RU2433141C2 - Оптимизированный слитый белок taci-fc - Google Patents
Оптимизированный слитый белок taci-fc Download PDFInfo
- Publication number
- RU2433141C2 RU2433141C2 RU2009148020/10A RU2009148020A RU2433141C2 RU 2433141 C2 RU2433141 C2 RU 2433141C2 RU 2009148020/10 A RU2009148020/10 A RU 2009148020/10A RU 2009148020 A RU2009148020 A RU 2009148020A RU 2433141 C2 RU2433141 C2 RU 2433141C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- taci
- fusion protein
- sequence
- region
- fused protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 44
- 102000016605 B-Cell Activating Factor Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108010028006 B-Cell Activating Factor Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 107
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 106
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 17
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 10
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000795167 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Proteins 0.000 claims 7
- 102100029675 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B Human genes 0.000 claims 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 33
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 abstract description 3
- 230000036737 immune function Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000006437 Proprotein Convertases Human genes 0.000 description 23
- 108010044159 Proprotein Convertases Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 17
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102100029690 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Human genes 0.000 description 3
- 101710178300 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 13C Proteins 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 102100025594 Guided entry of tail-anchored proteins factor CAMLG Human genes 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000932902 Homo sapiens Guided entry of tail-anchored proteins factor CAMLG Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710132774 Protein T1 Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710194518 T4 protein Proteins 0.000 description 1
- 102100036922 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13B Human genes 0.000 description 1
- 101710174842 Tumor necrosis factor soluble receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к оптимизированному слитому белку для блокирования BLyS или APRIL, который содержит внеклеточную область N-концевого усеченного TACI (трансмембранного активатора и CAML-партнера) и Fc последовательность IgG. Участок TACI слитого белка содержит последовательность аминоконцевой области внеклеточной области, начиная от 13-го аминокислотного остатка, полную последовательность цистеинобогащенной области и частичную последовательность стеблевой области из TACI и получен из нативной последовательности TACI между 12-й и 120-й аминокислотами. Участок Fc иммуноглобулина IgG слитого белка содержит шарнирную область, область СН2 и область СНЗ. Участок TACI и участок Fc слиты либо непосредственно, либо через линкерную последовательность. Кроме того, предлагаются последовательность ДНК, кодирующая слитый белок, вектор экспрессии, клетка-хозяин, фармацевтическая композиция, содержащая слитый белок, и применение слитого белка для блокирования BLyS или APRIL. Полученный слитый белок не деградирует в процессе экспрессии, обладает высокой биологической активностью и высоким уровнем экспрессии. Слитый белок по настоящему изобретению может использоваться при лечении заболеваний, связанных с аномальными иммунологическими функциями и при лечении заболеваний, вызываемых аномальной пролиферацией В-лимфоцитов. 6 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к получению оптимизированного слитого белка, в частности слитого белка TACI-Fc, посредством использования технологии генетической рекомбинации, и к его применению для лечения иммунологических заболеваний.
Уровень техники
Процесс развития и дифференциации лимфоцитов жестко контролируется различными цитокинами. Стимуляторы B-лимфоцитов (BLyS или так называемые BAFF, TNSF13B, THANK, TALL-1, zTNF4) и лиганд, индуцирующий пролиферацию (APRIL), представляют собой цитокины, которые играют важную роль при регуляции иммунной реакции in vivo (Schneider, 2005, Current Opinion in Immunology, 17:282-289; Seyler et al., 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115:3083-3092). Они стимулируют развитие и пролиферацию B-лимфоцитов c увеличением экспрессии различных иммуноглобулинов в крови. BLyS и APRIL также имеют главные регуляторные воздействия на созревание T-лимфоцитов и, таким образом, на клеточный иммунитет (Wang et al., 2001, Nature Immunology, 2:632-637).
BLyS и APRIL регулируют иммунную реакцию лимфоцитов через рецепторы на клеточной поверхности лимфоцитов. Они связываются с рецепторами клеточных мембран TACI (трансмембранный активатор и CAML-партнер) и BCMA (антиген созревания В-лимфоцитов). В дополнение к этому, BLyS может также связываться с другим рецептором, BAFF-R. B-лимфоцит экспрессирует TACI, BCMA и BAFF-R. Зрелый T-лимфоцит экспрессирует TACT. BLyS и APRIL регулируют активацию, пролиферацию и развитие лимфоцитов через трансдукцию сигналов, опосредуемую этими рецепторами, и таким образом усиливают иммунную реакцию. В дополнение к этому, в опухолях, полученных из лимфоцитов, BLyS и APRIL также облегчают пролиферацию клеток опухоли и подавляют апоптоз, тем самым ускоряя развитие опухоли.
Избыточная экспрессия BLyS и APRIL представляет собой один из факторов патогенеза при многих аутоиммунных заболеваний, которые включают, без ограничения, системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит (RA), синдром Шегрена и тому подобное. В клинических исследованиях показано, что концентрация BLyS часто положительно коррелирует с тяжестью аутоиммунных заболеваний. По этой причине ингибирование BLyS и APRIL становится потенциально эффективным средством для лечения связанных с ними аутоиммунных заболеваний. В то же время, поскольку BLyS и APRIL могут ускорять развитие опухолей B-лимфоцитов, ингибирование BLyS и APRIL может также использоваться для лечения опухолей B-лимфоцитов, таких как хроническая лимфоцитная лейкемия, множественная миелома, лимфома B-лимфоцитов и тому подобное.
