CN113121685A - 一种抗白介素-17a抗体、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明所公开的抗白介素‑17A抗体及其制备方法，获得的抗白介素‑17A抗体不具有非人源的糖基化，不具有免疫原性，不会引起施用人源化抗IL‑17A单克隆抗体后的不必要的副作用。

Description

一种抗白介素-17A抗体、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及一种抗白介素-17A抗体、其制备方法及应用。
技术背景
白介素-17家族，该家族的细胞因子被分别命名为白介素-17A到白介素-17F。白介素-17家族的细胞因子就如一把双刃剑，在急性炎症反应中，它们可以快速的分泌出来保护机体不受外源有害物质的危害，而当人体产生由于多种遗传和环境因素导致的慢性炎症时，它们又会加速多种慢性疾病的病程。
该家族中最具代表性的成员为白介素-17A，在机体受感染或损伤处，迁移过来的淋巴细胞会分泌白介素-17A，白介素-17A一方面会诱导炎症因子以及趋化因子的表达，从而招募更多的免疫细胞到达炎症部位加剧机体的炎症反应；另一方面，白介素-17A还会诱导一些组织修复相关因子的表达从而加速机体的恢复。
虽然白介素-17A在宿主抗感染和组织修复过程中起到扩大免疫防御反应保护自身机体的作用，但是，在很多自身免疫疾病病人和肿瘤病人当中，白介素-17A又是高表达的，由于它可以诱导很多炎症因子的表达，过高的白介素-17A水平对于疾病的病理发展起到恶化作用。很多动物实验也证明，白介素-17A缺失或者抗体中和白介素-17A，可以有效抑制多种自身免疫疾病病理程度。针对白介素-17A的治疗性抗体的研制是至关重要的。
自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、银屑病(psoriasis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、Ⅰ型糖尿病(type1diaberes，T1D)。
目前常用的抗IL-17A单克隆抗体的表达系统多为哺乳动物细胞表达系统，使用哺乳动物细胞 CHO细胞表达的抗体，具有翻译后的修饰，可以表达出与人类抗体结构相接近的抗体类药物。但是，使用CHO宿主细胞进行的表达，所表达出的抗体还会有非人源的糖基化表达，如小鼠的IgG中含有的唾液酸化类型的Neu5Gc(NGNA)；使用哺乳动物细胞表达还会产生Gal-a(1,3)-Gal(a- Gal)的糖基化机构，a-Gal(a-半乳糖)是一种非人源的聚糖，具有极强的免疫原性，会引发异体移植中的组织排斥反应，还会引起严重的超敏反应。
发明内容
本发明提供了一种抗白介素-17A抗体、其制备方法及应用。
本发明公开了一种抗白介素-17A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQID NO:1、 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的轻链可变区氨基酸序列，包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6所示的重链可变区氨基酸序列。
一个优选实施例抗白介素-17A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQ IDNO:4所示的轻链可变区氨基酸序列，包含SEQ ID NO:12所示的重链可变区氨基酸序列。
一个优选实施例抗白介素-17A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
如上所述的抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab)2、或F(ab’)2。
如上所述的单克隆抗体是小鼠抗体、嵌合抗体、或人源化抗体。
本发明公开了一种免疫缀合物，其中包含与治疗剂连接的上述单克隆抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载体。
如上所述的免疫缀合物中，所述治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
一种抗白介素-17A抗体的制备方法，优选抗IL-17A单克隆抗体轻链具有SEQ IDNO:8所述的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO:10所述的氨基酸序列。大规模生产表达抗IL-17A单克隆抗体，采用基础培养及补充培养的方法，使用无血清、无动物源组分的基础培养基及补充培养基对含有抗 IL-17A单克隆抗体基因序列的CHO宿主细胞进行培养表达。
人源化抗IL-17A单克隆抗体的大规模生产、制备步骤包括：1)细胞复苏，种子扩增；2)灌流培养；3)补充培养。其中细胞复苏、种子扩增及灌流培养阶段，均使用无血清、无动物源组分的基础培养基，补充培养阶段使用无血清、无动物源组分的补充培养基。
