CN117229412A - 包含抗cldn18.2抗体的双特异性抗体、药物组合物及用途 - Google Patents
包含抗cldn18.2抗体的双特异性抗体、药物组合物及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117229412A CN117229412A CN202310714494.9A CN202310714494A CN117229412A CN 117229412 A CN117229412 A CN 117229412A CN 202310714494 A CN202310714494 A CN 202310714494A CN 117229412 A CN117229412 A CN 117229412A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- acid sequence
- amino acid
- variable region
- chain variable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 93
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 73
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 69
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 64
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 60
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 49
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 217
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 175
- 101000868279 Homo sapiens Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 claims description 65
- 102100032913 Leukocyte surface antigen CD47 Human genes 0.000 claims description 61
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 27
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 24
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 19
- 230000005888 antibody-dependent cellular phagocytosis Effects 0.000 claims description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 claims description 9
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 claims description 8
- 101710138871 Ig gamma-1 chain C region Proteins 0.000 claims description 8
- 102100039345 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 7
- 101000961149 Homo sapiens Immunoglobulin heavy constant gamma 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 102100039347 Immunoglobulin heavy constant gamma 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 7
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 claims description 7
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 4
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 201000009036 biliary tract cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020790 biliary tract neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 claims 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 35
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 16
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 16
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 16
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 11
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 229950007157 zolbetuximab Drugs 0.000 description 10
- 238000013461 design Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 102000044459 human CD47 Human genes 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 6
- 101150036449 SIRPA gene Proteins 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 102100029948 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Human genes 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 102000002029 Claudin Human genes 0.000 description 4
- 108050009302 Claudin Proteins 0.000 description 4
- 101000863873 Homo sapiens Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type substrate 1 Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 4
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 230000002747 voluntary effect Effects 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 2
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 101710098610 Leukocyte surface antigen CD47 Proteins 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004979 bone marrow derived macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical group COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- LMFAFFIRCNUJJO-UHFFFAOYSA-N 5-(4-azidophenyl)-8-iodo-3-methyl-1,2,4,5-tetrahydro-3-benzazepin-7-ol Chemical compound C1N(C)CCC2=CC(I)=C(O)C=C2C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 LMFAFFIRCNUJJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010058590 CD47 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006355 CD47 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 231100000023 Cell-mediated cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010057250 Cell-mediated cytotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000126130 Ganymedes Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101100477531 Homo sapiens SIRPA gene Proteins 0.000 description 1
- 101000659879 Homo sapiens Thrombospondin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000335574 Narayana Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 102100023704 Spermatogenic leucine zipper protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021657 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Human genes 0.000 description 1
- 101710128901 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6 Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMJPCIAEJKVKMQ-UHFFFAOYSA-M [4-[[4-[benzyl(methyl)amino]phenyl]-[4-(dimethylamino)phenyl]methylidene]cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-dimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC(=CC=1)N(C)CC=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 ZMJPCIAEJKVKMQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007681 cardiovascular toxicity Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000005890 cell-mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000010220 ion permeability Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101150060219 tsp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种包含抗CLDN18.2抗体的双特异性抗体、其药物组合物及用途。具体地，本发明涉及一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中：所述第一蛋白功能区为抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述第二蛋白功能区靶向不同于CLDN18.2的靶点(例如CD47)。本发明的双特异性抗体具有良好的生物学活性和抗肿瘤应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗CLDN18.2抗体、包含该抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体、其药物组合物及用途。具体地，所述双特异性抗体为一种抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。
CD47又称为整合素相关蛋白(integrin associated protein，IAP)。CD47为5次跨膜蛋白，分子量在50kDa左右，属于免疫球蛋白超家族。其胞外N端为IgV结构域，与αvβ3(CD51/CD61)和αIIbβ3(CD41/CD61)整合素相连。CD47涉及多种生理功能，例如细胞转移，T细胞和树突细胞(Dendritic cell，DC)激活，轴突发育等功能。
CD47在包括红细胞在内的所有细胞类型上表达，同时CD47在几乎所有类型的肿瘤细胞上高表达，并与不良预后相关。CD47有两种配体分别为信号调节蛋白α(SignalRegulatory Proteinα，SIRPα)和凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP1)。SIRPα是一类含有免疫球蛋白结构域的受体型穿膜糖蛋白，属于SIRP家族，主要在吞噬细胞和神经细胞上表达。在CD47-SIRPα通路中，CD47蛋白与SIRPα结合磷酸化其免疫受体酪氨酸抑制基序ITIM，随后细胞内招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用(Matozaki T,Murata Y,Okazawa H,et al.Functions and molecular mechanisms ofthe CD47–SIRPαsignalling pathway.Trends in cell biology,2009,19(2):72-80.)。正常红细胞由于细胞膜表面的CD47和巨噬细胞的SIPRα结合产生抑制性信号，从而不被吞噬(Oldenborg PA,Zheleznyak A,Fang Y F,et al.Role of CD47 as a marker of self onred blood cells.Science,2000,288(5473):2051-2054.)。TSP1是由3条肽链组成的同源三聚体，与其它细胞表面受体、基质成分和生长因子相互作用参与细胞增殖、凋亡、粘附、迁移、血管生成等过程(Jiang P,Lagenaur CF,Narayanan V.Integrin-associated ProteinIs aLigand for the P84 Neural Adhesion Molecule.Journal of BiologicalChemistry 1999.274：559-62)。
巨噬细胞(Macrophages)源自单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行吞噬作用并激活淋巴细胞或其他免疫细胞，令其对病原体做出反应。目前研究认为肿瘤细胞具有逃逸巨噬细胞吞噬的机制，在肿瘤细胞生长过程中表面会形成特异性蛋白比如钙网蛋白，暴露肿瘤身份吸引巨噬细胞吞噬，但与此同时，具有SIRPα的巨噬细胞与高表达CD47的肿瘤细胞由于CD47-SIRPα通路激活抑制巨噬细胞的吞噬作用，巨噬细胞误判为正常细胞致使肿瘤细胞逃逸巨噬细胞的吞噬(CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cellsand leukemia cells to avoid phagocytosis.Jaiswal S,Jamieson C H M,Pang W W,etal.Cell,2009,138(3)271-285)。
CLDN18.2蛋白是一类存在于上皮和内皮紧密连接(tight junction)中的整合素膜蛋白，由261个氨基酸组成，属于Claudins(CLDNs)家族成员之一，其N端和C端均位于细胞内，整个蛋白表达于细胞膜上。CLDN18.2具有4个跨膜区、2个细胞外环及1个胞质内环，参与形成细胞之间的紧密连接结构(Gunzel,D.；Yu,A.S.L.Claudins and the Modulation ofTight Junction Permeability[J].Physiological Reviews.2013,93(2),525–569)。
CLDN18.2蛋白的胞外环2为螺旋-转角-螺旋结构，与邻近细胞的CLDN18.2蛋白胞外环通过芳香族残基之间的疏水键形成紧密连接。邻近细胞的CLDN18.2蛋白胞外环可通过相互作用维持上皮细胞与内皮细胞间的紧密连接、调节细胞间的渗透压、维持上皮细胞和内皮细胞的极性以及参与细胞增殖，并且可以通过富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的羧基末端参与多种信号转导途径(曹趁心.跨膜蛋白CLDN18.2在癌症靶向治疗中的研究进展[J].国际生物制品学杂志,2020(01):35-36-37-38-39-40.)。
CLDN18.2蛋白在正常健康组织中表达高度受限，仅表达于分化的胃黏膜膜上皮细胞，有利于维持胃黏膜的屏障功能。然而，CLDN18.2蛋白在恶性肿瘤发生发展过程中频繁发生异常改变，如当胃上皮组织发生恶性转化时，细胞极性的紊乱将导致细胞表面的CLDN18.2蛋白表位暴露。同时，CLDN18.2基因也会出现异常激活，高度选择性、稳定地表达于特定肿瘤组织，例如胃癌，影响细胞与细胞及细胞外基质连接，影响细胞屏障功能及极性的维持，从而引起细胞间细胞因子、离子渗透性的变化，损害屏障功能，使细胞发生增生性转化(Hashimoto Itaru,Oshima Takashi,Claudins and Gastric Cancer:An Overview.[J].Cancers(Basel),2022,14:undefined.)。
CD47和CLND18.2均为肿瘤膜抗原。靶向CD47或者CLND18.2的抗体均已展现出抗肿瘤活性。然而，包括血小板及红细胞在内的多种血细胞及成分也表达CD47，CD47抗体药物与红细胞、血小板等结合后可借由ADCC或者ADCP等效应造成红细胞、血小板的损伤，导致严重的血液毒性，引发贫血和/或血小板减少等副作用。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种抗CLDN18.2抗体，并在此基础上制得了抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体。本发明人惊奇地发现，本发明的抗CLDN18.2抗体(也简称为抗体或本发明的抗体)和抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体(也简称为双特异性抗体或本发明的双特异性抗体)具有优越的亲和力和/或特异性，可高特异性的与表达CD47和/或CLND18.2的肿瘤细胞结合，而不造成红细胞的凝集或者损伤，展现了良好的安全性，具有良好的抗肿瘤前景。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，所述抗CLDN18.2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，并且
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示和LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，
所述抗CLDN18.2抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41；并且
