KR101204229B1 - 최적화된 ＴＡＣＩ-Ｆｃ 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
N-말단이 잘려진 TACI(막횡단 활성인자 및 CAML-상호작용인자) 세포외 영역 및 Fc를 포함하는 최적화된 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열, 상기 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포 및 벡터, 상기 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한 질환을 치료하기 위한 상기 융합 단백질의 제조 방법 및 용도가 제공된다.
Description
본 발명은 유전자 재조합 기술의 사용에 의해 최적화된 융합 단백질, 특히 TACI-Fc 융합 단백질의 제조 및 면역 질환의 치료를 위한 그의 적용에 관한 것이다.
림프구 발육 및 분화의 프로세스는 다양한 사이토킨에 의해 타이트하게 제어된다. B 림프구 자극제 (BLyS, 또는 소위 BAFF, TNSF13B, THANK, TALL-1, zTNF4) 및 증식 유발 리간드(proliferation-inducing ligand)(APRIL)는 생체 내에서 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는 사이토킨이다(Schneider, 2005, Current Opinion in Immunology, 17:282-289; Seyler 등, 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115:3083-3092). 이들은 B 림프구 발육 및 증식을 자극하여 혈액 중에서 다양한 면역글로불린의 발현을 증가시킨다. BLyS 및 APRIL는 또한 T 림프구들의 성숙도와 그에 따른 세포 면역에 필수적인 조절 효과를 갖는다(Wang 등, 2001, Nature Immunology, 2:632-637).
BLyS 및 APRIL는 림프구들의 세포 표면상 수용체를 통해 림프구의 면역 반응을 조절한다. 이들은 세포막 수용체 TACI (막횡단 활성인자 및 CAML-상호작용인자) 및 BCMA (B 세포 성숙 항원)에 결합한다. 게다가, BLyS는 또한 또다른 수용체 인 BAFF-R에 결합할 수 있다. B 림프구는 TACI, BCMA 및 BAFF-R을 발현한다. 성숙한 T 림프구는 TACT를 발현한다. BLyS 및 APRIL는 이들 수용체에 의해 매개된 신호 전달을 통해 림프구의 활성화, 증식 및 발육을 조절하고, 그에 따라 면역 반응을 증강시킨다. 또한, 림프구-유도된 종양에서, BLyS 및 APRIL은 또한 종양 세포 증식을 촉진하고 세포자멸사(apoptosis)를 억제하며, 그에 의해 종양 진행을 촉진한다.
BLyS 및 APRIL의 과잉 발현은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 전신 홍반 루푸스(SLE), 류마티스 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome)을 포함하는 많은 자가면역 질환에 대한 발병기전 인자의 하나이다. 임상 연구에서는 BLyS의 농도가 종종 자가면역 질환의 심각성과 양의 상관관계를 가지는 것으로 나타나고 있다. 따라서, BLyS 및 APRIL의 억제는 관련된 자가면역 질환의 치료에 대한 잠재적으로 유효한 수단이 되어오고 있다. 한편, BLyS 및 APRIL은 B 림프구 종양의 진행을 촉진할 수 있기 때문에, BLyS 및 APRIL의 억제는 또한 B 림프구 종양, 예컨대 만성 림프구 백혈병, 다발 골수종, B 림프구 림프종 등을 치료하는데 사용될 수 있다.
TACI는 BLyS 및 APRIL의 각각에 대한 높은 친화도를 가지기 때문에, 가용성 TACI(TACI의 세포외 부위)를 사용하여 BLyS 또는 APRIL와 그들의 막 수용체(TACI, BCMA, BAFF-R)와의 상호작용을 방지할 수 있고, 그에 의해 BLyS 또는 APRIL의 생물학적 활성을 차단하고, 자가면역 질환 또는 종양을 치료한다.
