HU229680B1 - Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával - Google Patents

Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HU229680B1
HU229680B1 HU0401590A HUP0401590A HU229680B1 HU 229680 B1 HU229680 B1 HU 229680B1 HU 0401590 A HU0401590 A HU 0401590A HU P0401590 A HUP0401590 A HU P0401590A HU 229680 B1 HU229680 B1 HU 229680B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
soluble
ctla4
lys
ser
pro
Prior art date
Application number
HU0401590A
Other languages
English (en)
Inventor
Christian P Larsen
Thomas C Pearson
Andrew B Adams
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of HUP0401590A2 publication Critical patent/HUP0401590A2/hu
Publication of HUP0401590A3 publication Critical patent/HUP0401590A3/hu
Publication of HU229680B1 publication Critical patent/HU229680B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Description

A találmány általánosságban a szigetsejt átültetés kilökődésének meggátlására vonatkozik. Pontosabban, a találmány tárgyát eljárások képezik diabétesz, ide értve az 1-es és- 2-es típusú diabéteszt., kezelésére, mely során egy betegnek oldható CTLA4 mutáns- molekulák hatásos mennyiségét adjuk be.
A TALÁLMÁNY HÁTTERE
A szervátültetés az életveszélyes, szervsérüléses betegségek számos formája esetében a kezelésének előnyös módszerévé vált. A klinikai átültetés során jobb eredményeket, elsősorban az egyre hatásosabb, nem specifikus, kilökődés.! reakció gátlására szolgáié immunszuppresszív szerek kifejlesztésén keresztül érték el [Láncét 345, 1321-1325 (1995)j. Bár a rövid távé eredmények jobbak lettek, a hosszú távú -eredmények továbbra, sem kielégítők. Jelenleg egész életen át tartó immunszupp res-szlv gyógyszeres kezelésre van szükség az átültetett szerv krónikus kilökődésének meggátlására, és ezeknek a szereknek a használata drámai módon megnöveli a sziv-érrendszeri betegségek, fertőzések és rákos megbetegedések veszélyét.
Azoknak a stratégiáknak, a kifejlesztése, melyek elősegítik az ailogén szövetek befogadását anélkül, hogy krónikus immunézuppreszszióra lenne- szükség, nem csak ezeknek az életet veszélyeztető szövődményeknek a kockázatát csökkentené le, hanem nagyban kiterjesztené a szerv-, szövet- és sejtátültetés alkalmazását * ·->
olyan betegségeknél, is, mint. a hemoglobinopátiák, genetikai im~ mundeficienciák, és autoimmun betegségek.
Az inzulinfüggő diabétesz me.'11.1 túsz (IDOM) az egyik legáltalánosabban -előforduló anyagcsere-rendellenesség a világon. Az Amerikai Egyesült Államokban az IBüiá hozzávetőleg minden 3-400 ember közül egyet érint, és az epidemiológiai vizsgálatok azt mutatják# hogy az IDOM előfordulása egyre gyakoribb. Az 'LDDM~et egy autoimmun válasz okozza, mely azt eredményezi# hogy a T-lim.fo-~ citák a 'hasnyálmirigy inz.ul intermelő- szigetsejtjeit elpusztít jak.
Mintán az 1DDM klinikai tünetei nyilvánvalóvá válnak, a legáltalánosabban alkalmazott kezelés az 1DDM klinikai tüneteinek a megfékezésére a külső inzulinpótlás-, Bár az inzulinpötlásos terápia a legtöbb IQDM-es betegnél lehetővé teszi, hogy viszonylag normális életet éljen, teljesen nem állítja helyre az anyagcsere hoaeosztázíst, és- ennek eredményeképpen az inzulinpötlásos kezelésen áteső diabéteszes betegekben gyakoriak a súlyos szövődmények, ezek közé tartozik a szem, vese, szív és más szervek rendellenes működése.
Az IDDM betegek hosszú távú kezelését a sziget-átültetés jelenti, Az átültetett inzulistermelö szigetsejteket azonban gyakran gyorsan elpusztítja ugyanaz az autoimmun válasz, ami előtte a beteg saját szigetsejtjeit elpusztította. Az 1990 óta átültetett 260 allograft közül csak 12,4% eredményezett egy hétnél hosszabb Ideig tartó inzulinfüggetlenséget, és csak 8#25% eredményezett egy évnél hosszabb ideig tartó inzulinfüggetlenséget ÍLinsiey et al., Diabetes 46, 1120-3 (19-.97}}. Ezeknek az eljárásoknak a nagy részében az immunszuppressziö alapmódszere egy
Ví,S02/SS/?Ai TÁJ ·>
ezzel együtt cíkiesperínnal, anti-limfocita globulinnal és azatiprínnel és giükokortikoldokkal végrehajtott antitest indukcióból állt.
Az átültetési eljárás valamennyi típusánál a klinikai elfogadhatóság egyik kulcstényezője a hatékonyság és toxieitás közötti egyensúly. A szígétatöltetés tekintetében egy további gondot jelent, hogy a jelenlegi Ímmonszuppress2iv szerek közöl sok, különösen a. g.l öko kort ikoidok vagy egy kalcíneurin inhibitor, így a fcarkoiímuss, károsítja a foétasejteket vagy perifériás inzulinrezisztenciát vált ki [.Zeng et al.. Surgery 113, 93-102 (1393}J.
Egy sziroiimuszt, kis dózisa tarkóiimuszt és IL-2 receptor elleni monoklonáiis antitestet (mAb) magában foglaló szteroid mentes immunszuppresszív eljárást („Edmonton. protocolw) alkalmaztak egy sziget-átültetési kísérletben csak 1-es típusú diafeéfeszes betegeknél [Shapi.ro A., M., d. et al., N. Eng. 01 Med.
343, 230-238 (2:000)].
Napjainkban az „Edmonton protocol-t alkalmazva elért sikerek felébresztették a lelkesedést sziget-átültetés iránt a diabétesz kezelésében. Mindemellett a tarkolímusz toxioitása által okozott gondok korlátozhatják ezt a kezelési módszert emberekben. Azok a biológiai szerek, melyek gátolják a T-sejt kostímuláció-s szignálokat, különösen a CD28 reakciónkat, potenciális alternatívaját nyújtják az allogén szigetek megvédésének. A CD28 reakciőutat blokkoló szerek példái közé tartozik, de nem korlátozó módon, az oldható CTLA4, ide értve a mutáns CTLAí molekulákat ís.
A TALÁLMÁNY ÖSSZEGEZÉSE
A találmány rendelkezésre bocsátja az .1. igénypontban megha.$t32/SJS/KA2. táj *
tárózott oldható CTLA4 mutáns molekulák egy immunrendszeri betegségek kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására való alkalmazását. Az oldható CTLA4 mutáns molekulák kötődnek a CB8Ö és/vagy CD86 molekulákhoz a CD8Ö- és/vagy CDS6-pozitív sejteken, ezáltal meggátolva, hogy az endogén CDSO és/vagy CD86 molekulák a T-sejteken a CTLA4 és/vagy CD28-hoz. kötődjenek, és igy blokkolják a kulcsfontosságú T-sejt kostímuláciős szignálokat, különösen a
CD28 reakciéutet.
Az oldható CTLA4 mutáns molekulák köze tartozik, de nem korlátozó módon, az L104EA29Y, melynek a CTLA4 extracelluláris dóménjében mutációk vannak a +29. pozíciójú alaninnál és/vagy a +104~es helyzetű leucirmál, ahol a 29. helyzetű alanint tirozin helyettesíti, és a 10. helyzetű leucint glutaminsav helyettesíti. A CTLA4 mutáns- molekulák továbbá egy olyan részt tartalmaznak, például egy immunglobulin molekulát, mely a mutáns fehérjét oldhatóvá teszi.
Egy előnyös megvalósításban az L104EA29Y LlOáEAzSYIg (3. áb~
A találmány továbbá alkalmazható szigetsejt átültetés kilökődésének meggátzására egy betegben, oly módon, hogy a betegnek, akinél szigetsejt átültetést végeznek, L104'EA29Y-t (így LlÖ4EA2.9YIg-t)· adnak be.
A találmány alkalmazható diabétesz kezelésére is egy betegben, oly módon, hogy a betegnek, akinél diagnosztizálták, hogy diabéteszes, egy Llö4EA29Y-t ügy L.104EA29YIg-t) magában foglaló immnnszuppresszív kezelést adnak, és szigetsejt átültetést hajtanak végre.
VtgQZ/BS/BAZ ZAJ
AZ ABRAK RÖVID LEÍRÁSA
Az 1. ábra sz onkosztatin H szignáipepcidhez fuzionált humán CTLA4 receptor teljes nukleotid™ Cl. számú szekvencia)· és aminosav-szekvenoiáját (2, számú szekvencia) ábrázolja. Az onkoszt.at.in M szignálpeptidet a (-25)-(-1.) helyzetekben jelöljük.
