CN111801354A - 单克隆抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性地结合人T‑细胞受体的TRBV9家族的单克隆抗体。本发明也涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，表达载体，用于生产所述抗体的方法，和所述抗体在治疗与人T‑细胞受体家族有关的疾病或病症中的用途。本发明涉及生产抗体，其可以用于消除携带TRBV9家族的T‑细胞受体的T‑细胞，特别地用于治疗强直性脊柱炎、乳糜泻和血液癌症，在其发病机理中涉及TRBV9家族的T‑细胞受体。

Description

单克隆抗体及其使用方法

发明领域

本发明涉及生物技术和生物医学的领域，特别地涉及抗体或其抗原结合片段，以及涉及其用途。更具体地，本发明涉及特异性地结合人T细胞受体家族的单克隆抗体。本发明也涉及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，表达载体，用于制备所述抗体的方法，和所述抗体在治疗与人T细胞受体家族有关的疾病或病症中的用途。

发明背景

在人自身免疫病的治疗中，使用基于抗体的药物，所述抗体针对主要炎症性过程介质，诸如TNFα、IL1、IL6、IL17、IL23（van der Heijde D等人, Ann Rheum Dis. 2011年6月; 70(6):905-8, Baeten D, 等人, N Engl J Med. 2015年12月24日; 373(26):2534-48）。针对CD3和CD4受体复合体(其具有免疫调谐性质)的单克隆抗体处于治疗自身免疫病的临床试验中(Kuhn C.和Weiner L., Immunotherapy 2016年7月; 8(8):889-906; Helling B.等人, Immunology and Cell Biology 2015年4月; 93(4):396-405; Konig M. 等人,Front Immunol 2016年1月25日;7:11)。然而，已经显示，这样的药物的应用尽管导致炎症的减轻，但是不停止疾病的发展，且不直接作用于疾病的原因，即自体反应性T淋巴细胞(Haroon N等人, Arthritis Rheum. 2013年10月; 65(10):2645-54., Duarte J. 等人,PloS One 2010年5月10日; 5(5):e10558; Konig M. 等人, Front Immunol 2016年1月25日;7:11)。

尽管使用单克隆抗体对强直性脊柱炎(AS, 别赫捷列夫氏病)的对症治疗取得了成功，但是尚未产生允许自身免疫应答的选择性和长期性抑制以及停止AS的进展的有效药物。因而，迫切的任务是产生抗体，其允许除去AS患者的自体反应性T淋巴细胞克隆的构造，后者的出现与该疾病的发展有关。

已知的是，识别抗原的T细胞受体(TCR)和主要组织相容性复合体(MHC, HLA)蛋白（它们是细胞内蛋白或在其表面上的病原生物的蛋白的加工的肽）之间的相互作用在自体反应性T淋巴细胞克隆的出现中起重要作用。许多自身免疫病与特定HLA基因变体在人类中的存在有关。例如，HLA-B27等位基因与AS、反应性关节炎和克罗恩氏病有关。在某些HLA等位基因变体的携带者中发展自身免疫病的风险可以通过某些肽由这些等位基因的优先呈递来解释，所述肽是自身抗原，针对它们的免疫应答触发自身免疫病的发展。自身免疫反应的起始的可能机制之一是来自细菌或病毒起源的蛋白的肽（它们与生物自身肽同源）由组织相容性复合体分子的呈递，该事实可以导致归因于交叉反应性的对自身抗原的免疫应答。

如从现有技术已知的，T细胞受体(TCR)序列是允许鉴定与自身免疫病的发病机理有关的T-淋巴细胞克隆的标记。在结构上，T-细胞受体的亚基是免疫球蛋白超家族的成员，且由几个基因区段形成。TCR可变区形成TCR抗原结合部位。这意味着，它们是克隆-特异性的，即在对性质不同的抗原做出应答的T淋巴细胞方面不同。

依据在TCR可变结构域内的可变(V)基因区段的氨基酸同源性，将T细胞受体分成不同的家族。根据IMGT命名法，将β-链分类成26个性质不同的家族，并将α链分类成41个家族(Turner SJ等人, Nature Reviews Immunology 2006, V.6, 883–894)。为了确定TCR链家族，人们使用试验氨基酸序列和已知TCR链序列的多重比对，关于其的信息总结在IMGT数据库中(“The international ImMunoGeneTics information system”, Lefranc M-P.,Nucl Acids Res 2001; 29:207-209)，该数据库可于http://www.imgt.org在因特网上得到。使用IgBlast软件包可以执行TCR链家族的多重比对和确定。

已经描述了具有AS的患者中自身免疫TCRs的共有变体，已经显示，它存在于具有AS的患者的滑液和外周血中，且在健康供体的相同深度分析中不存在，不管他们的HLA*B27等位基因状态如何(Faham M. 等人, Arthritis Rheumatol. 2017;69(4):774-784;KomechЕ等人. 12th EJI-EFIS Tatra Immunology Conference; 2016年9月3-7日;Strbske Pleso, Slovakia. Abstract book第39页)。这些TCRs是TRBV9家族的成员(根据IMGT命名法)。

已经显示，带有TRBV9家族β-链的T细胞受体也与自身免疫病诸如乳糜泻的发展有关(Petersen J等人, J Immunol. 2015; 194(12): 6112-22)。并且，它们存在于在T细胞淋巴瘤和T细胞白血病（包括由EB病毒(EBV)引起的T-细胞淋巴瘤）中易发生恶性化的T细胞的表面(Toyabe S等人, Clin Exp Immunol. 2003; 134(1): 92-97)。

本发明的最接近的类似物是针对人T细胞受体可变结构域的β-链区域（它们属于TRBV5-3 TRBV8-1家族）的单克隆抗体W112和2D1，它们在专利申请(WO9006758)中被描述为用于诊断和治疗类风湿性关节炎的工具。这些单克隆抗体分别识别0.3-5%的带有TRBV5-3的周围T淋巴细胞和0.5-13%的带有TRBV8-1的周围T淋巴细胞。许多证实T淋巴细胞在类风湿性关节炎的发病机理中的牵连的研究的结果导致对T受体的β-链区域特异性的单克隆抗体的使用。特别地，Brennan等人, Clin Exp Immunol. 1988年9月; 73(3): 417-423的数据已经证实了与健康供体相比在遭受类风湿性关节炎的患者的滑液样品中带有TRBV5和TRBV8的淋巴细胞的升高的百分比T。

并且，WO9405801公开了与人T-细胞受体的VB3.1可变区的表位相互作用的用于诊断和治疗类风湿性关节炎的单克隆抗体，其与TCR V(β)3.1亚家族相互作用。

在WO9405801和WO9006758中描述的用于治疗类风湿性关节炎的方法的主要缺点是，缺乏将发病机理与β-链可变区段的特定家族关联的有力证据。

还已经描述了特异性地识别大鼠TRC的第13个家族β-链的单克隆抗体。动物模型已经证实，在这些抗体的帮助下，可能预防性地除去其T受体包含VB13β-链的T细胞的小群体(VB13+ T细胞)，且已经显示，这种程序保护免于I型糖尿病在有I型糖尿病倾向的系的大鼠中的发展，且也显著地降低病毒诱导的糖尿病的发展的风险(Zhijun Liu等人,Diabetes. 2012年5月; 61(5): 1160–1168.)。同时，其T受体包含性质不同的β-链家族(VB16)的T细胞的排除与对照组在结果方面没有不同。重要的是，注意到，甚至针对VB13的单克隆抗体的第一次施用导致大鼠脾中的VB13+ T细胞数目的60%下降。

所有所述的类似物均不结合属于TRBV9家族的TCRs，并且不适合用于治疗AS和其它与属于TRBV9家族的TCRs有关的疾病。

尚未描述适合用于消除带有TRBV9家族TCRs的T细胞的单克隆抗体，所述抗体可以用于治疗AS和乳糜泻。

发明概述

本发明涉及抗体的产生，所述抗体可以用于消除带有TRBV9家族TCRs的T细胞，特别是用于治疗AS、乳糜泻和恶性血液疾病，其发病机理涉及TRBV9家族TCRs。

本发明涉及具有特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力的单克隆抗体及其抗原结合片段。根据本发明的抗体可以用作用于治疗自身免疫和肿瘤学疾病的药物，所述疾病的发病机理涉及属于TRBV9家族的TCRs，例如，AS、乳糜泻和一些T细胞淋巴瘤和T细胞白血病。

本发明的抗体和抗原结合片段的特征在于，

1)其重链的可变结构域(VH)包含3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

HCDR 1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID NO:: 1的氨基酸序列；

HCDR 2具有SEQ ID NO:: 2的氨基酸序列；

HCDR 3具有选自SEQ ID NO:: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；

2)其轻链的可变结构域(VL)包含3个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

LCDR 1具有SEQ ID NO:: 7的氨基酸序列；

LCDR 2具有SEQ ID NO:: 8的氨基酸序列；

LCDR 3具有SEQ ID NO:: 9的氨基酸序列。

除非另外具体说明，否则在下文中使用众所周知的Kabat编号方案来确定抗体的CDRs。

根据本发明的抗体可以是嵌合的、人源化的或人抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体含有人-样恒定区和结构组分，但是具有大鼠-样可变结构域。

在一些实施方案中，抗体轻链可变结构域具有SEQ ID NO:: 11的氨基酸序列，且主题抗体的重链可变结构域具有选自SEQ ID NO:: 13、SEQ ID NO:: 15、SEQ ID NO:: 17、SEQ ID NO:: 19的氨基酸序列。

还提供了一种抗体，其轻链可变结构域的氨基酸序列与在SEQ ID NO:: 11中所示的序列基本上类似(例如，至少90%相同)。

还提供了一种抗体，其重链可变结构域的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:: 13、SEQID NO:: 15、SEQ ID NO:: 17、SEQ ID NO:: 19的序列基本上类似(例如，至少90%相同)。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含轻链和重链，所述轻链的氨基酸序列与SEQID NO:: 29基本上类似，所述重链的氨基酸序列与选自SEQ ID NO:: 21、SEQ ID NO:: 23、SEQ ID NO:: 25、SEQ ID NO:: 27的序列基本上类似。

