CN116891530A - 双特异性抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种双特异性抗体及其应用，该抗体包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；所述单链抗体具有第二抗原结合活性；所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs‑into‑hole结构相连。所述抗体能有效抑制肿瘤生长，且降低细胞因子风暴的可能，具有较高的安全性。

Description

双特异性抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种双特异性抗体及其应用。更具体地，本发明涉及一种抗体、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途、检测试剂盒、制备试剂盒的用途以及使抗体具有差异抗原结合活性的方法。
背景技术
目前，恶性肿瘤免疫主流治疗手段有三类：治疗性抗体、免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor,ICIs)、细胞治疗。不同的治疗手段各有优缺点。
治疗性抗体上市的品种主要为治疗性单抗及单抗偶联物，该免疫导向治疗手段给肿瘤免疫治疗带来了突破性的成效。虽然单抗治疗显示出良好的治疗效果。但存在用药剂量大，部分患者易产生耐药性等不足。普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，其结合特异性相对较低，容易发生脱靶效应。
与单抗相比，在解决治疗效果不明显和给药剂量大等缺陷上，双特异性抗体(BispecificAntibody，BsAb)是一个具有显著优势的药物。双特异性抗体包含两种不同的结合特异性，可用于替代两种常规单克隆抗体以结合不同的表位。此外，双特异性抗体可以在其两个靶蛋白之间架桥并使它们靠近。这种特性为两种单特异性抗体的混合物无法实现的治疗应用提供了机会。
双特异性抗体虽然显示出巨大的治疗潜力，已开发成多种不同的形式，比如BiTE、Triomab、Crossmab等，但在其组装、稳定性、免疫原性、半衰期和药效学方面临着巨大的挑战。因此，需要进一步开发效能更佳的双特异性抗体。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
目前已有的双特异性抗体仍需在稳定性、半衰期、药效学、安全性等方面做进一步的改进。本申请中，发明人利用结合肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)及免疫细胞抗原的抗体进行双特异性抗体的构建和筛选，意外地获得了一种非对称结构的双特异性抗体，所述非对称结构的双特异性抗体具有合理的亲和力效价，其中，靶向TAA的抗体的亲和力高于靶向免疫细胞抗原的抗体的亲和力，此外，发明人在非对称结构中引入了Fc片段，并将其进行突变，经过验证后，本申请获得的非对称结构双特异性抗体可以同时靶向肿瘤细胞、激活免疫细胞，不仅能抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，有效减弱了抗TAA抗体的内化作用，安全性高，且具有较长的半衰期、错配概率降低、易于纯化。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体。根据本发明的实施例，所述抗体包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；所述单链抗体具有第二抗原结合活性；所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。根据本发明实施例的非对称结构双特异性抗体可以同时与肿瘤细胞、免疫细胞表面的抗原进行结合，不仅能有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前面所述的抗体。根据本发明实施例的核酸分子获得的抗体可以同时与肿瘤细胞、免疫细胞表面的抗原进行结合，不仅能有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前面所述的核酸分子。根据本发明实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的特异性同时识别肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原的抗体的表达，进而实现所述抗体的体外大量获得。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，表达载体或者能够表达前面所述的抗体。根据本发明实施例的重组细胞可用于前面所述的特异性识别肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原的抗体的体外表达和大量获得。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，含有前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞。如前所述，所述抗体，以及表达后能够获得所述抗体的核酸分子、表达载体或重组细胞不仅能够特异性的靶向结合肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原，有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高，因此，根据本发明实施例的包含所述抗体或表达所述抗体的相关物质的药物组合物同样能够有效抑制肿瘤细胞生长，并降低细胞因子风暴的可能，具有较长的半衰期和较高的安全性。
在本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防第一抗原和/或第二抗原相关性疾病，根据本发明的一些具体实施例，所述第一抗原与第二抗原相同或不同，优选地，所述第一抗原为肿瘤抗原或免疫细胞抗原，所述第二抗原为免疫细胞抗原；更优选的所述第一抗原为CD20或Claudin18.2，所述第二抗原为CD3。如前所述，所述抗体，以及表达后能够获得所述抗体的核酸分子、表达载体或重组细胞不仅能够特异性的靶向结合肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原，有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高，因此，根据本发明实施例的包含所述抗体或表达所述抗体的相关物质的药物组合物同样能够有效抑制肿瘤细胞生长，并降低细胞因子风暴的可能，具有较长的半衰期和较高的安全性。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种检测第一抗原和/或第二抗原的试剂盒，所述第一抗原和/或第二抗原如前面所限定的。根据本发明的实施例，包括前面所述的抗体。如前所述，本发明实施例的抗体能够有效与前面所述的第一抗原和/或第二抗原进行结合，因此，所述抗体可用于检测前面所述的第一抗原和/或第二抗原，进一步地，包含所述抗体的试剂盒可以有效检测所述第一抗原和/或第二抗原，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的所述第一抗原和/或第二抗原，更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用抗原和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。上述抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试第一抗原和/或第二抗原相关疾病。
在本发明的第八方面，本发明提出了前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测第一抗原和/或第二抗原或者诊断第一抗原和/或第二抗原相关的疾病，所述第一抗原和/或第二抗原如前面所限定的。如前所述，本发明实施例的抗体能够有效与前面所述的第一抗原和/或第二抗原进行结合，因此，所述抗体可用于检测前面所述的第一抗原和/或第二抗原，进一步地，包含所述抗体的试剂盒可以有效检测所述第一抗原和/或第二抗原，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的所述第一抗原和/或第二抗原，更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用抗原和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。上述抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试第一抗原和/或第二抗原相关疾病。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种使抗体具有差异抗原结合活性的方法。根据本发明的实施例，所述抗原包括第一抗原和第二抗原，所述抗体包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；所述单链抗体具有第二抗原结合活性；所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。根据本发明实施例的方法可以有效获得对所述第一抗原和第二抗原具有差异抗原结合活性的抗体，以获得目标亲和力的双特异性抗体，提高产品的药效和安全性。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的对称双特异性抗体的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的1的非对称双特异性抗体的结构示意图；
图3是根据本发明实施例2的ProteinA捕获对称双特异性抗体dHL1/2/3/4蛋白的SDSPAGE检测结果图；
图4是根据本发明实施例2的对称双特异性抗体dHL1分离7个峰样品SDS-PAGE检测结果图；
图5是根据本发明实施例3的非对称双特异性抗体纯化样品SDS-PAGE检测结果图；
图6是根据本发明实施例4的双特异性抗体热稳定性的检测结果图，其中，横坐标(Temperature)表示温度；
图7是根据本发明实施例6的双特异性抗体与jurkat细胞的亲和力检测结果图，其中，横坐标(Con nM)表示抗体浓度，纵坐标(Parent％)表示抗体所结合jurkat细胞的比例；
图8是根据本发明实施例的7的双特异性抗体与肿瘤细胞BXPC3的亲和力检测结果图，其中，横坐标(Con nM)表示抗体浓度，纵坐标(Parent％)表示抗体所结合肿瘤细胞BXPC3的比例；
图9是根据本发明实施例8的双特异性抗体介导的PBMC细胞杀伤肿瘤细胞BXPC3检测结果图；
图10是根据本发明实施例9的流式检测双特异性抗体的内化情况检测结果图，其中：
10-A表示m1B6、h1B6及其双特异性抗体的内化检测结果图，
10-B表示m1E7及其双特异性抗体的内化检测结果图；
图11是根据本发明实施例10的双特异性抗体在hCD34+人源化小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型中的抗肿瘤检测结果图，其中，横坐标(Days posttumor inoculation)表示接种肿瘤后的天数，纵坐标(TumorVolume)表示肿瘤体积；
图12是根据本发明实施例10采用双特异性抗体治疗后，hCD34+人源化小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型的体重变化结果图，其中，横坐标(Days post tumorinoculation)表示接种肿瘤后的天数，纵坐标(BodyWeight)表示体重。
图13是根据本发明实施例11的双特异性抗体在PBMC免疫重建B-NDG B2mKO plus小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型中的抗肿瘤检测结果图，其中，横坐标(Daysposttumor inoculation)表示接种肿瘤后的天数，纵坐标(TumorVolume)表示肿瘤体积；
图14是根据本发明实施例11采用双特异性抗体治疗后，hPBMC免疫重建B-NDGB2mKO plus小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型的体重变化结果图，其中，横坐标(Daysposttumor inoculation)表示接种肿瘤后的天数，纵坐标(BodyWeight)表示体重；
图15根据本发明实施例11采用双特异性抗体治疗后，hPBMC免疫重建B-NDG B2mKO plus小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型外周血免疫细胞分析检测结果图；
图16根据本发明实施例11采用双特异性抗体治疗后，hPBMC免疫重建B-NDG B2mKO plus小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型肿瘤组织TIL分型检测结果图；
图17-A给药后不同组别hPBMC-B-NDG B2m KO plus小鼠皮下接种NUGC4～18.2人胃癌模型的肿瘤体积变化；
图17-B给药后不同组别hPBMC-B-NDG B2m KO plus小鼠皮下接种NUGC4～18.2人胃癌模型的肿瘤重量变化；
图17-C给药后不同组别hPBMC-B-NDG B2m KO plus小鼠皮下接种NUGC4～18.2人胃癌模型的体重变化。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
如本文所用，术语“含有”“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“含有”“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的抗体可变区时，也旨在涵盖由该具体序列组成的抗体可变区。
定义和说明
本文所使用的术语“Claudin”，是决定细胞间紧密连接结构的最重要的骨架蛋白，其参与粘附连接，并且在肿瘤细胞的转移和侵袭中起到重要作用。Claudin蛋白广泛存在于哺乳动物上皮和内皮细胞中，其分布主要是上皮细胞侧面以及基底细胞质膜上。不同的Claudin蛋白在不同组织中具有各自特异性表达，其中Claudinl8基因定位于3q22.3，分子量24kDa,包含261个氨基酸残基，属Claudins超家族成员，其蛋白结构包含2个细胞外环和4个穿膜区。人Claudin18蛋白的两个亚型分别是Claudin18.1(UniProtID:P56856-1)，和Claudinl8.2(UniProtID:P56856-2)，在二者蛋白的一级结构序列中，仅N端信号肽至细胞外环l(Loop l)结构的某些位置的氨基酸残基上有所区别，尤其是在细胞外环1上，Claudin18.1和Claudin18.2仅8个氨基酸不同。Claudin18.2或其任何变体和同种型可以从天然表达它们的细胞或组织中分离，或者使用本领域熟知的技术和/或本文所述的那些技术重组产生。在一个实施方案中，本文所述的Claudin18.2是人Claudin18.2。
本文所用的术语“抗Claudin18.2抗体”或“结合Claudin18.2的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)Claudin18.2以致所述抗体可以用作靶向(人)Claudin18.2的治疗剂。
本文所使用的术语“CD3”指表达在T细胞上作为多分子T细胞受体(TCR)的部分的抗原。
抗体
本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH，H链恒定区包括CH1、CH2和CH3区。
可变性在整个抗体的可变区中并非均匀分布；它集中在重链可变区和轻链可变区中的每一个的子结构域中。这些子结构域称为“超变区”或“互补决定区”(CDR)。可变区的更保守的(即非超变)部分被称为“框架”(FR)区，并且为三维空间中的六个CDR提供支架以形成抗原结合表面。天然存在的抗体重链和轻链的可变区各自包含主要采用β-折叠构型的四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)。与CDR一起，它们在可变重链或轻链内形成以下序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。每条链中的超变区通过框架区紧密靠近在一起，并通常与来自另一条链的超变区一起有助于抗原结合位点的形成。
术语“CDR”及其复数“CDR”是指其中三个构成轻链可变区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)的结合特征并且三个构成重链可变区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的结合特征的互补决定区。CDR包含大多数负责抗体(或抗体构建体或结合结构域)与抗原的特异性相互作用的残基，并且因此有助于抗体分子的功能活性：它们是抗原特异性的主要决定因素。
CDR边界和长度的准确定义受制于不同的分类和编号系统。因此，CDR可以通过Kabat、Chothia、Contact或任何其他边界定义(包括本文所述的编号系统)来引用。尽管有不同的边界，但这些系统中的每一者在构成可变序列内所谓的“超变区”的方面具有一定程度的重叠。因此，根据这些系统的CDR定义可以在相对于相邻框架区的长度和边界区域中不同。参见例如基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883,基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人，Sequences ofProteinsofImmunological Interest,第4版，U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes ofHealth(1987))。
除非另有说明，否则在本发明中，术语“CDR”或“CDR序列”涵盖以上述任一种方式确定的CDR序列。
