KR102211177B1 - 종양 표적치료용 인터루킨-15 융합 단백질 - Google Patents

종양 표적치료용 인터루킨-15 융합 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명이 제공하는 종양 표적 융합 단백질은 적어도 (i)IL-15 폴리펩타이드, IL-15 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편(functional fragment), (ii)IL-15Rα 폴리펩타이드, IL-15Rα 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편, (iii) Fc 도메인, Fc 변이체, 또는 그 기능성 단편, 및 (iv) RGD 폴리펩타이드 또는 그 변이체를 포함한다. 상기 융합 단백질의 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드-Fc 도메인-IL-15 폴리펩타이드-IL-15Rα 폴리펩타이드인 것이 바람직하다. 상기 종양 표적 융합 단백질은 한편으로는 IL-15의 항종양 효과를 향상시킬 수 있고, 다른 한편으로는 IL-15의 짧은 반감기 문제를 극복함과 동시에 종양 부위를 표적으로 삼아 종양 세포에 집중적으로 작용할 수 있다. 이밖에, 이러한 종양 표적 단백질은 고효율로 발현 및 정제될 수 있으며, 이와 동시에 고효율의 항종양 활성을 지니고, 면역 종양 억제요법 약물로서의 잠재력을 지닌다.

Description

종양 표적치료용 인터루킨-15 융합 단백질
본 발명은 사이토카인 인터루킨-15의 종양 표적 치료에의 응용에 관한 것으로서, 구체적으로는 인터루킨-15 융합 단백질의 항종양 작용에 관한 것이다.
사이토카인은 항종양 면역 반응을 포함하는 인체의 면역 시스템 조절에 있어서 중요한 역할을 하며, 일부 사이토카인은 이미 항종양 잠재력을 갖는 것으로 증명되었다. 인터루킨-15(IL-15)는 유망한 항종양 후보 약물로서 이미 광범위하게 연구되고 있다. IL-15와 IL-2는 수용체(IL-2/15βγ)의 β와 γ쇄를 함께 사용하나, 단 상이한 α수용체 사슬(IL-2Rα/IL-15Rα)에 결합된다. IL-15의 작용은 주로 다른 쪽 발현(trans-presentation) 모드를 통해 나타나며, 그 중 IL-15는 항원 제시(antigen presentation) 세포 표면에 발현되는 IL-15Rα와 결합된 후, 근접 효과 세포 표면의 IL-15βγ 복합물에 결합되고, 최종적으로 이펙터 세포를 활성화시킨다. IL-2와 유사하게, IL-15는 T세포와 자연 살생(NK) 세포의 증식을 촉진시키고, 세포독성 T세포의 증가와 NK 세포의 활성화를 촉진시킬 수 있다. 이와 동시에, IL-2와 다른 점은, IL-15는 활성화로 유도된 세포의 사망을 초래하지 않고, 조절성 T세포의 기능 유지에도 참여하지 않는다는데 있다. 따라서 IL-15는 미국 국립암 협회에 의해 가장 잠재력을 지닌 암 면역 치료 약물 명단의 1위에 올랐다.
그러나, IL-15에도 여전히 어느 정도의 단점이 존재한다. 먼저, 연구를 통해, 고용량의 IL-15를 투여해야만 체내 조건하에서 항종양 효과를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌고, 그 다음, IL-15의 다른 단점은 반감기가 비교적 짧다는데 있다. 마지막으로 IL-15의 작용은 종양 특이성이 아니라 전신성이라는 점이다. 세포 독성 T세포 또는 NK 세포는 IL-15의 자극에 의해 증가하나, 단 이러한 효과는 결코 종양 부위에 국한되지 않고 전신성으로 분포된다. 면역 시스템의 광범위한 활성은 흔히 치명적이며, 따라서 보다 이상적인 치료 약물은 종양 부위에 표적성으로 작용해야 함과 동시에 정상적인 조직에는 영향을 미치지 않아야 한다.
본 발명은 한편으로는 IL-15의 종양 억제 효과를 향상시킬 수 있고, 다른 한편으로는 IL-15의 짧은 반감기 문제를 극복함과 동시에 종양 부위를 표적으로 삼아 종양 세포에 집중적으로 작용할 수 있는 종양 표적 융합 단백질을 제공하고자 한다.
본 발명이 제공하는 종양 표적 융합 단백질은 적어도 (i)IL-15 폴리펩타이드, IL-15 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편(functional fragment), (ii)IL-15Rα 폴리펩타이드, IL-15Rα 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편, (iii) Fc 도메인, Fc 변이체, 또는 그 기능성 단편, 및 (iv) RGD 폴리펩타이드 또는 그 변이체를 포함한다.
일 실시방식에서, 상기 융합 단백질의 각 성분의 배열 순서는 RGD-Fc-IL-15-IL-15Rα이다.
본 발명의 일 실시방식에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 HC2와 CH3으로 구성되고, SEQ ID NO.1의 서열, 또는 SEQ ID NO.1의 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 상기 Fc 도메인과 동일한 기능을 갖는 유도 서열을 구비한다.
일 실시방식에서, IL-15Rα는 IL-15Rα sushi 도메인 및 엑손(exon) 3 이후의 12개의 아미노산으로 구성되며, SEQ ID No.2의 서열, 또는 SEQ ID No.2의 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 IL-15Rα 도메인과 동일한 기능을 갖는 유도 서열을 구비한다.
일 실시방식에서, IL-15는 SEQ ID No.3의 서열, 또는 SEQ ID No.3의 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 IL-15 도메인과 동일한 기능을 갖는 유도 서열을 구비한다.
일 실시방식에서, RGD 폴리펩타이드는 SEQ ID No.4의 서열, 또는 SEQ ID No.4의 서열 중 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 RGD 폴리펩타이드와 동일한 기능을 갖는 유도 서열을 구비한다.
바람직한 실시방식에서, 상기 종양 표적 융합 단백질의 아미노산 서열은, (a) SEQ ID NO.5의 서열; (b) SEQ ID NO.6의 핵산 서열로 인코딩된 아미노산 서열; (c) SEQ ID NO.6의 서열의 축중 서열(degenerate sequence)로 인코딩된 아미노산 서열; 및 (d) SEQ ID NO.5의 서열에서 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 상기 융합 단백질과 동일한 기능을 갖는 유도 서열로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 종양 표적 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는 약물 조성물을 제공하며, 상기 첨가제는 담체, 안정제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 종양 표적 융합 단백질 및 또 다른 항암제를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시방식에서, 상기 종양은 인테그린 양성 종양, 특히 악성 흑색종, 난소암 등과 같은 αVβ3 인테그린 양성 종양이다. 일 실시방식에서, 상기 종양은 진행성 종양, 말기 종양, 높은 종양 부하/부담을 갖는 종양, 또는 전이성 종양이다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 종양 표적 융합 단백질의 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 또는 상기 발현 벡터로 변화(transformation)되거나 또는 형질주입(transfection)된 숙주를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 종양 표적 융합 단백질, 본 발명의 상기 종양 표적 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 또는 상기 발현 벡터로 변화되거나 또는 형질주입된 숙주를 포함하는 키트를 더 제공한다.
