CN113307874A - 一种抗lag3的抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肿瘤治疗和分子免疫学领域，提供了一种抗LAG3抗体及其应用。本发明通过人LAG3抗原免疫小鼠，构建抗体文库及筛选，获得鼠源抗人LAG3抗体，而后经过人源化及亲和力成熟后获得高亲和力的抗LAG3单克隆抗体。本发明所述单克隆抗体能够很好地特异性结合LAG3抗原，有效阻断LAG3与MHC II和/或FGL1的结合，抑制和/或阻断由LAG3结合MHC II和/或FGL1所介导的细胞内信号传导，激活T细胞并引发肿瘤杀伤效应。

Description

一种抗LAG3的抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体工程技术领域，尤其涉及抗LAG3的抗体及其应用。
背景技术
LAG3(淋巴细胞活化基因-3，Lymphocyte-activation gene 3)，又称CD223，是在活化的CD4+和CD8+T细胞、NK细胞、DC细胞上表达的免疫检查点分子，属于免疫球蛋白超家族成员。
LAG3全长503个氨基酸，由胞外区、穿膜区和胞质区3部分组成。胞外区由D1、D2、D3和D44个免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域组成，LAG3胞外区域与CD4结构高度同源，但是有别于CD4，LAG3的D1结构域中含有一个由富含脯氨酸的30个氨基酸的环状结构。LAG3有多种配体，研究证实(Baixeras,E.等人，J.Exp.Med.1992,176,327–337)，MHC II分子为LAG3的主要配体。MHC II分子主要表达于上皮肿瘤细胞和肿瘤浸润的抗原呈递细胞。LAG3与MHC-Ⅱ类分子结合，向表达LAG3的细胞发送负面信号，下调抗原依赖性CD4+/CD8+T细胞应答，从而削弱免疫应答。LAG3不仅作用于效应T细胞，还在增强调节性T细胞(Treg)功能方面发挥作用。维介素蛋白1(Fibrinogen-like protein 1，FGL1)是LAG3的另一个主要配体(JunWang等，Cell.2019Jan 10；176(1-2):334-347.e12.)，FGL1与LAG3相互可以促进肿瘤免疫逃逸；FGL1是一种从肝脏分泌的蛋白质，人肿瘤细胞可以产生大量FGL1，血浆FGL1水平升高，对PD-1/B7-H1治疗和预后效果具有抗性，阻FGL1-LAG3通路可以增强CD8+T细胞抗肿瘤作用。
LAG3和其他免疫抑制受体共同表达于肿瘤浸润的CD4+和CD8+T细胞，有协同免疫抑制效应，尤其是与PD-1/PD-L1。
由于LAG3在肿瘤免疫和感染免疫中具有重要作用，因而其是免疫疗法的理想靶点。因此，本领域需要特异性结合LAG3并能解除T细胞免疫抑制的抗体，以为肿瘤或其他免疫疾病患者提供更为稳健有效的治疗方式。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种抗LAG3的抗体及其应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种鼠源抗LAG3的抗体，所述鼠源抗LAG3的抗体包括重链和轻链，其中，所述重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.19任意一项所示的氨基酸序列；所述重链的CDR2包括如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.20任意一项所示的氨基酸序列；所述重链的CDR3包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15或SEQ IDNO.21任意一项所示的氨基酸序列。
本发明中提供的抗LAG3抗体能够特异性与LAG3抗原结合，有效阻断LAG3与MHC II和/或FGL1的结合，抑制和/或阻断由LAG3结合MHC II和/或FGL1所介导的细胞内信号传导。所述抗LAG3抗体能够：
(1)特异性识别并结合LAG3(包括人和食蟹猴LAG3)；(2)与过表达人LAG3抗原的Jurkat细胞表面LAG3结合；(3)抑制和/或阻断LAG3与MHCⅡ的结合；(4)抑制和/或阻断LAG3与FGL1的结合；(5)在体外提高免疫细胞(特别是T细胞，例如抗原特异性T细胞)的效应细胞因子(例如IL-2等)的分泌水平。
优选地，所述轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.22任意一项所示的氨基酸序列；
所述轻链的轻链CDR2包括如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.23任意一项所示的氨基酸序列；
所述轻链的轻链CDR3包括如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.24任意一项所示的氨基酸序列。
作为本发明优选的技术方案，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或者，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
或者，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明还提供一种人源化抗LAG3抗体，所述人源化抗LAG3抗体包括重链和轻链；其中，所述重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.19任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR2包括如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.20任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR3包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.21任意一项所示的氨基酸序列。