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的CDR的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体CDR序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体CDR序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的CDR边界与本发明所定义的具体CDR边界不同，均在本发明的保护范围内。
双特异性的抗体，即所述抗体包含至少第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域结合一种靶标或抗原且所述第二结合结构域结合另一抗原或靶标。双特异性抗体形式包含IgG样和非IgG样抗体(Fan等人(2015)Journal ofHematology&Oncology.8:130)。最常见的IgG样抗体类型包含两个Fab区域和一个Fc区域，每个Fab的重链和轻链可以来自单独的单克隆抗体。非IgG样双特异性抗体缺乏Fc区域，其每一个抗原或靶标结合结构域可以是Fab,也可以是单链可变片段(scFv),还可以是模拟两种抗体的可变结构域的融合蛋白，不同的结合结构域通过连接肽、化学偶联、非共价键连接或者其他方式连接到一起。这些形式包含双特异性T-细胞衔接子(BiTE)。可以使用任何双特异性抗体形式或技术来制备本发明的双特异性抗体。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段可以与如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段等一种或多种其它分子实体功能性连结(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)，以产生双特异性抗体。
本申请中，所述“Knobs-into-hole结构”是通过Knobs-into-hole技术获得的，所述Knobs-into-hole技术是将抗体的一条重链恒定区体积较小的氨基酸突变为体积较大的氨基酸，形成突出的“Knobs”型结构；同时将抗体的另一条重链恒定区体积较大的氨基酸突变成体积较小氨基酸，形成凹陷的“holes”型结构；利用形成的“Knobs-into-holes”结构实现两条抗体重链间的组装。
在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；所述单链抗体具有第二抗原结合活性；所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。根据本发明实施例的非对称结构双特异性抗体可以同时与肿瘤细胞、免疫细胞表面的抗原进行结合，不仅能有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高。
在本申请中，所述IgG4的Fc片段的氨基酸编号为根据EU编号系统编号，例如，所述“S354C”是指按EU编号系统编号第354位的丝氨酸被半胱氨酸替代。
在本申请中，回复突变(reverse mutation/backmutation)是指突变体(mutant)经过第二次突变又完全地或部分地恢复为原来的基因型和表现型。例如，本申请双特异性抗体中，其中一个肽链的Fc具有H435R，Y436F突变，经过回复突变后(R435H,F436Y)，435位和436位又变成野生型。发明人惊奇的发现，H435R，Y436F突变并没有明显改善错配现象，而是显著改善了双抗的多聚体，提高了单体分子占比。
本申请中m1B6表示鼠源1B6抗体，m1E7表示鼠源1E7抗体，h1B6表示人源1B6抗体，且1B6抗体和1E7抗体均为Claudin18.2抗体，所述人源1B6抗体是指将所述m1B6抗体的框架区(FR区)和恒定区替换为人源获得的。
根据本发明的一些具体实施方案，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述单链抗体的C端与所述第二铰链区的N端相连，所述第二铰链区的C端与所述第二Fc区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区，所述第二重链可变区的C端与所述第二轻链可变区的N端相连，所述第二轻链可变区的C端与所述所第二铰链区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区，所述第二轻链可变区的C端与所述第二重链可变区的N端相连，所述第二重链可变区的C端与所述所第二铰链区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述单链抗体进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述第二重链可变区和第二轻链可变区之间。
根据本发明的一些具体实施方案，所述连接肽的N端与所述第二重链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二轻链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述连接肽的N端与所述第二轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二重链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述连接肽是GS连接肽，在一些具体实施方案中，所述连接肽包含如SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQID NO:96所示的氨基酸序列，其中，n为不小于1的整数，优选地，n为2、3、4或5。
(GGGGS)n(SEQ ID NO:92)。
VEGGSGGSGGSGGSGGVD(SEQ ID NO:93)。
(GS)n(SEQ ID NO:94)。
(GGGS)n(SEQ ID NO:95)。
(GGS)n(SEQ ID NO:96)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一抗原与第二抗原相同或不同。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一抗原为肿瘤抗原或免疫细胞抗原，所述第二抗原为免疫细胞抗原。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一抗原为CD20或Claudin18.2，所述第二抗原为CD3。
根据本发明的一些具体实施方案，所述Knobs-into-hole结构是通过如下方式实现的：第一Fc区包含S354C，T366W突变，第二Fc区包含Y349C，T366S，L368A，Y407V突变。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二Fc区进一步包含H435R，Y436F突变。为解决错配问题，提高纯度降低多聚体，通过Knobs-into-holes(KiH)技术同时引入两个突变位点(H435R和Y436F)。KiH技术是在两种重链上引入不同的突变，使得同种重链无法配对，而异种重链可很好地配对。另外，在其中一个重链则引入两个突变(H435R和Y436F)，可很好地降低多聚体占比，提高单体分子占比。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一Fc区和第二Fc区进一步包含S228P、F234A、L235A、R409K、K447缺失突变。其中，L234A，L235A位点可以减少细胞毒作用，S228P，R409K可以避免Fab-arm-exchange提高稳定性，K447缺失突变可以减少异质体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一Fc区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ IDNO:1)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二Fc区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG(SEQID NO:2)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG4或IgG1，或，IgG4或IgG1的突变体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:5、6和7或者与SEQ ID NO:5、6和7具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或分别如SEQ ID NO:8、9和10或者与SEQ ID NO:8、9和10具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或分别如SEQ ID NO:11、12和13或者与SEQ ID NO:11、12和13具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或分别如SEQ ID NO:14、15和16或者与SEQ ID NO:14、15和16具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
SYNMH(SEQ ID NO:5)。
AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:6)。
STYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:7)。
DYNMH(SEQ ID NO:8)。
YINPNNGGTSYNQKFKG(SEQ ID NO:9)。
TRYLAV(SEQ ID NO:10)。
SYWMH(SEQ ID NO:11)。
MIHPNSGSTNYNEKFKS(SEQ ID NO:12)。
RYYGSISPDY(SEQ ID NO:13)。
DYNMH(SEQ ID NO:14)。
YINPNNGGTSYNQKFQG(SEQ ID NO:15)。
TRYLAV(SEQ ID NO:16)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:17、18和19或者与SEQ ID NO:17、18和19具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:20、21和22或者与SEQ ID NO:20、21和22具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:23、24和25或者与SEQ ID NO:23、24和25具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:26、27和28或者与SEQ ID NO:26、27和28具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
RASSSVSYIH(SEQ ID NO:17)。
ATSNLAS(SEQ ID NO:18)。
QQWTSNPPT(SEQ ID NO:19)。
KSSQSLFNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:20)。
WASTRES(SEQ ID NO:21)。
QNDYSYPLT(SEQ ID NO:22)。
KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:23)。
WASTRES(SEQ ID NO:24)。
QNDYSYPFT(SEQ ID NO:25)。
RSSQSLFNSGNQKNYLT(SEQ ID NO:26)。
WASTRES(SEQ ID NO:27)。
QNDYSYPLT(SEQ ID NO:28)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:5、6和7或者与SEQ ID NO:5、6和7具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:17、18和19或者与SEQ IDNO:17、18和19具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:8、9和10或者与SEQ ID NO:8、9和10具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:20、21和22或者与SEQ ID NO:20、21和22具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:11、12和13或者与SEQ ID NO:11、12和13具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:23、24和25或者与SEQ ID NO:23、24和25具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:14、15和16或者与SEQID NO:14、15和16具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:26、27和28或者与SEQ ID NO:26、27和28具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二重链可变区包括分别如SEQ ID NO:29、30和31或者与SEQ ID NO:29、30和31具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
RYTMH(SEQ ID NO:29)。
YINPSRGYTNYNQKFKD(SEQ ID NO:30)。
YYDDHYCLDY(SEQ ID NO:31)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:32、33和34或者与SEQ ID NO:32、33和34具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第二轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:87、88和89或者与SEQ ID NO:87、88和89具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
SASSSVSYMN(SEQ ID NO:32)。
DTSKLAS(SEQ ID NO:33)。
QQWSSNPFT(SEQ ID NO:34)。
RASSSVSYMN(SEQ ID NO:87)。
DTSKVAS(SEQ ID NO:88)。
QQWSSNPLT(SEQ ID NO:89)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二重链可变区包括分别如SEQ ID NO:29、30和31或者与SEQ ID NO:29、30和31具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第二轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:32、33和34或者与SEQ ID NO:32、33和34具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或所述第二重链可变区包括分别如SEQ ID NO:29、30和31或者与SEQ ID NO:29、30和31具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和所述第二轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:87、88和89或者与SEQ ID NO:87、88和89具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。根据本发明的一些具体实施方案，所述第一铰链区与所述第二铰链区相同或不同。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一铰链区与所述第二铰链区包含SEQ IDNO:35所示的氨基酸序列。
ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:35)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一重链可变区包含SEQ ID NO:36～39任一项所示的氨基酸序列。
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQK FKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA(SEQ ID NO:36)。
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQK FKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSA(SEQ ID NO:37)。
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEK FKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSA(SEQ ID NO:38)。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNGGTSYNQ KFQGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVTTRYLAVWGQGTTVTVSSA(SEQ ID NO:39)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一轻链可变区包含SEQ ID NO:40～43任一项所示的氨基酸序列。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVA(SEQ ID NO:40)。