연구들에서는 TACI 세포외 부위(extracellular portion) 및 IgG Fc 단편의 융합 단백질(TACI-Fc)이 BLyS에 의해 유발된 질환 진행을 유효하게 억제할 수 있다는 것을 나타내고 있다(Gross 등, 2001, Immunity, 15:289-302). 그러나, 네이티브 TACI의 세포외 부위를 사용하여 구성된 TACI-Fc 융합 단백질은 세포들에서 발현될 때 분해되기 쉽다는 것과, 그에 의해 얻어진 생성물은 종종 불균일(heterogeneous)하다는 것이 연구들에서 또한 밝혀졌다. 따라서, Fc 단편과 네이티브 TACI의 TACI-Fc 융합 단백질은 산업적인 제조를 위해서 적합하지 않다. 본 발명은 유전 공학 기술에 의해 TACI-Fc 융합 단백질을 향상시켜서 산업적인 제조를 위해 적용가능한 약학적 조성물을 개발하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 BLyS 및 APRIL을 차단하는 단백질 약물의 구성 및 제조를 위한 방법, 상기 약물의 제조 방법 및 질환의 치료를 위한 상기 약물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 면역글로불린 Fc 단편과 TACI 단편의 융합에 의해 얻어지고, B 림프구의 증식을 차단할 수 있는 몇가지 융합 단백질을 제공하며, 상기 융합 단백질의 구조는 하기를 특징으로 한다 :
상기 융합 단백질의 TACI 부위는, TACI로부터의, 세포외 영역(extracellular region)의 아미노 말단 영역의 부분적인 서열, 시스테인-풍부 영역의 전체 서열, 및 줄기 영역의 부분적인 서열을 포함하고; 한편 상기 융합 단백질의 면역글로불린 Fc는 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고; 상기 TACI 서열 및 상기 Fc 서열은 링커 서열을 통해 또는 직접적으로 융합되고;
여기서 TACI 단편은 TACI의 아미노산 서열에서 13 내지 108 또는 13 내지 118의 위치로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 상기 링커 서열은 9Gly일 수 있으며,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 인간 또는 동물 면역글로불린의 Fc로부터 유도될 수 있고, 또한 전체 길이 Fc 또는 그 부분적 서열일 수 있으며; 추가적으로 Fc가 IgG, IgM, IgD, 및 IgA로부터 유도될 수 있고, 그들 각각은, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, 및 바람직하게는 IgG1과 같은 모든 아이소타입(isotype)을 각각 포함하며; 또한
여기서 상기 TACI 단편은 인간 및 동물로부터의 TACI 서열로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
특히, 본 발명의 바람직한 융합 단백질은
a. 융합 단백질 T1 : 이는 TACI의 13번째-108번째 아미노산 및 면역글로불린 IgG1 Fc를 융합하는 것에 의해 제조됨(서열식별번호: 1),
b. 융합 단백질 T2 : 이는 TACI의 13번째-118번째 아미노산 및 면역글로불린 IgG1 Fc를 융합하는 것에 의해 제조됨(서열식별번호: 2), 및
c. 융합 단백질 T3 : 이는 TACI의 13번째-118번째 아미노산, 9Gly의 링커 서열 및 면역글로불린 IgG1 Fc를 융합하는 것에 의해 제조됨(서열식별번호: 3);
일 수 있고,
여기서 상기 TACI는 인간 및 동물로부터의 TACI(막횡단 활성인자 및 CAML 상호작용인자)에 대한 세포외 영역의 서열들로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 관한 것이다.
상기 DNA 서열은 서열식별번호: 5 내지 7에 나타내어진다.
네이티브 TACI 서열과의 TACI-Fc 융합 단백질은 손쉬운 단백질 분해 때문에 산업적인 제조용으로 적용할 수 없다. PCT/US2002/015910는 Fc 단편과, 전체 아미노 말단 영역 및 줄기 영역의 부분적인 서열이 삭제된 TACI 단편의 융합이 상기 융합 단백질의 단백질 분해를 방지할 수 있다는 것을 기재하고 있다. 그러나, 아미노 말단 영역의 제거는 TACI의 생물학적 활성을 크게 감소시키는 것으로 보고되었다(Wu 등, 2000, The Journal of Biological Chemistry, 275:35478-35485).