所述抗CLDN18.2抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2或其抗原结合片段，其中，
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示；
或者
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链恒定区为Ig gamma-1chain C region(例如氨基酸序列如SEQ ID NO:61所示)或Ig gamma-4chain Cregion(例如NCBI ACCESSION:P01861.1)；轻链恒定区为Igkappa chain C region(例如NCBI ACCESSION:P01834)。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，
所述的抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2的细胞结合的EC50为小于或等于15nM、小于或等于10nM、小于或等于9nM、小于或等于8nM、小于或等于7nM、小于或等于6nM、或者小于或等于5nM；优选地，所述EC50为通过FACS方法(流式细胞术)测得。在本发明的一个实施方案中，所述表达CLDN18.2的细胞为表达CLDN18.2的CHO-K1细胞。在本发明的一个实施方案中，所述表达CLDN18.2的细胞为过表达CLDN18.2的CHO-K1细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗CLDN18.2抗体与同时表达CLDN18.2和CD47的细胞结合的EC50为小于或等于10nM、小于或等于5nM、或者小于或等于2nM；优选地，所述EC50为通过FACS方法测得。在本发明的一个实施方案中，所述同时表达CLDN18.2和CD47的细胞为同时表达CLDN18.2和CD47的CHO-K1细胞。在本发明的一个实施方案中，所述同时表达CLDN18.2和CD47的细胞为过表达CLDN18.2和CD47的CHO-K1细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的抗CLDN18.2抗体为抗CLDN18.2单克隆抗体。
本发明还涉及一种抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CLDN18.2抗体是由杂交瘤细胞株LT020产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT020保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2022124。
本发明还涉及杂交瘤细胞株LT020，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2022124。
本发明的另一方面涉及分离的核酸分子，其编码本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的重组载体。
本发明的再一方面涉及一种抗体药物偶联物，其包括抗体或其抗原结合片段以及小分子药物，其中，所述抗体或其抗原结合片段为本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段；优选地，所述小分子药物为小分子细胞毒药物；更优选地，所述小分子药物为肿瘤化疗药物。
所述化疗药物可以是常规的肿瘤化疗药物，例如烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂等。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段通过连接子与小分子药物连接；所述连接子可以是本领域技术人员知悉的连接子，例如，所述连接子为腙键、二硫键或肽键。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述的抗体药物偶联物，其中，所述抗体或其抗原结合片段与小分子药物的摩尔比为1：(2-4)，例如1：2、1：3或1：4。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或者本发明中任一项所述的抗体药物偶联物；可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其还包含有效量的抗CD47抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24；并且
所述抗CD47抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:26；
优选地，其中所述的抗CD47抗体：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
或者
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的药物组合物，其中，所述抗CD47抗体的重链恒定区为Ig gamma-1chain C region(例如NCBI ACCESSION:P01857)或Ig gamma-4chain Cregion(例如NCBI ACCESSION:P01861.1)；轻链恒定区为Ig kappa chain C region(例如NCBI ACCESSION:P01834)。
本发明的再一方面涉及一种双特异性抗体，其包括：
靶向CLDN18.2的第一蛋白功能区，和
靶向不同于CLDN18.2的靶点(例如CD47)的第二蛋白功能区；
其中：
所述第一蛋白功能区为本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。
如果没有特别说明，本发明的双特异性抗体为抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第二蛋白功能区为抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24；并且
所述抗CD47抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:26。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述的抗CD47抗体：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；
或者
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的组合药物产品，其中，所述抗CD47抗体的重链恒定区为Ig gamma-1chain C region(例如NCBI ACCESSION:P01857)或Ig gamma-4chainC region(例如NCBI ACCESSION:P01861.1)；轻链恒定区为Ig kappa chain C region(例如NCBI ACCESSION:P01834)。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为单链抗体的融合蛋白或半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，
所述第一蛋白功能区为单链抗体的融合蛋白，并且所述第二蛋白功能区为半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)；
或者
所述第一蛋白功能区为半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)，并且所述第二蛋白功能区为单链抗体的融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，
所述第一蛋白功能区为靶向CLDN18.2的单链抗体的融合蛋白，并且所述第二蛋白功能区为靶向CD47的半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)；
或者
所述第一蛋白功能区为靶向CLDN18.2的半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)，并且所述第二蛋白功能区为靶向CD47的单链抗体的融合蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体的融合蛋白由单链抗体、铰链区和Fc片段组成，或者由单链抗体和重链恒定区组成；
优选地，所述铰链区和Fc片段为人IgG1的铰链区和Fc片段；优选地，所述铰链区和Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；
优选地，所述重链恒定区为人IgG1的重链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，
所述单链抗体的融合蛋白中的Fc片段或者重链恒定区具有Knob突变(例如S354C和T366W突变)；和
所述半分子型单价抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，并且具有Hole突变(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其由SEQ ID NO:53所示肽链、SEQ ID NO:56所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链组成；
优选地，SEQ ID NO:53所示肽链和SEQ ID NO:56所示肽链通过铰链区的一个或多个二硫键连接，SEQ ID NO:56所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链通过一个或多个二硫键连接；
优选地，SEQ ID NO:53所示肽链和SEQ ID NO:56所示肽链通过铰链区两个二硫键连接，SEQ ID NO:56所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链通过一个二硫键连接。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中：
所述双特异性抗体与表达CLDN18.2的细胞结合的EC50为小于或等于20nM、小于或等于15nM、或者小于或等于12nM；优选地，所述EC50为通过FACS方法测得；
和/或
所述双特异性抗体与红细胞膜表面CD47结合的EC50为大于或等于20nM、大于或等于40nM、或者大于或等于50nM；优选地，所述EC50为通过FACS方法测得。在本发明的一个实施方案中，所述表达CLDN18.2的细胞为表达CLDN18.2的CHO-K1细胞。在本发明的一个实施方案中，所述表达CLDN18.2的细胞为过表达CLDN18.2的CHO-K1细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中：
所述双特异性抗体与同时表达CLDN18.2和CD47的细胞结合的EC50为小于或等于10nM、小于或等于5nM、或者小于或等于2nM；优选地，所述EC50为通过FACS方法测得。在本发明的一个实施方案中，所述同时表达CLDN18.2和CD47的细胞为同时表达CLDN18.2和CD47的CHO-K1细胞。在本发明的一个实施方案中，所述同时表达CLDN18.2和CD47的细胞为过表达CLDN18.2和CD47的CHO-K1细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体在3000nM或更低的浓度下不会引发人红细胞凝集。
在本发明的一些实施方式中，所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体具有ADCP活性、ADCC活性和CDC活性。
在本发明的一些实施方式中，所述抗CD47抗体为抗CD47单克隆抗体。
本发明的再一方面涉及一种分离的核酸分子，其编码本发明中任一项所述的双特异性抗体。
本发明的再一方面涉及一种载体，其包含本发明的分离的核酸分子。
本发明的再一方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子，或者本发明的载体。
本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的本发明中任一项所述的双特异性抗体，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或者本发明中任一项所述的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途；
优选的，所述肿瘤为CD47和/或CLDN18.2阳性的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为选自胆道癌、支气管癌、淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、黑色素瘤、血液瘤、神经胶质母细胞瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌和肾癌中的一种或多种。
根据本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或者本发明中任一项所述的双特异性抗体，其用于治疗或预防肿瘤；
优选的，所述肿瘤为CD47和/或CLDN18.2阳性的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为选自胆道癌、支气管癌、淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、黑色素瘤、血液瘤、神经胶质母细胞瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌和肾癌中的一种或多种。
本发明的再一方面涉及一种治疗或预防肿瘤的方法，包括给予有需求的受试者以有效量的本发明中任一项所述的抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或者本发明中任一项所述的双特异性抗体的步骤；
优选的，所述肿瘤为CD47和/或CLDN18.2阳性的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为选自胆道癌、支气管癌、淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、黑色素瘤、血液瘤、神经胶质母细胞瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌和肾癌中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗或预防肿瘤的方法，其中，在手术之前或之后给药，和/或在放疗之前或之后给药。
在本发明的一些实施方式中，所述的治疗或预防肿瘤的方法，其中，
所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段或者所述双特异性抗体的单次给药剂量为每千克体重0.1-100mg，优选每千克体重5-50mg或5-15mg；
优选地，每3天、每4天、每5天、每6天、每10天、每1周、每2周或每3周给药一次；
优选地，给药方式为静脉滴注或静脉注射。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语EC50是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximal effect)，是指能引起50％最大效应的浓度。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Bethesda M.d.,Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,(1987and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.1987；196:901-917；Chothia等人Nature 1989；342:878-883，或者IMGT编号系统定义，见Ehrenmann F,Kaas Q,Lefranc M P.IMGT/3Dstructure-DB andIMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,Tcell receptors,MHC,IgSF and MhcSF[J].Nucleic acids research,2009；38(suppl_1):D301-D307的定义。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(G,MilsteinC.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefinedspecificity[J].nature,1975；256(5517):495)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.Patent4,816,567)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature 1986；321:522 525；Reichmann etal.,Nature,1988；332:323 329；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.1992；2:593-596；和Clark,Immunol.Today 2000；21:397 402。在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体(Diabodies)，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90:6444-6448和Poljak R.J.et al.,Structure 1994；2:1121-1123)。
如本文中所使用的，术语“单链抗体(single chain fragment variable，ScFv)”是指，包含通过连接体连接的抗体重链可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)的分子。其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Birdet al,Science 1988；242:423-426和Huston et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988；85:5879-5883)。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-连接片段-VH-COOH或NH2-VH-连接片段-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan etal，Protein Eng.1995；8:725-731，Choi et al，Eur.J.Immunol.2001；31:94-106，Hu etal，Cancer Res.1996；56:3055-3061，Kipriyanov et al，J.Mol.Biol.1999；293:41-56和Roovers et al,Cancer Immunology,Immunotherapy,2001,50(1):51-59.描述。
如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，GS细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，CLDN18.2蛋白)。可以使用本领域技术人员知悉的方法测定KD，例如使用Fortebio分子相互作用仪测定。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，当提及CD47蛋白(NCBI GenBank:NP_001768.1)的氨基酸序列时，其包括CD47蛋白的全长，或者CD47的胞外片段CD47 ECD或者包含CD47 ECD的片段；还包括CD47蛋白的全长的融合蛋白或CD47 ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在CD47蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CD47蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述CD47蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