Поскольку TACI имеет высокое сродство как к BLyS, так и к APRIL, является возможным использование растворимого TACI (внеклеточного участка TACI) для предотвращения взаимодействия BLyS или APRIL с их мембранными рецепторами (TACI, BCMA, BAFF-R), тем самым блокируя биологическую активность BLyS или APRIL и излечивая аутоиммунные заболевания или опухоли.
В исследованиях показано, что слитый белок из внеклеточного участка TACI и фрагмента Fc IgG (TACI-Fc) может эффективно ингибировать развитие заболевания, вызванного BLyS (Gross et al., 2001, Immunity, 15:289-302). Однако в исследованиях также показано, что слитый белок TACI-Fc, сконструированный посредством использования внеклеточного участка нативного TACI, может легко деградироваться, когда он экспрессируется в клетках, и получаемые при этом продукты часто являются гетерогенными. По этой причине TACI-Fc слитый белок из нативного TACI с фрагментом Fc не является пригодным для промышленного получения. Настоящее изобретение имеет целью усовершенствование слитого белка TACI-Fc посредством технологии генной инженерии для того, чтобы разработать фармацевтическую композицию, применимую для промышленного получения.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способам конструирования и получения белкового лекарственного средства, которое блокирует BLyS и APRIL, к способу его получения и к его использованию для лечения заболеваний.
В настоящем изобретении предложены несколько слитых белков, которые получают посредством слияния фрагмента TACI с фрагментом Fc иммуноглобулина и которые могут блокировать пролиферацию B-лимфоцитов, структура слитого белка отличается тем, что:
участок TACI слитого белка содержит частичную последовательность аминоконцевой области внеклеточной области, полную последовательность цистеинобогащенной области и частичную последовательность стеблевой области от TACI; в то время как иммуноглобулин Fc в слитом белке содержит шарнирную область, область CH2 и область CH3; последовательность TACI и последовательность Fc сливают непосредственно или через линкерную последовательность;
где фрагмент TACI может быть выбран из группы, состоящей из положений от 13 до 108 или от 13 до 118 в последовательности аминокислот TACI, и указанная линкерная последовательность может представлять собой 9Gly, и
фрагмент Fc иммуноглобулина может быть получен из Fc иммуноглобулина человека или животного и может представлять собой полноразмерный Fc или его частичную последовательность; и в дополнение к этому Fc может быть получен из IgG, IgM, IgD и IgA, каждый из которых включает все изотипы, соответственно, такие как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а предпочтительно IgG1; и
где указанный фрагмент TACI может быть выбран из группы, состоящей из последовательности TACI человека и животных.
В частности, предпочтительный слитый белок по настоящему изобретению может представлять собой:
a. слитый белок T1: который получают посредством слияния 13-й - 108-й аминокислот TACI и Fc иммуноглобулина IgG1 (SEQ ID NO:1),
b. слитый белок T2: который получают посредством слияния 13-й - 118-й аминокислот TACI и Fc иммуноглобулина IgG1 (SEQ ID NO:2), и
c. слитый белок T3: который получают посредством слияния 13-й - 118-й аминокислот TACI, линкерной последовательности 9Gly и Fc иммуноглобулина IgG1 (SEQ ID NO:3); и
где TACI выбирают из группы, состоящей из последовательности внеклеточных областей для TACI (трансмембранного активатора и CAML-партнера) человека и животных.
Настоящее изобретение также относится к последовательности ДНК, которая кодирует белок по настоящему изобретению.
Указанная последовательность ДНК представлена в SEQ ID NO:5-7.
Слитый белок TACI-Fc с нативной последовательностью TACI не является применимым для промышленного получения из-за легкой деградации белка. PCT/US2002/015910 описывает, что слияние фрагмента TACI, в котором осуществляют делецию полной аминоконцевой области и частичной последовательности стеблевой области, с фрагментом Fc может предотвращать белковую деградацию слитого белка. Однако сообщается, что удаление аминоконцевой области значительно понижает биологическую активность TACI (Wu et al., 2000, The Journal of Biological Chemistry, 275:35478-35485).