A. 2. ábra CTLAilg nukleotid- (3. számú szekvencia) és aminosav-szekveneiáját (4. számú szekvencia) ábrázolja? mely rendelkezik egy szignálpeptiddel; a CTLA4 extracelluláris dóménjenek vad típusú amino-sav—szekvenciáiával, ami a +l~es helyzetű metioninnál kezdődik és a +124-es helyzetű aszparaglnsav.ig tart; vagy a -1. helyzetű alaninnái kezdődik és a +124. helyzetű aszparaginsavig tart; és egy lg régióval.
A 3. ábra a CTLA4 mutáns molekula (LlűdSAÖűYIg} nukleotid(5. számú szekvencia) és aminosav-szekvenciáját (6. számú szekvencia) mutatja be, mely tartalmaz egy szignálpeptidet; a CTLA4 egy mutáns extracelluláris dóménjót, mely a +1. helyzetű metionínnál kezdődik, és a *124. helyzetű aszparaginsavnál fejeződik be; vagy a -1. helyzetű alaninnái kezdődik és a +124. helyzetű aszparaginsavig tart; és egy lg régiót, ahogy azt a-z 1. példában lentebb leírjuk.
A. 4. ábra egy olyan görbét mutat be, mely egy normális egysében mutatja be az éhezés! plazmaglükóz-szintet, ahogy azt a 3. példában lentebb leírjuk.
Az 5. ábra egy olyan görbét ábrázol, mely a 3. példában leint, pankreatektomizált és hasnyálmirigy szigetsejt. átültetésen átesett betegekben mutatja be az éhezés! piazmaginkőz-szintet.
Az állatokba a 0. napon ültettük be a szigetsejteket, és vagy
L-lÖ4EA2$Yg~t tartalmazó- iassunszuppressziv kezelést és egy alap immunszuppresszív kezelést kaptak (kezelt), vagy csak alap immun-szupre-sszív kezelést kaptak (kontroll) . Az alap immuno,zuppreszssiv kezelés rapamicint ás anti-humán IL2E~t tartalmazott.
A 8. ábra sgy olyan görbe, mely az inzulinigényt ábrázolja a 3. példában leírt, átültetett szigetesjkekkel rendelkező- egyebekben. Az állatoknak a 0. napon ültettük be a szigetsejteket, és L104'EA29Yg-t magában foglaló immunszuppresszív kezelést és egy alap immunszuppresszív kezelést kaptak (kezeit)·, vagy csak alap immunszupresszív kezelést kaptak (kontroll).
A 7. ábra a- vérglü.kóz-szintet egy intravénás glükóz tolerancia tesztben a. szigetátülte-tés előtt és után bemutató görbe, ahogy azt a 3. példában, leírjuk.
A 8. ábra az L104£A29YIg inszertummai rendelkező piLN-L104BA29Y vektor vázlatos diagrammja.
A 3A.és 9B. ábrák FACS analízisekből származó adatokat mutatnak, melyek az Llö4EA2311g, LlOAEIg és CTLA4Xg kötődését mutatják be a humán CD80~naI vagy CD86-~tal transzfektált CKO sejtekhez, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjük.
A IGA. és 1ÖB. ábrák a CDSO-pozítiv és CDáó-pozitiv CKO sejtek proliferácröIának gátlását ábrázolják, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjük.
A X1A. és 11B. ábrák azt mutatják be, hogy az L104EA29¥Ig sokkal hatásosabb, mint a CTfA4Xg a primer- és szekunder altost Imoláit T-sejtek proli.fe.rációjának gátlásában, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjuk.
A 12&-C. ábrák azt szemléltetik, hogy az A104EA29YIg sokkal 77..SÖ2/SE/?A5!jrÁS hatásosabb, mint a CTLAllg az ailostimulált humán T-sejtek IL-2 (12A. ábra), IL-4 (12B. ábra) és γ-ínterferon (12C. ábra) cítokín termelésének gátlásában, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjük.
A 13, ábra azt mutatja be, hogy as L104EA29YIg sokkal hatásosabb, mint a CTLAélg a £ítobemagglutininnel (PHA) stimulált majom T-sejtek proliferácíójának gátlásában, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjük.
A 14A-C. ábra egy SDS gélt mutat be a CTLAiig (1, sáv), LlCMETg (2. sáv), és an LlÖ4EA29YIg (3A. sáv) esetében; és a CTLAálg (14B. ábra) és Llö4EA29Y.Tg (14C. ábra) méretkizárásos kromatográfiás képeit matatja.
A ISA. és 1SB. ábra a CTLA4 extraceiluláris Tg WR spektroszkópiával meghatározott oldat-szerkezetéből létrehozott V-szerű redősének szalag-diagrammját mutatja be. A Γ5Β. ábra a S2S-B33 régió és az MYFPFY (15, .számú szekvencia) kinagyított képe, az L104 és A29 aviúitás fokozó mutációk elhelyezkedését es oldallánc-orientácioját jelezve.
A 16, ábra az éhezés! vérglükózt ábrázolja az allogén szigetek LEA29Ylg-kezeit (A) és kontroll (3) reoipienseinél (reprezentatív állatok) a beültetés előtt és után. Az összes állat műtéti hasnyálmirigy eltávolításon esett át legalább két héttel a transzplantáció előtt (pretranszpiantációs inzulinszökséglet 8,36 0,18 egység/nap). (C) Az allogén szigetek intraportélis infúziója. után a recipiensek gyorsan englikémiássá váltak, és nem igényeltek exogén inzulint az átültetés után. (Ώ) A diabéteszindukciót és a beültetés utáni szigetzunkcíőt intravénás
7?.SÖ2/BS/iíA2 TÁJ glükóztoierancia teszttel igazoltuk az átültetés előtt és 1 hónappal és 3 hónappal az átültetés után, ahogy a. 3. példában lentebb leírjuk.
A 17. ábra a pozitív inzulinfestődésse-l igazoltan, működőképes, átültetett sziget immunbísztoiógiája. (B) Kontroli kezelést kapó állatból származó sziget, melyet mononukieáris infiltrátum vesz kerül, ami a kilökődést jelzi, ahogy azt a 3. példában lentebb leírjuk.
A 18. ábra az sntí-donor T- és B-sejt válaszok L104EA29Y kezelés általi szuppresszióját mutatják be. (A) Az anti-donor IFK-y-BLISpot válasz megfelel a kilökődés időpontjának a kontroliakban h-l héttel az átültetés után) < (B) Az L104EA2.9Y kezelés hatásosan gátolja az anti-donor T-sejt válasz létrejöttét. (C) A rapamicint és anti-IL-2'R mAb-t kapó állatok gyorsan hoznak létre kimutatható anti-donor antitesteket, melyet áramlási citometriás módszerekkel mértünk a kilökődés időpont jóban. (D) Az 1,1 ö 4 BAJCSY-1 magában foglaló kezelést kapó sziget reeipiensek nem tudtak kimutatható anti-donor antitest választ létrehozni a kezelés alatt, ahogy azt a 3. példában lentebb leírjuk.
A 19. ábra az IdOáEIg nukleotid- és amlnosav-szekvenoiáját (7-8, számú szekvenciák) mutatja be, ahogy azt a 2. példában lentebb ismertetjük.
A 20, ábra az I104EA29Llg nukleotíd- és aminosav-szekven™
olaját (9-10. számú szekvenciák) mutatja be.
A 21, ábra sz L104EA29TXg nukleotid- es amínosav-szekven-
diáját (11-12. számú szekvenciák) mutatja be •
A 22. ábra az LX04EA29bag nukleotid- és ami η o s a v - s ze kv e n-
? 0 3 -02/ ss zm eb olaját (13-14. számú szekvenciák) mutatja be.
A 23. ábra CTLAilg nukieotíd-szekvenciáját <15. számú szekvencia) mutatja be, mely rendelkezik egy szignálpeptíddel; a CTLA4 extracelluláris doménjének vad típusú aminosav-szekvenciájávai, ami a +!. helyzetű metioninnál kezdődik, és a +124. helyzetű aszparaginsavig tart; vagy a -.1. helyzetű alanínnál kezdődik, és a +124. helyzetű aszparaginsavig tart; és egy lg régióval.
A 24. ábra a CTLA4Ig nukleotid-szekvencíágát (16. számú szekvencia) mutatja be, mely rendelkezik egy szígnálpeptíddei; a CTLAi extracelluláris doménjének vad típusú aminosav-szekvenciájávai, ami a +1. helyzetű metioninnál kezdődik ás a +124. helyzetű azparagínsavig tart; vagy a -1. helyzetű alanínnál kezdődik és a +124. helyzetű aszparaginsavig tart; és egy lg régióval.