如本文中所使用的，当提及CLDN18.2蛋白(NCBI GenBank:NP_001002026.1)的氨基酸序列时，其包括CLDN18.2蛋白的全长，或者CLDN18.2的胞外片段CLDN18.2 ECD或者包含CLDN18.2ECD的片段；还包括CLDN18.2蛋白的全长的融合蛋白或CLDN18.2ECD的融合蛋白，例如与小鼠或人IgG的Fc蛋白片段(mFc或hFc)进行融合的片段。然而，本领域技术人员理解，在CLDN18.2蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“CLDN18.2蛋白”应包括所有此类序列，包括其天然或人工的变体。并且，当描述CLDN18.2蛋白的序列片段时，其还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。
本发明中，术语“ADCP”是指抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬(antibodydependent cellular phagoxytosis)。结合于细胞表面抗原的抗体的Fc段与具有吞噬活性的细胞如巨噬细胞的Fc受体结合，进而介导吞噬细胞吞噬结合了抗体的细胞。
本发明中，术语“ADCC”是指抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。抗体的Fab段结合病毒感染的细胞或肿瘤细胞的抗原表位，其Fc段与杀伤细胞(NK细胞、巨噬细胞等)表面的Fc受体(Fc Receptor,FcR)结合，介导杀伤细胞直接杀伤靶细胞。
本发明中，术语“CDC”是指补体依赖的细胞毒性(complement dependentcytotoxicity)。当抗体与细胞膜表面相应抗原特异性结合后，形成复合物而激活补体系统，进而在靶细胞表面形成MAC，导致靶细胞溶解。补体能导致多种细菌和其他病原生物细胞的溶解，是机体抵抗病原生物感染的重要防御机制。
在本发明中，如果没有特别说明，所述“第一”(例如第一蛋白功能区或第一药物产品)和“第二”(例如第二蛋白功能区或第二药物产品)是为了指代上的区分或表述上的清楚，并不具有典型的次序上的含义。
本发明中，术语“半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)”由IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的1条重链和1条轻链组成的抗体分子，其是一种单价抗体(例如请参见冯一帆等，HIV-1特异性单抗2G12单价抗体的构建及活性分析，中国病毒杂志，2015年5月第5卷第3期，p171-175)。
发明的有益效果
本发明取得了如下效果中的一项或多项：
(1)本发明的抗CLDN18.2抗体具有优越的亲和力和特异性；
(2)本发明的双特异性抗体例如能够很好地特异性与CLDN18.2结合，发挥针对表达CLDN18.2的细胞的抗体介导的细胞杀伤效应；
(3)本发明的双特异性抗体例如能够很好地特异性与共同表达CD47和CLDN18.2的细胞结合，发挥针对共表达CD47和CLDN18.2的细胞的抗体介导的细胞杀伤效应；
(3)本发明的双特异性抗体例如能够特异性与CD47结合，并且能够十分有效地阻断CD47与SIRPα的结合，特异地解除CD47/SIRPα介导的免疫抑制，激活免疫反应。
(4)本发明的双特异性抗体中的第一蛋白功能区和第二蛋白功能区之间具有协同作用。
(5)本发明的双特异性抗体不会引发红细胞凝集，安全性高，同时能具有ADCP、ADCC效应和CDC效应。
附图说明
图1：FACS检测8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞的结合活性。
图2：FACS检测8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2细胞的结合活性。
图3：FACS检测AsAb-8C4703与红细胞结合活性。
图4：FACS检测6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703竞争结合CHO-K1-CLDN18.2-CD47表面抗原。
图5：6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703对正常人红细胞凝集作用。
图6：8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703介导HPMM吞噬KATOⅢ-CLDN18.2细胞。
图7：8C5.1H3L3、AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)对CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞的ADCC活性检测。
图8：8C5.1H3L3、AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)对CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞的CDC活性检测。
图9：8C5.1H3L3、IMAB362介导HPMM吞噬CHO-K1-CLDN18.2细胞。
图10：间接ELISA方法检测AsAb-8C4703、8C5.1H3L3、IMAB362与抗原人CLDN18.2的结合活性。
图11：间接ELISA方法检测AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)与抗原CD47-Igv-TEV-his的结合活性。
图12：8C5.1H3L3与CLDN18.2 His结合的动力学参数检测结果。
图13：AsAb-8C4703与CLDN18.2 His结合的动力学参数检测结果。
图14：6F7H1L1(hG4)与CD47 ECD-His结合的动力学参数检测结果。
图15：AsAb-8C4703与CD47 ECD-His结合的动力学参数检测结果。
图16：AsAb-8C4703、Hu5F9-G4与T细胞结合活性检测。
图17：AsAb-8C4703、Hu5F9-G4与B细胞结合活性检测。
图18：AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)单药、8C5.1H3L3单药对MC38-CD47-CLDN18.2移植瘤C57BL/6小鼠模型的药效结果。
图19：6F7H1L1(hG4)与8C5.1H3L3联用对MC-38-CD47-CLDN18.2移植瘤C57BL/6小鼠模型的药效结果。
图20：AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)单药、8C5.1H3L3单药对MC38-CD47-CLDN18.2移植瘤C57BL/6小鼠模型体重影响。
图21：6F7H1L1(hG4)与8C5.1H3L3联用对MC-38-CD47-CLDN18.2移植瘤C57BL/6小鼠模型体重影响。
杂交瘤细胞株LT012，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018135，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
杂交瘤细胞株LT020，其于2022年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2022124，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
本发明涉及的部分序列如下：
6F7重链可变区:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCAGGAGCAGAGCTGGTGAGGCCAGGAGCATCCGTGAAGCTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACATCCTATTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCATGATCGACCCAAGCGATTCCGAGACCCACAACAATCAGATGTTTAAGGACAAGGCCACCCTGACAGTGGATAAGAGCTCCAATACCGCCTACATGCACCTGTCTAGCCTGACATCTGAGGACAGCGCCGTGTATCACTGCGCCCGGCTGTACAGATGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCCTCT(SEQ ID NO:1)
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQ RPGQGLEWIGMIDPSDSETHNNQMFKDKATLTVDKSSNTAYMH LSSLTSEDSAVYHCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:2)
6F7轻链可变区:
AACATCGTGATGACCCAGTCCCCCAAGTCTATGAGCATGTCCCTGGGCGAGAGGGTGACCCTGTCCTGTAAGGCCTCTGAGATCGTGGGCACATACGTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCACACCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCAATCGGTATACAGGCGTGCCTGACAGATTCACCGGCTCTGGCAGCGCCACAGACTTCACCCTGACAATCTCTAACGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGATTATCACTGCGGCCAGAGCTACAATTTCCCTTATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:3)
NIVMTQSPKSMSMSLGERVTLSCKASEIVGTYVSWFQQKPHQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISNVQAEDLADYHCGQSYNFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:4)
6F7CDR
HCDR1：GYTFTSYW(SEQ ID NO:5)
HCDR2：IDPSDSET(SEQ ID NO:6)
HCDR3：ARLYRWYFDV(SEQ ID NO:7)
LCDR1：EIVGTY(SEQ ID NO:8)
LCDR2：GAS(SEQ ID NO:9)
LCDR3：GQSYNFPYT(SEQ ID NO:10)
6F7H1VH:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGCTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACAAGCTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGAGACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAATGATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCCACAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACCCTGACAGTGGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGCACCTGAGCTCCCTGCGGTCCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGCTGTACCGCTGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:11)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHNAQKFQGKATLTVDKSTSTAYMHLSSLRSEDTAVYYCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:12)
6F7L1VL:
AACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACAATGTCTATGAGCCCAGGAGAGAGGGTGACCCTGTCCTGTAGAGCCTCTGAGATCGTGGGCACATACGTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTACGGAGCAAGCAACAGGTATACCGGAGTGCCAGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCGTGCAGCCTGAGGACCTGGCCGATTATCACTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:13)
NIVMTQSPATMSMSPGERVTLSCRASEIVGTYVSWFQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDLADYHCGQSYNFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:14)
6F7H2VH:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACATCCTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGAGACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGAATCATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCTCTAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCCGGGTGACCCTGACAGTGGACAAGAGCACCTCCACAGCCTACATGCACCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCAGGCTGTACCGCTGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:15)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPGQGLEWIGIIDPSDSETSNAQKFQGRVTLTVDKSTSTAYMHLSSLRSEDTAVYYCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:16)
6F7L2VL:
AACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGGGTGACCCTGTCCTGTAGAGCCTCTGAGATCGTGGGCACATACGTGTCTTGGTTTCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTATGGCGCCAGCAACAGGGCAACCGGCATCCCCGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACAGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGACCTGGCCGATTACTATTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:17)
NIVMTQSPATLSLSPGERVTLSCRASEIVGTYVSWFQQKPGQAPRLLIYGASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLADYYCGQSYNFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:18)
6F7H3VH:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCAGAGGTGGTGAAGCCAGGAGCCTCTGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCTCCGGCTACACCTTCACATCCTATTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCACCAGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGCATCATCGACCCTTCCGATTCTGAGACCTCTTACGCCCAGAAGTTTCAGGGCAGGGTGACCCTGACAGTGGACAAGAGCACCTCCACAGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGCGCAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGCTGTACAGATGGTATTTTGACGTGTGGGGAGCAGGAACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:19)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWIGIIDPSDSETSYAQKFQGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:20)
6F7L3VL:
AACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGCCACACTGTCTCTGAGCCCAGGAGAGAGGGTGACCCTGTCCTGTAGAGCCTCTGAGATCGTGGGCACATACCTGTCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCACCTAGGCTGCTGATCTACGGAGCCAGCACCAGGGCAACAGGCATCCCCGCACGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCCGTGTACTATTGCGGCCAGTCTTACAATTTCCCATATACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCAAG(SEQ ID NO:21)
NIVMTQSPATLSLSPGERVTLSCRASEIVGTYLSWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCGQSYNFPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:22)
6F7H4VH:
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAAGTGGTGAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACATCCTACTGGATGAACTGGGTGCGGCAGAGACCAGGCCAGTGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCGACCCATCTGATTCCGAGACCCACAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCCACACTGACCGTGGACAAGAGCACCTCCACAGCCTATATGCACCTGTCCTCTCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTATTACTGTGCCAGACTGTATCGGTGGTACTTTGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACAGTGACCGTGTCTAGC(SEQ ID NO:23)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPGQCLEWIGMIDPSDSETHNAQKFQGKATLTVDKSTSTAYMHLSSLRSEDTAVYYCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:24)
6F7L4VL:
AATATCGTGATGACCCAGTCTCCTGCCACAATGTCTATGAGCCCTGGCGAGAGAGTGACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCGAGATCGTGGGCACCTACGTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCAAGACTGCTGATCTATGGCGCCAGCAACCGGTATACAGGCGTGCCTGCCAGATTTTCTGGCTCCGGCTCTGGCACCGATTTCACACTGACCATCTCTAGCGTGCAGCCCGAGGATCTGGCCGATTACCACTGTGGCCAGTCCTACAACTTCCCCTATACATTCGGGTGCGGCACTAAACTCGAGATCAAA(SEQ ID NO:25)
NIVMTQSPATMSMSPGERVTLSCRASEIVGTYVSWFQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDLADYHCGQSYNFPYTFGCGTKLEIK(SEQ ID NO:26)
8C5.1VH
GAAGTGCAGCTGGTTGAGAGCGGCGGAGGACTGGTGAAACCTGGAGGATCTCTGAAGCTGAGCTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTTAGCAACTCCGCCGTGAGCTGGGTGAGACAAACACCTGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTGGCTACAATCACAAGCGGCGTGAGCTACACCTACTACCTGGACTCCGTGAGGGGCAGATTCACAATCAGCAGGGACAACGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCTATGTACTACTGTACCAGGCAGTTCAAGGGCAACGCCCTGGATTACTGGGGCCAAGGAACCTCTGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO:27)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSNSAVSWVRQTPEKRLEWVATITSGVSYTYYLDSVRGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCTRQFKGNALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:28)
8C5.1VL
GACATTGTGATGACCCAGTCCCCTTCCTCCCTGACAGTGACAGCTGGAGAGAAGGTGACAATGTCCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACTCCGGAAATCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGACAACCACCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAGGGAAAGCGGAGTTCCTGATAGATTCACCGGCAGCGGCTCCGGAACAGATTTCACACTGACAATCAACAACTTCCAGGCTGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGTCAGAACGACTACTTCTACCCTCTGACCTTCGGCGCCGGAACAAAGCTGGAACTGAAG(SEQ ID NO:29)
DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINNFQAEDLAVYYCQNDYFYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:30)
8C5.1 CDR
HCDR1：GFTFSNSA(SEQ ID NO:31)
HCDR2：ITSGVSYT(SEQ ID NO:32)
HCDR3：TRQFKGNALDY(SEQ ID NO:33)
LCDR1：QSLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:34)
LCDR2：WAS(SEQ ID NO:35)
LCDR3：QNDYFYPLT(SEQ ID NO:36)
8C5.1 H1VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNSAVSWVRQAPGKRLEWVATITSGVSYTYYLDSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQFKGNALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:37)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCTGGCTTCACCTTTTCTAACAGCGCCGTGTCTTGGGTGAGGCAGGCACCTGGCAAGCGCCTGGAGTGGGTGGCCACCATCACATCCGGCGTGTCTTACACCTACTATCTGGACAGCGTGCGGGGCAGATTCACAATCAGCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACAAGACAGTTTAAGGGCAATGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO:38)
8C5.1 H2VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNSAVSWVRQAPGKGLEWVSTITSGVSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQFKGNALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:39)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCATCTGGCTTCACCTTTTCTAACAGCGCCGTGTCTTGGGTGAGGCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCACCATCACATCCGGCGTGTCTTACACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCAGCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACACGCCAGTTTAAGGGCAATGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO:40)
8C5.1 H3VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNSAVSWVRQAPGKGLEWVSSITSGVSYTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRQFKGNALDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:41)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCATCTGGCTTCACCTTTTCTAACAGCGCCGTGTCTTGGGTGAGGCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCTCCATCACATCCGGCGTGTCTTACACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCAGCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACACGCCAGTTTAAGGGCAATGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO:42)
8C5.1 L1VL
DIVMTQSPSSLSVSPGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTINSFQAEDVAVYYCQNDYFYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:43)
GATATCGTGATGACCCAGAGCCCATCTAGCCTGTCCGTGTCTCCAGGCGAGAGAGTGACCATGAGCTGCAAGTCTTCCCAGAGCCTGCTGAATAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACATGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGCCTCCAAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACAAGAGAGAGCGGCGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGACCATCAACTCCTTCCAGGCCGAGGATGTGGCCGTGTATTACTGCCAGAACGATTACTTCTATCCCCTGACATTCGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO:44)
8C5.1 L2VL
DIVMTQSPSSLSVSPGERVTISCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSFQAEDVAVYYCQNDYFYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:45)
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCTGAGCGTGTCCCCAGGAGAGAGGGTGACAATCTCCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACAGCGGCAATCAGAAGAACTACCTGACCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAGGGAGTCTGGAGTGCCAGACAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGATTTCACCCTGACAATCTCCTCTTTTCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGAATGATTACTTCTATCCCCTGACCTTTGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO:46)
8C5.1 L3VL
DIVMTQSPSSLSVSPGERVTISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWY QQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAE DVAVYYCQNDYFYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:47)
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCTGAGCGTGTCCCCAGGAGAGAGGGTGACAATCTCCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACAGCGGCAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAGGGAGTCTGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGAATGATTACTTCTATCCCCTGACCTTTGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAG(SEQ ID NO:48)
TEV氨基酸序列为ENLYFQG(SEQ ID NO:49)
Linker(GGGGS)4的氨基酸序列：
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:50)
人hG1WT重链恒定区氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:61)铰链区、CH2结构域和CH3结构域(不含Knob突变位点S354C和T366W)：
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:62)
恒定区序列(不含hole突变位点Y349C、T366S、L368A和Y407V)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:63)
Hu5F9-G4重链氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:64)
Hu5F9-G4轻链氨基酸序列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:65)
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的下述实验例中，所用到同型对照抗体，即hIgG1、hIgG4均为靶向为人抗鸡蛋溶酶体(HEL)的抗体，这些抗体的可变区序列来自于Acierno等人发表的Affinitymaturation increases the stability and plasticity of the Fv domain of anti-protein antibodies(Acierno等人.J Mol Biol.2007；374(1):130-46.)，hIgG1的恒定区片段采用Ig gamma-1 chain C region，ACCESSION:P01857作为重链恒定区，Ig kappachain C region，ACCESSION:P01834为轻链恒定区；hIgG4重链恒定区采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION:P01861.1作为重链恒定区并引进S228P突变提高稳定性，Igkappa chain Cregion，ACCESSION:P01834为轻链恒定区；hIgG1、和hIgG4均为在中山康方生物医药有限公司的实验室制得。
制备例1：抗人CD47的抗体6F7的制备
1.杂交瘤细胞株LT012的制备
所用抗原为CD47 IgV TEV-His(包括GenbankID:NP 942088.1位置：19-141人CD47成熟肽与TEV-his标签的融合蛋白和3T3-CD47细胞(NIH/3T3，厂家：ATCC，货号：CRL-1658，在NIH/3T3的基础上转染上述人CD47成熟肽进细胞，构建3T3-CD47稳定表达系)。取免疫后小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞，分别以CD47 IgV TEV-His，3T3-CD47细胞作为抗原，对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选，获得能够分泌与CD47特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对ELISA筛选得到的杂交瘤细胞，通过竞争ELISA筛选出能够分泌与受体人SIRPαECD-hFc-Biotin(其中SIRPαECD表示SIRPα的胞外区，蛋白GenBank登录号：NP_542970.1的位置31-373；hFc为人IgG Fc纯化标签，具体为Ig gamma-1chain C region，GenbankID:P01857位置114-330)竞争结合人CD47 IgV TEV-His的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株LT012，其分泌的单克隆抗体命名为6F7。
杂交瘤细胞株LT012，其于2018年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2018135，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗CD47的抗体6F7的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium)对上面制得的LT012细胞株进行培养(CD培养基，内含1％青链霉素，Glutamax(Gibco35050079)，于5％ CO2，37℃细胞培养箱中进行培养)，7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤以及HiTrap proteinA HP柱进行纯化，制得抗体6F7。
制备例2：抗CD47的抗体6F7的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从制备例1中培养的LT012细胞株中提取mRNA。
按照InvitrogenIII First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，长度为351bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，长度为117aa
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:3所示，长度为321bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，长度为107aa。
通过IMGT编号系统定义抗体6F7的6个CDR，如下：
重链HCDR1的序列如SEQ ID NO：5所示，重链HCDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，重链HCDR3的序列如SEQ ID NO:7所示；
轻链LCDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，轻链LCDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，轻链LCDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
制备例3：抗人CD47的人源化抗体6F7H1L1(hG4)、6F7 H2L2(hG4)、6F7H3L3(hG4)和
6F7H4L4(hG4)的轻链和重链设计和制备
1.抗人CD47的人源化抗体6F7H1L1(hG4)、6F7H2L2(hG4)、6F7H3L3(hG4)和6F7H4L4(hG4)的轻链和重链设计
根据人CD47蛋白的三维晶体结构(Hage T,Reinemer P,Sebald W.Crystals of a1:1 complex between human interleukin-4 and the extracellular domain of itsreceptor alpha chain.Eur J Biochem.1998；258(2):831-6.)以及制备例2获得的抗体6F7的序列，通过计算机模拟抗体模型，根据模型设计突变，得到抗体6F7H1L1、6F7H2L2、6F7H3L3和6F7H4L4的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区序列为Ig gamma-4 chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION:P01834)。
设计的可变区序列如下：
(1)人源化单克隆抗体6F7H1L1的重链可变区和轻链可变区序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，长度为351bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，长度为117aa。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:13所示，长度为321bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，长度为107aa。