Ключ к настоящему изобретению лежит в том, что искусственные нейронные сети системы компьютерного программного обеспечения для пропротеин конвертазы (PC) используют для анализа последовательности аминокислот внеклеточной области TACI. Результат анализа показывает, что последовательность внеклеточной области TACI содержит два сайта расщепления PC (9-я и 135-я аминокислоты) и два дополнительных сайта (12-я и 120-я аминокислоты), имеющих показатель, близкий к пороговому значению для сайта расщепления PC. Предполагается, что эти сайты расщепления PC по существу могут быть ответственными за деградацию TACI в процессе экспрессии. На основании этого открытия авторы удалили указанные сайты расщепления PC при оптимизации молекулы TACI и слили фрагменты TACI без сайтов расщепления PC с Fc. Эксперимент авторов изобретения показал, что новый слитый белок эффективно предотвращает деградацию TACI во время экспрессии. Усеченная последовательность TACI, а также другие способы могут использоваться для удаления этих сайтов расщепления PC. Например, сайт-направленный мутагенез ДНК может использоваться для удаления этих сайтов расщепления РС. Таким образом, могут быть выбраны различные способы оптимизации для достижения одной и той же цели. Оптимизированный слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению сохраняет большую часть остатков в аминоконцевой области и длинную последовательность аминокислот в стеблевой области молекулы TACI. Оптимизированный слитый белок TACI-Fc преодолевает проблему деградации белка. По сравнению со слиянием TACI-Fc, при котором удаляют всю N-концевую область, оптимизированные слитые белки TACI-Fc по настоящему изобретению показывают более высокую биологическую активность и уровень экспрессии белка.
Конструирование слитых белков по настоящему изобретению основывается на обычной молекулярной технологии клонирования, и конкретные экспериментальные протоколы могут быть найдены в различных лабораторных руководствах, таких как 2-я и 3-я версии Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Способ синтеза PCR используют для клонирования ДНК, кодирующей упомянутый выше слитый белок, в вектор. Вектор для экспрессирования слитого белка может представлять собой плазмиду, используемую обычно в молекулярной биологии. Сигнальная пептидная последовательность включается в переднюю часть аминоконца слитого белка, чтобы обеспечить секрецию белка из клетки. Векторная последовательность содержит промотор для запуска экспрессии гена, старт- и стоп-сигналы для трансляции белка, а также последовательность полиаденилирования (polyA). Вектор может содержать ген устойчивости к антибиотикам для облегчения репликации плазмиды в бактериях. В дополнение к этому вектор может также содержать ген селекции эукариотических клеток для селекции штаммов стабильно трансфицированных клеток.
После конструирования плазмиды последовательность ДНК слитого белка подтверждается секвенированием. Затем соответствующий белок может экспрессироваться посредством трансфекции ДНК плазмиды в клетки. Множество систем экспрессии являются доступными для экспрессии таких слитых белков, они включают, без ограничения, клетки млекопитающих, бактерии, дрожжи, клетки насекомых и тому подобное.
Белки, экспрессируемые в клетках млекопитающих, гликозилируются в процессе пост-трансляционной модификации. Последовательности аминокислот слитых белков TACI-Fc по настоящему изобретению содержат гликозилированные аминокислоты; так что клетки млекопитающих являются наиболее предпочтительными для экспрессии этих белков. Имеются различные клетки млекопитающих, пригодные для крупномасштабной экспрессии белков, такие как клетки CHO, клетки SP20, клетки NS0, клетки COS, клетки BHK и клетки PerC6. Множество других клеток также может использоваться для экспрессии и продуцирования этих белков, и, таким образом, они рассматриваются в настоящем изобретении. Плазмида, кодирующая полипептиды, может проникать в клетки посредством трансфекции. Существует множество способов трансфицирования клеток, и они включают (без ограничения) электропорацию и трансфекцию, опосредуемую липосомами или кальцием, и тому подобное.
В дополнение к клеткам млекопитающих другие системы экспрессии также могут использоваться для экспрессии этих слитых белков, такие как бактерии, дрожжи и клетки насекомых, которые также рассматриваются в настоящем изобретении. Выход белка в этих системах экспрессии может быть более высоким, чем в клетках млекопитающих, но белок, продуцируемый в этих системах экспрессии, как правило, не имеет гликозилирования или имеет форму конъюгата с сахаром, которая отличается от клеток млекопитающих.
После экспрессии белка твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или другие способы могут использоваться для определения концентрации слитых белков в супернатантах культур клеток. Поскольку эти слитые белки содержат фрагмент Fc иммуноглобулина, афинная хроматография на белке A или G может использоваться как начальная стадия очистки для выделения этих слитых белков.
Фундаментальная функция слитого белка TACI-Fc по настоящему изобретению заключается в блокировании BLyS и APRIL, в то время как BLyS и APRIL являются ключевыми факторами для стимулирания развития B-лимфоцитов и созревания T-лимфоцитов. Соответственно, слитый белок TACI-Fc может использоваться при заболеваниях, связанных с аномальными иммуннологическими функциями и при заболеваниях, вызываемых аномальной пролиферацией B-лимфоцитов. Эти заболевания включают (без ограничения) ревматоидный артрит, системную красную волчанку и опухоль из B-лимфоцитов. Слитый белок TACI-Fc может вводиться в виде инъекции в организм человека как очищенный рекомбинантный белок. Альтернативно, последовательность ДНК, кодирующая слитый белок, может вставляться в соответствующий вектор для экспрессии слитого белка в организм человека посредством генной терапии или клеточной терапии. По этой причине имеется множество подходов к использованию слитого белка по настоящему изобретению, которые включают использование не только самого белка, но также и ДНК, которая кодирует слитый белок.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции слитого белка, которая может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция может представлять собой любую форму фармацевтического препарата, предпочтительно препарата для инъекции, включая жидкую форму и лиофилизированную форму. Фармацевтическая композиция может быть получена в соответствии с обычными фармацевтическими технологиями, которые включают смешивание активного ингредиента, то есть слитого белка по настоящему изобретению, с фармацевтически приемлемым носителем для приготовления желаемой лекарственной формы на основе фармацевтической технологии.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 показывает анализ последовательности аминокислот TACI с помощью искусственных нейронных сетей для пропротеин конвертазы (PC). Остатки 9-й и 135-й аминокислот во внеклеточной области TACI показаны как сайты расщепления РС. Остатки 12-й и 120-й аминокислот также имеют значение, близкое к порогу для сайта расщепления PC.