본 발명은 한편으로는 IL-15의 항종양 효과를 향상시킬 수 있고, 다른 한편으로는 IL-15의 짧은 반감기 문제를 극복함과 동시에 종양 부위를 표적으로 삼아 종양 세포에 집중적으로 작용할 수 있는 종양 표적 융합 단백질을 제공한다. 이밖에, 이러한 종양 표적 단백질은 고효율로 발현 및 정제될 수 있으며, 이와 동시에 고효율의 항종양 활성을 지니고, 면역 종양 억제요법 약물로서의 잠재력을 지닌다.
도 1은 본 발명의 종양 표적 융합 단백질의 일 실시방식(PFC-1)의 단백질 구조도이다. SP: 신호 펩타이드, RGD: 아르기닌, 글리신-아스파르트산 펩타이드 모티프; Fc: 인간 IgG1의 CH2와 CH3; IL-15Rα: IL-15Rα sushi 도메인+엑손3의 이후 12개의 아미노산; L1: SS; L2: G4S; L4: SG2SG4SG3SG4SLQ.
도 2는 융합 단백질 PFC-1을 비환원(NR) 또는 환원(R) 조건하에서 10%의 SDS-PAGE 전기영동으로 전개하여 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색한 도면이다.
도 3은 PFC-1과 rhIL-15의 mo7e 세포에 대한 증식 자극 실험을 나타낸 것이다. PFC-1의 몰농도는 모노머 분자량으로 계산하였다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차를 나타내며, 실험결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 4는 PFC-1과 rhIL-15의 CTLL-2 세포에 대한 증식 자극 실험을 나타낸 것이다. PFC-1의 몰농도는 모노머 분자량으로 계산하였다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차를 나타낸 것이고, 실험결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 5는 융합 단백질 PFC-1의 PBMC에 대한 체외 증식 자극을 나타낸 것이다. PBMC 세포는 CFSE로 표기 후, 각종 농도의 rhIL-15 또는 PFC-1과 함께 6일 동안 배양하고, 이후 유동 세포 기술을 통해 세포 증식 정도를 평가하였다. A: 대표적인 유동 세포 기술 실험 결과도이다. B: PBMC 세포 증식률이며, 실험 결과는 평균값 가감 표준차를 나타내고, 실험 결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 6은 유동 세포 기술로 융합 단백질 PFC-1의 HUVEC 세포계에 대한 결합 작용을 분석한 것이다. 실험 결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 7은 유동 세포 기술로 융합 단백질 PFC-1의 SKOV-3 종양 세포계에 대한 결합 작용을 분석한 것이다. 실험 결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 8은 유동 세포 기술로 융합 단백질 PFC-1의 LS74T 종양 세포계에 대한 결합 작용을 분석한 것이다. 실험 결과는 적어도 3회 독립 실험을 대표한다.
도 9는 레이저 공초점 현미경 기술로 HUVEC 세포 및 SKOV3 종양 세포 모델에서 융합 단백질 PFC-1과 항 인간 CD51/61(αVβ3 인테그린) 항체의 공동위치화를 분석한 결과이다.
도 10은 융합 단백질 PFC-1의 마우스 체내 항종양 작용을 나타낸 것이다. 등 부위의 피하에 B16F10 마우스 흑색종 종양이 접종된 마우스는 종양이 100mm3 부피만큼 자란 후, 3일마다 5 또는 20㎍의 PFC-1을 복강주사하여 치료하거나, 또는 200㎕의 PBS를 투여하였다. 총 2회 약물 주사를 투여하고 상응하는 종양 부피를 측정하였다. 측정 결과는 평균값 가감 표준차이며, 그룹당 5~8마리의 마우스를 포함한다. T-검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였으며, **는 p<0.01을 나타낸다.
도 11은 융합 단백질 PFC-1의 마우스 체내 항종양 작용을 나타낸 것이다. 등 부위의 피하에 B16F10 마우스 흑색종 종양이 접종된 마우스는 종양이 1000mm3 부피만큼 자란 후, 지정된 일자에 10㎍의 PFC-1을 꼬리정맥에 주사하여 치료하거나, 또는 200㎕의 PBS를 투여하였다. 총 3회 약물 주사를 투여하고 상응하는 종양 부피를 측정하였다. 측정 결과는 평균값 가감 표준차이며, 그룹당 5~8마리의 마우스를 포함한다. T-검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였으며, **는 p<0.01을 나타낸다.
도 12는 유동 세포 기술로 도 10 중의 실험 마우스가 PFC-1 치료를 받은 후 체내의 CD8+T 세포 표현형의 변화를 분석한 것이다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차이며, 그룹당 5~8마리의 마우스를 포함한다. T-검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였으며, **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.005를 나타낸다.
도 13은 유동 세포 기술로 도 10 중의 실험 마우스가 PFC-1 치료를 받은 후 체내의 NK 세포 표현형의 변화를 분석한 것이다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차이며, 그룹당 5~8마리의 마우스를 포함한다. T-검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였으며, **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.005를 나타낸다.
도 14는 유동 세포 기술로 도 10 중의 실험 마우스가 PFC-1 치료를 받은 후 체내의 CD8+T 세포와 NK 세포 표면의 CD44 항원 표현형의 변화를 분석하여, 세포 활성화 비율을 분석한 것이다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차이며, 그룹당 5~8마리의 마우스를 포함한다. T-검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였으며, **는 p<0.01을 나타내고, ***는 p<0.005를 나타낸다.
도 15는 융합 단백질 PFC-1의 C57BL/6 마우스 체내 항종양 악성 전이 실험 결과를 나타낸 것이다. C57BL/6 마우스는 day0에 꼬리정맥을 통해 5*105의 B16F10 흑색종 종양 세포를 주사하고, 같은 날 꼬리정맥 주사를 통해 10㎍의 PFC-1 또는 200㎕ 등부피의 PBS를 투여하였다. 21일째에, 마우스를 안락사시키고 폐부를 적출하여 쌍안 현미경으로 폐부 동종양의 상황과 수량을 검사하였다. 상부 도면은 대표적인 마우스 폐부 사진이다. Mock: 종양 세포 주사를 접종하지 않은 마우스의 폐부; vehicle: 종양 세포 주사를 접종한 대조그룹; PFC-1: PFC-1 주사 치료 그룹이다. 실험 결과는 평균값 가감 표준차이고, 그룹당 5마리의 마우스를 포함한다. T 검정을 통해 실험 데이터의 통계적 유의성을 분석하였다.
