーバから送り出すための流体送出機構および送出機構を作動させるための作動機構を含む、流体送達デバイスまたは小型ポンプシステムによる静脈内または皮下投与であり得る。皮下投与用のポンプシステムは、患者の皮膚に突き入り適当な組成物を患者体内に送達するための針またはカニューレを含み得る。このポンプシステムは、静脈、動脈または血管に関係なく、ポンプシステムと患者の皮膚が直接接触するよう患者の皮膚に直接固定または装着され得る。ポンプシステムは、患者の皮膚に24時間〜数日間装着され得る。ポンプシステムは、少量のリザーバを有する小サイズのものであり得る。非限定的な例として、投与される適当な薬学的組成物のリザーバの容量は、0.1〜50mlの間であり得る。
連続的な投与はまた、皮膚に装着され一定間隔で交換されるパッチによる経皮投与であり得る。当業者は、この目的に適した薬物送達のためのパッチシステムに精通している。経皮投与は、第1の使用済みパッチの交換が、新しい第2のパッチを例えば第1の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面にかつ第1の使用済みパッチの除去直前に設置するのと同時に達成され得る利点があるために、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流れの中断または動力源喪失の問題は生じない。
薬学的組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された物質はまず、投与の前に適当な液体で再構成される。凍結乾燥された物質は、例えば注射用静菌水（BWFI）、生理学的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または凍結乾燥の前にタンパク質が入っていたのと同じ配合物で再構成され得る。
本発明の組成物は、例えば漸増用量の本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトを非チンパンジー霊長類、例えばマカク、に投与する用量増加研究によって決定され得る適当な用量で対象に投与され得る。上記のように、本明細書に記載される種間特異性を示す本発明の抗体コンストラクトは、非チンパンジー霊長類における前臨床試験においておよびヒトにおける薬物として同一の形態で使用できる利点がある。投薬レジメンは、担当医および臨床的要因によって決定されるであろう。医学分野で周知のように、ある1人の患者に対する用量は、その患者のサイズ、体の表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間および経路、全般的健康状態ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。
「有効用量（effective dose）」または「有効用量（effective dosage）」という用語は、所望の効果を達成するまたは少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。「治療有効用量」という用語は、疾患にすでに罹患している患者において疾患およびその合併症を治癒するまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途で効果的な用量は、処置される状態（適応）、送達される抗体コンストラクト、治療の内容および目的、疾患の重篤度、治療歴、患者の病歴および治療剤に対する応答、投与経路、サイズ（体重、体表面積もしくは臓器サイズ）ならびに／または患者の状態（年齢および全般的健康状態）、ならびに患者自身の免疫系の全般的状態に依存するであろう。適当な用量は、最適な治療効果を得るために一度にまたは一連の投与として患者に投与され得るよう、担当医の判断にしたがい調節され得る。
典型的な用量は、上記の要因に依存して、約0.1 μg/kg〜約30 mg/kgまたはそれ以上の範囲であり得る。特定の態様において、用量は、1.0 μg/kg〜約20 mg/kg、任意で10 μg/kg〜約10 mg/kgまたは100 μg/kg〜約5 mg/kgの範囲であり得る。
治療有効量の本発明の抗体コンストラクトは、好ましくは、疾患症状の重篤度を低下させ、無疾患症状期の頻度もしくは期間を増加させ、または疾患の苦痛に起因する障害もしくは無力を防止する。本明細書において上述したようなBCMA発現と相関する疾患の処置のために、治療有効量の本発明の抗体コンストラクト、ここでは抗BCMA/抗CD3抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞成長または腫瘍成長を未処置患者と比較して少なくとも約20％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％または少なくとも約90％阻害する。腫瘍成長を阻害する化合物の能力は、効能を予測する動物モデルにおいて評価され得る。
薬学的組成物は、1回の治療としてまたは必要な場合は追加の治療、例えば抗癌治療、例えば他のタンパク質性および非タンパク質性薬物と組み合わせて投与され得る。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明の抗体コンストラクトを含む組成物と共に同時に投与され得または抗体コンストラクトの投与前もしくは投与後に時間的に定義された間隔および用量で別々に投与され得る。
本明細書で使用される「有効かつ非毒性用量」という用語は、大きな毒性作用を生じさせずにまたは本質的に生じさせずに病理学的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の縮退または疾患の安定化をもたらすのに十分高い、本発明の抗体コンストラクトの許容可能な用量を表す。そのような有効かつ非毒性用量は、例えば当技術分野で記載されている用量増加研究によって決定され得、そしてそれは重篤な有害副事象を誘導する用量以下とされるべきである（用量制限毒性、DLT）。
本明細書で使用される「毒性」という用語は、有害事象または重篤な有害事象において現れる薬物の毒性の効果を表す。これらの副事象は、全体的な薬物の許容性の欠如および／または投与後の局所的な許容性の欠如を表し得る。毒性はまた、その薬物によって引き起こされる催奇形効果または発癌効果を含み得る。
本明細書で使用される「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」という用語は、投与直後に（局所的認容性）およびより長期の薬物適用期間の間に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」または「認容性」は、例えば、処置中およびフォローアップ期間中に一定間隔で評価され得る。測定は、臨床評価、例えば臓器の兆候、および検査異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、NCI-CTCおよび／またはMedDRA標準にしたがう正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の兆候は、例えばCommon Terminology Criteria for adverse events v3.0（CTCAE）に示されるように、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固等の基準を含み得る。試験され得る検査パラメータは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロフィールおよび尿検査ならびにその他の体液、例えば血清、血漿、リンパまたは脊髄液、リカー等の試験を含む。したがって安全性は、例えば身体試験、画像化技術（すなわち、超音波、x線、CTスキャン、磁気共鳴画像化（MRI）、専門的装置を用いるその他の測定（すなわち、心電図）、バイタルサインによって、検査パラメータを測定し有害事象を記録することによって、評価され得る。例えば、本発明にしたがう使用および方法において、非チンパンジー霊長類における有害事象が組織病理学および／または組織化学法により試験され得る。
上記の用語はまた、例えば、Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting on July 16, 1997においても参照されている。
最後に、本発明は、本発明の抗体コンストラクトもしくは本発明の方法にしたがい製造された抗体コンストラクト、本発明の薬学的組成物、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターおよび／または本発明の宿主細胞を含む、キットを提供する。
本発明との関係で、「キット」という用語は、コンテナ、容器またはその他にまとめて梱包された、その1つが本発明の抗体コンストラクト、薬学的組成物、ベクターまたは宿主細胞に対応する、2つまたはそれ以上の要素を意味する。キットは、したがって、単品として販売することができる、特定の目的を達成するために十分な製品および／または用品の一式として表され得る。
キットは、投与に適した用量（上記参照）の本発明の抗体コンストラクトまたは薬学的組成物を含む任意の適当な形状、サイズおよび材質（好ましくは防水性、例えばプラスチックまたはガラス）の1つまたは複数の容器（例えば、バイアル、アンプル、コンテナ、シリンジ、ボトル、バッグ）を含み得る。キットはさらに、（例えば、リーフレットまたは指示マニュアルの形態の）使用説明書、本発明の抗体コンストラクトを投与するための手段、例えば、シリンジ、ポンプ、インフューザー等、本発明の抗体コンストラクトを再構成するための手段および／また本発明の抗体コンストラクトを希釈するための手段を含み得る。
本発明はまた、単回用量投与単位のためのキットを提供する。本発明のキットはまた、乾燥／凍結乾燥された抗体コンストラクトを含む第1の容器および水性配合物を含む第2の容器を含み得る。本発明の特定の態様において、単チャンバーおよび多チャンバー式充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（lyosyringe））を含むキットが提供される。