经过对基础培养基CHOM-B8E系列培养基的筛选，优选CHOM-B8E系列培养基的组合形式，选择CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:0.5～3，优选CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:1.5；经过对补充培养基CHOM-S8E系列培养基的筛选，优选CHOM-S8E系列培养基的组合形式，选择CHOM- S8E01:CHOM-S8E04为1:0.1～1，优选CHOM-S8E03:CHOM-S8E05为1:0.3。
使用基础培养基CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:1.5及补充培养基CHOM-S8E03:CHOM- S8E05为1:0.3对含有人源化抗IL-17A单克隆抗体的对CHO宿主细胞进行大规模生产培养、表达。
灌流培养阶段培养条件为：温度为35℃～39℃，优选36℃～37℃；pH值为6.6～7.2，优选pH 值为6.8～6.9；搅拌速度80～150rpm；表层通空气，深层微泡通气包括空气、氧气、二氧化碳；溶解氧30～60％，优选溶解氧40～50％；每日补充葡萄糖3～5g/L。
补充培养阶段培养条件为：经过如上灌流培养48～72小时后，调节细胞培养反应器温度32℃～ 34℃，优选33℃，调节pH值为7.0～7.3，优选pH值为7.0～7.1，添加补充培养基、葡萄糖溶液。根据细胞密度添加补充培养基至收获，每日添加量为初始上罐体积的1％～5％，低温培养8～10 天。
培养表达8～10天后，收取细胞培养液，将细胞培养液通过深层过滤澄清去除细胞及细胞碎片，再通过一级膜过滤降低生物负荷，获得含有人源化抗IL-17A单克隆抗体的培养上清液，将培养上清液进行纯化，获得人源化抗IL-17A单克隆抗体。
一种抗白介素-17A抗体的应用，上述抗白介素-17A抗体及其抗原结合片段在治疗自身免疫性疾病中的应用。
一种抗白介素-17A抗体的应用，上述抗白介素-17A抗体及其抗原结合片段在治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、银屑病(psoriasis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus， SLE)、I型糖尿病(type1diaberes，T1D)中的应用。
通过本发明所公开的制备方法获得的抗白介素-17A抗体不具有非人源的糖基化，不具有免疫原性，不会引起施用人源化抗IL-17A单克隆抗体后的不必要的副作用。
附图说明
图1、rh-IL-17A融合蛋白与市售IL-17A抗体的结合；
图2、不同鼠抗rh-IL-17A抗体与rh-IL-17A融合蛋白的结合；
图3、不同鼠抗rh-IL-17A抗体与Secukinumab-biotin的竞争结合；
图4、不同嵌合抗rh-IL-17A抗体与rh-IL-17A融合蛋白的结合；
图5、不同嵌合抗IL-17A抗体的生物活性检测；
图6、不同人源化抗rh-IL-17A抗体与rh-IL-17A融合蛋白的结合；
图7、不同人源化抗rh-IL-17A抗体与rh-IL-17A融合蛋白的结合；
图8、人源化IL-17A单克隆抗体7G5L1+8E4H3、8E4L2+8E4H3与rh-IL-17A融合蛋白的结合；
图9、人源化IL-17A单克隆抗体7G5L1+8E4H3、8E4L2+8E4H3与Secukinumab-biotin的竞争结合；
图10、人源化IL-17A单克隆抗体7G5L1+8E4H3、8E4L2+8E4H3生物活性检测；
图11、人源化IL-17A单克隆抗体8E4L2+8E4H3的糖型质谱检测图。
具体实施例
实施例1、抗白介素-17A抗体的制备
1)、鼠抗rh-IL-17A抗体的制备
全基因合成rh-IL-17A连接pL101表达载体并转化，将含有rh-IL-17A基因的表达载体转染至 CHO宿主细胞中，培养并表达rh-IL-17A融合蛋白，收集培养上清液，分离、纯化获得rh-IL-17A融合蛋白。
使用市售抗IL-17A抗体Secukinumab，检测所获得的rh-IL-17A融合蛋白，结果如图1所示， rh-IL-17A融合蛋白可以与IL-17A抗体Secukinumab相结合。
鼠抗rh-IL-17A抗体的制备：使用制备好的且与市售抗IL-17A抗体Secukinumab相结合的rh-IL- 17A融合蛋白免疫小鼠，加强免疫后，取小鼠脾脏，生理盐水中碾磨制备单细胞悬液，PEG法与 NS-1细胞融合。将融合细胞进行细胞培养、克隆筛选，获得抗rh-IL-17A单克隆抗体7-G5-7-B4、8- E4-1-B2、19-C1-1-E4、25-F6-3-E3、32-D3-3-A4、33-H5-3-D2、38-D4-2-E10。
检测上述单克隆抗体与rh-IL-17A融合蛋白的结合力，实验结果见图2，结果显示，抗rh-IL-17A 单克隆抗体7-G5-7-B4、8-E4-1-B2、19-C1-1-E4、25-F6-3-E3、32-D3-3-A4、33-H5-3-D2、38-D4-2- E10均可以与rh-IL-17A融合蛋白相结合。