(2)人源化单克隆抗体6F7H2L2的重链可变区和轻链可变区序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:15所示，长度为351bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，长度为117aa。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:17所示，长度为321bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，长度为107aa。
(3)人源化单克隆抗体6F7H3L3的重链可变区和轻链可变区序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:19所示，长度为351bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，长度为117aa。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:21所示，长度为321bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，长度为107aa。
(4)人源化单克隆抗体6F7H4L4的重链可变区和轻链可变区序列
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:23所示，长度为351bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，长度为117aa。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:25所示，长度为321bp。
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，长度为107aa。
并且6F7H1L1、6F7H2L2、6F7H3L3和6F7H4L4具有相同的HCDR1-HCDR3和LCDR1-LCDR3，如下：
HCDR1的序列如SEQ ID NO:5所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO:6所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO:7所示；
LCDR1的序列如SEQ ID NO:8所示，LCDR2的序列如SEQ ID NO:9所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO:10所示。
2.人源化抗体6F7H1L1(hG4)、6F7H2L2(hG4)、6F7H3L3(hG4)和6F7 H4L4的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-4chain C region，ACCESSION：P01861.1；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
将6F7H1L1(hG4)重链cDNA和轻链的cDNA、6F7H2L2(hG4)的重链cDNA和轻链的cDNA、6F7H3L3(hG4)重链cDNA和轻链的cDNA以及6F7H4L4(hG4)重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-6F7H1、pUC57simple-6F7L1；pUC57simple-6F7H2、pUC57simple-6F7L2、pUC57simple-6F7H3和pUC57simple-6F7L3、pUC57simple-6F7H4和pUC57simple-6F7L4。参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切基因合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中；获得表达质粒pcDNA3.1-6F7H1、pcDNA3.1-6F7L1、pcDNA3.1-6F7H2、pcDNA3.1-6F7L2、pcDNA3.1-6F7H3、pcDNA3.1-6F7L3、pcDNA3.1-6F7H4、pcDNA3.1-6F7L4，并进一步对重组表达质粒的重轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-6F7H1/pcDNA3.1-6F7L1，pcDNA3.1-6F7H2/pcDNA3.1-6F7L2，pcDNA3.1-6F7H3/pcDNA3.1-6F7L3和pcDNA3.1-6F7H4/pcDNA3.1-6F7L4)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱(MabSelect SURE(GE))进行亲和纯化获得人源化抗体。
制备例4：抗CLDN18.2抗体8C5.1的制备
1.杂交瘤细胞株LT020的制备
所用免疫原为过表达人Claudin18.2(GenbankID:NP_001002026.1)的3T3细胞系(中国科学院)(3T3 hClaudin18.2)。取免疫后的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞。以过表达人Claudin18.2的CHO-K1细胞系(中国医学科学院基础医学研究所)(CHO-K1-hClaudin18.2)作为抗原，对杂交瘤细胞进行间接ELISA法筛选，获得能够分泌与CLDN18.2特异性结合的抗体的杂交瘤细胞。对筛选得到的杂交瘤细胞，经过有限稀释法得到稳定的杂交瘤细胞株。将以上杂交瘤细胞株分别命名为杂交瘤细胞株LT020，其分泌的单克隆抗体分别命名为8C5.1。
杂交瘤细胞株LT020，其于2022年5月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2022124，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编：430072。
2.抗CLDN18.2抗体8C5.1的制备
用CD培养基(Chemical Defined Medium，含4％ Glutamax(Gibco 35050079)，1％青链霉素(gibco 15140163))对上面制得的LT020细胞株在5％ CO2，37℃条件下进行培养。7天后收集细胞培养上清，通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，并使用HiTrap protein AHP柱进行纯化，制得抗体8C5.1。
制备例5：抗CLDN18.2的抗体8C5.1的序列分析
按照培养细胞细菌总RNA提取试剂盒(Tiangen，货号DP430)的方法，从制备例4中培养的LT020细胞株中提取mRNA。
按照InvitrogenIII First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，并进行PCR扩增。
PCR扩增产物直接进行TA克隆，具体操作参考pEASY-T1Cloning Kit(TransgenCT101)试剂盒说明书进行。
将TA克隆的产物直接进行测序，测序结果如下：
重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:27所示，片段长354bp。
其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:28所示，长度为118个氨基酸。
轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:29所示，长度为339bp。
其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:30所示，长度为113个氨基酸。
通过IMGT编号系统定义抗体8C5.1的6个CDR，如下：
重链HCDR1的序列如SEQ ID NO:31所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO:32所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO:33所示；
轻链LCDR1的序列如SEQ ID NO:34所示，LCDR2的序列如SEQ ID NO:35所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO:36所示。
制备例6：抗人CLDN18.2的人源化抗体的轻链和重链设计和制备
1.抗人CLDN18.2的人源化抗体8C5.1H1L1、8C5.1H1L2、8C5.1H2L1、8C5.1H2L2、8C5.1H2L3、8C5.1H3L2、8C5.1H3L3的轻链和重链设计
根据人CLDN18.2蛋白的三维晶体结构以及制备例5获得的抗体8C5的序列，通过计算机模拟抗体模型，随后根据模型设计突变，得到抗体8C5.1H1L1、8C5.1H1L2、8C5.1H2L1、8C5.1H2L2、8C5.1H2L3、8C5.1H3L2、8C5.1H3L3的可变区序列(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区均采用Ig gamma-1chain C region,SEQ ID NO:61；轻链恒定区为Igkappa chain C region，ACCESSION:P01834)。
设计的可变区序列如下面的表A所示。
以上的7个抗体8C5.1H1L1、8C5.1H1L2、8C5.1H2L1、8C5.1H2L2、8C5.1H2L3、8C5.1H3L2、8C5.1H3L3，重链可变区的核酸序列的长度均为354bp，其编码的氨基酸序列的长度均为118aa；轻链可变区的核酸序列的长度均为339bp，其编码的氨基酸序列的长度均为113aa。
并且上述7个抗体具有相同的HCDR1-HCDR3和LCDR1-LCDR3，如下：
HCDR1的序列如SEQ ID NO:31所示，HCDR2的序列如SEQ ID NO:32所示，HCDR3的序列如SEQ ID NO:22所示；
LCDR1的序列如SEQ ID NO:34所示，LCDR2的序列如SEQ ID NO:35所示，LCDR3的序列如SEQ ID NO:36所示。
2.人源化抗体8C5.1H1L1、8C5.1H1L2、8C5.1H2L1、8C5.1H2L2、8C5.1H2L3、8C5.1H3L2、8C5.1H3L3的制备
重链恒定区均采用Ig gamma-1chain C region，SEQ ID NO:61；轻链恒定区均采用Ig kappa chain C region，ACCESSION:P01834。
将8C5.1H1L1、8C5.1H1L2、8C5.1H2L1、8C5.1H2L2、8C5.1H2L3、8C5.1H3L2、8C5.1H3L3重链cDNA和轻链的cDNA，分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-8C5.1H1、pUC57simple-8C5.1L1；
pUC57simple-8C5.1H1、pUC57simple-8C5.1L2；
pUC57simple-8C5.1H2、pUC57simple-8C5.1L1；
pUC57simple-8C5.1H2、pUC57simple-8C5.1L2；
pUC57simple-8C5.1H2、pUC57simple-8C5.1L3；
pUC57simple-8C5.1H3、pUC57simple-8C5.1L2；
pUC57simple-8C5.1H3、pUC57simple-8C5.1L3。
参照《分子克隆实验指南(第二版)》介绍的标准技术，EcoRI&HindIII酶切合成的重、轻链全长基因，通过限制酶(EcoRI&HindIII)的酶切亚克隆到表达载体pcDNA3.1中获得表达质粒pcDNA3.1-8C5.1H1、pcDNA3.1-8C5.1L1、pcDNA3.1-8C5.1H2、pcDNA3.1-8C5.1L2、pcDNA3.1-8C5.1H3、pcDNA3.1-8C5.1L3，并进一步对重组表达质粒的重/轻链基因进行测序分析。随后将含有相应的轻、重链重组质粒设计基因组合(pcDNA3.1-8C5.1H1/pcDNA3.1-8C5.1L1、
pcDNA3.1-8C5.1H1/pcDNA3.1-8C5.1L2、
pcDNA3.1-8C5.1H2/pcDNA3.1-8C5.1L1、
pcDNA3.1-8C5.1H2/pcDNA3.1-8C5.1L2、
pcDNA3.1-8C5.1H2/pcDNA3.1-8C5.1L3、
pcDNA3.1-8C5.1H3/pcDNA3.1-8C5.1L2、
pcDNA3.1-8C5.1H3/pcDNA3.1-8C5.1L3、)分别共转染293F细胞后收集培养液进行纯化。测序验证正确后，制备去内毒素级别的表达质粒并将质粒瞬时转染HEK293细胞进行抗体表达，培养7天后收集细胞培养液，采用Protein A柱进行亲和纯化获得人源化抗体。
制备例7：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体的设计和制备
1.结构设计
本示例中的双特异性抗体命名为AsAb-8C4703，其结构如下面的表1。
表1：双特异性抗体重链和轻链的组成设计
上面的表1中:
连接片段即Linker，氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
Knob和Hole的突变位置是根据EU numbering system进行编号。
双特异性抗体AsAb-8C4703从左往右分别包含三条肽链，分别命名为HC1、HC2和L3，其组成如下：
(1)HC1组成：ScFv(6F7H4的VH+连接序列+6F7L4的VL)+铰链区+hIgG1 CH2+hIgG1CH3，其含有Knob突变位点(第354位丝氨酸突变为半胱氨酸S354C，第366位苏氨酸突变为色氨酸T366W)。
scFv序列的氨基酸序列如下(其中下划线为Linker序列)：
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVRQRPGQCLEWIGMIDPSDSETHNAQKFQGKATLTVDKSTSTAYMHLSSLRSEDTAVYYCARLYRWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNIVMTQSPATMSMSPGERVTLSCRASEIVGTYVSWFQQKPGQAPRLLIYGASNRYTGVPARFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDLADYHCGQSYNFPYTFGCGTKLEIK(SEQ ID NO:51)
铰链区、CH2结构域和CH3结构域(其中双下划线为Knob突变位点S354C和T366W)：
HC1的全长氨基酸序列如下所示：(476aa，其中下划线为Linker序列，双下划线为Knob突变位点)
HC1的全长核酸序列如下所示：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGAGCCGAAGTGGTGAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGCTGTCCTGTAAGGCCTCTGGCTACACCTTTACATCCTACTGGATGAACTGGGTGCGGCAGAGACCAGGCCAGTGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCGACCCATCTGATTCCGAGACCCACAATGCCCAGAAGTTTCAGGGCAAGGCC
ACACTGACCGTGGACAAGAGCACCTCCACAGCCTATATGCAC
CTGTCCTCTCTGAGAAGCGAGGATACAGCCGTGTATTACTGT
GCCAGACTGTATCGGTGGTACTTTGACGTGTGGGGCGCCGG
CACCACAGTGACCGTGTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGAG
GAGGAGGCAGTGGCGGAGGGGGAAGCGGCGGAGGAGGATC
AAATATCGTGATGACCCAGTCTCCTGCCACAATGTCTATGAG
CCCTGGCGAGAGAGTGACCCTGTCTTGTAGGGCCAGCGAGA
TCGTGGGCACCTACGTGAGCTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGC
CAGGCCCCAAGACTGCTGATCTATGGCGCCAGCAACCGGTA
TACAGGCGTGCCTGCCAGATTTTCTGGCTCCGGCTCTGGCAC
CGATTTCACACTGACCATCTCTAGCGTGCAGCCCGAGGATCT
GGCCGATTACCACTGTGGCCAGTCCTACAACTTCCCCTATAC
ATTCGGGTGCGGCACTAAACTCGAGATCAAAGAGCCCAAATC
CTCCGACAAGACACACACCTGTCCCCCCTGTCCTGCTCCCGA
ACTCCTCGGAGGGCCCTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCC
TAAAGATACTCTGATGATTAGTAGGACTCCCGAAGTCACCTG
TGTGGTCGTGGACGTGTCACACGAAGATCCTGAGGTCAAATT
CAACTGGTACGTGGACGGCGTCGAGGTGCATAATGCCAAGA
CCAAGCCCCGCGAGGAACAGTACAACAGCACCTATCGAGTC
GTGTCCGTCCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGG
GAAGGAGTATAAGTGCAAAGTGAGCAATAAGGCTCTGCCCG
CACCTATCGAGAAGACCATTTCCAAGGCTAAAGGACAGCCCC
GCGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTTGCCGGGACGAA
CTGACCAAGAACCAGGTCTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAGGG
CTTCTACCCAAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAATGG
ACAGCCCGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGG
ACTCCGATGGCAGCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGG
ACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCAGTTGCTCA
GTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCATTACACTCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGCAAA(SEQID NO:54)
(2)HC2组成：8C5.1H3的VH+hIgG1恒定区，其含有Hole突变位点(第349位酪氨酸突变为半胱氨酸Y349C，第366位苏氨酸突变为丝氨酸T366S，第368位亮氨酸突变为丙氨酸L368A，第407位酪氨酸突变为缬氨酸Y407V)
8C5.1H3VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示。
恒定区序列(其中双下划线为hole突变位点Y349C、T366S、L368A和Y407V)：
HC2全长氨基酸序列如下所示：(447aa，其中双下划线为为hole突变位点)