본 발명의 핵심은 프로단백질 전환효소(PC) 인공 뉴런 네트워크의 컴퓨터 소프트웨어 시스템을 사용하여 TACI 세포외 영역의 아미노산 서열을 분석하는 것에 있다. 분석 결과는, TACI 세포외 영역의 서열이 2개의 PC 절단 지점들(cleavage site)(9번째 및 135번째 아미노산)를 포함하고, 또한 두 개의 추가적인 지점들(12번째 및 120번째 아미노산)는 PC 절단 지점에 대한 역치(threshold value)에 가까운 점수를 갖는 것을 나타냈다. 이들 PC 절단 지점들이 발현의 프로세스에서 본질적으로 TACI의 분해에 대한 원인이 될 수 있는 것으로 생각된다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 TACI 분자의 최적화에서 이들 PC 절단 지점들을 제거하고, Fc에 대해 PC 절단 지점들이 없는 TACI 단편을 융합하였다. 본 발명자들의 실험은 신규의 융합 단백질이 발현 도중 TACI의 분해를 효과적으로 방지한다는 것을 입증하였다. 잘려진(truncated) TACI 서열 및 기타 방법들이 사용되어 이들 PC 절단 지점들을 방지할 수 있다. 예를 들어, DNA 부위-지시 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)이 사용되어 이들 PC 절단 지점들을 제거할 수 있다. 따라서 다양한 최적화 방법이 선택되어 동일한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명의 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 TACI 분자의 줄기 영역에서 긴 아미노산 서열 및 아미노 말단 영역에서 대부분의 잔기를 보유한다. 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 단백질 분해의 발생을 극복한다. 전체 N-말단 영역이 제거된 TACI-Fc 융합과 비교하여, 본 발명의 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 더 높은 생물학적 활성 및 단백질 발현 수준을 보였다.
본 발명에서 융합 단백질의 구성은 종래의 분자 클로닝 기술을 기반으로 하고, 특정의 실험적 프로토콜이 다양한 실험실 매뉴얼, 예컨대 2판 및 3판의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual에 언급될 수 있다.
상기 융합 단백질을 벡터 내로 코딩하는 DNA를 클론하기 위하여 PCR 합성법을 사용하였다. 상기 융합 단백질을 발현하기 위한 벡터는 분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 플라스미드일 수 있다. 세포로부터 단백질 분비를 확보하도록 융합 단백질의 아미노 말단의 전방에 신호 펩티드 서열이 포함된다. 벡터 서열은 유전자 발현, 개시 및 정지 신호를 구동하기 위한 프로모터 뿐 아니라, 폴리아데닐화(polyA) 서열을 포함한다. 이 벡터는 박테리아에서 플라스미드 복제를 용이하게 하기 위해 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또한 이 벡터는 안정한, 트랜스펙트된 세포주의 선택을 위한 진핵 세포 선택 유전자를 포함할 수도 있다.
플라스미드의 구성 후, 융합 단백질의 DNA 서열을 시퀀싱에 의해 확인한다. 이어서 세포내로 플라스미드 DNA의 트랜스펙션(transfection)에 의해 상응하는 단백질이 발현될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 포유동물 세포, 박테리아, 효모, 곤충 세포 등을 포함하는, 그러한 융합 단백질의 발현을 위한 많은 발현 시스템이 이용가능하다.
포유동물 세포에서 발현된 단백질은 번역 후 수식(post-translational modification) 프로세스에서 글리코실화된다. 본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질의 아미노산 서열은 글리코실화된 아미노산을 포함하며; 따라서 포유동물 세포가 이들 단백질을 발현하기에 가장 바람직하다. CHO 세포, SP20 세포, NS0 세포, COS 세포, BHK 세포, 및 PerC6 세포와 같이, 대규모의 단백질 발현에 적합한 다양한 포유동물 세포들이 있다. 이들 단백질의 발현 및 생성을 위해 많은 기타 세포들이 또한 사용될 수 있고, 그에따라 본 발명에서 고려된다. 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드는 트랜스펙션에 의해 세포로 들어갈 수 있다. 세포 트랜스펙션을 위한 많은 방법들로는, (이에 한정되는 것은 아니지만) 전기천공, 및 리포솜- 또는 칼슘-매개된 트랜스펙션 등을 포함한다.