Фиг.2 показывает структуры нативного полноразмерного белка TACI и четырех слитых белков TACI-Fc.
Фиг.3 показывает сравнение экспрессии белка из клеток CHO для четырех слитых белков TACI-Fc.
Фиг.4 показывает анализ связывания четырех слитых белков TACI-Fc с BLyS. Результаты показывают, что весь слитый белок может связываться с BLyS, при этом T3 имеет самое высокое сродство к BLyS.
Фиг.5 показывает анализ SDS-PAGE очищенного слитого белка T3. Слитый белок T3, экспрессируемый в высокопроизводительной системе экспрессии CHO, выглядит как одна зона белка в геле, и имеет видимую молекулярную массу примерно 42 кДа, которая согласуется с ожидаемой молекулярной массой гликозилированного слитого белка T3.
Фиг.6 показывает значительное воздействие на аутоиммунные заболевания для слитого белка T3 на модели индуцированного коллагеном артрита у мышей. Развитие артрита у мышей измеряют с помощью клинической балльной оценки артрита. Результаты показывают, что мыши, обработанные слитым белком TACI-Fc T3, имеют значительно более низкие клинические балльные оценки, чем у контрольной группы (P<0,01).
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении представляются следующие примеры для подробного иллюстрирования строения, конструирования и оценки слитых белков TACI-Fc. Однако содержание и использование настоящего изобретения не ограничивается рамками примеров.
Пример 1: Анализ последовательности TACI
Пропротеин конвертаза (PC) может специфично расщеплять полипептиды в клетках. Для многих белков расщепление PC является важной стадией во время пост-трансляционной модификации белка. Семейство PC состоит из ряда ферментов, которые распознают и расщепляют конкретные последовательности аминокислот. Искусственные нейронные сети для PC представляют собой систему компьютерного программного обеспечения, которая использует базу данных для известных сайтов расщепления РС, для предсказания сайтов расщепления РС, имеющихся в последовательности белка. Система может использоваться для анализа любых потенциальных сайтов расщепления РС в белке. Настоящее изобретение анализирует последовательность аминокислот TACI посредством использования искусственной нейронной сети для PC, и обнаружено, что имеется два сайта расщепления РС (9-я и 135-я аминокислоты) во внеклеточной области TACI. В дополнение к этому два дополнительных сайта (12-я и 120-я аминокислоты) имеют балльные оценки, близкие к пороговым значениям, для сайтов расщепления PC (фиг.1). По этой причине является возможным конструирование оптимизированного слитого белка TACI-Fc посредством удаления этих сайтов расщепления РС и слияния последовательности TACI без потенциальных сайтов расщепления РС с Fc, чтобы предотвратить расщепление белка. На основе этих сведений авторы сконструировали несколько слитых белков TACI-Fc, где последовательности TACI получают из нативной последовательности TACI между 12-й и 120-й аминокислотами (фиг.2). Общие характеристики, присущие этим новым слитым белкам TACI-Fc, заключаются в том, что в них: 1) содержится главная последовательность аминоконцевой области TACI, 2) содержится полная последовательность цистеинобогащенной области и 3) содержится частичная последовательность стеблевой области.
Пример 2. Конструирование слитых белков и плазмиды, кодирующей их
Общую РНК выделяют и очищают от мононуклеарных клеток периферической крови человека посредством использования набора для очистки общей РНК Qiagen. кДНК синтезируют из общей РНК с помощью обратной транскриптазы. Затем желаемые фрагменты TACI получают путем амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) с соответствующими праймерами. Фрагмент иммуноглобулина Fc получают с помощью PCR амплификации из клонированной плазмиды IgG1 Fc. Наконец, последовательности TACI и Fc сливают с помощью PCR, и затем успешно конструируют последовательности ДНК слитых белков TACI-Fc.