优选地，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列。
作为本发明优选的技术方案，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ IDNO.25所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.50所示的氨基酸序列。
本发明中，所述人源化抗LAG3抗体包括单克隆抗体。
优选地，所述单克隆抗体为双价抗体或多价抗体。
第三方面，本发明还提供一种利用如第二方面所述的人源化抗LAG3抗体筛选得到的LAG3亲和力成熟变体。
优选地，所述LAG3结合增强的人源化抗体的序列为：
重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3和VH-FR4包含如SEQ ID No.26、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示的氨基酸序列，
轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和VL-FR4包含如SEQ ID No.31、SEQ IDNo.32、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；
重链CDR1包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，重链CDR2包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，重链CDR3包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
轻链CDR1包括如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，轻链CDR2包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，轻链CDR3包括如SEQ ID NO.55～74任意一项所示的氨基酸序列。
第四方面，本发明还提供一种如第一方面所述的鼠源抗LAG3的抗体、如第二方面所述的人源化抗LAG3抗体或如第三方面所述的LAG3亲和力成熟变体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
本发明中，利用抗LAG3抗体制备的药物用于提高免疫细胞活性、增强免疫应答，或者用于预防和/或治疗肿瘤、感染或自身免疫性疾病。
优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌或卵巢癌中的任意一种。
第五方面，本发明还提供一种同时结合PD-1和LAG3的双特异性抗体，所述双特异性抗体，包括PD-1抗原结合位点和LAG3抗原结合位点；
所述LAG3抗原结合位点包含如第二方面所述的人源化抗LAG3抗体或如第三方面所述的LAG3亲和力成熟变体中所包含的抗原结合位点。
所述抗PD-1和LAG3的双特异性抗体能够特异性结合PD-1和LAG3，在体外提高免疫细胞(特别是T细胞，例如抗原特异性T细胞)的效应细胞因子(例如IL-2等)的分泌水平，同时在小鼠体内抗肿瘤实验中，表现出抗肿瘤活性。
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下列举了本发明中使用的部分术语和缩略语：
抗体：antibody，Ab；单克隆抗体：monoclonal antibodies，mAbs；双特异性抗体：bispecific antibody，BsAb；
免疫球蛋白：immunoglobulin，Ig；程序性死亡细胞蛋白1：Programmed Death-1，PD-1；
重链：heavy chain，HC；轻链：light chain，LC；
重链可变区：heavy chain variable domain，VH；重链恒定区：heavy chainconstant domain，CH；轻链可变区：light chain variable domain，VL；轻链恒定区：lightchain constant domain，CL；
单链可变区抗体片段(又称单链抗体)：single-chain variable fragment，scFv；
互补决定区：complementarity determining region，CDR，是指抗体的抗原互补结合区；
抗原结合区：antigen binding fragment，Fab；铰链区：hinge region；Fc片段：fragment crystallizable region，Fc region；
自然杀伤细胞：natural killing cell，NK细胞；T细胞受体：T cell receptor，TCR；免疫受体酪氨酸活化基序：immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM；FACS：流式细胞术。
本发明中所述“抗体”包括全长抗体和抗体片段，涉及来自有机体的天然抗体、基因工程抗体或者通过重组技术获得的抗体。术语“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体等。术语“抗体”还包括鼠源抗体、人源化抗体和人抗体等。
本发明中所述“分离的”抗体指已经与其天然环境的成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于90％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE)测定的。