포유동물 세포에 더하여, 박테리아, 효모 및 곤충 세포와 같은, 기타 발현 시스템들도 이들 융합 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있으며, 이들도 본 발명에서 또한 고려된다. 이들 발현 시스템의 단백질 수율은 포유동물 세포에서보다 더 높을 수 있지만, 이들 발현 시스템에서 제조된 단백질은 일반적으로 글리코실화가 부족하거나, 포유동물 세포의 것과는 상이한 당 컨주게이트(sugar conjugate)의 형태를 가진다.
단백질 발현 후, 효소 면역 측정법(ELISA) 또는 기타 방법들이 사용되어 세포 배양 상청액에서 융합 단백질의 농도를 결정할 수 있다. 이들 융합 단백질이 면역글로불린의 Fc 단편을 포함하기 때문에, 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피가 최초의 정제 단계로서 사용되어 이들 융합 단백질을 분리할 수 있다.
본 발명의 TACI-Fc 융합 단백질의 기본적인 기능은 BLyS 및 APRIL을 차단하는 것이고, 한편 BLyS 및 APRIL는 B-림프구 발육 및 T-림프구 성숙을 자극하기 위한 핵심 인자이다. 따라서, TACI-Fc 융합 단백질이 비정상적인 면역 기능과 관련된 질환 및 B-림프구의 비정상적인 증식에 의해 유발된 질환에 사용될 수 있다. 이러한 질환으로는 (이에 한정되는 것은 아니지만) 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 및 B 림프구 종양을 포함한다. TACI-Fc 융합 단백질은 정제된 재조합 단백질로서 신체에 주입될 수 있다. 대안적으로, 이 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열이 적절한 벡터 내로 삽입되어 유전자 요법 또는 세포 요법에 의해 환자의 몸에서 이 융합 단백질을 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 사용하기 위한 많은 접근들이 존재하며, 이는 단백질 그 자체의 사용 뿐만 아니라, 융합 단백질을 코딩하는 DNA의 사용도 포함한다.
본 발명은 또한 융합 단백질의 약학적 조성물에 관한 것이며, 이는 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함할 수 있다. 약학적 조성물은 임의의 형태의 약학적 제형(pharmaceutical formulation)일 수 있고, 바람직하게는 액체 형태 및 동결건조된 형태를 포함하는, 주사용 제형일 수 있다. 약학적 조성물은 종래의 약학적 방법론에 따라 제조될 수 있으며, 이는 약학적 기술에 기반한 바람직한 투여 형태(dosage form)를 제조하기 위하여 약학적으로 허용가능한 캐리어와, 활성 성분, 즉, 본 발명의 융합 단백질을 혼합하는 것을 포함한다.
도 1은 프로단백질 전환효소(PC) 인공 뉴런 네트워크에 의한 TACI 아미노산 서열의 분석을 도시한다. TACI 세포외 영역에서 9번째 및 135번째 아미노산 잔기가 PC 절단 지점들로 나타내어진다. 12번째 및 120번째 아미노산 잔기는 또한 PC 절단 지점들에 대하여 역치에 가까운 값을 갖는다.
도 2는 네이티브 전체-길이 TACI 단백질 및 4개의 TACI-Fc 융합 단백질의 구조를 도시한다.
도 3은 4개의 TACI-Fc 융합 단백질에 대해 CHO 세포로부터의 단백질 발현의 비교를 도시한다.
도 4는 BLyS에 대한 4개의 TACI-Fc 융합 단백질의 바인딩에 대한 분석을 도시한다. 결과는 모든 융합 단백질이 BLyS에 결합할 수 있는 것을 나타내며, 여기서 T3이 BLyS에 대한 가장 높은 친화도를 갖는다.