본 발명에서, "융합 단백질", "PFC-1", "PFC-1 재조합 융합 단백질" 또는 "융합 분자"는 호환 사용이 가능하며, 이들은 생물 활성 폴리펩타이드를 지칭하는 것으로, 통상적으로는 재조합, 화학 또는 기타 적합한 방법을 통해 함께 공유결합 연결(즉 융합)되는 단백질 또는 펩타이드 서열이다. 융합 단백질은 링커(linker) 서열을 통해 하나 또는 다수의 부위에서 기타 펩타이드 또는 단백질 서열과 융합될 수 있다. 또는, 링커 서열은 융합 분자의 구축을 돕는데 사용될 수 있다. 융합 단백질은 단합체(monomer) 또는 다합체(multimer)(예를 들어 이합체)의 형식으로 존재할 수 있다.
본 발명에서, "융합 단백질"은 적어도 (i)IL-15 폴리펩타이드, IL-15 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편(functional fragment), (ii)IL-15Rα 폴리펩타이드, IL-15Rα 폴리펩타이드 변이체, 또는 그 기능성 단편, (iii) Fc 도메인, Fc 변이체, 또는 그 기능성 단편, 및 (iv) RGD 폴리펩타이드 또는 그 변이체를 포함한다. 상기 융합 단백질에서, 성분 (i), (ii)는 이펙터 모듈 또는 이펙터 분자를 함께 구성하며, 이펙터 세포(세포 독성 T세포, NK 세포)의 활성화를 야기할 수 있다.성분 (iii)은 IL-15의 순환 반감기를 연장시키기 위한 것이며, 성분 (iv)는 표적 분자로서, 고친화성과 특이성으로 종양 세표 표면에 발현되는 수용체 분자에 작용하여, 융합 단백질의 기타 부분을 종양 병소에 농축시킴으로써 종양 세포를 사멸시킨다.
본 발명에서, 융합 단백질 중의 각 성분은 합리적인 순서로 배열되어 융합 단백질이 전반적으로 본 발명의 희망하는 목적을 구현할 수 있도록 하였다. 일 실시방식에서, 상기 융합 단백질 중 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드-Fc 도메인-IL-15 폴리펩타이드-IL-15Rα 폴리펩타이드이다. 또 다른 실시방식에서, 상기 융합 단백질 중 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드-Fc 도메인-IL-15Rα 폴리펩타이드-IL-15 폴리펩타이드이다. 또 다른 실시방식에서, 상기 융합 단백질의 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드-IL-15Rα 폴리펩타이드-IL-15 폴리펩타이드-Fc 도메인이다. 또 다른 실시방식에서, 상기 융합 단백질의 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드-IL-15 폴리펩타이드-IL-15Rα 폴리펩타이드-Fc 도메인이다. 본 분야의 기술자라면 유전자 공학 기술 및 관련 기술을 통해 상이한 순서로 구성되는 상기 융합 단백질을 획득하고 그 생물학적 기능을 검증할 수 있으며, 창조적인 노동을 할 필요가 없다.
Fc 도메인
"Fc 도메인" 또는 "Fc 단편(fragment)"이란 면역글로불린 중쇄의 "결정화 가능 단편" 영역을 말한다. 일반적으로, Fc 도메인은 다른 Fc 도메인과 상호작용하여 이합체 복합물을 형성할 수 있다. Fc 도메인은 세포 표면 수용체(Fc 수용체) 및/또는 보체시스템의 단백질에 결합되거나, 또는 수정되어(modified) 이러한 결합 활성을 약화시키거나 또는 강화시킬 수 있다. Fc 도메인은 IgG, IgA, IgD, IgM 또는 IgE 항체로부터 유래되어, 옵소닌 작용, 세포 용해, 비만 세포 탈과립 등 기타 Fc 수용체 의존성 프로세스와 같은 면역 기능을 발생시킬 수 있다.
IgG 유형의 면역글로불린은 인간의 혈액 중 함량이 가장 풍부한 단백질 중의 하나로서, 그 순환 반감기는 21일에 달할 수 있다. IgG의 Fc 영역이 다른 단백질의 도메인과 결합된다는 것은 보고된 적이 있다. 원형 융합 단백질은 IgG의 Fc 경첩 영역 중의 시스테인 잔기를 통해 연결되는 호모다이머 단백질로서, 형성되는 분자는 중쇄 가변 영역, CH1 도메인과 경쇄가 없는 IgG 분자와 유사하다. Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 이합체 성질은 기타 분자에 결합되기에 유리할 가능성이 있다(예를 들어 2가 또는 이중특이성 결합). 구조상의 상동성으로 인해, Fc 융합 단백질은 유사 동종형을 갖는 인간 IgG에 상당하는 체내 약물대사 동력학 곡선을 나타낸다. IL-15 또는 IL-15 융합 단백질의 순환 반감기를 연장시키기 위하여, 본 발명은 IL-15/IL-15Rα 복합물을 인간 IgG 단백질 중쇄의 Fc 부분에 연결시켰다.
천연 Fc의 원시 면역글로불린은 인간 면역글로불린에서 유래되는 것이 바람직하며, IgG1 및 IgG2인 것이 바람직하다. 본 발명에서, Fc 도메인은 인간 IgG1의 CH2 및 CH3로 구성되는 것이 바람직하다.
일부 실시방식에서, "Fc 변이체"란 천연 Fc에 의해 변형(modification)되나 여전히 Fc 수용체와 결합될 수 있는 분자 또는 서열을 말한다. "Fc 변이체"는 비인간 천연 Fc가 인간화를 거친 분자 또는 서열을 포함한다. 이밖에, 모종의 구조적 특징 또는 생물 활성은 본 발명인 융합 분자가 필요로 하는 것이 아니므로, 천연 Fc의 약간의 부위는 제거될 수 있다. 따라서, 일부 실시방식에서, "Fc 변이체"는 하나 또는 다수의 천연 Fc 부위 또는 잔기가 결핍된 분자 또는 서열을 포함한다. "Fc 도메인"은 상기와 같은 천연 Fc 및 Fc 변이체의 분자 또는 서열을 포함하며, 이는 단합체 형식 또는 다합체 형식의 분자를 포함하고, 완전한 항체로부터 분해되어 획득되거나, 또는 유전자 재조합 발현을 통해 획득되거나 또는 기타 수단을 통해 획득될 수 있다.