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP DRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRTVA(SEQ ID NO:41)。
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVP DRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVA(SEQ ID NO:42)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYSYPLTFGGGTKLEIKRTVA(SEQ ID NO:43)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二重链可变区包含SEQ ID NO:44或45所示的氨基酸序列。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQK FKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:44)。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKF KDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:45)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二轻链可变区包含SEQ ID NO:46或47所示的氨基酸序列。
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSG SGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN(SEQ ID NO:46)。
DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSG SGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:47)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述单链抗体包含SEQ ID NO:48～50任一项所示的氨基酸序列。
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:48)。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:49)。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN(SEQ ID NO:50)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一肽链包含SEQ ID NO:51～54任一项所示的氨基酸序列。
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:51)。
EVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYTFTDYNMHWVKQSHGKSLEWIGYINPNNGGTSYNQKFKGKATLTVNKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCVTTRYLAVWGTGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ IDNO:52)。
QVQLQQPGSELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIHPNSGSTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRYYGSISPDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQID NO:53)。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQRLEWMGYINPNNGGTSYNQKFQGRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCVTTRYLAVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ IDNO:54)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第二肽链包含SEQ ID NO:55～58任一项所示的氨基酸序列。
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:55)。
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYFCQNDYSYPLTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:56)。
DIVMTQSPSSLSVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:57)。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLFNSGNQKNYLTWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNDYSYPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:58)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述第三肽链包含SEQ ID NO:59～61、SEQ IDNO:91任一项所示的氨基酸序列。
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:59)。
DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:60)。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:61)。
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:91)
核酸分子、表达载体、重组细胞
在一些实施方案中，本发明提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的抗体。根据本发明实施例的核酸分子获得的抗体可以同时与肿瘤细胞、免疫细胞表面的抗原进行结合，不仅能有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高。
根据本发明的一些具体实施方案，上述核酸分子还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子包含SEQ ID NO:62～72任一项所示的核苷酸序列。
CAGGTACAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACATTTACCAGTTACAATATGCACTGGGTAAAACAGACACCTGGTCGGGGCCTGGAATGGATTGGAGCTATTTATCCCGGAAATGGTGATACTTCCTACAATCAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCGACTTACTACGGCGGTGACTGGTACTTCAATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCTGCAGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCTGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTATGGTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTCCGG(SEQID NO:62)。
GAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGACCTGAGCTGGTGCGGCCTGGCGCCTCCGTGAAGATGTC
CTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTCAAGCAGTCTCACGGCAA
AAGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAACCCCAACAACGGCGGAACATCTTATAATCAAAAGTTCAA
GGGCAAGGCTACCCTCACCGTGAACAAGTCCTCCTCTACCGCCTACATGGAACTGAGATCCCTGAC
CTCCGAGGATTCTGCCGTGTACTACTGTGTGACCACCAGATACCTGGCTGTGTGGGGCACCGGCAC
AACCGTGACAGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCC
GGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTA
CCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCT
CCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACAC
TTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGA
CCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCA
AACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCC
AAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACC
AAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCA
AGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCG
AGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCTGC
CAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTATGGTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGAC
ATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTG
GACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGC
AACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:63)。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGATCTGAGCTGGTGAAACCTGGCGCTTCCGTGAAGCTGTC
CTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCTCTTATTGGATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCAGGACA
GGGCCTGGAATGGATCGGCATGATCCACCCCAACTCCGGCTCCACCAACTACAACGAGAAGTTCAA
GTCCAAGGCTACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCTCTACCGCCTACATGCAGCTCTCTTCTCTGAC
CTCCGAGGATTCTGCCGTGTACTACTGTGCCAGAAGATACTACGGCTCCATCTCCCCTGACTACTGG
GGCCAGGGCACCACACTGACAGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGC
TCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCC
CGAACCCGTTACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGT
GCTCCAGTCCTCCGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACC
AAGACCTACACTTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGT
CCAAGTACGGACCTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCC
TCTTCCCCCCCAAACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGG
TGGACGTGTCCCAAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCAC
AACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCAC
CGTGCTGCATCAAGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGC
CCAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACA
CTGCCCCCCTGCCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTATGGTGTTTAGTGAAGGGCTTC
TACCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACC
CCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTT
GGCAAGAAGGCAACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:64)。
CAAGTGCAACTAGTGCAAAGTGGTGCAGAAGTTAAGAAGCCCGGCGCTTCCGTGAAAGTGTC
CTGCAAGGCCTCTGGCTACACCTTCACCGACTACAACATGCACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCA
GCGGCTGGAGTGGATGGGCTACATCAACCCTAACAACGGCGGAACCAGCTATAATCAGAAGTTCCA
GGGCAGAGTGACAATCACCGTGGACACCTCTGCCTCCACCGCCTACATGGAACTGTCCTCTCTGAG
ATCCGAGGATACCGCTGTGTACTACTGTGTGACCACCAGATACCTGGCCGTGTGGGGCCAAGGAAC
AACAGTCACCGTGTCTAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGTAGCCG
GTCCACCTCCGAGTCCACAGCTGCTCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAACCCGTTAC
CGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTTTAACCTCCGGAGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTCCAGTCCTC
CGGTTTATACTCTTTATCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAGCCTCGGCACCAAGACCTACACT
TGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGAC
CTCCTTGTCCCCCTTGCCCCGCCCCCGAGGCCGCTGGCGGACCCTCCGTGTTCCTCTTCCCCCCCA
AACCCAAGGACACTTTAATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACTTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCC
AAGAAGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACC
AAGCCTAGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTCACCGTGCTGCATCA
AGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGGACTGCCCAGCTCCATCG
AGAAGACCATCAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCCGGGAACCTCAAGTTTATACACTGCCCCCCTGC
CAAGAAGAGATGACCAAGAACCAAGTTTCTTTATGGTGTTTAGTGAAGGGCTTCTACCCTAGCGAC
ATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAAAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTG
GACTCCGATGGTTCTTTTTTTTTATACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTTGGCAAGAAGGC
AACGTGTTCTCTTGTAGCGTGATGCACGAGGCTTTACACAACCACTACACCCAGAAGTCTTTATCTCTGTCTTTAGGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:65)。
CAAATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCCTGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACAATGACTTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATGCCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACTTCTTACTCTCTCACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAACGGACCGTGGCTGCCCCCTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTTTACTGAACAACTTCTACCCTCGTGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCTTTACAGTCCGGCAACTCCCAAGAATCCGTGACCGAGCAAGATTCCAAGGACTCCACCTACTCTTTATCCTCCACTTTAACTTTATCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCTTGTGAGGTGACCCATCAAGGTTTATCCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATCGTGGCGAGTGCTGATGAGAATTC(SEQ ID NO:66)。
GACATCGTGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGACCGTGACCGCCGGCGAGAAGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCTCTCAGAGCCTGTTCAACAGCGGCAATCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCAAGCACAAGAGAGAGCGGCGTGCCTGACAGATTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAAGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTTCTGTCAGAACGACTACAGCTACCCTCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGCTGAGAAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC(SEQ ID NO:67)。
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCTCTGTCCGTCACCGCTGGCGAGAAGGTGACCATG
TCCTGCAAGTCCTCTCAAAGCCTGCTCAATTCTGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAG
CAGAAACCTGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCTTCTACCAGAGAGTCCGGAGTGCCT
GATCGGTTCACCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACAATCTCCTCCGTGCAGGCCGAG
GACCTGGCCGTGTACTACTGTCAGAACGACTACTCCTATCCCTTTACCTTCGGCTCCGGCACCAAGC
TGGAAATCAAGAGGACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTG
AAGAGCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCCAAGGTGCA
GTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAG
CAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAC
AAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACAGGGGCGAGTGC(SEQ ID NO:68)。
GATATCCAAATGACTCAAAGTCCAAGTAGTCTGTCTGCTTCCGTGGGCGACAGAGTGACCATC
ACCTGTCGGTCCAGCCAATCTCTGTTCAACTCCGGCAACCAGAAAAATTACCTGACCTGGTACCAG
CAGAAGCCTGGCAAGGCCCCAAAGCTGCTGATCTACTGGGCTTCTACCAGAGAGTCTGGCGTGCC
CAGCCGGTTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACAGATTTCACCCTCACAATCTCCTCCCTGCAGCCTGA
GGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAACGACTACTCCTATCCTCTGACCTTTGGAGGCGGAACCAA
GCTGGAAATCAAGAGGACCGTGGCTGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCTCCTAGCGACGAGCAGCT
GAAGAGCGGCACCGCTAGCGTGGTGTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGGGAGGCCAAGGTGC
AGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGAGCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCC
AAGGACAGCACCTACTCCCTGAGCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCTGATTATGAGAAGCACAA
GGTGTATGCTTGCGAGGTGACACACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC(SEQ ID NO:69)。
CAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCATCATGTCTGCCTCTCCCGGCGAGAAGGTTACCATGA
CCTGTTCCGCCTCTTCCTCTGTCTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCTGGCACATCCCCTAA
GAGATGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCTTCCGGTGTGCCCGCTCACTTCAGAGGATCTGGCAG
CGGCACCTCTTACAGCCTGACAATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCA
GCAGTGGTCCTCGAATCCTTTCACCTTTGGCTCCGGCACCAAACTCGAGATCAACGGCGGCGGCGG
CAGCGGAGGAGGAGGCTCTGGCGGCGGCGGATCCCAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAA
CTGGCCCGGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACCAGATATA
CCATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAACCCCTCTA
GAGGCTACACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGTCCTCT
AGCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGA
TACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACAACCCTGACCGTGTCCTCCGA
GTCTAAGTACGGCCCACCTTGTCCCCCATGTCCTGCTCCTGAGGCCGCTGGCGGCCCTAGCGTGTT
CCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACACTGATGATCTCCAGAACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGT
GGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAAGTGCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGC
ACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACGTATCGGGTGGTGTCTGTGCTG
ACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCC
TGCCTTCTTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAAGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTGC
ACCCTTCCACCATCTCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTCTGAGCTGCGCTGTGAAGGG
CTTCTACCCTTCGGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAAA
CCACCCCTCCTGTGCTCGACTCTGATGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAACTGACCGTGGATAAGTC
CCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCGCTTTACACAGAAATCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCTGATAAGAATTC(SEQ ID NO:70)。
GACATCAAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGCTAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGAG
CTGCAAGACAAGCGGCTACACCTTCACAAGATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGACCTGGCC
AAGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCTAGCCGCGGCTACACCAACTACAATCAGAAGTTCA
AGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCT
GACAAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCTAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTA
TTGGGGACAAGGAACCACACTGACCGTGAGCAGCGTCGAGGGCGGCAGCGGAGGCAGCGGAGGC
AGCGGAGGCAGCGGCGGCGTCGACGACATTCAGCTGACACAGAGCCCTGCCATCATGAGCGCTAG
CCCTGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCAGAGCTAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTATC
AGCAGAAGAGCGGAACAAGCCCTAAGAGATGGATCTACGACACAAGCAAGGTGGCTAGCGGCGT
GCCTTACAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACAAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGCATGGAGG
CCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGTCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTCTGACCTTCGGCGCCGGC
ACCAAGCTGGAGCTGAAGGAGTCTAAGTACGGCCCACCTTGTCCCCCATGTCCTGCTCCTGAGGCC
GCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACACTGATGATCTCCAGAACC
CCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAAGTGCAGTTTAATTGGTAC
GTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACGT
ATCGGGTGGTGTCTGTGCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAAGAGTACAAGTGC
AAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAAGGCCAGCC
TCGGGAGCCTCAGGTGTGCACCCTTCCACCATCTCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCTC
TGAGCTGCGCTGTGAAGGGCTTCTACCCTTCGGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGCCAG
CCTGAGAACAACTACAAAACCACCCCTCCTGTGCTCGACTCTGATGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCC
AAACTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCGCTTTACACAGAAATCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCTGATAA(SEQ ID NO:71)。
CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAACTGGCCCGGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTC
CTGCAAGGCTTCTGGCTATACCTTCACCAGATATACCATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGACA
GGGCCTGGAATGGATCGGCTACATCAACCCCTCTAGAGGCTACACTAACTACAACCAGAAGTTCAA
GGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGTCCTCTAGCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGA
CCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGATACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTG
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CCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCGCTTTACACAGAAATCCCTGTCCCTGTCTCTGGGCTGATAAGAATTC(SEQ ID NO:72)。
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子包含SEQ ID NO:62～65任一项所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:66～69任一项所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:70～72任一项所示的核苷酸序列。