鼠抗rh-IL-17A抗体与Secukinumab-biotin的竞争：使用生物素标记试剂盒、并按照操作流程对市售抗IL-17A抗体Secukinumab进行生物素标记；使用rh-IL-17A融合蛋白包被酶标板，检测鼠抗 rh-IL-17A单克隆抗体7-G5-7-B4、8-E4-1-B2、19-C1-1-E4、25-F6-3-E3、32-D3-3-A4、33-H5-3-D2、38-D4-2-E10与ecukinumab-biotin的竞争能力。结果见图3，竞争结合结果显示，检测鼠抗rh-IL-17A 单克隆抗体7-G5-7-B4、8-E4-1-B2的竞争结合能力强于市售抗体ecukinumab-biotin。
实施例2、嵌合抗体的构建
使用“Trizol Reagent”试剂盒(Invitrogen公司产品)，提取分泌抗rh-IL-17A单克隆抗体的8-E4- 1-B2的总RNA。选择抗体(IgG1，k)重链和轻链恒定区的适当位置，分别设计3条基因特异性引物GSP1、GSP2、GSP3，其中GSP1距离可变区基因最远，用于逆转录反应，GSP2用于首轮PCR 扩增，GSP3用于巢式扩增。
使用5’RACE试剂盒，以GSP1为引物将总RNA逆转录为cDNA，然后给第一链cDNA的3’末端加上poly(C)尾，加尾后用GSP2和AAP为引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释100倍再以AUAP和 GSP3为引物进行巢式PCR扩增。筛选阳性克隆进行基因测序，对测序结果进行分析，正确克隆进行目的引物合成。
嵌合抗体的结合活性检测：将嵌合抗体质粒转染至CHO细胞，转染后的细胞采用无血清培养基培养12天，收集上清液，分离、纯化，获得嵌合抗体。使用rh-IL-17A融合蛋白包被酶标板，检测嵌合抗体结合活性，结果见图4，结果显示，嵌合抗rh-IL-17A抗体可以与rh-IL-17A融合蛋白结合。
嵌合抗体的生物活性检测：消化收集生物检测细胞，检测嵌合抗IL-17A抗体CIL-17A-7G5-M13- LH/XY及CIL-17A-M13-LH/XY，结果见图5，检测结果显示，嵌合抗IL-17A抗体CIL-17A-7G5- M13-LH/XY的生物活性高于CIL-17A-M13-LH/XY。
实施例3、人源化抗体的构建
全基因合成人源化抗体轻链全长、重链可变区基因，轻链、重链全长酶切与表达载体连接，转染CHO宿主细胞进行表达。
人源化抗体的结构确认：将人源化抗体轻链、重链质粒脂质体分别共同转染CHO-K1细胞株， 48小时后，吸取培养上清，进行ELISA检测。
表1、不同轻链、重链的组合
Figure RE-GDA0002397181970000041
Figure RE-GDA0002397181970000051
上述各种轻链、重链组合所培养获得的抗rh-IL-17A抗体，经过ELISA检测，结果见图6、图7。检测结果显示，上述各种组合的转染物表达上清均与rh-IL-17A融合蛋白想结合，其中1+10，1+11，1+12，3+10，3+11，3+12，8+10，8+11，8+12结果较好。
人源化抗IL-17A单克隆抗体的功能确认：将人源化抗体质粒转染至CHO-S细胞株，转染后的细胞用无血清培养基培养12天，收集表达上清，分离、纯化，获得人源化单克隆抗体。使用rh-IL- 17A融合蛋白包被酶标板，检测所得抗体，结果如图8所示，结果显示，获得的人源化抗IL-17A单克隆抗体与rh-IL-17A融合蛋白相结合。
人源化抗IL-17A单克隆抗体与Secukinumab-biotin的竞争：使用生物素标记试剂盒、并按照操作流程对市售抗IL-17A抗体Secukinumab进行生物素标记；使用rh-IL-17A融合蛋白包被酶标板， ELISA检测检测人源化IL-17A单克隆抗体与ecukinumab-biotin的竞争能力。结果见图9，竞争结合结果显示，检测人源化IL-17A单克隆抗体7G5L1+8E4H3、8E4L2+8E4H3的竞争结合能力强于市售抗体ecukinumab-biotin。
人源化抗IL-17A单克隆抗体活性确认：消化收集生物检测细胞，活性检测结果见图10，结果显示人源化抗IL-17A单克隆抗体hIL17A-M13-(8E4L2+8E4H3)/XY的生物活性较单克隆抗体 hIL17A-M13-(7G5L1+8E4H3)/XY生物活性更好。
实施例4、人源化抗IL-17A单克隆抗体的制备
将hIL17A-M13-(8E4L2+8E4H3)/XY人源化抗体质粒转染至CHO-K1细胞株，经过培养、克隆筛选后，获得高表达克隆。
经过上述实施例层层筛选后，最终优选的抗IL-17A单克隆抗体轻链具有SEQ IDNO:14所述的氨基酸序列，重链具有SEQ ID NO:16所述的氨基酸序列。
大规模生产表达抗IL-17A单克隆抗体，采用基础培养及补充培养的方法，使用无血清、无动物源组分的基础培养基及补充培养基对含有抗IL-17A单克隆抗体基因序列的CHO宿主细胞进行培养表达。
无血清、无动物源组分的基础培养基及补充培养基，购买于上海迈泰君奥生物技术有限公司，基础培养基为CHOM-B8E系列培养基，补充培养基为CHOM-S8E系列培养基。
