ES2693593T3 - Composición y método para la diversificación de secuencias diana - Google Patents

Abstract

Un vector de polinucleótido recombinante para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, que comprende: (a) una región de la secuencia de ácidos nucleicos en dirección 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homóloga al lado 5' del codón de inicio del ADN genómico endógeno que codifica un gen VH de inmunoglobulina de pollo; (b) un gen diana que comprende un gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una población de células de la bolsa de Fabricio de pollo, en las que dicho gen VH-D-JH se reorganiza de modo que los genes VH, D y JH están juntos; y (c) una región de la secuencia de ácidos nucleicos en dirección 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homóloga al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genómico endógeno que codifica un gen JH de inmunoglobulina de pollo, en el que el gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una célula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutación somática en una secuencia codificadora de la región VH de inmunoglobulina, y (ii) conversión génica entre una secuencia de ácidos nucleicos codificadora de VH de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de ácidos nucleicos del pseudogen VH de DT40.

Description

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DESCRIPCION

Composicion y metodo para la diversificacion de secuencias diana Referencia a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional americana N.° 61/611.446, presentada el 15 de Marzo de 2012, en la actualidad pendiente.

Listado de secuencia

El listado de secuencia asociado con esta solicitud se proporciona en formato texto en lugar de una copia en papel, y se incorpora por el presente documento como referencia en la memoria. El nombre del archivo de texto que contiene el Listado de Secuencia es 980087_402WO_SEQUENCE_LISTING.txt. El archivo de texto es de aproximadamente 17 KB, se creo el 13 de Marzo de 2013, y esta siendo presentado electronicamente via EFS-Web.

Declaracion del interes del Gobierno

Esta invencion se realizo con el soporte del gobierno bajo las becas R01 GM41712 y U54 AI081680 concedidas por el “U.S. National Institutes of Health”. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invencion.

Antecedentes

Campo de la invencion

Esta descripcion se refiere a la manipulacion dirigida de los genes a, y su integracion en, un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina. Los vectores, composiciones, y metodos descritos en el presente documento son particularmente utiles para la evolucion de anticuerpo acelerada ex vivo.

Descripcion de la tecnica anterior

Los anticuerpos monoclonales (AcM) estan bien establecidos como terapeuticos, diagnosticos y reactivos para la investigacion, pero su uso actualmente esta limitado por las dificultades y los costes asociados con la identificacion de los AcM con la afinidad y la especificidad requerida para una diana deseada. Muchas dianas de interes son protemas altamente conservadas, y los mecanismos de la regulacion inmune limitan la diversidad de anticuerpos que se pueden obtener a partir de una respuesta inmune fisiologica. Ademas, muchas dianas terapeuticas clave son protemas de la superficie celular, que representan retos particulares al desarrollo de AcM debido a que sus conformaciones fisiologicamente activas no son facilmente recapituladas por preparaciones de protemas purificadas o membrana usadas para la inmunizacion para obtener los anticuerpos espedficos. Estos componentes de superficie celular incluyen algunas dianas de especialmente alto valor para ciertos contextos clmicamente utiles, tales como receptores de citoquina y receptores acoplados a protema G.

La mayona de las estrategias actuales para el descubrimiento de AcM emplean planteamientos in vivo y/o in vitro. Los planteamientos in vivo implican la activacion y seleccion de linfocitos B productores de anticuerpo espedfico por inmunizacion, seguido de generacion de hibridomas (Kohler y col., 1975; Chiarella y col., 2008). Este proceso es costoso y requiere mucho tiempo, puesto que se requieren extenso cribado y, en muchos casos, etapas posteriores incluyendo la maduracion de la afinidad para obtener AcM con propiedades deseadas. Tambien esta limitado por la inmune tolerancia, que hace diffcil o imposible de obtener anticuerpos que espedficamente reconozcan algunos antfgenos. Ademas, una vez que se ha identificado un AcM no hay un paso directo a mas optimizacion de su afinidad o funcionalidad. Los planteamientos in vivo con frecuencia dependen de cribado de numeros masivos de anticuerpos de cadena sencilla sinteticos, generalmente presentados en fago (Winter y col., 1994; Bratkovic y col., 2010). Estos anticuerpos se expresan por genes clonados que codifican regiones variables de la cadena pesada (Vh) y variables de la cadena ligera (Vl) de inmunoglobulina unidas derivadas de un repertorio inmune, con frecuencia de un individuo convaleciente (Grandea y col., 2010; Hammond y col. 2010). Ademas se pueden optimizar por mutagenesis basada en PCR iterativa acompanada de seleccion in vitro, usando planteamientos de alta produccion. Sin embargo, el exito al final depende de la calidad de las genotecas de partida y de sus fuentes, y no todos los anticuerpos de cadena sencilla se pueden convertir facilmente en anticuerpos naturales para aplicaciones practicas.

El descubrimiento de AcM tambien se puede llevar a cabo ex vivo en linfocitos B inmortalizados. Los linfocitos B muestran moleculas de inmunoglobulina (Ig) en la superficie celular, facilitando la seleccion para el reconocimiento de antfgeno. En algunas lmeas de linfocito B, rutas fisiologicas para la diversificacion del gen de inmunoglobulina (Ig) permanecen activas, posibilitando la evolucion de anticuerpos de alta afinidad en el cultivo. La lmea de linfocito B de pollo, DT40, ha demostrado que es especialmente adaptable para tales propositos (Cumbers y col., 2002; Seo y col., 2005; Kajita y col., 2010). dT40 deriva de un linfoma bursal, y las celulas DT40 diversifican constitutivamente sus genes de la region variable de la cadena pesada (Vh) y la region variable de la cadena ligera (Vl) de

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inmunoglobulina (Arakawa y col., 2004). La diversificacion en curso se da por dos rutas, conversion genica e hipermutacion somatica (Maizels y col 2005). En resumen, la mayona de las mutaciones se hacen con molde y surgen como resultado de la conversion genica, con pseudoregiones V no funcionales que sirven como donadores para la transferencia de secuencias al gen V reordenado y transcrito. Una pequena fraccion de mutaciones son sin molde, y surgen como resultado de la hipermutacion somatica, la ruta mutagenica que genera mutaciones puntuales en genes de Ig de linfocitos B humanos y murinos activados por antfgeno. Las celulas DT40 proliferan rapidamente, con un tiempo de duplicacion de 8 a l0 horas (en comparacion con 20 a 24 horas para las lmeas de linfocito B humano), y son resistentes a manipulaciones experimentales incluyendo clasificacion celular activada magnetica (MACS), clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) y clonacion celular sencilla. Lo mas importante, las celulas DT40 soportan manipulacion genetica dirigida homologa muy eficaz (Buerstedde y col., 1991), por tanto las regiones genomicas en muchos casos se pueden reemplazar o modificar como se desee usando estrategias de recombinacion homologa apropiadamente disenadas.

A pesar del potencial considerable de las celulas DT40 para la evolucion de anticuerpo, su utilidad hasta ahora se ha limitado en la practica debido a que, como en otras lmeas de linfocito B transformadas, la diversificacion del gen de Ig se da a menos del 1 % la tasa fisiologica. El documento WO2011061937 describe metodos para introducir ADN que codifican una secuencia de aminoacidos deseada en el en el locus del gen de la region variable del anticuerpo de la lmea de linfocito B de pollo DT40-SW, que introduce mutaciones espontaneas. Buerstedde y col. (Cell, vol. 67, no. 1, p179-188, 1991) describe la transfeccion de celulas DT40 con construcciones de un gen de la cadena ligera de pollo reordenado. Se han usado varios planteamientos para acelerar la diversificacion en las celulas DT40. Esto se puede conseguir inhabilitando la ruta de recombinacion homologa (Cumbers y col., 2002), pero las celulas asf modificadas por ingeniena han perdido la capacidad de llevar a cabo manipulacion genetica dirigida, o diversificar sus genes de Ig por conversion genica, y la diversificacion produce mutaciones puntuales sin molde, como aquellas generadas durante hipermutacion somatica conducida de antfgeno en seres humanos o ratones. La diversificacion tambien se puede acelerar por tratamiento de las celulas con el inhibidor de la histona desacetilasa, tricostatina A (Seo y col., 2005). Este planteamiento incrementa la tasa de conversion genica, pero no promueve la mutagenesis puntual, limitando la diversidad potencial. Claramente queda una necesidad de generacion mas rapida y eficaz de diversidad de secuencia codificante en un gen diana de interes tal como un gen codificador de anticuerpo. Las composiciones actualmente descritas y los metodos abordan esta necesidad y ofrecen otras ventajas relacionadas.

Breve compendio

Segun un primer aspecto de la invencion descrita en el presente documento se proporciona un vector de polinucleotido recombinante para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, que comprende (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen Vh de inmunoglobulina de pollo; (b) un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio, en las que dicho gen Vh-D-Jh se reorganiza de modo que los genes Vh, D y Jh estan juntos; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jh de inmunoglobulina de pollo, en el que el gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VH de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de VH de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh de DT40. En ciertas realizaciones el gen diana comprende ademas una secuencia de polinucleotido que codifica una protema marcadora, que en ciertas realizaciones adicionales se selecciona de la protema verde fluorescente (gFp) y la protema azul fluorescente (BFP). En otras realizaciones la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina.

En un segundo aspecto se proporciona una composicion que comprende una pluralidad de vectores de polinucleotido recombinantes segun el primer aspecto de la invencion para integrar una pluralidad de genes diana en una pluralidad de loci de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo cada uno de dichos vectores (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen VH de inmunoglobulina de pollo; (b) un gen diana que comprende un gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo, en las que dicho gen Vh-D-Jh esta reorganizado de modo que los genes Vh, D y Jh estan juntos; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jh de inmunoglobulina de pollo, en el que el gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VH de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh

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de DT40, y en el que el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado se obtiene de una pluralidad de genes Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. En ciertas realizaciones el gen diana comprende ademas una secuencia de polinucleotido que codifica una protema marcadora, que en ciertas realizaciones adicionales se selecciona de la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP). En ciertas realizaciones la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina.

En otro aspecto se proporciona una composicion, que comprende (a) el vector anteriormente descrito; y (b) un segundo vector para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina, comprendiendo el segundo vector (1) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen VL de inmunoglobulina de pollo; (2) un segundo gen diana que comprende un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado que opcionalmente se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y (3) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jl de inmunoglobulina de pollo, en el que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VL de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vl de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vl de DT40. En otro aspecto se proporciona una composicion, que comprende (1) la composicion anteriormente descrita; y (2) uno o una pluralidad de vectores de polinucleotido recombinantes para integrar una pluralidad de genes diana en una pluralidad de loci de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo cada uno de dichos vectores (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen VL de inmunoglobulina de pollo; (b) un segundo gen diana que comprende un gen VL-JL de inmunoglobulina de pollo reordenado opcionalmente que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jl de inmunoglobulina de pollo, en el que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region Vl de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vl de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos de pseudogen Vl de DT40, y en el que opcionalmente el gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado se obtiene de una pluralidad de genes Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. En ciertas realizaciones el segundo gen diana comprende ademas una secuencia de polinucleotido que codifica una segunda protema marcadora, que en ciertas realizaciones mas adicionales se selecciona de la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP). En ciertas realizaciones la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada (framework) de Vl de inmunoglobulina.

Ciertos aspectos descritos en el presente documento proporcionan una celula hospedadora, que comprende cualquiera de los vectores o composiciones anteriormente descritos. En ciertas realizaciones la celula hospedadora es una celula bacteriana. En ciertas realizaciones la celula hospedadora se deriva de una celula de pollo, o es una celula de linfoma bursal de pollo, o es una celula DT40, y en ciertas realizaciones adicionales el locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina en la celula hospedadora comprende un operador de lactosa polimerizada y/o el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina en la celula hospedadora comprende un operador de lactosa polimerizada. Segun ciertos otros aspectos se proporciona una genoteca de las celulas hospedadoras descritas en el presente documento.

Volviendo a otro aspecto de la presente descripcion, se proporciona un metodo para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo, que comprende (a) someter a transfeccion linfocitos B de pollo con uno de los vectores anteriormente descritos, o someter a transfeccion linfocitos B de pollo con una de las composiciones anteriormente descritas; y (b) identificar un linfocito B de pollo en el que el gen diana esta integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina. En otro aspecto se proporciona un metodo para integrar un primer gen diana en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo e integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera de inmunoglobulina, que comprende (a) someter a transfeccion una o una pluralidad de linfocitos B de pollo con una de las composiciones anteriormente descritas para obtener una o una pluralidad de linfocitos B sometidos a transfeccion; y (b) identificar un linfocito B de pollo sometido a transfeccion (a) en el que el gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado esta integrado en el locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina y el segundo gen diana esta integrado en el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina. En otro aspecto se proporciona un metodo para producir un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de un polipeptido diana que es codificado por un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado, que

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comprende cultivar un linfocito B de pollo que contiene uno de los vectores anteriormente descritos bajo condiciones que permiten la proliferacion del linfocito B hasta que se obtiene una pluralidad de linfocitos B, en el que el linfocito B es capaz de cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh, y produciendo de ese modo un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo del polipeptido diana. En ciertos aspectos relacionados el linfocito B de pollo comprende ademas un segundo vector para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo el segundo vector (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 5' del codon de inicio del ADN genomica endogeno que codifica un gen Vl de inmunoglobulina de pollo; (b) un segundo gen diana que comprende un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado opcionalmente que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo que comprende un homologo de secuencia al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jl de inmunoglobulina de pollo, en el que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vl de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vl de DT40. En ciertas realizaciones adicionales el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo comprende un operador de lactosa polimerizada. En ciertas otras realizaciones adicionales se selecciona la celula de pollo de DT40 y DTLacO. Segun ciertos otros aspectos, los metodos anteriormente descritos comprenden ademas cribado de la pluralidad de linfocitos B de pollo para la union a un antigeno.

Estos y otros aspectos de la descripcion proporcionada en el presente documento seran evidentes tras la referencia a la siguiente descripcion detallada y dibujos adjuntos. Los aspectos y realizaciones de la descripcion se pueden modificar, si es necesario, para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones para proporcionar mas ejemplos adicionales.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra diagramas esquematicos de dos etapas de modificacion por ingeniena de la diversificacion clonal acelerada. El diagrama esquematico superior muestra el locus de la cadena pesada de Ig (IgH) reordenado y expresado, que contiene la region variable (VDJ), la region constante (CM), y la matriz Wh en direccion 5'. IgH se modifico primero por insercion de PolyLacO en la matriz Wh en celulas DT40 PoliLacO-AR, que llevan PolyLacO dirigido al locus de la cadena ligera o A de Ig (IgA) reordenado y expresado (Cummings y col., 2007; Cummings y col., 2008; Yabuki y col., 2009). Luego, este locus se modifico mas por sustitucion de la region Vh (VDJ) endogena con regiones Vh de un polluelo nuevo.

La Figura 2 muestra la tasa de diversificacion clonal acelerada en celulas DTLacO. (A) Ensayo de la perdida de IgM de superficie (sIgM) de tres transfectantes DTLacO Lacl-HP1 clonales representativos. La fraccion de celulas sIgM- en cada cultivo esta indicada abajo a la derecha en cada panel. (B) Compendio de los ensayos de la perdida de sIgM. Cada cfrculo en blanco representa el porcentaje de celulas sIgM' en un transfectante clonal, analizado tres semanas despues de la transfeccion. Las celulas analizadas eran: transfectantes control DT40 PolyLacO-AR GFP-Lacl (n=27); transfectantes DT40 PolyLacO-AR Lacl-HP1 (n=16), y transfectantes DTLacO Lacl-HP1 (n=20). (C) Perdida media de sIgM de transfectantes DT40 PolyLacO-AR Lacl-HP1 y DTLacO Lacl-HP1 en relacion con transfectantes control GFP-Lacl.

La Figura 3 muestra rapida evolucion de anticuerpos anti-estreptavidina (SAv) en celulas DTLacO. (A) El perfil de union de SAv de sucesivas poblaciones celulares seleccionadas de celulas DTLacO (izquierda) o DTLacO E47- Lacl (derecha). La seleccion se llevo a cabo en promedio a intervalos semanales. Los numeros celulares se trazaron en relacion con la senal fluorescente de SAv-PE. Las poblaciones en sucesivas rondas de seleccion se designan por encima de los picos (S0-S7). “Pre” designa poblaciones antes de cualquier clasificacion (relleno gris). (B) Cineticas de union saturacion de la poblacion S7 de DTLacO E47-Lacl. (C) Secuencias de AcM anti- SAv seleccionado de alta afinidad en comparacion con la lmea germinal (Reynaud y col., 1987; Reynaud y col., 1989). Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se identifican por encierre en recuadros. La insercion/duplicacion de 18 restos en CDR1 de Va del AcM anti-SAv recapitulo una insercion en CDR1 de la cadena ligera informada por otras selecciones de AcM anti-SAv a partir de celulas DT40 que no se habfan sometido a ninguna modificacion por ingeniena genetica (Seo y col., 2005). Las secuencias de Vh y Va de la lmea germinal se exponen en las SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente. Las secuencias de Vh y Va del AcM anti-SAv se exponen en las SEQ ID NO: 18 y 20, respectivamente.

La Figura 4 muestra AcM de alta afinidad seleccionados de celulas DTLacO. (A). Por encima, los perfiles de union de sucesivas poblaciones DTLacO Lacl-HP1 seleccionadas para el reconocimiento de receptores de superficie celular, VEGFR2, TIE2 y TROP2. Rondas de seleccion designadas por encima de los picos (S0-S8). Por debajo, cineticas de union saturacion, indicando kD aparente. (B) Especificidad de poblaciones DTLacO seleccionadas. El analisis FACS de la union de las poblaciones celulares seleccionadas para reconocimiento de alta afinidad de VEGFR2, TIE2 o TROP2 a VEGFR2 recombinante, TIE2, TROP2, SAv u ovoalbumina (OVA).

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Los picos rellenos representan el control de referencia negativo (anticuerpo secundario solo), y las lmeas solidas intensas representan la tincion para el antigeno indicado. (C) Alineamiento esquematico de las regiones Vh y Va de los AcM seleccionados para la union a VEGFR2, TIE2 y TROP2. Las lmeas horizontales claras representan regiones marco conservadas de pollo, las lmeas horizontales intensas encerradas en recuadros identifican las CDR, las barras verticales indican diferencias de resto unico en relacion con la secuencia de DTLacO mas comun, y el triangulo indica insercion.