在一些实施方案中，本发明的单克隆抗体是全长人IgG抗体，例如，IgG1或IgG2或IgG3或IgG4。

还提供了编码根据本发明的抗体的重链和轻链的可变结构域的核酸、编码根据本发明的抗体的重链和轻链的核酸及其功能片段。

还提供了表达盒和表达载体，其包含本发明的核酸和所述核酸在选择的宿主细胞中的表达所必需的调节元件。所述载体或表达盒可以作为染色体外元件存在于宿主细胞中，或作为所述表达盒或载体向细胞中引入(通过转染)的结果而整合进细胞基因组中。

此外，提供了包含本发明的核酸、载体或表达盒的细胞和稳定细胞系，及其制备方法。

还提供了用于生产以上抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在确保所述抗体生产的条件下在培养基中培养以上宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括所得到的抗体的接着发生的分离和纯化。

还提供了用于预防或治疗由人T受体的TRBV9家族β-链区域介导的疾病或病症的药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的以上抗体或其抗原结合片段。

在实施方案之一中，所述药物组合物意图预防或治疗选自以下组的疾病或病症：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

还提供了用于预防或治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或病症的药物组合，其包含以上抗体或其抗原结合片段和至少一种其它的治疗活性化合物。

在实施方案之一中，所述药物组合意图预防或治疗选自以下组的疾病或病症：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

在一个实施方案中，所述药物组合包含另一种治疗活性化合物，其选自小分子、抗体或类固醇激素，诸如皮质类固醇。

还提供了用于在需要这种抑制的主体中抑制T细胞受体的生物活性的方法，所述T细胞受体的β-链属于TRBV9家族，所述方法包括给所述主体施用有效量的上述抗体或其抗原结合片段。

还提供了用于治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括以治疗有效量给需要这种治疗的主体施用以上抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物。

在用于治疗疾病或病症的方法的实施方案之一中，所述疾病或病症选自以下组：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

还提供了上述抗体或其抗原结合片段或上述药物组合物用于在需要这种治疗的主体中治疗由带有TRBV9家族β-链的人T细胞受体介导的疾病或病症的用途。

在所述用途的实施方案之一中，所述疾病选自以下组：强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

本发明的技术结果是产生新的抗体，其特异性地结合其β-链属于TRBV9家族的TCRs，且可以用于治疗自身免疫和肿瘤学疾病, 其发病机理涉及其β-链属于TRBV9家族的TCRs。此外，技术结果是增加AS和/或乳糜泻的治疗的有效性和实现AS的长期缓和，所述增加由生产能够直接地作用于自身免疫T淋巴细胞的抗体提供。

附图简述

图1-4显示了使用用eFluor 405标记的抗-CD3单克隆抗体(纵坐标轴)和用FITC标记的针对TRBV9的单克隆抗体(横坐标轴)的单核血液级分细胞分布的双参数直方图：抗-TRBV9-1 (图1)、抗-TRBV9-2 (图2)、抗-TRBV9-3 (图3)、抗-TRBV9-4 (图4)。以两种浓度使用抗-TRBV9单克隆抗体的每种变体：每个试验270 ng (上图)或27 ng (下图)。小矩形表示CD3+TRBV9+的具体群体。

图5显示了在细胞毒性试验以后使用用eFluor 405标记的抗-CD3单克隆抗体(纵坐标轴)和用FITC标记的针对TRBV9的单克隆抗体(横坐标轴)的单核血液级分细胞分布的双参数直方图：与抗-TRBV9-2 (试验)和类克(Remicade)(对照)一起温育。

发明详述

本发明涉及具有特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力的分离的单克隆抗体及其功能片段。还提供了编码本发明的抗体及其片段的核酸，包含本发明的核酸和所述核酸在选择的宿主细胞中的表达所必需的调节元件的表达盒和表达载体。此外，提供了包含本发明的核酸、载体或表达盒的细胞和稳定细胞系。还提供了用于生产单克隆抗体或其功能片段的方法，包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的有效量的本发明的抗体的药物组合物和药物组合，和使用本发明的抗体诊断和治疗AS和其它疾病的方法。

定义

在首先定义一些术语的情况下，将更容易理解本发明。

应当理解，本文提供的材料和方法不限于特定组合物和方法步骤，这是因为这些可以变化。必须指出，如在本文中和在所附权利要求书中所使用的，单数形式包括对应的复数形式，除非上下文另外清楚地指出。

人“T细胞受体”（也被称作“TCR”、“T受体”）是在T淋巴细胞表面上发现的异源二聚体蛋白复合体。所述受体仅存在于T淋巴细胞上。TCR的主要功能是特异性地识别与主要组织相容性复合体(HLA)的分子结合的加工的抗原。

人TCR由通过二硫键连接并停靠在细胞膜上的2个亚基α和β-链、或γ和δ链组成。每个TCR链具有N-末端可变(V)结构域、连接结构域和连接至跨膜结构域的恒定(C)结构域，所述跨膜结构域将受体锚定在T淋巴细胞质膜中。α和β-链的恒定结构域的长度分别是91和129个氨基酸残基。α链的连接和跨膜结构域的长度是30和17个氨基酸残基(AARs)，且β-链的连接和跨膜结构域的长度是21和22个AARs。T受体可变结构域的长度在104-125个AARs之间变化。

小部分的T淋巴细胞具有γ/δ型受体。它们类似于α/β受体进行排列，但是在它们的一级结构方面不同且具有许多功能特征。它们表现出低得多的变异性(有限的克隆特异性)，它们识别与“非典型”(非-MHC)抗原呈递分子形成复合体的抗原或甚至游离抗原。

T受体通过6个决定其互补性的区域(CDRs)与MHC/抗原复合体反应：3个α链区域和3个β-链区域。这些CDRs是高变区，T细胞受体的可变结构域的环，Vα和Vβ。

术语“TRBV9”或“TRBV9家族”表示根据IMGT命名法区分的T细胞受体的β-链的第九个家族，其特征在于，其可变结构域的氨基酸序列包含CDR1 (氨基酸序列是S-G-D-L-S)和CDR2 (氨基酸序列是Y-Y-N-G-E-E)的独特基序。术语“TRBV9家族TCR”表示其β-链属于TRBV9家族的T细胞受体。

关于T淋巴细胞或TCRs的术语“病理学的”是指，这种TCR或带有TCR的T淋巴细胞与疾病或病理学有关和/或引起疾病和/或有助于疾病的发展。

关于TCR的术语“自身免疫”是指，这种TCR与自身免疫病的发展有关。

如本文中所使用的术语“抗体”意图表示由通过二硫键连接的4个多肽链(2个重(H)链和2个轻(L)链)组成的免疫球蛋白分子。将轻链分类为κ或λ。将重链分类为γ、μ、α、δ或ε；它们分别决定了抗体同种型诸如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，且它们中的几个可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。每个重链类型由特定恒定区表征。

每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区域可以进一步细分成高变异性的区域，称作互补性决定区(CDRs)，其被称作构架区(FR)的更保守的区域围着。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

在本申请中，3个重链CDRs被称作“CDRH1、CDRH2和CDRH3”，而3个轻链CDRs被称作“CDRL1、CDRL2和CDRL3”。CDRs含有与抗原特异性地相互作用的大多数残基。除非另有说明，否则按照众所周知的Kabat编号方案将在根据本发明的抗体的HCVRs和LCVRs内的CDR-氨基残基编号和定位。本申请包括氨基酸的常规字母代码，除非另有说明。

术语“抗-TRBV9抗体”、“针对TRBV9的抗体”、“特异性地结合TRBV9家族β-链的抗体”和“针对TRBV9家族β-链的抗体”在本申请的上下文中是可互换的，并涉及特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β-链的表位的抗体。

为了本申请起见，术语“抗体”和“单克隆抗体”表示针对TRBV9家族TCR的单克隆抗体。如本文中所使用的，“单克隆抗体”涉及啮齿类动物、灵长类动物或骆驼科（Camelidae）的抗体，优选地涉及小鼠、猕猴、骆驼或美洲鸵抗体，嵌合抗体，人源化抗体或全人抗体，除非另有说明。

每对轻/重链的可变区形成抗体的抗原结合部位。如在本申请中所使用的，“抗原结合部分”或“抗原结合区域”或“抗原结合结构域”或“抗原结合部位”可互换地涉及抗体分子的这种部分，其包含与抗原相互作用的氨基酸残基，并给与所述抗体对于所述抗原来说的特异性和亲和力。抗体的所述部分包含维持抗原结合残基的适当构象所需要的“构架”氨基酸残基。

如本文中所使用的，术语“人抗体”表示这样的抗体，其中可变和恒定结构域的序列衍生自人序列。根据本发明的人抗体可以包含不是人特有的氨基酸残基(例如，通过体外非定向或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，且特别地，在CDR3中。

当关于抗体使用时，术语“人源化的”用于表示这样的抗体，其特征在于人-样恒定区和结构组分的存在，但是具有其它起源的免疫球蛋白或经修饰的抗体的对应片段特有的互补性决定区(CDRs)。

关于本发明的抗体的术语“嵌合的”用于表示这样的抗体，其特征在于人-样恒定区，但是具有其它起源的可变区。在这种抗体中，非人起源(例如，大鼠起源)的轻链和/或重链的可变结构域可操作地连接到人起源的对应链的恒定结构域。

当用于描述抗体时，术语“可操作地连接的”等表示放置于彼此物理（共价, 除非另外说明）和功能关系中的多肽序列。在最优选的实施方案中，嵌合分子的多肽组分的功能与分离的多肽组分的功能性质相比没有变化。当用于描述核酸时，术语“可操作地连接的”等是指，所述核酸共价地连接，从而使得在它们的连接点处不存在读框移位和终止密码子。如对于本领域技术人员显而易见的，编码包含“可操作地连接的”组分(蛋白、多肽、接头序列、蛋白结构域等)的嵌合蛋白的核苷酸序列由编码所述组分的片段组成，其中所述片段共价地连接，从而使得在核苷酸序列的翻译和转录过程中产生全长嵌合蛋白，例如，根据本发明的嵌合抗体。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“衍生的”是指处于除分子或细胞在自然界中所存在的环境以外的环境中的分子或细胞。

在优选的实施方案中，本发明的抗体是重组体，即，使用重组DNA技术产生的。如本文中所使用的，术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，诸如使用引入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因转基因的动物分离的抗体(参见，例如，Taylor L.D. 等人(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295)。在一些实施方案中，使所述重组人抗体经历体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列，其尽管衍生自人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列有关，但是可能不天然存在于体内人抗体种系谱内。