人源化抗IL-17A单克隆抗体的大规模生产、制备步骤包括：1)细胞复苏，种子扩增；2)灌流培养；3)补充培养。其中细胞复苏、种子扩增及灌流培养阶段，均使用无血清、无动物源组分的基础培养基，补充培养阶段使用无血清、无动物源组分的补充培养基。
经过对基础培养基CHOM-B8E系列培养基的筛选，优选CHOM-B8E系列培养基的组合形式，选择CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:0.5～3，优选CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:1.5；经过对补充培养基CHOM-S8E系列培养基的筛选，优选CHOM-S8E系列培养基的组合形式，选择CHOM- S8E01:CHOM-S8E04为1:0.1～1，优选CHOM-S8E03:CHOM-S8E05为1:0.3。
使用基础培养基CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:1.5及补充培养基CHOM-S8E03:CHOM-S8E05 为1:0.3对含有人源化抗IL-17A单克隆抗体的对CHO宿主细胞进行大规模生产培养、表达，工作细胞经过细胞复苏及种子扩增后，检测细胞活率及细胞密度，进行接种灌流培养，接种后的活细胞密度不低于0.3×106cell/ml，接种比例1:2～1:8，要求细胞活率大于90％。
灌流培养：将经过上述细胞扩增后的细胞，转入500L细胞培养反应器中，使其初始细胞密度不低于0.3×106cell/ml。温度为35℃～39℃，根据培养工艺的要求调整温度控制范围，优选36℃～ 37℃；pH值为6.6～7.2，以CO2和碳酸钠溶液调控pH，优选pH值为6.8～6.9；搅拌速度80～ 150rpm；表层通空气，深层微泡通气包括空气、氧气、二氧化碳；溶解氧30～60％，优选溶解氧 40～50％；每日补充葡萄糖3～5g/L。
补充培养：经过上述灌流培养48～72小时后，调节细胞培养反应器温度32℃～34℃，优选 33℃，调节pH值为7.0～7.3，优选pH值为7.0～7.1，添加补充培养基、葡萄糖溶液。根据细胞密度添加补充培养基至收获，每日添加量为初始上罐体积的1％～5％，低温培养8～10天。
培养表达8～10天后，收取细胞培养液，将细胞培养液通过深层过滤澄清去除细胞及细胞碎片，再通过一级膜过滤降低生物负荷，获得含有人源化抗IL-17A单克隆抗体的培养上清液，将培养上清液进行纯化，获得人源化抗IL-17A单克隆抗体。
将经过上述培养方法获得的人源化抗IL-17A单克隆抗体进行蛋白质糖型质谱检测，结果如图11 所示。由检测的图谱可以明显得知，使用上述基础培养基及补充培养基，经上述培养方法培养表达的人源化抗IL-17A单克隆抗体不含有小鼠的IgG中含有的唾液酸华类型的Neu5Gc(NGNA)，也不含有a-1,3半乳糖。
经过上述培养方法获得的人源化抗IL-17A单克隆抗体不含有非人源的糖基化，不具有免疫原性，不会引起施用人源化抗IL-17A单克隆抗体后的不必要的副作用。
实施例5、人源化抗IL-17A单克隆抗体的热稳定性测定
进行差示扫描热量法(DSC)测量以确定表观中点解析折叠温度(Tm)。DSC也用于测量状态的热容和与可由温度变化诱导的转变相关的过剩热。过剩热容的积分是该过程的焓。主要的解折叠转变表现为显著的吸热峰。
使用VP-DSC对PBS(pH7.0的磷酸盐缓冲液)中的蛋白质浓度为0.5mg/ml的Secukinumab、 Ixekizumab及IL-17A单克隆抗体7G5L1+8E4H3、8E4L2+8E4H3进行差示扫描热量法(DSC)测量。以0.5mg/ml的蛋白质浓度分别测试了各种单克隆抗体，并且使用不含有蛋白质的缓冲液对照作为参照。在10℃最初的10min平衡之后以100℃/小时的速率从10℃到120℃扫描样品。进行了至少 5次缓冲液-缓冲液扫描，以获得基线值并建立热史。
使用Origin7.0分析数据，将所有热分析图进行基线校正，并使用Origin中的非两态模型拟合以获得解折叠的表观中点温度(Tm)和解折叠的表观焓(△H)。结果如表2所示，由检测结果可以得知，抗IL-17A单克隆抗体8E4L2+8E4H3的解折叠温度高于Secukinumab、Ixekizumab，表明与 Secukinumab、Ixekizumab相比，本发明所提供的IL-17A单克隆抗体8E4L2+8E4H3具有更好的热稳定性。
表2、由DSC确定的表观中点解折叠温度和解折叠焓
抗IL-17A单克隆抗体 Tm(℃) 焓(△H)
Secukinumab 70.2 801
Ixekizumab 71 813
8E4L2+8E4H3 79.4 889
7G5L1+8E4H3 69.6 581
序列表
<110> 上海百迈博制药有限公司
<120> 一种抗白介素-17A抗体、其制备方法及应用
<130> 20191231
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 4
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly Thr