HC2的全长核酸序列如下所示：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCCGGCGGCAGCCTGAGGCTGTCCTGCGCAGCATCTGGCTTCACCTTTTCTAACAGCGCCGTGTCTTGGGTGAGGCAGGCACCTGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGAGCTCCATCACATCCGGCGTGTCTTACACCTACTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCAGCAGAGATAACGCCAAGAACAGCCTGTATCTGCAGATGAACTCTCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTACACGCCAGTTTAAGGGCAATGCCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGAGCTCCGCCTCCACAAAGGGGCCCAGCGTGTTTCCTCTCGCCCCCTCCTCCAAAAGCACCAGCGGAGGAACCGCTGCTCTCGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAACCCGTCACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACAAGCGGAGTCCATACATTCCCTGCTGTGCTGCAAAGCAGCGGACTCTATTCCCTGTCCAGCGTCGTCACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTCAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTGGAGCCCAAATCCTGCGACAAGACCCATACCTGCCCACCTTGTCCAGCTCCAGAGCTGCTGGGAGGACCAAGCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCTAAAGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCAGAGGTCACATGTGTGGTCGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAAGTCAAGTTTAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTCCATAATGCCAAGACCAAGCCCCGCGAAGAGCAGTACAACTCAACTTATCGAGTCGTGAGCGTGCTGACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGCAAAGTGTCTAACAAGGCCCTGCCTGCTCCAATCGAGAAGACCATTAGCAAGGCCAAAGGCCAGCCCAGAGAACCTCAGGTGTGCACCCTGCCTCCAAGCAGGGATGAGCTGACAAAGAACCAGGTCAGCCTGTCCTGTGCTGTGAAAGGATTCTACCCCTCCGACATCGCAGTGGAGTGGGAATCTAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACCACACCCCCTGTGCTGGATTCAGACGGCAGCTTCTTCCTGGTGAGCAAGCTGACTGTGGATAAGTCAAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTAGTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCATTACACCCAGAAATCACTGAGCCTGTCCCCCGGG(SEQ ID NO:57)
(3)L3组成：8C5.1L3的VL+人Ig kappa恒定区
8C5.1L3VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
人Ig kappa恒定区的氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:58)
L3的全长氨基酸序列如下所示：
DIVMTQSPSSLSVSPGERVTISCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYFYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:59)
L3的全长核酸序列如下所示：
GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAAGCTCCCTGAGCGTGTCCCCAGGAGAGAGGGTGACAATCTCCTGCAAGTCTAGCCAGTCTCTGCTGAACAGCGGCAATCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTACTGGGCCTCCACCAGGGAGTCTGGAGTGCCAGACAGATTCTCTGGCAGCGGCTCCGGCACAGACTTCACCCTGACAATCTCCTCTCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGTCAGAATGATTACTTCTATCCCCTGACCTTTGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAGCGTACGGTGGCAGCCCCATCTGTCTTCATTTTTCCCCCTAGTGACGAGCAGCTGAAATCCGGAACAGCCTCTGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTCTACCCTCGCGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCTCTGCAGAGTGGCAATTCACAGGAGAGCGTGACTGAACAGGACTCCAAGGATTCTACCTATAGTCTGAGCTCCACTCTGACCCTGTCCAAAGCAGATTACGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGTGAGGTCACCCACCAGGGGCTGAGTTCTCCAGTCACCAAATCCTTCAACAGAGGCGAATGT(SEQ ID NO:60)
双特异性抗体AsAb-8C4703的肽链HC1和HC2通过铰链区的两个二硫键连接，HC2和L3通过一个二硫键连接。
2.抗体的分子构建和表达纯化
分别将编码双特异性抗体AsAb-8C4703的三条多肽链的cDNA序列克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-HC1、pUC57simple-HC2、pUC57simple-L3质粒。
分别将质粒pUC57simple-HC1、pUC57simple-HC2、pUC57simple-L3进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收后分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、上清浓缩后上样至HiTrap MabSelect SuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白并回收目标样品并换液至PBS。
制得的抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体用于下面的实验。
实施例1：FACS检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体的结合活性
1.FACS(fluorescence activated cell sorter)检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异
性抗体与CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞的结合活性
收集对数生长期CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞(CHO-K1细胞过表达CLDN18.2和CD47抗原，其中CHO-K1细胞获自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，按1×105个细胞/孔将细胞转移至尖底96孔板中，加入100μL 1％ PBSA(PBS+1％BSA)，1000×g离心5min，去上清。加入1％ PBSA稀释的抗体100μL(终浓度分别为900nM、300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM、0.41nM、0.041nM和0.0041nM)，轻柔混匀后于冰上孵育40分钟。每孔加入150μL 1％ PBSA，1000xg离心5min，弃上清；再重复洗涤三次，200μL/次。加入300倍稀释的PE anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat.409304)重悬混匀，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，冰上避光孵育0.5h。加入150μL 1％PBSA，1000g离心5min，去上清，并用200μL 1％ PBSA洗涤两次。加入200μL 1％PBSA重悬细胞沉淀，并转移至流式管，FACS Calibur检测并分析结合活性。
实验结果如表2和图1所示。
表2：FACS检测8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞的结合活性
| 8C5.1H3L3 | 6F7H1L1(hG4) | AsAb-8C4703 | |
| EC50(nM) | 1.220 | 1.295 | 1.245 |
结果显示，在相同实验条件下，8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞结合的EC50分别为1.220nM、1.295nM、1.245nM。
结果表明，在相同实验条件下8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞结合活性相当，提示AsAb-8C4703具有有效结合同时表达CLDN18.2和CD47的细胞的活性。
2.FACS检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与CHO-K1-CLDN18.2细胞的结合活
性
收集对数生长期CHO-K1-CLDN18.2细胞(CHO-K1细胞过表达CLDN18.2抗原，其中CHO-K1细胞获自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)，按2.5×105个细胞/孔将细胞转移至尖底96孔板中，加入100μL 1％ PBSA(PBS+1％BSA)，1000×g离心5min，去上清。加入1％ PBSA稀释的抗体100μL(终浓度分别为900nM、300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM、0.123nM、0.0123nM和0.00123nM)，轻柔混匀后于冰上孵育40分钟。每孔加入150μL1％PBSA，1000xg离心5min，弃上清；再重复洗涤三次，200μL/次。加入300倍稀释的PEanti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat.409304)重悬混匀，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，冰上避光孵育0.5h。加入150μL 1％ PBSA，1000g离心5min，去上清，并用200μL 1％ PBSA洗涤两次。加入200μL 1％PBSA重悬细胞沉淀，并转移至流式管，FACS Calibur检测。
实验结果如表3和图2所示。
表3：FACS检测8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2细胞表面CLDN18.2的结合活性
| / | 8C5.1H3L3 | AsAb-8C4703 |
| EC50(nM) | 4.439 | 10.59 |
结果显示，在相同实验条件下，8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2细胞结合的EC50分别为4.439nM、10.59nM。
结果表明，在相同实验条件下，8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CHO-K1-CLDN18.2细胞结合活性相当，提示8C5.1H3L3、AsAb-8C4703具有有效结合CHO-K1-CLDN18.2细胞膜表面CLDN18.2的活性。
3.FACS检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与红细胞的结合活性
分离新鲜的血液(健康志愿者知情同意后自愿捐献)获得红细胞，将红细胞用适量PBS洗涤2次后调整密度，将细胞悬液按100万细胞/样本加至96孔锥底板中，每孔加入适量1％ PBSA(PBS+1％BSA)，750xg离心5min，弃上清；1％ PBSA将抗体稀释至900nM、300nM、100nM、33.33nM、11.11nM、3.70nM、1.23nM、0.41nM、0.041nM、0.0041nM，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，放置冰上孵育40min；每孔加入150μL 1％ PBSA，750xg离心5min，弃上清；再重复洗涤三次，200μL/次；用1％ PBSA稀释PE anti-human IgGFc Antibody(Biolegend,Cat.409304)，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，放置冰上避光孵育30min；每孔加入150μL 1％ PBSA，350xg离心5min，弃上清；再重复洗涤两次，200μL/次；每孔加入200μL 1％ PBSA，重悬细胞团后转移至上样管，上机检测。
实验结果如表4和图3所示。
表4：FACS检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体AsAb-8C4703与红细胞的结合活性
| AsAb-8C4703 | |
| EC50(nM) | 50.68 |
| MFImax | 24.32 |
结果显示，抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体AsAb-8C4703与红细胞结合的EC50为50.68nM。
结果表明，抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体AsAb-8C4703与红细胞仅具有极微弱的结合。
实施例2：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体对细胞膜表面抗原CD47的竞争性结合
竞争流式细胞法测定抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与hSIRPαV2竞争结合细胞膜表面抗原CD47。具体方法如下：
取CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞常规消化，按3×105个细胞/孔将细胞转移至尖底96孔板中，加入100μL 1％ PBSA离心洗涤。每管加入50μL的hSIRPαV2-hFc-mFc(中山康方生物生产，批号：20210120)，混匀，使得最终浓度为3nM，冰上孵育30min。加入相应梯度稀释的抗体(终浓度分别为900nM、300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM、0.41nM、0.041nM和0.0041nM)，每样本50μL，冰上孵育30min。每孔加入150μL 1％ PBSA，1000xg离心5min，弃上清；再重复洗涤三次，200μL/次。用1％ PBSA稀释APC Streptavidin(300倍稀释)(Biolegend,Cat.405207)，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，放置冰上避光孵育30min；每孔加入150μL 1％ PBSA，1000xg离心5min，弃上清；再重复洗涤两次，200μL/次；每孔加入200μL 1％ PBSA，重悬细胞团后转移至上样管，上机检测。
结果如图4所示，各样品的EC50值见表5。通过荧光定量分析和曲线拟合，计算出抗体6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703的竞争结合EC50分别为5.003nM、10.05nM。
表5：FACS检测6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703竞争结合CHO-K1-CLDN18.2-CD47表面抗原的荧光强度分析
| 6F7H1L1(hG4) | AsAb-8C4703 | |
| EC50(nM) | 5.003 | 10.05 |
结果显示，6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703抗体能有效地阻断hSIRPαV2对CHO-K1-CLDN18.2-CD47宿主细胞表面的CD47的结合，且呈剂量依赖关系。
实施例3：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体对正常人红细胞(RBC)凝集的影响
配制0.2mg/mL的Dextran T500溶液；分离新鲜的血液(健康志愿者知情同意后自愿捐献)获得红细胞，将红细胞用适量PBS洗涤2次后调整密度，按50μL/孔接种至96孔板(细胞数为1*107/孔)；每孔加入50μL相应抗体(抗体工作浓度为3000nM、1000nM、333.3nM、111.1nM、37.0nM、12.3nM、4.1nM、1.4nM、0.14nM、0.014nM)，阳性对照加入50μL DextranT500(0.1mg/mL)，阴性对照加入50μLPBS，同型对照组加入hIgG1(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190410)和hIgG4(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190910)抗体，置于37℃培养2-4h，观察红细胞凝集现象，并拍照。
6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703对正常人红细胞凝集作用的影响见图5。
结果显示，6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703在3000nM及更低的浓度均无红细胞凝集现象，显示了良好的安全性。
实施例4：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬
本实施例中以HPMM为效应细胞，以KATOⅢ-CLDN18.2为靶细胞，检测8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703抗体介导的细胞吞噬活性(ADCP)。具体方法如下：
收集KATOⅢ-CLDN18.2(KATOⅢ细胞过表达CLDN18.2，其中KATOⅢ细胞获自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，用PBS洗涤1次，170xg离心5min，细胞计数并测定活率；CFSE(Biolegend,Cat.423801)用PBS稀释至2.5μM，取适量稀释后的CFSE重悬细胞(染色密度：1000万细胞/mL)，放置培养箱孵育20min；加入6mL的1640完全培养基(含10％FBS)终止染色，170xg离心5min，弃上清，加入1mL的1640完全培养基重悬，放置培养箱孵育10min，调整细胞数为15万细胞/管。
用1640完全培养基稀释抗体(工作浓度为1nM、10nM、100nM、300nM)，同时设置同型对照hIgG1(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190410)、hIgG4(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190910)(工作浓度均为300nM)。
收集HPMM(分离自健康志愿者知情同意后自愿捐献的外周血)，细胞计数并测定活率；按5万细胞/管将细胞悬液加至1.5mL EP管，1200xg离心5min，弃上清；将靶细胞悬液和抗体各50μL于1.5mLEP管中，放置培养箱孵育2h。
每孔加入700μL 1％ PBSA(PBS+1％BSA)，1200xg离心5min，弃上清。用1％ PBSA稀释APC anti-mouse/human CD11b Antibody(500倍)(Biolegend，Cat.101212)，按100μL/孔将稀释后的抗体加至相应样本中并重悬细胞团，放置冰上孵育30min。每孔加入800μL1％PBSA，1200xg离心5min，弃上清，再重复洗涤2次，800μL/次。每孔加入200μL 1％ PBSA，重悬细胞团后转移至上样管，上机检测。