本发明中所述“人源化抗体”是指人源免疫球蛋白(受体抗体)的部分或者全部CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或者抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或者反应性的非人源(如小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的架构区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或者被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步改善或者优化抗体的一种或多种特性。
本发明中所述“氨基酸”是指20种天然存在的氨基酸或者任何可能出现在某一特定的位置非天然的氨基酸类似物。本发明中所述“氨基酸突变”是指多肽链中某一个氨基酸的添加、取代、插入和/或删除。
本发明中所述“EC50”即半最大效应浓度(Concentration for 50％ofmaximaleffect)，是指引起50％最大效应所对应的抗体浓度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过哺乳动物细胞表达系统，表达纯化重组人源LAG3抗原并免疫BALB/c小鼠，分离小鼠脾脏组织，制备细胞悬液并提取总RNA，经逆转录后获得cDNA，通过聚合酶链式反应(PCR)克隆重链及轻链可变区基因，可变区经重叠延伸PCR扩增后克隆至噬菌粒载体并转化宿主TG1细胞，获得鼠源抗LAG3单链可变区scFv噬菌体文库；然后，通过噬菌体展示及筛选，获得阳性鼠源抗LAG3抗体mL42、mL3B2和mL4F6，鼠源抗体经人源化及亲和力成熟后获得高亲和力的抗LAG3单克隆抗体；
本发明所得抗体能够特异性结合包括人和食蟹猴LAG3在内的LAG3抗原，且能够与过表达人LAG3抗原的Jurkat细胞表面LAG3结合，进而抑制和/或阻断LAG3与MHCⅡ的结合，抑制和/或阻断LAG3与FGL1的结合，在体外提高免疫细胞效应细胞因子的分泌水平，在制备预防或治疗肿瘤的药物中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中鼠源抗体与人LAG3抗原的亲和力检测曲线图。
图2为实施例1中使用流式细胞仪检测鼠源抗体与过表达LAG3的Jurkat细胞的结合情况的结果图。
图3为实施例1中使用流式细胞仪检测鼠源抗体阻断Raji细胞上的MHCⅡ与LAG3抗原的结合情况的结果图。
图4为实施例1中鼠源抗体阻断FGL1与LAG3的结合情况曲线图，其中I图为mL42的检测结果，II图为mL3B2和mL4F6的检测结果。
图5为实施例1中鼠源抗体处理SED刺激的人PBMC后细胞因子IL-2产生量比较图。
图6为实施例2中人源化抗体与人LAG3抗原的亲和力检测曲线图，其中I图为hmL42的检测结果，II图为hmL3B2和hmL4F6的检测结果。
图7为实施例2中人源化抗体与过表达LAG3的Jurkat细胞的结合情况检测图。
图8为实施例2中人源化抗体阻断Raji细胞上的MHCⅡ与LAG3抗原的结合情况检测图。
图9为实施例2中人源化抗体阻断FGL1与LAG3的结合情况检测图，其中I图反映hmL42，II图反映hmL3B2和hmL4F6。
图10为实施例2中人源化抗体处理SED刺激的人PBMC后细胞因子IL-2产生量比较图。
图11为实施例3中不同hmL42人源化变体与人LAG3抗原的结合情况检测图，其中I图包括变体R2、R2D12、R2G10、R3G6、R2E8、R3H5和R3G4；II图包括R3B5、R3H9、R3B6、R3D4、R3E6、R3E5和R2F8；III图包括R3A7、R2E7、R3C5、R2A8、R2C9和R3G5；IV图表示R2A7、R3A5、R3C4、R3A4、R2B11和R2H11。
图12为实施例3中hmL42人源化变体与过表达人LAG3的Jurkat细胞的结合情况检测图。
图13为实施例3中hmL42人源化变体阻断Raji细胞上的MHCⅡ与LAG3抗原的结合情况检测图。
图14为实施例3中hmL42人源化变体R3G5阻断FGL1与LAG3的结合情况检测图。
图15为实施例3中hmL42人源化变体处理SED刺激的人PBMC后细胞因子IL-2产生量比较图，其中I图包括变体R2、R2D12、R2G10、R3G6、R2E8、R3H5、R3G4、R3B5、R3H9、R3E5、R3D4和R3B6，II图包括变体R3C5、R2C9、R3G5、R2A8、R2B11、R2H11、R31A4、R3C4。
图16为实施例3中hmL42人源化变体与食蟹猴LAG3抗原的结合情况检测图，其中I图表示R3C5、R2C9、R3G5、R2A8、R2B1和R2E7，II图表示R2H11 R3A4、R2、R2G10、R3G4 R3E5、R3D4和R3B6。
图17为实施例4中PD-1×LAG3双特异性抗体处理SED刺激的人PBMC后细胞因子IL-2产生量比较图。
图18为实施例4中PD-1×LAG3双特异性抗体处理B-hPD-1/hLAG3人源化小鼠后小鼠MC38肿瘤体积曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1鼠源抗LAG3抗体的生成
(1)小鼠的免疫接种
用LAG3蛋白(NCBI登录号：NP_002277.4，表达胞外区23-450位氨基酸)作为抗原，在第0、14、21、28天右侧免疫雌性5-6周的BALB/c小鼠(购自广东省实验动物中心)。于第28天从经免疫的小鼠取血清并测量其与LAG3抗原的结合，结果表明所有小鼠均显示阳性结合。从经免疫的小鼠分离脾细胞，提取RNA，逆转录得cDNA，PCR扩增全套抗体的重链和轻链可变区序列。将抗体片段群与噬菌体衣壳蛋白融合表达，并展示于噬菌体表面，构建鼠抗LAG3抗体噬菌体展示文库。经三轮淘洗后，富集阳性克隆，测序。最终获得3株鼠源抗LAG3抗体，命名为mL42，mL3B2，mL4F6。