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
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Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120
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<211> 661
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
gaagtcgtga tgacccagag ccctttgtca ttgtctgtct ctcctgggga gcgagctaca 60
atctcttgca ggagttctca gagtcttgtg cactccaacg gcaacacata tctccactgg 120
tatcaacaga aacctggaca ggccccacga ctccttattt acaaagtgtc taaccggttt 180
agcggcgtgc ctgaccgctt tagcggaagc ggtagtggta ccgattttac tctcacaata 240
agccgccttg aagctgagga ctttgccgta tactattgct ctcagtccac ccacgtctat 300
acctttggac aggggacaaa ggtggaaatc aagcgcactg tggctgcacc atctgtcttc 360
atcttccctc catctgatga gcagctgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420
aataacttct atcccagaga ggccaaagtg cagtggaagg tggataacgc cctccaatct 480
ggtaactccc aggagtccgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540
agcaccctga cactgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600
acccatcagg gcctgtcctc tcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgaatt 660
c 661
<210> 8
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 9
<211> 1366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
caggtgcagc tcctggagtc aggccctggt ttggtgaaac cctctcagac tcttagcctg 60
acatgtactg tatctggagg tagtctgacc acatacggtg tgcattgggt taggcagccc 120
cctggcaaag gcctggagtg gctcgtggtt atctggtctg acggtactac cacttataat 180
tcagcactga agtcccgact gtccatttcc agggatacaa gtaagtctca ggtgttcctt 240
aagatgaact ctgtgacagc tgctgacacc gccgtatatt actgtgccag gtctcctcct 300
tattactata ctatggacta ctgggggcag ggcacactgg tgacagtgag cagcgctagc 360
aagcttcacg ctagcaccaa gggcccatcc gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagctgc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg 480
accgtgtctt ggaactctgg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc tgctgtcctc 540
cagtcctctg gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcctgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagcgt 660
gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cctgcccagc acctgaactc 720
ctggggggac catccgtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc atgaagaccc tgaggtcaag 840