上机体系中巨噬细胞为APC-CD11b+阳性，发生吞噬作用的巨噬细胞则为APC-CD11b+CFSE+双阳性。以双阳性细胞在APC阳性细胞中的比例作为吞噬指数，评价抗体介导的ADCP活性。按如下公式计算各组ADCP活性，以P％表示：
结果如图6所示。
结果显示，8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703的吞噬指数明显高于空白对照及同型对照，表明8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703均具有ADCP活性，且AsAb-8C4703的ADCP活性优于8C5.1H3L3组、6F7H1L1(hG4)组以及8C5.1H3L3与6F7H1L1(hG4)联用组。
实施例5：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体ADCC活性检测
常规收集CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞，170xg离心5min后，再用培养基(RPMI-1640+1％FBS)重悬细胞，洗涤2次；用培养基重悬细胞后计数，调整细胞密度，按100μL/孔将靶细胞悬液加至96孔板中(每孔约含3*104个靶细胞)；用培养基(RPMI-1640+1％FBS)稀释抗体8C5.1H3L3、6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703(工作浓度均为3nM、1nM、0.33nM、0.11nM、0.037nM、0.0123nM、0.00123nM)，按50μL/孔将稀释后的抗体加至相应孔中，放置37℃培养箱孵育1h；同时设置阴性对照medium、同型对照hIgG1(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190410)；
常规收集效应细胞PBMC，170xg离心5min，弃上清；洗涤2次；用培养基(RPMI-1640+1％FBS)重悬细胞后计数，调整细胞密度；往预孵育后的靶细胞中加入50μL效应细胞悬液(每孔约含9*105个效应细胞)，充分混匀；置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育4h；250xg离心5min；小心吸取100μL细胞上清于新的96孔平底板中，每孔加入100μL新配的反应液，室温避光孵育30min；分别于490nm和650nm处测量OD值，各组OD值＝OD490nm-OD650nm。
结果如图7所示。
结果显示，与同型对照相比，抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体AsAb-8C4703具有ADCC活性，能够特异性杀死CLDN18.2和CD47阳性细胞，且杀伤活性优于对应单抗8C5.1H3L3和6F7H1L1(hG4)。
实施例6：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体CDC活性检测
常规消化收集CHO-K1-CLDN18.2-CD47细胞，170xg离心5min后，再用培养基(RPMI-1640+1％FBS)重悬细胞，洗涤2次；用培养基(RPMI-1640+1％FBS)重悬细胞后计数，调整细胞密度，按100μL/孔将靶细胞悬液加至96孔板中(每孔约含3*104个细胞)；用培养基(RPMI-1640+1％FBS)稀释抗体(工作浓度均为100nM、10nM、1nM、0.1nM)，按50μL/孔将稀释后的抗体加至相应孔中，室温预孵育10min；往预孵育后的靶细胞中加入50μL补体血清(终浓度2％)，充分混匀；置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育4h；250xg离心5min；小心吸取100μL细胞上清于新的96孔平底板中，每孔加入100μL新配的反应液，室温避光孵育30min；
分别于490nm和650nm处测量OD值，各组OD值＝OD490nm-OD650nm。
结果如图8所示，与同型对照hIgG1(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190410)相比，抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体AsAb-8C4703具有CDC活性，可通过补体介导杀伤肿瘤细胞，且与8C5.1H3L3活性相当。
实施例7：抗CLDN18.2抗体促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬
本实施例中以MBMM(小鼠骨髓来源的巨噬细胞，mouse bone marrow-derivedmacrophages)为效应细胞，以CHO-K1-CLDN18.2为靶细胞，检测8C5.1H3L3抗体介导的细胞吞噬活性(ADCP)。
Claudiximab(IMAB362，Zolbetuximab)是德国Ganymed公司研发的靶向CLDN18.2的人鼠嵌合单抗。Claudiximab可特异性识别、结合CLDN18.2蛋白的细胞膜外第一个细胞外域(thefirst extracellular domain，ECD1)介导抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(antibody-dependent phagocytosis，ADCP)等(Singh P,Toom S,Huang Y.Anti-claudin18.2 antibody as new targeted therapy for advanced gastric cancer[J].Journalof Hematology&Oncology,2017,10(1).)。
本实施例的具体方法如下：
常规收集CHO-K1-CLDN18.2，170xg离心5min，重悬后计数并测定活率，用PBS洗涤一次。CFSE用PBS稀释至2.5μM，取适量稀释后的CFSE重悬细胞(染色密度：1000万细胞/mL)，放置培养箱孵育20min；
加入6mL的DMEM完全培养基(含10％FBS)终止染色，170xg离心5min，弃上清；加入1mL DMEM完全培养基，放置培养箱孵育10min；抗体用DMEM完全培养基稀释抗体(10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL)，并设计同型对照抗体及参照抗体；
收集巨噬细胞，170xg离心5min，弃上清计数，转移至1.5mL的EP管中，1200xg离心5min，弃上清；将孵育30min后的肿瘤细胞+抗体悬液加至已含巨噬细胞的1.5mL的EP管中，重悬混匀，放置37℃培养箱孵育2h；每管加800μL常温的1％ PBSA，1200xg离心5min，弃上清；用800μL的PBSA洗涤一次；按100μL/样本将600倍稀释的APC anti-mouse/human CD11bantibody(Biolegend，货号：101212)加至相应样本中，混匀，冰上孵育40min。每管加800μL1％ PBSA，1200xg离心5min，弃上清；每管用200μL PBSA洗涤一次，每管加200μL 1％ PBSA重悬，转移到流式上样管，上机。
结果如图9所示。
结果显示，8C5.1H3L3、IMAB362(参照抗体)(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190704)的吞噬指数明显高于空白对照及同型对照，表明8C5.1H3L3、参照抗体IMAB362均具有ADCP活性，且8C5.1H3L3的ADCP活性优于IMAB362。
实施例8：ELISA方法测定抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与抗原的结合活性
1.间接ELISA方法分别测定AsAb-8C4703、8C5.1H3L3、IMAB362与抗原人CLDN18.2的结合活性。具体方法如下：
将人CLDN18.2，2μg/mL包被酶标板置于4℃孵育过夜，然后使用PBST洗板包被了抗原的酶标板1次，再使用1％ BSA的PBST溶液作为封闭液在37℃下对酶标板进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次，加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表6)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1:5000比例稀释的HRP标记羊抗人IgG FC(H+L)(Jackson,货号：109-035-098)二抗工作液，然后置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板3次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表6和图10所示。
表6：ELISA检测AsAb-8C4703、8C5.1H3L3、IMAB362与人CLDN18.2的结合
图10显示，AsAb-8C4703、8C5.1H3L3、IMAB362与人CLDN18.2能够有效地结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体AsAb-8C4703、8C5.1H3L3、IMAB362(作为对照)的结合效率EC50分别为0.021nM、0.011nM、0.014nM。
结果表明，在相同实验条件下，AsAb-8C4703、8C5.1H3L3具有有效结合人CLDN18.2的活性。
2.间接ELISA方法分别测定AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)与抗原CD47-Igv-TEV-his的结合活性。具体方法如下：
将CD47-Igv-TEV-his，2μg/mL包被酶标板置于4℃孵育过夜，然后使用PBST洗板包被了抗原的酶标板1次，再使用1％ BSA的PBST溶液作为封闭液在37℃下对酶标板进行封闭2小时。酶标板封闭结束后用PBST洗板3次，加入PBST溶液梯度稀释的抗体(抗体稀释梯度详见表7)，加入待测抗体的酶标板置于37℃条件下孵育30分钟，孵育完成后用PBST洗板3次。洗板后加入1:5000比例稀释的HRP标记羊抗人IgG FC(H+L)(Jackson,货号：109-035-098)二抗工作液，然后置于37℃条件下孵育30分钟。孵育完成后使用PBST洗板3次，后加入TMB(Neogen，308177)避光显色5min，加入终止液终止显色反应。立即把酶标板放入酶标仪中，选择450nm光波长读取酶标板各孔的OD数值。用SoftMax Pro 6.2.1软件对数据进行分析处理。
检测结果如表7和图11所示。
表7：ELISA检测AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)与CD47-Igv-TEV-his的结合
图11显示，AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)与CD47-Igv-TEV-his能够有效地结合，并且其结合效率呈剂量依赖关系。通过对结合的抗体进行吸光度定量分析，曲线模拟计算获得抗体AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)的结合效率EC50分别为0.164nM、0.012nM。
结果表明，在相同实验条件下，AsAb-8C4703、6F7H1L1(hG4)具有有效结合CD47-Igv-TEV-his的活性。
实施例9：人源化抗体抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体的动力学参数测定
采用Fortebio Octer分子相互作用仪检测抗体与人CLDN18.2以及CD47 ECD-His的亲和力常数。样品稀释缓冲液为PBS，0.02％Tween-20，0.1％BSA，pH7.4。抗体与人CLDN18.2亲和力检测方法，20nM抗体固定在AHC传感器上，时间60s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与CLDN18.2 His结合，CLDN18.2His浓度为6.25-100nM(两倍稀释)，时间180s，蛋白在缓冲液中解离，时间360s。抗体与人CD47 ECD-His亲和力检测方法，30nM的抗体固定在AHC传感器上，时间120s，传感器在缓冲液中平衡60s，固定在传感器上的抗体与蛋白CD47 ECD-His结合，蛋白浓度为4.94-400nM(三倍稀释)，时间50s，抗体在缓冲液中解离，时间120s。样品板震动速率为1000rpm，检测温度为30℃，频率为5.0Hz。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。数据采集软件为Fortebio Data Acquisition 12.0，数据分析软件为Fortebio Data Analysis HT 12.0。
抗体8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CLDN18.2 His结合的动力学参数见表8，动力学特征参数检测结果分别如图12和图13所示。
表8：人源化抗体8C5.1H3L3、AsAb-8C4703与CLDN18.2 His结合的动力学参数
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，抗体8C5.1H3L3、AsAb-8C4703均与抗原CLDN18.2 His有较好的亲和力。
抗体6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CD47 ECD-His结合的动力学参数见表9，动力学特征参数检测结果分别如图14和图15所示。
表9：人源化抗体6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与CD47 ECD-His结合的动力学参数
| 抗体名称 | KD(M) | kon(1/Ms) | kon误差 | kdis(1/s) | kdis误差 | Rmax(nm) |
| 6F7H1L1(hG4) | 2.73E-08 | 5.19E+05 | 9.12E+03 | 1.42E-02 | 7.83E-05 | 0.09-0.20 |
| AsAb-8C4703 | 2.17E-08 | 6.82E+05 | 1.72E+04 | 1.48E-02 | 1.12E-04 | 0.02-0.12 |
KD为亲和力常数；kon为抗原抗体结合速率；kdis为抗原抗体解离速率；KD＝kdis/kon。
结果表明，抗体6F7H1L1(hG4)、AsAb-8C4703与抗原有较好的亲和力。
实施例10：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与人免疫细胞的结合
常规收集PBMC细胞，用适量PBS洗涤2次，计数并测定细胞活率；按3×105个细胞/样本将PBMC悬液加至96孔板，750×g离心5分钟，弃上清。加入终浓度为5μg/mL的Mouse IgGIsotype Control(Thermofisher，Cat.10400C)，冰上封闭20分钟，750×g离心5分钟，弃上清。加入100μL梯度稀释的抗体(抗体工作浓度为900nM、300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、0.37nM、0.037nM、0.0037nM)，同时设计同型对照hIgG1(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20170424)和hIgG4(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20190910)(工作浓度均为900nM)，重悬细胞团，放置冰上孵育40分钟；加入1％ PBSA(PBS+1％ BSA)，750×g离心5分钟，弃上清，再重复洗涤3次。加入100μL FITC抗人CD3(Biolegend，Cat.344804)、Brilliant Violet 421TM anti-human CD19 Antibody(Biolegend，Cat.302234)、MouseAnti-Human IgG Fc-AF647(Southern Biotech，Cat.9040-31)混悬液，重悬细胞团，放置冰上避光孵育30分钟。加入1％ PBSA，750×g离心5分钟，弃上清，再重复洗涤2次。加入1％PBSA，重悬细胞团后转移至上样管，FACS Calibur检测。参照抗体Hu5F9-G4是Forty Seven公司研发的一种人源化IgG4抗体药物，以高亲和力靶向CD47。
结果如表10以及图16和图17所示。
表10：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体与人免疫细胞的结合
实验结果显示，与参照抗体Hu5F9-G4(中山康方生物医药有限公司生产，批号：20220303)比较，AsAb-8C4703与CD3+CD19-T细胞和CD3-CD19+B细胞的结合MFI值均较低，且其相应EC50均较高，表明AsAb-8C4703与CD3+CD19-T细胞和CD3-CD19+B细胞的结合活性均远弱于Hu5F9-G4。
实施例11：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体体内抑制肿瘤生长实验
为检测抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体的体内抑瘤活性，首先用MC38-CD47-CLDN18.2细胞(转染人CD47和人CLDN18.2的MC38小鼠结肠癌细胞株，中山康方生物自制，其中MC38来自上海南方模式生物科技股份有限公司)，接种于到5-7周龄的雌性C57BL/6小鼠(购买自广东药康生物科技有限公司)右侧皮下，造模与具体给药方式见表11。给药后测量各组肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。
分组后每周两次使用游标卡尺测量肿瘤大小，并根据计算公式TV＝0.5×ab2计算肿瘤体积，其中a是肿瘤的长径，b是肿瘤的短径，TV是肿瘤的体积，根据肿瘤体积计算TGI(％)(肿瘤生长抑制率)，公式：TGI(％)＝(1-meanRTV treat/meanRTV vehicle)×100％(其中RTV＝Vt/V0)，RTV为相对肿瘤体积，meanRTV treat和meanRTV vehicle分别为给药组和模型组的平均相对肿瘤体积，Vt和V0分别为第t天和第0天的肿瘤体积，采用GraphPadprism软件作图，根据TGI评价药效结果。
表11：抗CLDN18.2-抗CD47双特异性抗体治疗MC38-CD47-CLDN18.2移植瘤C57BL/6小鼠模型的给药方案(所有组别均来源于同一实验)
备注：表11中，IP表示腹腔注射，BIW表示每周两次。
结果如图18、图19、图20和图21所示。
结果显示:
分组给药后第21天，AsAb-8C4703 17mg/kg肿瘤生长抑制率TGI(％)为85.43％，在等摩尔剂量下优于6F7H1L1(hG4)20mg/kg单药组(TGI＝18.28％)，8C5.1H3L3 20mg/kg单药组(TGI＝23.09％)和6F7H1L1(hG4)20mg/kg+8C5.1H3L3 20mg/kg联用组(TGI＝23.78％)；
AsAb-8C4703 5.7mg/kg肿瘤生长抑制率TGI(％)为83.62％，在等摩尔剂量下优于6F7H1L1(hG4)6.7mg/kg+8C5.1H3L3 6.7mg/kg联用组(TGI＝51.22％)；
AsAb-8C4703 1.9mg/kg肿瘤生长抑制率TGI(％)为44.26％，等摩尔剂量下优于6F7H1L1(hG4)2.2mg/kg+8C5.1H3L3 2.2mg/kg联用组(TGI＝3.74％)。。
此外，如图20和图21所示，荷瘤鼠对受试药的耐受性均良好，各组对荷瘤小鼠体重无影响，体现了良好的安全性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (26)
1.一种双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中：
所述第一蛋白功能区为抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段，
所述第二蛋白功能区靶向不同于CLDN18.2的靶点(例如CD47)，
其中，所述抗CLDN18.2抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，并且
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示和LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，