(2)鼠源抗LAG3抗体及参照抗体的表达和纯化
本发明涉及的所有抗体均采用HEK293F细胞瞬时转染表达。
将鼠源抗LAG3抗体分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1，提取重组质粒，转染HEK293F细胞。细胞培养6-7天后收集上清，上清经proteinA亲和层析柱纯化，纯化产物即为鼠源抗-LAG3抗体。
本实施例中使用的阳性参照抗体，序列来源于默沙东公司(PCT申请号：WO2015US45481)。采用上述同样方法表达纯化，获得对照抗体模拟物，命名为anti-LAG3antibody。
(3)鼠源抗LAG3抗体的验证
1、鼠源抗LAG3抗体与人LAG3抗原的结合活性
采用间接ELISA法检测鼠源抗LAG3抗体与人LAG3抗原的结合活性。具体方法如下：96孔酶标板中，每孔加入人LAG3抗原孵育(ACRO，Cat.LA3-H5222，PBS稀释)，4℃过夜。用含3％牛奶的PBS封闭2h后，0.05％PBST洗涤。分别加入梯度稀释的鼠源抗LAG3抗体，室温孵育1h。0.05％PBST洗去未结合物，每孔加入二抗HRP标记的羊抗人IgG(H+L)(Proteintech，Cat.SA0001-17)，室温孵育1h，0.05％PBST洗去未结合物。加入TMB显色5min，终止反应后，在酶标仪450nM处检测波长吸光度。以log(抗体浓度)为横坐标，吸光度OD450为纵坐标，绘制剂量效应曲线。以EC50代表抗体与抗原的结合活性。以anti-LAG3antibody作为结合测定的阳性对照。
鼠源抗LAG3抗体与人LAG3抗原的结合情况如图1所示，3株鼠源抗LAG3抗体与人LAG3抗原的结合稍弱于参照抗体。
2、鼠源抗LAG3抗体与过表达人LAG3的Jurkat细胞的结合
为评估鼠源抗LAG3抗体的细胞结合特异性，本实施例采用间接流式细胞术法(FACS)测定鼠源抗LAG3抗体与过表达人LAG3抗原及未经转染的Jurkat细胞的结合。
具体方法如下：收集过表达人LAG3抗原的Jurkat/LAG3细胞(Jurkat，人外周血白血病T细胞)及未经转染的Jurkat细胞，调整细胞密度。每个收集管分别加入稀释的鼠源抗LAG3抗体(用含2％FBS的PBS稀释)，冰上共同孵育1小时。用PBS洗涤后，加入PE标记的抗人IgG Fc二抗(BioLegend，Cat.409264)，冰上孵育1小时。再用PBS洗涤3次后，加入PBS重悬细胞，在流式细胞仪(CytoFlek,A00-1-1102)PE通道上检测荧光信号。将anti-LAG3antibody作为结合特异性测定的阳性对照。
结果如图2所示，鼠源抗体mL42，mL3B2，mL4F6及参照抗体均能与过表达人LAG3的Jurkat细胞结合(右侧实线)，但不结合未经LAG3转染的Jurkat细胞(左侧实线)。这些数据表明鼠源抗LAG3抗体的细胞结合特异性。
3、鼠源抗LAG3抗体阻断LAG3结合癌细胞表面MHCⅡ的生物学活性评价
LAG3对应的配体是MHC class II(MHC II)，本实施例将Raji细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)用作人MHCⅡ类表达阳性的细胞系，采用流式细胞术(FACS)检测鼠源抗LAG3抗体阻断LAG3结合Raji表面MHCⅡ的生物学活性。原理是：带有鼠Fc标签的LAG3抗原，与Raji细胞共孵育，LAG3抗原可以结合Raji细胞上的MHCⅡ，加入针对鼠Fc标签的PE标记的抗鼠Fc二抗，通过荧光信号的检测，可以以此评价LAG3与MHCⅡ的结合效果。而抗LAG3抗体的加入，LAG3抗原与MHCⅡ的结合被阻断，荧光信号不能被检测到。
具体方法如下：用预先稀释的LAG3-mFc抗原(ACRO，Human LAG3/CD223 Protein,Mouse IgG2a Fc Tag，Cat.LA3-H52Aa)与鼠源抗LAG3抗体稀释液以体积比1:1混合，室温放置30min。每个收集管加入Raji细胞，再加入鼠源LAG3抗体与LAG3-mFc抗原的混合物，冰上孵育1小时。PBS洗3次后，加入PE标记的鼠抗人IgG2二抗(Biolegend，PE Human IgG2Isotype Control RecombinantAntibody，Cat.403605)，冰上孵育1小时。再用PBS洗3次后，加入PBS重悬细胞后在流式细胞仪上用PE通道检测荧光信号。
结果如图3所示，鼠源抗体mL42，mL3B2，mL4F6及参照抗体均能阻断LAG3抗原结合Raji细胞上的MHCⅡ，荧光信号不能被检测到。而阴性对照抗体hIgG不能阻断LAG3抗原结合Raji细胞上的MHCⅡ，可以检测到荧光信号。
4、鼠源抗LAG3抗体对LAG3抗原与FGL1配体结合的阻断
本实施例采用ELISA法检测鼠源抗LAG3抗体对LAG3抗原与FGL1配体结合的阻断。具体方法如下：
将稀释好的人FGL1抗原加入酶标板中，包被过夜。PBST洗涤3次后，室温封闭。将LAG3(his标签)抗原与梯度稀释好的抗LAG3抗体混匀，室温孵育30min。0.05％PBST洗涤3次后，加入孵育好的LAG3抗原：抗体混合物，室温孵育。酶标板0.05％PBST洗涤3次，每孔加入稀释的Anti-His Antibody，室温孵育。0.05％PBST洗涤3次，每孔加入Goat Anti-mouse，室温孵育。0.05％PBST洗涤3次后，加入TMB显色液，室温避光孵育，用H2SO4终止反应，在酶标仪450nM处检测吸光度。分析数据，以log(抗体浓度)为横坐标，OD450为纵坐标，绘制剂量效应曲线。
结果如图4所示，鼠源抗体mL42(I图)，mL3B2和mL4F6(II图)、参照抗体均能阻断LAG3与FGL1的结合，而阴性对照抗体不能阻断LAG3与FGL1的结合。