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc aagggaagag 900
cagtacaaca gcacatacag agtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020
accatctcca aagccaaagg gcagcccaga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080
agggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagcccg agaacaacta caagaccaca 1200
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctcc tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320
cactacaccc agaagagcct ctccctgtct cccggtaaat gaattc 1366
<210> 10
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Val Val Ile Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ser Pro Pro Tyr Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asn Ser Phe Thr Gly Arg Gln Gly
115 120 125
Glu Ala Leu Leu Gly Val Val Val Val Gln Ser Leu Met His His Gly
130 135 140
Ala Gly Glu Asp Val Pro Leu Leu Pro Pro Ala Leu Val His Gly Glu
145 150 155 160
Leu Ala Val Glu Glu Glu Gly Ala Val Gly Val Gln His Gly Arg Cys
165 170 175
Gly Leu Val Val Val Leu Gly Leu Pro Ile Ala Leu Pro Leu His Gly
180 185 190
Asp Val Ala Gly Ile Glu Ala Phe Asp Gln Ala Gly Gln Ala Asp Leu
195 200 205
Val Leu Gly His Leu Leu Pro Gly Trp Gly Gln Gly Val His Leu Trp
210 215 220
Phe Ser Gly Leu Pro Phe Gly Phe Gly Asp Gly Phe Leu Asp Gly Gly
225 230 235 240
Trp Glu Gly Phe Val Gly Asp Leu Ala Leu Val Leu Leu Ala Ile Gln
245 250 255
Pro Val Leu Val Gln Asp Gly Glu Asp Ala Asp His Ser Val Cys Ala
260 265 270
Val Val Leu Leu Phe Pro Trp Leu Cys Leu Gly Ile Met His Leu His
275 280 285
Ala Val His Val Pro Val Glu Leu Asp Leu Arg Val Phe Met Ala His
290 295 300
Val His His His Ala Cys Asp Leu Arg Gly Pro Gly Asp His Glu Gly
305 310 315 320
Val Leu Gly Phe Trp Gly Glu Glu Glu Asp Gly Trp Ser Pro Gln Glu
325 330 335
Phe Arg Cys Trp Ala Gly Trp Ala Cys Val Ser Phe Val Thr Arg Phe
340 345 350
Gly Leu Asn Thr Leu Val His Leu Gly Val Ala Gly Leu Val Ile His
355 360 365
Val Ala Asp Val Gly Leu Gly Ala Gln Ala Ala Gly Gly His Gly His
370 375 380
His Ala Ala Glu Gly Val Glu Ser Arg Gly Leu Glu Asp Ser Arg Glu
385 390 395 400
Gly Val His Ala Ala Gly Gln Gly Ala Arg Val Pro Arg His Gly His
405 410 415
Gly Phe Gly Glu Val Val Leu Asp Gln Ala Ala Gln Gly Ser Cys Ala
420 425 430