La Figura 5 muestra la seleccion y humanizacion de los AcM anti-FN14 y anti-FZD10. (A) Esquema del trascurso del tiempo de la seleccion de los AcM anti-FN14 y anti-FZD10, con etapas de seleccion indicadas por S, y afinidades aparentes (kp) de los AcM quimericos recombinantes mostrados mas adelante. (B) Alineamiento esquematico de las regiones Vh y Va de los AcM seleccionados para la union a FN14 y FZD10. Las lmeas horizontales claras representan regiones marco conservadas de pollo, las lmeas horizontales intensas encerradas en recuadros identifican las CDR, las barras verticales indican las diferencias de resto unico en relacion con la secuencia DTLacO mas comun, y el triangulo indica insercion. (C) Humanizacion de anticuerpo. Las regiones Vh y Va de los AcM humanizados hFS24 y hFZ2 esquematicamente alineados al consenso Vh-IIi o Va-III humano (lmeas superiores). Las lmeas horizontales claras representan regiones marco conservadas humanas; los asteriscos indican los dos restos eliminados del N-terminal de la cadena ligera; las lmeas verticales fuera de los recuadros identifican restos de la zona Vernier conservados en los AcM humanizados; otras indicaciones como en el Panel B. (D) Afinidades aparentes (ko) de los AcM de FZ2 (anti-FZD10) humanizados y progenitores.

Descripcion detallada

La presente descripcion se refiere en parte a vectores de polinucleotido recombinantes, y a composiciones relacionadas, celulas hospedadoras, genotecas y metodos para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo. En particular, los metodos descritos en el presente documento contemplan reemplazar un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo con un gen diana por recombinacion homologa en un linfocito B de pollo. El locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo ha sido sumamente diffcil de caracterizar (vease, Reynaud y col., Cell 59:171-83, 1989). Por lo tanto, la integracion con exito de genes diana en este locus no se podfa haber previsto previamente y hoy en dfa sorprendentemente se ha conseguido por primera vez segun la descripcion encontrada en el presente documento. La integracion de los genes diana en este locus permite ventajosamente diversificacion acelerada de genes diana integrados a traves de cualquiera o ambas de hipermutacion somatica y conversion genica en un linfocito B de pollo.

En un ejemplo preferido, los genes (Vh-D-Jh) de la region variable de la cadena pesada (Vh), la region de diversidad (D) y la region de union (J) de inmunoglobulina de pollo independientemente reordenados (por ejemplo, una genoteca de Vh de regiones Vh-D-Jh ya reordenadas derivadas de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo) se usan para reemplazar un gen Vh-D-Jh de pollo endogeno en un linfoma de linfocito B, tal como DT40. Tal sustitucion promueve la generacion acelerada de la diversidad de secuencia de Vh por los linfocitos B en combinacion con hipermutacion somatica y mecanismos de conversion genica. Los metodos descritos en el presente documento son utiles para generar una genoteca diversa de inmunoglobulinas (Ig) que se pueden someter a cribado para identificar y recuperar anticuerpos capaces de unirse espedficamente a antfgenos diana deseados.

Vectores

En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona un vector de polinucleotido recombinante para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo. El vector de polinucleotido recombinante comprende: (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo; (b) un gen diana; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo. En un aspecto preferido, el gen diana es un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado, el cual tras la integracion en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VH de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh de DT40. En ciertos aspectos la hipermutacion somatica se puede dar en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad (CDR) de Vh de inmunoglobulina, y en ciertos aspectos la hipermutacion somatica se puede dar en una secuencia codificadora de la region marco conservada (FW) de Vh de inmunoglobulina y en ciertos aspectos la hipermutacion somatica se puede dar en tanto una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad (CDR) de VH de inmunoglobulina como en una secuencia codificadora de la region marco conservada (FW) de Vh de inmunoglobulina.

Un “vector de polinucleotido recombinante” se refiere a una molecula de polinucleotido de no origen natural util para transferir informacion codificante a una celula hospedadora. Tales vectores se generan usando tecnicas de recombinacion de ADN.

Un “locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina” se refiere al locus en el que un gen que codifica la cadena pesada de inmunoglobulina reside en el genoma de pollo. Contiene un gen Jh unico y un gen Vh funcional

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unico de 15 kb en direccion 5', con genes de aproximadamente 15 D intermedios. Vease, Reynaud y col., Cell 59:171-83, 1989. Este locus tambien contiene un grupo de pseudogenes (WH) que abarcan 60 a 80 kb, comenzando 7 kb en direccion 5' a partir del gen Vh, as^ como un grupo de genes C que codifican regiones constantes de la inmunoglobulina en direccion 3' del gen Jh.

El locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo se ha conocido durante largo tiempo como que es excepcionalmente diffcil de caracterizar o secuenciar (Reynaud y col., Cell 59: 171-83, 1989). Tales dificultades pueden ser debidas a la riqueza de GC (es decir, una alta frecuencia y preponderancia de dinucleotidos G-C emparejados) y/o a la presencia de muchas secuencias de nucleotidos repetidas en este locus.

Un “gen diana” se refiere a un gen que codifica una protema de interes. En un aspecto preferido, un gen diana es un gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado.

Un “gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado” se refiere a un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado en una celula somatica del linaje de linfocito B de manera que los genes Vh, D y Jh estan juntos en lugar de separados por otras secuencias, como en otras celulas. “Gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina” se usa en el presente documento intercambiablemente con “gen VDJ de Ig” o “gen VDJ de inmunoglobulina”. En ciertos aspectos, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado se afsla de una celula de la bolsa de Fabricio de pollo.

“Integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo” se refiere a integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo por recombinacion homologa. Mas espedficamente, tal integracion se efectua por recombinacion homologa entre un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo endogeno de un linfocito B (por ejemplo, una celula DT40) y un vector de polinucleotido recombinante que comprende tanto una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo y una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo. El vector ademas comprende el gen diana entre la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo y la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo.

Una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo” se refiere a una region en un genoma de pollo que esta en direccion 5' a partir del codon de inicio (por ejemplo, localizado 5' al codon de inicio cuando se usa la hebra codificante o sentido para la orientacion) de un gen Vh de inmunoglobulina de pollo en ciertos aspectos. Tal region tambien es referida como una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo de origen natural”. Esta region debe ser suficientemente larga en un vector de polinucleotido recombinante para permitir recombinacion homogenea con un gen Vh-D-Jh endogeno de un linfocito B de pollo. En ciertos aspectos, esta region es al menos 100 a 2.000 o al menos 500 a 2.000 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo, por ejemplo, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, o al menos

1.500) nucleotidos de largo. En ciertos aspectos, el terminal 3' de la region es de 1 a 1.000 (incluyendo todos los numeros enteros en este intervalo) nucleotidos a partir del codon de inicio de un gen Vh de inmunoglobulina de pollo. En ciertos aspectos, una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo no incluye ninguna secuencia en la matriz Wh. En ciertos otros aspectos, una region de la secuencia de acidos nucleotidos en direccion 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo puede incluir una secuencia de la matriz Wh.

En ciertos otros aspectos, “una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo” tambien puede incluir una secuencia que es suficientemente homologa a una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo de origen natural para permitir recombinacion homologa con un gen Vh-D-Jh endogeno de un linfocito B de pollo. Tales regiones pueden compartir al menos 80,0 a 99,9 o al menos 90,0 a 99,9 (incluyendo todos los valores en el intervalo, por ejemplo, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95 o al menos 99) por ciento de identidad con una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo de origen natural.

El termino “unido de forma operativa” significa que los componentes a los que se aplica el termino estan en una relacion que los permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control de transcripcion “unida de forma operativa” a una secuencia codificante de protema esta ligada a la misma de modo que la expresion de la secuencia codificante de protema se consigue bajo condiciones compatibles con la actividad transcripcional de las secuencias control.

El termino “secuencia control” como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleotido que pueden afectar a la expresion, procesamiento o localizacion intracelular de secuencias codificantes a las que estan ligadas o unidas de forma operativa. La naturaleza de tales secuencias control puede depender del organismo hospedador. En aspectos particulares, las secuencias control de la transcripcion para procariotas pueden incluir un promotor, sitio de union ribosomal, y secuencia de finalizacion de la transcripcion. En otros aspectos particulares, las secuencias control de la transcripcion para eucariotas puede incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para los factores de la transcripcion, secuencias potenciadoras de la transcripcion, secuencias de finalizacion de la transcripcion y secuencias de poliadenilacion. En ciertos aspectos, las

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“secuencias control” pueden incluir secuencias Ifder y/o secuencias pareja de fusion.

El termino “polinucleotido” como se refiere en el presente documento significa poKmeros de acidos nucleicos de cadena sencilla o doble cadena. En ciertos aspectos, los nucleotidos que comprenden el polinucleotido pueden ser ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos o una forma modificada de cualquiera de los dos tipos de nucleotidos. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de base tales como bromouridina, modificaciones de ribosa tales como arabinosido y 2',3'-didesoxirribosa y modificaciones del enlace de internucleotidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato. El termino “polinucleotido” espedficamente incluye formas de cadena sencilla o doble de ADN.

El termino “nucleotidos de origen natural” incluye desoxirribonucleotidos y ribonucleotidos. El termino “nucleotidos modificados” incluye nucleotidos con grupos de azucar modificados o sustituidos y similares. El termino “enlaces de oligonucleotido” incluye enlaces de oligonucleotido tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Vease, por ejemplo, LaPlanche y col., 1986, Nucl. Acids Res., 14:9.081; Stec y col., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106:6.077; Stein y col., 1988, Nucl. Acids Res., 16:3.209; Zon y col., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon y col., 1991, “OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH”, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford Inglaterra; Stec y col., patente americana N.° 5.151.510; Uhlmann y Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543. Un oligonucleotido puede incluir una etiqueta detectable para posibilitar la deteccion del oligonucleotido o su hibridacion.

El termino “vector” se usa para referirse a cualquier molecula (por ejemplo, acido nucleico, plasmido, o virus) usado para transferir informacion codificante a una celula hospedadora. El termino “vector de expresion” se refiere a un vector que es adecuado para la transformacion de una celula hospedadora y contiene secuencias de acido nucleico que dirigen y/o controlan la expresion de las secuencias de acidos nucleicos heterologas insertadas. La expresion incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripcion, traduccion y corte y empalme de ARN, si los intrones estan presentes.

Como se entendera por aquellos expertos en la tecnica, los polinucleotidos pueden incluir secuencias genomicas, secuencias extragenomicas y codificadas por plasmido y segmentos de gen modificado por ingeniena mas pequenos que expresan, o pueden adaptarse para expresar, protemas, polipeptidos, peptidos y similares. Tales segmentos se pueden aislar naturalmente, o modificar sinteticamente por los expertos en la tecnica.

Como se reconocera por los expertos en la tecnica, los polinucleotidos pueden ser de cadena sencilla (codificante o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser moleculas de ADN (genomico, ADNc o sintetico) o de ARN. Las moleculas de ARN pueden incluir moleculas de ARNhn, que contienen intrones y corresponden a una molecula de ADN de una manera uno a uno, y moleculas de ARNm, que no contienen intrones. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no necesitan, estar presentes en un polinucleotido segun la presente descripcion, y un polinucleotido puede, pero no necesita, estar unido a otras moleculas y/o materiales de soporte. Los polinucleotidos pueden comprender una secuencia natural o pueden comprender una secuencia que codifica una variante o derivado de tal secuencia.

Cuando se comparan secuencias de polinucleotido, se dice que dos secuencias son “identicas” si la secuencia de nucleotidos en cada una de las dos secuencias es la misma cuando las secuencias se alinean para la maxima correspondencia. La identidad en porcentaje entres dos secuencias de nucleotidos como se describe en el presente documento (por ejemplo, con respecto a una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo y una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo) se puede determinar segun practicas y criterios aceptados por la tecnica, por ejemplo, los algoritmos BLAST y BLaSt 2.0 descritos en Altschul y col., Nucl. Acids Res. 25:3.389-3.402 (1977) y Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. El programa informatico para la realizacion de los analisis BLAST esta publicamente disponible en el “National Center for Biotechnology Information”. En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumulativas se pueden calcular usando, para secuencias de nucleotidos, los parametros M (puntuacion de recompensa para un par de restos de emparejamiento; siempre >0) y N (puntuacion de castigo para restos de mal emparejamiento; siempre <0). Las extensiones de las correspondencias de palabra en cada region se paran cuando: la puntuacion de alineamiento acumulativo cae fuera de la cantidad X de su valor alcanzado maximo; la puntuacion acumulativa llega a cero o por debajo, debido a la acumulacion de uno o mas alineamientos de resto de puntuacion negativa; o se alcanza el final de cualquier de las dos secuencias. Los parametros W, T y X del algoritmo de BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleotidos) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, y expectacion (E) de 10, y los alineamientos de la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10.915 (1989)), (B) de 50, expectacion (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparacion de ambas hebras.

Una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo” se refiere a una region que esta en direccion 3' a partir del sitio de corte y empalme (por ejemplo, localizada 3' al sitio de corte y empalme cuando se usa la hebra codificante o sentido para la orientacion) de un gen Jh de inmunoglobulina de pollo en ciertos aspectos. Tal region tambien es referida como una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo de origen natural”. Esta region debe ser suficientemente larga en

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un vector de polinucleotido recombinante para permitir recombinacion homologa con un gen Vh-D-Jh endogeno de un linfocito B de pollo. En ciertos aspectos, esta region es al menos 100 a 2.000 o al menos 500 a 2.000 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo, por ejemplo, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, o al menos

1.500) nucleotidos de largo. En ciertos aspectos, al menos uno del terminal 5' de la region y el terminal 3' de la region es 1 a 1.000 (incluyendo todos los numeros enteros en este intervalo) nucleotidos a partir del sitio de corte y empalme de un gen Jh de inmunoglobulina de pollo. En ciertos aspectos, una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo no incluye ninguna secuencia en el grupo de genes C que codifican regiones constantes de una cadena pesada de inmunoglobulina.

En ciertos otros aspectos, “una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo” tambien puede incluir una secuencia que es suficientemente homologa a una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo de origen natural para permitir recombinacion homologa con un gen Vh-D-Jh endogeno de un linfocito B de pollo. Tales regiones pueden compartir al menos 80,0 a 99,9 o al menos 90,0 a 99,9 (incluyendo todos los valores en el intervalo, por ejemplo, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, o al menos 99) por ciento de identidad con una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo de origen natural.

La lmea de linfocito B de pollo DT40 se deriva de un linfoma bursal inducido por virus de la leucosis aviar. Se detiene en una fase de diferenciacion del linfocito B de la bolsa y se sabe que muta constitutivamente sus genes de inmunoglobulina cadena pesada y ligera en cultivo. Como otros linfocitos B, esta mutagenesis constitutiva dirige las mutaciones a la region variable (V) de los genes de la inmunoglobulina (Ig), y por tanto, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las moleculas anticuerpo expresadas. La mutagenesis constitutiva en las celulas DT40 tiene lugar por conversion genica usando como secuencias donadoras una matriz de genes V no funcionales (pseudogenes V; W) situada en direccion 5' de cada region V funcional. Previamente se mostro que la delecion de la region W en el locus de la cadena ligera causa un cambio en el mecanismo de diversificacion de conversion genica a hipermutacion somatica, el mecanismo comunmente observado en los linfocitos B humanos. Tambien se ha demostrado que DT40 soporta eficiente recombinacion homologa, que posibilita la creacion de celulas modificadas en las que los genes espedficos se modifican, se someten a delecion o insertan o en las que los genes espedficos de interes reemplazan un gen endogeno, en particular un gen de Ig reordenado.

La “hipermutacion somatica” se refiere a la mutacion de un acido nucleico en una celula somatica a una tasa por encima de lo anterior (por ejemplo, de manera estadfsticamente significante). Preferiblemente, la hipermutacion se refiere a una tasa de mutacion de entre 10‘5 y 10‘3 pb_1 generacion’1 al nivel fisiologico. Esta es mucho mayor que las tasas de mutacion anteriores, que son del orden de 10‘9 y 10‘10 pb_1 generacion'1. La hipermutacion somatica se puede detectar por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, las secuencias de los genes variables de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, secuencias codificadoras de la region determinante de complementariedad de los genes variables de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina) de celulas somaticas (por ejemplo, linfocitos B) se pueden comparar con la secuencia genica variable de la lmea germinal mas homologa. En ciertos aspectos, las secuencias de las celulas somaticas difieren en al menos 1 a 10 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo, por ejemplo, al menos 1, al menos 2, al menos 5, o al menos 10) por ciento de sus secuencias de la lmea germinal correspondiente.

“Conversion genica” se refiere a la transferencia de la informacion de secuencia de manera unidireccional de un alelo homologo al otro. Por ejemplo, la conversion genica incluye el proceso por el cual regiones pseudo V no funcionales (por ejemplo, pseudogenes Vh o Vl) sirven como donadores para transferir de una parte de la secuencia de nucleotidos al gen V reordenado y transcrito (por ejemplo, genes Vh o Vl reordenados y transcritos). La conversion genica se puede detectar por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, incluyendo la comparacion de las secuencias de los genes V reordenados con aquellas de las regiones pseudo V.

La hipermutacion somatica y la conversion genica generan diversidad natural en los genes VDJ y VJ de inmunoglobulina de linfocitos B. La hipermutacion somatica tiene lugar en los centros germinales despues de la estimulacion de antfgeno. La conversion genica tiene lugar en organos linfoides primarios, como la bolsa de Fabricio en pollo y otras especies aviares, independiente de la estimulacion de antfgeno. En pollo, los tramos a partir de los pseudogenes V en direccion 5' se transfieren en el gen Vh-D-Jh o Vl-Jl reordenado.

En ciertos aspectos, el gen diana puede ser un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de mairnfero (por ejemplo, ser humano, raton o conejo) reordenado o un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina humanizada. Al integrar la composicion descrita en el presente documento en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, el gen Vh- D-Jh de inmunoglobulina de mai^ero (por ejemplo, ser humano, raton o conejo) reordenado o el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina humanizada se puede diversificar por hipermutacion somatica, conversion genica o ambas en un linfocito B de pollo, tal como una celula DT40.

En ciertos aspectos, el gen diana no incluye genes Vh-D-Jh reordenados descritos en la publicacion de la solicitud PCT N.° 2009/029315.

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En ciertos aspectos, el gen diana es un gen que codifica una protema marcadora, tal como la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP). Genes como ejemplos adicionales incluyen aquellos que codifican resistencia a anticuerpos tales como neomicina, blasticidina, histidinol, higromicina, zeocina, zeomicina y puromicina. Genes diana como ejemplos adicionales incluyen genes Vh-D-Jh reordenados fusionados con una secuencia codificante para un epftopo marcador tal como una etiqueta FLAG, Myc o HA.