5、鼠源抗LAG3抗体增强T细胞应答的生物学活性检测
本实验通过ELISA测定在鼠源抗LAG3抗体及参照抗体刺激下，PBMC细胞分泌IL-2细胞因子的水平，以评估相应抗体的生物学活性。采用密度梯度离心法从人新鲜血液中制备PBMC细胞。获得的PBMC细胞，用含的SED(葡萄球菌肠毒素D)培养液重悬并调整细胞密度，均匀分配至96孔板中。同时将鼠源抗LAG3抗体及参照抗体用RPMI1640培养基稀释至目标浓度，均匀分配至96孔板中。将96孔板放入培养箱中，继续培养。40h后，取出96孔板，离心取上清，用IL-2试剂盒(R&D Systems，Cat.DY202)检测上清中的IL-2的含量。
结果如图5所示，鼠源抗体mL42，mL3B2，mL4F6及参照抗体均能提高人PBMC分泌IL-2的水平，显示了增强T细胞应答的能力。
(5)鼠源抗体的抗体序列
通过前述实施例获得3株与LAG3结合力较强，具有MHCⅡ/LAG3和FGL1/LAG3阻断效应并能激活人PBMC产生IL-2的候选鼠源抗体，分别为mL42，mL3B2，mL4F6。
本发明呈现的鼠源LAG3抗体mL42，mL3B2，mL4F6的重链可变区及轻链可变区，如下表1所示(CDR区标有下划线)。
表1
Figure BDA0003093563730000101
3株鼠源抗体都将进行后续人源化与功能验证，其重链互补决定区(HC-CDR)和轻链互补决定区(LC-CDR)如下表2所示。
表2
Figure BDA0003093563730000102
实施例2鼠源抗体人源化
(1)将鼠源抗体mL42、mL3B2和mL4F6进行人源化
采用CDR移植抗体人源化改造方法，对鼠源抗体mL42、mL3B2和mL4F6进行人源化改造。简言之，通过搜索IMGT结构域空位比对3D结构数据库(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi),比对鼠源抗体的骨架区(Framework，FR)与人源抗体的骨架区，根据高同源性突变相应位点的鼠源抗体序列的框架氨基酸，并与原有重链互补决定区及轻链互补决定区重新组合，获得人源化抗体序列hmL42，hmL3B2，hmL4F6。将人源化抗体hmL42，hmL3B2，hmL4F6分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1，提取重组质粒，共转染HEK293F细胞。细胞培养数天后收集上清，上清经proteinA亲和层析柱纯化，纯化产物即为人源抗-LAG3抗体。
(2)人源化抗体hmL42，hmL3B2，hmL4F6的抗体序列，分别如表3所示(CDR区标有下划线)。
其中，hmL42的重链互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3分别被定义为SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9；其轻链互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分别被定义为SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。
hmL3B2的重链互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3分别被定义为SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15；其轻链互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分别被定义为SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18。
hmL4F6的重链互补决定区VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3分别被定义为SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21；其轻链互补决定区VL-CDR1、VL-CDR2、VL-CDR3分别被定义为SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24。
表3
Figure BDA0003093563730000111
Figure BDA0003093563730000121
(3)人源化抗体的表达和纯化参考实施例1中的相应步骤。
(4)人源化抗体的验证
1、ELISA检测人源化抗体与人LAG3抗原的结合活性
具体方法参考实施例1中的相应步骤，结果如图6所示。mL42人源化后的抗体hmL42(I图)，mL3B2人源化后的抗体hmL3B2和mL4F6人源化后的抗体hmL4F6(II图)，与人LAG3抗原的结合有不同程度地减弱。
2、FACS检测人源化抗体与过表达人LAG3的Jurkat细胞的结合
具体方法参考实施例1中的相应步骤，结果如图7所示。人源化的抗体hmL42，hmL3B2，hmL4F6与过表达人LAG3的Jurkat细胞结合，而不结合未经转染的Jurkat细胞。
3、人源化抗LAG3抗体阻断Raji细胞上的MHCⅡ与LAG3抗原的结合
具体方法参考实施例1中的相应步骤，结果如图8所示，人源化的抗体hmL42，hmL3B2，hmL4F6均能阻断LAG3抗原结合Raji细胞上的MHCⅡ。
4、人源化抗LAG3抗体对LAG3抗原与FGL1配体结合的阻断
具体方法参考实施例1中的相应步骤，结果如图9所示，人源化的抗体hmL42(I图)，hmL3B2和hmL4F6(II图)均能阻断LAG3抗原与FGL1配体的结合。
5、人源化抗LAG3抗体增强T细胞应答的生物学活性检测
具体方法参考实施例1中的相应步骤，结果如图10所示，人源化后的抗体hmL42，hmL3B2，hmL4F6均能提高人PBMC分泌IL-2的水平，显示了增强T细胞应答的生物学活性。