RGD 폴리펩타이드
세포 부착 서열로서의 아르기닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp, RGD) 폴리펩타이드는 Pierschbacher 및 Rouslahti가 1984년에 FN에서 발견한 것으로서, 이들은 RGD 폴리펩타이드가 인테그린(intergrin) α5β1을 친화성 컬럼으로부터 용리시켜, 기질 재료에 고정된 후 세포에 부착되도록 할 수 있음을 발견하였다. 이후, 계속해서 세포외 기질 중 많은 당단백질(예를 들어 LM), 콜라겐, 피브리노겐(Fb) 등에 모두 고도로 보수적인 RGD 폴리펩타이드가 함유되어 있음이 발견되었고, RGD 폴리펩타이드가 세포와 세포, 세포와 세포외 기질 단백질의 상호작용을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 발휘한다는 것이 증명되었다.
RGD 폴리펩타이드와 세포의 결합은 세포 표면의 인테그린과의 결합이기도 하다. 인테그린은 20세기 90년대 중기에 발견되었으며, Ca2 + 의존성 세포 표면 수용체 가족으로서, 각각의 인테그린마다 α서브유닛과 β서브유닛인 2개의 서브유닛을 포함한다. 지금까지 18종의 α서브유닛과 8종의 β서브유닛이 발견되었으며, 24종의 인테그린을 구성한다. RGD 폴리펩타이드를 식별할 수 있으면서 그것과 결합될 수 있는 인테그린 수용체는 α3β1, α5β1, αIIbβ3, α5β1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8 등이 있으며, 특히 αvβ3 인테그린에 대해 대단히 강한 선택성과 친화성을 구비한다. αvβ3 인테그린은 다양한 종양세포 및 종양과 관련된 혈관에서 생성되는 내피세포에서 고도의 과발현이 나타난다.
본 발명은 약물을 RGD 폴리펩타이드와 결합(coupling) 또는 융합시키고, RGD 폴리펩타이드를 이용하여 융합된 단백질 거대분자 약물이 종양 조직부위에 선택적으로 농축되도록 유도함으로써, 국부 농도를 증가시켜 종양 살상 작용을 강화시키고 전신성 독성을 제한한다.
단순한 RGD 트리펩타이드는 생물 활성이 매우 낮으며, RGD 트리펩타이드와 연결되는 제4위치의 아미노산이 RGD 트리펩타이드의 활성에 미치는 영향이 매우 크고, RGD 트리펩타이드와 연결되는 제5위치의 아미노산 역시 펩타이드의 결합 특이성(binding specificity)에 대해 중요한 역할을 한다. 기존의 연구에서, RGD 트리펩타이드의 선단에 잔기를 추가할 경우 세포의 부착에 영향을 미치지 않으나, 예를 들어 RGD 트리펩타이드와 GRGD 테트라펩타이드는 세포 부착력에 뚜렷한 영향을 미치지 않으나, 단 C 말단에 아미노산의 참여를 추가할 경우 그것과 세포의 부착에 영향을 미칠 수 있으며, 예를 들어 RGD의 아스파르트산 이후에 세린 잔기가 있는 경우 그 세포 부착 작용이 강화되고, 우선성 잔기로 좌선성 잔기를 대체할 경우 세포 부착력이 낮아지게 된다는 것이 증명되었다.
본 발명의 일 실시방식에서, RGD 폴리펩타이드 서열은 ACDCRGDCFCG, 즉 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly이며, 제5 내지 제7번째 아미노산 위치에 RGD 모티프(motif)를 포함한다.
본 발명에서, RGD 변이체란 본 발명의 RGD 폴리펩타이드 서열과 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 가리키며, 단 여전히 RGD의 인테그린 수용체 결합 기능을 유지할 수 있다. 본 분야의 기술자라면 본 발명이 제공하는 가르침 및 종래 기술을 근거로 기타 본 발명의 목적을 만족시키는 하나 또는 다수의 RGD 폴리펩타이드 변이체를 설계할 수 있을 것이다. 예시적인 RGD 변이체는 GRGD, GRGDSPC, GRGDDSY, EPRGDNYR 등을 포함한다.
링커(linker) 서열
본 발명의 융합 단백질은 각 성분 사이에 위치하는 링커 서열을 더 포함하며, 통상적으로는 4-20개의 아미노산으로 구성되는 짧은 펩타이드이다. 이러한 링커 서열은 각 성분 사이를 합리적으로 위치시킴으로써 각 성분의 기능 활성을 구현한다.
일부 실시방식에서, 본 발명의 융합 단백질 중, IL-15 폴리펩타이드는 링커 서열을 통해 IL-15Rα 폴리펩타이드에 공유결합 연결됨으로써, IL-15와 IL-15α 도메인이 상호작용하여 복합물을 형성하도록 할 수 있다. 모종의 실시방식에서, IL-15와 IL-15Rα 도메인의 위치 결정은 이들과 면역세포와의 사이가 상호작용하도록 함으로써, 면역반응을 일으키거나 또는 억제하고, 또는 세포 발육을 억제하거나 자극할 수 있다.
일부 실시방식에서, 본 발명의 융합 단백질 중, IL-15 또는 IL-15Rα 도메인은 링커 서열을 통해 면역글로불린 Fc 도메인에 공유결합 연결된다. 상기 링커 서열은 Fc 도메인, IL-15 또는 IL-15Rα 도메인을 합리적으로 위치시켜 각 도메인의 기능 활성이 발휘되도록 해야 한다. 모종의 실시방식에서, Fc 도메인을 효과적으로 위치시킴으로써, 적당한 융합 단백질 복합물을 형성하고 상기 융합 단백질 복합물이 체내에서 연장된 반감기를 가지도록 할 수 있다.
일부 실시방식에서, 본 발명의 융합 단백질 중, RGD 폴리펩타이드는 링커 서열을 통해 Fc 도메인에 공유결합 연결된다. 상기 링커 서열은 RGD 폴리펩타이드와 Fc 도메인을 합리적으로 위치시킴으로써 각 도메인의 기능 활성이 발휘되도록 해야 한다. 모종의 실시방식에서, RGD 폴리펩타이드를 유효하게 위치시킴으로써, 고친화성과 특이성으로 종양세포 표면의 인테그린 분자에 결합되도록 할 수 있다.