Los vectores de polinucleotido recombinantes que contienen genes que codifican de protemas marcadoras se pueden usar para facilitar la integracion de otros genes diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo. Por ejemplo, un vector de polinucleotido recombinante que comprende una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo, un gen de GFP, y una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo se pueden usar para integrar primero el gen de GFP en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de un linfocito B de pollo. Los linfocitos B de pollo con el gen de GFP integrado se pueden detectar facilmente basandose en la fluorescencia generada por la GFP celularmente expresada. A continuacion, tales linfocitos B se pueden someter a transfeccion con un segundo vector de polinucleotido recombinante que comprende tambien una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo y una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo pero un segundo gen diana (por ejemplo, un gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado). Por recombinacion homologa, el gen de GFP se puede reemplazar por el segundo gen diana en alguna de los linfocitos B sometidos a transfeccion, dichas celulas se pueden detectar facilmente mediante la perdida de fluorescencia producida por GFP.

En ciertos aspectos, el gen diana es un gen que codifica una enzima de interes. El vector de polinucleotido recombinante que comprende tal gen diana es util en la diversificacion de la enzima de manera que se pueden obtener variantes de la enzima que tienen propiedades modificadas (por ejemplo, actividad catalttica, especificidad de sustrato y/o estabilidad de calor). Genes diana como ejemplos incluyen aquellos que codifican receptores, ligandos, proteasas, lipasas, glucosidasas, fosfatasas, quinasas y nucleasas.

En ciertos aspectos, los vectores de polinucleotido recombinantes de la presente descripcion comprenden dos o mas genes diana. Por ejemplo, un vector de polinucleotido recombinante que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado ademas puede comprender otro gen que codifica una protema marcadora.

Vectores de polinucleotido recombinantes de la presente descripcion pueden en ciertos aspectos contener una o mas secuencias reguladoras, incluyendo secuencias promotoras, secuencias de finalizacion, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y/u otras secuencias segun sea apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, virales, por ejemplo, fago, o fagomido, como sea apropiado. Para mas detalles, vease, por ejemplo, “Molecular Cloning: a Laboratory Manual”: 2° edicion, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para la manipulacion del acido nucleico, tal como preparacion de construcciones de acido nucleico, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas, etc. estan descritos en detalle en “Current Protocols in Molecular Biology”, Segunda Edicion, Ausubel y col. eds., John Wiley & Sons, 1992, o sus actualizaciones posteriores.

Composiciones

La presente descripcion tambien proporciona, segun ciertos aspectos, composiciones que comprenden los vectores de polinucleotido recombinantes descritos en el presente documento.

En ciertos aspectos, se proporciona una composicion que comprende vectores de polinucleotido recombinantes multiples como se describe en el presente documento. Por ejemplo, como se describe en el presente documento tal composicion puede comprender una pluralidad de vectores de polinucleotido recombinantes para integrar una pluralidad de genes diana en una pluralidad de loci de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo. Cada uno de los vectores comprende: (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo; (b) un gen diana; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo. Los genes diana en diferentes vectores de la composicion pueden tener diferentes secuencias de nucleotidos y pueden codificar una o una pluralidad de protemas diana y/o una o mas variantes de las mismas.

Una “variante” de una “protema diana” es una protema que tiene al menos 60 a 99,5 (incluyendo todos los valores en el intervalo anterior, por ejemplo, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 75, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95 o al menos 99) por ciento de homologfa de secuencia con la protema diana.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de homologfa de las dos secuencias de aminoacidos tambien se determina usando los programas BLAST de Altschul y col. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) con sus parametros por defecto.

En un aspecto preferido, el gen diana es un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado, que tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse

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a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de Vh de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y/o en una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh de DT40. En un aspecto preferido adicional, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado se obtiene de una pluralidad de genes Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. La edad del pollo a partir del cual se obtiene las celulas de la bolsa de Fabricio puede ser dfa 15 embrionario a dfa 180 despues de incubar (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo). Los genes Vh-D- Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo pueden haberse diversificado ya por hipermutacion somatica y conversion genica in vivo. Se pueden diversificar mas cuando se integran de nuevo en los loci de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo por los vectores proporcionados en el presente documento.

Segun ciertos aspectos descritos en el presente documento hay contemplado una composicion que comprende vectores de polinucleotido recombinantes multiples para integrar los genes Vh-Jh de inmunoglobulina reordenados multiples en los loci de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo. Tal composicion es util para preparar una genoteca de regiones variables de la cadena pesada de inmunoglobulina, como se describe mas adelante.

En ciertos aspectos se proporciona una composicion que comprende un primer vector de polinucleotido recombinante para integrar un primer gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo como se describe en el presente documento, y un segundo vector de polinucleotido recombinante para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo. El segundo vector de polinucleotido recombinante comprende: (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo; (b) un segundo gen diana; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo.

De una manera similar a lo anteriormente descrito para el primer gen diana, el segundo gen diana puede ser un gen que codifica alguna protema de interes, tal como inmunoglobulinas, protemas marcadoras y enzimas.

En ciertos aspectos, los primeros y segundos genes diana codifican subunidades de una protema o dos protemas que se unen una con otra para formar un complejo proteico. La composicion en tales aspectos es util en la diversificacion de ambas subunidades o protemas para modificar las caractensticas (por ejemplo, afinidad de union o especificidad) de los complejos resultantes. Por ejemplo, el primer gen diana puede codificar una region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de mairnfero (incluyendo ser humano, raton o conejo) o humanizada), y el segundo gen diana puede codificar una region variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, una region variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de mai^ero (incluyendo ser humano, raton o conejo) o humanizada). La composicion en este ejemplo es util en la integracion de ambos genes diana en el genoma de un linfocito B de pollo (por ejemplo, celulas DT40) y diversificacion de las regiones variables tanto cadena pesada como ligera de inmunoglobulina para desarrollar regiones variables de la inmunoglobulina con afinidad y/o especificidad alterada a un antfgeno.

En una realizacion preferida, el primer gen diana es un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado y el segundo gen diana es un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado. Tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, el primer gen diana es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de VH de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de VH de inmunoglobulina y/o en una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen VH de DT40; y el segundo gen diana es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de Vl de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina y/o en una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vl de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vl de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vl de DT40.

Un “locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo” se refiere al locus en el que un gen que codifica la cadena ligera de inmunoglobulina reside en el genoma de pollo. Contiene un gen Jl unico y un gen Vl funcional en direccion 5'. Vease, Reynaud y col., Cell 40:283-91, 1985, publicacion de solicitud de patente americana N.° US 2007/0186292, y publicacion de solicitud PCT N.° WO 2009/029315. Este locus tambien contiene un grupo de pseudogenes (Wl) en direccion 5' a partir del gen Vl asf como un gen C que codifica una region constante de la cadena ligera de inmunoglobulina del gen Jl.

Un “gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo” se refiere a un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado en una celula somatica del linaje de linfocito B de manera que los genes Vl y Jl esten juntos en lugar de separados por

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otras secuencias como en otras celulas (por ejemplo, celulas de la lmea germinal). El “gen Vl-Jl de inmunoglobulina” se usa en el presente documento intercambiablemente con el “gen Vl de Ig” o “gen VJ de inmunoglobulina”. En ciertas realizaciones, el gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado se afsla de una celula de la bolsa de Fabricio de pollo.

“Integrar un gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo” se refiere a integrar un gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo por recombinacion homologa. Mas espedficamente, tal integracion se efectua por recombinacion homologa entre un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo endogeno de un linfocito B (por ejemplo, una celula DT40) y un vector de polinucleotido recombinante que comprende tanto una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo como una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo. El vector ademas comprende el gen diana entre la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo y una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo.

Una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo” se refiere a una region en un genoma de pollo que esta en direccion 5' a partir del codon de inicio (por ejemplo, localizada 5' al codon de inicio cuando se usa la hebra codificante o sentido para la orientacion) de un gen Vl de inmunoglobulina de pollo en ciertos aspectos. Tal region tambien es referida como una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo de origen natural”. Esta region debe ser suficientemente larga en un vector de polinucleotido recombinante para permitir recombinacion homologa con un gen Vl-Jl endogeno de un linfocito B de pollo. En ciertos aspectos, esta region es al menos 100 a 2.000 o al menos 500 a 2.000 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo, por ejemplo, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, o al menos

1.500) nucleotidos de largo. En ciertos aspectos, el terminal 3' de la region es 1 a 1.000 (incluyendo todos los numeros enteros en este intervalo) nucleotidos a partir del codon de inicio de un gen Vl de inmunoglobulina de pollo. En ciertos aspectos, una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo no incluye ninguna secuencia en la matriz Wl. En ciertos otros aspectos, sin embargo, una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VL de inmunoglobulina de pollo puede incluir una secuencia de la matriz ^Vl. Por ejemplo, ciertos vectores dirigidos a Vl pueden comprender una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que contiene uno, dos o mas pseudogenes Vl en el grupo de homologfa en direccion 5'. Como un ejemplo, un vector dirigido a Vl contema dos pseudogenes Vl en la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo como resultado de la distancia de secuencia (aproximadamente 2,4 kb) entre la region codificadora de Vl y el pseudogen Vl en direccion 5' mas cercano, que era una distancia relativamente corta en comparacion con el espacio entre los elementos homologos en el locus IgH.

En ciertos otros aspectos, una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo” tambien puede incluir una secuencia que es suficientemente homologa a una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VL de inmunoglobulina de pollo de origen natural para permitir recombinacion homologa con un gen Vl-Jl endogeno de un linfocito B de pollo. Tales regiones pueden compartir al menos 80,0 a 99,9 o al menos 90,0 a 99,9 (incluyendo todos los valores en el intervalo, por ejemplo, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, o al menos 99) por ciento de identidad con una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo de origen natural.

Una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo” se refiere a una region que esta en direccion 3' a partir del sitio de corte y empalme (por ejemplo, localizada 3' al sitio de corte y empalme cuando se usa la hebra codificante o sentido para orientacion) de un gen Jl de inmunoglobulina de pollo. Tal region tambien es referida como una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo de origen natural”. Esta region debe ser suficientemente larga en un vector de polinucleotido recombinante para permitir la recombinacion homologa con un gen VL-JL endogeno de un linfocito B de pollo. En ciertos aspectos, esta region es al menos 100 a 2.000 o al menos 500 a 2.000 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo, por ejemplo, al menos 100, al menos 500, al menos 1.000, o al menos 1.500) nucleotidos de largo. En ciertos aspectos, el terminal 3' de la region es de 1 a 1.000 (incluyendo todos los numeros enteros en este intervalo) nucleotidos a partir del sitio de corte y empalme de un gen Jl de inmunoglobulina de pollo. En ciertos aspectos, una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo no incluye ninguna secuencia en el gen C que codifica regiones constantes de una cadena ligera de la inmunoglobulina.

En ciertos otros aspectos, una “region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo” tambien pueden incluir una secuencia que es suficientemente homologa a una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo de origen natural para permitir recombinacion homologa con un gen VL-JL endogeno de un linfocito B de pollo. Tales regiones pueden compartir al menos 80,0 a 99,9 o 90,0 a 99,9 (incluyendo todos los valores en el intervalo, por ejemplo, al menos 80, al menos 85, al menos 90, al menos 95, o al menos 99) por ciento de identidad con una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo de origen natural.

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Segun ciertos otros aspectos, la presente descripcion proporciona una composicion que comprende (1) una pluralidad de primeros vectores de polinucleotido recombinantes para integrar una pluralidad de primeros genes diana en una pluralidad de loci de cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, y (2) una pluralidad de segundos vectores de polinucleotido recombinantes para integrar una pluralidad de segundos genes diana en una pluralidad de loci de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo. Cada uno de los primeros vectores de polinucleotido recombinantes comprende: (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo; (b) un primer gen diana; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jh de inmunoglobulina de pollo. Cada uno de los segundos vectores de polinucleotido recombinantes comprende: (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo; (b) un primer gen diana; y (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo. Los primeros genes diana en diferentes primeros vectores de polinucleotido recombinantes pueden tener secuencias de nucleotidos y pueden codificar una primera protema diana o sus variantes. Igualmente, los segundos genes diana en diferentes segundos vectores de polinucleotido recombinantes pueden tener diferentes secuencias de nucleotidos y pueden codificar una segunda protema diana o sus variantes.

En ciertos aspectos, los primeros y segundos genes diana codifican subunidades de una protema o dos protemas que se unen una a otra para formar un complejo proteico o las variantes de tales subunidades o protemas. Por ejemplo, el primer gen diana puede codificar una region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, una region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de mairnfero (incluyendo ser humano, raton, o conejo) o humanizada), y el segundo gen diana puede codificar una region variable de la cadena ligera de inmunoglobulina (por ejemplo, una region variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de mam^era (incluyendo ser humano, raton, o conejo) o humanizada).

En un aspecto preferido, el primer gen diana es un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado y el segundo gen diana es un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado. Tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, el primer gen diana es capaz de someterse a cualquier o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VH de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y/o en una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos de pseudogen VH de DT40; y el segundo gen diana es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region Vl de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina y/o en una secuencia codificadora de la region marco conservada de VL de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de VL de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos de pseudogen VL de DT40. En un aspecto preferido adicional, el gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado y/o el gen Vl-Jl reordenado se obtienen a partir de una pluralidad de genes Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados y/o genes Vl-Jl reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. Las composiciones que comprenden multiples primeros vectores de polinucleotido recombinantes y multiples segundos vectores de polinucleotido recombinantes son utiles para generar una genoteca diversa de inmunoglobulinas que se pueden someter a cribado para identificar y recuperar anticuerpos capaces de unirse espedficamente a antigenos diana deseados como se describe mas adelante.

Anticuerpos y fragmentos de union a antigeno de los mismos

Un “anticuerpo” es una molecula de inmunoglobulina capaz de union espedfica a una diana, tal como carbohidrato, polinucleotido, ftpido, polipeptido, etc., a traves de al menos un sitio de reconocimiento de epftopo, localizado en la region variable (tambien referida en el presente documento como dominio variable) de la molecula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el termino “anticuerpo” abarca no solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino tambien fragmentos de los mismos (tales como un anticuerpo de la region variable sencilla (Acd), u otros fragmentos de anticuerpo conocidos tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv y similares, variantes sinteticas de cadena sencilla (ScFv) de los mismos, variantes de origen natural, protemas de fusion que comprenden una parte de anticuerpo con un fragmento de union a antigeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, y cualquier otra configuracion obtenida por ingeniena o modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un sitio o fragmento de union a antigeno (sitio de reconocimiento a epftopo) de la especificidad requerida. “Diacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespedficos construidos por fusion genica (documento WO94/13804; Holliger y col, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6.444-6.448, 1993) son tambien una forma particular de anticuerpo contemplado en el presente documento. Los minicuerpos que comprenden una scFv unida a un dominio CH3 tambien estan incluidos en el presente documento (Hu y col, Cancer Res., 56, 3.055-3.061, 1996; vease tambien, por ejemplo, Ward y col., Nature 341, 544-546 (1989); Bird y col, Science 242, 423-426, 1988; Huston y col, PNAS USA, 85, 5.879-5.883, 1988; documento PCT/US92/09965; documento WO94/13804; Holliger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6.444-6.448, 1993; Reiter y col., Nature Biotech 14, 1.239-1.245, 1996; Hu y col, Cancer Res. 56, 3.055-3.061, 1996). Tambien se contemplan nanocuerpos y maxicuerpos (vease, por ejemplo, los documentos U.S. 6,765,087; U.S. 6,838,254; WO 06/079372; WO

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El termino “fragmento de union a antigeno” como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de polipeptido que contiene al menos una CDR de una cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina que se une al antigeno de interes. A este respecto, un fragmento de union a antfgeno de los anticuerpos descritos en el presente documento puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o todas las seis CDR de una secuencia Vh y/o Vl presentada en el presente documento.

El termino “antfgeno” se refiere a una molecula o una parte de una molecula capaz de unirse por un agente de union selectiva, tal como un anticuerpo, y ademas capaz de usarse en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epitopo de ese antigeno. Un antigeno puede tener uno o mas epftopos.

El termino “epttopo” incluye cualquier determinante, preferiblemente un determinante de polipeptido, que es capaz de union espedfica a una inmunoglobulina o receptor de linfocito T. Un epttopo es una region de un antigeno que esta unido por un anticuerpo. En ciertos aspectos, determinantes de epftopo incluyen agrupaciones superficiales qmmicamente activas de moleculas tales como aminoacidos, cadenas laterales de azucar, fosforilo o sulfonilo, y pueden en ciertos aspectos tener caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, y/o caractensticas de carga espedficas. En ciertos aspectos, se dice que un anticuerpo se une espedficamente un antfgeno cuando reconoce preferencialmente su antfgeno diana en una mezcla compleja de protemas y/o macromoleculas. Se puede decir que un anticuerpo segun ciertos aspectos se une un antfgeno espedficamente cuando la constante de disociacion de equilibrio para la union anticuerpo-antfgeno es menos que o igual a 10-6 M, o menos que o igual a 10' 7, o menos que o igual a 10-8 M. En algunos aspectos, la constante de disociacion de equilibrio puede ser menos que o igual a 10-9 M o menos que o igual a 10-10 M.

La enzima proteolttica papama preferencialmente parte moleculas de IgG para producir diversos fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos F(ab)) cada uno comprende un heterodfmero covalente que incluye un sitio de union a antfgeno intacto. La enzima pepsina es capaz de partir moleculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento F(ab')2 que comprende ambos sitios de union a antfgeno. Un fragmento Fv para usarse segun ciertos aspectos de la presente descripcion se puede producir mediante escision proteolftica preferencial de una IgM, y en rara ocasiones de una molecula de inmunoglobulina IgG o IgA. Sin embargo los fragmentos Fv mas comunmente se derivan usando tecnicas recombinantes conocidas en la tecnica. El fragmento Fv incluye un heterodfmero Vh::Vl no covalente que incluye un sitio de union a antfgeno que retiene muchas de las capacidades de reconocimiento y union a antfgeno de la molecula de anticuerpo natural (Inbar y col. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2.659-2.662; Hochman y col. (1976) Biochem 15:2.706-2.710; y Ehrlich y col. (1980) Biochem 19:4.0914.096).