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES LEÍRÁSÚ
MEGHÁLÁLÓ2ÁSOK
Az összes leírásban alkalmazott tudományos és műszaki kifejezés a szakterületen szokásosan használt jelentéssel bír, hacsak azt másképp nem határozzuk meg. A bejelentésben alkalmazva a következő szavak és kifejezések az itt meghatározott jelentéssel bírnak.
A bejelentésben alkalmazva a „vad típusú CTLA4 a természetben előforduló, teljes hosszúságú CTLA4 amínosav-szekvencíájavai rendelkezik (ŰS 5 434 131, 5 844 095, 5 851 795 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), vagy ennek bármely része vagy származéka, ami felismer és köt egy 97 molekulát (például CD8ö~t és/vagy CDdf-t ), vagy akadályozza a S?~t (például €D80-t és/vagy CD8fí-t), meggátolva a kötődését a CTLA4 extra77.3Ö2/SS/M2 TÁJ cellulárís dóménjéhez vagy annak részeihez. Bizonyos megvalósítási módokban a vad típusú CTLA4 extracelluláris dómén je metíonirmal kezdődik a +1. helyzetben, és aszparaginsavval végződik a +124. helyzetben, vagy a vad típusú CTLA4 extracelluláris dóménje alaninnal kezdődik a -1. helyzetben, és aszparaginsavval végződik a +124. helyzetben. Hás megvalósítási módokban, a vad típusú CTLA4 a US 5 434 131, 5 344 093, 5 851 793 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások 3. ábráján és a bejelentésben az 1. ábrán bemutatott C7LA4 receptor 187 aminosavából áll. A vad típusú CTLA4 egy sejtfelszíni fehérje, melynek, egy N-torrainális extracelluláris dóménje, egy transzraembrán dóménje és egy C- terminál is ci top lármás dómén je van. A eélanti.génefchez., mint például a CDS 0-hoz és CD8 β-hoz az extracelluláris- dómén köt. Sgy sejtben a természetben előforduló vad típusú C1LA4 fehérje éretlen polípeptidként transzlatálődik, mely az N-terminálís végén egy szígnálpepüdet tartalmaz. Az éretlen polipeptid poszttranszlációs érésen esik át, mely során a szignálpeptid léha sad és eltávolitódik, hogy egy, az éretlen forma N-terminálís végétől eltérő, újonnan keletkezett N-termínális véggel rendelkező CTLA1 hasítási termék jöjjön, létre. A szakemberek számára érthető, hogy további poszttranszlációs érési folyamat fordulhat elő, mely a CSLA4 hasítási termék újonnan létrejött ^-terminális végéről egy vagy több aminosavat eltávolít. A CTLA4 molekula érett formája magában foglalja az extracelluláris domént vagy valamely részét, mely kötődik a CDBÖ-ho-z és/vagy a CDS6-hoz.
A bejelentésben, alkalmazva a „CTLA4 extracelluláris dóménje a CTLA4 receptornak az a része, ami a sej tháriyán. tűllóg, és a -7.SÖ2/BE/&&Z TÁJ
CTLA4 egy olyan részét foglalja magában- ami a sejthártyán tűlíőg, és fölismeri és köti a CTLA4 ligandumokat, úgymint a B7 molekulákat (például CD30 és/vagy CDSδ molekulát). Például a CTLAé agy extraceliulárís dóménje a +1. helyzetű metionintől a + 124, helyzetű aszparacinssvig tartó részt tartalmazza (2- ábra). Alternatív lehetőségként a CTI.A4 extracellulár.is dóménje a ~1.
helyzetű alanintói a +1.24. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazza (1. ábra· , Az oxtrseellnlá.ris dómén magában foglalja a CTLA4 olyan fragmentumait és származékait is, melyek kötik a
B7 molekulát (például CD8Q és/vagy CD86 molekulát).
A bejelentésben alkalmazva a ,,nem-CTLA4 fehérje-szekvencia vagy „nem-CTLAá molekula úgy határozható meg, hogy az bármely molekula, mely nem köti a CDSO-t és/vagy CDS6~t, és nem gátolja a C1LA4 kötődését a célmolekulához. Ennek egy nem korlátozó példája egy immunglobulin (lg) konstans régié vagy ennek része. Előnyösen az lg konstans régié egy humán vagy egér lg konstans régió, például humán C(gamma)1, ide értve a osuklőrégiöt, CH2 és CH3 régiókat. Az lg konstans régión. mutácíó: hajtható végre, hogy csökkentsük az effektor funkciókat (US 5 63? 481 és 6 090 914 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás),
A bej elöntésben alkalmazva, az „oldható olyan, molekulára vagy fragmentumaira vagy származékaira vonatkozik, melyek nem kötődnek vagy kapcsolódnak egy sejthez, azaz keringenek. Például a CTLA4, L104SA23Ylg, S? vagy CD28 oldhatóvá tehető egy immunglobulin (lg) résznek a CTLA4, B'7 illetőleg CD28 extraceliuláris dóménjéhez való kapcsolásával. Egyéb molekula lehet a papíllőmavírus £7 géntermék (E7), p9? meianőma-asszooiált antigén (pú?)
77.S02/&S/RA3 Ab vagy a HÍV env fehérje (ea? gp!20) .. Alternatív lehetőségként egy molekula, mint például. CTLA4 oldhatóvá tehető a transzmembrán dómén eltávolításával. Jellemzően a találmány szerinti eljárásokban alkalmazott oldható molekulák nem. tartalmaznak szignál (vagy leader) -szekvenciát.
A „CTLAilg egy olyan oldható fúziós fehérje, mely egy lg farokhoz. kapcsolva a CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza, vagy ennek egy olyan részét, mely köti a CD80-t és/vagy CD86~t. Egy sajátos megvalósítási mód a vad típusú CTLA4 extracelluláris doménjét tartalmazza a +1. pozíciónál lévő metioninnal kezdve és a +124. pozíciónál lévő aszparaginsavval bezárólag; vagy a -Ί. pozíciónál lévő alaninnai kezdve a +124. pozícióba lévő aszparagínsavíg; a +125. helyzetben tartalmaz egy gintamin kapcsoló aminosavat; és -egy immunglobulin részt, mely felöleli a +12 6. helyzetű giatarainsavtől a +357'.. helyzetű iizinig terjedő szakaszt (2. ábra). A CTLAllg-t kódoló EkS-t 1391. május .31-én helyezték letétbe az American Type Culture Coilection-nái ATTC)f 10-801 University BlvcL, Manassas, VA 20110-2209 a Budapesti. Szerződés előírásai szerint, és ATCC 68023 letéti számot kapta; Linsiey P. et al., Immuníty 1, 793-80 (1994), A CTLAlig-t kifejező kínai hörcsög petefészek (CHO; sejtvonalat 199.1. május 31-én helyezték letétbe az ATCC-nél CRL-1Ö762 számon. A találmány szerinti eljárásokban és/vagy kitekben használt oldható CTLAilg molekulák egy szignál- (leader) pepiid szekvenciát tartalmazhatnak, vagy nem szabad ilyet tartalmazniuk. Jellemzően a találmány szerinti eljárásokban és/vagy kitekben a molekulák nem tartalmaznak szignálpeptid szekvenciát.
?7.«82/Β·Β/ΒΛΧ TÍO
A bejelentésben alkalmazva a „oldható CTLA4 molekulák nem sejtfelszínhez kötött (azaz keringő) CTLA4 molekulákat (vad típusú vagy mutáns) jelentenek, vagy egy CTLA-4 molekula valamely funkcionális részét, mely köti a B?-t, ide tartoznak, korlátozás nélkül: a C!LA4ig fúziós fehérjék (például ATCC C8 62S) , ahol a CTLA4 extracelluiárís dóménje egy immunglobulin (lg) részhez van fuzionálva, mely a fúziós molekulát oldhatóvá teszi, vagy ennek fragmenseí és származékai; fehérjék, melyek a CTLA4 ext.raceli.u~ .láris dóménjévei rendelkeznek, mely egy biológiailag aktív vagy kémiailag aktív fehérje egy részéhez van fuzionálva vagy kapcsolva, mint például a papillómavirus £? géntermékéhez (CTLA4-E7), a p97 melanőma-asszociált antigénhez (CTLA4-p97j vagy HÍV env fehérjéhez (CTLA4-env gpllö), vagy ezek fragmenseí és származékai; hibrid (kiméra) fúziós fehérjék, mint például CD28/CTLA4fg, vagy ennek fragmentumai és származékai; CTLA4 molekulák eltávolított transzmembrán doménnel, hogy a fehérje oldhatóvá váljon [Oaks, M< K. et al., Ce'llular Immunology 201, 144-153 (2000)1 vagy fragmenseí és származékai. Az „oldható CTLA4 molekulák·'' közé tartoznak a molekulák azon fragmenseí, részei és származékai, valamint azok az oldható mutáns molekulák, melyek CTLA4-~kötő aktivitással rendelkeznek> A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott oldható CTL&4 molekulák tartalmazhatnak vagy nem szabad tartalmazniuk egy szignál- (leader) peptid szekvenciát. Jellemzően a találmány szerinti eljárásokban a molekulák nem tartalmaznak szignálpeptid szekvenciát.