实施例3人源化抗体亲和力成熟
本实施例表明本发明中结合人LAG3的人源化抗体，可以转化为与LAG3特异性结合并且与LAG3结合增强的人源化IgG抗体。
将如实施例2中所述产生的人源化抗LAG3抗体hmL42，利用噬菌体展示技术，构建抗体突变库，筛选出高亲和力抗体，并表达为LAG3结合增强的人源化抗体。方法具体如下
(1)hmL42亲和力成熟文库的生成及筛淘
将人源化抗体hmL42的CDR区随机突变构建亲和力成熟噬菌体展示文库，经多轮亲和筛选进一步获取高亲和力的抗体序列。亲和力成熟文库利用磁珠法(Biotin-AvidinSystem，BAS)进行筛选，共获得27株人源化变体。
(2)hmL42亲和力库成熟库抗体的表达和纯化，具体方法参考实施例1中的相应步骤。
(3)hmL42人源化亲和力成熟变体的验证
1、hmL42人源化亲和力成熟变体与人LAG3抗原的结合活性
检测结果如图11所示，其中I图～IV图均表示了不同变体的检测结果。
结合活性EC50(μg/mL)，结果如表4所示，26株hmL42人源化亲和力成熟变体中有20株抗体与人LAG3抗原的结合活性，较人源化抗体hmL42有不同程度地提高。
表4
抗体 EC<sub>50</sub>(μg/mL) 抗体 EC<sub>50</sub>(μg/mL) 抗体 EC<sub>50</sub>(μg/mL)
R2 0.2019 R3B5 0.1842 R2A8 0.1319
R2D12 0.1195 R3H9 0.1829 R2C9 0.2213
R2G10 0.1598 R3B6 0.2163 R3G5 0.1377
R3G6 0.2065 R3D4 0.1121 R3C4 0.2485
R2E8 0.2037 R3E5 0.1786 R3A4 0.3119
R3H5 0.1467 R3A7 3.316 R2B11 0.2445
R3G4 0.1746 R3C5 0.4373 R2H11 0.3824
R3A5 - R3E6 - R2E7 9.823
R2F8 - R2A7 4.246
备注：-代表抗体与抗原结合呈弱阳性
2、hmL42人源化亲和力成熟变体与过表达人LAG3的Jurkat细胞的结合
选择前述ELISA检测结果中，与人LAG3抗原结合活性较强的20株亲和力成熟变体，采用间接流式细胞术法检测其与过表达人LAG3的Jurkat细胞的结合。结果如图12所示，hmL42人源化亲和力成熟变体与过表达人LAG3的Jurkat细胞结合，而不结合未经LAG3转染的Jurkat细胞。
3、hmL42人源化亲和力成熟变体阻断LAG3结合Raji细胞上的MHCⅡ
根据前述结果，选择18株亲和力成熟变体，采用流式细胞术法阻断LAG3结合Raji表面MHCⅡ的生物学活性。结果如图13所示，hmL42人源化亲和力成熟变体均能阻断LAG3结合Raji细胞上的MHCⅡ。
4、hmL42人源化亲和力成熟变体对LAG3抗原与FGL1配体结合的阻断
代表性结果如图14所示，hmL42人源化亲和力成熟变体较hmL42均能阻断LAG3抗原与FGL1的结合。
5、hmL42人源化亲和力成熟变体增强T细胞应答的生物学活性检测
结果如图15所示，I图和II图均表示了不同亲和力成熟变体，部分亲和力成熟后的抗体较人源化抗体hmL42，对SED刺激的人PBMC中的IL-2产生水平，有不同程度地提高。
6、hmL42人源化亲和力成熟变体与食蟹猴LAG3抗原的结合活性
采用ELISA法检测hmL42人源化亲和力成熟变体与食蟹猴LAG3抗原的结合活性。具体方法如下：食蟹猴LAG3抗原(ACRO，Cat.LA3-C5252)稀释后加入酶标板中，包被过夜。PBST洗涤3次后，每孔milk-PBS，室温封闭。PBST洗涤3次后，加入梯度稀释的LAG3抗体，室温孵育。PBST洗涤3次，加入HRP标记的羊抗人IgG(H+L)二抗(Proteintech，Cat.SA0001-17)，室温孵育。PBST洗涤3次后，加入TMB显色液，室温避光孵育，用H2SO4终止反应，在酶标仪450nM处检测吸光度。以log(抗体浓度)为横坐标，OD450为纵坐标，绘制曲线。
部分结果如图16所示，I图和II图均表示了不同亲和力成熟变体，结果表明hmL42人源化亲和力成熟变体均能与食蟹猴LAG3抗原结合。
(4)hmL42人源化亲和力成熟变体的抗体序列
通过前述实施例，共获得20株具有以下一项或多项特征的人源化亲和力成熟抗LAG3抗体：1、与人LAG3抗原有高亲和力；2、与食蟹猴LAG3抗原有结合；3、与过表达人LAG3抗原的Jurkat细胞结合，而不结合未经LAG3转染的Jurkat细胞；4、阻断LAG3抗原结合癌细胞上的MHCⅡ；5、阻断LAG3与其配体FGL1的结合；6、增强T细胞应答；
20株hmL42人源化亲和力成熟变体，其重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3、VH-FR4分别被指定为SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29；轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3、VL-FR4分别被指定为SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34；重链互补决定区HC-CDR 1、HC-CDR 2、HC-CDR 3分别被指定为SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，轻链互补决定区LC-CDR1、LC-CDR2分别被指定为SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11，其轻链互补决定区LC-CDR3如下表5所示。
表5
抗体 LC-CDR3 SEQ ID No. 抗体 LC-CDR3 SEQ ID No.