En ciertos aspectos, se contemplan anticuerpos Fv de cadena sencilla o scFv. Por ejemplo, se pueden preparar cuerpos Kappa (III y col., Prot. Eng. 10:949-57 (1997); minicuerpos (Martin y col., EmBo J 13:5.305-9 (1994); diacuerpos (Holliger y col., PNAS 90:6.444-8 (1993)); o Janusinas (Traunecker y col., EMBO J. 10:3.655-59 (1991) y Traunecker y col. Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52 (1992)), usando las tecnicas de biologfa molecular estandar seguido de las ensenanzas de la presente solicitud con respecto a la seleccion de anticuerpos que tienen la especificidad deseada. En aun otros aspectos, los anticuerpos biespedficos o quimericos se pueden hacer que abarquen los ligandos de la presente descripcion. Por ejemplo, un anticuerpo quimerico puede comprender CDR y regiones marco conservadas de diferentes anticuerpos, mientras que los anticuerpos biespedficos se pueden generar de manera que se unan espedficamente a un antfgeno deseado a traves de un dominio de union y a una segunda molecula a traves de un segundo dominio de union. Estos anticuerpos se pueden producir a traves de tecnicas biologicas moleculares recombinantes o se pueden conjugar ffsicamente juntos.

Un polipeptido Fv (sFv) de cadena sencilla es un heterodfmero Vh::Vl covalentemente unido que se expresa a partir de una fusion genica que incluyen genes codificadores de Vh y Vl unidos a un conector codificador peptfdico. Huston y col. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5.879-5.883. Se ha descrito un numero de metodos para discernir estructuras qmmicas para convertir las cadenas polipeptfdicas ligeras y pesadas naturalmente agregadas pero qmmicamente separadas de una region V del anticuerpo en una molecula sFv que se plegara en una estructura tridimensional basicamente similar a la estructura de un sitio de union a antfgeno. Vease, por ejemplo, la patente americana N.° 5.091.513 y 5.132.405, de Huston y col.; y la patente americana N.° 4.946.778, de Ladner y col.

Un fragmento Acd de un anticuerpo consiste en un dominio VH (Ward, E. S. y col., Nature 341, 544-546 (1989)).

En ciertos aspectos, un anticuerpo como se describe en el presente documento esta en forma de una diacuerpo. Los diacuerpos son multfmeros de polipeptidos, comprendiendo cada polipeptido un primer dominio que comprende una region de union de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una region de union de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando los dos dominios unidos (por ejemplo, por un conector peptfdico) pero incapaces de asociarse uno con otro para formar un sitio de union a antfgeno; los sitios de union a antigeno estan formados por la asociacion del primer dominio de un polipeptido en el multfmero con el segundo dominio de otro polipeptido en el multimero (documento WO94/13804).

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Cuando los anticuerpos biespedficos son para usarse, estos pueden ser anticuerpos biespedficos convencionales, los cuales se pueden fabricar en una diversidad de maneras (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), por ejemplo, qmmicamente preparados o a partir de hibridomas Idbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpo biespedficos anteriormente mencionados. Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin una region Fc, usando solamente regiones variables, reduciendo potencialmente la probabilidad o gravedad de una respuesta inmune provocada, tal como una reaccion antiidiotfpica, en un sujeto que recibe una administracion de tales anticuerpos.

Los diacuerpos biespedficos, en lugar de los anticuerpos totales biespedficos, tambien pueden ser particularmente utiles debido a que se pueden construir y expresar facilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipeptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de union apropiadas se pueden seleccionar facilmente usando presentacion en fago (documento WO94/13804) a partir de genotecas. Si un grupo del diacuerpo se mantiene constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida a antfgeno X, entonces se puede producir una genoteca donde el otro grupo se vana y un anticuerpo de especificidad apropiada seleccionada. Los anticuerpos completos biespedficos se pueden producir mediante modificacion por ingeniena de protuberancias en agujeros (Ridgeway y col, Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

En ciertos aspectos, los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden proporcionar en la forma de un UniBody®. Un UniBody® es un anticuerpo de IgG4 con la region bisagra eliminada (vease, GenMab Utrecht, Los Pafses Bajos; vease tambien, por ejemplo, el documento US20090226421). Esta tecnologfa de anticuerpo patentada crea un formato de anticuerpo estable y mas pequeno con una ventana terapeutica mas larga esperada que los formatos de anticuerpo pequenos actuales. Los anticuerpos de IgG4 se consideran inertes y por tanto no interactuan con el sistema inmune. Los anticuerpos de IgG4 completamente humanos se pueden modificar eliminando la region bisagra del anticuerpo para obtener fragmentos de molecula medios que tienen distintas propiedades de estabilidad en relacion con la IgG4 intacta correspondiente (GenMab, Utrecht). Reducir a la mitad la molecula de IgG4 deja solamente un area sobre el UniBody® que se puede unir a antfgenos cognados (por ejemplo, dianas de enfermedad) y el UniBody® por lo tanto se une univalentemente a solamente un sitio sobre las celulas diana. Para ciertos antfgenos de superficie de celula cancerosa, esta union univalente no puede estimular el crecimiento de las celulas cancerosas ya que se puede ver que usan anticuerpos bivalentes que tienen la misma especificidad a antfgeno, y, por lo tanto, la tecnologfa de UniBody® puede proporcionar opciones de tratamiento para algunos tipos de cancer que pueden ser refractarios a tratamiento con anticuerpos convencionales. El UniBody® es aproximadamente la mitad de tamano de un anticuerpo de IgG4 regular. Este pequeno tamano puede ser un gran beneficio cuando se trata algunas formas de cancer, permitiendo mejor distribucion de la molecula sobre mayores tumores solidos y eficacia potencialmente creciente.

En ciertos aspectos, los anticuerpos de la presente descripcion pueden tomar la forma de un nanocuerpo. Los nanocuerpos se codifican mediante genes unicos y se producen eficazmente en casi todos los hospedadores procariotas y eucariotas, por ejemplo, E. coli (vease, por ejemplo, la patente americana N.° 6.765.087), mohos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma) y levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Kluyvermyces, Hansenula o Pichia (vease, por ejemplo, la patente americana N.° 6.838.254)). El proceso de produccion se puede poner a escala y se han producido cantidades en multikilogramos de nanocuerpos. Los nanocuerpos se pueden formular como una solucion lista para usar que tiene una larga semivida. El metodo de Nanoclone (vease, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un metodo patentado para generar Nanocuerpos frente a una diana deseada, basado en la seleccion de alto rendimiento automatizada de linfocitos B.

En ciertos aspectos, los anticuerpos y sus fragmentos de union a antfgeno como se describen en el presente documento incluyen un conjunto de cDr de una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente interpuesto entre el conjunto de region marco conservada (FR) de una cadena pesada y una cadena ligera que proporciona soporte a las CDR y define la relacion espacial de las CDR en relacion unas con otras. Como se usa en el presente documento, el termino “conjunto de CDR” se refiere a las tres regiones hipervariables de una region V de la cadena pesada o ligera. Avanzando desde el terminal N de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como “CDR1," "CDR2," y "CDR3" respectivamente. Un sitio de union a antfgeno, por lo tanto, incluye seis CDR, comprendiendo el conjunto de CDR de cada una de la region V de una cadena pesada y una ligera. Un polipeptido que comprende una CDR unica (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se refiere en el presente documento como una “unidad de reconocimiento molecular”. El analisis cristalografico de un numero de complejos antfgeno- anticuerpo ha demostrado que los restos de aminoacidos de las CDR forman contacto extenso con antfgeno unido, en el que el contacto de antfgeno mas extenso es con la CDR3 de la cadena pesada. Por tanto, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de union a antfgeno.

Como se usa en el presente documento, el termino “conjunto de FR” se refiere a las cuatro secuencias de aminoacidos flanqueantes que enmarcan las CDR de un conjunto de un conjunto de CDR de la region V de una cadena pesada o ligera. Algunos restos de FR pueden contactar con el antfgeno unido; sin embargo, las FR principalmente son responsables del plegamiento de la region V en el sitio de union a antfgeno, particularmente los restos de FR directamente adyacentes a las CDR. En las FR, ciertos restos de aminoacidos y ciertas caractensticas estructurales estan muy altamente conservadas. A este respecto, todas las secuencias de la region V contienen un bucle de disulfuro interno de restos de alrededor 90 aminoacidos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de

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union, las CDR se muestran como motivos bucle salientes que forman una superficie de union a antigeno. Generalmente se reconoce que son regiones estructurales conservadas de las FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras “canonicas” sin reparar en la secuencia de aminoacidos de CDR precisa. Ademas, se sabe que ciertos restos de FR participan en contactos interdominio no covalentes que establecen la interaccion de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Las estructuras y localizaciones de las regiones variables de inmunoglobulina se pueden determinar como referencia a Kabat, E.A. y col, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, 4° Edicion, “US Department of Health and Human Services”, 1987, y sus actualizaciones, ahora disponibles en internet (immuno.bme.nwu.edu).

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una poblacion de anticuerpo homogenea en la que el anticuerpo monoclonal esta comprendido de aminoacidos (de origen natural y de no origen natural) que estan implicados en la union selectiva de un epftopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, estando dirigidos a un epftopo unico. El termino “anticuerpo monoclonal” abarca no solamente anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino tambien sus fragmentos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv) cadena sencilla (scFv), variantes de los mismos, protemas de fusion que comprenden una parte de union a antfgeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quimericos, y cualquier otra configuracion modificada de la molecula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de union a antfgeno (sitio de reconocimiento de epftopo) de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un epftopo. No se pretende que se limite con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en la que se produce (por ejemplo, por hibridoma, seleccion de fago, expresion recombinante, animales transgenicos, etc.). El termino incluye inmunoglobulinas completas asf como los fragmentos, etc. anteriormente descritos.

Anticuerpos “humanizados” se refieren a una molecula quimerica, generalmente preparada usando tecnicas recombinantes, que tienen un sitio de union a antfgeno derivado de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de inmunoglobulina restante de la molecula basada en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sito de union a antfgeno puede comprender o bien regiones variables completas fusionadas sobre dominios constantes o solamente las CDR injertadas sobre las regiones marco conservadas apropiadas en los dominios variables. Los sitios de union a epftopo pueden ser de tipo silvestre o pueden estar modificados por una o mas sustituciones de aminoacidos. La estructura quimerica elimina la region constante del origen no humano como un inmunogen en individuos humanos, pero la posibilidad de una respuesta inmune a la region variable extrana permanece (LoBuglio, A. F. y col., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:4.220-4.224; Queen y col., PNAS (1988) 86:10.029-10.033; Riechmann y col., Nature (1988) 332:323-327).

Otro planteamiento se centra no solamente en proporcionar regiones constantes derivadas de humanos, sino tambien en modificar las regiones variables asf como para reformarlas tan cercanamente como sea posible a la forma humana. Como tambien se indico anteriormente, se sabe que las regiones variables de tanto las cadenas pesadas como ligeras contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que vanan en respuesta a los epftopos en cuestion y determinan la capacidad de union, flanqueadas por cuatros regiones marco conservadas (FR) que estan relativamente conservadas en una especie dada y que proporcionan supuestamente un armazon para las CDR. Cuando los anticuerpos no humanos se preparan con respecto a un epftopo particular, las regiones variables se pueden “reformar” o “humanizar” injertando CdR derivadas de anticuerpo no humano sobre las FR presentes en el anticuerpo humano a modificar. La solicitud de este planteamiento a diversos anticuerpos se ha publicado por Sato, K., y col., (1993) Cancer Res. 53:851-856; Riechmann, L., y col., (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen, M., y col., (1988) Science 239:1.534-1.536; Kettleborough, C.A., y col., (1991) Protein Engineering 4:773-3.783; Maeda, H., y col. (1991) Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S.D., y col., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4.181-4.185; Tempest, P.R., y col., (1991) Bio/Technology 9:266-271; Co, M.S., y col., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2.869-2.873; Carter, P., y col., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4.2854.289; y Co, M.S. y col., (1992) J. Immunol. 148:1.149-1.154. En algunos aspectos, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de raton humanizado contiene todas las seis CDR de los anticuerpos de raton). En otros aspectos, los anticuerpos humanizados tienen una o mas CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que estan alteradas con respecto al anticuerpo original, que tambien se califican de una o mas CDR “derivadas de” una o mas CDR del anticuerpo original.

En ciertos aspectos, los anticuerpos de la presente descripcion pueden ser anticuerpos quimericos. A este respecto, un anticuerpo quimerico esta comprendido de un fragmento de union a antfgeno de un anticuerpo de especificidad de union deseada unido de forma operativa o si no fusionado a una parte Fc heterologa de un anticuerpo diferente. En ciertos aspectos, el dominio Fc heterologo es de origen humano. En otros aspectos, el dominio Fc heterologo puede ser de una clase de Ig diferente del anticuerpo parental, incluyendo IgA (incluyendo subclases IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG (incluyendo subclases IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), e IgM. En aspectos adicionales, el dominio Fc heterologo puede estar comprendido de dominios CH2 y CH3 de una o mas de las diferentes clases de Ig. Como se indico anteriormente con respecto a los anticuerpos humanizados, el fragmento de union a antfgeno de un anticuerpo quimerico puede comprender solamente una o mas de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento), o pueden comprender un domino variable entero (Vl, Vh o ambas).

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En ciertos aspectos, un anticuerpo que tiene una especificidad de union a antigeno deseada comprende una o mas de las CDR de los anticuerpos descritos en el presente documento. A este respecto, se ha mostrado en algunos casos que la transferencia de solamente la VHCDR3 de un anticuerpo se puede hacer mientras aun se retiene la union espedfica deseada (Barbas y col., PNAS (1995) 92:2.529-2.533). Vease tambien, McLane y col., PNAS (1995) 92:5.214-5.218, Barbas y col., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2.161-2.162.

Marks y col (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describen metodos de produccion de repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que los cebadores consenso dirigidos a o adyacentes al extremo 5' del area del dominio variable se usan junto con cebadores consenso a la tercera region marco conservada de los genes Vh, para proporcionar un repertorio de dominios variables Vh que carecen de una CDR3. Marks y col. ademas describen como se pueden combinar este repertorio con una CDR3 de un anticuerpo particular. Usando tecnicas analogas, las secuencias derivadas de CDR3 de los anticuerpos actualmente descritos se pueden barajar con repertorios de dominios Vh y Vl que carecen de una CDR3, y los dominios Vh y Vl completos barajados combinados con un dominio Vl y Vh cognado para proporcionar un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo que se une a un antigeno deseado. A continuacion el repertorio se puede mostrar en un sistema hospedador adecuado tal como el sistema de presentacion en fago del documento WO92/01047 de manera que los anticuerpos adecuados o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden seleccionar. Un repertorio puede consistir en al menos de aproximadamente 104 miembros individuales y mas por varias ordenes de magnitud, por ejemplo, a aproximadamente de 106 a 108 o 1010 o mas miembros. Barajar analogos o tecnicas combinatorias tambien estan descritas por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), quien describe la tecnica en relacion con un gen de p- lactamasa pero observa que el planteamiento se puede usar para la generacion de anticuerpos.

Una alternativa adicional es generar nuevas regiones Vh y Vl nuevas que llevan una o mas secuencias derivadas de CDR de los ejemplos descritos en el presente documento usando mutagenesis aleatoria de uno o mas genes Vh y/o Vl seleccionados para generar mutaciones en el dominio variable entero. Tal tecnica esta descrita por Gram y col. (1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3.576-3.580), quien uso PCR propensa a error. Otro metodo que se puede usar es mutagenesis directa a regiones CDR de los genes Vh o Vl. Tales tecnicas estan descritas por Barbas y col. (1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3.809-3.813) y Schier y col. (1996 J. Mol. Biol. 263:551-567).

En ciertos aspectos, una Vh y/o Vl espedfica de los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden usar para cribado de una genoteca del dominio variable de complementariedad para identificar anticuerpos con propiedades deseadas, tales como afinidad incrementada para un antfgeno deseado. Tales metodos estan descritos, por ejemplo, en Portolano y col., J. Immunol. (1993) 150:880-887; Clarkson y col., Nature (1991) 352:624628.

Tambien se pueden usar otros metodos para mezclar y emparejar CDR para identificar anticuerpos que tienen actividad de union deseada. Por ejemplo: Klimka y col., British Journal of Cancer (2000) 83:252-260, describen un proceso de cribado que usa una genoteca de Vl de raton y una de Vh humana con CDR3 y FR4 conservadas de la Vh de raton. Despues de obtener los anticuerpos, la Vh se sometio a cribado frente a una genoteca de Vl humana para obtener anticuerpos que se unen a antfgeno. Beiboer y col., J. Mol. Biol. (2000) 296:833-849 describen un proceso de cribado que usa una genoteca entera de cadena pesada de raton y una de cadena ligera humana. Despues de obtener los anticuerpos, se combino una VL con una genoteca de VH humana con la CDR3 del raton conservada. Se obtuvieron anticuerpos capaces de unirse a antfgeno. Rader y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1998) 95:8.910-8.915 describen un proceso similar al anterior de Beiboer y col.

Estas tecnicas ya descritas son, por sf mismas, conocidas como tales en la tecnica. Sin embargo, basandose en la presente descripcion, el experto en la tecnica sera capaz de usar tales tecnicas para obtener anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos segun varios aspectos descritos en el presente documento, usando la metodologfa de rutina en la tecnica.

Un epttopo que “se une espedficamente” o “se une preferencialmente” (usado intercambiablemente en el presente documento) a un anticuerpo o un polipeptido es un termino bien conocido en la tecnica, y los metodos para determinar tal union espedfica o preferencial tambien son bien conocidos en la tecnica. Se dice que una molecula presenta “union espedfica” o “union preferencial” si reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion y/o con mayor afinidad con una celula o sustancia particular que hace con celulas o sustancias alternativas. Un anticuerpo “se une espedficamente” o “se une preferencialmente” a una diana si se une con mayor afinidad, avidez, mas facilmente, y/o con mayor duracion que se une a otras sustancias. Tambien se entiende al leer esta definicion que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epftopo) que espedfica o preferencialmente se une a una primera diana puede o no puede unirse espedfica o preferencialmente a una segunda diana. De por sf, “union espedfica” o “union preferencial” no requiere necesariamente (aunque puede incluir) union exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a union significa union preferencial.

La union inmunologica se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que se dan entre una molecula de inmunoglobulina y un antfgeno para el cual la inmunoglobulina es espedfica, por ejemplo, a modo de ilustracion y no limitacion, como resultado de atracciones o repulsion electrostaticas, ionicas, hidrofilas y/o hidrofobas, fuerzas estericas, enlaces de hidrogeno, fuerzas de van der Waals, y otras interacciones. La fuerza, o

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afinidad de las interacciones de union inmunologica se puede expresar en terminos de constante de disociacion (kd) de la interaccion, en la que una kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de union inmunologica de los polipeptidos seleccionados se pueden cuantificar usando metodos bien conocidos en la tecnica. Un dicho metodo implica medir las tasas de la formacion de complejo sitio de union a antfgeno/antfgeno y la disociacion, en el que esas tasas dependen de las concentraciones de las parejas del complejo, la afinidad de la interaccion, y de los parametros geometricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por tanto, tanto la “constante de asociacion” (Kon) y la “constante de disociacion” (Koff) se pueden determinar mediante el calculo de las concentraciones y las tasas actuales de asociacion y disociacion. La relacion de Koff/Kon posibilita la cancelacion de todos los parametros no relacionados con la afinidad, y, por tanto, es igual a la constante de disociacion Kd. Vease, en general, Davies y col. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473.