如本文中所使用的术语“特异性地结合”意图表示这样的情形，其中特异性结合对的一个成员不显著地结合除了一种或多种其特异性结合配偶体以外的分子。在例如本发明的抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位具有特异性的场合，所述术语也是适用的；在这种情况下，包含抗原结合结构域的特异性抗体将能够特异性地结合各种携带所述表位的抗原。因此，本发明的单克隆抗体特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β-链的表位，然而它不特异性地结合其它家族的TCRβ-链和TCRα链。

术语“表位”表示能够在抗体的抗原结合区中的一个或多个处被抗体识别和结合的分子的部分。表位经常由分子（诸如氨基酸或糖侧链）的化学活性表面类群组成，且具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。

如在本申请中所使用的，术语“表位”尤其还表示在动物中（优选地在哺乳动物例如小鼠、大鼠或人中）具有抗原活性和/或免疫原性活性的多肽片段。如本文中所使用的术语“抗原性表位”是可以特异性地结合抗体且可以通过从现有技术众所周知的任何技术（例如，通过标准免疫测定）检测的多肽片段。抗原表位不一定是免疫原性的，然而，它们可以是免疫原性的。如本文中所使用的“免疫原性的表位”被定义为在动物中引起抗体应答的多肽片段，如通过从现有技术已知的任何方法所确定的。“非线性表位”或“构象表位”包含在结合表位特异性抗体的抗原蛋白内的非邻近多肽(或氨基酸)。

关于本发明的抗体或其功能片段的术语“生物学性质”或“生物学特征”或术语“活性”或“生物活性”在本申请中可互换地使用，且包括，但不限于表位/抗原亲和力和特异性，中和或拮抗包含属于TRBV9家族的β-链的TCR的活性的能力。

抗体的其它可鉴定的生物学性质或特征包括，例如，交叉反应性(即，通常，与靶肽的非人同源物（homologs），或与其它蛋白或组织)，和在哺乳动物细胞中保持高蛋白表达水平的能力。使用本领域中公认的技术可以观察、测量和/或评估前述性质或特征，所述技术包括，但不限于，ELISA、竞争性ELISA、KINEXA表面等离振子共振分析、不受限制情况下的体外或体内抑制测定、受体结合测定、细胞因子或生长因子生产和/或分泌测定、以及从各种来源（包括人、灵长类动物或任意其它来源）得到的组织切片的信号转导和免疫组织化学。

关于本发明的抗体的活性如本文中所使用的术语“抑制”或“中和”表示基本上拮抗、阻止、预防、限制、减慢、破坏、消除、停止、减少例如正抑制的对象（包括，但不限于，抗体的生物活性，或性质、疾病或状况）的进展或严重性的能力。

如本文中所使用的，术语“突变体”或“变体”表示在本发明中公开的抗体，其中在本发明的抗体或其片段的N-末端和/或C-末端处和/或在天然氨基酸序列内添加和/或取代和/或缺失和/或插入一个或多个氨基酸。如本文中所使用的，术语“突变体”也表示编码突变蛋白的核酸分子。此外，术语“突变体”表示比蛋白或核酸更短或更长的任何变体。

术语“同源性”用于描述核苷酸或氨基酸序列与其它核苷酸或氨基酸序列的关系，其由被对比的所述序列之间的同一性和/或相似性程度决定。

如本文中所使用的，如果氨基酸或核苷酸序列与选择用于对比的区域内的指定序列具有至少70%同一性，那么所述氨基酸或核苷酸序列是与参考序列“基本上类似的”或“基本上相同的”。因而，基本上类似的序列包括具有例如至少75%同一性、例如至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性(例如，90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98%或99%同一性)的那些。彼此相同的2个序列也是基本上类似的。

基于参考序列来确定序列同一性。用于序列分析的算法是本领域已知的，诸如在Ye等人. Nucleic Acids Res. 2013, W34-40中描述的IgBLAST。为了本发明起见，为了确定核苷酸序列和氨基酸序列之间的同一性和相似性的水平，可以在由国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）提供的IgBLAST软件包(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)的帮助下使用具有标准参数的缺口比对对比核苷酸和氨基酸序列。为了计算百分比同一性，使用参考序列的全长，例如，可变区。

对“编码”多肽的核苷酸序列的提及是指在mRNA的翻译和转录过程中从核苷酸序列产生多肽。由此，可以指示与mRNA相同且一般用在序列表中的编码链和充当用于转录的模板的互补链两者。如对于本领域技术人员显而易见的，所述术语也包括编码相同氨基酸序列的任何简并核苷酸序列。编码多肽的核苷酸序列包括包含内含子的序列。

抗体

如上文所提及的，本发明涉及具有特异性地结合人T受体的TRBV9家族β-链区域的能力的分离的单克隆抗体及其功能片段。

根据本发明的抗体的特征在于

a)其重链的可变结构域(VH)包含3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

本发明的抗体的特征在于

a)其重链的可变结构域(VH)包含3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

HCDR1 (根据Kabat编号方案)具有氨基酸序列DYLVH (SEQ ID NO: 1)；

HCDR2具有氨基酸序列WINTYTGTPTYADDFEG (SEQ ID NO: 2)；

HCDR3具有选自SWRRGLRGLGFDY (SEQ ID NO: 3)、SWRRGLRGIGFDY (SEQ ID NO: 4)、SWRRGIRGLGFDY (SEQ ID NO: 5)、SWRRGIRGIGFDY (SEQ ID NO: 6)的氨基酸序列；

b)其轻链的可变结构域(VL)包含3个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

LCDR1具有氨基酸序列KASKSINKYLA (SEQ ID NO: 7)；

LCDR2具有氨基酸序列DGSTLQS (SEQ ID NO: 8)；

LCDR3具有氨基酸序列QQHNEYPPT (SEQ ID NO: 9)。

根据本发明的抗体可以是嵌合的、人源化的或人抗体或其抗原结合片段，且可以用作用于治疗别赫捷列夫氏病和其发病机理涉及属于TRBV9家族的TCRs的其它疾病（例如，乳糜泻或T细胞淋巴瘤）的药物。

使用例如本领域众所周知的杂交瘤技术、以及重组技术、噬菌体展示技术、合成技术或这种技术的组合或本领域众所周知的其它技术，可以得到本发明的单克隆抗体。如在本申请中所使用的术语“单克隆抗体”表示从单个拷贝或克隆（包括，例如，任何真核、原核或噬菌体克隆）得到的抗体，而不是表示其生产方法。

通过肽合成或使用如下面“核酸”部分中所描述的重组DNA技术，可以得到人源化的和嵌合抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体是嵌合的且其特征在于，它们具有非人起源(例如，大鼠或小鼠)的轻链和重链的可变结构域，和人起源恒定结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体的特征在于，它们具有选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的重链可变结构域的氨基酸序列，和在SEQ ID NO: 11中所示的轻链可变结构域的氨基酸序列。由此，在优选的实施方案中，所述抗体包含重链的恒定区，诸如人IgG1、IgG2、IgGS、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgD的恒定区。优选地，重链恒定区是人IgG1重链恒定区。此外，抗体可以包含轻链恒定区或轻链κ恒定区或轻链λ恒定区。优选地，抗体包含轻链κ恒定区。

根据本发明的抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3或抗-TRBV9-4抗体的重链的氨基酸序列的例子分别显示在SEQ ID NO: 21、23、25和27中。抗体的轻链的示例性氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 29中。

在一些实施方案中，抗体的可变结构域的构架区的氨基酸序列或其部分通常具有人起源，且因此是“人源化的抗体”。所述“人源化”被认为在降低用于治疗用途的所述抗体在患者中的免疫原性中是有用的。在构架区中的某些选择的氨基酸残基仍然是大鼠的，而不是人的。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段包含轻链的可变结构域，其氨基酸序列与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列基本上类似，例如，至少90%相同，更经常至少93%相同，一般94%或更多相同(优选地95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)。

在一些实施方案中，本发明的抗体及其抗原结合片段包含重链的可变结构域，其可变结构域的氨基酸序列与选自SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列基本上类似。例如，它们具有与选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列至少90%相同，更经常至少93%相同，一般94%或更多相同(优选地95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链和轻链，所述重链具有与选自SEQ IDNO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27的氨基酸序列至少90%相同（例如，93%或更多相同，94%或更多相同，95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)的氨基酸序列，所述轻链具有与SEQ ID NO:29的氨基酸序列至少90%相同（例如，93%或更多相同，94%或更多相同，95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)的氨基酸序列。

如从现有技术已知的，可以将突变引入抗体序列，包括可变结构域，其不显著改变抗体结合抗原的能力。本发明的抗体也可以包含进一步的突变，其不导致抗体结合TCR的TRBV9家族β-链的能力的丧失，但是可以导致依赖抗体的细胞毒性的下降或抗体的亲和力或其它生物学性质的增加。特别地，如从现有技术众所周知的，可以在抗体序列中产生保守氨基酸取代。如在本申请中所使用的，“保守取代”是指这样的取代，其中氨基酸残基被另一个具有类似侧链的氨基酸残基取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族是本领域众所周知的，其包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。优选地，在VL和/或VH结构域中的CDR3区域包含不多于5个保守氨基酸取代，更经常不多于3个保守取代。一般，不在对于结合TRBV9家族β-链的表位而言关键性的氨基酸位置处产生保守取代。

通过肽合成或使用如下面“核酸”部分中所描述的重组DNA技术，可以产生根据本发明的抗体的以上变体(突变体)。

还提供了本发明的抗体的抗原结合片段。如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”(或“抗体的功能片段”或“抗体的活性片段”)表示一种或多种保留特异性地结合抗原的能力的抗体片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。被包括在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括：(a) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(b) F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(c)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(d)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(e)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989) Nature 341:544-546)，和(f)分离的互补性决定区（CDR）。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头进行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白链，其中VL和VH区域配对以形成单价分子（称为单链Fv (scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426; Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883）。这种单链抗体也预期包括在术语抗体的“抗原结合片段”内。它们还包括其它形式的单链抗体，诸如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于单个多肽链上，但使用太短以致于不能允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对且产生两个抗原结合部位(参见例如，Holliger P.等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. 等人(1994)结构2:1121-1123)。