R2 MGYLFFPYT 55 R3D4 QQYNVFAFT 65
R2D12 QQYMSFAFT 56 R3E5 QQYVNFPFT 66
R2G10 QQYWEFSFT 57 R3C5 QQYWVWDYV 67
R3G6 QQYVDFPFK 58 R2A8 MGYWVFPYT 68
R2E8 HQYIMFPYT 59 R2C9 MSYVVFPYT 69
R3H5 QQYWVFSFT 60 R3G5 QQYVMFPFT 70
R3G4 QQYIDFPFV 61 R3C4 QQYVAFSFT 71
R3B5 QQYVRFSYT 62 R3A4 QQYVNFPFT 72
R3H9 QQYVDFPYT 63 R2B11 QQYVVFSYS 73
R3B6 QQYLSFPFM 64 R2H11 QQYYSWSYT 74
实施例4制备LAG3双特异性抗体并验证其抗肿瘤活性
为验证前述获得的抗LAG3抗体其有益效果，本发明人创造性的将前述其中一种抗LAG3抗体与本发明人前期筛选获得的抗PD-1抗体，利用基因工程技术手段，基于本发明人已获得的专利(WO2016US45325)所述技术，构建抗LAG3/抗PD-1双特异性抗体。
(1)抗LAG3/抗PD-1双特异性抗体的构建
通过前述实施例，选取LAG3抗体，与PD-1单抗构建抗LAG3/抗PD-1双特异性抗体。其中，抗体的Fc部分按照发明人先前的专利申请公开WO2016US45325的方法进行改造，分别将两种抗体的编码基因克隆至真核表达载体中。根据前述实施例抗体的制备方法，本实施例中构建有三种双特异性抗体。
本发明中采用的PD-1阳性对照抗体anti-PD-1，为纳武单抗模拟物，序列来源于Drugbank(https://www.drugbank.com/)。
(2)抗LAG3/抗PD-1增强T细胞应答的生物学活性检测
取新鲜分离的PBMC，用培养基调整至合适的细胞密度。同时，将抗体用培养稀释至合适浓度。96孔板中每孔加入PBMC细胞及SED稀释液，每孔加入抗体稀释液。将96孔板放入培养箱中，继续培养。96h后，取出96孔板，离心，取上清，用IL-2试剂盒检测上清中的IL-2含量。
所得结果如图17所示，三种双特异性抗体能够明显提高人PBMC中的IL-2产生量。
(3)抗LAG3/抗PD-1抗体体内药效试验
将合适密度的MC38接种于B-hPD-1/hLAG3人源化小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到一定体积时按肿瘤体积挑选30只随机分组，每组6只，共5组，分别为：生理盐水(G1组；对照组)、Anti-PD-1+Anti-LAG3(G2组；0.5+5mg/kg)、1-抗LAG3/抗PD-1(G3组；5mg/kg)、2-抗LAG3/抗PD-1(G4组；5mg/kg)和3-抗LAG3/抗PD-1(G5组；5mg/kg)。其中，Anti-PD1为采用的是nivolumab单抗类似物。
分组当天给药(D0)，所有组给药途径均为静脉注射，每周给药2次，于D0，D3，D7，D14连续给药4次后结束实验。给药和观察期间每周测量2次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照，计算肿瘤体积生长抑制率。
在实验终点(即分组给药第14天)，hPD-1/hLAG3双人源化小鼠肿瘤体积如下表6所示，各组肿瘤重量如表7所示，结果显示抗LAG3/抗PD-1双特异抗体在测试剂量显著抑制肿瘤体积增长，与生理盐水对照组相比，具有统计学差异(t-test分析，p<0.05)。
表6
Figure BDA0003093563730000161
Figure BDA0003093563730000171
a：平均数±标准误；b：给药组肿瘤体积与生理盐水对照组肿瘤体积在分组给药第14天统计学比较，t-test分析，*p<0.05，**p<0.01；
表7
组别 受试品 瘤重(g)<sup>a</sup> TGI<sub>TW</sub>(％) P<sup>b</sup>
G1 生理盐水 0.421±0.050 - -
G2 Anti-PD-1+Anti-LAG3 0.306±0.043 27.3 0.112
G3 1-抗LAG3/抗PD-1 0.262±0.059 37.7 0.068
G4 2-抗LAG3/抗PD-1 0.212±0.062 49.7 *0.025
G5 3-抗LAG3/抗PD-1 0.230±0.046 45.5 *0.018
注：a：均数±标准误；b：受试药组在实验终点和生理盐水对照组瘤重在统计学比较，t-test分析，*p<0.05。
肿瘤体积变化曲线如图18所示，在实验终点(即分组给药第14天)，Anti-PD-1+Anti-LAG3联用，2-抗LAG3/抗PD-1，3-抗LAG3/抗PD-1测试剂量均抑制肿瘤体积增长，与对照组相比，均具有统计学差异(p<0.05)。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州爱思迈生物医药科技有限公司
<120> 一种抗LAG3的抗体及其应用
<130> 20210528
<160> 74
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Val His Trp Leu Lys Gln Thr Pro Val Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Val Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Asp Ile Leu Met Asn Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Ala Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Glu Arg
100 105
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Glu Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Ala Ile Ala Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Val Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Asp Ile Glu Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
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<211> 114
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Glu Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
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Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Ala
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp
1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Gln Asp Val Ser Thr Ala
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Trp Ala Ser
1
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe Glu
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Ile His Pro Gly Ser Gly Ala Ile Ala
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp
1 5
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu
1 5
<210> 17
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
Arg Ala Asn
1
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 18
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 19
Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe Glu
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 20
Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 21
Thr Tyr Gly Trp Asn Asp
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 22
Gln Asp Val Gly Thr Ala
1 5
<210> 23
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 23
Trp Ala Ser
1
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 24
Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
100 105 110
Ser
<210> 26
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 27
Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 28
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 28
Ala Tyr Asn Gln Lys Val Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr
1 5 10 15
Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 29
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 31
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 32
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 33
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 33
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 34
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 35
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Glu Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Ala Ile Ala Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Val Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ser Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser
<210> 36
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu
20 25
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 37
Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 38
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 38
Ala Tyr Asn Gln Lys Val Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Val Leu Thr Ser Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 39
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 40
Asp Ile Glu Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 41
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 42
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 43
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 43
Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr Glu Asp Met Gly
20 25 30
Ile Tyr Tyr Cys
35
<210> 44