A bejelentésben alkalmazva a „fúziós fehérje úgy határozható meg, mint egy vagy több aminosav-szekvencia összekapcsolva a
77.8ö2/:55:/t?AS TÁJ szakterületen jól ismert és az 5 434 131 vagy 5 €37 481 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leirt módszerekkel. Az összekapcsolt atdnosav-szekvenciák ezáltal egy fúzió-s fehérjét képeznek.
A bejelentésben alkalmazva a „CTLA.4 mutáns molekula egy olyan molekula lehet, mely a teljes hosszúságú CTLA4 vagy annak részei (származékai vagy fragmensei), mely egy mutációval vagy több mutációval rendelkezik a CTLAd-ben (előnyösen a CTLA4 extracelluiárís dóménjében), igy ez hasonló de nem azonos a vad típusú CTLA4 molekulával. A CT.LA4 mutáns molekulák kötnek egy 37 molekulát (például a CD3u~t vagy CDS6-t vagy mindkettőt). A mutáns CTLA4 molekulák egy biológiailag vagy kémiailag aktív .n.em-CTIA4 molekulát foglalhatnak magukban vagy ahhoz .lehetnek kapcsolva. A mutáns molekulák oldhatóak (azaz keringek) vagy egy felszínhez kötöttek lehetnek. A CTLA4 mutáns molekulák, magukban foglalhatják a CTLA4 teljes extracelluláris· dóráénjét vagy annak részéit, például fragmenseit vagy származékait. A CTLA4 mutáns molekulák előállíthatók szintetikusan vagy r©kombináns módon.
A bejelentésben alkalmazva, a „mutáció kifejezés egy vadtípusű polipeptid nukleotid- vagy aminosav-szekvenelájában. bekövetkező változást jelent. A találmány egy mutációt vagy változást biztosit a vad típusú CTLA4 extracelluláris dómén.gében. A vad típusú CTLA4 szekvenciában bekövetkezett változások konzervatív és nem konzervatív változásokat foglalnak magukban. A változás. lehet egy aminosav-változás, melybe szubsztitúciók, deléciók, inszerciők, addioiók vagy csonkolások tartoznak. Egy mutáns molekula- egy vagy több mutációval rendelkezhet. A nukl.eotid77.80Z/3Z/SAZ TÁJ'
-szekvenciában lévő mutációk az aminosav-szekvenciában is mutációt eredménye zhatnék, vagy lehet, hogy nem eredményeznek mutációt, ahogy az a szakterületen ismert. Ebből a szempontból bizonyos nukleotid-kodonok ugyanazt az aminosavat kódolják. Például a CGU, CGG, CGC és CGA nukleotid-kodonok. az arginin (R) aminosavat kódolják; és a GAG és GAG kodono-k az aszparaginsav 1 Dj aminosavat kódolják. Tehát egy fehérjét egy vagy több olyan nukleinsav-mo.iek.ula kódolhat, melyek specifikus nukleotid-szekvonciája eltér, de azonos szekvenciával rendelkező fehérjemelekólákat kódolnak. Az aminosav-kódol.ó szekvenciák a következők:
Aminosav Jele Sgybetűs jel Kodonok
Aianin Alá A. GC G, GCC, GC A , GCG
Cisztein Cys r· k- UGU, ÜGC
Aszparaginsav Asp D GAU, GAu
Glutaminsav Gin o.e.A, GAG
Fenilatsain Phe F UüG, ÜGC
Glicin Gly G GGü, GGC, GGA, GGG
Hisztidin Ki s H CAü, CAC
Xzoleucin He T AGG, AGG, AGA
Lizán Lys K AAA, AAG
Leucin Len L UUA, ÜÜG, Cüü, cuc, CGA, CGG
Metionin Mas AGG
Aszna rag.In Asn b AAG, AAC
Prolin Pro ,P CCÜ, CCC, CCA, GCG
Gintamin Gin Q CAA, CAG
Arginin Arg R CGG, GGC, CGA, A G A ? AGG
Szerín Ser .-x UCU, UCC, UCA, UCG, ÁGIG AGC
7?.S02/8£/ZAZ TÁJ
Trsonín
Thr
AGG, AGG, AGA, AGG
Valin
Val
Güb, GüC, GUA, Gü-G
Triptofán
Trp
UGG
Tire· sín
Tyr
ÜAG, ÜAC
As „L104gA23TTg egy fúziós fehérje, mely egy oldható GTLA4 mutáns molekula, és egy Tg farokhoz hozzákapcsolva egy vad típusú CTLA4 extracelluiárís doménjet tartalmazza, ami Ά29Υ (egy tirozln aminosav-maradék helyettesíti az aianrnt 29. helyzetben) és L104E (egy glutaminsav amino sav-maradék helyettesíti a ieucint a +104. helyzetbon) aminosav-cserékét tartalmaz, vagy egy olyan része, mely köti a B? molekulát (3. ábra; az Llö4EA29YIg-t kódoló DNS-t 20(10. június 20-án deponáltuk az ATCC-nél, PTA-2104 számon). A találmány szerinti eljárásokban és kitekben alkalmazott oldható LlO4EA29Yíg molekulák egy szignál- (ieader) peptid szekvenciát tartalmazhatnak, vagy nem szabad ilyet tartalmazniuk. Jellemzően a találmány szerinti eljárásokban és/vagy kitekben a molekulák nem tartalmaznak szignálpeptid szekvenciát.
A mutáns molekula egy vagy több mutációval rendelkezhet. A bejelentésben alkalmazva, egy „nem CTLA4 fehérjeszekvencía vagy „nem CTLA4 molekula jelentése valamely fehérjemoiekula, mely nem köti a Β'7-t, és nem akadályozza a CTLA4 kötődését a céimolekulához. Ennek egyik példája, de nem korlátozó módon, egy immunglobulin (lg) konstans régió vagy része. Előnyösen az lg konstans régió egy humán vagy majori lg konstans régió, például humán Gigámmá)!, mely magában foglalja a csnklórégiót, CH2 és CH3 régiót. Az lg konstans régión mutáció hajtható végre, hogy csökkentsük az effektor funkciókat (5 637 411, 5 844 0S5 és 5 433 • v.nc/mvcn: táj
131 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás),
A bejelentésben alkalmazva a „fragmens' vagy „rész egy CTLA4. molekula valamely része vagy darabja, előnyösen a CTLA4 vagy CD28 extracelluláris· dóménje vagy annak egy része vagy darabja, mely felismeri és köti a célmolekulát, például egy .87 molekulát.
A bejelentésben alkalmazva a „87 a molekulák 87 családjára utal, korlátozás nélkül ezek koré tartozik a 87-1 (CD80?
[Freeman et el., J. Immunoi. 143, 2.714-2722 (1489), mely a hivatkozással teljes terjedelmében a leírásba épüli, a 37-2 (CS86) [Freeman et al., Science 262, 369-911 (1993?, mely a hivatkozással teljes terjedelmében a leírásba épül; Azuma et al., Natúré 366,
76-79, mely a hivatkozással teljes terjedelmében a leírásba épül], melyek felismerhetik és köthetik a CTLA4-1 és/vagy CD28-t.
A bejelentésben alkalmazva a „CD28 olyan molekulára vonatkozik, mely felismeri és köti a B7-t, ahogy ezt az 5 580 756 és 5 521 288 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban leírták (mely referenciaként teljes terjedelmében a leíráshoz tartozik) ..
A bejelentésben alkalmazva, a „37-pozitív sejtek. olyan sejtek, melyek a sejtieiszínen a S7 molekulák egy vagy több típusát kifej ezik.
A bejelentésben alkalmazva a „származék egy olyan molekula, mely a .szülömolekulájavai szekvencia hasonlóságot és közös aktivitást mutat. Például egy CTL.M származék egy olyan oldható CTLA4 molekulát foglal magában, mely a vad típusú CTLA4 extracelluláris dóménjéhez legalább 70%-fcan hasonló amínosav-szekvenódával rendelkezik, és ami felismeri és köti a 87-t, ilyen példaT? .0>£./Β£/ΗΛΚ TÁJ ul a CTLA4rg vagy az LI04SA29Ylg oldható CTLA4 mutáns molekula.
