CN114437219A

CN114437219A - 一种抗lag-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

Info

Publication number: CN114437219A
Application number: CN202210076921.0A
Authority: CN
Inventors: 徐广贤; 蒋丹; 王红霞; 张西倩; 舒纬童; 蓝华滔; 周海金
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2022-01-24
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2042-01-24
Also published as: CN114437219B

Abstract

本发明提供了一种抗LAG‑3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，属于免疫学技术领域。本发明所述纳米抗体来源于骆驼，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR，针对LAG‑3的重链。本发明基于所述抗LAG‑3的纳米抗体，将其与人IgG Fc段连接，形成重组纳米抗体，能够特异性的识别LAG‑3抗原。在本发明实施例中，将所述重组纳米抗体与T细胞和Daudi细胞进行共培养，所述重组纳米抗体杀伤肿瘤细胞的最佳浓度为200μg/mL；同时所述重组纳米抗体可促进T/CD19 CAR‑T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤能力。

Description

一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用。

背景技术

淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyte Activation Gene-3，LAG-3)是由LAG-3基因编码的蛋白质/免疫检查点受体，是免疫球蛋白家族中一个重要的负性共刺激分子，表达于细胞毒性T细胞和Treg细胞。LAG-3的主要配体是MHC II类分子，与pMHC II复合物结合后，能够负性调节T细胞的增殖、活化和动态平衡，具有维持内环境稳定和参与免疫调节的功能，与肿瘤的发生发展密切相关。此外，LAG-3表达于聚集在肿瘤病灶的Treg细胞，抑制细胞毒性T细胞。临床前研究显示，阻断LAG-3可以促进T细胞增殖，增强细胞毒性T细胞的功能。

靶向抑制性协同受体PD-1和CTLA-4的检查点免疫疗法彻底改变了癌症治疗，而LAG-3作为新一代发现的抑制性检查点，有望成为肿瘤治疗中极具前景的靶点。多项研究表明，LAG-3与PD-1协同抑制抗肿瘤免疫和自身免疫。抗LAG-3抗体作为单药治疗的实际疗效或抗LAG-3抗体在PD-1和LAG-3联合治疗中的确切加性效应有待进一步的报道。我国人口基数大，患病人数多，药品需求量大，而拥有自主知识产权的免疫检查点抑制剂药品较少，因此研发拥有自主知识产权的免疫抑制点抑制剂药品尤其重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用，所述纳米抗体和重组纳米抗体能够特异性识别LAG-3抗原，并提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种抗LAG-3的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

本发明提供了编码上述纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种抗LAG-3的重组纳米抗体，所述重组纳米抗体从N端至C端，依次包括上述纳米抗体和人IgG Fc段。

优选的，在所述纳米抗体和人IgG Fc段之间还包括连接肽，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

优选的，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组载体，所述重组载体的基础载体包括pET-30a。

本发明还提供了一种表达上述重组纳米抗体的重组菌株，所述重组菌株的基因组中包含上述重组载体。

本发明还提供了上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的有效成分，包括上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。

本发明还提供了一种肿瘤诊断试剂，所述肿瘤诊断试剂的有效成分，包括上述纳米抗体、上述重组纳米抗体或上述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。

有益效果：本发明提供了一种抗LAG-3的纳米抗体，所述纳米抗体来源于骆驼，包括框架区FR和抗原决定簇互补CDR，针对LAG-3的重链。本发明基于所述抗LAG-3的纳米抗体，将其与人IgG Fc段连接，形成重组纳米抗体，能够特异性的识别LAG-3抗原。在本发明实施例中，将所述重组纳米抗体与T细胞和Daudi细胞进行共培养，所述重组纳米抗体杀伤肿瘤细胞的最佳浓度为200μg/mL；同时所述重组纳米抗体可促进T/CD19 CAR-T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤能力。

附图说明

图1为纳米抗体的第一轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第六道为1000bp的Marker(条带大小依次为：1000、700、500、400、300、200、100bp)，第一、二、三及五道为PCR产物，条带约为700bp，第四道为空；

图2为纳米抗体的第二轮DNA电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的Marker(条带大小同上)，第二、四及六道为PCR产物，条带约为400bp，第三及五道为空；