도 5는 정제된 T3 융합 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 고성능 CHO 발현 시스템에 발현된 T3 융합 단백질은 겔에서 단일 단백질 밴드로서 나타나고, 약 42 kD의 명확한 분자량을 가지며, 이는 글리코실화된 T3 융합 단백질의 분자량 기대치와 부합된다.
도 6은 콜라겐-유도 마우스 관절염 모델에서 T3 융합 단백질의 자가면역 질환에 대한 유의한 효과를 나타낸다. 마우스 관절염의 진행 t는 관절염 임상 점수에 의해 측정되었다. 결과는 TACI-Fc 융합 단백질 T3으로 처리된 마우스가 대조군에 비해 유의하게 낮은 임상 점수를 갖는 것을 나타낸다(P<0.01).
본 발명은 TACI-Fc 융합 단백질의 디자인, 구성 및 평가를 보다 상세하게 설명하기 위하여 하기 실시예들을 제공한다. 그러나, 본 발명의 내용 및 용도가 실시예들의 범주로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : TACI의 서열 분석
프로단백질 전환효소(PC)는 세포에서 폴리펩티드를 특이적으로 절단할 수 있다. 많은 단백질에 대해서, PC 절단은 단백질 번역 후 수식(post-translational modification) 도중에 중요한 단계이다. PC 패밀리는 특이적 아미노산 서열을 인식 및 절단하는 다수의 효소로 구성된다. PC 인공 뉴런 네트워크는 단백질 서열에 존재하는 PC 절단 지점들을 예측하기 위하여 알려진 PC 절단 지점들에 대한 데이터베이스를 활용하는 컴퓨터 소프트웨어 시스템이다. 이 시스템은 단백질에서 임의의 잠재적인(potential) PC 절단 지점들을 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명은 PC 인공 뉴런 네트워크를 사용하여 TACI 아미노산 서열을 분석하였고, 2개의 PC 절단 지점들(9번째 및 135번째 아미노산)이 TACI 세포외 영역에 존재하는 것을 발견하였다. 또한, 2개의 추가적인 지점들(12번째 및 120번째 아미노산)이 PC 절단 지점에 대한 역치에 가까운 점수를 갖는다(도 1). 따라서, 단백질 절단을 방지하도록, 이들 PC 절단 지점들을 제거하고, Fc에 대한 잠재적인 PC 절단 지점들이 없는 TACI 서열을 융합하는 것에 의해 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질을 디자인하는 것이 가능하다. 이들 발견에 기반하여, 본 발명자들은 몇개의(several) TACI-Fc 융합 단백질을 구성하였고, 여기서 상기 TACI 서열은 12번째 및 120번째 아미노산 사이의 네이티브 TACI 서열로부터 유도되었다(도 2). 이들 신규의 TACI-Fc 융합 단백질에 의해 공유되는 공통적인 특징은 : 1) TACI의 아미노 말단 영역의 주 서열(major sequence)이 포함된다는 것, 2) 시스테인-풍부 영역의 전체 서열이 포함된다는 것, 및 3) 줄기 영역의 부분적 서열이 포함된다는 것이다.
실시예 2. 융합 단백질 및 이를 코딩하는 플라스미드의 구성
Qiagen 토탈 RNA 정제 키트를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 전체 RNA를 분리 및 정제하였다. 역전사로 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 이어서 적절한 프라이머로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 원하는 TACI 단편을 얻었다. 클로닝된 IgG1 Fc 플라스미드로부터 PCR 증폭에 의해 면역글로불린 Fc 단편을 얻었다. 마지막으로, TACI 및 Fc 서열을 PCR에 의해 융합하고, 그 결과 TACI-Fc 융합 단백질의 DNA 서열을 성공적으로 구성하였다.