바람직하게는, 링커 서열은 2 내지 20개의 아미노산 서열을 포함하며, 5 내지 20개의 아미노산을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 링커 서열은 이펙트 분자 또는 폴리펩타이드를 하나의 원치 않는 형태(conformation)로 제한하지 않는 플렉시블 링커 서열인 것이 바람직하다. 링커 서열은 예를 들어 식별 위치를 융합 단백질과 이격시키는데 사용될 수 있다. 링커 서열은 글리신, 알라닌 및 세린과 같이 주로 작은 측쇄를 갖는 아미노산으로 구성되며, 따라서 상기 유연성(flexiblity)을 제공한다. 링커 서열의 약 80 이상 또는 그보다 많은 비율의 아미노산이 글리신, 알라닌 또는 세린 잔기이고, 특히 글리신과 세린 잔기인 것이 바람직하다. 적합한 링커 서열의 예로는 GGGGS(G4S), 즉 Gly Gly Gly Gly Ser이며, 예를 들어 본 발명 중의 RGD 폴리펩타이드와 Fc 도메인, 및 Fc 도메인과 IL-15Rα 폴리펩타이드를 연결하는데 사용되거나; 또는 SG2SG4SG3SG4SLQ, 즉 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln이며, 예를 들어 본 발명 중의 IL-15와 IL-15Rα 도메인을 연결하는데 사용된다. 또한 이미 성공적으로 상이한 항체 가변 영역을 연결하는데 사용되는 다양한 플렉시블 링커 설계를 포함하는 기타 상이한 링커 서열을 사용할 수도 있다. 링커 서열의 크기와 서열 구성은 통상적인 컴퓨터 모델링 및 기술을 통해 결정할 수 있다.
본 발명에서, "폴리펩타이드"란 기본적으로 20종의 천연 아미노산 중의 임의의 몇 가지로 구성되는 임의의 길이를 갖는 중합체를 말한다. 비록 "단백질" 또는 "단백"이 통상적으로 아미노산 길이가 비교적 긴 중합체를 가리키고, "펩타이드"는 통상적으로 아미노산 길이가 비교적 짧은 중합체를 가리키나, 이 두 용어 사이에는 통상적으로 뚜렷한 경계가 없으며, 또한 흔히 범위 면에서 중첩된다. "폴리펩타이드 변이체"는 통상적으로 대조 폴리펩타이드와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 가지나, 단 여전히 폴리펩타이드의 생물학적 기능을 유지할 수 있는 아미노산 서열을 말한다.
본 발명에서, "벡터"는 숙주 세포 중에서 자주적으로 복제할 수 있으면서 외래 DNA를 수용할 수 있는 핵산분자이다. 벡터는 그 자신의 복제 시작위치를 가지며, 외래 DNA의 제한성 엔도뉴클레아제 식별위치, 및 통상적인 선택성 마커(예를 들어 항생물질 내성을 인코딩한 유전자 )를 삽입하는데 사용될 수 있고, 흔히 삽입된 DNA를 발현하기 위한 식별 서열(예를 들어 촉진자(promoter)와 증폭자(enhancer))을 더 포함한다. 통상적인 벡터는 플라즈마 벡터와 파지 벡터(phage vector)를 포함한다.
시약 및 재료
항체: 재조합 인간 IL-2(AF-200-02)와 과립대식세포 집락 자극인자(300-03)는 Peprotech사로부터 구입하였고, 재조합 인간 IL-15(247-IL-105)는 R&D systems사로부터 구입하였다.
항MsCD3e(145-2C11)-PerCP, 항MsCD8a(53-6.7)-FITC, 항MsNK1.1(PK136)-FITC, 항MsCD44(IM7)-PE 및 항MsCD122(TM-Btal)-PE는 각각 BD Pharmingen에서 구입하였고, 항 인간 CD51/61(αVβ3 인테그린) 정제 모노클론 항체는 eBioscience로부터 구입하였다. 염소 항-인간 IgG(H+L)-AlexaFluor 488과 염소 항-마우스 IgG(H+L)-AlexaFluor 488, 647은 Invitrogen으로부터 구입하였다.
세포계(cell line)와 실험동물: SKOV-3, CTLL-2 및 Mo7e 세포는 상하이 셀뱅크로부터 제공받았고, HUVEC 세포는 쓰촨 대학 까오훼이위에(高會樂) 박사가 아낌없이 증정하였다.
CTLL-2 세포는 20%의 소태아혈청(FBS)의 RPMI 1640 배지에서 배양함과 동시에, 30ng/ml의 IL-2와 1%의 비필수 아미노산을 첨가하였다. Mo7e 세포는 10%의 소태아혈청(FBS)의 RPMI1640 배지에서 배양함과 동시에, 10ng/ml의 GM-CSF, 및 1%의 비필수 아미노산을 첨가하였다. SKOV-3와 HUVEC 세포는 모두 10%의 FBS의 DMEM 배지에서 배양하였다.
PBMC는 건강한 지원자의 혈액으로부터 Ficoll 원심분리법을 이용하여 추출하고, 세포는 10%의 FBS의 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. C57BL/6 마우스는 중산대학 동물실험센터로부터 구입하였다. 인체의 혈액 수집과 동물 실험은 모두 학교 관리부서의 윤리심사와 동의를 거쳤다.
융합 단백질의 발현과 정제
일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 제조는 본 발명이 공개한 절차와 재조합 DNA 기술, 예를 들어 PCR, 플라즈마 DNA 추출, DNA의 제한 엔도뉴클레아제의 소화, DNA 연결, mRNA 분리, DNA를 적합한 세포에 도입, 숙주 세포의 변화(transformation) 또는 형질주입(transfection), 숙주 세포의 배양 등을 통해 제조된다. 이밖에, 융합 단백질은 적당한 시약 및 전기영동, 원심분리, 크로마토그래피 방법 등과 같은 숙지하는 방법을 이용하여 분리 및 정제될 수 있다.
PFC-1 재조합 융합 단백질의 유전자 서열은 마우스의 k쇄의 신호 펩타이드를 함유한 pcDNA3.1 벡터로 클로닝하였다. 일시적 주입(transient transfection) 기술을 이용하여 발현 벡터를 293 세포에 주입하여 발현하였으며, 일시적 주입 후의 세포는 100ml의 세포 배지에서 3일 동안 배양한 후 세포를 수집하고 Protein-A 아가로오스 친화 정제법을 이용하여 정제시킴으로써 재조합 융합 단백질을 획득하였다.
융합 단백질 PFC-1의 구조는 도 1에 도시된 바와 같이, 주로 IL15/IL15Rα 복합물, Fc 도메인, 및 RGD 폴리펩타이드의 3개의 모듈로 구성된다. 모듈 사이를 GGGGS의 짧은 펩타이드로 연결함과 동시에, 단백질의 C 말단에 His-tag 라벨을 추가하였다(도 1). DNA 서열을 pcDNA3.1(+) 벡터 중에 서브클로닝시키고, 일시적 주입을 통해 벡터를 HEK293 세포로 주입하여 발현시켰다.