本明細書で使用される場合、単数形（「a」、「an」および「the」）は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り、複数の参照を含むことに留意されなければならない。したがって、例えば、「試薬（a reagent）」に対する参照は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「方法（the method）」に対する参照は、本明細書に記載される方法のために改変され得るまたは本明細書に記載される方法と置換され得る当業者に公知の等価な工程および方法（equivalent steps and methods）に対する参照を含む。
そうでないことが示されない限り、要素群の前に置かれる「少なくとも」という用語は、この群のあらゆる要素を参照していると理解されるべきである。当業者は、慣用的以上の実験を用いずとも、本明細書に記載される本発明の具体的態様の多くの等価物を認識するまたは確認することができる。そのような等価物は、本発明に含まれることが意図されている。
「および（ならびに）／または（もしくは）」という用語は、本明細書のいずれの場所で使用される場合でも、「および（ならびに）」、「または（もしくは）」および「この用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含んでいる。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、示された値または範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内を意味する。しかしこれには名数（concrete number）も含まれ、例えば約20は20を含む。
「〜未満」または「〜を超える」という用語には、名数が含まれる。例えば、20未満とは、それ未満であるか同等であることを意味する。同様に、超えるまたはより大きいとは、それを超えるか同等であることまたはより大きいか同等であることをそれぞれ意味する。
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（comprise）」という単語および「含む（comprises）」、「含む（comprising）」等の派生語は、言及されている整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを含むが、任意のその他の整数値もしくは工程または整数値もしくは工程のグループを排除しないことを暗に示すものと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含む（containing）」もしくは「含む（including）」という用語と、または本明細書で使用される場合ときどき「有する（having）」という用語と置き換えられ得る。
本願で使用される場合、「からなる」は、添付の特許請求の範囲の要素の中で指定されていない任意の要素、工程または成分を排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、添付の特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない物質または工程を排除しない。
本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語はいずれも、他の2つの用語のいずれかと置き換えられ得る。
本発明は、本明細書に記載した特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、および物質などに限定されず、それらは変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される専門用語は特定の態様を説明する目的で提供されるにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は専ら特許請求の範囲によって定義される。
本明細書を通して引用されているすべての刊行物および特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造元の仕様書、説明書等を含む）は、前記のものも後記のものも、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書のいかなる事項も、本発明がそれらが先行発明であることを理由としてそのような開示よりも前の日付を主張する資格を有さないことの承認とみなされるべきでない。参考文献に含まれる内容が本明細書と相反または矛盾する程度まで、本明細書はあらゆるそのような内容よりも優先される。
説明目的でのみ提供される以下の実施例から、本発明およびその利点についてのより良好な理解が得られるであろう。実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。以下の実施例は、本発明による他の二重特異性抗体コンストラクトと同様に、すなわち同じプロトコールに従って、実施されうる。
実施例1：標的細胞の非存在下でT細胞においてBiTE（登録商標）により誘導されるCD69発現
健常なヒトドナーから単離されたPBMCを、漸増濃度の標的B/CD3または標的A/CD3 HLE二重特異性抗体コンストラクトと共に48時間培養した。T細胞における活性化マーカーCD69の発現を、免疫染色およびフローサイトメトリーならびに抗原特異的コンジュゲートmAbによって決定した。
すべての抗CDH 19コンストラクトにおいてCD69の上方調節の観点での標的非依存的T細胞活性化が観察されたが、それはヘテロFcおよびクロスボディ分子において最も強かった。抗標的B-scFcによるCD69の上方調節はより高い濃度で起こり、その程度は他の2つのFcベースのコンストラクトと比較していくぶん低かった。
抗標的Aに関して、標的非依存的T細胞活性化はscFc含有分子でほとんど観察されなかったが、ヘテロFcコンストラクトは標的細胞の非存在下で細胞表面T細胞においてCD69の強い上方調節を誘導した。
C末端に単鎖FcまたはヘテロFc融合を含むBiTE（登録商標）コンストラクトにより誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
BiTE（登録商標）コンストラクト（連続希釈物：0.1 pM〜2μM）
a. 標的A-I2C scFc；1.14 mg/mL；
b. 標的A ヘテロFc；1.02 mg/
ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー；#065、#823、#836（scFc）#401、#415、#433（ヘテロFc）；#590、#595、598、#605（Xボディ））
48時間のインキュベート時間
フローサイトメトリーおよび抗原特異的コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現の測定。結果については図2を参照のこと。
C末端に単鎖Fc、ヘテロFcまたはクロスボディ融合を含むBiTE（登録商標）抗体コンストラクトにより誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
BiTE（登録商標）コンストラクト（連続希釈物：0.1 pM〜2μM）
c. 標的BxI2C scFc；245.3 μg/mL；
d. 標的B ヘテロFC；1 mg/mL
e. 標的Bクロスボディ；6.3 mg/mL
ヒトPBMCエフェクター細胞（3〜4名のドナー；#386、#392、#401（scFc）#282、#284、#287（ヘテロFc））
48時間のインキュベート時間
フローサイトメトリーおよび抗原特異的コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現の測定。結果については図3を参照のこと。
これらのアッセイで試験されたいくつかの二重特異性コンストラクトにおいて、CD69の上方調節の観点での標的非依存的T細胞活性化が観察された。CD69の上方調節は、概ね、それぞれのscFcコンストラクトと比較した場合に、カノニカルBiTE（登録商標）抗体コンストラクト、ヘテロFcおよびクロスボディ分子でより強かった。scFcコンストラクトによるCD69の上方調節は、概ね、若干高い濃度で起こり、その程度は、他の2つのFcベースのコンストラクトと比較していくぶん低かった。
抗標的B-scFcコンストラクトに関しては、標的非依存的T細胞活性化は観察されなかったが、ヘテロFcおよびXボディコンストラクトは標的細胞の非存在下でT細胞の細胞表面においてCD69の強い上方調節を誘導した。
加えて、抗標的Cおよび抗標的Gコンストラクトを用いたアッセイでは、CD69の標的細胞非依存的な上方調節が観察されなかった。骨髄系の細胞において標的が発現されることから、これらの細胞をアッセイのセットアップ前に除去した。これらのデータは、二重特異性コンストラクトのFc領域とFcγR発現細胞の相互作用がT細胞におけるCD69の標的非依存的誘導を担う可能性を示している。
腫瘍細胞の非存在下での抗標的H-scFcコンストラクトによるT細胞におけるCD69の強い上方調節は、T細胞上での標的Hの発現に起因する。
材料および方法
1. 標的I
以下のコンストラクトに関する、単鎖Fcを含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的I-scFc
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

2. 標的D
C末端に単鎖Fc、ヘテロFcまたはクロスボディ融合を含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的D-hetFc（ヘテロFc）
2. 標的D-scFc
3. 標的D-Xボディ(標的D-クロスボディ)
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

3. 標的C