使用常规技术，诸如完整抗体的分别木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，可以从完整抗体得到抗体片段，诸如Fab和F(ab′)2。此外，使用标准的重组DNA技术可以得到抗体、抗体片段和免疫黏附分子。

抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体片段与一种或多种蛋白或肽的共价或非共价缔合而形成的较大免疫黏附分子的部分。这种免疫黏附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区域的使用以制备四聚体scFv分子(Kipriyanov S.M. 等人(1995) HumanAntibodies and Hybridomas 6:93-101)以及半胱氨酸残基、标记肽和C-末端聚组氨酸标签的使用以制备二价和缩小尺寸的scFv生物分子(Kipriyanov S.M. 等人(1994) Mol.Immunol., 31:1047-1058)。在抗体片段之间的其它化学键也是从现有技术众所周知的。

根据本发明的抗体及其功能片段以分离的形式存在，即，这意味着，这种蛋白基本上没有其它蛋白或其它天然存在的生物分子（诸如寡糖、核酸及其片段等）的存在，其中术语“基本上没有”在所述情况下是指，小于70%、一般小于60%和更经常小于50%的所述包含分离的蛋白的组合物是其它天然存在的生物分子。在一些实施方案中，所述蛋白以基本上纯化的形式存在，其中术语“基本上纯化的形式”是指等于至少95%、一般等于至少97%和更经常等于至少99%的纯度。

用于纯化通过重组或杂交瘤技术得到的抗体的方法是本领域众所周知的，例如，可以通过层析(例如，离子交换层析，亲和层析，尤其是对特定抗原A蛋白或G蛋白的亲和力，和分级柱层析)、离心、差别溶解度或用于纯化蛋白的任意其它标准技术来执行纯化。此外，通过根据本发明的技术产生的抗体或其片段可以融合至异源多肽序列(例如，组氨酸标签)以促进纯化。

通过确定解离常数(KD)，可以使用标准分析确定抗体亲和力。使用公式KD=kd/kon计算KD，其中kd是通过实验计算的解离速率常数，且kon是通过实验计算的抗体-抗原复合体的结合速率常数。

优选的抗体是以以下KD值结合人抗原的那些抗体：不超过约1×10^-7 M；优选地不超过约1×10^-8 M；更经常不超过约1×10^-9 M；更优选地不超过约1×10^-10 M，且最优选地不超过约1×10^-11 M，例如，不超过约1×10^-12 M。

优选的抗体包括抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3或抗-TRBV9-4，其特征在于CDR3序列，并在下面的实验部分中详细描述。

可以用于本发明的组合物和方法中的抗体及其片段是生物活性的抗体和片段，即，它们能够结合期望的抗原性表位并直接地或间接地表现出生物学作用。

根据本发明的抗体及其功能片段能够特异性地结合TRBV9家族β-链的表位(区域)。在优选的实施方案中，其对TRBV9家族β-链的特异性结合导致包含所述β-链的TCRs的抑制的活性。一般，抑制优选地是至少约20、30、40、50、60、70、80、90、95%或更多。

在一些实施方案中，根据本发明的针对TRBV9家族β-链的抗体或其片段可以消除带有包含TRBV9家族β-链的TCR的T细胞。在一些实施方案中，根据本发明的抗体或其片段可以提供T淋巴细胞的至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或约100%消除。

核酸

本发明提供了编码本发明的抗体的重链和轻链、其功能片段和可变结构域的核酸分子，其可以用于生产包含与人抗体的已知恒定结构域可操作地融合的本发明的可变结构域的嵌合抗体。

在优选的实施方案中，本发明的核酸编码抗体重链，其可变结构域包含3个高变区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中

HCDR1 (根据Kabat编号方案)具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；

HCDR2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；

HCDR3具有选自SEQ ID NO:: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；

在优选的实施方案中，本发明的核酸编码抗体轻链，其可变结构域包含3个高变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中：

LCDR1具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列；

LCDR2具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列；

LCDR3具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

编码所述抗体链的同源物和突变体、其功能片段和结构域的核酸分子也在本发明范围内。

在一些实施方案中，核酸编码抗体轻链，其可变结构域包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列；例如，它们至少90%相同，更经常至少93%相同，一般94%或更多相同(优选地95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)。

在一些实施方案中，核酸编码抗体重链，其可变结构域包含与选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列；例如，它们至少90%相同，更经常至少93%相同，一般94%或更多相同(优选地95%或更多相同，96%或更多相同；97%或更多相同，98%或更多相同，99%或更多相同或99.5%或更多相同)。

在一些实施方案中，核酸编码抗体轻链和抗体重链，所述抗体轻链包含可变结构域，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 11中，所述抗体重链包含可变结构域，其氨基酸序列选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19。

在一些实施方案中，核酸编码可变结构域，其氨基酸序列呈现在SEQ ID NO: 11、13、15、19中，其可以用于与编码抗体的对应恒定结构域的核酸可操作地融合。

感兴趣的核酸分子的示例性具体类型更详细地公开在下面实验部分中。

如本文中所使用的，核酸分子是DNA分子，诸如基因组DNA分子或cDNA分子，或RNA分子，诸如mRNA分子。在一些实施方案中，本发明的核酸分子是包含可读框的DNA (或cDNA)分子，其编码本发明的抗体或抗体片段且能够在合适的条件（例如，生理学细胞内条件）下用于在异源表达系统中表达。

在一些实施方案中，通过基因工程方法生产本发明的核酸分子。用于生产核酸的方法是本领域众所周知的。例如，氨基酸序列信息或核苷酸序列信息的可用性使得能够通过寡核苷酸合成来制备本发明的分离的核酸分子。在氨基酸序列信息的情况下，可以合成许多由于简并密码而彼此不同的核酸。为期望的宿主选择密码子变体的方法是本领域众所周知的。

通过亚磷酰胺方法可以制备合成的寡核苷酸，且可以根据本领域众所周知的方法，诸如高效液相层析(HPLC)或在例如Sambrook等人, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 第2版, (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY中描述的其它方法，并根据例如United States Dept. of HHS, NationalInstitute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research描述的指南，纯化作为结果而产生的构建体。可以以下述方式合成本发明的长双链DNA分子：通过合成几个具有适当互补性的较小片段，其包含能够与邻近片段黏合的适当末端。使用DNA连接酶或基于PCR的方法，可以连接邻近片段。

也可以从生物学来源克隆本发明的核酸分子。

本发明也包括与编码本发明多肽的核酸同源的、基本上相同的、相同的或由其衍生出的核酸。

本发明的核酸存在于除它们在自然界中所存在的环境以外的环境，例如，它们是分离的，以增加的量存在，在体外系统中或在除它们在自然条件下所存在的那些以外的细胞或生物中存在或表达。

紧密相关的核酸序列之间的核苷酸序列的变化或差异可能代表在正常复制或重复过程期间产生的序列中的核苷酸变化。可以为了特定目的特别设计其它变化并引入序列中，以致改变特定氨基酸的密码子或调节区中的核苷酸序列。这种具体变化可以使用多种诱变技术在体外产生，或在放置于诱导或选择所述变化的特定选择条件下的宿主生物中得到。这种特别产生的序列变体可以被称作原始序列的“突变体”或“衍生物”。

通过模板序列中一个或多个核苷酸的修饰、缺失或添加，或它们的组合，以产生模板核酸的变体，可以在选自以上核酸的模板核酸上得到突变体或衍生物核酸。修饰、添加或缺失可以通过本领域已知的任何方法进行(参见，例如，Gustin等人, Biotechniques(1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123；和Colicelli等人, Mol. Gen.Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook等人, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, (1989), CSH Press, 第15.3-15.108页)，包括易错PCR、改组、寡核苷酸指导的诱变、装配PCR、有性PCR诱变（sexual PCR mutagenesis）、体内诱变、盒式诱变、循环总体诱变（recursive ensemble mutagenesis）、指数总体诱变（exponential ensemblemutagenesis）、位点特异性诱变、随机诱变、基因重装配（gene reassembly）、基因位点饱和诱变（gene site saturated mutagenesis）(GSSM)、合成连接重装配（synthetic ligationreassembly）(SLR)或它们的组合。修饰、添加或缺失也可以通过包括重组、循环序列重组（recursive sequence recombination）、硫代磷酸酯（phosphothioate）修饰的DNA诱变、含有尿嘧啶的模板诱变、缺口双链体诱变、点错配修复诱变、修复缺失宿主株系诱变、化学诱变、辐射所致的诱变、缺失诱变、限制-选择诱变（restriction-selection mutagenesis）、限制-纯化诱变（restriction-purification mutagenesis）、人工基因合成、总体诱变、嵌合核酸多聚体产生和它们的组合的方法进行。

还提供了编码本发明的蛋白的核酸的简并变体。核酸的简并变体包括用编码相同氨基酸的其它密码子置换核酸的密码子。特别地，产生核酸的简并变体以增加在宿主细胞中的表达。在所述实施方案中，将在宿主细胞基因中非偏爱的或较不偏爱的核酸的密码子用在宿主细胞基因中的编码序列中超量表现（over-represented）的密码子置换，其中所述被置换的密码子编码相同的氨基酸。遗传密码优化是从现有技术众所周知的。

以上修饰不显著改变抗体或其功能片段的性质，但是可以促进宿主细胞中的蛋白折叠，减小聚集能力，或调节蛋白的其它生化性质，例如，半衰期。在一些实施方案中，这些修饰不修饰蛋白的生化性质。在核酸水平进行上面指定的所有类型的修饰和突变。

可以以基本上纯化的形式分离和制备请求保护的核酸。基本上纯化的形式是指，所述核酸是至少约50%纯的，一般至少约90%纯的，且一般是“重组体”，即侧接一个或多个核苷酸，它在其天然宿主生物中在自然界中存在的染色体上一般不与所述核苷酸结合。

还提供了编码包含本发明蛋白的融合蛋白的核酸或其片段，它们在下面更详细地讨论。编码本发明的可变结构域的核酸可以可操作地连接到编码抗体的轻链和重链的对应恒定结构域的核酸。编码抗体的轻链和重链的核酸可以可操作地连接到编码前导肽的核酸，所述前导肽促进表达产物从宿主细胞的转运。接着在多肽的成熟过程中除去前导肽。