所述抗CLDN18.2抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:41；并且
所述抗CLDN18.2抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述的抗CLDN18.2抗体：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:30所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:45所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:47所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:45所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:47所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:43所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:45所示；
或者
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:47所示。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述抗CLDN18.2抗体的重链恒定区为Ig gamma-1chain C region或Ig gamma-4chain C region；轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，
所述抗CLDN18.2抗体包括非-CDR区，且所述非-CDR区来自不是鼠类的物种，例如来自人抗体。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中：
所述抗CLDN18.2抗体与表达CLDN18.2的细胞结合的EC50为小于或等于15nM、小于或等于10nM、或者小于或等于5nM；
和/或
所述抗CLDN18.2抗体与同时表达CLDN18.2和CD47的细胞结合的EC50为小于或等于10nM、小于或等于5nM、或者小于或等于2nM；
优选地，所述EC50分别为通过FACS方法测得。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中所述抗CLDN18.2抗体是由杂交瘤细胞株LT020产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株LT020保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:C2022124。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述第二蛋白功能区为抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述抗CD47抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1至HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1至LCDR3，其中：
HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示、HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示和HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，并且
LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示和LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其中，
所述抗CD47抗体的重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24；并且
所述抗CD47抗体的轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:26。
11.根据权利要求9至10中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述的抗CD47抗体：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:4所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:22所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:26所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:14所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:18所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:22所示；
或者
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:26所示。
12.根据权利要求9至11中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述抗CD47抗体的重链恒定区为Ig gamma-1chain C region或Ig gamma-4chain C region；轻链恒定区为Ig kappa chain C region。
13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区独立地为单链抗体的融合蛋白或者半分子型单价抗体(IgG halfmolecule,IgG-HM)。
14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，
所述第一蛋白功能区为单链抗体的融合蛋白，并且所述第二蛋白功能区为半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)；
或者
所述第一蛋白功能区为半分子型单价抗体(IgG half molecule,IgG-HM)，并且所述第二蛋白功能区为单链抗体的融合蛋白。
15.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，
所述第一蛋白功能区为靶向CLDN18.2的单链抗体的融合蛋白，并且所述第二蛋白功能区为靶向CD47的半分子型单价抗体；
或者
所述第一蛋白功能区为靶向CLDN18.2的半分子型单价抗体，并且所述第二蛋白功能区为靶向CD47的单链抗体的融合蛋白。
16.根据权利要求13至15中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述单链抗体的融合蛋白由单链抗体、铰链区和Fc片段组成、或者由单链抗体和重链恒定区组成；
优选地，所述铰链区和Fc片段为人IgG1的铰链区和Fc片段；优选地，所述铰链区和Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:62所示；
优选地，所述重链恒定区为人IgG1的重链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:63所示。
17.根据权利要求13至16中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，
所述单链抗体的融合蛋白中的Fc片段或者重链恒定区具有Knob突变(例如S354C和T366W突变)；和
所述半分子型单价抗体的重链恒定区为人IgG1的重链恒定区，并且具有Hole突变(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V突变)。
18.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的双特异性抗体，其由SEQ ID NO:53所示肽链、SEQ ID NO:56所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链组成；
优选地，SEQ ID NO:53所示肽链和SEQ ID NO:56所示肽链通过铰链区的一个或多个二硫键连接，SEQ ID NO:52所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链通过一个或多个二硫键连接；
优选地，SEQ ID NO:53所示肽链和SEQ ID NO:56所示肽链通过铰链区的两个二硫键连接，SEQ ID NO:56所示肽链和SEQ ID NO:59所示肽链通过一个二硫键连接。
19.根据权利要求1至18中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中：
所述双特异性抗体与表达CLDN18.2的细胞结合的EC50为小于或等于20nM、小于或等于15nM、或者小于或等于12nM；
所述双特异性抗体与红细胞膜表面CD47结合的EC50为大于或等于20nM、大于或等于40nM、或者大于或等于50nM；
和/或
所述双特异性抗体与同时表达CLDN18.2和CD47的细胞结合的EC50为小于或等于10nM、小于或等于5nM、或者小于或等于2nM；
优选地，所述EC50分别为通过FACS方法测得。
20.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体在3000nM或更低的浓度下不会引发人红细胞凝集。
21.根据权利要求1至19中任一权利要求所述的双特异性抗体，其中，所述双特异性抗体具有ADCP活性、ADCC活性和CDC活性。
22.分离的核酸分子，其编码权利要求1至21中任一权利要求所述的双特异性抗体。
23.一种载体，其包含权利要求22所述的分离的核酸分子。
24.一种宿主细胞，其包含权利要求22所述的分离的核酸分子，或者权利要求23所述的载体。
25.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求1至21中任一权利要求所述的双特异性抗体，以及一种或多种药学上可接受的辅料。
26.权利要求1至21中任一权利要求所述的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途；
优选的，所述肿瘤为CD47和/或CLDN18.2阳性的肿瘤；
优选地，所述肿瘤为选自胆道癌、支气管癌、淋巴瘤、卵巢癌、食管癌、黑色素瘤、血液瘤、神经胶质母细胞瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌和肾癌中的一种或多种。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2022106760830 | 2022-06-15 | ||
| CN202210676083 | 2022-06-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117229412A true CN117229412A (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=89085018
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211211390.8A Pending CN117229398A (zh) | 2022-06-15 | 2022-09-30 | 抗cldn18.2抗体、其药物组合物及用途 |
| CN202310714494.9A Pending CN117229412A (zh) | 2022-06-15 | 2023-06-15 | 包含抗cldn18.2抗体的双特异性抗体、药物组合物及用途 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211211390.8A Pending CN117229398A (zh) | 2022-06-15 | 2022-09-30 | 抗cldn18.2抗体、其药物组合物及用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (2) | CN117229398A (zh) |
| WO (2) | WO2023241629A1 (zh) |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014146672A1 (en) * | 2013-03-18 | 2014-09-25 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer |
| WO2016165762A1 (en) * | 2015-04-15 | 2016-10-20 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2 |
| WO2016180468A1 (en) * | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh | Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes |
| EP3762031A4 (en) * | 2018-03-08 | 2021-12-22 | Phanes Therapeutics, Inc. | ANTI-CLAUDINE ANTIBODIES 18.2 AND THEIR USES |
| CN111518214B (zh) * | 2019-02-03 | 2023-09-22 | 上海健信生物医药科技有限公司 | 靶向cldn18.2的双特异性抗体及其制备方法和应用 |
| EP3808376A4 (en) * | 2018-06-17 | 2021-09-01 | L&L Biopharma Co., Ltd. | CLDN18.2 ANTIBODY, BISPECIFIC ANTIBODY, ADC AND CAR, AND APPLICATIONS THEREOF |
| UY38326A (es) * | 2018-08-03 | 2020-01-31 | Amgen Inc | Constructos de anticuerpos para cldn18.2 y cd3 |
| JP2021535744A (ja) * | 2018-08-27 | 2021-12-23 | ナンジン・サンホーム・ファーマシューティカル・カンパニー・リミテッドNanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. | 抗クローディン１８．２抗体及びその使用 |
| KR20210109520A (ko) * | 2018-12-28 | 2021-09-06 | 쓰촨 케룬-바이오테크 바이오파마수티컬 컴퍼니 리미티드 | 항체 및 이의 용도 |
| WO2021003082A1 (en) * | 2019-07-03 | 2021-01-07 | Phanes Therapeutics, Inc. | Anti-claudin 18.2/anti-cd47 bispecific antibodies and uses thereof |
| WO2021024020A1 (en) * | 2019-08-06 | 2021-02-11 | Astellas Pharma Inc. | Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer |
| US20220324971A1 (en) * | 2019-09-03 | 2022-10-13 | Akeso Biopharma, Inc | Anti-cd47 monoclonal antibody and use thereof |
| WO2022068810A1 (zh) * | 2020-09-29 | 2022-04-07 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 抗Claudin18.2和CD3的双特异性抗体以及其用途 |
| WO2022100590A1 (zh) * | 2020-11-10 | 2022-05-19 | 齐鲁制药有限公司 | 针对密蛋白18a2的adcc增强型人源化抗体及其应用 |
| CN112830969B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-07-26 | 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 | 一种特异性结合人Claudin18.2的单克隆抗体及包含其的药物和试剂盒 |
-
2022
- 2022-09-30 CN CN202211211390.8A patent/CN117229398A/zh active Pending
-
2023
- 2023-06-14 WO PCT/CN2023/100225 patent/WO2023241629A1/zh unknown
- 2023-06-15 WO PCT/CN2023/100452 patent/WO2023241656A1/zh unknown
- 2023-06-15 CN CN202310714494.9A patent/CN117229412A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117229398A (zh) | 2023-12-15 |
| WO2023241656A1 (zh) | 2023-12-21 |
| WO2023241629A1 (zh) | 2023-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7082620B2 (ja) | 抗ｐｄ１モノクローナル抗体、その医薬組成物およびその使用 | |
| US20230340097A1 (en) | Anti-pd-1/vegfa bifunctional antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof | |
| WO2019042119A1 (zh) | 抗人cd47抗体及其用途 | |
| CN110577597A (zh) | 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体 | |
| WO2021104302A1 (zh) | 抗pd-1-抗vegfa的双特异性抗体、其药物组合物及其用途 | |
| CN111269315B (zh) | 针对bcma的单克隆抗体 | |
| CN114181310B (zh) | 抗tigit抗体、其药物组合物及用途 | |
| CN114478769B (zh) | 抗tigit抗体、其药物组合物及用途 | |
| WO2022100694A1 (zh) | 抗体及其制备方法 | |
| WO2023241656A1 (zh) | 包含抗cldn18.2抗体的双特异性抗体、药物组合物及用途 | |
| WO2023036215A1 (zh) | 双特异性抗原结合分子及其应用 | |
| WO2022262749A1 (zh) | 靶向pd1和/或ox40的特异性结合蛋白 | |
| WO2023088337A1 (zh) | 抗tigit-抗pd-l1双特异性抗体、其药物组合物及用途 | |
| WO2023001303A1 (zh) | 药物组合物及用途 | |
| WO2023186063A1 (zh) | 抗pvrig抗体、其药物组合物及用途 | |
| WO2023134766A1 (zh) | 靶向cd25的抗体及其制备方法和应用 | |
| WO2023040940A1 (zh) | Pvrig/tigit结合蛋白联合免疫检查点抑制剂用于治疗癌症 | |
| CN116003625A (zh) | 包含抗TIGIT抗体和TGF-βR的融合蛋白、其药物组合物及用途 | |
| CN118027195A (zh) | 亲和力成熟的mica抗体及其应用 | |
| CA3230246A1 (en) | Bispecific antibody and use thereof | |
| CN116848144A (zh) | 抗pd-l1抗体及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40101629 Country of ref document: HK |