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子包含SEQ ID NO:62所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:66所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列；或SEQ IDNO:63所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO:64所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:68所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列；或SEQ ID NO:65所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列；或SEQ IDNO:65所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列，和，SEQ ID NO:72所示的核苷酸序列。
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在一些实施方案中，本发明提出了一种表达载体，携带前面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的所述核酸分子，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的同时特异性识别肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原的抗体的表达，进而实现所述抗体的体外大量获得。
根据本发明的一些具体实施方案，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。进而实现前面所述抗体在合适受体细胞中的表达，如CHO细胞。
在一些实施方案中，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带前面所述的核酸分子，表达载体或者能够表达前面所述的抗体。根据本发明实施例的重组细胞在适合条件下可用于前面所述的特异性识别肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原的抗体的体外表达和大量获得。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重组细胞是通过将权前面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的一些具体实施方案，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
根据本发明的一些具体实施方案，所述宿主细胞为大肠杆菌或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，人胚胎肾细胞(HEK293)。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为原核细胞或真核细胞，所述重组细胞不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
药物组合物、试剂盒及制药用途和在制备试剂盒中的用途
在一些实施方案中，本发明提出了一种药物组合物，含有前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞。如前所述，所述抗体，以及表达后能够获得所述核酸分子、表达载体或重组细胞表达的抗体不仅能够特异性的靶向结合肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原，有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高，因此，根据本发明实施例的包含所述抗体或表达所述抗体的相关物质的药物组合物同样能够有效抑制肿瘤细胞生长，并降低细胞因子风暴的可能，具有较长的半衰期和较高的安全性。
在一些实施例中，这些药物组合物进一步包括药学上可接受的载体，包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、或其他液体赋形剂、分散剂、矫味剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、助流剂或润滑剂，等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
例如，本发明的抗体可掺入适用于胃肠外施用(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射或肌肉内或皮下注射来施用。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在一些实施方案中，本发明提出了前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或者预防第一抗原和/或第二抗原相关性疾病，所述第一抗原和/或第二抗原如前面所限定的。如前所述，所述抗体，以及所述核酸分子、表达载体或重组细胞表达获得的抗体不仅能够特异性的靶向结合肿瘤细胞、免疫细胞表面抗原，有效抑制肿瘤细胞生长，并且释放的细胞因子较少，有效降低了细胞因子风暴的可能，减弱了抗TAA抗体的内化作用，具有较长的半衰期、结构稳定，且安全性较高，因此，根据本发明实施例的包含所述抗体或表达所述抗体的相关物质的药物组合物同样能够有效抑制肿瘤细胞生长，并降低细胞因子风暴的可能，具有较长的半衰期和较高的安全性。
根据本发明的一些具体实施方案，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述第一抗原相关性疾病为癌症。
根据本发明的一些具体实施方案，所述癌症包括：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和直肠癌中的至少之一。
在一些实施方案中，本发明提出了一种检测第一抗原和/或第二抗原的试剂盒，所述第一抗原和/或第二抗原如前面所限定的。根据本发明的一些具体实施方案，包括前面所述的抗体。如前所述，本发明实施例的抗体能够有效与前面所述的第一抗原和/或第二抗原进行结合，因此，所述抗体可用于检测前面所述的第一抗原和/或第二抗原，进一步地，包含所述抗体的试剂盒可以有效检测所述第一抗原和/或第二抗原，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的所述第一抗原和/或第二抗原，更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用抗原和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。上述抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试第一抗原和/或第二抗原相关疾病。
在一些实施方案中，本发明提出了前面所述的抗体，核酸分子，表达载体或重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测第一抗原和/或第二抗原或者诊断第一抗原和/或第二抗原相关的疾病，所述第一抗原和/或第二抗原如前面所限定的。如前所述，本发明实施例的抗体能够有效与前面所述的第一抗原和/或第二抗原进行结合，因此，所述抗体可用于检测前面所述的第一抗原和/或第二抗原，进一步地，包含所述抗体的试剂盒可以有效检测所述第一抗原和/或第二抗原，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的所述第一抗原和/或第二抗原，更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用抗原和抗体特异性结合性能来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。所述抗体可以与任何检测试剂或治疗制剂联用，例如与诊断性核素、纳米材料等联合使用，通过核素的放射性对靶标部位进行探测，进而获取靶标部位的信息；也可以与治疗性核素联用，利用核素的放射性，特异性杀伤靶标细胞、组织等。
方法
在一些实施方案中，本发明提出了一种使抗体具有差异抗原结合活性的方法，所述抗原包括第一抗原和第二抗原，所述抗体包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；所述单链抗体具有第二抗原结合活性；所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。根据本发明实施例的方法可以有效获得对所述第一抗原和第二抗原具有差异抗原结合活性的抗体，以获得目标亲和力的双特异性抗体，提高产品的药效和安全性。根据本发明的一些具体实施例，发明人通过上述方法使得CD3抗体的亲和力低于anti-TAA抗体(Claudin18.2抗体)，在一定程度上降低了CD3分子结合TCR\CD3 complex引起二聚化介导的T细胞激活风险，提高了产品的安全性和抗肿瘤效果。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1表达载体构建
本申请将能够结合TAA的抗体(Claudin18.2抗体或CD20)的Fab片段、IgG4的Fc区、CD3单链抗体进行多种方式的组合，以获得目标的双特异性抗体，其中，发明人构建了对称和非对称结构的双特异性抗体，具体结构设计如下：
(1)对称结构的双特异性抗体：具体构成如图1所示，在CD20抗体轻链的C端通过1-3个不同长度的(GGGGS)与4种CD3单链抗体CD3-SCFV1、CD3-SCFV2、CD3-SCFV3、CD3-SCFV4连接，通过铰链区将CD20抗体重链的Fab区与IgG4的Fc变体进行连接，对称结构的双特异性抗体表示为[Fab-ScFv-Fc(IgG4)]x[Fab-ScFv-Fc(IgG4)]，获得的对称结构双特异性抗体为dHL1、dHL2、dHL3、dHL4，其具体的氨基酸序列及编码所述对称结构双特异性抗体的核苷酸序列如表1所示。
(2)非对称结构的双特异性抗体：具体构成如图2所示，将能够结合TAA的抗体CD20、m1B6、m1E7、h1B6的Fab片段以及上述不同的CD3单链抗体、CD3-SCFV5或CD3-SCFV6分别通过铰链区与突变后IgG4的Fc区进行连接形成融合蛋白；Fc区的突变利用KiH技术和抗体工程技术进行，以实现非对称性结构工艺的可行性，其中，Fc的突变位点包括：1)促进重链异源二聚化(KiH)：CH3 domain a(knobs)：S354C，T366W；CH3 domainb(holes)：Y349C，T366S，L368A，Y407V。2)改善多聚体，提高单体分子占比作用：CH3 domainb(holes)：H435R，Y436F；3)减少细胞毒作用：L234A，L235A；避免Fab-arm-exchange；4)提高稳定性：S228P，R409K；5)减少异质体：K447缺失。BsAb的结构可表示为[Fab-mutFc(IgG4)]x[ScFv-mutFc(IgG4)]，获得的非对称结构的双特异性抗体为：KCD3×CD20、KCD3×m1B6、KCD3×m1E7、KCD3×h1B6、KCD3HL×h1B6、KCD3HL2×h1B6、KCD3HL2×h1B6-R435H/F436Y(点回复突变)。
本实施例委托广州艾基生物技术有限公司合成表1所示的编码对称和非对称结构的双特异性抗体的轻链和重链，以及其它对照组抗体，在37℃条件下，利用内切酶HindⅢ和EcoRⅠ(TAKARA，Japan)消化处理目的基因序列和载体质粒pcDNA3.4，采用Gel ExtractionKit试剂盒按厂商说明纯化回收消化产物。利用DNALigation KitVer.2.1(TAKARA，Japan)按厂商说明将纯化回收的目的基因和载体连接，16℃恒温处理1小时，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到感受态细胞DH5a中，取菌体涂布氨苄平板。挑取平板上的单克隆于1mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L和琼脂2％，抗生素含量100μg/mL)中培养后提取质粒，经广州艾基生物技术有限公司测序验证正确，采用Invitrogen质粒大提试剂盒提取一系列经验证正确的表达载体，用限制性内切酶PvuⅠ酶切(TAKARA，Japan)，进行线性化后利用乙醇沉淀方法纯化回收，-20℃保藏备用。
表1：
/>
/>
备注：dHL1～dHL4是对称结构的双特异性抗体。
编码D1-H的核苷酸序列：
CAAGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGCGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCTGTTAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCTCTTACAACATGCACTGGGTCAAGCAGACCCCAGGCAGAGGCCTGGAATGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGTGATACATCCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGTCTAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTCTCACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCTACCTACTACGGAGGCGACTGGTACTTTAACGTGTGGGGCGCTGGAACAACGGTGACCGTCAGCGCCGCCTCCACCAAGGGCCCAAGTGTGTTCCCTCTGGCCCCATGCTCCCGCTCCACATCTGAGTCCACCGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCTGTCACAGTGTCTTGGAACTCTGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCTGCCGTTCTGCAGTCCTCTGGACTGTACTCTCTGTCCTCTGTGGTGACCGTGCCTTCTTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAATGTGGACCACAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGATAAGAGAGTGGAATCTAAGTACGGCCCCCCCTGCCCTCCTTGTCCTGTCCTGAAGCCGCTGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGACACTCTGATGATCAGCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCTCAAGAAGATCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAAGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACATACAGAGTGGTCTCTGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAACCTCAGGTTTATACCCTGCCTCCTTCTCAAGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCTCTGACATCGCCGTCGAGTGGGAGTCAAATGGACAGCCTGAGAACAACTACAAAACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCTTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCATTACACCCAGAAAAGCCTGTCCCTGTCCCTCGGA(SEQ ID NO:73)。
编码D1-L的核苷酸序列：
CAGATTGTCCTGTCCCAGTCTCCTGCTATCCTGTCCGCATCCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACATGCAGAGCCTCCAGCTCCGTGTCCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCTCCAGCCCTAAGCCATGGATCTATGCCACCTCCAACCTGGCTAGCGGAGTGCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGGGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTATTGCCAGCAGTGGACCAGCAATCCCCCTACATTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCACCCTCTGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAGTCTGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGATAGCACCTATTCTCTGTCTTCCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACACATCAGGGCCTGAGCTCTCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGCGGCGAGTGTGGATCCGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCTATCATGTCCGCTAGCCCTGGAGAAAAAGTGACCATGACATGCTCTGCCTCTTCTTCCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGTCTGGCACATCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTCGGGGCTCTGGCTCCGGCACAAGCTATTCTCTGACCATCTCTGGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTTTCACATTTGGCTCCGGTACTAAGCTGGAGATCAATGGCGGCGGCGGCTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGAGCTGAGCTGGCTAGGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGAGCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGGTATACCATGCATTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTATAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCCACACTGACCACCGATAAGTCTTCCAGCACCGCTTACATGCAGCTGTCTTCCCTGACAAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTATTACGATGACCATTACTGTCTGGATTACTGGGGGCAGGGCACAACTCTGACCGTGTCCTCTTGATGAGAATTCCGG(SEQ ID NO:74)。