还提供了包含请求保护的核酸的载体和其它核酸构建体。术语“载体”表示能够转运与它已经可操作地连接的另一种核酸的核酸分子。某些载体可以在它们被引入的宿主细胞中自主复制，而其它载体可以整合进宿主细胞基因组中并与宿主基因组一起复制。此外，一些载体能够指导与它们已经可操作地连接的基因的表达。这种载体在本申请中被称作“重组表达载体”(或简称“表达载体”)；示例性的载体是从现有技术众所周知的。合适的载体包括病毒和非病毒载体、质粒、黏粒、噬菌体等，优选质粒，并用于本发明的核酸序列到适当宿主中的克隆、扩增、表达、转移等。适当载体的选择是对于本领域技术人员显而易见的。一般借助于DNA连接酶与载体中切割的限制酶位点附着，将全长核酸或其部分插入载体中。另一方面，通过体内同源重组可以插入期望的核苷酸序列，一般通过在期望的核苷酸序列的侧面将同源性区域附着至载体。通过寡核苷酸的连接，或通过使用引物的聚合酶链反应，添加同源性区域，所述引物包含例如同源性区域和期望的核苷酸序列的部分两者。一般，载体具有确保其由于其作为染色体外元件引入细胞中的结果在宿主细胞中繁殖的复制起点。载体通常也可以包含调节元件，其确保核酸在宿主细胞中的表达和靶多肽的产生。在表达载体中，所述核酸可操作地连接到调节序列，所述调节序列可以包括启动子、增强子、终止子、操纵基因、阻遏物和诱导物，以及多肽的起始密码子。在一些实施方案中，本发明的核酸进一步可操作地连接到前导肽，其确保表达产物从宿主细胞分离进细胞外空间中。

还提供了表达盒或系统，其尤其还用于基于它们生产主题多肽（例如，本发明的抗体的轻链和重链），或用于复制主题核酸分子。作为所述表达盒向细胞中引入的结果，所述表达盒可以作为染色体外元件存在，或可以整合进细胞基因组中。关于表达，在任何方便的表达系统中表达由本发明的核酸编码的蛋白产物，包括，例如，细菌系统、酵母、昆虫、两栖类或哺乳动物细胞。在表达盒中，将靶核酸可操作地连接到调节序列，所述调节序列可以包括启动子、增强子、终止序列、操纵基因、阻遏物和诱导物，以及多肽的起始密码子。在一些实施方案中，本发明的核酸进一步可操作地连接到前导肽，所述前导肽确保表达产物从宿主细胞分离进细胞外空间中。用于制备表达盒的方法或能够表达期望的产物的系统是本领域技术人员已知的。

以上表达系统可以用在原核或真核宿主中。宿主细胞，诸如大肠杆菌（E. coli），枯草芽孢杆菌（B. subtilis），啤酒糖酵母（S. cerevisiae），与杆状病毒载体组合的昆虫细胞，或高等生物的细胞（其不是人胚胎细胞），诸如酵母、植物、脊椎动物，例如，CHO细胞(例如ATCC CRL-9096)、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞(例如ATCC CRL-1650、CRL-1651)和HeLa (ATCC CCL-2)，可以用于生产所述蛋白。

为了生产本发明的抗体，用包含编码抗体轻链的核酸的表达载体和包含编码抗体重链的核酸的表达载体共转化宿主细胞。在一些实施方案中，使用单一表达载体，其中引入了编码抗体的轻链和重链两者的核酸。

对于轻链和重链的表达，将编码重链和轻链的一种或多种表达载体转化(共转化)进宿主细胞中，从而使得所述轻链和重链在宿主细胞中表达且优选地分泌进在其中培养宿主细胞的培养基中，且可以从所述培养基分离抗体。术语“转化”的各种解释意图包括各式各样的通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的方法，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等，如在Sambrook, Fritsch和Maniatis (编) Molecular Cloning; ALaboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989; Ausubel F.M. 等人(编) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates(1989)中所述的。

当将包含抗体的核酸的重组表达载体引入宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以在宿主细胞中表达抗体或(更优选地)将抗体分泌进在其中培养宿主细胞的培养基中的时间段来产生抗体。使用标准的蛋白纯化技术，可以从培养基分离抗体。细胞培养条件是本领域技术人员众所周知的，且描述在由John Wiley & Sons, Inc.在2000年出版的CurrentProtocols in Cell Biology, Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.В.,Lippincott-Schwartz J. 和Yamada K.M. (编)中。

如果使用适合用于复制和/或表达本发明的核酸的以上宿主细胞或其它宿主细胞或生物中的任一种，则所得到的复制的核酸、表达的蛋白或多肽作为宿主细胞或生物的产物在本发明范围内。通过本领域已知的合适技术可以分离所述产物。

通过本领域已知的方法(例如与选择标记的共转染，诸如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素，其允许鉴定和分离转染的细胞，所述细胞含有整合进基因组中的基因)，可以选择稳定地表达本发明的蛋白的细胞系。

本发明的核酸分子也可以用于确定生物样品中的基因表达。在其中对于特定核苷酸序列（诸如基因组DNA或RNA）的存在来检查细胞的方法是本领域中充分确立的。简而言之，从细胞样品分离DNA或mRNA。可以通过RT-PCR来扩增mRNA，其中使用逆转录酶以形成互补DNA链，继之以使用对于主题DNA序列特异性的引物的聚合酶链反应扩增。另一方面，将mRNA样品通过凝胶电泳分离，转移至合适的载体，例如硝化纤维素、尼龙等，并然后用主题DNA的片段作为探针进行探测。其它技术，诸如寡核苷酸连接测定、原位杂交和与固定化在固体芯片上的DNA探针的杂交也可以应用。与主题序列杂交的mRNA的检测指示样品中的基因表达。

本发明的抗体的治疗用途

在一个方面，将本发明的抗体或其活性片段用于治疗与带有表面TRBV9家族TCRs的病理T淋巴细胞的活性有关的病症，例如，在AS、乳糜泻、T细胞淋巴瘤中表现出自身免疫性T淋巴细胞的活性。

如在本申请中所使用的，术语“患者”表示哺乳动物，包括但不限于小鼠、猴、人、家畜哺乳动物、运动哺乳动物和宠物哺乳动物；优选地所述术语适用于人。在特定实施方案中，所述患者进一步特征在于由TCR在其身体中的存在介导的疾病或病症或状况，所述TCR的β-链属于TRBV9家族。如从现有技术已知的，其β-链属于TRBV9家族的TCR与AS和乳糜泻有关。此外，其β-链属于TRBV9家族的TCR可能与许多血液疾病的发展有关，例如由EB病毒引起的T细胞淋巴瘤。

如本文中所使用的，预期表示抗体与一种或多种其它治疗剂的术语“共同施用”、“共同施用的”和“与……组合”意指、表示和包括以下：

1)当将这种组分一起配制在单一剂量形式中时，所述剂量形式基本上同时向所述患者释放所述组分，本发明的抗体和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的同时施用，

2)当将这种组分彼此分开配制在单独剂量形式中时，所述剂量形式基本上同时被所述患者服用，随后所述组分基本上同时释放给所述患者，本发明的抗体和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的同时施用，

3)当将这种组分彼此分开配制在单独剂量形式中时，所述剂量形式在每次施用之间有显著的时间间隔的情况下在连续的时间被所述患者服用，随后所述组分在基本上不同的时间释放给所述患者，本发明的抗体和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的序贯施用；和

4)当将这种组分一起配制在单一剂量形式中时，所述剂量形式以受控方式释放所述组分，随后它们在相同和/或不同的时间同时地、连续地和/或重叠地释放给所述患者，其中每个部分可以通过相同的或不同的途径施用，本发明的抗体和治疗剂的这种组合向需要治疗的患者的序贯施用。

可以在没有进一步的治疗性治疗的情况下施用本发明的抗体(例如，抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3或抗-TRBV9-4)，即作为独立疗法。此外，本发明的抗体的治疗可以包含至少一种额外的治疗性治疗(联合治疗)。在本发明的一些实施方案中，所述抗体可以与用于自身免疫或肿瘤学疾病的另一种药剂/药物共同施用或配制，所述疾病的发病机理涉及包含TRBV9β-链的TCRs，例如，AC、乳糜泻、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病。

施用剂量和途径

本发明的抗体将以有效治疗所讨论的状况的量施用，即以达到期望的结果所需要的剂量和在达到期望的结果所需要的时间段期间。治疗有效量可以根据诸如要治疗的具体状况，患者的年龄、性别和重量，以及抗体被单独施用还是与一种或多种另外的免疫抑制或抗炎治疗技术组合的因素而变化。

可以调节剂量方案以提供最适应答。例如，可施用快速灌注剂（single bolus），可随时间的过去施用几个分开的剂量，或可如治疗形势的紧急状态所指示的按比例降低或提高所述剂量。尤其有利的是，为了施用容易和剂量均匀，将肠胃外组合物配制在单位剂量形式中。如本文中所使用的单位剂量形式意图表示适合作为要治疗的患者/主体的单位剂量的物理上不连续的单位；每个单位含有与期望的药用载体结合的经计算以得到期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的单位剂量形式的规格一般取决于和直接依赖于：(a)化学治疗剂的独特特征以及要实现的特定治疗或预防效果，和(b)配合用于治疗主体的敏感性的这种活性化合物的领域中固有的限制。

因而，本领域技术人员从本文公开内容将认识到，根据治疗领域中众所周知的方法调节剂量和剂量方案。这意味着，可以容易地确立最大耐受剂量，且还可以确定为患者提供可检测的治疗效果的有效量，以及为了达到患者的可见治疗效果每种试剂的施用的时间要求。因而，尽管在所述文件中作为实例给出了一些剂量和剂量方案，但是这些实例绝不限制在本发明的实践中对于患者可能必需的剂量和剂量方案。

应当指出，剂量值可以随要减轻的状况的类型和严重性而变化，且可以包括单剂量或多剂量。进一步应当理解，对于任何特定主体，应当根据个体需要以及管理或监督所述组合物的施用的人士的专业判断随时间的过去调整具体剂量方案，并且在本文中陈述的剂量范围仅仅是示例性的，且无意限制具体化的组合物的范围或实践。此外，使用本发明的组合物的剂量方案可以基于各种因素，包括疾病的类型、年龄、重量、性别、患者的健康状况、状况的严重性、施用途径和使用的特定抗体。因而，剂量方案可以广泛地变化，但是可以使用标准方法常规地确定。例如，可以基于药物代谢动力学或药物动力学参数来调节剂量，所述参数可以包括临床效果诸如毒性效果和/或实验室值。因而，本发明包括如由本领域技术人员所确定的患者内剂量逐步上升。确定所需的剂量和方式是相关技术领域中众所周知的，并且是本领域技术人员在获知在所述文件中公开的概念后将显而易见的。