图3为用噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图：其中1是将LAG-3抗原包被在酶标板上，2是噬菌体上清，3是鼠抗km13107抗体，4是山羊抗鼠IgG(AP)的抗体，5是TMB显色液；

图4为纯化的重组纳米抗体，其中，左图为破碎后处理样品、流出样品和洗脱样品的SDS-PAGE电泳染色图；右图为纯化后的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图；

图5为LAG-3抗原的western blot图；

图6为不同浓度的重组纳米抗体对Daudi细胞的杀伤能力比较；

图7为T细胞/CD19 CAR-T对K562细胞的杀伤；

图8为T细胞/CD19 CAR-T对Daudi细胞的杀伤。

具体实施方式

本发明提供了一种抗LAG-3的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：QVQLQESGGGAVQAGGSLRLACALSGFTSRWFTMAWFRQPQGLERMGVASINNEGDTMYAGSFKARFTISHDSAKTTLFLEMNNLKPEDTAMYYCAIQLDPVSAVAAYLVAYFTDYGQGTQVTVSS。

本发明所述纳米抗体优选包括框架区FR和抗原决定簇互补区CDR，其中所述框架区FR优选包括FR1、FR2、FR3和FR4，所述抗原决定簇互补区CDR优选包括CDR1、CDR2和CDR3，对应的氨基酸序列优选如下所示：

FR1:QVQLQESGGGAVQAGGSLRLACALS(SEQ ID No.6)；

FR2:MAWFRQPQGLERMGV(SEQ ID No.7)；

FR3:MYAGSFKARFTISHDSAKTTLFLEMNNLKPEDTAMYYC(SEQ ID No.8)；

FR4:YGQGTQVTVSS(SEQ ID No.9)；

CDR1:GFTSRWFT(SEQ ID No.14)；

CDR2:ASINNEGDT(SEQ ID No.15)；

CDR3:AIQLDPVSAVAAYLVAYFTD(SEQ ID No.16)。

与上述氨基酸序列对应的核苷酸序列优选包括：

FR1:CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGGGGCGCGGTGCAGGCTGGAGGCTCCCTGCGACTCGCCTGTGCACTTTCT(SEQ ID No.10)；

FR2:ATGGCCTGGTTCCGCCAGCCTCAAGGGTTGGAGCGCATGGGAGTT(SEQ ID No.11)；

FR3:ATGTATGCAGGGTCCTTCAAGGCCCGGTTCACCATCTCCCACGACAGCGCCAAGACCACTCTGTTTCTGGAAATGAACAACCTCAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGT(SEQ ID No.12)；

FR4:TACGGGCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID No.13)；

CDR1:GGCTTCACATCCCGTTGGTTCACC(SEQ ID No.17)；

CDR2:GCGAGCATTAACAATGAAGGAGACACA SEQ ID No.18)；

CDR3:GCGATACAATTAGACCCTGTTAGCGCGGTGGCAGCCTATCTAGTCGCATACTTTACTGAC(SEQID No.19)。

本发明对所述纳米抗体的筛选方法并没有特殊限定，优选利用用噬菌体表面展示技术构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，然后以生物素化的LAG-3抗原为基础进行筛选，获得LAG-3特异性的纳米抗体基因序列。本发明所述天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库的构建方法，优选包括以下步骤：1)提取骆驼脾脏组织总RNA、反转录所述总RNA获得cDNA；2)以所述cDNA为模板进行巢式PCR扩增获得重链抗体的可变区片段；3)分别酶切所述重链抗体的可变区片段和pcantab5e噬菌体载体后，进行连接获得连接产物；4)将所述连接产物转入感受态细胞中获得天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库。本发明在所述转入后，优选还包括辅助噬菌体救援。

本发明在构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库后，以生物素化的LAG-3抗原为基础进行筛选，所述筛选的方法并没有特殊限定，采用本领域常规纳米抗体筛选方法即可。