C末端に単鎖Fc、ヘテロFcまたはクロスボディ融合を含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的C-カノニカル
2. 標的C-scFc
3. 標的C-hetFc
4. 標的C-Xボディ
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

4. 標的B
C末端に単鎖Fc、ヘテロFcまたはクロスボディ融合を含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的B-scFc
2. 標的B-hetFc
3. 標的B-Xボディ
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

5. 標的A
C末端に単鎖Fc、ヘテロFcまたはクロスボディ融合を含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的A-scFc
2. 標的A-hetFc
3. 標的A-Xボディ
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

6. 標的F
単鎖FcまたはヘテロFcを含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的F-カノニカル
2. 標的F-scFc
3. 標的F-hetFc
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

7. 標的E
単鎖FcまたはヘテロFcを含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的E-カノニカル
2. 標的E-scFc
3. 標的E-hetFc
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

8. 標的H
単鎖Fcを含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的H-scFc
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析

9. 標的G
単鎖Fcを含むBiTE（登録商標）分子により誘導される標的非依存的T細胞活性化を、以下のコンストラクトで評価した：
1. BiTE（登録商標）抗体コンストラクト（連続希釈物：1.3 pM〜20 nM）
1. 標的G-scFc
2. ヒトPBMCエフェクター細胞（3名のドナー；CD14+/CD33+細胞枯渇）
3. 48時間のインキュベート時間
4. CD69に特異的なPE-Cy7コンジュゲートmAbを用いたCD4+およびCD8+ T細胞におけるCD69発現のフローサイトメトリー分析
実施例2：
精製されたBiTE（登録商標）抗体コンストラクトを、漸減濃度（100 nM、1:4希釈）でMaxisorb Plate上にコーティングした。PBS-Tでの3回の洗浄およびPBS/3% (w/v) BSAでのブロッキング（60分間、37℃）の後、プールされたヒト血漿を室温で60分間、80 rpmでインキュベートした。3回の洗浄後、ヒトC1qサブユニットA（CC1q）に特異的なマウスモノクローナル抗体を室温で60分間、80 rpmで添加し（Thermo MA1-83963、1:500）、記載された洗浄工程の後、ヤギ抗マウスFc-POX mAb（1:5,000）を室温で60分間、80 rpmでインキュベートした。さらなる洗浄の後、TMB基質をインキュベートし、比色反応の後にH2SO4の添加により停止させた。450 nmで吸光度を決定した。
結果：高濃度に関して図4に示されているように、BiTE（登録商標）ヘテロFcコンストラクト（四角）は、BiTE（登録商標）単鎖Fcコンストラクト（三角）と比較してヒトCC1qに対してより高い結合シグナルを示した。陰性対照としてカノニカルBiTE(登録商標）（丸）を使用し、これは有意なCC1q結合を示さなかった。
実施例3：半減期延長様式に融合されたBiTE（登録商標）抗体コンストラクトの薬物動態
様々な標的結合BiTE（登録商標）抗体コンストラクトを4つの異なる半減期延長部分に融合した。薬物動態（PK）研究のために、BiTE（登録商標）抗体ごとに利用可能なすべての異なるHLE変種をカニクイザルで試験した。以降、これらを標的結合体に付加される半減期延長様式にしたがい、BiTE（登録商標）-scFc、BiTE（登録商標）-hetFc、BiTE（登録商標）-HALB、BiTE（登録商標）-Xボディと称する。非HLE-BiTE（登録商標）分子は、「カノニカル」BiTE（登録商標）と称する。これらの分子の対応する命名法を、以下の表4に簡潔にまとめる。
（表４）単回投薬BiTE（登録商標）分子の化合物名
Figure 0006959011
BiTE（登録商標）分子を、静脈内ボーラスとして（化合物1b、2a〜d、3a/b、4a/b、5a〜5c、7〜9）および静脈内注入として（化合物1a、1c、3c/d、6a/b、各々30分間注入として）投与した。BiTE（登録商標）分子を、それぞれ、3μg/kg〜6μg/kg、12μg/kgおよび15μg/kgの直線的な用量の、薬物動態的に関連する範囲で投与した。化合物10aを短時間静脈内ボーラス注射として、カノニカルなコンストラクト（化合物10b）を連続静脈内注入として投与した。10aおよび10bの両化合物の薬物動態パラメータを比較するため、カノニカルBCMA-BiTE（登録商標）に関して注入終了直後から始まる末期フェーズのみを図5に示す。BCMA BiTE（登録商標）分子を、15μg/kgの直線的な用量の、薬物動態的に関連する範囲で投与した。比較の理由から、図5に示される血清濃度は用量標準化および分子量標準化（nmolで表される）されている。上記の名称の化合物の各々について、少なくとも2〜3匹の動物のグループを使用した。血清濃度の測定のために血液サンプルを回収し、血清を調製した。血清BiTE（登録商標）抗体レベルを、免疫アッセイを用いて測定した。血清BCMA BiTE（登録商標）レベルを、BiTE（登録商標）分子のコーティングおよび検出のために抗CD3イディオタイプ抗体の対を使用する免疫アッセイを用いて測定した。血清濃度-時間プロフィールを使用してPKパラメータを決定した。適当な研究設定を、BiTE（登録商標）分子の特徴ごとに調節し、1週間または2週間のいずれかの期間とした。血液サンプル採取時点は、若干異なり得、以下の表5に両方の設定に関して列挙されている。
（表５）PK研究における血液サンプル採取時点。時点は個々の研究間で異なり得る。アスタリスクを付された時点は必須であり、すべての研究で共通であった。
Figure 0006959011
BiTE（登録商標）-HLE分子の薬物動態が、表6に例示されている。各化合物グループは、scFc、hetFc、HSA（ヒト血清アルブミン、HALB）もしくはクロスボディ-Fc形式に融合されたまたはカノニカルBiTE（登録商標）分子のままの同じBiTE（登録商標）タンパク質を表している。すべてのタンパク質において、血清レベルはBiTE（登録商標）分子投与後のすべての動物におけるすべての時点で定量可能であった。PKプロフィールは、各々の単回の試験物質の投与後に、二相性の指数関数的下降を示している。
薬物動態パラメータは、標準的なノンコンパートメント解析（NCA）法を使用して決定した。ノンコンパートメント解析を用いて、以下のPKパラメータを概算した：AUCinf（血清濃度-時間曲線下面積）、Vss（定常状態での分布容積）、CL（全身クリアランス）および末期t1/2（末期半減期）。
各試験化合物のPKパラメータが、以下の表6において、それぞれn=2およびn=3の平均としてまとめられている。
（表６）カニクイザルにおける異なるBiTE（登録商標）-標的結合体由来の様々なHLE変種の薬物動態パラメータ
Figure 0006959011
典型的に、カノニカルBCMA-BiTE（登録商標）分子のPKプロフィールは、これらのカノニカルタンパク質のクリアランス機構に関連する非常に急激に下降する血清濃度プロフィールを示す。半減期延長されたBCMA標的指向BiTE（登録商標）-scFcは、カニクイザルへの単回の試験物質の投与後に二相性の指数関数的下降を示す。
全体として、scFc HLE様式に融合されたBCMA-BiTE（登録商標）分子（化合物10a）は、18772 h*ng/mLの平均AUCinf、0.8 mL/h/kgの全身クリアランス値および110 mL/kgの対応する分布容積を示す。カノニカルな非半減期延長BCMA標的指向BiTE（登録商標）である化合物10bは、1677 h*ng/mLの低血清暴露をもたらす62.6 mL/h/kgの高いクリアランスを示す。
試験した2つの異なるBCMA BiTE（登録商標）様式の薬物動態挙動の違いは、特に体内での物質の残留時間の点で、対応するカノニカル版を上回る半減期延長BCMA標的指向BiTE（登録商標）-scFcの優位性を完全に表わしている。
全体として、scFc、hetFc、HASまたはクロスボディHLE様式のいずれかに融合された異なるBiTE（登録商標）標的結合体のAUCinfは、それぞれ、BiTE（登録商標）の標的に依存して、1971 h*ng/mL〜77271 h*ng/mLの間の範囲であった。すべての分析されたHLE融合体は、0.4〜7.6 mL/h/kgの全身クリアランス値を達成した。対応する分布容積は、68〜540 mL/kgの範囲であった。カノニカルな非半減期延長化合物3 BiTE（登録商標）標的結合体である化合物3dは、参照として含まれる。非半減期延長BiTE（登録商標）分子は、高いクリアランス、低い血清暴露および結果として短い末期半減期を示す。様式による末期半減期の比較が表7にまとめられている。
（表７）カニクイザルにおいて調査した様式による末期半減期の比較
Figure 0006959011
標的指向BiTE（登録商標）につき最大4つの異なる半減期延長（HLE）部分の調査により、scFc部分が、6、10、12および15μg/kgでの単回低用量投与後に対応する他の半減期延長部分と比較してt1/2の増加を示すことが明らかとなっている（図6を参照のこと）。