Реакции PCR включают: 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд; отжиг при 56°C в течение 45 секунд и удлинения при 72°C в течение 2 минут. Продукты PCR TACI и Fc клонируют, соответственно, в плазмиду pCR2.1 посредством использования набора для клонирования TA. Плазмиды трансформируют в E.coli. Белые колонии E.coli повергают селекции и выращивают в среде LB в течение ночи. Затем плазмиды выделяют посредством использования набора для плазмид Qiagen. Последовательности TACI и Fc подтверждают посредством расщепления ферментом рестрикции и секвенирования ДНК. Наконец, TACI и IgG Fc кДНК сливают посредством использования способа PCR с перекрыванием. Фрагменты слияния TACI-Fc вставляют в плазмиду экспрессии млекопитающих, рекомбинантные плазмиды трансформируют в E. coli, производят положительную селекцию колоний и целевые последовательности подтверждают с помощью дигерирования ферментами рестрикции и анализов секвенирования ДНК. Наконец, полученные плазмиды используют для трансфицирования клеток CHO для экспрессии слитых белков.
| Белок T1 | аминокислоты 13-108 TACI+Fc | SEQ ID NO:1 и 5 |
| Белок T2 | аминокислоты 13-118 TACI+Fc | SEQ ID NO:2 и 6 |
| Белок T3 | аминокислоты 13-118 TACI+линкерная последовательность 9Gly+Fc | SEQ ID NO:3 и 7 |
В дополнение к этому это исследование также включает слитый белок T4 для сравнения.
Отличием белка T4 от других трех слитых белков является отсутствие N-концевой области TACI в T4. На самом деле T4 представляет собой белок, слитый между аминокислотными остатками 30-110 TACI и последовательностью Fc (Смотрите SEQ ID NO:4 и 8).
Праймер последовательности для слитого белка T1:
Прямой праймер: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
Обратный праймер: GAGCTTGTTCTCACAGAAGTATG
Праймер последовательности для слитого белка T2:
Прямой праймер: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
Обратный праймер: GAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTG
Праймер последовательности для слитого белка T3:
Прямой праймер: AGCCGTGTGGACCAGGAGGAG
Обратный праймер:
ACCTCCACCTCCACCTCCACCTCCACCGAGCTCTGGTGGAAGGTTCACTGGGCTCCT
Праймер последовательности для слитого белка T4:
Прямой праймер: GCTATGAGATCCTGCCCCGAAG
Обратный праймер: TGAAGATTTGGGCTCGCTCC
Пример 3: Экспрессия слитых белков TACI-Fc в клетках
Настоящее изобретение иллюстрирует экспрессию слитых белков TACI-Fc, например, в клетках млекопитающих. Четыре слитых белка T1, T2, T3 и T4 клонируют в плазмиду pcDNA3.1 (Invitrogen). Сигнальную последовательность пептидов Flt-1 добавляют на 5'-конце каждого слитого белка. Четыре плазмиды TACI-Fc очищают с использованием набора для очистки плазмид ДНК высокой чистоты (QIAGEN). Затем плазмиду ДНК вводят в клетки CHO, соответственно, с помощью набора для трансфицирования FUGEN6 (ROCHE). Транзиентный способ трансфицирования используют для сравнения уровней экспрессии четырех слитых белков TACI-Fc. Клетки CHO культивируют в чашках для клеточных культур в полной среде DMEM с 10% фетальной сывороткой теленка. Когда клетки достигают определенной плотности, к культуре добавляют комплекс плазмиды ДНК с реагентом FUGEN 6 (Roche). После культивирования в течение трех дней супернатанты собирают, и они содержат экспрессируемые слитые белки. Концентрации слитых белков определяют с помощью способа ELISA. Результаты для концентрации белков показаны на фиг.3: T3 имеет самую высокую экспрессию, среди прочих, за ним следует T2. T4 имеет самый низкий уровень экспрессии. Таким образом, с точки зрения экспрессии белка, слитый белок T3 является самой лучшей молекулярной композицией.
Пример 4: Оценка активности связывания слитого белка с BLyS
После экспрессии каждого слитого белка авторы определяют активность его связывания с BLyS в анализе связывания с BLyS. В этом анализе рекомбинантный белок BLyS (R&D Systems) сначала наносят как покрытие на 96-луночные планшеты ELISA. Сайты неспецифичного связывания белка блокируют с помощью блокирующего раствора 2% BSA. Затем слитые белки TACI при различных концентрациях добавляют в соответствующие лунки. Планшеты инкубируют в течение двух часов при 37°C, а затем промывают перед добавлением конъюгата антитела кролика против Ig человека - HRP. Наконец, пероксидазный субстрат используют для проявления цвета. Устройство для считывания планшетов ELISA используют для измерения значения OD (оптической плотности) для каждой лунки 96-луночного планшета, при этом увеличение значения OD указывает на связывание слитого белка с BLyS. Авторы обнаружили, что T3 имеет самое лучшее связывание с BlyS, T1 и T2 имеют умеренное связывание и T4 имеет самое низкое связывание (фиг.4). Таким образом, с точки зрения как экспрессии белка, так и активности связывания с BLyS, слитый белок T3 является самой лучшей молекулярной композицией.