A bejelentésben alkalmazva a „blokkol vagy „gátol egy receptort, szignált vagy molekulát, azt. jelenti, hogy akadályozza a receptor, szignál vagy molekula aktiválódását, mely egy szakterületen ismert teszttel kimutatható. Például egy sejtközvetített immunválasz blokkolása úgy mutatható ki, hogy meghatározzuk a reumás betegséggel járó tünetek csökkenését. A gátlás blokkolása részleges vagy teljes lehet.
A bejelentésben alkalmazva., a „87 kölcsönhatás blokkolása azt jelenti, hogy akadályozza a 87 kötődését a ligandumaihoz, úgymint a CD28~hoz és/vagy CTLAi-hez, ezáltal útját állja a T~ sejtek és B7-pozitiv sejtek kölcsönhatásának, A 87 kölcsönhatást blokkoló szerek nem korlátozó példái közé olyan molekulák tartoznak, mint egy a CTLA-4, CD28 vagy 37 molekulák valamelyikét {például 87-2-t) felismerő és kötő antitest {vagy része vagy származékai; a molekulák egy oldható formája {vagy része vagy származéka), mint például az oldható CTLA4; egy peptíd-fragmens vagy más kicsi molekula, melyet arra terveztünk, hogy megakadályozza a CTLA4/CD28/B7 közvetített kölcsönhatáson keresztüli sejrezignált. Az egyik előnyös megvalósítási módban a blokkolőszer egy oldható ÜTLA4 molekula, úgymint CTLAálg (ATCC 68829) vagy L104EA29YIg (ATCC PTA-2104), egy oldható C828 molekula, mint például CD28lg (ATCC 68628), egy oldható 87 molekula, mint például 87ig (ATüC 66627), egy anti-87 monoklonális antitest {például ATCC H8-253, ATCC CAL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301,
ATCC HB-11341 és Andersen és munkatársai 6 113 898 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásában vagy Yokochi és
Z?.eö2/»£/8AS Zár i Cí munkatársai J. Immun. 128 (2), 823--827 (1982) cikkében ismertetett monoklonális antitestek, egy anti-CTLA4 monoklonális antitest (például, as ATCC HB-304, és a 82. és 83. irodalmi hivatkozásokban leírt monoklonális antitestek) és/vagy egy anti-CD28 monoklonális antitest (például ATCC BB 11944 és az mAb 9.3, melyet Hansen (Hansen et al«, Xmmunogenetics 10, 247-260 (1280)j vagy Martin (Martin et al., J. Cián. Immun. 4(1), 18-22 (1984)]:
ismertet.
A bejelentésben alkalmazva, az „immunrendszer! betegség bármely betegség, melyet a T-sejt B7-pozitív sejtekkel való kölcsönhatásai közvetítenek, korlátozás nélkül ezek közé tartoznak az autoimmun betegségek, a beültetéssel kapcsolatos rendellenességek és az ímmunprollferativ betegségek. Az immunrendszer! betegségek példái közé tartozik a graft verses hőst betegség (GVhD) (például melyet a csontvelő átültetés okozhat, vagy a tolerancia indufcálásánál jelentkezik), a graft transzplantációs kilökődéssel, krónikus kilökődéssel, és szövet vagy sejt al lóvagy xenooraftokkal — ide értve a szilárd szerveket, bort, hasnyálmirigy szigeteket, izmokat, iépsejtekef, ideg-sejteket — járó immunrendellenességek. Az Ímmunprollferativ betegségek nem korlátozó példái közé tartozik a pszoriázis, Ϊ-sejtes limíöma, T-sejtes akut iimfobiasztos leukémia, here angiocentrikus T~sejtes limfóma, jóindulatú límfocitás angíífisz, lupusz (például lupusz eritomatözusz vagy lupusz nefritisz), Hashimoto-tíreoitidisz, primer mixödéma, Graves betegség, vészes vérszegénység, autoimmun atrófíás gasztritisz, Addíson betegség, diabétesz (például inzulinfüggő diabétesz mellitusz, ΐ-es típusú diabétesz 7 ?, SCO/SS/SAS Tk?
I.I-es good pasture mellitosz, II-es típusú diabétesz meliitusz), szindróma, miaszténia gravisz, pemfiguss, Crohn betegség, szimpátiás oftalmía., autoimmun uveagyulladás, szklerözís multiplex, autoimmun hemolitikus anémia, idiopátiás trombocitopénia, primer biiíáris cirrózis, krónikus hatású májgyulladás, fekélyes vastagbélgyulladás, Sjogren szindróma, reumás megbetegedések (például reumatoid artritisz), polimiozitísz, szkleroderma és kevert kötőszöveti betegség.
A bejelentésben alkalmazva, a „beteg nem korlátozó módon az embert, nem humán főemlősöket (például majom, emberszabású majmok) , birkát, n.yulat, disznót, kutyát, macskát, egeret vagy patkányt foglalja magában.
A bejelentésben alkalmazva a „szövet átültetés úgy határozható meg, mint egy szerv teljes szövete vagy része, melyet egy reoipiens betegbe ültettünk át. Bizonyos megvalósítási módokban a szövet egy vagy több szilárd szervből származik.. A szövetek vagy szervek például, a korlátozás szándéka nélkül a következők lehetnek: bőr, szív, tüdő, hasnyálmirigy, vese, máj, csontvelő, hasnyálmirigy sziget sejtjei, piurípotens őssejtek, sejtszuszpenziők és genetikailag módosított sejtek. A szövetet kivehetjuk egy donorból vagy in vifcro növeszthetjük. A transzplantátűz: egy autograft, ízograft, allograft vagy xenograft vagy ezek kombinációja lehet.
A bej elöntésben alkalmazva az „átültetés k.ilökődésé-t úgy határozzuk meg, hogy az az életképes graft szövet majdnem teljes vagy teljes elveszítése a reoipiens betegből.
A bejelentésben alkalmazva a „kapszulázás úgy határozható ??. etu/ss/sAs táj meg, mint egy olyan eljárás, mely ímmunológiaiiag izolálja azokat a sejteket és/vagy sejtetőpontokat, melyek a terápiás anyagokat, például az inzulint termelik és kiválasztják, és ezeknek a készítményeknek a gyógyászati alkalmazása. A kapszulázási eljárás magában foglalja, hogy a sejteket és/vagy sejt-csoportokat egy féligáteresztő membrán válaszfalon beiül helyezzük, el az átültetés előtt abból a célból, hogy elkerüljük, hogy az immunrendszer kilökje. A kapszulázó membrán molekulatömeg vágási értékét a kapszulázási eljárással szabályozhatjuk úgy, hogy kizárjuk az immunglobulin és a komplement rendszer lírikus faktorainak befelé történő diffúzióját, de lehetővé tegyük a kisebb molekulák, mint például glükóz és inzulin áthaladását. A kapszulazás lehetővé teszi, hogy a szigetsejtek fiziológiailag válaszoljanak a vér glükóz-szintgében bekövetkezelt változásokra, de meggátolja az Immunrendszer komponenseivel való érintkezést, A hasnyálmirigysejtek kapszulázási eljárásait az OS 6 08/5 412 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban írják le,
A bejelentésben alkalmazva a „ligandum egy olyan molekulára vonatkozik, mely specifikusan felismer és köt más molekulákat, például a ÜTLA4 egy ligánduma egy CD80 és/vagy CD86 molekula.
A bejelentésben alkalmazva, „egy oldható ligandum, mely felismeri es köti a. ÜD80 és/vagy CD88 antigént, olyan ligandamokat foglal magában, mint a CTLAálg, CDzSIg vagy a CTLA4 és CD28 más oldható formái; a rekombínáns ÜTLA4 és C.O28; a mutáns CTLA4 molekulák, mint például az Llö4EA29Ylg; és minden olyan antitest molekula, annak fragmentuma vagy rekombínáns kötőfehérje, mely felismeri és köti a CD80 és/vagy CD86 antigént. Ezeket az égen77 .eO2/B£/:M2jrÁJ s-e'ket „immunszuppresszív .szereknek is tekintjük.
A bejelentésben alkalmazva a „kostimulátor reakcióút úgy határozható meg, hogy az a T~sejteken és az antígénprezentálő sejteken (A?C-k) lévő kostimulátor szignálok kölcsönhatásából származó biokémiai, reakciőűt. A ko-stixnulátor szignálok segítenek meghatározni egy antigénre adott immunológiai válasz nagyságát. A CD28 és CTLA4 T-sejt receptorok és az APC-ken lévő CDüö és/vagy CD86 molekulák közötti kölcsönhatás egy kostimulátor szignált biztosit.