実施例4：
精製された標的A-hALB、標的A-hFcおよび標的A-scFcをそれぞれ含む配合済み薬物を、10 kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有するメンブレンを用いた限外濾過／ダイアフィルトレーションを通じた緩衝液交換に供した。最終配合物は、濃縮ストック溶液を添加することによって達成した。各コンストラクトについて得られた配合物が表8に列挙されている。標的タンパク質濃度は、1.0 mg/mLであった。配合された標的AコンストラクトをI型ガラスバイアルに1 mLまで満たし、これをブチルゴムストッパーで栓詰めし、アルミニウムシールで圧着した。満たしたバイアルを-20、5、25および37℃でインキュベートした。各バージョンの1つのバイアルを5回の凍結解凍（F/T）サイクルに供した。標的凍結温度は-29℃であった。標的解凍温度は2℃であった。上昇速度はおよそ0.3 K/分であった。
目視可能粒子は、訓練された担当者が、Ph Eur 2.9.20に記載される方法にしたがい評価した。バイアルあたりの目視可能粒子の数が表8に示されている。標的A-hFcにおいて、目視可能（125μmより大きな）タンパク質粒子の数は、標的A-hALBおよび標的A-scFcの両方と比較して多かった。
（表８）異なる半減期延長抗標的A BiTE（登録商標）コンストラクトを含むストレス下および非ストレス下（T0）のサンプルにおけるバイアルごとの目視可能タンパク質粒子の数
Figure 0006959011
高分子量種（HMWS）の百分率による量を定量するため、上記のサンプルを、サイズ排除超高性能クロマトグラフィー（SE-UPLC)によっても分析した。SE-UPLCは、Acquity UPLC BEH200 SEC 150 mmカラム（Waters）を用いたAcquityH-Class UPLCシステム（Waters）により実施した。カラム温度を25℃に設定した。サイズ変種の分離を、0.4 mL/分の流速でアイソクラチック法を提供することによって達成した。移動相は、pH 6.8で100 mMリン酸ナトリウム、250 mM NaClから構成されるものであった。泳動時間は、合計6.0分間であった。分析までサンプルをオートサンプラー内で8℃で保持した。総量3μgのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを避けるために、各サンプルの後に40％アセトニトリルの中間注入を行った。検出は、蛍光発光（280 nmでの励起、325 nmでの発光）に基づくものであった。ピークの積分を、Empower（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。HMWSの相対曲線下面積を報告した（表9）。
Fcベースのコンストラクトは、ストレス条件に非依存的に、別配合物であるK60RTrTにおけるよりもG40MSuTにおいて低いHMWS量を示した。標的A-scFcは、G40MSuTおよびK60RTrTの両調製物において標的A-hFcよりも少ないHMWSを含むことが明らかとなった。その好ましい配合物（G40MSuT）中の標的A-scFcは、K60RTrT中に配合された標的A-hALBよりもHMWS形成の傾向が低かった。以前の実験において、この緩衝液は、hALBベースのコンストラクトに対して改善された安定化能を示した。
（表９）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下および非ストレス下（T0)の標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
n.t. = 試験せず
熱ストレス（37℃でのインキュベート）による化学修飾の量を、ペプチドマッピングによりモニターした。タンパク質サンプルを酵素消化し、得られたペプチドを逆相クロマトグラフィーを用いて分離した。ペプチドの同定および定量のために、カラム溶出液を質量分析装置のイオン源に直接注入した。
最大の網羅範囲を達成するため、トリプシンを用いて一度、キモトリプシンを用いて一度の、2つの別個の酵素消化を行った。各例において、タンパク質を、塩化グアニジウムを用いて変性させ、次いでジチオトレイトール（DTT）を用いて還元した。DTT中でのインキュベート後、遊離のシステイン残基を、ヨード酢酸の添加によってアルキル化した。次いでサンプルを、消化のために50 mM Tris pH 7.8に緩衝液交換した。トリプシンおよびキモトリプシンを、各々1：10（サンプル：酵素）の比で別個の反応チューブに添加した。サンプルを37℃で30分間消化し、その反応をトリフルオロ酢酸の添加によって停止させた。
5μgの量の各消化物を、0.1％(V/V)ギ酸（FA）で平衡化させたZorbax SB-C18（Agilent #859700-902）逆相カラムに個別に注入した。0.1％ FAを含む最大90％のアセトニトリルへの156分間勾配を使用して、ペプチドをQ-Exactive Plus質量分析装置（Thermo Scientific）のエレクトロスプレーイオン源に直接溶出させた。データは、全体走査（分解能70 000；走査範囲200〜2000 m/z）の後に12の最も豊富なイオンの高エネルギー衝突解離（HCD）（分解能17 500）を行う上位12法を用いてデータ依存的な様式で回収した。
ペプチドを、独自ソフトウェアを用いて精密質量およびタンデム質量スペクトルに基づき同定した。同定は、手作業により検証した。修飾および非修飾ペプチドの相対量を、Pinpointソフトウェア（Thermo Scientific）を用いてイオン量に基づき計算した。
標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物において検出された相補性決定領域（CDR）および半減期延長部分（hALBまたはFcのいずれか）の化学修飾の比率が表10に示されている。類似の配合条件を比較することで、全体的な化学修飾がscFcコンストラクトにおいて最も少ないことが明らかとなった。
（表１０）ペプチドマッピングを通じて決定されたストレス下および非ストレス下（T0）の標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物における化学修飾の概要
Figure 0006959011
n.a.=適用できない；n.t.=試験せず
実施例5：
実施例4に記載されるように配合された標的A-hALB、-hFc、-scFcをpH上昇実験に供した。出発物質の濃度は1.0 mg/mLとした。ガラスバイアルに0.38 mLの量の各出発物質を満たした。37℃でのプレコンディショニングの後、溶液を、0.090 Mリン酸カリウム、0.480 Mリン酸ナトリウム（両方とも二塩基）、0.052 M塩化カリウムおよび2.76 M NaClから構成される20倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスパイクした。スパイクしたサンプルを37℃で2週間インキュベートした。インキュベート後、それらを、実施例4に記載される方法を用いてSE-UPLCによって分析し、HMWSの百分率による量を報告した（表11）。K60RTrTに配合されたすべてのコンストラクトを比較すると、HMWS量は、以下の順で増加した：hALB＜scFc＜hFc。標的A-scFcはまた、G40MSuTに配合された場合に、標的A-hFcよりも低いHMWS量を示した。
（表１１）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下（pH上昇＋2w 37℃）の標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
実施例6：
実施例4に記載されるように配合された標的A-hALB、-hFc、-scFcを撹拌ストレスに供した。出発物質の濃度は1.0 mg/mLとした。0.5 mLの量の各溶液を適当な0.22μmフィルターを通してろ過し、3ccガラスバイアルに満たした。このバイアルをプラスチックボックス内に置き、バイアルが撹拌中にボックス内で移動しないようにした。このボックスをオービタルシェーカーに設置した。サンプルを500 rpmで65時間撹拌した。目視可能粒子をPh Eur 2.9.20に記載される方法にしたがい評価した。この方法は、訓練された担当者が行った。バイアルあたりの目視可能粒子の数を表12に示す。目視可能タンパク質粒子は、標的A-hFc調製物において観察されたのみであった。
（表１２）撹拌したサンプル中のバイアルあたりの目視可能タンパク質粒子の数
Figure 0006959011
高分子量種（HMWS）の百分率による量を定量するため、上記のサンプルを、サイズ排除超高性能クロマトグラフィー（SE-UPLC)によっても分析した。実施例4に記載されているのと同じ方法を適用した。撹拌したサンプルのHMWS量を表13にまとめる。HMWSの形成は、K60RTrT調製物と比較した場合に、標的A-hFcにおいて最も顕著であった。HMWSは、標的A-scFcよりも標的A-hFcにおいて豊富であった。
（表１３）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下（pH上昇 + 2w 37℃）の標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
実施例7：
実施例4に記載されるようにして配合された標的A-hALB、-hFcおよび-scFcを可視光およびUVA光（光ストレス）に暴露した。すべての調製物において、タンパク質濃度を合計1 mg/mLとした。タンパク質溶液を、0.22μm孔サイズのフィルターを通してろ過し、I型ガラスバイアル中に0.5 mL満たした。標的A-hALBおよび-scFcを、それぞれ、0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光および1.2 MLux可視光/173 W*h/m2を含む2つの異なる試験に供した。標的A-hFcを、それぞれ、UVA光なしの0.2 MLux可視光および1.2 MLux可視光/30 W*h/m2 UVA光を含む2つの異なる試験に供した。チャンバー温度は、25℃に調節した。露光後、サンプルを目視検査（表14）、SE-UPLC（表15）およびペプチドマップ（表16）によって分析した。上記の方法を、実施例4に記載される手順にしたがい行った。標的A-hALBおよび-scFcはより高線量のUVA光に暴露されたにもかかわらず、目視可能タンパク質粒子が観察されなかったのに対して、標的A-hFcサンプルは、配合物によらず両試験においてバイアル当たり1個の目視可能タンパク質粒子を示した。