Пример 5: Установление линий клеток с высокой экспрессией
После определения того, что слитый белок T3 представляет собой самую лучшую молекулярную композицию, авторы установили стабильный и имеющий высокую экспрессию штамм клеток CHO посредством использования стабильного трансфицирования и амплификации генов. Ген, кодирующий слитый белок T3, клонируют в плазмиду, содержащую ген DHFR. ДНК плазмиды с высокой чистотой очищают посредством использования набора для очистки плазмид QIAGEN, и клетки CHO трансфицируют плазмидой с использованием электропорации. Трансфицированные клетки культивируют в среде селекции с получением резистентных клонов. Метотрексат (MTX) добавляют для амплификации гена T3 и получения клонов клеток с высокой экспрессий. Наконец клетки CHO полученного селекцией клона размножают в культуре, и слитый белок продуцируется в крупном масштабе в биореакторе. Концентрацию слитого белка определяют с помощью ELISA. При использовании этого подхода авторы успешно производят слитый белок T3 в крупном масштабе. Выход слитого белка может быть выше, чем 20 пг на клетку в день. Слитый белок T3 может очищаться посредством использования афинной хроматографии на белке A или G.
Пример 7: Электрофоретическая идентификация слитого белка TACI-Fc
В настоящем изобретении экспериментально показано, что не происходит деградации слитого белка во время экспрессии оптимизированного слитого белка. Штамм клеток CHO для высокой экспрессии слитого белка T3 культивируют в колбе для культур клеток. После того как клетки достигают высокой плотности, супернатант культуры клеток собирают и слитый белок очищают посредством использования афинной хроматографии на белке. Очищенный слитый белок смешивают с нагрузочным буфером для SDS-PAGE и кипятят в течение 3 минут. Слитый белок разделяют в полиакриламидном геле и окрашивают с помощью Кумасси ярко-синего. Зоны белка визуализируются после удаления красителя из геля с помощью метанола. Показано, что белок T3 виден как одна зона в геле (фиг.5), с видимой молекулярной массой примерно 42 кДа, которая согласуется с ожидаемой молекулярной массой гликозилированого слитого белка T3. Важно, что не наблюдается зоны белка при молекулярной массе меньше чем 42 кДа. Этот результат показывает, что оптимизированный слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению может эффективно предотвращать расщепление и деградацию белка в процессе экспрессии, и, таким образом, может использоваться для крупномасштабного промышленного получения.
Пример 8: Терапевтические воздействия оптимизированного слитого белка TACI-Fc на аутоиммунное заболевание
Продемонстрировано на модели индуцированного коллагеном артрита у мышей, что оптимизированный слитый белок TACI-Fc имеет антиаутоиммунную биологическую активность. Мышей DBA/1 в возрасте 8 недель делят на две группы по 10 животных в каждой группе. Каждой мыши делают чрескожную инъекцию 200 мкг бычьего коллагена типа II, смешанного с полным адъювантом Фройнда. Через 21 день каждой мыши делают чрескожную инъекцию белка бычьего коллагена, типа II, смешанного с неполным адъювантом Фройнда. Со дня 24 каждой мыши в исследуемой группе делают подкожную инъекцию 100 мкг слитого белка T3 по три раза в неделю. Мышам в контрольной группе делают инъекцию нормального IgG человека при такой же дозе. Развитие артрита измеряют с использованием клинических балльных оценок артрита. Они показывают, что тяжесть артрита у мышей, обработанных T3, значительно меньше, чем у контрольных мышей, и имеется значимая разница (P<0,01) в клинических балльных оценках между двумя группами (фиг.6).
В итоге оптимизированные слитые белки TACI-Fc по настоящему изобретению предотвращают деградацию белка в процессе экспрессии, имеют более высокую биологическую активность и показывают высокие уровни экспрессии белка, таким образом, они могут использоваться в крупномасштабном промышленном производстве.
Claims (10)
1. Слитый белок для блокирования BLyS или APRIL, состоящий из усеченного TACI и Fc иммуноглобулина IgG, отличающийся тем, что участок TACI слитого белка содержит последовательность аминоконцевой области внеклеточной области, начиная от 13-ого аминокислотного остатка, полную последовательность цистеинобогащенной области и частичную последовательность стеблевой области из TACI и получен из нативной последовательности TACI между 12-й и 120-й аминокислотами; участок Fc иммуноглобулина IgG слитого белка содержит шарнирную область, область СН2 и область СНЗ; и участок TACI и участок Fc слиты либо непосредственно, либо через линкерную последовательность.
2. Слитый белок по п.1, отличающийся тем, что участок TACI выбирают из группы, состоящей из 13-й - 108-й аминокислот и 13-й - 118-й аминокислот TACI; линкерная последовательность представляет собой 9Gly.
3. Слитый белок по п.1, отличающийся тем, что участок Fc иммуноглобулина получен из IgGl.
4. Слитый белок по п.1, отличающийся тем, что последовательность аминокислот слитого белка выбрана из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-3.
5. Последовательность ДНК, кодирующая слитый белок по п.1, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность слитого белка выбрана из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1-3.
6. Последовательность ДНК по п.5, отличающаяся тем, что она представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5-7.
7. Вектор для экспрессии слитого белка по п.1, содержащий последовательность ДНК по п.5.