환원성 SDS-PAGE 전기영동도(도 2) 중의 60kDa 부위에서 단일한 밴드(band)를 관찰할 수 있으며; 비환원성 SDS-PAGE 전기영동도 중, 약 120kDa 부위에서 한 가닥의 주요 밴드를 관찰할 수 있고, 동시에 약 60kDa 부위에서 부차적인 밴드를 관찰할 수 있다. 실험 결과, 포유동물의 세포 발현과 친화성 정제를 통해, 우리는 단일한 균질의 PFC-1 융합 단백질을 획득하였고, 또한 절대다수의 PFC-1 단백질이 이합체 형식으로 존재한다는 것이 밝혀졌다.
사이토카인 의존성 세포 증식 실험
사이토카인 의존성 세포 증식 실험에서, 대수생장기에 처한 CTLL-2와 Mo7e 세포를 수확한 후, PBS로 2회 세척하고, 검출 배지에서 4시간 동안 배양하여(10%의 FBS, 1%의 NEAA가 보충된 RPMI 1640 배지), 실험 세포가 사이토카인 기아 상태에 이르게 하였다. 측정 배지에서 IL-15와 PFC-1을 종농도가 10nM이 되도록 희석하여 단계적 희석(gradient dilution)을 실시하였다. IL-15 또는 PFC-1이 첨가된 CTLL-2 또는 Mo7e 세포를 48 또는 72시간 동안 계속 배양하고, 마지막으로 CCK-8 시약을 사용하여 생세포의 수량을 측정하고 세포 증식 비율을 계산하였다.
CTLL-2는 마우스 세포 독성 T 임파세포계로서, IL-15Rα쇄 및 IL-15βγ 복합물의 양성 발현이며; Mo7e는 인간 거핵세포 백혈병 세포계로서, IL-15βγ 복합물의 단일한 양성 발현이다. 이 두 가지 세포는 모두 사이토카인에 의존하여 세포 증식을 자극하며, 따라서 융합 단백질 PFC-1의 IL-15 복합물의 사이토카인 기능을 분석하는데 사용될 수 있다. IL-15의 효과와 유사하게, PFC-1은 체외 실험에서 Mo7e와 CTLL-2 세포계의 증식을 뚜렷하게 자극할 수 있으며(도 3 및 4), 이는 정제로 획득된 PFC-1 융합 단백질이 사이토카인 활성을 지닌다는 것을 나타낸다.
Mo7e 세포의 경우, rhIL-15는 PFC-1보다 약간 높은 사이토카인 활성을 나타내나, 단 사이토카인 농도가 증가함에 따라, 두 가지 단백질 간의 사이토카인 활성 차이가 축소되기 시작하며, 10nM 농도에서 두 단백질 사이는 거의 차이가 없다(도 3). CTLL-2 세포의 경우, PFC-1의 사이토카인 활성은 대략 rhIL-15의 2 내지 4배이다(도 4).
PBMC 증식 실험
PBMC를 2×106 세포/ml의 단세포 현탁액으로 조정하고, 5μM의 CFSE(eBioscience 사)로 염색하였다. CFSE 염색 후의 PBMC를 5×105 세포/ml로 조정하고, 종농도가 1nM 또는 10nM인 재조합 인간 IL-15 또는 PFC-1의 자극 하에 각각 6일 동안 배양하였다. Cytomic FC500(Beckman Coulter사) 유동 세포 분석기를 이용하여 데이터를 수집하고, Kaluza 소프트웨어(Beckman Coulter사)로 데이터 분석을 실시하였다.
PFC-1의 인간유래 면역세포에 대한 사이토카인 활성을 검출하기 위하여, PBMC를 CFSE로 염색한 후 체외에서 rhIL-15 또는 PFC-1과 공동으로 6일 동안 배양하였다. 1nm 또는 10nM의 농도 하에, rhIL-15와 PFC-1은 모두 PBMC의 증식을 뚜렷하게 자극할 수 있었다(도 5). 그러나, Mo7e와 CTLL-2 사이토카인 의존성 증식 실험 결과와 다른 점은, PFC-1이 PBMC 증식 실험에서 rhIL-15보다 10배 높은 사이토카인 활성을 나타낸다는데 있다. 10nM의 rhIL-15 평균 증식률은 20.71%이고, 1nm의 PFC-1은 22.05%이며(도 5), 이는 PFC-1 중 IL-15/IL-15Rα 복합물이 rhIL-15보다 높은 생물 활성을 지니기 때문일 것이다.
PFC-1과 인테그린의 공동위치화(co-localization)
문헌에 따르면, HUVEC 또는 난소암 세포계 SKOV3은 αVβ3 인테그린의 고발현 세포계임을 알 수 있다. 동시에, 유동 세포 분석기술은 HUVEC(도 6) 또는 난소암 세포 SKOV3(도 7)을 막론하고 모두 αVβ3 인테그린의 발현이 양성임을 보여준다. 이와 동시에, 직장암 세포계 LS174T는 Vβ3 인테그린의 발현이 음성이다(도 8). 따라서, 이상의 3종 세포계는 PFC-1과 인테그린의 공동위치화를 검증하는데 사용된다.
대수생장기의 HUVEC와 SKOV3 세포를 트립신을 이용하여 단세포 현탁액으로 소화시키고, 4×105 세포/ml 밀도로 조정하여, 37℃에서 2시간 동안 배양시켜 세포 표면의 표지물 단백질 발현이 회복되도록 하였다. 이후 PBS로 세포를 충분히 세척하고, 2×105 세포의 매 튜브마다 유동 세포 분석 또는 PFC-1 마크를 실시하고, 상응하는 형광 이차항체로 염색한 후 즉시 기기에 올려 검출하였다.
PFC-1를 HUVEC 또는 SKOV3와 함께 인큐베이팅한 후, 유동 세포 분석 기술에서 뚜렷한 양성 신호가 나타났으며, 이는 PFC-1이 HUVEC(도 6) 및 SKOV3 세포(도 7)에 결합될 수 있음을 알려준다. PFC-1의 양성 신호 강도는 항 αVβ3 인테그린 모노클론 항체의 신호보다 약하다. 그러나 PFC-1 또는 항 αVβ3 인테그린 모노클론 항체를 막론하고 LS174T 세포와 함께 인큐베이팅한 후에는 모두 양성 신호가 나타나지 않았다(도 8). 유동 세포 분석 결과는 PFC-1이 HUVEC 또는 SKOV3 세포 표면에 특이적으로 결합될 수 있음을 초보적으로 설명할 수 있다.