PCR 반응은 : 30사이클의 95℃에서 30초간 변성(denaturing); 56℃에서 45초간 어닐링(annealing); 및 72℃에서 2분간 확장(extending)을 포함한다. TA 클로닝 키트를 사용하여 TACI 및 Fc의 PCR 생성물을 pCR2.1 플라스미드 내로 각각 클로닝하였다. 플라스미드를 E. coli로 트랜스폼하였다. 화이트 E. coli 군체를 선택하고, LB 배지에서 밤새 키웠다. 이어서 Qiagen 플라스미드 키트를 사용하여 플라스미드를 분리하였다. 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱을 통해 TACI 및 Fc 서열을 확인하였다. 마지막으로, 중복 PCR 법을 사용하여 TACI 및 IgG Fc cDNA를 융합하였다. TACI-Fc 융합 단편을 포유동물 발현 플라스미드 내로 삽입하고, 재조합 플라스미드를 E. coli 내로 트랜스폼하고, 양성인 군체를 선택하고, 제한 효소 소화 및 DNA 시퀀싱 분석을 통해 타겟 서열을 확인하였다. 마지막으로, 결과로 얻어진 플라스미드를 사용해 CHO 세포를 트랜스펙트하여 융합 단백질을 발현하였다.
T1 단백질 : TACI의 아미노산 13-108 + Fc 서열식별번호 : 1 및 5
T2 단백질 : TACI의 아미노산 13-118 + Fc 서열식별번호 : 2 및 6
T3 단백질 : TACI의 아미노산 13-118 + 링커 서열 9Gly + Fc 서열식별번호 : 3 및 7
또한, 본 연구는 비교를 위해 융합 단백질 T4도 포함하였다. 다른 3개의 융합 단백질과 T4 단백질의 차이는 T4에서 TACI N-말단 영역의 부재이다. 사실, T4는 TACI 아미노산 잔기 30-110 및 Fc 서열(서열식별번호 4 및 8 참조) 간의 융합 단백질이다.
T1 융합 단백질에 대한 프라이머 서열:
포워드 프라이머: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
리버스 프라이머: GAGCTTGTTCTCACAGAAGTATG
T2 융합 단백질에 대한 프라이머 서열:
포워드 프라이머: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
리버스 프라이머: GAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTG
T3 융합 단백질에 대한 프라이머 서열:
포워드 프라이머: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
리버스 프라이머:
ACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCGAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTGGGCTCCT
T4 융합 단백질에 대한 프라이머 서열:
포워드 프라이머: GCTATGAGATCCTGCCCCGAAG
리버스 프라이머: TGAAGATTTGGGCTCGCTCC
실시예 3: 세포에서 TACI-Fc 융합 단백질의 발현
본 발명은 예를 들어 포유동물 세포에서 TACI-Fc 융합 단백질의 발현을 예시하고 있다. 4개의 융합 단백질 T1, T2, T3, 및 T4를 pcDNA3.1 플라스미드(Invitrogen)로 클로닝하였다. 각각의 융합 단백질의 5' 말단에 Flt-1 신호 펩티드 서열을 가하였다. 고순도 플라스미드 DNA 정제 키트(QIAGEN)를 사용하여 4개의 TACI-Fc 플라스미드를 정제하였다. 이어서 FUGEN6 트랜스펙션 키트(ROCHE)로 플라스미드 DNA를 각각 CHO 세포로 도입하였다. 과도(transient) 트랜스펙션 방법을 사용하여 4개의 TACI-Fc 융합 단백질의 발현 수준을 비교하였다. 10% 우태아혈청을 가지는 완전한 DMEM 배지에서 CHO 세포를 세포 배양 접시에서 배양하였다. 세포들이 일정한 농도에 도달했을 때, FUGEN 6 시약(Roche)과 플라스미드 DNA의 복합체를 배양물에 가하였다. 3일 동안 배양 후, 발현된 융합 단백질을 함유하는 상청액을 얻었다. 융합 단백질의 농도를 ELISA 법으로 결정하였다. 단백질 농도의결과는 도 3에 도시되며 : T3이 그 중에서도 특히 가장 높은 발현을 가졌고, 그 다 음이 T2였다. T4가 가장 낮은 발현 수준을 가졌다. 따라서, 단백질의 발현의 관점에서, 융합 단백질 T3이 최고의 분자 조성이다.