A be jelentésben alkalmazva a „CűÜO és/vagy CD'86 magában foglalja a B7~l~t (CDöO-nak is hívják), 37-2-t (CDSS-nak is hívják) , B7-3-t (CD74-nek is hívják), és a 37 családot, például a 37-1, 37-2 és/vagy 37-3 kombinációját.
A be jelentésben alkalmazva a ,, kostimulátor blokád úgy határozható meg, hogy az egy vagy több olyan szer beadási eljárása egy betegnek, mely szerek akadályoznak vagy blokkolnak egy fentebb ismertetett kostimulátor reakciöutat. A kostimulátor reafccióutat akadályozó szerek példái közé tartoznak, de nem korlátozó módon, az oldható CTLA4, mutáns CTLA4, oldható CD23, anti~S7 monoklonális antitestek {mAb-k}, oldható CD40 és anti-gp39 mAb~k. Az egyik megvalósítási módban az L104£A29YIg egy olyan előnyös szer, mely megakadályozza a kostimulátor blokádot.
A bejelentésben alkalmazva a „T-sejt mentesített csontvelő úgy határozható meg, hogy olyan csontból kivett csontvelő, mely egy T-sejt ellenes eljárásnak lett alávetve. A T-sejt ellenes eljárás ügy határozható meg, hogy az egy eljárás a T-sejtek eltávolítására a csontvelőből. A T-sejteket szelektíven eltávolító z t:e· v: táv
3 «· módszerek a szakterületen jól ismertek. T-sejt ellenes eljárás például, amikor a csontvelőt T-sejt specifikus antitesteknek, mint például a.nii~CD3~nak, anti~CD4~nek, anti-CDS-nek, antí-CDSnak és ant.i~CD9Ö monoklonális antitesteknek tesszük ki, ahol az antitestek citotoxíkusak a T-sejtre. Alternatív megoldásként az antitesteket egy mágneses részecskékhez kapcsolhatjuk, hogy lehetővé tegyük a T-sejtek eltávolítását a csontvelőből mágneses mezőt alkalmazva. Egy másik példa a T-sejt ellenes eljárásra, amikor a csontvelői T-sejteket anti-iimfocita szérumnak vagy anti-timooita giebülínnak tesszük ki.
A bejelentésben alkalmazva a „T-sejt mentesített csontvelő tolerizálő dózisa kifejezés úgy határozható meg, hogy az a T-sejt mentesített csontvelő azon kezdeti dózisa, melyet egy betegnek abból a célból adunk be, hogy inaktíváljuk a potenciálisan donor-reaktiv T-sejteket.
A. bejelentésben alkalmazva a „T-sejt mentesített csontvelő átültetési dózisa kifejezés ügy határozható meg, hogy az a T-sejt mentesített csontvelő egy olyan következő dózisa, melyet egy betegnek abból a célból adunk be, hogy kevert hematopoietikus kimérismust hozzunk létre. A T-sejt mentesített csontvelő átültetési dózisát következésképpen a T-sejt mentesített csontvelő tolerizálő dózisa után fogjuk beadni.
A bejelentésben alkalmazva a „kevert hematopoietikus kimérizmus úgy határozható meg, hogy az a donor és recipiens vér progenitor és érett sejtek (például vér eredetű sejtek) jelenléte immunválasz jelenléte nélkül (vagy kimutathatatlan jelenlétében) .
TJ.882/8E/2M TÁJ
A bejelentésben alkalmazva a „donor-recípiens párosítások-at a molekuláris tipizálás alapján határozzuk meg a korábban meghatározott fő hisztokompafcibilitásí allélek (8 I. osztály és 12 II. osztály) egy paneljét alkalmazva [Lobashsvsk.y A. et al., Tissue Antigéné 54, 254-253 (1999); Knapp L. A. et al,, Tissue Antigens 52, 657-651 (1997); Watkins D. I., Crit. Rév. Immunoi. 15, 1-19 (1995)1. A párosításoknál maximalizáltuk a különbözőséget az 1. és II. osztály lótuszainál.
Ά bejelentésben alkalmazva a „bead vagy „beadás bármely módon történő beadást jelent, ezek közé tartozik az intravénás (i.v.)· beadás, az intrap-eritoneálís (i.p.) beadás, az .intramuszkuláris (i.m.) beadás, a szubkután beadás, szájon át történő beadás, kúpként vagy helyileg történő beadás vágy egy lassú hatóanyag-leadásé eszköz, mint például, egy mini-ozmotikus pumpa beépítése a betegbe.
A bejelentésben alkalmazva a „gyógyászatilag elfogadható hordozó bármely olyan anyagot jelent, mely a hatóanyaggal kombinálva megtartja a hatóanyag aktivitását, például a kötési spécifitast és nem reaktív a beteg immunrendszerével. Ezek közé tartoznak, de nem kizárólagosan, a szokásos gyógyászati hordozok valamelyike, úgymint foszfát-púi férőit sóoldat,· víz, emulziók (például olaj/víz emulzió), és a nedves 1. fős serek különböző típusai. Egyéb hordozók közé tartoznak a steril oldatok; tabletták, ide értve a bevont tablettákat és kapszulákat. Jellemzően az ilyen hordozók kötőanyagokat tartalmaznak, úgymint keményítőt, tejet, cukrot, az agyag bizonyos típusait, zselatint, sztearinsavakat vagy sóit, magnézium- vagy kaicium-sztearátot, talkumot, ? .soz/be/k&z -nő növényi zsírokat vagy olajokat, gumikat, gliko-iokat vagy más ismeri kötőanyagokat, Az ilyen hordozóanyagok tartalmazhatnak ízes színadalékokat vagy más alkotórészeket.. Az ilyen hordozókat tartalmazó készítményeket jól ismert hagyományos módszerekkel forma1á zhat j u k.
A bejelentésben alkalmazva az „íimranszuppresszív szerek kifejezés úgy határozható meg, hogy az egy vagy több olyan molekulatípussal rendelkező készítmény, melyek meggátolják egy immunválasz előfordulását vagy gyengítik a beteg immunrendszerét.
Előnyösen a szerek lecsökkentik vagy meggátolják a T-sejt proliferáoíót. Bizonyos szerek ágy gátolhatják meg a T-sejt proliiérációt, hogy gátolják a T-sejtek kölcsönhatását más antigénprezentáló sejtekkel (APC-k). Az antigénprezentálő sejtek egyik példáját a B-sejtek képezik. Azoknak a szereknek, melyek akadályozzák a T-sejt kölcsönhatásait az antigénprezentálő sejtekkel, és ezáltal gátolják a T-sejt~proliterációt., nem korlátozó példái közé tartoznak a CbSö és/vagy CDS6 antigének ligandumai, a CTLA4 antigén ligandumai, a CD£8 antigén ligandumai. A CD60 és/vagy CDS6 antigének Ugandáméinak nem korlátozó példáit képezi az •oldható CTLA4, oldható CD28 vagy azok a monoklonális antitestek, melyek felismerik és kötik a CD8Ö és/vagy CDS6 antigéneket vagy fragmsnseít Egy előnyös szer az L104SA29YIg. A CT1A4 vagy CD28 antigének ligandumai közé tartoznak azok a monoklonális antitestek, melyek felismerik és kötik a CTLAi-t és/vagy a CDzB-at vagy ezek fragmenseit, A CTLA4 vagy CD28 egyéb ligandumai közé tartoznak az oldható CD80 és/vagy CD86 molekulák, mint például a
CD80 és/vagy CDséig. A szakterületen jártasak számára világosan 77.SS2/&S/RM TÁJ *
érthető, hogy más szerek vagy ligandumok is alkalmazhatóak a DCD28-nak a CDSö-nai és/vagy CD86~taI való kölcsönhatásának gátlására .
Az immunszuppresszív szerek köze tartoznak, de nem kizárólagosan, a metotrexat, ciklofoszfamid, ciklosporin, ciklosporin A, klórokén, hídroxi-klorokin, szuifaszalazín (szüliaszslazopriin), aranysak, D-pimicillamin, ieflunomíd, azatioprén, anakínra, infiximab (REMICADES) , stanercept, TNFu. blokkolók, valamely gyulladásos citokint megcélzó biológiai ágens és nem szteroid gyulladásellenes szerek (bSAID-ok) . A NSAlD-ok közé tartoznak, de nem kizárólagosan az aoetii-szálíciisav, kolin-magnézium-szalicilát, diflunizal, magnézlum-szalícllát, s-zalszalát, nátrium-szalicilét, diklofenak, etodoiak, fenoprorén, £ lurbiprofén, índometaoln, ketoprofén, meklofenamát, naproxén, nabumeten, feni Ibut azon, piroxikaxr, szulindak, tolmetin, acetaminofen, ibuprofén, Cox-2 inhibitorok és trámadol.