El termino “inmunologicamente activo”, con referencia a un epftopo que es o “se mantiene inmunologicamente activo”, se refiere a la capacidad de un anticuerpo de unirse al epftopo bajo diferentes condiciones, por ejemplo, despues de que el epftopo se haya sometido a condiciones de reduccion y desnaturalizacion.

Celulas hospedadoras y genotecas

En otros aspectos, la presente descripcion proporciona celulas hospedadoras que comprenden los vectores de polinucleotido recombinantes o composiciones que comprenden tales vectores descritos en el presente documento.

En ciertos aspectos relacionados, las celulas hospedadoras son capaces de propagar los vectores de polinucleotido recombinantes descritos en el presente documento. Celulas hospedadoras como ejemplos para tales propositos incluyen celulas bacterianas (por ejemplo, E. coli).

En ciertos aspectos, las celulas hospedadoras son celulas de pollo que permiten la integracion de un gen diana en un locus de la cadena pesada o ligera del gen de inmunoglobulina de pollo. En una realizacion preferida, las celulas hospedadoras son linfocitos B de pollo o celulas derivadas de linfocitos B de pollo, tales como celulas del linfoma bursal de pollo. En una realizacion mas preferida, las celulas hospedadoras son celulas DT40.

En ciertos aspectos, las celulas hospedadoras son linfocitos B de pollo (por ejemplo, celulas DT40) que comprenden ademas un “elemento regulador en cis” (por ejemplo, una secuencia del operador de lactosa polimerizada) en sus loci de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina y/o sus loci de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina para permitir el uso de los sistemas descritos en los documentos WO 2009/029315 y US 20100093033 que facilitan ademas la diversificacion de secuencias diana. En resumen, en los mismos se describe un linfocito B modificado que permite induccion reversible de la diversificacion de un gen diana. Las celulas se modifican para incluir un “elemento regulador en cis” unido de forma operativa a un gen diana de interes (por ejemplo, un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado). La celula se modifica ademas para incluir un “factor de diversificacion" que se fusiona a un “factor de anclaje”. La funcion del factor de anclaje es unirse al elemento regulador en cis, trayendo de ese modo el factor de diversificacion a la region que controla la expresion y/o mutagenesis del gen diana. El papel del factor de diversificacion es acelerar o regular la diversificacion (mutacion) de la secuencia diana. Puesto que el gen diana esta insertado en el locus de Ig, las mutaciones se dirigen a su region codificante y se controlan mediante el uso de la protema de fusion de factor de diversificacion-factor de anclaje. Generalmente, el elemento regulador en cis puede ser cualquier secuencia de ADN que permite la union de un factor de anclaje al mismo de una manera espedfica a secuencia y esta colocado en una region que controla la expresion o diversificacion de un gen (por ejemplo, el gen de interes, tal como un gen diana). Los elementos reguladores en cis pueden incluir un operador de lactosa polimerizada (PolyLacO), tal como los que comprenden aproximadamente 100 repeticiones del sitio de union a LacO de 20 pares de bases. El elemento regulador en cis esta colocado en la region W de la cadena ligera de IgA y los loci de IgH. El factor de anclaje incluye el represor de Lac (Lacl) que se une con alta afinidad al LacO. Esta insercion del elemento regulador en cis no afecta al proceso normal de la mutagenesis con molde (conversion genica) en la lmea celular de DT40 modificada.

El aspecto inducible del sistema de los documentos WO2009029315 y US2010093033 se da a traves de la expresion de las protemas de fusion factor de anclaje (Lacl)-factor de diversificacion y el uso de isopropil p-D-1- tiogalactopiranosida (IPTG), una pequena molecula que causa liberacion de Lacl de LacO. El cultivo de las celulas DT40 modificadas con apenas 10 pM de IPTG causa liberacion de Lacl de PolyLacO y no afecta a la proliferacion celular. Se contemplan muchos factores diferentes de diversificacion e incluyen factores que afectan a la estructura de la cromatina, activadores transcripcionales y otros reguladores de gen, desaminasas, protemas implicadas en la reparacion y replicacion de ADN, resolvasas y helicasas, reguladores del ciclo celular, protemas del complejo de poro nuclear, y protemas implicadas en ubiquitinilacion. Una construccion de factor de anclaje-factor de diversificacion como ejemplo incluye Lacl-HP1. En esta construccion, la protema de heterocromatina, HP1, promueve una estructura de cromatina cerrada de genes cercanos. Por tanto, cuando Lacl se une al PolyLacO en las celulas DT40 modificadas, la protema HP1 anclada causa una transicion de las secuencias W donadoras de un estado de cromatina abierta a no permisiva. Esto es funcionalmente equivalente a la delecion de la region W e igualmente da como resultado el cambio de una mutagenesis con molde del locus VA de Ig en direccion 3' a una hipermutacion somatica de esta region dirigida. Las construcciones adicionales factor de anclaje-factor de diversificacion utiles en combinacion con PolyLacO tambien estan descritas en los documentos WO2009029315 y

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US2010093033.

En ciertos aspectos, las celulas hospedadoras son celulas de pollo (por ejemplo, celulas DT40) en las que los genes que codifican regiones constantes de la cadena pesada de Ig de pollo y/o genes que codifican regiones constantes de la cadena ligera de Ig de pollo se han reemplazado con genes que codifican regiones constantes de la cadena pesada y/o ligera de Ig humana. Tales sustituciones tambien se pueden hacer por recombinacion homologa en regiones en direccion 5' y en direccion 3' a partir de los genes de pollo a reemplazar. Tales celulas hospedadoras son capaces de generar anticuerpos quimericos y, por tanto, facilitar la humanizacion de anticuerpos deseables producidos en aquellas celulas.

En un aspecto relacionado, la presente descripcion proporciona genotecas de celulas hospedadoras que comprenden los vectores de polinucleotido recombinantes descritos en el presente documento.

En un aspecto, se proporciona una genoteca de celulas hospedadoras para propagar los vectores de polinucleotido recombinantes descritos en el presente documento. Por ejemplo, se puede producir una genoteca de celula bacteriana transformando celulas bacterianas con una composicion que comprende vectores de polinucleotido recombinantes multiples para integrar genes Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. Igualmente, otra genoteca de celula bacteriana se puede producir transformando celulas bacterianas con una composicion que comprende vectores de polinucleotido recombinantes multiples para integrar genes Vl-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo.

En otro aspecto, se proporciona una genoteca de celulas de pollo con genes diana integrados en sus loci de la cadena pesada y/o ligera del gen de inmunoglobulina. Una genoteca como ejemplo puede comprender celulas DT40 sometidas a transfeccion con vectores de polinucleotido recombinantes que contienen diferentes genes de la region variable de la cadena pesada aislados de celulas de la bolsa de Fabricio de uno o mas pollos. Tal genoteca se puede producir segun el metodo para integrar genes diana en los loci de la cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina de pollo como se describe en el presente documento.

En un aspecto adicional, se proporciona una genoteca de celulas de pollo con genes diana integrados en sus loci de la cadena pesada y/o ligera del gen de inmunoglobulina. Una genoteca como ejemplo puede comprender progenie de celulas DT40 sometidas a transfeccion con vectores de polinucleotido recombinantes que contienen diferentes genes de la region variable de la cadena pesada de Ig aislados de celulas de la bolsa de Fabricio de uno o mas pollos. Se pueden producir segun el metodo de produccion de repertorios de variantes de secuencia de polipeptidos de la cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina de pollo como se describe en el presente documento.

Las genotecas proporcionadas en el presente documento pueden comprender al menos 10 a 1014 (incluyendo todos los numeros enteros en el intervalo anterior, por ejemplo, al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000, al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010, etc.) celulas que contienen variantes de secuencia de los genes diana, por ejemplo, en ciertos aspectos al menos 103 a 107 celulas que contienen variantes de secuencia de los genes diana. Por ejemplo, una genoteca puede tener al menos 10 a 1014 celulas DT40 que contienen diferentes genes de la region variable de la cadena pesada de inmunoglobulina.

Metodos de integracion o diversificacion de genes diana

Segun ciertos aspectos de la presente descripcion, se proporciona un metodo para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo. Tal metodo comprende: (a) someter a transfeccion linfocitos B de pollo con un vector de polinucleotido recombinante para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo o una composicion que comprende una pluralidad de tales vectores de polinucleotido recombinantes como se proporcionan en el presente documento; y (b) identificar un linfocito B en el que el gen diana esta integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina.

La etapa (a) se puede realizar usando cualquier metodo conocido en la tecnica para someter a transfeccion una celula de pollo con un vector de polinucleotido recombinante, incluyendo el metodo usado en el Ejemplo de mas adelante. Algunos linfocitos B de pollo que permiten la recombinacion homologa se pueden someter a transfeccion. Se proporciona descripcion adicional de tales celulas anteriormente relacionado con las celulas hospedadoras.

La etapa (b) se puede realizar usando cualquier metodo apropiado conocido en la tecnica. Por ejemplo, los linfocitos B en los que el gen diana esta integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina se pueden identificar por analisis de transferencia Southern usando el gen diana como sonda o mediante reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el fragmento de acidos nucleicos entre la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo y la region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo, seguido de deteccion del fragmento de acidos nucleicos amplificado. En ciertas realizaciones, los linfocitos B en los que se ha de integrar un gen diana puede tener ya un gen marcador (por ejemplo, el gen de GFP) integrado en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo. La integracion del gen diana en tales linfocitos B se puede identificar por la sustitucion del gen marcador con el gen diana y, por lo tanto, la perdida del marcador (por ejemplo, fluorescencia producida por GFP).

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En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para integrar un primer gen diana en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo e integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo. Tal metodo comprende (a) someter a transfeccion linfocitos B de pollo con (1) un primer vector de polinucleotido recombinante para integrar un primer gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo o una primera composicion que comprende una pluralidad de tales primeros vectores de polinucleotido recombinantes proporcionados en el presente documento, y (2) un segundo vector de polinucleotido recombinante para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo o una segunda composicion que comprende una pluralidad de tales segundos vectores de polinucleotido recombinantes proporcionados en el presente documento; e (b) identificar un linfocito B de pollo en el que el primer gen diana esta integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina y el segundo gen diana esta integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina.

La etapa (a) se puede realizar mezclando primero uno o mas de los primeros vectores de polinucleotido recombinantes para integrar un primer gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo con uno o mas de los segundos vectores recombinantes para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo para formar una mezcla y, a continuacion, someter a transfeccion los linfocitos B con dicha mezcla. Alternativamente, los linfocitos B de pollo se pueden someter a transfeccion de manera separada con uno o mas de los primeros vectores de polinucleotido recombinantes y con uno o mas de los segundos vectores de polinucleotido recombinantes.

La etapa (b) se puede realizar usando cualquier metodo apropiado conocido en la tecnica. En ciertos aspectos preferidos, los linfocitos B en los que se han de integrar los primeros y segundos genes ya pueden tener un primer gen marcador (por ejemplo, el gen de GFP) integrado en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo y un segundo gen marcador (por ejemplo, el gen de BFP) integrado en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo. La integracion de tanto los primeros como los segundos genes diana en tales linfocitos B se pueden identificar por la sustitucion de los primeros y segundos genes marcadores con los primeros y segundos genes diana, por tanto, la perdida de tanto los primeros como los segundos marcadores (por ejemplo, fluorescencia producida por GFP y por BFP).

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para producir un repertorio (es decir, una genoteca) de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina de un polipeptido diana codificado por un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado. Tal metodo comprende: cultivar un linfocito B que contiene un vector que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado bajo condiciones que permiten la proliferacion del linfocito B hasta que se obtiene una pluralidad de linfocitos B. El linfocito B es capaz de cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia

codificadora de la region VH de inmunoglobulina, que puede incluir hipermutacion somatica en una secuencia

codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y/o en una secuencia

codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia

de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh. La proliferacion del linfocito B produce un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina del polipeptido diana codificado por el gen diana que comprende el gen Vh-D- Jh de inmunoglobulina reordenado.

En ciertos aspectos, el gen diana comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de mairnfero (por ejemplo, ser humano, raton o conejo) o humanizada. En ciertos aspectos preferidos, el gen diana comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado de pollo.

En ciertos aspectos, el linfocito B a proliferar se puede someter a transfeccion con, y por tanto comprender un segundo vector para integrar un gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo como se describe en el presente documento. El gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado puede ser un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de mai^ero (por ejemplo, ser humano, raton, o conejo) o humanizada reordenado. En aspectos preferidos, el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado es un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado.

En ciertos aspectos, el linfocito B a proliferar puede comprender un operador de lactosa polimerizada en su locus de la cadena pesada o ligera del gen de inmunoglobulina. Como se describio anteriormente, el operador de lactosa polimerizada facilita diversificacion de los gen(es) diana.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para cribado de linfocitos B para la produccion de anticuerpos que se unen espedficamente a un antfgeno dado. Como se describio anteriormente, los linfocitos B de pollo (por ejemplo, celulas DT40) se pueden someter a transfeccion con un primer vector de polinucleotido recombinante que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado y un segundo vector de polinucleotido recombinante que comprende un gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado para obtener un linfocito B de pollo que tiene el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado integrado en su locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina y el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado integrado en su locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina. Tales linfocitos B de pollo ademas se pueden cultivar para obtener una pluralidad de linfocitos B

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que producen un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina as^ como un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena ligera de inmunoglobulina. La pluralidad de linfocitos B se puede someter a cribado para su produccion de anticuerpos que se unen a un antfgeno espedfico.

Se pueden usar cualquier metodo apropiado para cribado linfocitos B para su produccion de anticuerpos espedficos a antigeno conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se puede detectar la union de moleculas de inmunoglobulina a antfgenos espedficos como interaccion con derivados fluorescentes de los antigenos analizados por inmunocitofluorimetna de flujo; y se pueden recuperar linfocitos B que se unen a un antfgeno espedfico tras la clasificacion mediante la misma tecnica de citometna de flujo o similar (por ejemplo, clasificacion celular activada por fluorescencia, FACS). Los linfocitos B que se unen a antfgenos espedficos tambien se pueden seleccionar sobre soportes solidos que llevan esos antigenos, por ejemplo, perlas magneticas revestidas por antigeno. Por el contrario, la union a soportes solidos tambien puede permitir la separacion de linfocitos B con especificidades de union no deseadas en una tecnica apropiadamente configurada, tal como agotamiento de las celulas mediante “seleccion (panning)" sobre placas revestidas con antigeno. Metodos como ejemplos para cribado de linfocitos B para producir anticuerpos espedficos a antfgenos particulares incluyen clasificacion celular activada por magnetismo (MACS) y clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) como se describe en el Ejemplo. Se pueden realizar multiples rondas de seleccion para identificar los linfocitos B con suficiente afinidad de union al antfgeno espedfico.

En ciertos aspectos, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado y el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado integrados en los loci de la cadena pesada y ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, respectivamente, son un gen de la cadena pesada Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado humano y un gen de la cadena ligera Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado humano. El metodo para cribado de linfocitos B para producir anticuerpos espedficos para un antfgeno particular anteriormente descrito es, por tanto, capaz de identificar directamente los linfocitos B que producen anticuerpos humanos que se unen al antfgeno. Tales linfocitos B pueden haber tenido ya genes de la region constante de la cadena pesada y ligera de pollo reemplazados por genes de la region constante de la cadena pesada y ligera humanos, antes de la integracion de los genes Vh-D-Jh y Vl-Jl de inmunoglobulina reordenados humanos en los loci de la cadena pesada y ligera del gen de inmunoglobulina de pollo.

En ciertos aspectos, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado y el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado integrados en los loci de la cadena pesada y ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, respectivamente, son un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado humanizado (por ejemplo, aquellos que contienen regiones marco conservadas de la cadena pesada humanas) y un gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado humanizado (por ejemplo, aquellos que contienen regiones marco conservadas de la cadena ligera humanas). El metodo para cribado de linfocitos B para producir anticuerpos espedficos para un antfgeno particular anteriormente descrito es por tanto capaz de identificar directamente los linfocitos B que producen anticuerpos humanizados que se unen al antigeno.

En ciertos aspectos, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado y el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado integrados en los loci de la cadena pesada y ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, respectivamente, son un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado de pollo y un gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado de pollo. En aspectos preferidos, el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina reordenado y el gen Vl-Jl de inmunoglobulina reordenado se obtienen de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo. El metodo de cribado de linfocitos B para producir anticuerpos espedficos para un antfgeno particular descrito en el presente documento es, por tanto, capaz de identificar linfocitos B que producen anticuerpos de pollo que se unen al antfgeno. Los anticuerpos de pollo obtenidos ademas pueden ser humanizados usando metodos descritos en el presente documento y conocidos en la tecnica.

Los anticuerpos obtenidos por los metodos anteriormente descritos pueden tener aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. Ademas, los metodos son adaptables a planteamientos de alto rendimiento, y pueden ser especialmente adecuados para desarrollos de anticuerpos monoclonales para medicina personalizada.