실시예 4: BLyS에 대한 융합 단백질의 결합 활성의 평가
각각의 융합 단백질의 발현 후, 본 발명자들은 BLyS 결합 분석으로 BLyS에 대한 그들의 결합 활성을 측정하였다. 이러한 분석에서, 96-웰 ELISA 플레이트상으로 재조합 BLyS 단백질(R&D 시스템)을 우선 코팅하였다. 비특이적(nonspecific) 단백질 결합 지점들은 2% BSA 차단 용액으로 차단되었다. 다양한 농도의 TACI 융합 단백질을 이어서 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 토끼 항-인간 Ig 항체-HRP 컨주게이트의 첨가 전에 세척하였다. 마지막으로, 컬러 현상을 위해 페록시다아제 기질을 사용하였다. ELISA 플레이트 리더를 사용하여 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대한 OD 값을 측정하였는데, 여기서 증가된 OD 값은 BLyS에 대한 융합 단백질의 결합을 나타낸다. 본 발명자들은 T3이 BlyS에 대한 가장 좋은 결합을 가지고, T1 및 T2가 중간 정도의 결합을 가지고, 또한 T4가 가장 낮은 결합을 가지는 것을 발견하였다(도 4). 따라서, 단백질 발현 및 BLyS에 대한 결합 활성 양자의 관점에서, 융합 단백질 T3이 가장 좋은 분자 조성이다.
실시예 5: 고발현 세포주의 수립
융합 단백질 T3이 가장 좋은 분자 조성이라는 것을 결정한 후, 본 발명자들 은 안정한 트랜스펙션 및 유전자 증폭을 사용하여 안정하고 고 발현의 CHO 세포 균주를 수립하였다. 융합 단백질 T3을 코딩하는 유전자를 DHFR 유전자를 함유하는 플라스미드 내로 클로닝하였다. QIAGEN 플라스미드 정제 키트를 사용하여 고순도 플라스미드 DNA를 정제하고, 전기천공을 사용하여 CHO 세포를 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙트된 세포를 선택 배지에서 배양하여 내성 클론을 얻었다. 메토트렉세이트(MTX)를 가하여 T3 유전자를 증폭하고, 고 발현 세포 클론을 얻었다. 마지막으로 선택된 클론의 CHO 세포를 배양으로 확장시키고, 바이오리액터에서 대규모로 융합 단백질을 제조하였다. 융합 단백질의 농도는 ELISA에 의해 측정하였다. 이러한 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 대규모의 융합 단백질 T3을 성공적으로 제조하였다. 융합 단백질의 수율은 하루에 세포당 20 pg 보다 더 높을 수 있다. 융합 단백질 T3은 단백질 A 또는 G 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
실시예 7: TACI-Fc 융합 단백질의 전기영동 동정(electrophoretic identification)
본 발명은 최적화된 융합 단백질의 발현 도중 융합 단백질의 어떠한 분해도 발생하지 않는다는 것을 실험적으로 입증하였다. 융합 단백질 T3의 고 발현을 위한 CHO 세포 균주를 세포 배양 플라스크에서 배양하였다. 세포가 고밀도에 도달한 후, 세포 배양 상청액을 얻고, 융합 단백질을 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 정제된 융합 단백질을 SDS-PAGE 로딩 버퍼와 혼합하고, 3분 동안 끓였다. 융합 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 겔을 메탄올로 탈염색(destained)한 후, 단백질 밴드를 시각화하였다. T3 단백질은 겔에서 단일 밴드로서 나타나고(도 5), 약 42 kD의 명확한 분자량을 가지며, 이는 글리코실화된 T3 융합 단백질의 분자량 기대치와 부합되는 것을 나타냈다. 42 kD 미만의 분자량에서는 어떠한 단백질 밴드도 관찰되지 않았다는 것이 중요하다. 이 결과는, 본 발명의 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질이 발현의 프로세스에서 단백질 절단 및 분해를 효과적으로 방지할 수 있고, 그에 따라, 대규모의 산업적인 제조에 사용될 수 있다는 것을 입증하였다.