编码D2-L的核苷酸序列：
CAGATTGTCCTGTCCCAGTCTCCTGCTATCCTGTCCGCATCCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACATGCAGAGCCTCCAGCTCCGTGTCCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCTCCAGCCCTAAGCCATGGATCTATGCCACCTCCAACCTGGCTAGCGGAGTGCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGGGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTATTGCCAGCAGTGGACCAGCAATCCCCCTACATTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCACCCTCTGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAGTCTGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGATAGCACCTATTCTCTGTCTTCCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACACATCAGGGCCTGAGCTCTCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGCGGCGAGTGTGGATCCGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCTATCATGTCCGCTAGCCCTGGAGAAAAAGTGACCATGACATGCTCTGCCTCTTCTTCCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGTCTGGCACATCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTCGGGGCTCTGGCTCCGGCACAAGCTATTCTCTGACCATCTCTGGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTTTCACATTTGGCTCCGGTACTAAGCTGGAGATCAATGGAGGAGGAGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGAGCTGAGCTGGCTAGGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGAGCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGGTATACCATGCATTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTATAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCCACACTGACCACCGATAAGTCTTCCAGCACCGCTTACATGCAGCTGTCTTCCCTGACAAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTATTACGATGACCATTACTGTCTGGATTACTGGGGGCAGGGCACAACTCTGACCGTGTCCTCTTGATGAGAATTCCGG(SEQ ID NO:75)。
编码D3-L的核苷酸序列：
CAGATTGTCCTGTCCCAGTCTCCTGCTATCCTGTCCGCATCCCCCGGCGAGAAGGTGACCATGACATGCAGAGCCTCCAGCTCCGTGTCCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCTCCAGCCCTAAGCCATGGATCTATGCCACCTCCAACCTGGCTAGCGGAGTGCCCGTGAGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCAGCTACTCTCTGACAATCTCCAGGGTGGAGGCTGAGGACGCTGCTACCTACTATTGCCAGCAGTGGACCAGCAATCCCCCTACATTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCCGCTCCAAGCGTGTTCATCTTTCCACCCTCTGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCTTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCTCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAGTCTGTGACAGAGCAGGACTCCAAGGATAGCACCTATTCTCTGTCTTCCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTATGCTTGCGAGGTGACACATCAGGGCCTGAGCTCTCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGCGGCGAGTGTGGATCCGGAGGCAGCGGAGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCAGCTATCATGTCCGCTAGCCCTGGAGAAAAAGTGACCATGACATGCTCTGCCTCTTCTTCCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAGCAGAAGTCTGGCACATCCCCTAAGAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTCGGGGCTCTGGCTCCGGCACAAGCTATTCTCTGACCATCTCTGGCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGTCCAGCAACCCTTTCACATTTGGCTCCGGTACTAAGCTGGAGATCAATGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGCAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGAGCTGAGCTGGCTAGGCCAGGAGCCTCCGTGAAGATGAGCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACAAGGTATACCATGCATTGGGTGAAGCAGCGGCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTATAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCCACACTGACCACCGATAAGTCTTCCAGCACCGCTTACATGCAGCTGTCTTCCCTGACAAGCGAGGACTCTGCCGTGTACTATTGTGCTAGGTATTACGATGACCATTACTGTCTGGATTACTGGGGGCAGGGCACAACTCTGACCGTGTCCTCTTGATGAGAATTCCGG(SEQ ID NO:76)。
编码D4-L的核苷酸序列：
CAAATTGTCCTGAGTCAGAGCCCAGCCATCCTGTCCGCTAGTCCCGGCGAAAAGGTGACAATGACCTGTCGGGCCAGCTCTAGTGTCAGCTATATCCATTGGTTCCAGCAGAAACCTGGCAGCTCTCCCAAGCCATGGATCTACGCCACATCCAACCTGGCATCTGGCGTGCCCGTGCGCTTCAGTGGGTCCGGGAGTGGAACCTCTTACTCTCTCACTATTAGCAGAGTGGAGGCAGAGGATGCAGCAACATACTATTGCCAGCAGTGGACCTCTAATCCACCAACATTCGGAGGAGGAACCAAGCTCGAAATCAAAAGGACCGTCGCTGCTCCCTCCGTGTTCATCTTTCCTCCTTCTGATGAGCAGCTCAAGTCTGGCACCGCTTCTGTGGTGTGTCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGGGAGGCAAAAGTGCAATGGAAAGTGGATAATGCACTGCAGTCCGGAAACTCCCAGGAAAGTGTGACCGAACAAGATAGCAAAGACAGTACATATAGCCTGTCTTCTACTCTGACCCTCTCTAAAGCAGACTATGAAAAGCATAAGGTCTATGCTTGCGAAGTTACTCATCAGGGACTGTCCAGTCCAGTGACAAAGTCCTTCAACCGCGGTGAATGCGGTGGCGGCGGTAGCCAGGTCCAACTCCAACAGAGTGGCGCCGAACTCGCTCGCCCTGGTGCTTCTGTGAAAATGTCCTGTAAGGCCAGTGGCTATACCTTCACAAGATACACTATGCATTGGGTTAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGGCTCGAATGGATCGGCTATATCAACCCTAGTAGAGGATACACTAATTACAACCAGAAGTTCAAAGACAAGGCTACACTGACCACTGATAAGTCTTCCAGTACTGCTTACATGCAGCTGAGTAGCCTGACCAGTGAAGACAGTGCAGTTTACTATTGCGCCAGATATTACGATGACCACTATTGCCTGGATTACTGGGGTCAGGGAACTACACTGACCGTCAGCTCTGGTGGAGGTGGCAGTGGTGGTGGCGGTTCTCAGATTGTCCTGACACAATCTCCCGCCATTATGTCTGCAAGCCCAGGCGAGAAAGTCACCATGACATGCTCTGCAAGTTCTAGTGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCTGGGACCTCTCCCAAGAGGTGGATCTACGATACCAGTAAGCTGGCTTCTGGCGTTCCAGCTCACTTTCGCGGAAGCGGAAGTGGCACTAGCTATAGTCTCACCATTTCTGGGATGGAAGCTGAGGACGCTGCTACATATTACTGCCAACAGTGGTCTAGCAACCCTTTCACCTTCGGCTCTGGTACAAAGCTGGAGATCAAC(SEQ ID NO:77)。
D1-H：
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FKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVF
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ISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(SEQ ID NO:78)。
D1-L：
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:79)。
D2-L:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:80)。
D3-L:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGSGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:81)。
D4-L:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN(SEQ ID NO:82)。
M362-H：
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPSDSYTNYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCTRSWRGNSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:83)。
M362-L：
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:84)。
编码M362-H的核苷酸序列：
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGCGCCGAGCTGGTGAGACCCGGAGCTAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTACTGGATCAACTGGGTGAAACAGAGACCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAACATCTACCCCTCAGATAGCTATACCAACTACAACCAGAAATTCAAGGACAAAGCCACCCTGACCGTGGACAAAAGCAGCAGCACAGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCCCACCAGCGAAGACAGCGCCGTGTACTACTGCACCAGATCCTGGAGAGGCAACAGCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCCTGACAGTGAGCTCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:85)。
编码M362-L的核苷酸序列：
GACATTGTGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACCGTGACCGCCGGAGAAAAAGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAAAACTACCTGACTTGGTATCAGCAGAAACCCGGCCAGCCCCCCAAACTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGAGAGAGCGGAGTGCCAGACAGATTCACCGGCAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATTTCCAGCGTGCAGGCTGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGAATGACTACAGCTACCCCTTCACCTTCGGAAGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:86)。
K4-CD3核苷酸序列：
CAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCGCCGAACTGGCCCGGCCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTT
CTGGCTATACCTTCACCAGATATACCATGCACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACA
TCAACCCCTCTAGAGGCTACACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCACCGACAAGTCCTC
TAGCACCGCCTACATGCAGCTGTCCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCTGTGTACTACTGTGCCAGATACTACGACGA
CCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACAACCCTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGG
AGGCTCTGGCGGCGGCGGATCCCAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCATCATGTCTGCCTCTCCCGGCGAGAAGG
TTACCATGACCTGTTCCGCCTCTTCCTCTGTCTCCTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCTGGCACATCCCCTAAGA
GATGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCTTCCGGTGTGCCCGCTCACTTCAGAGGATCTGGCAGCGGCACCTCTTAC
AGCCTGACAATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGACGCTGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCGAATCCTTTCAC
CTTTGGCTCCGGCACCAAACTCGAGATCAACGAGTCTAAGTACGGCCCACCTTGTCCCCCATGTCCTGCTCCTGAGG
CCGCTGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACACTGATGATCTCCAGAACCCCCGAAGTG
ACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAAGAGGATCCTGAAGTGCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGC
ACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTTCAACTCCACGTATCGGGTGGTGTCTGTGCTGACAGTCCTGCA
CCAGGACTGGCTGAACGGAAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCTTCCATCGAGAAGACC
ATCTCCAAGGCCAAAGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTGCACCCTTCCACCATCTCAAGAAGAGATGACCAAGA
ACCAGGTGTCTCTGAGCTGCGCTGTGAAGGGCTTCTACCCTTCGGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAACGGCCA
GCCTGAGAACAACTACAAAACCACCCCTCCTGTGCTCGACTCTGATGGCTCCTTCTTCCTGGTGTCCAAACTGACCG
TGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCATAATCACTACACACAGAAATCCCTGTCCCTGTCTCTGGGC(SEQ ID NO:90)。
实施例2对称结构双特异性抗体表达及纯化
利用实施例1获得的质粒进行对称结构双特异性抗体的表达和纯化。
为了瞬时产生双特异性抗体dHL1～4，根据ExpiCHOS表达系统使用手册说明进行操作。将ExpiCHOS宿主细胞用ExpiCHO-STM Expression Medium培养基复苏培养，当细胞密度约6*106cell/mL时对宿主细胞进行转染。转染时按照1mg质粒总量/mL细胞配制质粒稀释液，转染质粒包括重链和轻链，其中dHL1～4的重链载体分别是D1-H、D2-H、D3-H、D4-H，轻链载体分别是D1-L、D2-L、D3-L、D4-L，转染时重链和轻链按2:1比例混匀，室温静置4min后逐滴加入至细胞培养液中，于37℃，140rpm，8％CO2条件下培养，隔18-20h加入补料ExpiCHOTMFeed和ExpiCHOTM Ehancer。转染后第7至8天收集发酵液，于1000rpm离心10min后，收集上清于4500rpm离心20min，收集细胞发酵液上清，过滤后用于纯化。
将收集的发酵液上清利用ProteinA层析柱(EzFast ProteinADiamond，博格隆)进行亲和纯化，平衡液为20mM PBS、0.15MNaCl，pH为7.4；洗脱液为0.1M柠檬酸缓冲液pH为3.2，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，洗脱后立即用1M Tris回调pH至7.4，用PBS缓冲液透析后，对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测，具体的实验结果如图3所示，电泳图谱还原显示目标蛋白大小条带，非还原条带有杂带。因此采用体积排阻色谱(SEC)进一步分离样品。
取ProteinA捕获的蛋白于12000rpm离心10min后得上清液，采用安捷伦1260色谱系统对上清液进行等度洗脱分离，并收集目标峰。色谱条件如表2所示。
表2：
分离得到7个峰，对收集的样品分别经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测，其中dHL1样品分离检测结果如图4所示，电泳图结果显示未分离出目的蛋白。由此可知，从蛋白电泳非还原结果看，对称结构的双特异性抗体表达量很低，未能很好形成完整稳定的分子。
实施例3非对称结构双特异性抗体表达及纯化
利用实施例1获得的质粒进行非对称结构双特异性抗体的表达和纯化。为了瞬时产生蛋白非对称双特异性抗体，根据ExpiCHOS表达系统使用手册说明进行操作。将ExpiCHOS宿主细胞用ExpiCHO-STM Expression Medium培养基复苏培养，当细胞密度约6*106cell/mL时对宿主细胞进行转染。转染时按照1mg质粒总量/mL细胞配制质粒稀释液，转染质粒包括重链、轻链和scfv链，其中抗体KCD3×CD20，KCD3×m1B6和KCD3×m1E7的重链载体分别是K1-H、K2-H、K3-H，轻链载体分别是k1-L、k2-L、k3-L，scfv链是K1-CD3；抗体KCD3×h1B6，KCD3HL×h1B6，KCD3HL2×h1B6和KCD3HL2×h1B6-R435H/F436Y的重链载体是K4-H，轻链载体是K4-L，scfv链分别是K2-CD3，K1-CD3，K3-CD3和K4-CD3；转染时重链、轻链和Scfv链按2：1：2比例混匀，室温静置4min后逐滴加入至细胞培养液中，于37℃，140rpm，8％CO2条件下培养，隔18-20h加入补料ExpiCHOTM Feed和ExpiCHOTM Ehancer。转染后第7至8天收集发酵液，于1000rpm离心10min后，收集上清于4500rpm离心20min，收集细胞发酵液上清，过滤后用于纯化。
将收集的发酵液上清利用ProteinA层析柱(EzFastProteinADiamond，博格隆)进行亲和纯化，平衡液A(20mM PBS，0.15MNaCl，pH7.4)；用洗脱液B(0.1M柠檬酸缓冲液pH3.2)梯度洗脱，收集目标吸收峰下蛋白洗脱液，洗脱后立即用1M Tris回调pH至5.5，用PBS缓冲液透析后，对收集的样品经还原与非还原后通过10％SDS-PAGE电泳检测，电泳图谱还原显示目标蛋白大小条带，非还原条带有杂带。其中KCD3HL×h1B6和KCD3×m1B6在115kd处有降解条带，而KCD3×h1B6没有该降解条带。
为了将双特异性抗体与副产物分离，用阳离子层析柱(苏州纳微公司，NanoGel-50SPHPX，50μm7.7×100mm)进一步纯化，用平衡缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH5.5)平衡层析柱，取proteinA捕获样品，用平衡液稀释6-7倍至电导4.5-5mS/cm之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(20mM PB缓冲液+1M NaCl，pH5.5)线性梯度洗脱，收集后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，纯度95％以上，结果如图5所示。同时将样品进行质谱检测，质谱(Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，型号G6530，AgilentTechnologies)检测分子量，与理论分子量一致，且为同源二聚体形式。
实施例4双特异性抗体的热稳定性检测
本实施例利用差示扫描热量仪对实施例2获得的双特异性抗体CD20×CD3进行热稳定性检测，双特异性抗体样品纯化后置换于PBS缓冲液中，以PBS缓冲液作为对照，量热扫描数据以1℃/min的加热速率从20℃至100℃进行扫描获得。具体的实验结果如图6所示，微量热差示扫描量热结果显示双特异性抗体的Tm值在65-75℃左右，表现出了良好的热稳定性。
实施例5KCD3HL2×h1B6和KCD3HL2×h1B6-R435H/F436Y单体分子纯度检测
为了验证R435H/F436Y回复突变对双抗分子纯度的影响情况，将ProteinA捕获得到的样品KCD3HL2×h1B6(H435R/Y436F)和KCD3HL2×h1B6-R435H/F436Y均经缓冲液置换，将其基质换成空白缓冲体系(20mM PBS pH7.4)，并将双特异性抗体浓度稀释为1mg/mL，进行SEC(size exclusion chromatography)检测，具体检测结果如表3所示，结果表明KCD3HL2序列中H435R/Y436F位点的突变，能有效改善双抗分子多聚体情况，提高单体分子的占比，H435R/Y436F位点突变后的样品KCD3HL2×h1B6纯度明显提高。
表3：双特异性抗体-proteinA捕获样品SEC检测结果
样品 KCD3HL2×h1B6 KCD3HL2×h1B6-R435H/F436Y
单体占比(％) 60.86 38.73
多聚体占比(％) 25.48 47.23
碎片占比(％) 13.67 14.03
实施例6双特异性抗体放置稳定性实验
单链抗体片段(scFv)通过一个连接肽(Gly4Ser)3把重链可变区和轻链可变区连接起来而形成，为了验证双特异性抗体稳定性情况，双特异性抗体KCD3×h1B6样品均经超滤放置，将其基质换成空白缓冲体系(20mM PBS pH7.4)，并将双特异性抗体浓度稀释为1mg/mL，分别在-70℃、4℃、37℃恒温放置26天取样检测，SEC(size exclusionchromatography)检测聚集情况，具体的实验结果如表4所示，结果表明样品随着放置时间延长，未出现多聚体明显增加现象。
表4：双特异性抗体样品放置稳定性结果
样品 取样26天检测聚集体占比
KCD3×h1B6(-70℃) 0.890％
KCD3×h1B6(4℃) 0.848％
KCD3×h1B6(37℃) 0.852％
实施例7利用流式检测双特异性抗体与细胞jurkat的结合
培养足够的jurkat细胞，离心收集细胞。同时稀释KCD3、KCD3×m1B6、KCD3×m1E7抗体，浓度从10μg/mL，2倍梯度稀释得到24个梯度稀释，备用。将收集的细胞用PBS洗两遍，再加PBS重悬细胞至2*106个细胞/mL，细胞铺板于96孔板中，每孔100μL，离心去上清，加入100μL稀释好的抗体，室温孵育1h；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗人IgG Fc抗体(Jackson immuno，109115098)重悬细胞，每孔100μL，室温避光孵育30分钟，PBS洗3遍，再用200μLPBS重悬，上机检测，用软件GraphPadPrism 6.01进行分析。具体的实验结果如图7所示，结果显示，抗体样品与CD3亲和力对比看，KCD3比KCD3×m1B6强513倍，KCD3×m1E7比KCD3×m1B6的亲和力强2倍，双抗比单抗对CD3亲和力有所下降，在一定程度上可降低细胞因子的释放。
实施例8利用流式检测双特异性抗体与肿瘤细胞BXPC3的共结合
培养足够的BXPC3细胞，用0.25％胰酶消化，离心收集细胞。同时稀释KCD3×m1B6(antiCD3/Claudin18.2)、KCD3×m1E7(antiCD3/Claudin18.2)抗体，浓度从10μg/mL，2倍梯度稀释得到18个梯度稀释，备用。将收集的细胞用PBS洗两遍，再加PBS重悬细胞至2*106个细胞/mL，细胞铺板于96孔板中，每孔添加体积为100μL，离心去上清，分别加入100μL稀释好的抗体，室温孵育1h；离心去上清，用PBS洗细胞两遍，再用稀释好的PE标记的抗人IgG Fc抗体(Jackson immuno，109115098)重悬细胞，每孔100μL，室温避光孵育30分钟，PBS洗三遍，再用200μLPBS重悬，上机检测，用软件GraphPadPrism 6.01进行分析。具体的实验结果如图8所示，抗体与Claudin18.2亲和力，KCD3×m1B6比KCD3×m1E7强16倍。
实施例9双特异性抗体介导的PBMC细胞杀伤肿瘤细胞BXPC3检测
用胰酶消化BXPC3细胞，离心收集细胞，用10％FBS-1640将细胞重悬至2*105个细胞/mL，铺于96孔板中，每孔50μl，培养2h。2h后，将KCD3×m1B6(antiCD3/Claudin18.2)、KCD3xm1E7(antiCD3/Claudin18.2)梯度稀释，最高浓度32nM，二倍稀释10个梯度，铺于上述96孔板中，每孔添加25μL，设置对照组，无需加入抗体孔则用相同体积的10％FBS-1640培养基补入。将PBMC(妙通，PB010C)细胞从液氮罐取出，在水浴锅中迅速解冻，加入到5mL的1640培养基中，400g、5min离心后去上清，用10％FBS-1640将细胞重悬至4*106个细胞/mL，铺于上述96孔板中，每孔添加25μL，对照组无需加入PBMC孔则用相同体积的10％FBS-1640培养基补入。48h后取出96孔板，400g、5min离心后取50μL上清至新的96孔板中，用CytoTox96Non-Radioactive CytotoxicityAssay(Promega,G1781)试剂盒检测上清中的LDH，根据公式％Cytotoxicity＝(Experimental–Effector Spontaneous–TargetSpontaneous)/(TargetMaximum–Target Spontaneous)×100求的抗体的杀伤率，用软件GraphPad Prism 6.01进行分析。结果如图9所示，KCD3×m1B6的杀伤效果明显强于KCD3×m1E7。
实施例10应用FACS方法采用ZenonTMpHrodoTMiFL IgG Labeling Reagent评价双特异性抗体内化情况
本实施例对抗体的内化情况进行检测，构建Claudin18.2稳定表达细胞系A20～18.2(靶细胞)，采用含10％FBS(Gibco,10099-141C)、0.05mMβ-巯基乙醇(阿拉丁，M301574)和1μg/mL的嘌呤霉素(Gibco,A11138-03)的1640完全培养基(Gibco,22400-089)进行培养，待细胞生长到整个培养皿的80％左右，细胞离心，台盼蓝测定活力，确保细胞活力在95％以上，全细胞自动计数仪进行计数，调整细胞密度为2*10^6/mL。采用1640完全培养基配制待测抗体(m1B6、KCD3×h1B6、KCD3×m1B6、m1E7、KCD3×m1E7、)，待测抗体终浓度为6，2，0.5μg/mL。采用1640完全培养基配制ZenonTMpHrodoTMiFL IgG Labeling Reagent(invitrogen,Z25612)，其终浓度为40nM。将配制好的待测抗体和ZenonTMpHrodoTMiFL IgG LabelingReagent各25μL加入96孔板中，室温条件下共孵育5min。每孔中再加入50μLA20～18.2细胞，每孔细胞量为1*10^5.将96孔板置于37℃，5％CO2孵育箱中孵育4h。PBS洗去剩余抗体或试剂，流式检测抗体内化情况，统计出发生内化的细胞比例。
具体的实验结果如表5、图10和图11所示，Claudin18.2鼠源单抗1B6发生了明显的抗体内化，最大内化细胞比例达到87％。相同条件下，m1B6、m1E7、KCD3×m1B6和KCD3×m1E7内化细胞比例在所有检测浓度下内化比例均不超过10％。KCD3×h1B6、KCD3×m1B6和KCD3×m1E7双抗内化效率显著低于m1B6和m1E7鼠源单抗，可以更好的发挥对T细胞招募以及促进T细胞增殖活化的作用。
表5：抗体荧光强度检测
抗体 抗体浓度(μg/mL) 荧光强度(MFI)
- 0 2509
m1B6 6 7016
m1B6 2 12343
m1B6 0.5 10219
KCD3×h1B6 6 3275
KCD3×h1B6 2 3271
KCD3×h1B6 0.5 2914
KCD3×m1B6 6 4486
KCD3×m1B6 2 4544
KCD3×m1B6 0.5 3610
m1E7 6 4592
m1E7 2 4684
m1E7 0.5 3469
KCD3×m1E7 6 2869
KCD3×m1E7 2 2776
KCD3×m1E7 0.5 2590
实施例11双特异性抗体皮下移植瘤抗肿瘤药效检测
采用CD34+HSC注射构建hCD34+人源化小鼠，20-24周龄的hCD34+人源化小鼠将被用于实验。取对数生长期的人胃癌细胞(高表达Claudin18.2)NμgC4～18.2，离心，细胞计数后，用无血清RPMI-1640培养基和Matrigel混合液(按1:1的体积比)调整细胞密度至5.0*107/mL左右。以0.1mL/Mouse的体积注射入hCD34+人源化小鼠背部皮下。待平均肿瘤体积达到60-80mm3左右，随机分组给药。腹腔分别给予antiCD3阴性对照、抗体4周，每周给药2次，具体给药量如图11和图12中所标注的进行。从给药0天开始，每周测量瘤径大小以及称量小鼠体重两次，用于计算肿瘤体积及体重变化趋势。采用肿瘤生长抑制率(TGI)作为试验评价指标。(TGI)％＝[1-T/C]×100％，其中T、C分别为实验结束时治疗组肿瘤体积、对照组肿瘤体积。采用SPSS16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，P＜0.05(*)表示有统计学意义。
实验结果如图11和12所示，KCD3×m1B6双抗两个剂量有剂量依赖性抗肿瘤药效，且其抗肿瘤效果优于其对照抗体IMAB362和antiCD3阴性对照。KCD3×m1B6双抗两个剂量组以及KCD3×m1E7双抗均对荷瘤小鼠体重增长无影响。表明构建Anti-CD3/Claudin18.2双抗具有显著优于anti-Claudin18.2单抗的药效特征，且并未增加毒副作用。
实施例12人源化双特异性抗体皮下移植瘤抗肿瘤药效检测