Se pueden usar tecnicas estandar para ADN recombinante, smtesis de oligonucleotidos, y cultivo de tejido y transformacion (por ejemplo, electroporacion, lipofeccion). Las reacciones enzimaticas y las tecnicas de purificacion se pueden realizar segun las especificaciones del fabricante o como se efectuan comunmente en la tecnica o como se describen en el presente documento. Estas y las tecnicas y procedimientos relacionados generalmente se pueden realizar segun los metodos convencionales bien conocidos en la tecnica y como se describe en diversas referencias generales y mas espedficas en tecnicas de microbiologfa, biologfa molecular, bioqmmica, genetica molecular, biologfa celular, virologfa e inmunologfa que se citan y discuten por toda la presente memoria. Vease, por ejemplo, Sambrook, y col., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; “Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley and Sons, actualizacion Julio 2008); “Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology", Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; “Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II" (IRL Press, Oxford Univ. Press USA, 1985); “Current Protocols in Immunology" (Editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY); “Real-Time PCR: Current Technology and Applications", Editado por Julie Logan, Kirstin Edwards and Nick Saunders, 2009, Caister Academic Press, Norfolk, UK; “Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes", (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, “Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology" (Academic Press, Nueva York, 1991);

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“Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, Ed., 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1985); “Transcription and Translation” (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); “Animal Cell Culture” (R. Freshney, Ed., 1986); “Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984); “Next-Generation Genome Sequencing” (Janitz, 2008 Wiley- VCH); “PCR Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Park, Ed., 3a Edicion, 2010 Humana Press); “Immobilized Cells And Enzymes” (IRL Press, 1986); el tratado, “Methods In Enzymology” (Academic Press, Inc., N.Y.); “Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells” (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Harlow y Lane, “Antibodies”, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998); “Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology” (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); “Handbook Of Experimental Immunology”, Volumenes I-IV (D.M. Weir and CC Blackwell, eds., 1986); Riott, “Essential Immunology”, 6° Edicion, (Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988); “Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Kurstad Turksen, Ed., 2002); “Embryonic Stem Cell Protocols: Volume I: Isolation and Characterization (Methods in Molecular Biology)“(Kurstad Turksen, Ed., 2006); “Embryonic Stem Cell Protocols: Volume II: Differentiation Models (Methods in Molecular Biology)” (Kurstad Turksen, Ed., 2006); “Human Embryonic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Kursad Turksen Ed., 2006); “Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, and Bruce A. Bunnell Eds., 2008); “Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Medicine)” (Christopher A. Klug, and Craig T. Jordan Eds., 2001); “Hematopoietic Stem Cell Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Kevin D. Bunting Ed., 2008) “Neural Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology)” (Leslie P. Weiner Ed., 2008).

A menos que se proporcionen definiciones espedficas, la nomenclatura utilizada en relacion con, y los procedimientos y tecnicas de laboratorio de, biologfa molecular, qmmica analttica, qmmica organica sintetica, y qmmica medicinal y farmaceutica descritos en el presente documento son bien conocidos y normalmente usados en la tecnica. Se pueden usar tecnicas estandar para la tecnologfa recombinante, biologfa molecular, microbiologfa, smtesis qmmica, analisis qmmico, preparacion farmaceutica, formulacion, y administracion, y tratamiento de pacientes.

Por toda esta memoria, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra “comprender”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entendera que implica la inclusion de un elemento indicado o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros pero no la exclusion de ningun otro elemento o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros. Por “consistir en” se quiere decir incluir, y generalmente limitado a, lo que sea que siga la frase “consistir en”. Por “consistir basicamente en” se quiere decir incluir cualquier elemento enumerado despues de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o accion especificada en la descripcion para los elementos enumerados. Por tanto, la frase “consistir basicamente en” indica que los elementos enumerados se requieren o son obligatorios, pero que no otros elementos se requieren y pueden o no pueden estar presentes dependiendo de si afectan o no a la actividad o accion de los elementos enumerados.

En esta memoria y las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular “un”, “una” y “el” y “la” incluyen referencias del plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Como se usa en el presente documento, en aspectos particulares, los terminos “aproximado” o “aproximadamente” cuando preceden un valor numerico indica el valor mas o menos un intervalo de 5 %, 6 %, 7 %, 8 % o 9 %. En otros aspectos, los terminos “aproximado” o “aproximadamente” cuando preceden un valor numerico indican el valor mas o menos un intervalo de 10 %, 11 %, 12 %, 13 % o 14 %. En otros aspectos mas, los terminos “aproximado” o “aproximadamente” cuando preceden un valor numerico indica el valor mas o menos un intervalo de 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 %.

La referencia por toda esta memoria a “una realizacion” o “un aspecto” significa que un rasgo particular, estructura o caractenstica descrita en relacion con la realizacion esta incluida en al menos un aspecto de la presente descripcion. Por tanto, las apariciones de las frases “en un aspecto” en diversos sitios por toda esta memoria no son necesariamente todos referentes al mismo aspecto. Ademas, los rasgos, estructuras o caractensticas particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en uno o mas aspectos.

El siguiente ejemplo es a modo ilustrativo y no es limitante.

Ejemplo

En este ejemplo se usan los siguientes materiales y metodos:

Cultivo celular y manipulacion genetica dirigida. Las lmeas celulares derivadas de DT40 (Cummings y col., 2007; Cummings y col., 2008; Yabuki y col., 2009; y como se describen en el presente documento) se mantuvieron y se sometieron a transfeccion como se describio previamente (Yabuki y col., 2005). Las celulas FreeStyle 293-F (Invitrogen, Carlsbad, CA) se mantuvieron y se sometieron a transfeccion como se especifica por el fabricante.

Se dirigio PolyLacO a la matriz Wh en el alelo de la cadena pesada reordenado y expresado de celulas DT40 PolyLacO-AR, previamente modificadas por ingeniena para llevar el PolyLacO en el alelo de la cadena ligera reordenado o expresado (Cummings y col., 2007; Cummings y col., 2008; Yabuki y col., 2009). El elemento regulador de PolyLacO (Robinett y col., 1996) comprendfa aproximadamente 100 repeticiones de un operador de

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lactosa de 20 mer (LacO). La construccion de transferencia (targeting construct), pPolyLacO-WH, llevaba el gen de resistencia a blasticidina para posibilitar la seleccion de transfectantes estables seguido de aproximadamente 10 d^as de crecimiento en 20 pg/ml de concentracion de blasticidina (Invitrogen). Para generar esta construccion, se obtuvieron grupos de homologfa de 2,8 y 4,2 kb de los fragmentos de matriz WH amplificados a partir de ADN genomico de Dt40 usando los cebadores 5'-GGGGTCTCTATGGGGTCTAAGCGTGGCC-3' (SEQ ID NO:1) y 5'- GGCCGATTCTTTTCTCATGAGATCCCTCCAGAAG-3' (SEQ ID NO:2) o 5'-

TTCCCCACAACCAGGCCATGCGCCTCCTTG-3' (SEQ ID NO:3) y 5'-CCTGCAGACACCCAGAGGAGGGCTCAGC- 3' (SEQ ID NO:4). El PolyLacO, el gen de resistencia a blasticidina, y dos grupos de homologfa se subclonaron en pBluescript II KS(+) (Strategen). La construccion se verifico mediante analisis de restriccion y secuenciacion parcial, y se propago en cepas de E. coli deficientes en recombinacion Stbl2 (Invitrogen) para mantener la estabilidad de repeticion. La manipulacion dirigida se llevo a cabo basicamente como se describio anteriormente (Yabuki y col., 2009). Las celulas DT40 PolyLacO-AR se sometieron a transfeccion, y despues de 10 d^as de cultivo en presencia de antibiotico, los transfectantes estables se sometieron a cribado por PCR genomica y transferencia Southern para identificar integrantes homologos.

El repertorio de la region Vh (VDJ) de celulas DTLacO se aumento en dos etapas, ambas de las cuales dependfan del vector de transferencia, pVDJ3. Para generar pVDJ3, se amplificaron grupos de homologfa de 2,2 y 1,8 kb a partir del ADN genomico de DT40 usando los cebadores 5'- TGAATGCTTTGTTAGCCCTAATTAGGGATTGAATTGAGAG-3' (SEQ ID NO:5) y 5'- CCGTGAGACCCCCCGTTGACC-3' (SEQ ID NO:6) o 5'-GCCCGACCGAAGTCATCGTCTCCTCCGGTG-3' (SEQ ID NO:7) y 5'-TTTGCCTTCAAATCACcCTA-3' (SEQ iD NO:8), respectivamente, y se centraron en la region VDJ lfder y se clonaron en pBluescript II KS(+). El derivado de la construccion de transferencia pVDJ3-GFP se genero reemplazando la region VDJ lfder con un casete de expresion de GFP (McConnell Smith y col., 2009). El conjunto de construccion de transferencia pVDJ3-Bin1 se genero insertando una genoteca de la region Vh en el sitio Xcml-PshAI de pVDJ3. Esas secuencias se han amplificado a partir de la bolsa de un polluelo Leghorn Blanco de 2 meses de vida usando los cebadores de PCR 5'-GGGTCTGCGGGCTCTATGGGG-3' (SEQ ID NO:9) y 5'- ATCGCCGCGGCAATTTTGGGG-3' (SEQ ID NO:10). En la primera etapa, la region vDj endogena se reemplazo por el casete de expresion de GFP usando pVDJ3-GFP. En la segunda etapa, el conjunto de construccion de transferencia pVDJ3-Bin1 se uso para reemplazar la GFP previamente dirigida, produciendo celulas slgM+. Las transfecciones para manipulacion dirigida de la cadena pesada se llevaron a cabo usando un Nucleofector (programa B-023; Lonza).

Las celulas slgM+ se recogieron por MACS y a continuacion FACS. En resumen, despues de dos dfas despues de la transfeccion, las celulas se lavaron en PBS que contema BSA al 1 % (Sigma, St. Louis, MO), y celulas sIgM+ enriquecidas por la union a Dynabeads (Dynal) de protema G acopladas a anti-IgM de pollo (Southern Biotech) segun las orientaciones de los fabricantes. Despues de tres dfas en cultivo, las celulas sIgM+/GFP‘ se clasificaron usando una FACSAria (BD Biosciences), generando la poblacion de DTLacO-2.

Construcciones de transfeccion a VJ. Para dirigir nuevas secuencias VJ, se construyo pVJ1. Un fragmento de 3,2 kb de la region en direccion 5' VJ se amplifico con los cebadores de PCR 21-22 (5'-

GGGACACCTGAAGGCATGAGTGG-3', SEQ ID NO:21) y (5'-GGCGGAATCCCAGCAGCTGTGT-3', SEQ ID NO:22); un fragmento de 1,2 kb de la region en direccion 3' VJ se amplifico con cebadores de PCR 23-24 (5'- GTGAGTCGCTGACCTCGTCTCGGTC-3', SEQ ID NO:23) y (5'-GGGCTCTTTCTACCTCAAGGCATGT-3', SEQ ID NO:24); y ambos fragmentos se clonaron en pCR2.1 (Invitrogen). La region VJ lfder, a continuacion, se inserto en el sitio BmgBI-AvrII del plasmido. La construccion se verifico mediante analisis de restriccion y secuenciacion. Las nuevas secuencias VJ tambien estaban ligadas en el sitio BmgBI-AvrII.

Para dirigir BFP a la region VJ de DT40, se produjo pVJ1-BFP. Las secuencias senal de poly A de SV40 y BFP se amplificaron a partir de pTagBFP-N (Evrogen); unas 155 pb de la region en direccion 5' VJ se fusionaron al amplicon; y, a continuacion, se insertaron en el sitio BmgBI-AvrII del vector VJ.

Para anadir la etiqueta FLAG al VJ, se produjo pVJ1-FLAGA. Se inserto una etiqueta FLAG corta (DYKDE, SEQ ID NO:25) justo en direccion 5' de la region VJ madura por mutagenesis dirigida a sitio.

Construcciones de transferencia a region C. Primero se genero una construccion de expresion de la cadena pesada quimerica humana-de pollo: chVDJ-huCY1-FLAG-TEV-chTMD, y se confirmo que este polipeptido de fusion se emparejaba con la cadena ligera A de pollo y se expresaba sobre la superficie de las celulas DT40.

Para generar la construccion de sustitucion de la region C, un fragmento de 4 kb de la region en direccion 5' CM1 se amplifico a partir del ADN genomico de DT40 con XP0090 (5'-AGCCTCATTATCCCCCTGAT-3', SEQ ID NO:26; disenado basandose en GenBank N.° AB029075.1) y XP0094 (5'-TCTCTTTCCCTTCGCTTTGA-3', SEQ ID NO:27) y un fragmento de 6 kb de la region CM1-CM2 se amplifico con XP0095 (5'-ACAGTTCCGTTTCCGGTATG-3', SEQ iD NO:28) y XP0099 (5'-CACTCCATCCTCTTGCTGGT-3', SEQ ID NO:29). La en direccion 5' se clono en el sitio EcoRV del pBluescript II KS(+) (Stratagene); las secuencias senal de poly A de BGH y huCY1-FLAG-TEV-chTMD se fusionaron a justo en direccion 3' de la secuencia en direccion 5' insertada por mutagenesis dirigida a sitio QuikChange™ (Stratagene); y, a continuacion, la direccion 3' se clono en el sitio Hindlll-Xhol del plasmido. Tambien

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se inserto el marcador de Zeocina flanqueado por sitios loxP modificados en el sitio Hindlll para proporcionar un mecanismo de seleccion de farmaco para transfectantes estables, si se necesita posteriormente. La construccion se verifico por analisis de restriccion y secuenciacion parcial, y se propago en cepas de E. coli deficientes en recombinacion Stbl2 o Stbl3 (Invitrogen) para mantener las secuencias de repeticion de la region S.

Para prevenir posible apoptosis inducida por receptor del linfocito B (BCR) debido a la union de IgM anclado en membrana a antigenos diana con alta afinidad, se preparo una version mutante de la construccion que reemplaza la region C. Dos aminoacidos Ser-Thr en el domino de la transmembrana (TMD), los cuales son cruciales para la transduccion de la senal (Shaw, A.C., Mitchell, R.N., Weaver, Y.K., Campos-Torres, J., Abbas, A.K. y Leder, P. Cell 63, 381-392 (1990)), se sustituyeron por Val-Val mediante mutagenesis dirigida a sitio.

Las construcciones de transferencia tanto silvestres como mutantes se disenaron tambien para tener sitios de escision de proteasa en caso de llegar a ser deseable para los anticuerpos quimericos para liberarse de las celulas. Una era la etiqueta FLAG de longitud completa (DYKDDDDK, sEq iD NO:30; que se podfa escindir por enteroquinasa) y la otra era el sitio de reconocimiento de TEV (ENLYFQG, SEQ ID NO:31; que se podfa escindir por TEV proteasa).

Para reemplazar la region C de la cadena pesada, celulas DT40 silvestres se sometieron a transfeccion con cualquiera de las dos construcciones que reemplazan la region C usando un Nucleofactor (Lonza); y despues de 3 dfas despues de la transfeccion, las celulas que expresan anticuerpo quimerico humano-de pollo se enriquecieron por MACS con Dynabeads Protema G (Invitrogen). La expresion de la protema de fusion se detecto por FACS con anti-IgG humana (Southern Biotech) y las secuencias de las fusiones chVDJ-huCY1-FLAG-TEV-chTMD expresadas se confirmaron por RT-PCR.

La secuencia de nucleotidos que codifica chVDJ-huCY1-FLAG-TEV-chTMD se expone en la SEQ ID NO:32, en la cual las secuencias de nucleotidos componentes que codifican los fragmentos chVDJ, huCY1, FLAG, TEV, y chTMD se exponen en las SEQ ID NOS:33 a 37, respectivamente.

Cuantificacion de tasas de diversificacion. Las tasas de diversificacion se cuantificaron usando el ensayo de perdida de sIgM, que mide la fraccion de celulas que han perdido la expresion de IgM sobre la superficie celular debido a los sucesos de diversificacion (Sale y col., 2001; Yabuki y col., 2005; Ordinario y col., 2009). En resumen, los paneles de aproximadamente 20 transfectantes independientes se aumentaron durante 3 semanas, a continuacion las celulas (aproximadamente 1x106) de cada miembro del panel se tineron con anti-IgM de pollo conjugada con R-PE (1:200; Southern Biotech), y se analizaron sobre un FACScan con el programa informatico CellQuest (BD Biosciences). El porcentaje de celulas sIgM' se calculo como la relacion del numero de celulas con descenso 8 veces o mayor en la intensidad de PE y PE de la poblacion de sIgM+ (Hatanaka y col., 2005; Sale y col., 2001).

Analisis de la secuencia de la region V. La PCR de la region V y el analisis de secuencia se realizaron basicamente como se describe (Yabuki y col., 2005; Cummings y col., 2007), usando cebadores 5'-

CAGGAGCTCGCGGGGCCGT CACTGATTGCCG-3' (SEQ ID NO:11) y 5'-

GCGCAAGCTTCCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG-3' (SeQ ID NO:12) para la amplificacion de las regiones Va reordenadas y los cebadores 5'-GGGTCTGCGGGCTCTATGGGG-3' (sEq ID NO:13) y 5'-

ATCGCCGCGGCAATTTTGGGG-3' (SEQ ID NO:14) para amplificacion de las regiones Vh reordenadas. Cuando es necesario, se llevo a cabo PCR semianidada usando un cebador de segunda ronda 5'- T CACT GATTGCCGTTTTCTCCCCTCT CTCC-3' (SEQ ID NO:15) para las regiones Va o 5'- GGTCAACGGGGGGTCTCACGG-3' (SEQ ID NO:16) para las regiones Vh. Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificacion de PCR QIAquick™ (Qiagen, Valencia, CA) y se secuenciaron directamente.

Antigenos y seleccion para la union a antigeno. Las selecciones iniciales se realizaron uniendo poblaciones de DTLacO diversificadas a perlas magneticas formando complejos con antigenos, y posteriormente selecciones por FACS usando antigenos solubles marcados por fluorescencia, seguido de procedimientos previamente descritos (Cumbers y col., 2002; Seo y col., 2005) con modificaciones menores. Dynabeads M-280 (Dynal) de SAv y SAv-PE (Southern Biotech) se usaron para seleccionar celulas que reconodan SAv. La seleccion de celulas que reconodan protemas de superficie celular humanas usaron protemas quimericas humanas recombinantes, expresadas como fusiones con Fc de IgG1 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN), incluyendo el dominio extracelular de VEGFR2 (restos 20-764; n.° de Cat 357-KD), TIE2 (restos 23-745; n.° de Cat. 313-TI), TROP2 (restos 88-274; n.° de Cat. 650- T2), FN14 (restos 28-79; N.° de Cat. 1199-TW) or FZD10 (restos 21-161; N.° de Cat. 3459-FZ). Las protemas quimericas se unieron a Dynabeads de protema G (Dynal) usando las condiciones recomendadas por los fabricantes para el metodo MACS, y se detectaron con anti-Fc de IgG humana marcado con PE-Cy5 (Southern Biotech; 1:200) para el metodo FACS. Las protemas quimericas se unieron a Dynabeads de protema G (Dynal) usando las condiciones recomendadas por los fabricantes para el metodo MACS, y se detectaron con anti-Fc de IgG humana marcado con PE-Cy5 (Southern Biotech; 1:200) para el metodo FACS. Los antigenos para la seleccion se usaron a concentraciones de 10 pg/ml; las selecciones se llevaron a cabo sobre >108 celulas a una relacion perla:celula que oscilaba de 3:1 a 1:1. En algunos casos, el preaclaramiento de celulas DTLacO no espedficas se llevo a cabo usando perlas que caredan de antigeno.