（表１４）露光後に決定された標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるバイアルごとの目視可能タンパク質粒子の数の概要
Figure 0006959011
1）0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光、2）UVA光なしの0.2 MLux可視光、3）1.2 MLux可視光/173 W*h/m2、4）1.2 MLux可視光/30 W*h/m2
HMWSは、タンパク質をK60RTrTに配合した場合、以下の順、標的A-hALB＜-scFc＜-hFc、で増加した。Fcベースのコンストラクトに関して、HMWSは、G40MSuTに配合した場合に減少し得る。しかし、HMWSは、ここでも、標的A-scFcにおいて少なかった。標的A-hFcは、UVA光への暴露に対して本質的に感受性であることが明らかになった。
（表１５）SE-UPLCを通じて露光後に決定された標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
1）0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光、2）0.2 MLux可視光、UVA光なし、3）1.2 MLux可視光/173 W*h/m2、4）1.2 MLux可視光/30 W*h/m2
標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物において検出された相補性決定領域（CDR）および半減期延長部分（hALBまたはFcのいずれか）の化学修飾の比率が表16に示されている。類似の配合条件を比較することで、全体的な化学修飾がscFcコンストラクトにおいて最も少ないことが明らかとなった。
（表１６）ペプチドマッピングを通じて露光後に決定された標的A-hALB、-hFcおよび-scFc調製物における化学修飾の概要
Figure 0006959011
n.a.=適用できない；n.t.=試験せず
実施例8：
実施例4に記載される手順にしたがい、標的A-hALBをK60RTrTに配合し、標的A-scFcをG40MSuTに配合した。タンパク質濃度は、合計0.05 mg/mLとした。ガラス（ホウケイ酸塩、I型、West製13 mm 3 ccバイアル、製品番号68000375）およびポリプロピレン試験容器（例えばSarstedt製Oリング付き2mL、製品番号72.694.005）を、500μLの試験溶液で満たす。試験溶液を、第1の試験容器内で5分間静置した。次いで分析のために150μLのアリコートをサンプル採取した。残りの試験溶液（350μL）を1つの試験溶液から次の容器（合計5つの容器）に連続的に移動させた。各バイアルにおいて、次の移動の前に溶液を5分間静置した。各移動工程で同じピペットチップを使用した。同じ試験を、30 mLポリカーボネートボトル（Nalgene、蓋付きPCS-000295、PP/20-415/ZTPE）を用いて行った。この容器タイプでは、第1の容器に5 mLを満たした。150μLのアリコートをサンプル採取した後、残りの分を（上記の手順にしたがい）1つの試験容器から次の容器に移した。容器＃1および＃5から取り出したサンプルをSE-UPLC（実施例4に記載される方法）により分析した。加えて、タンパク質濃度を決定するために、PDA検出器（280 nm）を用いてタンパク質検出を行った。各試験容器からのタンパク質回収率が表17に示されている。タンパク質回収は、容器のタイプに関係なく、標的A-hALBよりも標的A-scFcでより高いことが示された。
（表１７）SE-UPLCによって決定された、標的A-hALBおよび-scFcにおける異なる容器タイプからのタンパク質回収
Figure 0006959011
実施例9：
実施例4に記載される手順にしたがい、標的A-hALBをK60RTrTに配合し、標的A-scFcをK60RTrTおよびG40MSuTに配合した。タンパク質濃度は、合計1.0 mg/mLとした。1950μLの各試験溶液を50μLの1000 ppmケイ素標準溶液（AlfaAesar製Specpure、製品番号38717）で25 ppmのスパイクを行った。スパイクしなかった試験溶液を、対照サンプルとして使用した。スパイクされた試験溶液および対照サンプルを、3cc I型ガラスバイアルに入れ、37℃で24時間インキュベートした。HMWSの量を定量するために、すべてのサンプルを実施例4に記載される方法にしたがいSE-UPLCにより分析した（表18）。K60RTrTに配合された場合、標的A-hALBおよび-scFcは、ケイ素によるスパイクに対して同程度のHMWSの増加を示した。
（表１８）25 ppmケイ素によるスパイク後のSE-UPLCを通じて決定された標的A-hALBおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
実施例10：
精製された標的C(cc)-hALB、標的C(cc)-hFcおよび標的C(cc)-scFcをそれぞれ含む配合済み薬物を、10 kDaの分子量カットオフ（MWCO）を有するメンブレンを用いた限外濾過／ダイアフィルトレーションを通じた緩衝液交換に供した。最終配合物は、濃縮ストック溶液を添加することによって達成した。各コンストラクトについて得られた配合物が表19に列挙されている。標的タンパク質濃度は、1.0 mg/mLであった。配合された標的C(cc)コンストラクトをI型ガラスバイアルに1 mLまで満たし、これをブチルゴムストッパーで栓詰めし、アルミニウムシールで圧着した。満たしたバイアルを-20、5、25および37℃でインキュベートした。各バージョンの1つのバイアルを5回の凍結解凍（F/T）サイクルに供した。標的凍結温度は-29℃であった。標的解凍温度は2℃であった。上昇速度はおよそ0.3 K/分であった。高分子量種（HMWS）の百分率による量を定量するため、上記のサンプルを、サイズ排除超高性能クロマトグラフィー（SE-UPLC)によっても分析した。SE-UPLCは、実施例4に記載される方法にしたがい行った。K60RTrTに配合した場合、HMWSは、非ストレス下サンプルにおいて以下の順で増加した：scFc＜hALB＜hFc。凍結解凍ストレスに対するHMWSの最小の増加が、scFcコンストラクトで観察された。hFcコンストラクトは、-20℃で最もHMWS形成を起こしやすいことが明らかになった。HMWS量は、5℃で4週間の保管後に増加した。これらの条件下でのHMWS形成は、アルブミンベースのコンストラクトよりもFcベースのコンストラクトで顕著であった。K60RTrTにおいて、高い保管温度（25および37℃）でHMWSの有意な増加は観察されなかった。G40MSuTに配合された場合、すべてのコンストラクトが、非ストレス下サンプルにおいて同程度のHMWS量を示した。凍結解凍時の増加は、アルブミンベースのコンストラクトと比較して、Fcベースのコンストラクトでより大きかった。G40MSuTにおいて、hFcコンストラクトは、-20℃の保管時に最も安定性を欠いていた。液体保管時のHMWSの有意な増加が、hALBコンストラクトにおいてのみ観察された。
（表１９）SE-UPLCを通じて決定された、ストレス下および非ストレス下（T0）の標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
n.t.=試験せず
熱ストレス（37℃でのインキュベート）による化学修飾の量を、実施例4に記載される方法にしたがうペプチドマッピングによりモニターした。標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物において検出された相補性決定領域（CDR）の化学修飾の比率が表20に示されている。全体として、標的C(cc)-scFcが、CDRにおいて最小量の化学修飾を示した。特にCDRの脱アミド化はscFcコンストラクトで最も少ないことが明らかになった。
（表２０）ペプチドマッピングを通じて決定されたストレス下および非ストレス下（T0）の標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物における化学修飾の概要
Figure 0006959011
n.a.=適用できない；n.t.=試験せず
実施例11：
実施例4に記載されるように配合された標的C(cc)-hALB、-hFc、-scFcをpH上昇実験に供した。出発物質の濃度は1.0 mg/mLとした。ガラスバイアルに0.38 mLの量の各出発物質を満たした。37℃でのプレコンディショニングの後、溶液を、0.090 Mリン酸カリウム、0.480 Mリン酸ナトリウム（両方とも二塩基）、0.052 M塩化カリウムおよび2.76 M NaClから構成される20倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスパイクした。スパイクしたサンプルを37℃で2週間インキュベートした。インキュベート後、それらを、実施例4に記載される方法を用いてSE-UPLCによって分析し、HMWSの百分率による量を報告した（表21）。標的C(cc)-scFcコンストラクトは、配合物にかかわらず、標的C(cc)-hALBおよび-hFcと比較して、pH上昇後に最小のHMWS量を示した。
（表２１）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下（pH上昇＋2w 37℃）の標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