레이저 공초점 현미경 실험
대수생장기의 HUVEC와 SKOV3 세포를 하루 전에 레이저 공초점 현미경 전용 배양접시에 접종하여, 세포가 기기 검출 시 약 70%의 세포 융합도에 이르게 하였다. 이튿날, 차가운 PBS로 세포를 철저히 세척한 후, 4%의 파라포름알데히드로 실온에서 15분 동안 고정시키고, 고정된 세포를 2㎍ 항 인간 CD51/61(αVβ3 인테그린) 항체 또는 PFC-1로써 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅 한 다음, 상응하는 형광 이차항체로 각각 실온에서 1시간 동안 염색하고, DAPI로 세포핵을 염색한 후 즉시 기기로 검출하여 PFC-1과 항 인간 CD51/61의 공동위치화 효과를 검출하였다. 본 실험은 Zeiss사의 LSM710 공초점 현미경을 사용하였다.
레이저 공초점 현미경 실험에서, HUVEC와 SKOV3 세포를 모델로 하여, PFC-1 및 항 αVβ3 인테그린 모노클론 항체로 세포를 함께 인큐베이팅한 결과, PFC-1과 항 αVβ3 인테그린 모노클론 항체는 2종 세포 표면에서 모두 뚜렷하게 공동위치화 현상이 나타난 것을 분명하게 발견할 수 있었으며(도 9), 이는 PFC-1과 항αVβ3 인테그린 모노클론 항체가 동일한 세포 표면의 단백질에 결합하나, 단 상이한 단백질 에피토프에 작용하여 결합된다는 것을 설명한다. 본 실험 시나리오에서는 αVβ3 인테그린이다.
유동 세포 분석기술과 레이저 공초점 현미경 실험 결과는 함께, PFC-1이 RGD 모듈을 통해 αVβ3 인테그린에 특이적으로 결합될 수 있으며, 따라서 체외 실험 조건하에서 αVβ3 인테그린이 고발현되는 종양세포에 대해 특이성 결합을 구현할 수 있음을 나타내었다.
PFC-1은 고효율의 체내 항종양 효과를 갖는다
PFC-1의 체내 항종양 효과를 평가하기 위하여, 우리는 4-6주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 우측 등 부위에 5×105 B16F10 마우스 흑색종 세포를 주사하였다. 대략 10-12일 후, 종양의 직경(day0)이 5-8mm에 이르렀으며, 이식 종양이 50-100mm3 부피까지 자랐을 때 상이한 용량의 PFC-1 또는 음성 대조(PBS)를 투여하기 시작하였고, 또한 지정된 날짜에 마우스의 종양 크기를 측정하였다. 실험 결과, 5㎍의 PFC-1 용량그룹에서 종양 생장률에 70%의 억제가 나타났고, 20㎍의 PFC-1 용량 그룹에서는 즉 100% 억제되는 것으로 나타났다(도 10).
유사한 마우스 실험에서, 4-6주령의 수컷 C57BL/6 마우스의 등 부위 피하에 B16F10 흑색종을 이식하고, 거대 종양 부담 모델을 구축하였다. 모델이 구축된 후, 마우스에게 이틀 연속 10㎍의 PFC-1(도 11)을 정맥내 주사하였다. PFC-1은 양호한 체내 종양 생장 억제 효과를 나타내었다. 실험 개시 후 5일째에, 실험 시작시의 종양 부피에 비해, PFC-1로 치료한 마우스 그룹에서 종양이 원래 부피의 75%까지 축소되었고(도 11), 6일째에, PFC-1 치료그룹의 마우스에게 별도의 PFC-1 정맥내 주사를 한 번 투여한 결과, 종양 부피가 원래 부피의 54%까지 지속적으로 축소되었다.
세포 표현형(cell phenotype)의 유동 세포 분석
마우스를 마취시킨 후 안와정맥으로부터 말초정맥혈을 수집하고, 즉시 혈액 응고 억제(anti-clotting)와 적세포 용해(lysis) 처리를 실시하였다. 마우스를 인도적으로 사망시킨 후, 비장을 적출하고 비장 세포를 즉시 수집함과 아울러, 70μM의 나일론망(BD)을 통한 여과 및 적세포 용해 처리 후, 비장의 단세포 현탁액을 획득하였다. 이와 동시에 종양 조직을 추출하여, 핀셋으로 종양조직 구조를 약하게 파괴한 후 37℃에서 0.2mg/ml Collagenase IV와 0.1mg/ml의 DNAse I로 15분 동안 소화시켰다. 단세포 현탁액을 수집하고 남은 종양 조직을 상기 효소 용액으로 25분 동안 소화시킨 다음 병합하여 획득된 단세포 현탁액을 70미크론의 나일론망으로 여과하였다. 말초혈 단세포, 비장세포와 종양세포를 유동 항체로 염색한 후 4%의 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 차광 상태에서 보관하거나 또는 즉시 세포 표현형을 기기에 올려 검출하였다.
항체 염색을 거친 후 유동 세포 분석 기술로 분석한 결과, PFC-1(도 12)로 치료한 마우스의 말초혈, 비장 및 종양 조직 중의 CD8+ T 세포 비율이 급격히 상승한 것을 발견할 수 있었다. 이와 동시에, 마우스의 말초혈과 비장 세포 조직 중의 CD8+ T 세포의 표면 항원 CD44 발현량도 마찬가지로 뚜렷이 상승하였으며, 종양 조직 중의 CD8+ T 세포의 표면 항원 CD44의 발현량에 상대적으로 미약한 상승이 나타났다. CD8+ T 세포 표면에서의 CD44의 발현량은 CD8+ T 세포의 활성화 정도를 반영할 수 있다. 상기 실험 결과는 두 종류의 융합 단백질이 CD8+ T 세포 군락의 비율을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 동시에 CD8+ T 세포의 활성을 촉진할 수도 있음을 알려준다. 또한, 유동 세포기술 분석은, PFC-1이 NK 세포를 효과적으로 동원하여 종양 조직(도 13)에 더욱 많이 침투될 수 있도록 할 수 있음을 보여주었으며, 이는 PFC-1이 면역 시스템을 효과적으로 활성화시켜 종양세포를 사멸시킬 수 있음을 추가적으로 알려준다.
PFC-1의 마우스 체내 B16 종양의 악성 전이 억제
5×105 B16F10 마우스 흑색종 세포를 꼬리정맥 주사 방식을 통해 4-6주령의 수컷 C57BL/6 마우스 체내에 주사하였다. 모델 마우스 체내에서, 종양세포가 신속하게 폐부로 전이되어 가시적인 동종양(sinus tumor)을 형성하였다. 이튿날, 복막내 주사방식을 통해 마우스에게 10㎍의 PFC-1 또는 등부피의 PBS(100㎕)을 투여하였다. 21일째에, 마우스를 인도적으로 사망시키고, 폐부를 적출하여, PBS로 철저히 세척한 후 10%의 포름알데히드에 보관하였다. 이후 쌍안 현미경(Leica M125)으로 검사하고 상이한 그룹의 마우스 폐부의 종양 전이 병소 수량을 계산하였다.