8. Клетка, содержащая вектор по п.7, которую используют для экспрессии соответствующего слитого белка по п.1 и которая выбрана из эукариотической клетки или прокариотической клетки.
9. Применение слитого белка по п.1 при получении лекарственного средства для блокирования BLyS или APRIL.
10. Фармацевтическая композиция для блокирования BLyS или APRIL, содержащая слитый белок по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007101111622A CN101323643B (zh) | 2007-06-15 | 2007-06-15 | 优化的TACI-Fc融合蛋白 |
| CN200710111162.2 | 2007-06-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2009148020A RU2009148020A (ru) | 2011-07-10 |
| RU2433141C2 true RU2433141C2 (ru) | 2011-11-10 |
Family
ID=40155884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009148020/10A RU2433141C2 (ru) | 2007-06-15 | 2008-06-16 | Оптимизированный слитый белок taci-fc |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8193316B2 (ru) |
| EP (1) | EP2161287B1 (ru) |
| JP (1) | JP5372917B2 (ru) |
| KR (1) | KR101204229B1 (ru) |
| CN (1) | CN101323643B (ru) |
| BR (1) | BRPI0811333B8 (ru) |
| RU (1) | RU2433141C2 (ru) |
| WO (1) | WO2008154814A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2779387C1 (ru) * | 2019-12-10 | 2022-09-06 | Ремеджен Ко., Лтд. | Фармацевтический состав слитого белка taci-fc |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
| AU2012204846B2 (en) * | 2011-01-06 | 2016-09-08 | Complix Nv | Alphabodies specifically binding to cytokines or growth factors and/or cytokine or growth factor receptors |
| CN102085367B (zh) * | 2011-01-19 | 2012-08-22 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗类风湿性关节炎药物的应用 |
| CN102085368B (zh) * | 2011-01-19 | 2013-06-12 | 烟台荣昌生物工程有限公司 | 优化的TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用 |
| CN103833856B (zh) * | 2012-11-22 | 2017-05-03 | 上海康岱生物医药技术股份有限公司 | 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途 |
| CN103936833B (zh) * | 2014-04-18 | 2016-02-10 | 天津大学 | BLyS拮抗肽、含TC-Fc融合蛋白基因的质粒及TC-Fc融合蛋白 |
| AU2018289493A1 (en) | 2017-06-20 | 2019-12-12 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods for modulating regulatory T cells, regulatory B cells, and immune responses using modulators of the APRIL-TACI interaction |
| CN110522908A (zh) * | 2018-05-25 | 2019-12-03 | 荣昌生物制药（烟台）有限公司 | TACI-Fc融合蛋白用于制备治疗视神经脊髓炎谱系疾病和多发性硬化之药物中的应用 |
| EP4074337A4 (en) * | 2019-12-10 | 2023-12-13 | RemeGen Co., Ltd. | PHARMACEUTICAL TACI-FC FUSION PROTEIN FORMULATION |
| WO2021128027A1 (zh) | 2019-12-24 | 2021-07-01 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | TACI-Fc融合蛋白及其用途 |
| AU2021268033A1 (en) | 2020-05-08 | 2022-12-15 | Alpine Immune Sciences, Inc. | APRIL and BAFF inhibitory immunomodulatory proteins with and without a T cell inhibitory protein and methods of use thereof |
| CN115073607A (zh) * | 2021-03-12 | 2022-09-20 | 上海康岱生物医药技术股份有限公司 | Tnfr2与baff受体的融合蛋白 |
| WO2022206872A1 (zh) * | 2021-03-31 | 2022-10-06 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 截短的taci多肽及其融合蛋白和用途 |
| WO2022236335A1 (en) | 2021-05-07 | 2022-11-10 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Methods of dosing and treatment with a taci-fc fusion immunomodulatory protein |
| CN117529506A (zh) * | 2021-06-11 | 2024-02-06 | 海南先声药业有限公司 | 抗人il-17抗体和taci的双功能融合蛋白分子 |
| BR112023018745A2 (pt) | 2021-08-10 | 2024-03-12 | Remegen Co Ltd | Método para tratar nefropatia por iga com proteína de fusão de taci-fc |
| CN117203242A (zh) | 2021-09-30 | 2023-12-08 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗干燥综合征的方法 |
| CN117916273A (zh) * | 2021-09-30 | 2024-04-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗il23抗体融合蛋白及用途 |
| WO2023083298A1 (zh) * | 2021-11-11 | 2023-05-19 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 抗icosl抗体融合蛋白及用途 |
| WO2023236967A1 (zh) * | 2022-06-08 | 2023-12-14 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗重症肌无力的方法 |
| WO2024046301A1 (zh) * | 2022-08-29 | 2024-03-07 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 包含taci多肽的融合蛋白及其用途 |
| WO2024067756A1 (zh) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗膜性肾病的方法 |
| WO2024077018A2 (en) | 2022-10-04 | 2024-04-11 | Alpine Immune Sciences, Inc. | Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein |
| WO2024114777A1 (zh) * | 2022-12-02 | 2024-06-06 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | 用TACI-Fc融合蛋白治疗微小病变型肾病的方法 |
| WO2024120458A1 (zh) * | 2022-12-07 | 2024-06-13 | 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 | TACI-Fc融合蛋白液体药物制剂 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE60122337T2 (de) * | 2000-04-27 | 2007-08-16 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Verwendung von taci als antitumormittel |
| SI2116259T1 (sl) * | 2001-05-24 | 2012-11-30 | Zymogenetics Inc | Taci imunoglobulin fuzijski proteini |
| WO2006052493A1 (en) * | 2004-11-04 | 2006-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptides that bind baff and/or april |
| AU2006278227B2 (en) * | 2005-08-09 | 2011-10-20 | Ares Trading S.A. | Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules |
| CN100471872C (zh) * | 2005-11-04 | 2009-03-25 | 余波 | 包含vegf受体片段的优化融合蛋白质及其医疗应用 |
-
2007
- 2007-06-15 CN CN2007101111622A patent/CN101323643B/zh active Active
-
2008
- 2008-06-16 RU RU2009148020/10A patent/RU2433141C2/ru active
- 2008-06-16 EP EP08757443.0A patent/EP2161287B1/en active Active
- 2008-06-16 KR KR1020097026657A patent/KR101204229B1/ko active IP Right Grant
- 2008-06-16 BR BRPI0811333A patent/BRPI0811333B8/pt active IP Right Grant
- 2008-06-16 JP JP2010511477A patent/JP5372917B2/ja active Active
- 2008-06-16 WO PCT/CN2008/001162 patent/WO2008154814A1/zh active Application Filing
-
2009
- 2009-12-15 US US12/638,392 patent/US8193316B2/en active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HYMOWITZ S.G. ЕТ AL.: "Structures of APRIL-receptor complex", the journal of biological chemistry, 2005,v.280, № 8, p.7218-7227. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2779387C1 (ru) * | 2019-12-10 | 2022-09-06 | Ремеджен Ко., Лтд. | Фармацевтический состав слитого белка taci-fc |
| RU2814988C2 (ru) * | 2019-12-24 | 2024-03-11 | Ремеджен Ко., Лтд. | Слитый белок taci-fc и его применение |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0811333A2 (pt) | 2015-06-16 |
| WO2008154814A1 (en) | 2008-12-24 |
| BRPI0811333B1 (pt) | 2020-09-15 |
| US8193316B2 (en) | 2012-06-05 |
| RU2009148020A (ru) | 2011-07-10 |
| KR101204229B1 (ko) | 2012-11-26 |
| EP2161287A4 (en) | 2010-08-11 |
| EP2161287B1 (en) | 2015-03-04 |
| EP2161287A1 (en) | 2010-03-10 |
| BRPI0811333B8 (pt) | 2021-05-25 |
| US20100136008A1 (en) | 2010-06-03 |
| JP5372917B2 (ja) | 2013-12-18 |
| CN101323643B (zh) | 2010-12-01 |
| KR20100009600A (ko) | 2010-01-27 |
| CN101323643A (zh) | 2008-12-17 |
| JP2010529967A (ja) | 2010-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2433141C2 (ru) | Оптимизированный слитый белок taci-fc | |
| EP1767546B1 (en) | Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use | |
| AU2022204946A1 (en) | Molecules that selectively activate regulatory t cells for the treatment of autoimmune disease | |
| US7666837B2 (en) | Methods and compositions for producing secreted trimeric receptor analogs and biologically active fusion proteins | |
| EA017303B1 (ru) | Модифицированные гуманизированные антитела против интерлейкина-18 и их применение | |
| CN104039831A (zh) | 免疫球蛋白fc变体 | |
| JP2013512674A (ja) | Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させるための組成物および方法 | |
| EP1954714A2 (en) | Hepatocyte growth factor intron fusion proteins | |
| AU2003299971A1 (en) | Combination therapy with co-stimulatory factors | |
| CA2662549C (en) | Il-1 family variants | |
| CN102875683B (zh) | 长效重组人生长激素的Fc融合蛋白 | |
| EA037256B1 (ru) | Химерный белок мочевого трипсинового ингибитора (мти), содержащий домен мти и fc-домен igg1 | |
| KR20230060514A (ko) | 인터루킨-2 뮤테인 및 이의 용도 | |
| JP6320973B2 (ja) | Ｂ細胞活性化因子の拮抗物質、その調製方法及び利用法 | |
| JP6687548B2 (ja) | 変性された潜在関連蛋白質構成物 | |
| CN114302743B (zh) | 用于治疗关节炎的hla-dr/cii肽复合体 | |
| RU2689522C1 (ru) | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок, состоящий из растворимого внеклеточного домена человеческого tnfr1 и константной части тяжёлой цепи человеческого igg4 | |
| CN103833856B (zh) | 抑制taci‑baff复合物形成的融合蛋白及其制法和用途 | |
| JP2023524981A (ja) | 操作されたリラキシンおよびその使用の方法 | |
| WO2017075037A1 (en) | Primed growth factors and uses thereof | |
| US20240150432A1 (en) | Fusion protein of tnfr2 and april baff receptor |