上面提供了合适的施用方法的例子。

预期本发明的抗体的合适剂量将在0.1-200 mg/kg的范围内，优选0.1-100 mg/kg，包括约0.5-50 mg/kg，例如约1-20 mg/kg。可以施用抗体，例如以至少0.25 mg/kg的剂量，诸如至少0.5 mg/kg，包括至少1 mg/kg，例如至少1.5 mg/kg，诸如至少2 mg/kg，例如至少3 mg/kg，包括至少4 mg/kg，例如至少5 mg/kg；和例如最多到50 mg/kg的最大酯，包括最多到30 mg/kg的最大值，例如最多到20 mg/kg的最大值，包括最多到15 mg/kg的最大值。一般将以适当的时间间隔重复施用，诸如每周1次、每2周1次、每3周1次或每4周1次，且达到负责医生认为适当的那么久，在一些情况下，如果必要的话，所述负责医生可能增加或减少剂量。

药物组合物

可以将本发明的抗体并入适合用于施用给患者的药物组合物中。可以以单剂量或多剂量单独地或与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合地施用本发明的抗体。将用于施用的药物组合物进行设计以适合所选的施用方式，以及在适当时使用的药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，诸如分散剂、缓冲液、表面活性剂、防腐剂、加溶剂、等渗剂（isotonicity agent）、稳定剂等。根据如在例如，Remington, The Science and Practiceof Pharmacy, 第19版, Gennaro, 编, Mack Publishing Co., Easton, PA 1995中的常规方法设计所述组合物，如从业人员通常已知的，其提供了用于得到组合物的各种技术。

“药剂(药物)”-是作为意图用于恢复、改善或修饰人和动物的生理功能，和用于治疗和预防疾病，用于诊断、麻醉、避孕、美容术和其它的以下形式的药物组合物的化合物或化合物的混合物：片剂、胶囊、粉末、冷冻干燥物（lyophilisates）、注射液、浸剂、软膏和其它现成形式。本领域中接受的用于施用肽、蛋白或抗体的任何方法都可以适当地用于本发明的抗体。

术语“药学上可接受的”表示适合用于在哺乳动物、优选人中施用的一种或多种相容的液体或固体组分。

术语“赋形剂”在本文中用于描述除了本发明的以上成分以外的任何成分。这些是无机或有机特性的物质，它们被用在药物制备中以给药物产品提供必要的物理化学性质。

术语“缓冲液”、“缓冲组合物”、“缓冲剂”表示溶液，其能够抵抗由它的酸-碱共轭物组分的作用造成的pH变化，且其允许抗体药物耐受pH变化。通常，药物组合物优选地具有从4.0到8.0的范围的pH。使用的缓冲液的例子包括，但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐等缓冲溶液。

如本文中所使用的，术语“渗涨剂（tonic agent）”、“渗压剂”或“渗透剂”表示可以增加液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。“等渗的”药物是具有与人血液的渗透压相等的渗透压的药物。等渗的药物一般具有约250-350 mOsm/kg的渗透压。使用的等渗剂包括，但不限于：多元醇，糖和蔗糖，氨基酸，金属盐，例如，氯化钠等。

“稳定剂”表示提供活性剂的物理和/或化学稳定性的赋形剂或两种或更多种赋形剂的混合物。稳定剂包括氨基酸，例如，但不限于，精氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸；表面活性剂，例如，但不限于，聚山梨醇酯20 (商品名: 吐温20)、聚山梨醇酯80(商品名: 吐温80)、聚乙烯-聚丙二醇及其共聚物(商品名：泊洛沙姆，Pluronic，十二烷基硫酸钠(SDS)；抗氧化剂，例如，但不限于，甲硫氨酸、乙酰半胱氨酸、抗坏血酸、一硫代甘油、亚硫酸盐等；螯合剂，例如，但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、柠檬酸钠等。

如果活性剂于例如2-8℃的贮藏温度在指定的贮存期限期间保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性，那么药物组合物是“稳定的”。优选地，活性剂保持物理和化学稳定性两者，以及生物活性。基于在加速或天然老化条件下的稳定性试验的结果调节贮藏时间段。

使用标准施用方法，包括经口、静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用，可以如在本申请中所述将包含本发明的单克隆抗体的药物组合物施用给表现出病理学的患者。

本发明的药物组合物优选地包含或是“治疗有效量”的本发明的抗体。术语“治疗有效量”意图表示在达到期望的治疗结果所必需的剂量和时间段有效的量。抗体的治疗有效量可以根据诸如主体的疾病状态、年龄、性别和重量以及抗体或其部分在主体中引起期望的应答的能力的因素而变化。治疗有效量也是这样的量，其中抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害作用。“预防有效量”意图表示在达到期望的预防结果所必需的剂量和时间段有效的量。因为在疾病之前或在疾病的早期阶段为个体开出预防剂量，所以一般预防有效量可以小于治疗有效量。

治疗有效量或预防有效量至少是最小治疗有益剂量，其小于给患者提供治疗益处所必需的活性剂的有毒剂量。另一方面，本发明的抗体的治疗有效量是在哺乳动物、优选人中降低自身免疫克隆的生物活性的量，例如，通过结合其β-链属于TRBV9家族的TCR，其中所述克隆的存在引起或有助于不期望的病理学作用，或减少其β-链属于TRBV9家族的TCR在哺乳动物、优选人中引起有益的治疗效果。

本发明的抗体的施用途径可以是口服、肠胃外、吸入或局部。优选地，可以将本发明的抗体包含在肠胃外施用可接受的药物组合物中。如本文中所使用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道或腹膜内施用。静脉内、腹膜内或皮下注射是优选的施用途径。这种注射液的可接受的药用载体是从现有技术众所周知的。

如在适当的指南中所述的，药物组合物在生产和在容器中贮藏的条件下应当是无菌的和稳定的，所述容器由例如气密密封的小瓶(安瓿)或注射器提供。因而，可以在制备所述组合物以后使药物组合物经历过滤除菌，或可以通过任意其它技术使其在微生物学上合适。用于静脉内输注的典型组合物可以包括250-1000 ml流体诸如无菌的林格液、生理盐水、葡萄糖溶液或Hank's盐溶液，和治疗有效剂量(例如，1-100 mg/ml或更多)的抗体浓缩物。所述剂量可以取决于疾病类型和严重性而变化。从医学领域现有技术众所周知，对于任何患者的剂量取决于多种因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用的持续时间和途径、一般健康状况和其它同时施用的药疗法。典型剂量可以例如在0.001-1000 µg的范围内；然而，预见到比所述举例说明性范围更低和更高的剂量，尤其考虑到上述的参数。每天肠胃外的给药方案可以是0.1 µg/kg至100 µg/kg总体重，优选0.3 µg/kg至10 µg/kg，且更优选1 µg/kg至1 µg/kg，甚至更优选每天0.5-10 µg/kg体重。通过定期评估患者的健康状态，可以监控治疗过程。关于重复施用达几天或更久，取决于患者的状况，重复治疗直到期望的应答或疾病征状的抑制。然而，还可以应用本文未描述的另一种给药方案。依赖于专业人员想要实现的药物代谢动力学崩解样品，可以通过单极施用（single-pole administration）、多次快速灌注施用（multiple bolus administrations）或通过抗体的连续输注施用期望的剂量。

抗体的所述假定性质主要依赖于医生的判断。选择适当的剂量和方案的关键因素是期望的结果。在本文中考虑的因素包括要治疗的某种疾病、要接受治疗的某种哺乳动物、某位患者的临床状况、病症原因、抗体施用部位、具体抗体类型、施用途径、施用方案和医学领域众所周知的其它因素。

可以将本发明的治疗剂冷冻或冷冻干燥并在施用前在适当的无菌载体中重构。冷冻干燥和重构可以导致抗体的活性的一些丧失。可以调节剂量以补偿所述丧失。通常，在6-8之间的pH是药物组合物优选的。

制造品(产品)和试剂盒

本发明的另一个实施方案是制造品，其包括用于治疗自身免疫病和相关的状况和恶性血液疾病（其发病机理涉及带有TRBV9家族β-链的TCRs）的产品。这种疾病包括，例如，AS、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤和其它。

所述产品是具有标签和包装插页的容器，其可以是在泡形罩和/或包中。合适的容器包括，例如，小瓶、安瓿、注射器等。所述容器可以由各种材料制成，诸如玻璃或聚合物材料。所述容器包括有效用于治疗某种状况的组合物，且可以具有无菌的进入口。组合物中的至少一种活性成分是根据本发明的抗体。标签和包装插页指示，药物意图用于治疗某种状况。标签和/或包装插页另外含有关于在患者中施用抗体组合物的说明书，包括这种治疗产品的适应症、频率、剂量、施用途径、禁忌征和/或预先警告。在一个实施方案中，包装插页指示，组合物意图用于治疗。

此外，制造品可以包括，但不限于，对于商业目的所必需的或对于消费者所必需的其它产品，诸如溶剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。

本发明也涉及试剂盒，其可以用于各种目的，例如，用于评估杀死带有TRBV9家族TCRs的T细胞的能力，用于从细胞纯化或免疫沉淀TRBV9受体。对于分离和纯化，试剂盒可以包括与颗粒(例如，琼脂糖凝胶颗粒)偶联的抗体。试剂盒包括容器、标签和包装插页。

诊断用途

本发明的抗体也用于诊断目的(例如，体外、先体外后体内)。例如，抗体可以用于检测或测量从患者得到的样品(例如，组织样品或体液样品，诸如炎症渗出物、血液、肠液、唾液或尿)中包含TRBV9家族TCRs的T淋巴细胞的水平。合适的用于检测和测量的方法包括免疫测定，诸如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光测定、放射免疫测定和免疫组织学。本发明进一步包括试剂盒，例如，包括本文描述的抗体的诊断试剂盒。

为了更好地理解本发明，陈述以下实施例。这些实施例只是为了举例说明起见，且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。

在本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都引入本文作为参考。尽管为了避免含糊的解释通过举例说明和实施例已经相当详细地描述了以上发明，但是本领域技术人员基于本发明公开的概念将非常明白，在不偏离所附的实施方案的本质或范围的情况下可以产生某些变化和修饰。