実施例12：
実施例4に記載されるように配合された標的C(cc)-hALB、-hFc、-scFcを撹拌ストレスに供した。出発物質の濃度は1.0 mg/mLとした。0.5 mLの量の各溶液を適当な0.22μmフィルターを通してろ過し、3cc I型ガラスバイアルに満たした。このバイアルをプラスチックボックス内に置き、バイアルが撹拌中にボックス内で移動しないようにした。このボックスをオービタルシェーカーに設置した。サンプルを500 rpmで65時間撹拌した。高分子量種（HMWS）の百分率による量を定量するため、サンプルをSE-UPLCによって分析した。実施例4に記載されているのと同じ方法を適用した。撹拌サンプルのHMWS量を表22にまとめる。HMWSの形成は、いずれの配合物においても、標的C(cc)-scFcで最も少なかった。
（表２２）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下（pH上昇＋2w 37℃）の標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
実施例13：
実施例4に記載されるようにして配合された標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFcを可視光およびUVA光（光ストレス）に暴露した。タンパク質濃度は、すべての調製物において、合計1 mg/mLとした。タンパク質溶液を、0.22μm孔サイズのフィルターを通してろ過し、I型ガラスバイアル中に0.5 mL入れた。標的C(cc)-hALBおよび-scFcを、それぞれ、0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光および1.2 MLux可視光/173 W*h/m2を含む2つの異なる試験に供した。標的C(cc)-hFcを、それぞれ、UVA光なしの0.2 MLux可視光および1.2 MLux可視光/30 W*h/m2 UVA光を含む2つの異なる試験に供した。チャンバー温度は、25℃に調節した。露光後、サンプルをSE-UPLC（表23）およびペプチドマップ（表24）によって分析した。上記の方法を、実施例4の手順にしたがい行った。標的C(cc)-scFcに対してより大きなUVA光強度が適用されたにもかかわらず、このコンストラクトはHMWS形成に対して安定であった。対照的に、標的C(cc)-hFcおよび標的C(cc)-hALBは、2つの試験条件において、HMWSの増加を示した。
（表２３）SE-UPLCを通じて露光後に決定された標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
1）0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光、2）UVA光なしの0.2 MLux可視光、3）1.2 MLux可視光/173 W*h/m2、4）1.2 MLux可視光/30 W*h/m2
露光に対する全体的な化学修飾は、標的C(cc)-scFcで最も少なかった。特にCDRの脱アミド化は、標的C(cc)-hALBおよび標的C(cc)-hFcにおいてより高い程度で形成された。Fcベースのコンストラクトと比較することで、標的C(cc)-scFcは、scFcコンストラクトがhFcコンストラクトよりも高いUVA光線量に暴露されたにもかかわらず、Fc部分の化学修飾を起こす傾向が小さかったことが明らかとなった。表24はまた、標的C(cc)-hALB中のアルブミン部分の最も豊富な化学修飾を列挙しており、このコンストラクトの半減期延長部分が標的C(cc)-hFcおよび-scFcのFc部分よりも多く化学的に分解されたことが示されている。
（表２４）ペプチドマッピングを通じて露光後に決定された標的C(cc)-hALB、-hFcおよび-scFc調製物における化学修飾の概要
Figure 0006959011
1）0.2 MLux可視光/25 W*h/m2 UVA光、2）UVA光なしの0.2 MLux可視光、3）1.2 MLux可視光/173 W*h/m2、4）1.2 MLux可視光/30 W*h/m2
実施例14
標的F非半減期延長（非HLE、カノニカル）、標的F-hALBおよび標的F-scFcを含む標的Fを標的とするよう設計された異なるBiTE（登録商標）抗体コンストラクトを試験した。標的タンパク質濃度は、hALBおよびscFcについては1.0 mg/mL、非HLE版については0.4 mg/mLとした。配合されたBiTE（登録商標）抗体コンストラクトをI型ガラスバイアルに1 mLまで満たし、これをブチルゴムストッパーで栓詰めし、アルミニウムシールで圧着した。満たしたバイアルを-20℃および37℃で4週間インキュベートした（タンパク質の凝集を誘導するその能力が知られている25 ppmケイ素なしおよびあり）。上記のコンストラクトを、光（1.2 MLux可視光/173 W*h/m2 UVA光）にも暴露した。光ストレスのために、チャンバー温度を25℃に設定した。-70℃で保管されたサンプルを対照として使用した（T0)。
高分子量種（HMWS）の百分率による量を定量するため、上記のサンプルを、サイズ排除超高性能クロマトグラフィー（SE-UPLC)によって二つ組で分析した。SE-UPLCは、Acquity H-Class UPLCシステム（Waters）においてAcquity UPLC BEH200 SEC 150 mmカラム（Waters）を用いて実施した。カラム温度を25℃に設定した。サイズ変種の分離を、0.4 mL/分の流速でアイソクラチック法を適用することによって達成した。移動相は、100 mMリン酸ナトリウム、250 mM NaCl pH 6.8から構成されるものであった。泳動時間は、合計6.0分間である。サンプルを分析までオートサンプラー内で8℃で保持した。総量3μgのタンパク質を注入した。キャリーオーバーを避けるために、各サンプルの後に40％ ACNの中間注入を行った。検出は、蛍光（280 nmでの励起、325 nmでの発光）に基づくものであった。ピークの積分を、Empower（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。HMWSの相対曲線下面積を報告した（表25）。
非ストレス下サンプルの中で、HMWSはscFcコンストラクトで最も少なかった。HMWS形成は、もっぱら-20℃で4週間の保管中に観察された。これらの条件下でのHMWS量は、以下の順scFc＜hALB＜非HLEで多かった。
（表２５）SE-UPLCを通じて決定されたストレス下および非ストレス下（T0）の標的F-非HLE、-hALBおよび-scFc調製物におけるHMWS量の概要
Figure 0006959011
さらに、ケイ素の非存在下および存在下で熱ストレスを与えたサンプルを、Fluid Imaging Technologies, Inc製のFlowcamを用いるマイクロ流体イメージング（MFI）によって目視可能未満粒子の量について評価した。この機器にFC80FVフローセルを装着した。光学倍率10倍を適用した。システムの妥当性を、粒子非含有水を用いて検証した。毎秒20フレームの自動撮影速度を適用した。暗部および明部のしきい値を、それぞれ25および20ピクセルに設定した。1回の測定のサンプル量は、合計0.25 mLである。サンプルを三つ組で測定した。三つ組の各々の前に、システムを0.5 mLの各サンプル溶液で洗い流した。最初および三つ組の各々の間に、1.0 mLの粒子非含有水での洗浄を行った。データ評価は、Visual Spreadsheetソフトウェアを用いて行った。サンプルを三つ組で測定した。結果が表26にまとめられている。
熱ストレスは、非HLEおよびhALBコンストラクトを含む調製物において目視可能未満粒子の形成をもたらした。これに対して、scFcコンストラクトは、安定なままであった。目視可能未満粒子の形成は、BiTE（登録商標）抗体コンストラクトの性質に関わりなく、ケイ素の添加によって促進されなかった。
（表２６）ケイ素の非存在下および存在下での熱ストレス後の標的F-非HLE（カノニカル）、-hALBおよび-scFc調製物におけるMFIによる目視可能未満粒子の評価
Figure 0006959011
Waters製のUPLC Aquity Hクラスを用いて電荷変種の百分率による量を定量するため、熱ストレスを与えたサンプルを、弱陽イオン交換（WCX）クロマトグラフィーによっても分析した。Protein-Pak Hi Res CM 7im 4.6 x 100 mmカラム（Waters、カタログ番号186004929）を適用した。カラム温度は30℃に調節した。流速は0.65 mL/分に設定した。適用する勾配は以下のように設計した（表27）。オートサンプラーの温度は2〜8℃で維持した。
（表２７）WCXクロマトグラフィーに適用した勾配
Figure 0006959011
総量3μgのタンパク質を注入した。検出は、蛍光（280 nmでの励起、325 nmでの発光）に基づくものであった。ピークの積分を、Empower（登録商標）ソフトウェアを用いて行った。主ピークならびに酸性および塩基性電荷変種の相対曲線下面積を報告した（表28）。
熱ストレスは、酸性電荷変種の支配的な形成に起因する主ピーク率の減少をもたらした。主ピーク率の減少は、scFcコンストラクトで最も小さかった（7.5％）。塩基性電荷変種は、半減期が延長された両方のコンストラクトにおいて、露光により形成された。塩基性電荷変種の増加は、hALBおよびscFcコンストラクトにおいて5〜6％の間の範囲であった。
（表２８）熱および光により誘導されたストレス後の標的F-非HLE（カノニカル）、-hALBおよび-scFc調製物におけるWCXクロマトグラフィーによる電荷変種の評価
Figure 0006959011