A TALÁLMÁNY SZERINTI KÉSZÍldÉblEK
A találmány rendelkezésre bocsát az 1. igénypontban meghatározott oldható CTLA9 mutánsokat immunbetegségek, így diabétesz kezelésében, transzplantátum. kilökődések, igy diabétesz kezelése céljából végzett szigetsejt átültetés kilökődés meggátlására és emberben T-sejt funkció gátlására, de nem T-sejt mentesítésre való alkalmazásra. Az oldható CTLA4 mutánsok példái közé tartozik az blO4EA29Ylg, LI04EA29LIg, L109EA29TIg és L104EA29WIg.
A mutáns vagy vad típusú szekvenciákkal rendelkező CTLA4 molekulák oldhatóvá tehetők a CTLA4 transzmembrán részének kiiktatásával [Oaks, EL K. et al., Cel.lu.lar Immunology 201, 144-153 (2000)1. ?7.S02/B£/R?m TÁJ
Alternatív lehetőségként a mutáns vagy vad típusú szekvenciákkal rendelkező- CTLA4 molekulák fúziós fehérjék lehetnek, ahol a CTLA4 molekulák nem CTLA4 moleku'larészekhez, úgymint immunglobulin (Tg) molekulákhoz vannak fuzionálva, melyek a C1LA4 molekulákat oldhatóvá teszik. Például egy CTLA-4 fúziós fehérje tartalmazhatja a CTLA4 extracelluláris dóménjét egy immunglobulin konstans doménhez fuzionálva, mely a CTLMlg molekulát eredményezi (2. ábra) [Lin-s-ley P. S. et al., Immaníty p, 793-80 (199-45 ].
A klinikai eljárások céljára előnyös, ha sz immunglobulin régió nem vált ki káros immunválaszt egy betegben. Előnyös molekula rész az immunglobulin konstans régió, ide értve a humán ós majom immunglobulin. konstans régiókat. Egy megfelelő immunglobulin régió például a humán Cyl, mely tartalmazza a csuklórégiót, CH2 és CH3 régiókat, melyek effektor funkciókat közvetíthetnek, -úgymint az Fo receptorokhoz, való kötődést, a komplement-függő citotox-ícitást (CDC) vagy az antitest-dependens sejt-közvetített citotoxicitást (ADCC) közvetíti. Az immunglobulin részben egy vagy több mutáció lehet (például, a CH2 doménfoen, ami lecsökkenti az effektor funkciókat, úgymint a CDC-t vagy ADCC-t), ahol a. mutáció módosítja az immunglobulin kötési képességét a ligandumával szemben, növelve vagy csökkentve az immunglobulin kötési képességét az Fc receptorokhoz. Például az immunglobulinban lévő mutációk cseréket foglalhatnak magukban a csuklórégióban lévő valamely vagy összes ciszteinmaradékban, például a 4-13-0., 4136. és 4139. helyrétekben lévő oi.sztein.eket szerin helyettesíti (24. ábra) . Az íímcung lobul in molekulában egy s-zerín helyettesítheti a prolint a 4148. helyzetben, ahogy a 24. ábrán bemutatjuk. To-váb77 ,βΟΖ/δΚ/ΒΛί- TÁJ a fi
3» bá as immunglobulin részben lévő mutációk közé tartozik a + 144, helyzetű ieucln helyettesítése fenilaianinnal, a +145. helyzetű leucin helyettesítése giutaminsavval, vagy a +147., helyzetű giicin helyettesítése aianlnnai.
További, az oldható CTLA4 molekulákban vagy oldható CTLA4 mutáns molekulákban történő alkalmazásra szolgáló, nem CTLA4 részek közé tartoznak, de nem kizárólagosan, a p97 molekula, env gp!20 molekula, S7 molekula és óva molekula [Dash B. et al<, J,
Gén. Vlrol. 7 5 (Ft 6), 1389-97 (1994); ikeda T. et al., Gene
138(1-2), 193-6 (1994); kaik K. et al., Gell. Immunoi. 150(2),
447-52 (1993); Fujísaka K. et al., Virology 204(2), 789-93 (1994)1. Más molekulák is lehetségesek (Gerard, C. et al., beuroscíence 62(3), 721 (1994); Byrn R. et al., 63(10), 4370 (1989); Smíth, D. et al. Science 238, 1704 (1987); Lasky L., Science 233, 209 (1996).
A találmány szerinti oldható CTLA4 egy szignálpepfid szekvenciát foglalhat magában, mely a molekula CTLA4 része extraeeilulárls doménjónek d-termlnálls végéhez kapcsolódik. A szignálpeptid bármilyen szekvencia lehet, mely lehetővé teszi a molekula szekrécióját, ezek közé tartozik az onkosztatin M-böl származó szignálpeptid^ [Malik et al,, Molec. Coll. Bioi. (9, 2897-2853 (1989)1, vagy a CDS-ből [Jones N. h, et al., betűre 323, 346-349 (1986)1, vagy valamely extraceiluiáris fehérjéből származó szignálpeptid. A találmány szerinti oldható CTLA4 .molekula tartalmazhatja az onkosztatin M szignálpeptídet a CTL&4 extraceiluiáris doménjónek N-terminális végéhez kapcsolva, és a humán immunglobulin molekulát (például csukló, CH2 és CH3) a CTLA4 extra29 celluláris dóménjének. (vadtípusú vagy mutáns; C~terminális végéhez kapcsolva, Ez a molekula magában foglalja, az onkosztatin M szignálpeptídet, mely egy a -26, helyzetű met.ion intól a -I. helyzetű aleninig tartó aminosav-szekvenciát tartalmas, a CTLA4 részt, mely a +1. helyzetű metionintél a +124, helyzetű aszparaginsavig tartó aminosav-szekvenciát tartalmazza, egy kapcsoló giutamin aminosav-maradékot a +125. helyzetben, és az immunglobulínrészt, ami a +126, helyzetű glataminsavtól a +357, helyzetű lizinig tartó aminosav-szekvenciát tartalmazza.
Az egyik megvalósítási módban a találmány szerinti oldható CTLA4 mutáns molekulák, melyek az alább leirt mutáns GTLA4 szekvenciákat tartalmazzák, olyan fúziós molekulák, melyek mutáns CTLA4 fragmentumokhoz fuzionált humán igC (gamma) '1 (azaz IgCyl) részeket tartalmaznak. Az oldható CTLA4 mutáns molekulák egy vagy több mutációt tartalmazhatnak (például aminosav-szubsztitűciók, deléciékat vagy inszerciókat) a CTLA4 extraosiluláris dóménjében.
Például az oldható CTLA4 mutáns molekulák a +25. helyzetű szerintöi a +33. helyzetű argininíg terjedő régió szoros közeiében tartalmazhatnak mutációt vagy mutációkat (például S25-R33, a szokásos egyhetes aminosav-szimbólnmokat alkalmazva). á mutáns
CTLA4 molekula a kővetkező pozíciók közül egynél vagy többnél.
egy amínosav-szubsztitűclót tartalmazhat: S25, P26, G27, K.28,
A29, T30, E31. vagy P33,
Egy másik megvalósítási módban az oldható CTLA4 mutáns molekulák a +95. helyzetű glutaminsavtél a +10+. helyzetű glicinig terjedő régió szoros közelében tartalmazhatnak mutációt vagy mn7?,802/3S/'FAS ZAJ *
tációkat (például E95-G187). A mutáns CTLA4 molekula a következő pozíciók közül egynél vagy többnél egy aminosav-szubsztitúciőt tartalmazhat: K93, L96, b97, í'98f P9S, P100, Pici, ¥102, Y103,
1104, Glöö, I1Ö6 és G107.
Továbbá a találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosít, melyek a +108. helyzetű aszparagintői a +115. helyzetű izoieucinig terjedő régió szoros közelében mutációt, vagy mutációkat tartalmazhatnak (például $108-1115). A mutáns CTLA4 molekula a következő pozíciók közül egynél vagy többnél tartalmazhat amine— sav-szubsztitúciót: L1Ö4, Glűö, 1186, G1Ö7, Qlll, ¥113 vagy 1115).
Az egyik megvalósítási módban az oldható CTLA4 mutáns molekulák IgCyl-t tartalmaznak az extracelluiáris doménben egyszeres mutációt tartalmazó CTLA4 fragmentumhoz fuzionálva. A CT1A4 eztraoelluiárís dómén a +1. helyzetű metioníntől a +124. helyzetű aszparaginsavig tartó részt (például. 1. ábra) tartalmazza. A CT.LA4 extrace Halár is része a -1. pozíciótól, a +124. helyzetű aszparaginsavig tartó részt (például 1. ábra) tartalmazhatja.