采用静脉注射PBMC构建NDG免疫重建人源化小鼠，取对数生长期的人胃癌细胞(高表达Claudin18.2)NUGC4～18.2，离心，细胞计数后，用无血清RPMI-1640培养基和Matrigel混合液(按1:1的体积比)调整细胞密度至5.0*107cells/mL左右。以0.1mL/Mouse的体积注射入PBMC人源化小鼠背部皮下。待平均肿瘤体积达到70-80mm3左右，随机分组给药。腹腔给予对应抗体4周，每周给药2次。从给药0天开始，每周测量瘤径大小以及称量小鼠体重两次，用于计算肿瘤体积及体重变化趋势。采用肿瘤生长抑制率(TGI)作为试验评价指标。(TGI)％＝[1-T/C]×100％，其中T、C为实验结束时治疗组肿瘤体积、对照组肿瘤体积。采用SPSS16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，P＜0.05(*)表示有统计学意义。
在第10次(D46)给药后采集外周血进行细胞因子检测，最后一次给药(D45)后次日进行终点取材，包括外周血和肿瘤组织，肿瘤组织拍照称重，研磨成单细胞悬液做TIL分析，外周血流式分析免疫细胞分型。
实验结果如图13和14所示，KCD3×h1B6双抗3mpk剂量具有显著的抗肿瘤药效，TGI可达到73.38％，且对荷瘤小鼠体重增长无影响。表明Anti-CD3/Claudin18.2人源化双抗仍然具有显著的抗肿瘤药效，且在不同来源的PBMC人源化小鼠中均体现优良抗肿瘤效果。
另外从图15显示的外周血免疫细胞分型结果可以推测，PBMC免疫重建后，外周血Cytotoxicity T比例越高，CD3双抗在该模型中更为敏感。图16显示的分析肿瘤组织TIL分型结果可见，无论是Donor1还是Donor2，给药组KCD3×h1B6 TIL中Cytotoxicity T(CD3+CD4-CD8+)比例均高于对应的Vehicle组，与KCD3×h1B6在PBMC免疫重建B-NDG B2m KO plus小鼠皮下移植NUGC4～18.2细胞模型中的抗肿瘤效果一致。
实施例13Anti-CD3/Claudin18.2人源化抗体皮下移植瘤抗肿瘤药效检测
采用静脉注射PBMC(迈顺生物，PB010C)构建B-NDG B2mKO plus免疫重建人源化小鼠，取对数生长期的人胃癌细胞(高表达Claudin18.2)NUGC4～18.2(北京康源博创，KC-1471)，离心，细胞计数后，用无血清RPMI-1640培养基(GIBCO，A10491-01)和Matrigel(Corning，354234)混合液(按1:1的比例)调整细胞密度至5.0*107/mL左右。以0.1mL/Mouse的体积注射入PBMC人源化小鼠背部皮下。待平均肿瘤体积达到90-100mm3左右，随机分组给药。腹腔给予对应抗体4周，Anti-CD3/Claudin18.2双抗KCD3HL2×h1B6，阳性对照抗体CL-1×12C-ScFc(公开于CN112512581A中)，阴性对照：溶媒组PBS溶液，和双抗CD20×OKT3-ScFv2组，每周给药1次。从给药0天开始，每周测量瘤径大小以及称量小鼠体重两次，用于计算肿瘤体积及体重变化趋势。采用肿瘤生长抑制率(TGI)作为试验评价指标。(TGI)％＝[1-T/C]×100％，其中T、C为实验结束时给药组与对照组的肿瘤体积。采用SPSS16.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，P＜0.05(*)表示有统计学意义。
实验结果如附图17A-C所示，Anti-CD3/Claudin18.2双抗KCD3HL2×h1B6具有显著的抗肿瘤药效，低高剂量均可使肿瘤消退，消退率分别为4/6和5/6；同实验条件下，阳性对照抗体CL-1×12C-ScFc低剂量的TGI＝43.43％，高剂量TGI＝56.51％，与对照组相比，也具有显著的抑瘤效果，但整体抑瘤水平不及KCD3HL2×h1B6，且不会导致肿瘤消退。
KCD3HL2×h1B6和CL-1×12C-ScFc均对小鼠体重无明显影响。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (30)

1.一种抗体，其特征在于，包括：第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；
第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；
第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；
其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；
所述单链抗体具有第二抗原结合活性；
所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；
所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；
所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述单链抗体的C端与所述第二铰链区的N端相连，所述第二铰链区的C端与所述第二Fc区的N端相连。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区，所述第二重链可变区的C端与所述第二轻链可变区的N端相连，所述第二轻链可变区的C端与所述所第二铰链区的N端相连；
任选地，所述单链抗体包括第二重链可变区和第二轻链可变区，所述第二轻链可变区的C端与所述第二重链可变区的N端相连，所述第二重链可变区的C端与所述所第二铰链区的N端相连；
任选地，所述单链抗体进一步包括连接肽，所述连接肽设置于所述第二重链可变区和第二轻链可变区之间；
任选地，所述连接肽的N端与所述第二重链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二轻链可变区的N端相连；
任选地，所述连接肽的N端与所述第二轻链可变区的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二重链可变区的N端相连；
任选地，所述连接肽是GS连接肽；
任选地，所述连接肽包含如SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一抗原与第二抗原相同或不同。
5.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一抗原为肿瘤抗原或免疫细胞抗原，所述第二抗原为免疫细胞抗原。
6.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一抗原为CD20或Claudin18.2，所述第二抗原为CD3。
7.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述Knobs-into-hole结构是通过如下方式实现的：第一Fc区包含S354C，T366W突变，第二Fc区包含Y349C，T366S，L368A，Y407V突变。
8.根据权利要求7所述的抗体，其特征在于，所述第二Fc区进一步包含H435R，Y436F突变。
9.根据权利要求7或8所述的抗体，其特征在于，所述第一Fc区和第二Fc区进一步包含S228P、F234A、L235A、R409K突变、和K447缺失突变；
任选地，所述第一Fc区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二Fc区包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于人源抗体；
任选地，所述轻链恒定区和重链恒定区均来自于人源IgG抗体或其突变体；
任选地，所述轻链恒定区来自于人源的Kappa轻链恒定区；重链恒定区来自于人源IgG4或IgG1，或，IgG4或IgG1的突变体；
任选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
任选地，所述轻链恒定区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一重链可变区包括分别如SEQ IDNO:5、6和7或者与SEQ ID NO:5、6和7具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
分别如SEQ ID NO:8、9和10或者与SEQ ID NO:8、9和10具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
分别如SEQ ID NO:11、12和13或者与SEQ ID NO:11、12和13具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
分别如SEQ ID NO:14、15和16或者与SEQ ID NO:14、15和16具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
12.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一轻链可变区包括分别如SEQ IDNO:17、18和19或者与SEQ ID NO:17、18和19具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:20、21和22或者与SEQ ID NO:20、21和22具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:23、24和25或者与SEQ ID NO:23、24和25具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:26、27和28或者与SEQ ID NO:26、27和28具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
13.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一重链可变区包括分别如SEQ IDNO:5、6和7或者与SEQ ID NO:5、6和7具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:17、18和19或者与SEQ ID NO:17、18和19具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
或
所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:8、9和10或者与SEQ ID NO:8、9和10具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:20、21和22或者与SEQ ID NO:20、21和22具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
或
所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:11、12和13或者与SEQ ID NO:11、12和13具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:23、24和25或者与SEQ ID NO:23、24和25具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
或
所述第一重链可变区包括分别如SEQ ID NO:14、15和16或者与SEQ ID NO:14、15和16具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；和
所述第一轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:26、27和28或者与SEQ ID NO:26、27和28具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
14.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述第二重链可变区包括分别如SEQ IDNO:29、30和31或者与SEQ ID NO:29、30和31具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
15.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述第二轻链可变区包括分别如SEQ IDNO:32、33和34或者与SEQ ID NO:32、33和34具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
或所述第二轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:87、88和89或者与SEQ ID NO:87、88和89具有至少90％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
16.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一铰链区与所述第二铰链区相同或不同；
任选地，所述第一铰链区与所述第二铰链区包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1或3所述的抗体，其特征在于，所述第一重链可变区包含SEQ ID NO:36～39任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第一轻链可变区包含SEQ ID NO:40～43任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二重链可变区包含SEQ ID NO:44或45所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二轻链可变区包含SEQ ID NO:46或47所示的氨基酸序列；
任选地，所述单链抗体包含SEQ ID NO:48～50任一项所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述第一肽链包含SEQ ID NO:51～54任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第二肽链包含SEQ ID NO:55～58任一项所示的氨基酸序列；
任选地，所述第三肽链包含SEQ ID NO:59～61、SEQ ID NO:91任一项所示的氨基酸序列。
19.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～18任一项所述的抗体。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含SEQ ID NO:62～72所示的核苷酸序列。
21.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求19～20任一项所述的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为真核表达载体或者原核表达载体。
23.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求19或20所述的核酸分子，权利要求21-22任一项所述的表达载体或者表达权利要求1～18任一项所述的抗体。
24.根据权利要求23所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是通过将权利要求21-22任一项所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
25.根据权利要求24所述的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；
任选地，所述宿主细胞为大肠杆菌或中国仓鼠卵巢细胞，人胚胎肾细胞。
26.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～18任一项所述的抗体，权利要求19～20任一项所述的核酸分子，权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～25任一项所述的重组细胞。
27.权利要求1～18任一项所述的抗体或权利要求19～20任一项所述的核酸分子或权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～25任一项所述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防第一抗原和/或第二抗原相关性疾病，所述第一抗原和/或第二抗原如权利要求4～6任一项所限定的；
任选地，所述第一抗原相关性疾病为癌症；
任选地，所述癌症包括：胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌和直肠癌中的至少之一。
28.一种检测第一抗原和/或第二抗原的试剂盒，所述第一抗原和/或第二抗原如权利要求4～6任一项所限定的，其特征在于，包括权利要求利要求1～18任一项所述的抗体。
29.权利要求1～18任一项所述的抗体或权利要求19～20任一项所述的核酸分子或权利要求21～22任一项所述的表达载体或权利要求23～25任一项所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测第一抗原和/或第二抗原或者诊断第一抗原和/或第二抗原相关的疾病，所述第一抗原和/或第二抗原如权利要求4～6任一项所限定的。
30.一种使抗体具有差异抗原结合活性的方法，其特征在于，所述抗原包括第一抗原和第二抗原，所述抗体包括：
第一肽链，所述第一肽链包括抗体第一重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包括CH1区、第一铰链区以及第一Fc区；
第二肽链，所述第二肽链包括抗体第一轻链可变区和轻链恒定区；
第三肽链，所述第三肽链包括单链抗体、第二铰链区以及第二Fc区；
其中，所述抗体重链可变区和轻链可变区具有第一抗原结合活性；
所述单链抗体具有第二抗原结合活性；
所述第一肽链与第二肽链通过二硫键相连；
所述第一铰链区与第二铰链区通过二硫键相连；
所述第一Fc区与第二Fc区通过Knobs-into-hole结构相连。
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