本发明提供了编码上述纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGGGGCGCGGTGCAGGCTGGAGGCTCCCTGCGACTCGCCTGTGCACTTTCTGGCTTCACATCCCGTTGGTTCACCATGGCCTGGTTCCGCCAGCCTCAAGGGTTGGAGCGCATGGGAGTTGCGAGCATTAACAATGAAGGAGACACAATGTATGCAGGGTCCTTCAAGGCCCGGTTCACCATCTCCCACGACAGCGCCAAGACCACTCTGTTTCTGGAAATGAACAACCTCAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGATACAATTAGACCCTGTTAGCGCGGTGGCAGCCTATCTAGTCGCATACTTTACTGACTACGGGCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。

本发明在所述纳米抗体和人IgG Fc段之间优选还包括连接肽，编码所述连接肽的核苷酸序列优选如SEQ ID No.4所示：GGTGGTGGTGGTAGT。本发明所述人IgG Fc段的编码基因的核苷酸序列优选如SEQ ID No.24所示，具体如下：GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGGGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA。

本发明所述重组纳米抗体的完整核苷酸序列优选如SEQ ID No.5所示，具体如下：CAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGGGGCGCGGTGCAGGCTGGAGGCTCCCTGCGACTCGCCTGTGCACTTTCTGGCTTCACATCCCGTTGGTTCACCATGGCCTGGTTCCGCCAGCCTCAAGGGTTGGAGCGCATGGGAGTTGCGAGCATTAACAATGAAGGAGACACAATGTATGCAGGGTCCTTCAAGGCCCGGTTCACCATCTCCCACGACAGCGCCAAGACCACTCTGTTTCTGGAAATGAACAACCTCAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGATACAATTAGACCCTGTTAGCGCGGTGGCAGCCTATCTAGTCGCATACTTTACTGACTACGGGCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAA。本发明所述重组纳米抗体的氨基酸序列优选如SEQ ID No.3所示：QVQLQESGGGAVQAGGSLRLACALSGFTSRWFTMAWFRQPQGLERMGVASINNEGDTMYAGSFKARFTISHDSAKTTLFLEMNNLKPEDTAMYYCAIQLDPVSAVAAYLVAYFTDYGQGTQVTVSSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

本发明对所述重组载体的构建方法并没有特殊限定，优选将上述SEQ ID No.5所示的核苷酸序列插入所述pET-30a的NdeI和XhoI位点之间。

本发明所述重组菌株的基础菌株优选包括原核表达菌株，更优选包括大肠杆菌菌株。本发明实施例中优选利用Arctic Express作为基础菌株，并将上述重组载体转化如所述基础菌株中，即得所述重组菌株。

本发明所述纳米抗体或所述重组纳米抗体能够特异性识别LAG-3抗原，并且利用重组纳米抗体与T细胞和Daudi细胞进行培养，在所述重组纳米抗体浓度为200μg/mL时，具有强大的促进T细胞杀伤肿瘤效果，可用于制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂。

本发明对所述抗肿瘤药物的剂型并没有特殊限定，优选还包括药学上可接受的辅料，根据不同的剂型需求添加不同的辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

针对于天然驼源纳米抗体基因库的构建：

(1)Trizol法提取骆驼脾脏组织总RNA，利用TIANGEN公司提供的RNA纯化试剂盒纯化，按照Thermo Scientific ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kits试剂盒反转录得到cDNA。

(2)以cDNA为模板，用巢式PCR扩增得到重链抗体的可变区片段；

第一轮PCR：

20μL体系：cDNA2μL、Mix 10μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH₂O余量。

上游引物：5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAAG-3’(SEQ ID No.20)；

下游引物：5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’(SEQ ID No.21)；

PCR扩增反应条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃10min。

扩增重链抗体引导肽和抗体CH₂之间的片段，结果如图1所示，纳米抗体基因电泳条带约为700bp。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物为模板，构建50μL体系：700bp产物2μL、Mix25μL、上游引物1μL、下游引物1μL和ddH₂O余量。

上游引物：

5'-TCGCGGCCCAGCCGGCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGG-3'(SEQ ID No.22)；

下游引物：

5'-ATAAGAATGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3'(SEQ ID No.23)；

第二轮PCR扩增反应条件为：94℃5min；94℃40s，55℃40s，72℃40s，25个循环；72℃10min。

扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)，结果如图2所示，扩增片段的大小约为400bp，即纳米抗体基因电泳条带约为400bp。