실시예 8: 자가 면역 질환에서 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질의 치료 효과
최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 항-자가면역 생물학적 활성을 갖는다는 것이 콜라겐-유도 마우스 관절염 모델에서 입증되었다. 8주령의 DBA/1 마우스들을 각 그룹에 10마리씩 두 그룹으로 분리하였다. 프로인트 완전면역보강제와 혼합된 200 μg 의 소 콜라겐 타입 II를 마우스에 각각 피내로(intracutaneously) 주사하였다. 21일 후, 프로인트 불완전면역보강제와 혼합된 소 콜라겐 타입 II를 마우스에 각각 피내로 주사하였다. 24일 째부터 실험군의 마우스에 100 μg의 T3 융합 단백질을 각각 피하로 1주일에 3회 주사하였다. 대조군의 쥐에는 통상의 인간 IgG을 동일한 투여량으로 주사하였다. 관절염의 진행은 관절염의 임상 점수를 사용하여 측정하였다. T3-처리된 마우스에서 관절염의 심각성은 대조군의 마우스에 비해 유의하게 더 낮은 것으로 나타났고, 두 그룹 간의 임상 점수에는 유의한 차이(P<0.01)가 있었다(도 6).
요약하면, 본 발명의 최적화된 TACI-Fc 융합 단백질은 발현의 프로세스에서 단백질 분해를 방지하고, 더 강한 생물학적 활성을 가지며, 높은 단백질 발현 수준을 나타내고, 그에 따라 대규모의 산업적인 제조에서 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Yantai RongChang Biotechnologies, Ltd.
<120> Optimized TACI-Fc fusion protein and its applications
<160> 8
<210> 1
<211> 323
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg
1 5 10 15 20
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Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile
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Thr Cys Pro Leu Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 480
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agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 900
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Claims (10)
- 잘려진(truncated) TACI 및 면역글로불린 Fc를 포함하는 융합 단백질로서,상기 융합 단백질의 TACI 부위가, TACI로부터의, 13번째 아미노산 잔기로부터 시작하는 세포외 영역의 아미노 말단 영역의 서열, 시스테인-풍부 영역의 전체 서열, 및 줄기 영역의 부분적인 서열을 포함하고, 그리고 상기 TACI 부위가 12번째 및 120번째 아미노산 사이의 네이티브 TACI 서열로부터 유도되고;상기 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 부위가 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하고;상기 TACI 부위 및 상기 Fc 부위는 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 융합되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 TACI 부위가 TACI의 13번째 내지 108번째 아미노산 및 13번째 내지 118번째 아미노산으로 구성된 군에서 선택되고; 상기 링커 서열이 9Gly이고; 상기 면역글로불린 Fc 부위가, 각각의 모든 아이소타입을 포함하여, 인간 또는 동물 면역글로불린 IgG, IgM, IgD, 및 IgA의 Fc로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 부위가 IgG1으로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열이 서열식별번호 1 내지 3에 나타낸 서열들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 융합 단백질.
- 청구항 1에 기재된 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열.
- 청구항 5에 있어서, 서열식별번호 5 내지 7에 나타낸 서열인 것을 특징으로 하는 DNA 서열.
- 청구항 5에 기재된 DNA 서열을 포함하는 벡터.
- 청구항 7에 기재된 벡터를 포함하는 세포로서, 청구항 1에 기재된 상응하는 융합 단백질의 발현을 위해 사용되고, 진핵 세포 또는 원핵 세포로부터 선택된 것인, 세포.
- BLyS 또는 APRIL의 차단에 의해, 자가면역 질환(autoimmune diseases) 또는 림프구 종양(lymphocyte tumors)을 치료하기 위한, 청구항 1에 기재된 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
- 자가면역 질환(autoimmune diseases) 또는 림프구 종양(lymphocyte tumors)의 치료를 위한, 청구항 1에 기재된 융합 단백질을 포함하는 약학적 조성물.
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