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Ensayos de union y afinidad. Se determinaron las cineticas de union saturacion tinendo celulas con diversas concentraciones de antfgenos solubles marcados fluorescentes, y las afinidades aparentes (kD) se calcularon mediante regresion no lmea usando el programa informatico GraphPad™ Prism. Para ensayar la union de los AcM a los antigenos de superficie celular, se generaron AcM humanos-de pollo quimericos recombinantes clonando segmentos Vh y Va amplificados por PCR en el marco en derivados de pcDNA3.1 (Invitrogen), pcDNA3.HG1 y pcDNA3.HLam, que llevan las regiones constantes y1 y A humanas, respectivamente. Los plasmidos de expresion se sometieron a transfeccion conjunta de manera transitoria en celulas FreeStyle™ 293-F (Invitrogen, Carlsbad, CA) segun las instrucciones del fabricante. Despues de 2 a 4 dfas de cultivo, los anticuerpos secretados se purificaron de sobrenadantes mediante cromatograffa de la protema A (MabSelect SuRe; GE Healthcare) y, si era necesario, se concentraron por ultrafiltracion Ultracel (Millipore). Las celulas diana se generaron mediante transfeccion transitoria de celulas 293-F con construcciones de expresion de antfgeno (GeneCopoeia).

Se obtuvieron los siguientes resultados:

La plataforma de descubrimiento de AcM de DTLacO. La plataforma de DTLacO para la seleccion y optimizacion rapida de AcM se obtuvo por ingeniena en dos etapas (Figura 1). Primero, un elemento regulador fuerte, multfmeros del ADN del operador de lactosa del operon de lactosa de E. coli ("PolyLacO"), se inserto en direccion 5' del gen de IgH reordenado y expresado en la lmea celular DT40 PolyLacO-AR, previamente modificada por ingeniena para llevar PolyLacO en IgA solamente. Luego, la region Vh endogena (VDJ) se sustituyo con una genoteca de Vh generada a partir de linfocitos B de la bolsa de pollo, aumentando el repertorio de Vh inicial. Ambas etapas de modificacion por ingeniena tomaron ventaja de la alta eficacia de la manipulacion genetica dirigida en linfocitos B DT40 de pollo.

Previamente se demostro que PolyLacO puede posibilitar la regulacion inducible de la tasa y el resultado de la diversificacion del gen de IgA (hipermutacion somatica o conversion genica) tras la expresion de factores reguladores distintos fusionados a protema represora de lactosa (Lacl) (Cummings y col., 2007; Cummings y col., 2008; Yabuki y col., 2009). Este uso de la red reguladora de LacO/Lacl tomo ventaja de la alta afinidad (kD=10‘14 M) de Lacl para LacO, asf como la sensibilidad de la interaccion Lacl/LacO en la molecula pequena, IPTG.

Aceleracion sinergica de la diversificacion para PolyLacO dirigido a tanto IgA como IgH. Se previno que la diversificacion era elevada en celulas “DTLacO”, modificadas por ingeniena para llevar PolyLacO dirigido a tanto los genes de IgA como los de IgH, en relacion con las celulas DT40 PolyLacO-AR, que llevaban PolyLacO solamente en IgA. Las tasas de diversificacion de las lmeas modificadas por ingeniena candidatas se determinaron mediante el ensayo de la fraccion de celulas sIgM' 3 semanas despues de la transfeccion con el factor regulador Lacl-HP1. Los candidatos representativos presentaron tasas de diversificacion de 6,9 %, 12,6 % y 25,7 % (por ejemplo, Fig. 2A), elevado de 2,5 a 9,2 veces en relacion con el 2,8 % caractenstico de la lmea parental DT40 PolyLacO-AR Lacl-HP1. La diversificacion acelerada se reconfirmo para una lmea mediante ensayo de fluctuacion de transfectantes individuales (Fig. 2B). Los porcentajes de celulas sIgM’ oscilaron de 2,5 % a 52,5 %, con una media de 13,0 % (Fig. 2B), 4,6 veces mayor que en los transfectantes DT40 PolyLacO-AR LacI-HP1 (2,8 %) y 21,7 veces mayor que en las celulas control DT40 PolyLacO-AR GFP-LacI (0,6 %, comparable con la lmea parental DT40 (Cummings y col., 2007). Algunos de los clones individuales presentaron perdida de sIgM considerablemente diferente de la media, como se predice debido a que este ensayo de fluctuacion media variantes sIgM‘ acumuladas. Por tanto, dirigir elementos PolyLacO a la diversificacion acelerada de tanto los genes de la cadena pesada como ligera casi 22 veces en relacion con la lmea celular parental DT40 (Fig. 2C). La diversificacion tambien se acelero tras la transfeccion de otros factores, incluyendo Lacl-VP16 y E47-LacI (no mostrado).

Evolucion ex vivo de anticuerpos anti-estreptavidina. Para ensayar la utilidad de las celulas DTLacO para la evolucion de AcM ex vivo, se seleccionaron AcM frente al antfgeno modelo, estreptavidina (SAv) (Cumbers y col., 2002; Seo y col., 2005) de la poblacion DTLacO-1 (Figura 1, Etapa 1). Las celulas se sometieron a transfeccion establemente con una construccion de expresion E47-Lacl, que codificaba una fusion de Lacl y la isoforma E47 del factor regulador, E2A. E47 era un regulador transcripcional conocido en algunos contextos, pero en los genes de Ig de las celulas DT40 promovieron la diversificacion pero no la transcripcion (Yabuki y col., 2009). Una poblacion diversificada de 3x108 celulas DTLacO E47-Lacl se enriquecieron dos veces para la union a perlas magneticas conjugadas a SAv y, a continuacion, se seleccionaron mediante rondas sucesivas de FACS para la union a SAv-PE. La poblacion celular presento afinidad incrementada despues de cada ronda de seleccion. Un cambio de 30 veces era evidente despues de la quinta ronda de seleccion y un cambio de 100 veces por la septima ronda (S5 y S7, respectivamente; Figura 3A). La afinidad de union de la poblacion S7 para SAv-PE-Cy7 se midio mediante cineticas de union saturacion. En este metodo basado en FACS, las celulas se tineron con concentraciones crecientes de antfgeno hasta que se establecio el equilibrio de antfgeno unido y no unido; los valores de intensidad de fluorescencia media (IFM) resultantes se analizaron con el programa informatico Prism (GraphPad); y se determino la afinidad en equilibrio (kD) (Figura 3B). La afinidad aparente se encontro que era 0,7 nM, despues de 7 rondas de seleccion, que se comparo favorablemente con 15-19 rondas de seleccion que se requirieron para la seleccion de anticuerpos de afinidad comparable ex vivo usando lmeas de linfocito B humanas cultivadas (Cumbers y col., 2002). Las secuencias de las regiones Vh y Va se determinaron mediante la amplificacion por PCR de celulas unicas, y comparadas con la lmea germinal (Reynaud y col., 1987; Reynaud y col., 1989). Sorprendentemente, una insercion/duplicacion de 18 restos se identifico en CDR1 de Va (Figura 3C). Una insercion en la CDR1 de la cadena ligera de los AcM anti-SAv tambien ha sido publicada por otros usando celulas DT40 que no se han sometido a modificacion por ingeniena (Seo y col., 2005).

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Seleccion de los AcM de alta afinidad que reconocen receptores de superficie celular conservados. Las celulas DTLacO-1 que expresan establemente Lacl-HP1 se seleccionaron para identificar AcM frente a tres antfgenos de superficie celular de interes terapeutico: el receptor tirosina quinasas, VEGFR2 y TIE2, que juega papeles esenciales en la angiogenesis fisiologica y patologica, mas notablemente en cancer (Huang y col., 2010; Ferrara y col., 2010); y la glucoprotema, TROP2, que se sobreexpresa en numerosos canceres epiteliales (Cubas y col., 2010). Los dominios extracelulares de estos receptores estaban altamente conservados, con los ortologos humanos y murinos que presentaban 80 %, 90 % y 83 % de identidad, respectivamente. Cada dominio extracelular se expreso como protema recombinante fusionada al dominio Fc de IgG1 humana. Las celulas DTLacO espedficas para cada antigeno se enriquecieron a partir de 1x109 celulas mediante la seleccion inicial sobre el antigeno unido a perlas magneticas, y a continuacion uniendose al antfgeno soluble y clasificandose por FACS. Se caracterizaron ocho poblaciones seleccionadas con exito y se mostro que presentaban afinidad incrementada en cada etapa de seleccion (Figura 4A, superior). En la octava etapa de seleccion, el analisis de las cineticas de union saturacion de los antfgenos solubles VEGFR2, TIE2, y TROP2 a sus poblaciones DTLacO cognadas establecio valores de afinidad aparentes (kp) de 6,0, 1,4 y 2,0 nM, respectivamente (Figura 4A, inferior). La especificidad de las poblaciones seleccionadas individuales se ensayaron analizando la union a un panel de antfgenos (VEGFR2, TIE2, TROP2, SAv y ovoalbumina). Las celulas DTLacO seleccionadas reconocieron solamente la diana cognada, y no eran de reaccion cruzada (Figura 4B).

AcM de alta afinidad caracterizados por mutaciones dirigidas a CDR. Se generaron AcM humanos-de pollo quimericos y recombinantes mediante la clonacion de las regiones Vh y Va de las celulas DTLacO que reconodan VEGFR2, TIE2 o TROP2 en una construccion para la expresion fusionada a regiones constantes de la cadena pesada y1 y ligera A humana. Los AcM quimericos conservaron reconocimiento a antfgeno de alta afinidad (datos no mostrados), mostrando que el receptor del linfocito B confena union de alta afinidad mediante las celulas seleccionadas. El analisis de secuencia de las regiones Vh y Va clonadas mostro que las mutaciones que confenan alta afinidad y la especificidad se mapearon principalmente a CDR (Figura 4C). Tanto las mutaciones con molde como sin molde eran evidentes en las CDR.

La diversidad de Vh aumentada acelero mas la seleccion de AcM. Las celulas DTLacO que expresaban los factores de fusion a Lacl reguladores, de o bien la poblacion inicial (DTLacO-1) o la poblacion modificada por ingeniena por sustitucion de Vh como se describe en el presente documento (DTLacO-2) (Figura 1), eran las fuentes de los AcM que reconodan otros dos antfgenos de interes terapeutico, el miembro de la familia del receptor de TNF pequeno, FN14 (Winkles y col., 2008), y el receptor acoplado a protema G, FZD10 (Katoh y col., 2007). Ambas protemas teman dominios extracelulares altamente conservados (92 % y 94 % de identidad, respectivamente, entre humano y raton). Como se describe en los documentos U.S.A.N. 13/416.752 y PCT/US2012/28584, se selecciono un AcM anti- FN14 de la poblacion DTLacO-1 y se maduro por la diversificacion conducida por Lacl-HP1 (Figura 5A). La afinidad subnanomolar (kD=0,44 nM) se consiguio despues de 17 rondas de seleccion durante 12 semanas, y la afinidad se mejoro modestamente en el trascurso de las 7 selecciones adicionales durante las proximas 4 semanas (kD=0,26 nM).

Se selecciono un AcM anti-FZD10 (FZ2) (U.S.A.N. 61/523.102) de la poblacion DTLacO-2 descrita en el presente documento, con diversificacion acelerada por el factor anclado HIRA-Lacl (Cummings y col., 2008). La poblacion alcanzo afinidad subnanomolar despues de solamente cuatro rondas de seleccion, durante 8 semanas (Figura 5A). Este AcM reconocio su diana con afinidad aparente kD=0,16 nM. El analisis de secuencia de las regiones Vh y Va clonadas mostro que las mutaciones que confenan alta afinidad y especificidad se mapearon principalmente a CDR (Figura 5B).

Humanizacion superficial de anticuerpos de pollo. Los anticuerpos seleccionados en ratones u otras especies son generalmente humanizados para las aplicaciones terapeuticas (Almagro y col., 2008). El AcM anti-FZD10 se eligio para humanizacion, ya que su alta afinidad y distintas CDR de la cadena pesada ofredan un ensayo fuerte de su etapa clave en el desarrollo de AcM. Las regiones Vh y Va de pollo estaban relacionadas muy de cerca con subgrupo III de Vh y subgrupo III de Va humanos, respectivamente. Estos eran regiones marco conservadas bien establecidas para la humanizacion, y se han usado previamente para humanizar AcM obtenidos por inmunizacion de pollos (Tsurushita y col., 2004; Nishibori y col., 2006). La estructura de una CDR se determina no solamente por la secuencia primaria de la propia CDR sino tambien por un numero pequeno de restos de “zona Vernier” cercanos que contribuyen a dar forma a la estructura de CDR (Foote y col., 1992). Los armazones para injertar CDR se generaron modificando regiones marco conservadas humanas en las pocas posiciones necesarias para conseguir la identidad con los restos de la zona Vernier de la correspondiente region Vh o Va de pollo. Los armazones marco conservados generados de ese modo eran 94 a 96 % identicos a las secuencias marco conservadas humanas, haciendo a la inmunogenicidad muy poco probable. Los dos primeros restos N terminales de las cadenas ligeras tambien se eliminaron, ya que estos residuos estaban situados proximos a CDR1 en los anticuerpos de mairnfero y podfan interferir en principio con la interaccion de los anticuerpos con antfgenos. Las CDR del AcM de pollo, a continuacion, se injertaron a los armazones modificados, para crear las regiones Vh y Va humanizadas (Figura 5 C). Las comparaciones de las afinidades de union aparentes de las versiones de pollo y humanizadas del AcM anti-FZD10 mostraron que la humanizacion se alcanzaba sin perdida de afinidad (Figura 5D). Esta humanizacion superficial contrastaba con los anticuerpos murinos, los cuales requieren considerable optimizacion empmca.

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Los resultados anteriormente descritos mostraron que la plataforma DTLacO-2 permiffa rapido descubrimiento ex vivo de AcM que reconocen dianas altamente conservadas. Se demostro el poder de la plataforma DTLacO generando AcM espedficos y de alta afinidad para cinco anffgenos de superficie celular de interes terapeutico, el receptor tirosina quinasas VEGFR2 y TIE2, la glucoprotema TROP2, y el receptor acoplado a protema G FZD10, todos los cuales como se describen en el presente documento se obtuvieron usando DTLacO-2, y tambien el miembro FN14 de la familia del receptor de TNF pequeno obtenido usando DTLacO-1. Los dominios extracelulares altamente conservados de estos receptores de superficie celular eran probablemente para hacerlos dianas diffciles para el descubrimiento de AcM in vivo, lo cual esta limitado por inmune tolerancia. El tiempo desde la seleccion inicial a la identificacion de un AcM de alta afinidad (<10 nM) era en el orden de 4 a 8 semanas, y la afinidad subnanomolar se alcanzo en 8 a 12 semanas. Este marco de tiempo para la produccion de anticuerpos de alta afinidad de especificidad deseada se comparo muy favorablemente con otras plataformas ex vivo o in vivo para el descubrimiento de AcM.

La plataforma de descubrimiento de AcM ex vivo de DTLacO proporciono varias ventajas adicionales en relacion con otros planteamientos de descubrimiento de AcM. Las celulas produdan anticuerpos intactos, los cuales se podfan ensayar inmediatamente para propiedades deseadas, mientras que muchos planteamientos in vitro como el sistema de presentacion en fago producen anticuerpos de cadena sencilla, que son frecuentemente diffciles de convertir en AcM de longitud completa activos debido a la agregacion o inestabilidad. Las celulas DTLacO diversificaron regiones V de Ig usando rutas fisiologicas (hipermutacion somatica y conversion genica), que dirigen mutaciones principalmente a CDR, los subdominios de las regiones V que directamente contactan con anffgenos. Ademas, las celulas proliferaron rapidamente y eran inmortales, de manera que en cada etapa de seleccion la poblacion celular proporciono no solamente una fuente renovable de anticuerpos (o secuencias Vh y Vl para la expresion de anticuerpos recombinantes), sino tambien un punto de partida para la optimizacion adicional.

La plataforma DTLacO se distingrna de otras plataformas de descubrimiento de AcM que usan celulas DT40 (Cumbers y col.; Seo y col., 2005) por la capacidad de acceder de ambos de los mecanismos de diversificacion fisiologicos descritos, hipermutacion somatica y conversion genica. Las celulas DTLacO tambien conservaban la capacidad de llevar a cabo manipulacion genetica dirigida homologa, que permiffa la modificacion por ingenieffa genetica adicional. La caracteffstica anterior de las celulas DTLacO se exploto mas sustituyendo la region Vh endogena con una genoteca VH reordenada, para crear la poblacion de DTLacO-2 que lleva un repertorio de VH aumentado. La tercera CDR de la cadena pesada, CDR-H3, inclda la union VDJ y era un determinante principal para el reconocimiento de anffgeno (Xu y col., 2000). La diversidad de CDR-H3 puede haber contribuido a la seleccion rapida de un AcM anti-FZD10 de alta afinidad a partir de la poblacion DTLacO-2. Tambien es posible intercambiar regiones V humanas por regiones V de pollo (datos no mostrados), que permiffan la optimizacion de la afinidad o funcionabilidad de AcM descubiertos por otros metodos, asf como descubrimiento directo de AcM terapeuticos humanos.

Los AcM de pollo optimizados en las celulas DTLacO probaron que eran facilmente humanizados por el injerto de CDR en regiones marco conservadas del subgrupo III de Vh y subgrupo III de Va humanas consenso en las que los retos de la zona Vernier se han modificado para conservar la estructura CDR. La humanizacion de Ig se llevo a cabo sin perdida de afinidad, y alcanzo >94 % de identidad a Ig humanas en las regiones marco conservadas. Este resultado era comparable a o mejor que muchos AcM murinos humanizados actualmente en la clmica, e hicieron a la inmunogenicidad muy poco probable. Las lecturas con las que los AcM se humanizaron contrastaron con los anticuerpos descubiertos en celulas de raton o murinas, las cuales deben someterse a optimizacion empffica. Las regiones marco conservadas del subgrupo III de Vh y el subgrupo III de Va se conservan entre un numero de vertebrados, surgiendo la posibilidad de que los marco conservados de AcM se pudieran modificar para el tratamiento de enfermedades cronicas en otras especies.

Referencias

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antibodies by enhanced homologous recombination”. Nat. Biotechnol. 23:731-735.

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Los diversos aspectos descritos anteriormente se pueden modificar, si es necesario para emplear conceptos de las diversas patentes, solicitudes y publicaciones. Estos y otros cambios se pueden hacer a los ejemplos teniendo en cuenta la descripcion anteriormente detallada.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Omeros Corporation

University of Washington through its Center for Commercialization Cummings, W. Jason Tjoelker, Larry W.

Wood, Christi L.

Yabuki, Munehisa Allison, Daniel S.