使用限制性内切酶(购自Takara公司)SifI和Not I酶切pcantab5e噬菌体载体及VHH片段(本发明SEQ ID No.1)，并用T4 DNA连接酶(购自Takara公司)连接两个片段。

将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建天然驼源纳米抗体噬菌体展示文库，经辅助噬菌体救援后，其库容量达9.0×10¹³。

其中辅助噬菌体救援步骤如下：

①取100μL的文库，接种于50ml的2×YT/Amp/Glu培养基中，37℃，200rpm，震荡培养至对数期OD₆₀₀约为0.4～0.5。

②向培养液中加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13KO7，混匀后37℃静置30min。

③将培养液在室温，9000rpm，离心10min，弃上清沉淀菌体，用200mL的2×YT/Amp/Kana培养液重悬，37℃200rpm，培养过夜。

④将培养液于4℃，9000rpm，离心10min取上清，加入1/5体积的PEG/NaCl，4℃静置6h。

⑤9000rpm离心20min弃上清，用PBS(1mL)重悬沉淀，得到重组噬菌体抗体库，分装到1.5ml Ep管中，4℃保存。

与此同时，通过菌落PCR检测文库的插入率，引物使用第二轮PCR引物，退火温度55℃，结果显示插入率达到95％以上(目的片段插入率＝含目的片段的菌落数/所有菌落数)。

针对抗LAG-3纳米抗体的筛选过程：

将噬菌体文库(1×10¹²个噬菌体)与50μL链霉亲和素磁珠在转动台上室温孵育1h后，收集噬菌体抗体；在2个已用2％PBSM封闭过的1mL离心管中，分别加入500μL预先削减的噬菌体抗体，再向一个离心管中加入500μL用PBS稀释的5μg生物素化的LAG-3抗原，另一个离心管中加入500μL的PBS缓冲液作为阴性对照，在转动台上室温孵育1h，后加入预先封闭的50μL的链霉亲和素磁珠，在转动台上室温孵育30min，收集磁珠。用PBST洗涤磁珠7次，PBSM洗涤2次，PBS洗涤1次。加入pH2.7的Glycine进行洗脱，pH9.1的1mol/L Tris-HCl进行中和。将上述中和液加入到5mL处于对数生长期的TG1(OD₆₀₀为0.5)中，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，经过3轮筛选，阳性克隆将不断得到富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛选抗体库中LAG-3特异性抗体的目的。

噬菌体的酶联免疫方法(phage-ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

筛选原理模式图如图3所示，具体方法如下：

首先制备VHH噬菌体单克隆上清：从3轮筛选后的固体平板上，随机挑取90个单菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基中，220rpm 37℃培养过夜，次日取50μL菌液至新的96深孔板中，每孔加入800μL含有100μg/mL的氨苄青霉素及2％的葡萄糖的2×YT培养基，生长至对数期后，加入感染复数为20:1的辅助噬菌体M13K07，37℃侵染30min，10000rpm离心5min，弃上清，用800μL含有100μg/mL的氨苄青霉素及50μg/mL的卡那青霉素的新鲜2×YT培养基重悬菌体，37℃，220rpm培养12h，次日，将菌液10000rpm，离心5min，其上清即为VHH噬菌体单克隆上清。

用包被液将LAG-3抗原稀释至10μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被过夜，并设立阴性和阳性对照。次日，用PBST洗涤三次，用2％PBSM于37℃封闭2h，用PBST洗涤三次，加入200μL预处理的VHH噬菌体单克隆上清，37℃孵育1h。加入1:5000的用0.1％的PBST稀释的鼠源性抗M13KO7/HRP的二抗，37℃孵育1h，洗去未结合的抗体，加入TMB显色液，于酶标仪上在450nm波长处读取吸光度值。当样品孔OD值大于对照孔OD两倍以上时判定为阳性对照孔，取阳性菌液进行基因测序。

使用DNAMAN软件进行序列分析及blast比对，把CDR1、CDR2和CDR3序列相同的菌株视为同一克隆株。最终采用氨基酸序列SEQ ID N0.1所示的纳米抗体序列做后续实验。