实验部分

实施例1. 抗体的生产和纯化

通过使用重叠引物和高保真度Q5聚合酶(NEB, USA)扩增DNA片段，得到编码抗体重链和轻链的可变结构域的核酸(SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 18)。将得到的核酸使用试剂盒(# 28104)在得自Quagen (德国)的柱上纯化，并靶向克隆进商购可得的pFuse载体中，所述载体包含人重(IgG1)和轻(κ)链基因的恒定区(Invivogen, USA)。通过使用桑格法测序，证实克隆的片段的序列。

结果，得到质粒，其包含四种抗体重链变体的编码序列：

HV抗-TRBV9-1，其核苷酸和氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 20和21中；

HV抗-TRBV9-2，其核苷酸和氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 22和23中；

HV抗-TRBV9-3，其核苷酸和氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 24和25中；

HV抗-TRBV9-3，其核苷酸和氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 26和27中；

以及对于一种抗体轻链变体，LV抗-TRBV9，(SEQ ID NO: 28和29)。

抗体重链的人源化程度是72%，且轻链的人源化程度是69%。

为了得到抗体，将质粒转染进HEK293F悬浮细胞系中。将293fectine试剂(ThermoFisher scientific, USA # 1234701)用于转染。将3000万个细胞放置入各自30 mlFreeStyle培养基中，向其中加入30 μg编码抗体重链变体之一的pFuse质粒和30 μg编码抗体轻链的pFuse质粒以及60 μl 293fectine (Thermo Fisher scientific, USA #12347019)。将包含免疫球蛋白重链和轻链的质粒溶解在测试过内毒素含量的水(Quagen,USA)中。

将所得到的反应混合物在摇动器上于37℃温育1周。1周以后，收获细胞上清液，将其用于分离抗体。为此，将上清液于10,000 rpm达10分钟离心3次，并将液体级分使用1 mlHiTrap PrG柱(Thermo Fisher scientific, USA)纯化。对于洗脱，使用引入HCl中的0.1 M甘氨酸缓冲液，pH2.5。使用12%PAGE在变性条件下评价分离质量。通过在280A在NanoDrop2000显微分光光度计上测量进行定量。将所得到的产物于+4℃贮藏。

表1显示了分离的蛋白的特征。

表1抗体的特征

使用OctetRed 96仪器(得自ForteBio)测量抗-TRBV9抗体的亲和力。根据在生产商的手册中描述的关于AR2G传感器的制备和固定化的标准规程，将抗原(表1)非特异性地固定化在胺反应性的第二代传感器(得自AR2G)的表面上。使用包含0.1%吐温-20和0.1%BSA的磷酸缓冲盐水(PBS)作为工作缓冲液，于30℃进行分析。使用以2的增量从126 nM至2 nM的浓度的工作缓冲液分析抗-TRBV9抗体的结合亲和力。根据标准程序使用Octet DataAnalysis软件(7.0版)和使用1:1相互作用模型，分析减去参比信号以后的结合曲线。结果总结在表2中。

表2. 抗体亲和力的评价

当使用TRBV7+TRAV38抗原时，没有观察到与抗体的相互作用。TRBV9-2和TRBV9-4抗体表现出最佳特征。

实施例2. 抗-TRBV9单克隆抗体用于标记表达属于TRBV9家族的TCRβ-链的T淋巴 细胞的用途。

如在实施例1中所述生产了单克隆抗体(抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4，特征在于重链CDR3序列)。为了显示抗体，根据生产商的规程使用异硫氰酸荧光素试剂(Sigma, USA)用荧光素标记它们。通过在495/280 nm波长的吸收光谱比率，控制与抗体分子反应的荧光团的量。将标记的抗体用于检测人血液的单核级分中表达TRBV9家族的TCRβ-链的T淋巴细胞。

5位健康供体的外周血用于获得所述级分。将血液收集在EDTA Vacuette管(各2x9ml)中，根据描述于(Kovalchuk L. V. 等人. Immunology: Workshop - 2010. - 176 p.)的标准程序分离单核级分。分离以后，将细胞转移至包含0.5%牛血清清蛋白(BSA)和2 mMEDTA的磷酸缓冲盐水(PBS)。通过如Lang N.R.所描述的锥虫蓝染色方法(Stimulation oflymphocytes M.: Medicine , 1976.-288 p.)，确定细胞的总数目及其生存力。

为了标记T淋巴细胞，在每个试验中向各包含500,000个细胞(每个试验)的单核级分的等分部分添加在补加了0.5%牛血清清蛋白(BSA)和2 Mm EDTA的PBS缓冲液中的抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4抗体至5 ng/μl和0.5 ng/μl的终浓度，以及在生产商推荐的浓度的针对CD3-eFluor405的单克隆抗体((OKT3克隆, eBioscience)；)。

将具有50 μl体积的补加了0.5%BSA、2mM EDTA的PBS的所得到的反应混合物于室温温育30分钟，此后将细胞用补加了0.5%BSA、2mM EDTA的PBS缓冲液洗涤，并通过流式细胞术分析染色的结果(FACSARIA III, USA, 图1-4)。表明所有所得到的单克隆抗体变体都特异性地识别CD3+阳性细胞的级分。然而，在5 ng/μl和0.5 ng/μl的抗体浓度两者，TRBV9-2变体显示出最稳定的染色，其为CD3-阳性级分的2.9%。而其它抗体变体(抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4)在相同浓度显示出不同比例的TRBV9+淋巴细胞的染色。并且，通过弱染色的非特异性的CD3-阴性细胞（其在使用其它变体时存在）的不存在，和通过特定细胞群体与对于TRBV9阴性的其它CD3-阳性淋巴细胞的显著分离，确定了抗-TRBV9-2的特异性。

因而，发现第二种变体(抗-TRBV9-2)表现出最有效的且高度特异性的TRBV9+ T淋巴细胞染色。所述抗体可以用于诊断目的，用于在0.6 ng/μl的浓度检测TRBV9+ T淋巴细胞。

为了评估抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4抗体的特异性，将如上所述从5个外周血样品得到的单核血液级分用如上所述的抗-TRBV9-FITC抗体和抗-CD3-eFluor450 (eBioscience, USA)抗体使用下述比例染色：

将5 μl (1 μg)的抗-CD3-eFluor 450 (eBioscience, USA)和30 ng (0.5 ng/μl)的抗-TRBV9-2 FITC添加到单核血液级分的300万细胞。将反应混合物于室温温育30分钟，将细胞用补加了0.5%BSA的PBS缓冲液洗涤，并在细胞分选仪(FACSARIA III, USA)上分选以分离CD3+TRBV9+细胞群体以及CD3+TRBV9-细胞。通过CD3+TRBV9+ 群体的再分选（resorting）来控制分选质量，所述再分选表明靶细胞群体的95%富集。

将得到的细胞级分放置在RLT缓冲液(Quagen, 德国)中，使用Quiagen RNAeasy小量试剂盒（mini kit）#217004试剂盒(Quagen)根据生产商的规程从其分离RNA。在分离的RNA模板上合成CDNA，根据Britanova等人(J Immunol, 2016, 196(12) 5005-5013)描述的规程，使用Mint cDNA合成试剂盒(Eurogen, 俄罗斯)扩增T受体β-链的片段。将Illumina衔接头(USA)连接至生产的扩增子，根据序列分析仪生产商的规程在MiSeq Illumina平台上进行测序。使用在因特网上在https://milaboratory.com可得到的MiGEC、MiXCR和VDJtools软件分析测序数据。数据分析表明，90%的来自CD3+TRBV9+ 级分的序列属于TRBV9β-链可变区段基因家族。同时，在CD3+TRBV9- 级分中没有发现含有TRBV9可变区段序列的片段。因而，抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4特异性地结合TRBV9家族β-链。

实施例3. 抗体的功能活性

如在实施例1中所述得到单克隆抗体(抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3、抗-TRBV9-4，特征在于重链CDR3序列)。如在实施例2中所述得到人血液的单核级分。

进一步地，使用人NK细胞分离试剂盒# 130-092-657 (Miltenyi biotec, USA)从单核级分的一部分分离天然杀伤细胞。使用生产商的规程。使用标记的抗体CD16-FITC、CD56-PE、CD3-VioBlue，通过细胞荧光光度术(BD FACS ARIA III, USA)评估NK细胞分离的质量。NK细胞的富集为85-95%。

为了评估细胞毒性，将抗体(抗-TRBV9-1、抗-TRBV9-2、抗-TRBV9-3或抗-TRBV9-4)添加到包含1 x 106细胞的单核级分的等分部分至5 μg/ml的终浓度。在与抗-TRBV9抗体相同浓度的抗体类克用作阴性对照。没有将抗体添加到对照细胞等分部分(阳性对照)。并且，将105个NK细胞添加到所有反应混合物。最终的反应体积为100 μl。

将反应混合物于室温温育1小时，然后将细胞洗涤几次以除去抗体，并分配进在桌上的96-孔圆底平板的孔中。

6天以后，将细胞从孔收获并用于使用流式细胞术的免疫分型（immunophenotypic）分析。使用下述抗体检测T淋巴细胞：抗-CD3-eFluor450 (OKT3克隆,eBioscience)；抗-CD8-PC7 (SFCI21Thy2D3克隆, Beckman Coulter, USA)；所得到的抗体为用Fitc标记的抗-TRBV9-1,2,3,4。染色以后，将细胞洗涤并在BD FACSARIA III仪器上分析。在与本发明的抗-TRBV9抗体一起温育的样品中没有检测到CD3+TRBV9+ T-淋巴细胞。相反，仍然在没有抗-TRBV9抗体(“零对照”)以及有治疗用抗体类克的对照样品中检测到CD3+TRBV9+ 双阳性T淋巴细胞，所述事实证实在添加针对TRBV9的抗体以后TRBV9+ T细胞的特异性消除。图5显示了流式细胞术的典型结果。在进一步的阴性对照中，其中使用非细胞毒性的抗-CD6抗体而不是本发明的抗-TRBV9抗体，与“零对照”相比在靶CD3+CD6+ 群体中没有观察到变化。这指示，没有观察到在第6天未标记的抗体对表位的筛选，并证实了抗-TRBV9抗体的消除带有TRBV9家族TCR的细胞的能力。

实施例4. 稳定细胞系的人工改造

通过用包含最适比例的轻和重抗体链的载体构建体转染悬浮CHO-S细胞系，得到生产抗-TRBV9-2单克隆抗体的稳定细胞系。使用ClonePix机器人平台(Molecular Devices)得到维持高水平(不止100 mg/L)的克隆系。通过Biomek FX机器人技术自动化系统(BeckmanCoulter)和Octet RED96分析系统(Pall Life Sciences)，分析选择的克隆的生产力。使用不含有动物衍生的蛋白的无血清培养基培养生产者。在HyClone一次性使用的生物反应器(Thermoscientific) 200 L发酵罐中生产用于临床前研究的BCD085产物。

实施例5. 得到包含本发明的抗体的药物组合物

药物组合物的组分显示在表3中。

表3. 药物组合物的组分的浓度

组分	浓度
		抗-TRBV9-2抗体	10-50 mg/ml
10 mM柠檬酸盐缓冲液至pH	6.0-7.0
		氯化钠	50-150 mM
蔗糖, 海藻糖	0.3-0.5%
		注射用水	一直到1 ml.