加えて、LabChip GXIIシステム（Perkin Elmer）に基づくマイクロ流体キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（CE-SDS）アッセイを用いて熱および光ストレス下のサンプルにおけるサンプル純度を定量した。サンプル変性溶液は、34 mMジチオトレイトールを補充した（Perkin Elmerによって提供された）HT Protein Express Sample Bufferから構成されるものであった。各サンプルを、変性溶液で1：8希釈し、タンパク質発現ラダーと共に10分間70℃まで加熱した。35μLの注射用水（WFI）を40μLの変性サンプルに添加した。120μLのWFIを12μLのラダーに添加した。サンプル、ラダー、タンパク質発現洗浄緩衝液、ゲル色素および脱色溶液を、各リザーバに移した。サンプルを、マイクロタイタープレートから、タンパク質およびそのサイズ変種の分離、染色、脱色および検出を統合したチップ上に動電学的に投入する。得られた電気泳動図を評価し、純度の変化を報告した。ストレス後に検出された百分率による純度の概要が、表29に示され、非ストレス下サンプル（T0）と比較されている。
すべての条件下で、非HLEコンストラクトと比較して、hALBおよびscFcコンストラクトにおいてより高い純度が観察された。熱および光ストレスにより、T0と比較してわずかな純度の減少がhALBおよびscFcコンストラクトにおいて検出された。37℃で4週間の保管後の純度の低下は、hALBコンストラクトにおいては合計8.4％、scFcコンストラクトにおいては合計6.6％であった。露光後の低下は、hALBおよびscFcの間で同等であった。
（表２９）LabChip GXII（カリパス）を通じて決定されたストレス下および非ストレス下（T0)の標的F-非HLE、-hALBおよび-scFc調製物における百分率による純度の概要
Figure 0006959011
実施例15
標的E-hALBおよび標的E-scFcを含む標的Eを標的とするよう設計された異なるBiTE（登録商標）抗体コンストラクトをそれぞれ配合した。標的タンパク質濃度は、両コンストラクトとも1.0 mg/mLとした。配合されたBiTE（登録商標）抗体コンストラクトをI型ガラスバイアルに1 mLまで満たし、これをブチルゴムストッパーで栓詰めし、アルミニウムシールで圧着した。満たしたバイアルを37℃（標的E-hALB）および40℃（標的E-scFc）で4週間インキュベートした。-70℃で保管したサンプルを対照として使用した（T0)。サンプルを、実施例13に記載される方法にしたがいSE-UPLCによって分析した。結果が表30にまとめられている。
scFcコンストラクトは、インキュベート温度が若干高いにもかかわらず、hALBコンストラクト（4.0％）と比較して、熱ストレスに対する低い単量体喪失率（2.3％）を示した。
（表３０）SE-UPLCを通じて決定された、ストレス下および非ストレス下（T0)の標的E-hALBおよび-scFc調製物における単量体ピーク率の概要
Figure 0006959011
実施例16
標的I-Xボディおよび標的I-scFcを含む標的Iを標的とするよう設計された異なるBiTE（登録商標）抗体コンストラクトを試験した。標的タンパク質濃度は、1.0 mg/mLとした。配合されたBiTE（登録商標）抗体コンストラクトをI型ガラスバイアルに1 mLまで満たし、これをブチルゴムストッパーで栓詰めし、アルミニウムシールで圧着した。満たしたバイアルを-20℃および37℃で4週間インキュベートした。さらに、すべてのサンプルを1.2 MLux可視光および1.73 W*h/m2 UVA光に暴露した。チャンバー温度は、25℃に調節した。-70℃で保管したサンプルを対照として使用した（T0)。-20および-37℃で保管したサンプルを、実施例13に記載される方法にしたがいSE-UPLCによって分析した。結果が表31にまとめられている。
scFcコンストラクトは、それぞれ-20および37℃で4週間保管された場合、Xボディと比較してより高い単量体量を維持した。
（表３１）SE-UPLCを通じて決定された、ストレス下および非ストレス下（T0)の標的I-Xボディおよび-scFc調製物における単量体量の概要
Figure 0006959011
加えて、非ストレス下サンプルを、実施例13に記載される方法を用いるマイクロ流体イメージング（MFI）によって目視可能未満粒子の量について評価した。結果が表32にまとめられている。標的I-scFc調製物は、標的I-Xボディ調製物と比較して有意に少ない量の目視可能未満粒子を示した。これは、すべての含まれるサイズ画分に当てはまる。
（表３２）非ストレス下の標的I-Xボディおよび-scFcにおけるMFIによる目視可能未満粒子の評価
Figure 0006959011
実施例13に記載される方法にしたがい、Waters製のUPLC Aquity Hクラスを用いて電荷変種の百分率による量を定量するため、光ストレスを与えたサンプルを、弱陽イオン交換（WCX）クロマトグラフィーによっても分析した。主ピークならびに酸性および塩基性電荷変種の相対曲線下面積を報告した（表33）。
scFcコンストラクトは、Xボディと比較して、露光に対する増大した安定性を示し、これはXボディコンストラクトの5.5％に対して合計1.4％であった主ピークにおける減少の少なさによって示された。
（表３３）熱および光により誘導されたストレス後の標的I-Xボディおよび-scFc調製物におけるWCXクロマトグラフィーによる電荷変種の評価
Figure 0006959011
実施例17：二重特異性scFc変種のサイズ排除クロマトグラフィー
コンストラクトD9F、T2G、D3L、T7IおよびK6C（図7を参照のこと）を各々、標準的な手順にしたがうサイズ排除クロマトグラフィーによってそれらの泳動挙動について試験した。詳細には、25μgの定義された量の各コンストラクトを、室温でSuperdex 200 increase 10/300GLカラムにおいてCitrate Lysin Buffer（10 mMおよび75 mM、pH 7）中で（750μl/分で）泳動し、OD 280 nmを記録した。その後、コンストラクトをそれらの残留時間によって比較した。結果、コンストラクトD9Fは、T2G、D3L、T7IおよびK6Cと比較して有意に遅い溶出（表34）を示しており、これはFcドメインの構造／配置の違いを示している。この残留時間の違いは、ヒンジ領域に対を形成しないシステインならびにCH3に対するCH2およびCH2CH3の連結を有するコンストラクトT7Iに対して最も有意であった（18.98分対18.62分、0.36分の違い）。しかし、D9FとT2Gの間の0.16分の残留時間の違いもまた、それぞれBSA対照の残留時間を考慮すると有意である。BSA対照は、単量体について19.07分および二量体について16.82分の残留時間を示し、2倍の分子量で残留時間に2.25分の違いが生じることを示した。したがって、Fc部分にのみ構造の違いを有するコンストラクトとして、残留時間の0.16分の違いは有意である。まとめると、コンストラクトD9Fは、最強の結合を示す最長の残留時間を示した。この結論は、D9Fがインビボでの最長の半減期を有するという期待を抱かせるものである。
（表３４）
Figure 0006959011
実施例18：ヒトFcRn（FCGRT/B2M）への結合の表面プラズモン共鳴ベースの測定
コンストラクトD9F、T2G、D3L、T7IおよびK6C（図7）を各々、標準的な手順にしたがうSPR（Biacore)実験においてヒトFcRnに対して結合するそれらの能力について試験した。詳細には、酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5および200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA pH 6.0からなる泳動緩衝液を使用することによって、CM5センサーチップ（GE Healthcare）に450〜500 RUのFCGRT/B2M（ACRO Biosystems）を固定した。次いで、これらのコンストラクトを、その後の泳動で、200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、pH 6.0で希釈された250 nMおよび125 nMの2つの濃度および36℃で注入した。結合は、30μl/分の流速で90秒間行い、その後の解離フェーズを、30μl/分の流速で90秒間、36℃の200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、pH 6.0中で行った。その後の再生は、10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA pH 7.4を用いて30μl/分で10秒間行った。
すべてのコンストラクトにおいて、注入フェーズ中の最大結合を、結合したコンストラクトに起因するFcRnコートCM5チップ上での分子量の増加に相当するそれぞれの反応単位（RU）で測定した。すべてのコンストラクトを二つ組で測定した。二つ組の測定の平均値が、それぞれ、図8Aおよび8Bに示されている。
結果として、コンストラクトD9Fは、T2G、D3L、T7IおよびK6Cと比較してFcRnコートCM5チップ上で有意に高い質量増加を示し、これはヒトFcRnに対するD9Fのより強い結合親和性を示している。この観察は、それぞれのコンストラクトの両方の濃度で見られた。
FcRnに対する結合は、コンストラクト中のFc部分を通じて媒介される。文献に記載されているようにヒトFcRnに対するより強い結合は、それぞれのタンパク質のより高い細胞内救済およびそれによる分解率の減少に起因するより長いインビボ半減期の指標である。この理由から、他のコンストラクトと比較してより強いD9FのヒトFcRnに対する結合は、この分子を、患者内での潜在的薬物のより長い暴露およびより低頻度の薬物投与を実現する治療分子の基礎として明確に優れたものにしている。
実施例19：ヒトFcRn（FCGRT/B2M）に対する結合の表面プラズモン共鳴ベースの測定