실험 결과, 10㎍의 PFC-1를 1회 복강주사한 경우 종양의 악성 전이를 효과적으로 억제할 수 있음이 증명되었다. 대조그룹과 비교하여, 투약 그룹의 폐부 동종양의 평균값은 61로부터 11.4로 감소하였으며, 감소폭은 80%를 초과하였다(도 15). 이는 PFC-1이 면역 시스템을 효과적으로 활성화시킴으로써 전이된 종양 세포를 사멸시킬 수 있음을 증명한다. 종양의 악성 전이 억제는 종양의 재발과 촉진을 방지하는 종양의 예후에 대해 적극적인 의미가 있다.
본 분야의 기술자라면, 본 발명을 개조하여 본문에서 설명한 목적들 및 장점 및 본문에 내포된 목적들과 장점을 용이하게 획득할 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다. 본문에서 현재 바람직한 실시 방식의 대표적인 형식으로 묘사한 방법, 변이체와 조성물은 예시적인 것이지, 결코 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 본 분야의 기술자는 이들을 변경하거나 또는 기타 용도로 사용할 수 있으나, 단 이는 모두 청구항에 정의된 본 발명의 범위 내에 포함된다.
비록 본 발명은 이미 바람직한 실시방식과 임의의 특징을 통해 구체적으로 공개되었으나, 단 본 분야의 기술자는 본문에 공개된 구상에 대해 수정 및 변화를 실시할 수 있으며, 이러한 수정과 변화는 여전히 첨부된 청구항으로 정의된 본 발명의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> TRIDENT BIOSCIENCES INC. <120> INTERLEUKIN-15 FUSION PROTEINS FOR TUMOR TARGETING THERAPY <130> 16521WO <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro Gly Lys 225 <210> 2 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr 35 40 45 Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro 50 55 60 Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 4 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 5 Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 20 25 30 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 35 40 45 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 50 55 60 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 65 70 75 80 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 85 90 95 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 100 105 110 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 115 120 125 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 130 135 140 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 145 150 155 160 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 165 170 175 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 180 185 190 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 195 200 205 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 210 215 220 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 225 230 235 240 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His 245 250 255 Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr 260 265 270 Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr 275 280 285 Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro 290 295 300 Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala 305 310 315 320 Pro Pro Ser Thr Val Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln Asn Trp Val Asn Val Ile Ser 340 345 350 Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala 355 360 365 Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala 370 375 380 Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly 385 390 395 400 Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn 405 410 415 Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu 420 425 430 Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe 435 440 445 Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser 450 455 <210> 6 <211> 1548 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 aagcttctga gatcaccggc gaaggagggc caccatgtac aggatgcaac tcctgtcttg 60 cattgcacta agtcttgcac ttgtcacgaa ttcggcttgc gattgccgag gcgattgctt 120 ttgtggcctc gagggaggag gaggctccga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc 180 acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct 240 catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc 300 tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc 360 gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca 420 ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc 480 catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct 540 gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg 600 cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta 660 caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac 720 cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc 780 tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaag atatcggagg 840 aggaggctcc ccccctccta tgagcgtgga acatgctgac atttgggtga agtcttactc 900 tctgtacagt cgggagagat atatctgcaa ctcagggttc aagcgaaaag ccggaacaag 960 ctccctgact gaatgtgtgc tgaacaaggc cactaatgtc gctcactgga ccacacctag 1020 cctgaaatgc attagggacc cagcactggt gcatcagcga ccagcaccac cttcaaccgt 1080 cagcggaggg tccggaggag gaggatcagg agggggaagc ggcggaggag gcagcctgca 1140 gaactgggtg aatgtcatct ccgacctgaa gaaaatcgag gatctgattc agtccatgca 1200 cattgacgcc actctgtaca ccgaatccga tgtgcatccc tcttgcaagg tcacagctat 1260 gaaatgtttc ctgctggagc tgcaggtcat cagcctggaa agtggcgacg cttctattca 1320 cgataccgtg gagaatctga tcattctggc aaacaattct ctgtctagta acggcaatgt 1380 gacagagagt gggtgcaagg aatgtgagga actggaggaa aagaacatca aagagttcct 1440 gcagagcttt gtgcatatcg tccagatgtt tattaatacc agctgagtgc gacggccggc 1500 aagcccccgc tccccgggct ctcgcggtcg cacgaggatg cttctaga 1548

Claims (16)

  1. 적어도 (i) IL-15 폴리펩타이드, (ii) IL-15Rα 폴리펩타이드의 변이체, (iii) Fc 도메인, 및 (iv) RGD 폴리펩타이드
    를 포함하는, 종양 표적 융합 단백질로서,
    상기 IL-15Rα 폴리펩타이드의 변이체가 SEQ ID NO.2의 아미노산 서열을 갖는,
    종양 표적 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 각 성분의 배열 순서는 RGD 폴리펩타이드 - Fc 도메인 - IL-15Rα 폴리펩타이드의 변이체 - IL-15 폴리펩타이드인, 종양 표적 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    Fc 도메인의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1의 서열인, 종양 표적 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    IL-15의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3의 서열인, 종양 표적 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    RGD 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4의 서열인, 종양 표적 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 종양 표적 융합 단백질의 아미노산 서열은, (a) SEQ ID NO.5의 아미노산 서열; 및 (b) SEQ ID NO.6의 핵산 서열로 인코딩된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 종양 표적 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 종양은 인테그린 양성 발현 종양인, 종양 표적 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 종양은 αVβ3 인테그린 양성 발현 종양인, 종양 표적 융합 단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 종양은 진행성 종양, 말기 종양, 또는 전이성 종양인, 종양 표적 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 종양 표적 융합 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 종양 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 종양 표적 융합 단백질 및 또 다른 항암제를 포함하는, 종양 치료용 약학 조성물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 종양 표적 융합 단백질을 인코딩한 핵산 분자.
  13. 제12항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  14. 제13항에 따른 발현 벡터로 변화(transformation)되거나 또는 형질주입(transfection)된 비-인간 숙주.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 종양 표적 융합 단백질,
    상기 종양 표적 융합 단백질을 인코딩한 핵산 분자,
    상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 또는
    상기 발현 벡터로 변화(transformation)되거나 또는 형질주입(transfection)된 비-인간 숙주
    를 포함하는 키트.
  16. 삭제
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