实施例6. 包括具有抗体的药物组合物的试剂盒

为了生产具有包含抗-TRBV9-2抗体组合物的剂量形式的试剂盒，将根据实施例5制备的药物组合物在无菌条件下密封在1 ml安瓿或注射器中，贴标签，并包装进塑料或纸板容器中。

并且，在安瓿容器中包括插页。

实施例7. 根据本发明的抗体的变体

如Wurch等人, Methods in Molecular Biology. 12 (9), 653–657 (2004)所述，使用PCR产物的“重叠序列延伸”，通过位点定向诱变得到突变体HV抗-TRBV9-1序列。根据生产商的指南，将Q5高保真度聚合酶(NEB, USA)用于PCR。扩增以后，将得到的片段通过1%琼脂糖凝胶电泳纯化并进一步提取。通过重叠序列延伸PCR (于95℃变性12秒；于55℃退火2分钟；于72℃延伸1分钟，8个PCR循环)将凝胶分离的包含突变的DNA片段组合进完整构建体。所述方法假定，存在于反应混合物中的、具有彼此互补的区域的片段用作模板和引物。在添加与扩增的片段的末端互补的引物的情况下通过标准PCR扩增整个构建体。将得到的核酸在Quagen (德国)柱上使用试剂盒(# 28104)纯化，并如实施例1所述克隆进pFuse载体中。通过根据桑格法测序，检查突变体DNA序列。所得到的可变结构域的核苷酸和氨基酸序列显示如下：变体1–在SEQ ID NO: 30和SEQ ID NO: 31中；变体2–在SEQ ID NO: 32和SEQ IDNO: 33中。如在实施例2中所述，验证了突变体抗体的结合T淋巴细胞的能力，所述T淋巴细胞表达属于TRBV9家族的TCRβ-链。显示引入的取代不影响结合特异性。

序列表

<110> JSC "BIOCAD"

<120> 单克隆抗体及其使用方法

<130> TCRB9.docx

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR1氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 1

Asp Tyr Leu Val His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR2氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 2

Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR3氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 3

Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR3氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 4

Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR3氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 5

Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> HCDR3氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 6

Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> LCDR1氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 7

Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> LCDR2氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 8

Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser

1 5

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> LCDR3氨基酸序列（根据Kabat编号方案）

<400> 9

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 10

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体轻链可变结构域的核苷酸序列

<400> 10

gacgtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 60

atcaactgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctccaccc tgcagtccgg catcccctcc 180

aggttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagggg cctggagccc 240

gaggacttcg gcctgtacta ctgccagcag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 300

ggcaccaagc tggagctgaa g 321

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体轻链可变结构域的氨基酸序列

<400> 11

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 12

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的核苷酸序列

<400> 12

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctcc 366

<210> 13

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的氨基酸序列

<400> 13

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的核苷酸序列

<400> 14

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctcc 366

<210> 15

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的氨基酸序列

<400> 15

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的核苷酸序列

<400> 16

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggca tcaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctcc 366

<210> 17

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的氨基酸序列

<400> 17

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的核苷酸序列

<400> 18

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggca tcaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctcc 366

<210> 19

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的氨基酸序列

<400> 19

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-1抗体重链的核苷酸序列

<400> 20

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365

<210> 21

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-1抗体重链的氨基酸序列

<400> 21

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 22

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-2抗体重链的核苷酸序列

<400> 22

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365

<210> 23

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-2抗体重链的氨基酸序列

<400> 23

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 24

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-3抗体重链的核苷酸序列

<400> 24

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggca tcaggggcct gggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365

<210> 25

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-3抗体重链的氨基酸序列

<400> 25

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 26

<211> 1365

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-4抗体重链的核苷酸序列

<400> 26

cagatccagc tggtgcagtc cggccccgag ctgagggagc ccggcgagtc cgtgaagctg 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccctggagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggca tcaggggcat cggcttcgac tactggggcc agggcgtgtt cgtgaccgtg 360

tcctccgcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 420

tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480

gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540

tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 600

cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660

gagcccccga aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 720

ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 780

cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 840

ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 900

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 960

aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1020

accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1080

cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1140

agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1200

cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1260

agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1320

cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gataa 1365

<210> 27

<211> 452

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9-4抗体重链的氨基酸序列

<400> 27

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Arg Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Ile Arg Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Phe Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 28

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9抗体轻链的核苷酸序列

<400> 28

gacgtgcaga tgacccagtc cccctacaac ctggccgcct cccccggcga gtccgtgtcc 60

atcaactgca aggcctccaa gtccatcaac aagtacctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaagccca acaagctgct gatctacgac ggctccaccc tgcagtccgg catcccctcc 180

aggttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagggg cctggagccc 240

gaggacttcg gcctgtacta ctgccagcag cacaacgagt acccccccac cttcggcgcc 300

ggcaccaagc tggagctgaa gcgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgtcgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgtcctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagag 639

<210> 29

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗-TRBV9抗体轻链的氨基酸序列

<400> 29

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Asn Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 30

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的变体的核苷酸序列

<400> 30

cagatccagt tggtgcagtc cggccccgag ctgaaggagc ccggcgagtc cgtgaagatc 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcatcaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccatcgagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacatcaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tac 333

<210> 31

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的变体的氨基酸序列

<400> 31

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Ile Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Ile Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Ile Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr

100 105 110

<210> 32

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的变体的核苷酸序列

<400> 32

cagatccagt tggtgcagtc cggccccgag ataaaggagc ccggcgagtc cgtgaagatc 60

tcctgcaagg cctccggcta caccttcacc gactacctgg tgcactgggt gaagcaggcc 120

cccggcaagg gcatcaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcac ccccacctac 180

gccgacgact tcgagggcag gttcgtgttc tccatcgagg cctccgcctc caccgccaac 240

ctgcagatct ccaacatcaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggtcctgg 300

aggaggggcc tgaggggcct gggcttcgac tac 333

<210> 33

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 抗体重链可变结构域的变体的氨基酸序列

<400> 33

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Ile Lys Glu Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Leu Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Ile Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Thr Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Val Phe Ser Ile Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Asn Ile Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Trp Arg Arg Gly Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Tyr

100 105 110

Claims (24)

1.特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β链区域的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

1)包含HCDR 1-3的氨基酸序列的重链可变结构域，其中

HCDR 1包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列；

HCDR 2包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列；

HCDR 3包含选自SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6的氨基酸序列；

2)包含LCDR 1-3的氨基酸序列的轻链可变结构域，其中：

LCDR 1包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列；

LCDR 2包含SEQ ID NO: 8的氨基酸序列；

LCDR 3包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

2.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含与选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求2的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变结构域包含选自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。

4.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列。

5.根据权利要求4的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变结构域包含SEQID NO: 11的氨基酸序列。

6.根据权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：

1)重链，所述重链具有与选自SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ IDNO: 27的序列至少90%相同的氨基酸序列；

2)轻链，所述轻链具有与SEQ ID NO: 29的序列至少90%相同的氨基酸序列。

7.根据权利要求6的单克隆抗体，其包含：

1)重链，所述重链包含选自SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ IDNO: 27的氨基酸序列；

2)轻链，所述轻链包含SEQ ID NO: 29的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7中任一项的单克隆抗体，其中所述抗体是全长IgG抗体。

9.根据权利要求8的单克隆抗体，其中所述抗体涉及选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的人同种型。

10.核酸，所述核酸编码根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段，其特异性地结合人T细胞受体的TRBV9家族β链区域。

11.包含根据权利要求10的核酸的表达载体。

12.得到宿主细胞以生产根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，包括用根据权利要求11的载体转化所述细胞，所述载体包含根据权利要求10的核酸。

13.用于得到根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，其包含根据权利要求10的核酸。

14.得到根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于在确保生产指定抗体的条件下在培养基中培养根据权利要求13的宿主细胞，继之以分离和纯化得到的抗体。

15.用于预防或治疗由人T细胞受体的TRBV9家族β链区域介导的疾病或病症的药物组合物，其包含与一种或几种药学上可接受的赋形剂组合的有效量的根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段。

16.根据权利要求15的药物组合物，其中所述特定疾病或病症选自强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

17.用于预防或治疗由携带TRBV9家族β链的人T细胞受体介导的疾病或病症的药物组合物，其包含有效量的根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段和有效量的至少一种其它的治疗活性化合物。

18.根据权利要求17的药物组合物，其中所述特定疾病或病症选自强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

19.根据权利要求17-18中任一项的药物组合物，其中所述另一种治疗活性化合物选自小分子、抗体或类固醇激素。

20.用于在需要这种抑制的主体中抑制T细胞受体的生物活性的方法，所述T细胞受体的β链涉及TRBV9家族，所述方法包括给所述主体施用有效量的根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段。

21.用于治疗由携带TRBV9家族β链的人T细胞受体介导的疾病或病症的方法，所述方法包括以治疗有效量给需要这种治疗的主体施用根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求15的药物组合物。

22.根据权利要求21的治疗疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症选自强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

23.根据权利要求1-9中任一项的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求15的药物组合物用于在需要这种治疗的主体中治疗由携带TRBV9家族β链的人T细胞受体介导的疾病或病症的用途。

24.根据权利要求23的用途，其中所述疾病选自强直性脊柱炎、乳糜泻、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤。

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