实施例2

重组纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化：

(1)将测序分析所获得的的纳米抗体序列连接人源性IgG Fc段并亚克隆pET-30a质粒载体中，并转化至大肠杆菌Arctic Express，挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/mL Kan的3mL LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜；(2)次日按1:100接种于50μg/mLKan的30mL LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD₆₀₀为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，20℃220rpm振摇过夜，诱导融合蛋白表达；(3)收集菌体并进行超声破碎，得到包涵体蛋白粗体液，后经Ni柱亲和纯化得到融合蛋白。图4是纯化的重组纳米抗体，其中左图为重组纳米抗体纯化过程中的SDS-PAGE电泳染色图：其中泳道M为蛋白分子标准，泳道1-2分别是破碎后处理样品、流出样品，泳道3-4是洗脱样品；右图为纯化后的重组纳米抗体的SDS-PAGE电泳染色图，其中泳道M为蛋白分子标准，泳道1是0.5mg/ml的BSA作为浓度衡量标准，泳道2是纯化的重组纳米抗体。

实施例3

重组纳米抗体的特异性验证：

用LAG-3抗原做western blot(其中一抗用纯化的重组纳米抗体，二抗为抗人IgGFc/HRP)，图5为LAG-3抗原的western blot图：其中泳道M是蛋白分子标准，泳道1-2是LAG-3抗原，泳道3是293T细胞全蛋白。由此说明本发明提供的重组纳米抗体可以特异性识别LAG-3抗原。

实施例4

重组纳米抗体对肿瘤细胞杀伤浓度确定：

复苏Daudi细胞，分离纯化T细胞；

T细胞与Daudi细胞以效靶比10：1进行共培养，共培养体系中加入不同终浓度重组纳米抗体；孵育24h后检测T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

结果如图6为所示，200μg/mL的重组纳米抗体加入量，T细胞对肿瘤细胞杀伤效果最好。

实施例5

重组纳米抗体对不同肿瘤细胞的杀伤作用验证：

(1)复苏K562，Daudi细胞，传代2次(K562为CD19阴性，Daudi为CD19阳性)；

(2)分离T细胞，制备扩增CD19 CAR-T细胞；

(3)T细胞/CD19 CAR-T与K562或Daudi细胞以10:1和20:1两种效靶比共培养，培养体系中加入终浓度为200μg/mL的重组纳米抗体；

(4)24h后检测细胞毒性。

重组纳米抗体可促进T/CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，不区分肿瘤细胞类型。图7为T细胞/CD19 CAR-T对K562细胞的杀伤，图8为T细胞/CD19 CAR-T对Daudi细胞的杀伤。

综上可知，重组纳米载体可促进T/CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，不区分肿瘤细胞类型。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东医科大学

<120> 一种抗LAG-3的纳米抗体、编码基因、重组纳米抗体、重组载体、重组菌株和应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Ser Arg Trp Phe

20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Gln Gly Leu Glu Arg Met Gly Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn Glu Gly Asp Thr Met Tyr Ala Gly Ser Phe Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Ser Ala Lys Thr Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ile Gln Leu Asp Pro Val Ser Ala Val Ala Ala Tyr Leu Val Ala Tyr

100 105 110

Phe Thr Asp Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caggtccaac tgcaggagtc tggggggggc gcggtgcagg ctggaggctc cctgcgactc 60

gcctgtgcac tttctggctt cacatcccgt tggttcacca tggcctggtt ccgccagcct 120

caagggttgg agcgcatggg agttgcgagc attaacaatg aaggagacac aatgtatgca 180

gggtccttca aggcccggtt caccatctcc cacgacagcg ccaagaccac tctgtttctg 240

gaaatgaaca acctcaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcgat acaattagac 300

cctgttagcg cggtggcagc ctatctagtc gcatacttta ctgactacgg gcaggggacc 360

caggtcaccg tctcctca 378

<210> 3

<211> 363

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Leu Ser Gly Phe Thr Ser Arg Trp Phe

20 25 30

Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Gln Gly Leu Glu Arg Met Gly Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Asn Glu Gly Asp Thr Met Tyr Ala Gly Ser Phe Lys