Pro Arg Gly Ala Leu Gly Gly Gly Cys Gln Gly Glu Asp Gly Trp Ala
435 440 445
Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu
450 455

Claims (14)

1.一种抗IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3所示的轻链可变区氨基酸序列；具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所述的重链可变区序列。
2.根据权利要求1所述的一种抗IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是小鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
3.根据权利要求1所述的一种抗IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有SEQ ID NO:8所述的轻链氨基酸序列；具有SEQ ID NO:10所述的重链氨基酸序列。
4.一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述抗体具有权利要求1、3所述的氨基酸序列，所述方法使用无血清、无动物源组分的基础培养基及补充培养基对含有抗IL-17A单克隆抗体基因序列的CHO宿主细胞进行培养，所述基础培养基为CHOM-B8E系列的组合培养基，所述补充培养基为CHOM-S8E系列的组合培养基。
5.根据权利要求4所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包含使用基础培养的细胞复苏、种子扩增阶段、灌流培养阶段；及使用补充培养基的补充培养阶段。
6.根据权利要求5所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述灌流培养阶段的条件为：温度为35℃～39℃，；pH值为6.6～7.2；搅拌速度80～150rpm；表层通空气，深层微泡通气包括空气、氧气、二氧化碳；溶解氧30～60%；每日补充葡萄糖3～5g/L。
7.根据权利要求6所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述灌流培养阶段的条件为：温度为36℃～37℃；pH值为6.8～6.9；溶解氧40～50%。
8.根据权利要求5所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述补充培养阶段的条件为：经灌流培养48～72小时后，调节细胞培养反应器温度32℃～34℃，调节pH值为7.0～7.3，每日添加补充培养基，添加量为初始上罐体积的1%～5%，低温培养8～10天。
9.根据权利要求8所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述补充培养阶段的条件为：经过如上灌流培养48～72小时后，调节细胞培养反应器温度33℃，调节pH值为7.0～7.1，每日添加补充培养基，添加量为初始上罐体积的1%～5%，低温培养8～10天。
10.根据权利要求4-9所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述基础培养基的CHOM-B8E系列的组合为CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:0.5～3；所述补充培养基CHOM-S8E系列的组合为CHOM-S8E01:CHOM-S8E04为1:0.1～1。
11.根据权利要求10所述的一种抗IL-17A单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述基础培养基的CHOM-B8E系列的组合为CHOM-B8E03:CHOM-B8E05为1:1.5；所述补充培养基CHOM-S8E系列的组合为CHOM-S8E01:CHOM-S8E04为1:0.3。
12.一种免疫缀合物，其特征在于，包含与免疫治疗剂连接的权利要求1-11中任一项所述的单克隆抗体，所述免疫治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。
13.一种根据权利要求1-11所述的抗IL-17A单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在自身免疫性疾病治疗中的应用。
14.一种根据权利要求1-11所述的抗IL-17A单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体在类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病、银屑病、系统性红斑狼疮、Ⅰ型糖尿病的治疗中的应用。
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