コンストラクトD9F、T2G、D3L、T7IおよびK6CならびにヒトIgG1-カッパ抗体MT201を各々、標準的な手順にしたがうSPR（Biacore)実験においてヒトFcRnに対して結合するそれらの能力について試験した。詳細には、酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5および200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA pH 6.0からなる泳動緩衝液を使用することによって、CM5センサーチップ（GE Healthcare）におよそ350 RUのFCGRT/B2M（ACRO Biosystems）を固定した。次いで、これらのコンストラクトおよびヒトIgG1-カッパ対照（MT201）を、200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、pH 6.0で希釈された125 nMの濃度および36℃で注入した。結合は、30μl/分の流速で90秒間行い、その後の解離フェーズを、30μl/分の流速で60秒間、36℃の200 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、pH 6.0中で行った。その後の再生は、10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA pH 7.4を用いて30μl/分で10秒間行った。
すべてのコンストラクトにおいて、注入フェーズ中の最大結合を、結合したコンストラクトに起因するFcRnコートCM5チップ上での分子量の増加に相当するそれぞれの反応単位（RU）で測定した。すべてのコンストラクトを二つ組で測定した。二つ組の測定の平均値が、標準偏差エラーバーを含めて図9に示されている。
結果として、コンストラクトD9Fは、T2G、D3L、T7IおよびK6Cと比較してFcRnコートCM5チップ上で有意に高い質量増加を示し、これはヒトFcRnに対するD9Fのより強い結合親和性を示している。D9Fに関するFcRnコートCM5チップ上での質量の増加は、ヒトIgG1-カッパ対照抗体MT201の質量増加に匹敵するものであり、これはヒトFcRnに対するコンストラクトD9Fの匹敵する結合を示している。
FcRnに対する結合は、コンストラクト中のヒトIgG1 Fc部分を通じて媒介される。当技術分野で報告されているようにヒトFcRnに対するより強い結合は、それぞれのタンパク質のより高い細胞内救済およびそれによる分解率の減少に起因するより長いインビボ半減期の指標である。この理由から、他のコンストラクトと比較しての、ヒトIgG1-カッパ抗体（MT201)の範囲のより強いD9FのヒトFcRnに対する結合は、この分子を、全長ヒトIgG1抗体の範囲と推定される、患者内での潜在的薬物のより長い暴露およびより低頻度の薬物投与を実現する治療分子の基礎として明確に優れたものにしている。
Figure 0006959011
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Claims (19)

  1. ・BCMAに結合する第1のドメイン、
    ・ヒトおよび／またはマカクCD3ε鎖の細胞外エピトープに結合する第2のドメイン、ならびに
    ・ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメインを各々が含む2つのポリペプチド単量体を含む第3のドメインであって、該2つのポリペプチド単量体がペプチドリンカーを通じて相互に融合されている、第3のドメイン
    を含む、単鎖抗体コンストラクト。
  2. 第3のドメインが、アミノからカルボキシルへの順に、
    ヒンジ-CH2-CH3-リンカー-ヒンジ-CH2-CH3
    を含む、請求項1記載の抗体コンストラクト。
  3. 前記ポリペプチド単量体の各々が、SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択される配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1または2記載の抗体コンストラクト。
  4. 前記ポリペプチド単量体の各々が、SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  5. CH2ドメインが、ドメイン内システインジスルフィド架橋を含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  6. （i）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
    （ii）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが2つの抗体可変ドメインを含む、
    （iii）第1のドメインが2つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、または
    （iv）第1のドメインが1つの抗体可変ドメインを含み、かつ第2のドメインが1つの抗体可変ドメインを含む、
    請求項1〜5のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  7. 第1および第2のドメインが、ペプチドリンカーを通じて第3のドメインに融合されている、請求項1〜6のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  8. アミノからカルボキシルへの順に、
    （a）第1のドメイン、
    （b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
    （c）第2のドメイン、
    （d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
    （e）第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
    （f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
    （g）第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
    を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  9. アミノからカルボキシルへの順に、
    （a）SEQ ID NO:53、59、71、77、89または95からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第1のドメイン、
    （b）SEQ ID NO:1〜3からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
    （c）SEQ ID NO:15または110〜129からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第2のドメイン、
    （d）SEQ ID NO:1、2、3、9、10、11および12からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、
    （e）SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインの第1のポリペプチド単量体、
    （f）SEQ ID NO:5、6、7および8からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカー、ならびに
    （g)SEQ ID NO:17〜24からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する第3のドメインの第2のポリペプチド単量体
    を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  10. SEQ ID NO:55、56、61、62、73、74、79、80、91、92、97および98からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1〜9のいずれか1項記載の抗体コンストラクト。
  11. 請求項1〜10のいずれか1項記載の抗体コンストラクトをコードする、ポリヌクレオチド。
  12. 請求項11記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  13. 請求項11記載のポリヌクレオチドまたは請求項12記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
  14. 請求項1〜10のいずれか1項記載の抗体コンストラクトの発現を可能にする条件下で請求項13記載の宿主細胞を培養する工程、および産生された抗体コンストラクトを培養物から回収する工程を含む、請求項1〜10のいずれか1項記載の抗体コンストラクトの製造のための方法。
  15. 請求項1〜10のいずれか1項記載のまたは請求項14記載の方法により製造された抗体コンストラクトを含む、薬学的組成物。
  16. 約-20℃で少なくとも4週間安定である、請求項15記載の薬学的組成物。
  17. BCMA発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害または自己免疫疾患から選択される疾患の予防、処置または改善において使用するための、請求項1〜10のいずれか1項記載のまたは請求項14記載の方法により製造された抗体コンストラクト。
  18. BCMA発現に関連するB細胞障害、形質細胞障害または自己免疫疾患の処置または改善のための組成物であって、請求項1〜10のいずれか1項記載のまたは請求項14記載の方法により製造された抗体コンストラクトを含む、組成物。
  19. 請求項1〜10のいずれか1項記載のもしくは請求項14記載の方法により製造された抗体コンストラクト、請求項11記載のポリヌクレオチド、請求項12記載のベクターおよび／または請求項13記載の宿主細胞を含む、キット。
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