50 55 60

Ala Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Ser Ala Lys Thr Thr Leu Phe Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ile Gln Leu Asp Pro Val Ser Ala Val Ala Ala Tyr Leu Val Ala Tyr

100 105 110

Phe Thr Asp Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

130 135 140

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

145 150 155 160

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

165 170 175

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

180 185 190

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

195 200 205

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

210 215 220

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

225 230 235 240

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

245 250 255

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

260 265 270

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

275 280 285

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

290 295 300

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

305 310 315 320

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

325 330 335

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

340 345 350

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355 360

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggtggtg gtagt 15

<210> 5

<211> 1089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caggtccaac tgcaggagtc tggggggggc gcggtgcagg ctggaggctc cctgcgactc 60

gcctgtgcac tttctggctt cacatcccgt tggttcacca tggcctggtt ccgccagcct 120

caagggttgg agcgcatggg agttgcgagc attaacaatg aaggagacac aatgtatgca 180

gggtccttca aggcccggtt caccatctcc cacgacagcg ccaagaccac tctgtttctg 240

gaaatgaaca acctcaaacc tgaggacact gccatgtact actgtgcgat acaattagac 300

cctgttagcg cggtggcagc ctatctagtc gcatacttta ctgactacgg gcaggggacc 360

caggtcaccg tctcctcagg tggtggtggt agtgagccca aatcttgtga caaaactcac 420

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 480

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 660

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 780

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960

ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1020

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc 1080

ccgggtaaa 1089

<210> 6

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Leu Ser

20 25

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Trp Phe Arg Gln Pro Gln Gly Leu Glu Arg Met Gly Val

1 5 10 15

<210> 8

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Tyr Ala Gly Ser Phe Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser His Asp Ser

1 5 10 15

Ala Lys Thr Thr Leu Phe Leu Glu Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

35

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Tyr Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 10

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caggtccaac tgcaggagtc tggggggggc gcggtgcagg ctggaggctc cctgcgactc 60

gcctgtgcac tttct 75

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcctggt tccgccagcc tcaagggttg gagcgcatgg gagtt 45

<210> 12

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtatgcag ggtccttcaa ggcccggttc accatctccc acgacagcgc caagaccact 60

ctgtttctgg aaatgaacaa cctcaaacct gaggacactg ccatgtacta ctgt 114

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tacgggcagg ggacccaggt caccgtctcc tca 33

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Phe Thr Ser Arg Trp Phe Thr

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ala Ser Ile Asn Asn Glu Gly Asp Thr

1 5

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ala Ile Gln Leu Asp Pro Val Ser Ala Val Ala Ala Tyr Leu Val Ala

1 5 10 15

Tyr Phe Thr Asp

20

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcttcacat cccgttggtt cacc 24

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcgagcatta acaatgaagg agacaca 27

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgatacaat tagaccctgt tagcgcggtg gcagcctatc tagtcgcata ctttactgac 60

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtcctggctg ctcttctaca aag 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgcggccca gccggcccag gtccaactgc aggagtctgg gg 42

<210> 23

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ataagaatgc ggccgctgag gagacggtga cctgggtccc c 41

<210> 24

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgggg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 696

Claims

1.一种抗LAG-3的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.一种抗LAG-3的重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体从N端至C端，依次包括权利要求1所述纳米抗体和人IgG Fc段。

4.根据权利要求3所述重组纳米抗体，其特征在于，在所述纳米抗体和人IgG Fc段之间还包括连接肽，编码所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

5.根据权利要求3或4所述重组纳米抗体，其特征在于，所述重组纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.一种表达权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体的重组载体，其特征在于，所述重组载体的基础载体包括pET-30a。

7.一种表达权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的基因组中包含权利要求6所述重组载体。

8.权利要求1所述纳米抗体、权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体或权利要求7所述重组菌株制备得到的重组纳米抗体在制备抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂中的应用。

9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的有效成分，包括权利要求1所述纳米抗体、权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体或权利要求7所述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。

10.一种肿瘤诊断试剂，其特征在于，所述肿瘤诊断试剂的有效成分，包括权利要求1所述纳米抗体、权利要求3～5任一项所述重组纳米抗体或权利要求7所述重组菌株制备得到的重组纳米抗体。