Leppard, John B.

Maizels, Nancy

<120> COMPOSICION Y METODO PARA DIVERSIFICACION DE SECUENCIAS DIANA

<130> 980087.402WO

<140> PCT <141>

<150> US 61/611.446 <151>

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 1

ggggtctcta tggggtctaa gcgtggcc 28

<210> 2 <211> 34 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 2

ggccgattct tttctcatga gatccctcca gaag 34

<210> 3 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 3

ttccccacaa ccaggccatg cgcctccttg 30

<210> 4 <211> 28 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 4

cctgcagaca cccagaggag ggctcagc 28

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 5

tgaatgcttt gttagcccta attagggatt gaattgagag 40

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido

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ccgtgagacc ccccgttgac c 21

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 7

gcccgaccga agtcatcgtc tcctccggtg 30

<210>8 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 8

tttgccttca aatcacccta 20

<210>9 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 9

gggtctgcgg gctctatggg g 21 <210> 10

<211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 10

atcgccgcgg caattttggg g 21

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 11

caggagctcg cggggccgtc actgattgcc g 31

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<213> Secuencia artificial <220>

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gcgcaagctt ccccagcctg ccgccaagtc caag 34

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 13

gggtctgcgg gctctatggg g 21

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 14

atcgccgcgg caattttggg g 21

<210> 15 <211> 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

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<223> Oligonucleotido <400> 15

tcactgattg ccgttttctc ccctctctcc 30

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 16

ggtcaacggg gggtctcacg g 21

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Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gin Thr Pro Gly Arg 15 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asn Met Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val 35 40 45

Ala Gly He Asp Asn Thr Gly Arg Tyr Thr Gly Tyr Gly Ser Ala val 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr He Ser Arg Asp Asn Gly Gin Ser Thr val Arg 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Ala Ala Gly 100

<210> 18 <211> 101 <212> PRT <213> Gallus gallus

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Ala Val Thr Leu Asp Glu Ser Gly Gly Gly Leu Gin Thr Pro Gly Gly 15 10 15

Ala Leu Ser Leu Val Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn 20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Gly lie Asp Asp Asp Gly Ser Gly Thr Arg Tyr Ala Pro Ala Val 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr lie Ser Arg Asp Asn Gly Gin Ser Thr Leu Arg 65 70 75 80

Leu Gin Leu Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Lys Cys Ala Tyr 100

<210> 19 <211> 94 <212> PRT <213> Gallus gallus

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Ala Leu Thr Gin Pro Ser Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Gly Thr Val 15 10 15

Lys lie Thr Cys Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Tyr Gly Trp Tyr Gin Gin 20 25 30

Lys Ala Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Val lie Tyr Asp Asn Thr Asn 35 40 45

Arg Pro Ser Asn lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser 50 55 60

Thr Ala Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Arg Ala Asp Asp Asn Ala Val 65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Ala Arg 85 90

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10

15

Ala Leu Thr Gin Pro Ala Ser Val Ser Ala Asn Pro Gly Glu Thr Val 15 10 15

Lys lie Thr Cys Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr 20 25 30

Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Tyr Ala Gly Ser Tyr Tyr Tyr Gly Trp Tyr 35 40 45

Gin Gin Lys Ser Pro Gly Ser Ala Pro Val Thr Leu lie Tyr Asn Asn 50 55 60

Asn Asn Arg Pro Ser Asp lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser 65 70 75 80

Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr lie Thr Gly Val Arg Ala Asp Asp Glu 85 90 95

Ala Val Tyr Phe Cys Gly Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala Ala Phe Gly 100 105 110

<210> 21 <211> 23 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 21

gggacacctg aaggcatgag tgg 23

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<210> 22 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 22

ggcggaatcc cagcagctgt gt 22

<210> 23 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 23

gtgagtcgct gacctcgtct cggtc 25

<210> 24 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 24

gggctctttc tacctcaagg catgt 25

<210> 25 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido <400> 25

Asp Tyr Lys Asp Glu 1 5

<210> 26 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 26

agcctcatta tccccctgat 20

<210> 27 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<400> 27

tctctttccc ttcgctttga 20

<210> 28 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 28

acagttccgt ttccggtatg 20

<210> 29 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido <400> 29

cactccatcc tcttgctggt 20

<210> 30 <211>8 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido <400> 30

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 31 <211>7 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido <400> 31

Glu Asn Leu Tyr Phe Gin Gly 1 5

<210> 32 <211> 1548 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica cadena pesada de Ig humana-de pollo quimerica <400> 32

gccgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccgggggagc gctcagcctc 60

gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agtaacgcca tgggttgggt gcgacaggcg 120

cccggcaagg

ggct ggagt g ggt cgct ggt attgatgatg atggt agtgg cacaagatac 180

gcgccggcgg

tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacactgagg 240

ctgcagctga

acaacctcag ggctgaggac accggcatct actactgcac gaaatgtgct 300

tacagtagtg

gttgtgatta tgaagctggt tatatcgacg catggggcca cgggaccgaa 360

gtcatcgtct

cctccgcctc gaccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 420

aagagcacct

ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 480

ccggtgacgg

tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 540

gtcctacagt

cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 600

ttgggcaccc

agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 660

aagaaagttg

agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 720

gaactcctgg

ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 780

atctcccgga

cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 840

gtcaagttca

actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 900

gaggagcagt

acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 960

tggctgaatg

gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctecc ageccccatc 1020

gagaaaacca

tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1080

ccatcccggg

atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1140

tatcccagcg

acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1200

accacgcctc

ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1260

gacaagagca

ggtggcagca ggggaacgtc ttetcatget cegtgatgca tgaggctctg 1320

cacaaccact

acacacagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaagatta caaggatgac 1380

gacgataagg

agaacctgta ttttcagggt gatctcctcc attggcctct ggaggccgaa 1440

gaggacgacg

acatccaacg cctttgggcc accacctcca ccttcatcgt cctcttcatc 1500

ctcagcctct

tctacagcgc caccgtcacc ctcatcaagg tgaaatga 1548

<210> 33 <211> 43

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construccion que codifica region J de IgH de pollo reorganizada (chVDJ)

10

<400> 33

atcgacgcat ggggccacgg gaccgaagtc atcgtctcct ccg 43

<210> 34

15 <211> 989

<212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

20 <223> Construccion que codifica region C gamma 1 de Ig humana

5

10

15

20

25

30

<400> 34

cctcgaccaa

gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60

gcacagcggc

cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120

ggaactcagg

cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180

gactctactc

cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240

acatctgcaa

cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300

aatcttgtga

caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360

cgtcagtctt

cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc oggaccoctg 420

aggtcacatg

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480

acgtggacgg

cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540

gcacgtaccg

tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600

agtacaagtg

caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660

aagccaaagg

gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 720

tgaccaagaa

ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780

ccgtggagtg

ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840

tggactccga

cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900

agcaggggaa

cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac 960

agaagagcct

ctccctgtct ccgggtaaa 989

<210> 35 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica la etiqueta de epttopo peptidico <400> 35

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 36 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construccion que codifica el sitio de escision de la proteasa <400> 36

gagaacctgt attttcaggg t 21

<210> 37 <211> 138 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica el dominio de transmembrana de IgH de pollo artificial

5

10

15

20

25

<400> 37

gatctcctcc attggcctct ggaggccgaa gaggacgacg acatccaacg cctttgggcc 60

accacctcca ccttcatcgt cctcttcatc ctcagcctct tctacagcgc caccgtcacc 120

ctcatcaagg tgaaatga 138

<210> 38 <211> 376 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica la region J de IgH de pollo reorganizada (chVDJ)

<400> 38

gocgtgacgt tggacgagtc cgggggcggc ctccagacgc ccgggggagc gctcagcctc 60 gtctgcaagg cctccgggtt caccttcagc agtaacgcca tgggttgggt gcgacaggcg 120 cccggcaagg ggctggagtg ggtcgctggt attgatgatg atggtagtgg cacaagatac 180 gcgccggcgg tgaagggccg tgccaccatc tcgagggaca acgggcagag cacactgagg 240 ctgcagctga acaacctcag ggctgaggac accggcatct actactgcac gaaatgtgct 300 tacagtagtg gttgtgatta tgaagctggt tatatcgacg catggggcca cgggaccgaa 360 gtcatcgtct cctccg 376

<210> 39 <211> 989 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica la region C gamma 1 de Ig humana <400> 39

5

10

15

20

25

30

cctcgaccaa

gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg 60

gcacagcggc

cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt 120

ggaactcagg

cgocctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag 180

gactctactc

cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct 240

acatctgcaa

cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca 300

aatcttgtga

caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac 360

cgtcagtctt

cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg 420

aggtcacatg

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt 480

acgtggacgg

cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca 540

gcacgtaccg

tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg 600

agtacaagtg

caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca 660

aagccaaagg

gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc 720

tgaocaagaa

ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg 780

ccgtggagtg

ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc 840

tggactccga

cggctccttc ttcctctaoa gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc 900

agcaggggaa

cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac 960

agaagagcct

ctccctgtct ccgggtaaa 989

<210> 40 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica la etiqueta de epttopo peptidico <400> 40

gattacaagg atgacgacga taag 24

<210> 41 <211> 21 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica el sitio de escision de la proteasa <400> 41

gagaacctgt attttcaggg t 21

<210> 42 <211> 138 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion que codifica el dominio transmembrana de IgH de pollo artificial <400> 42

Claims (22)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un vector de polinucleotido recombinante para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, que comprende:

   (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vh de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen Vh de inmunoglobulina de pollo;

   (b) un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo, en las que dicho gen Vh-D-Jh se reorganiza de modo que los genes Vh, D y Jh estan juntos; y

   (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen JH de inmunoglobulina de pollo,

   en el que el gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh de DT40.
2. 2. El vector de la reivindicacion 1, en el que el gen diana comprende ademas una secuencia de polinucleotido que codifica una protema marcadora, tal como una protema marcadora seleccionada de la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP).
3. 3. El vector de la reivindicacion 1 en el que la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina.
4. 4. Una composicion que comprende una pluralidad de vectores de polinucleotido recombinantes de la reivindicacion 1 para integrar una pluralidad de genes diana en una pluralidad de loci de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo cada uno de dichos vectores:

   (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VH de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen VH de inmunoglobulina de pollo;

   (b) un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo, en las que dicho gen Vh-D-Jh se reorganiza de modo que los genes Vh, D y Jh estan juntos; y

   (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JH de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen JH de inmunoglobulina de pollo,

   en los que el gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VH de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre la secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh de DT40, y

   en los que el gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado se obtiene a partir de una pluralidad de genes Vh- D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo.
5. 5. La composicion de la reivindicacion 4, en la que el gen diana ademas comprende una secuencia de polinucleotido que codifica una protema marcadora, tal como una protema marcadora seleccionada de la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP).
6. 6. La composicion de la reivindicacion 4 en la que la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vh de inmunoglobulina.
7. 7. Una composicion, que comprende:

   (a) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

   (b) un segundo vector para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina, comprendiendo el segundo vector

   (1) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   codifica un gen Vl de inmunoglobulina de pollo;

   (2) un segundo gen diana que comprende un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y

   (3) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen Jl de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen Jl de inmunoglobulina de pollo,

   en el que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region Vl de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de VL de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vl de DT40.
8. 8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7; en la que la composicion comprende ademas:

   uno o una pluralidad de vectores de polinucleotido recombinantes para integrar una pluralidad de genes diana en una pluralidad de loci de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo cada uno de dichos vectores:

   (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen VL de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen Vl de inmunoglobulina de pollo;

   (b) un segundo gen diana que comprende un gen VL-JL de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y

   (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen JL de inmunoglobulina de pollo,

   en los que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region VL de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de VL de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen VL de DT40, y

   en los que el gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado se obtiene de una pluralidad de genes Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenados aislados de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo.
9. 9. La composicion de la reivindicacion 7 u 8, en la que el segundo gen diana comprende ademas una secuencia de polinucleotido que codifica una segunda protema marcadora, tal como una protema marcadora seleccionada de la protema verde fluorescente (GFP) y la protema azul fluorescente (BFP).
10. 10. La composicion de o bien la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8 en la que la hipermutacion somatica tiene lugar en cualquiera o ambas de una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina y una secuencia codificadora de la region marco conservada de Vl de inmunoglobulina.
11. 11. Una celula hospedadora, que comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
12. 12. La celula hospedadora de la reivindicacion 11 en la que la celula se selecciona del grupo que consiste en una celula bacteriana, derivada de una celula de pollo, una celula de linfoma bursal de pollo y una celula DT40.
13. 13. La celula hospedadora de la reivindicacion 11 o 12, en la que el locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina en la celula hospedadora comprende un operador de lactosa polimerizada.
14. 14. La celula hospedadora de las reivindicaciones 11 a 13, en la que el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina en la celula hospedadora comprende un operador de lactosa polimerizada.
15. 15. Una genoteca de las celulas hospedadoras segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
16. 16. Un metodo ex vivo para la produccion de un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo de un polipeptido diana que se codifica por un gen diana que comprende un gen Vh-D-Jh de inmunoglobulina de pollo reordenado, que comprende:

    cultivar un linfocito B de pollo que contiene el vector de polinucleotido recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 bajo condiciones que permiten la proliferacion del linfocito B hasta que se obtiene una pluralidad de linfocitos B, en el que el linfocito B es capaz de cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vh de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vh de inmunoglobulina de pollo

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen Vh, y produciendo de ese modo un repertorio de variantes de secuencia de polipeptido de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo del polipeptido diana.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 16 en el que el linfocito B comprende ademas un segundo vector para integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo, comprendiendo el segundo vector

    (a) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 5' del gen Vl de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 5' del codon de inicio del ADN genomico endogeno que codifica un gen Vl de inmunoglobulina de pollo;

    (b) un segundo gen diana que comprende un gen Vl-Jl de inmunoglobulina de pollo reordenado que se ha aislado de una poblacion de celulas de la bolsa de Fabricio de pollo; y

    (c) una region de la secuencia de acidos nucleicos en direccion 3' del gen JL de inmunoglobulina de pollo que comprende una secuencia homologa al lado 3' del sitio de corte y empalme del ADN genomico endogeno que codifica un gen JL de inmunoglobulina de pollo,

    en el que el segundo gen diana, tras ser integrado en el locus de la cadena ligera de inmunoglobulina de pollo de una celula DT40, es capaz de someterse a cualquiera o ambas de (i) hipermutacion somatica en una secuencia codificadora de la region determinante de complementariedad de Vl de inmunoglobulina, y (ii) conversion genica entre una secuencia de acidos nucleicos codificadora de Vl de inmunoglobulina de pollo reordenada y una secuencia de acidos nucleicos del pseudogen VL de DT40.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 17, en el que el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina de pollo comprende un operador de lactosa polimerizada.
19. 19. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en el que la celula de pollo se selecciona de DT40 y DTLacO.
20. 20. El metodo de la reivindicacion 17 o 18, que comprende ademas el cribado de la pluralidad de linfocitos B de pollo para unirse a un antfgeno.
21. 21. Un metodo ex vivo para integrar un gen diana en un locus de la cadena pesada de inmunoglobulina de pollo, que comprende:

    (a) someter a transfeccion linfocitos B de pollo con el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o someter a transfeccion linfocitos B de pollo con la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; y

    (b) identificar un linfocito B en el que el gen diana esta integrado en el locus de la cadena pesada de inmunoglobulina.
22. 22. El metodo de la reivindicacion 21 que comprende ademas integrar un segundo gen diana en un locus de la cadena ligera de inmunoglobulina, que comprende:

    (a) someter a transfeccion uno o una pluralidad de linfocitos B de pollo con la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 para obtener una o una pluralidad de linfocitos B sometidos a transfeccion; y

    (b) identificar un linfocito B de pollo sometido a transfeccion a partir de (a) en el que el gen diana que comprende un gen VH-D-JH de inmunoglobulina de pollo reordenado esta integrado en el locus de la cadena pesada del gen de inmunoglobulina y el segundo gen diana esta integrado en el locus de la cadena ligera del gen de inmunoglobulina.

    imagen1

    PolyLacO |

    genes sustitucion VH

    PolyLacO

    mm-

    imagen2

    ■—DHHHIh

    FIG. 1

    imagen3

    imagen4

    DTLacO

    OTLacO E47—Lacl

    Pre S2 S3

    Pre S2 S3 S4 S5 S6 S7

    SAv-PE

    FIG. 3A

    2000n

    1500

    70nM

    500

    M

    SAv

    PE

    Cy5

    FIG

    3B

    germinal AVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKASGFTFS SYNMGVi 7RQAPGKGLEFVA jIDNTGRYTGY

    linea

    SAv

    PE

    S7

    HA

    DD

    SG

    GS

    KGRATISRDNGQSTVRIQLNNLRAEDTGTYYCA

    inea

    germinal

    SAv

    PE

    S7

    Vx Mnea germinal ALTQPSSVSANPGGTVKITC SGDSS

    Y YGW I'QQKAPGSAPVTV

    SAv-PE S7

    --GG-YAGSYYYCHYQQKYAGSY

    ...........A.................E...............

    Vx linea germinal IY DNTNRPSlIPSRFSGSKSGSTATLTITGVRADONAVYYClASTDSSSTAAR --M-N---------p.............................................................................E—F

    SAv-PE S7

    -G-A-N-GA-FG

    FIG. 3C

    imagen5

    imagen6

    TIE2 TR0P2

    SO S3 S5 S8 SO S3 S5 S8

    imagen7

    imagen8

    Of 'DM

    imagen9

    imagen10

    zdoai

    Z3I1 >

    imagen11

    VAO AVS ZdOdl Z3I1

    ZdJ93A

    Q

    | ZHJ93A

    00DH(]

    ouaBj)uv

    J

    4^

    CD

    vH

    DTLacO

    VEGFR2

    TIE2-1

    TROP2-2

    CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3

    imagen12

    DTLacO

    VEGFR2

    TIE2-1

    TROP2-2

    CDR-L1

    CDR-L2

    CDR-L3

    imagen13

    FIG. 4C

    cn

    o

    imagen14

    FIG. 5A

    Vu

    H DTLacO FN14FS24 FZD10FZ2

    CDR-H1 CDR-H2 CDR-H3

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    Ml.IT 1 [ 11 kHHHKISlK

    DTLacO

    FN14FS24

    FZD10FZ2

    CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3

    imagen15

    imagen16

    CDR-L1 CDR-L2 CDR-L3

    imagen17

    FIG. 5C

    ACM

    FZ2 (anti-FZDIO)

    polio (K0)

    0.16 nM

    humanizado (K0)

    0.22 nM