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 44
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Arg Phe Thr Asp Phe
20 25 30
Glu Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Tyr Gly Trp Asn Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu
20 25
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 47
Val His Trp Val Lys Leu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Ala
<210> 48
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 48
Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 49
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Asp Tyr Leu Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser
20 25
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 52
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser
<210> 53
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 53
Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala
20 25 30
Asp Tyr Leu Cys
35
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 54
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 55
Met Gly Tyr Leu Phe Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 56
Gln Gln Tyr Met Ser Phe Ala Phe Thr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 57
Gln Gln Tyr Trp Glu Phe Ser Phe Thr
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 58
Gln Gln Tyr Val Asp Phe Pro Phe Lys
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 59
His Gln Tyr Ile Met Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 60
Gln Gln Tyr Trp Val Phe Ser Phe Thr
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 61
Gln Gln Tyr Ile Asp Phe Pro Phe Val
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 62
Gln Gln Tyr Val Arg Phe Ser Tyr Thr
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 63
Gln Gln Tyr Val Asp Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 64
Gln Gln Tyr Leu Ser Phe Pro Phe Met
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 65
Gln Gln Tyr Asn Val Phe Ala Phe Thr
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 66
Gln Gln Tyr Val Asn Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 67
Gln Gln Tyr Trp Val Trp Asp Tyr Val
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 68
Met Gly Tyr Trp Val Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 69
Met Ser Tyr Val Val Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 70
Gln Gln Tyr Val Met Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 71
Gln Gln Tyr Val Ala Phe Ser Phe Thr
1 5
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 72
Gln Gln Tyr Val Asn Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 73
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 73
Gln Gln Tyr Val Val Phe Ser Tyr Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 74
Gln Gln Tyr Tyr Ser Trp Ser Tyr Thr
1 5

Claims (10)

1.一种鼠源抗LAG3的抗体，其特征在于，所述鼠源抗LAG3的抗体包括重链和轻链，其中，所述重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.19任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR2包括如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.20任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR3包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.21任意一项所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的鼠源抗LAG3的抗体，其特征在于，所述轻链的CDR1包括如SEQID NO.10、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.22任意一项所示的氨基酸序列；
所述轻链的CDR2包括如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.23任意一项所示的氨基酸序列；
所述轻链的CDR3包括如SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.24任意一项所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的鼠源抗LAG3的抗体，其特征在于，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
或者，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
或者，所述鼠源抗LAG3的抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
4.一种人源化抗LAG3抗体，其特征在于，所述人源化抗LAG3抗体包括重链和轻链；其中，所述重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.19任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR2包括如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.20任意一项所示的氨基酸序列；
所述重链的CDR3包括如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.21任意一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的人源化抗LAG3抗体，其特征在于，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.15所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.18所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链的CDR1包括如SEQ ID NO.19所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；所述人源化抗LAG3抗体的轻链的CDR1包括如SEQ ID NO.22所示的氨基酸序列，CDR2包括如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列，CDR3包括如SEQ ID NO.24所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的人源化抗LAG3抗体，其特征在于，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.30所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.35所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.40所示的氨基酸序列；
或者，所述人源化抗LAG3抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO.45所示的氨基酸序列，轻链可变区包括如SEQ ID NO.50所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求4～6任一项所述的人源化抗LAG3抗体，其特征在于，所述人源化抗LAG3抗体包括单克隆抗体；
优选地，所述单克隆抗体为双价抗体或多价抗体。
8.一种利用如权利要求4～7任一项所述的人源化抗LAG3抗体筛选得到的LAG3亲和力成熟变体；
优选地，所述LAG3亲和力成熟变体的序列如下：
重链框架区VH-FR1、VH-FR2、VH-FR3和VH-FR4包括如SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQID No.28和SEQ ID No.29所示的氨基酸序列；
轻链框架区VL-FR1、VL-FR2、VL-FR3和VL-FR4包括如SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQID No.33和SEQ ID No.34所示的氨基酸序列；
重链互补决定区CDR1包括如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，重链互补决定区CDR2包括如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，重链互补决定区CDR3包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
轻链互补决定区CDR1包括如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR2包括如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，轻链互补决定区CDR3包括如SEQ ID NO.55～74任意一项所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1～3任一项所述的鼠源抗LAG3的抗体、如权利要求4～7任一项所述的人源化抗LAG3抗体或如权利要求8所述的LAG3亲和力成熟变体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、肾肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌、非小细胞性肺癌或卵巢癌中的任意一种。
10.一种同时结合PD-1和LAG3的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括PD-1抗原结合位点和LAG3抗原结合位点；
其中，所述LAG3抗原结合位点为如权利要求4～7中任一项所述的人源化抗LAG3抗体或如权利要求8中所述的LAG3亲和力成熟变体中所包含的抗原结合位点。
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