Az egyszeres mutációk közé a következők tartozhatnak, ahol a
* ·ι
LlOsKig lizin AAG
LlOéElg arginin CGG
LlOiGlg gliein GGG
Továbbá a találmány olyan mutáns molekulákat biztosít, melyek a CTLA4 kétmutációs extracelluláris dóménjóval rendelkeznek, mely egy lg Ovi moleknlarészhez van fuzionálva. Ezek példái közé tartoznak a következők; ahol a +104. helyzetű leucin egy másik aminosavra van cserélve (például glutaminsavra) és a +105. helyzetű gliein, a +25. helyzetben szerín, a +30. helyzetű treonin vagy a +2.9. helyzetű alanin valamely más aminosavra van kicserélve:
Kétszeres mutánsok Ködoncsere
adOiEGlöűFIg fsnilaisnín TTC
Llö4£G105WIg triptofán TGG
LlOiSGlOSLIg leucin C7T
LlíMESzSRTg arginin CGG
L104ET30GIO gliein GGG
L104ET30bIg aszparagin AAT
rlO4EA29TIg tirozín TAT
LlOdEáléLIg leucin TTG
hlO4EA29Tlg treonin AGG
L104EA29WIg t r i pto fán TGG
?”,eö2/SK/RS.Z_TÁZ
Továbbá a találmány olyan mutáns molekulákat biztosít, melyek a CTL&4 három mutációs extracelluláris doménjével rendelkeznek, mely egy lg Gyl molekularészhez van fuzionálva. Ezek példái közé tartoznak a következők: ahol a +104. helyzetű leucin egy másik aminosa-vra van cserélve (például glutaminsavrs.) , a +29. helyzetű alanin egy másik amínosavra van kicserélve (például tirozinra), és a -+25. helyzetű szerín egy másik aminoeavra van kicserélve:
Káromé wzos mutánsok Ködonesere
1104EA29YS25Elg lizín AAA.
L104EA29YS2öKlg lizín AAG
Liü4EA29YS2Skig a s zp a ra g ί n A AC
L104EA29YS25Rlg argínin. CÉG
Az: oldható CTLA4 mutáns molekuláknak lehet egy kapcsoló- aminosav-maradékuk, mely a molekula CTLA4 része és az lg része között helyezkedik el. A kapcsoló amínosav bármilyen amihosav lehet, ide értve a glutamint is. A kapcsoló amínosav a szakterületen ismert molekuláris vagy kémiai szintéziséé- módszerekkel építhető be.
A találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosit, melyek egyszeres mutációt tartalmaznak a CTIA4 extracelluláris doménjében, úgymint az LÍG4EIg~t (mint a 19. ábrán) vagy az LiOlSig-t, ahol az L104'S'Ig és az LlOiSIg olyan mutációkon esett át a CTLA4 szekvenciákban, hogy a +104. helyzetű leucint gluta™ ainsav, illetőleg .szerin helyettesítse. Az egyszeresen mutáns molekulák továbbá, a -ti. helyzetű metróníntól a +124. helyzetű aszparaginsavig tartó CTLA4 részt, a + 125. helyzetben egy glutamin. kapcsoló aminosavst, és a +126. helyzetű glutaminsa'vtól a +357. helyzetű iizinig tartó immunglobulin részt tartalmazzák,. A mutáns molekula immunglobulin része szintén mutációnak vethető alá, hogy a +130., +136. és 139, helyzetű ciszteinsk szerinre legyenek kicserélve, és a +148. helyzetű prollnt szerinnel cseréljük kl. Alternatív .lehetőségként az egyszeres mutáns oldható CTLA.4 molekula egy olyan CTLA4 résszel rendelkezik, mely a -1. helyzetű alaníntői a +124, helyzetű aszpara-ginsavig terjedő részt öleli fel.
A találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosit, melyek kétszeres mutációt tartalmaznak a CTLA4 extracelluláris doménjében, mint például az L104EA29Yig, nlO4EA2911Ig, LÍÖ4EA291ug vagy LlQ4EA29HIgf ahol a +104. helyzetű ieucínt egy glutaminsavval cseréltük, ki, és a + 29. helyzetű alanint tiroz ínnal, lene innal, treoninnal vagy triptofánnai cseréltük ki. Az Llö4BA29Ylg, L104£A29LIg, nlö4bA2911g és L1Ö4EA29V1XC szekvenciája a +1. helyzetű metioninnál kezdődik és a +357, helyzetű iizinnéi fejeződik be, valamint egy szignál- (leader) szekvenciát tartalmaz, a szekvenciákat a 3. illetőleg 20-22. ábrákon mutatjuk be, A kétszeresen mutáns molekulák továbbá tartalmaznak a +1. helyzetű metionintől a +124. pozícióig tartó C1LA4 részeket, a +125. helyzetben egy -glufcamin kapcsoló aminosav-maradékot, és a +12 6. helyzetű glotaminsavtői a +357. helyzetű üzlnig tartó immunglobul ínrészt. A mutáns molekula immunglobulin része szintén mutációnak vethető alá, hogy a +130,, +136. és 139. helyzetű ciszternákét szerinre cseréljük ki, és a +148. helyzetű prollnt szerinnei cseréljük ki. Alternatív lehetőségként ezek a mutáns molekulák egy olyan CTLA4 résszel rendelkezhetnek, mely a -1. helyzetű alanintoi a +124. helyzetű aszparaginsavio terjedő CTLA4 részt öleli fel.
A találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosit,
77.8Ü2/BS/H&S TÁJ melyek kétszeres mutációt tartalmaznak a CTLA4 eztraeeiluXáris dóménjében, mint például az L104SGlö5FIg, L104EG105Wig vagy LlöéEGlOSLIg, ahol a +104. helyzetű leucint egy giutaminsavval cseréltük ki, és a +105. helyzetű glicint fenilalanínnal, tríptofánnal Illetőleg leucinnai cseréltük ki. A kétszeres mutáns molekulák továbbá tartalmaznak a +1. helyzetű met ionintői a +124. pozícióig tartó ClLAá részeket, a +125. helyzetben egy glutamin kapcsoló aminosav-maradékot, és a +126. helyzetű glutaminsavtöl a +357. helyzetű líziníg tartó immunglobulinrészt. A mutáns molekula immunglobulin része szintén mutációnak vethető alá, hogy a +130., +136. és 133. helyzetű ciszteineket szerinre cseréljük ki, és a +148. helyzetű pro!int szerinnei cseréljük ki. Alternatív lehetőségként ezek a mutáns molekulák egy olyan CTLA4 résszel rendelkezhetnek, moly a -1. helyzetű alanintól a +124. helyzetű assparaginsavíg terjedő CTLA4 részt öleli fel.
A találmány az L104ES2SRIg---t biztosítja, mely egy kétszeresen mutáns molekula, ami tartalmazza a. +1. helyzetű metionintöl. a +124. pozícióig tartó CTLA4 részt, a +125. helyzetben egy giuéamin kapcsoló amlnosav-maradékot, és a +126. helyzetű glutaminsavtól a +357. helyzetű lizínig tartó ímmunglobulinrészt. A
CTLA.4 extracellulárís részével rendelkező részt mutációnak vetjük alá, hogy a +25. helyzetű szerint argíninra cseréljük ki, és a +104. helyzetű leucint giu+eminsavvai cseréljük ki. Alternatív lehetőségként a Llö4ES25RXg egy olyan CTLA4 résszel rendelkezhet, mely a -1. helyzetű aianinté! a +124. helyzetű aszparaginsavig terjedd CTLAí részt öleli fel.
7?.so2/tn:/so.f: hu
A találmány olyan oldható- CTLA4 mutáns molekulákat biztosit, melyek kétszeres mutációt tartalmaznak a C7LA4 extraceiluláris dóménjében, mint például az L104£T3űGlg, L104ST30Elg, ahol. a 4-104. helyzetű leucint egy glutaminsavval cseréltük ki, és a. + 30. helyzetű treonint glicinnel illetőleg as-zparaginnal cseréltük ki. A kétszeres mutáns molekulák továbbá tartalmazzák a +1.
helyzetű metionintéi a +124, pozícióig tartó- CTLA4 részeket, a. + 125. helyzetben egy kapcsoló amino-sav-maradékot, -és a. +126. helyzetű glutaminsavtől a +357. helyzetű lízinig tartó immunglobulin részt . A mutáns molekula immunglobulin része szint-én mutációnak vethető alá, hogy a +130,, +136, és +139, helyzetben lévő ciszteineket szerinre cseréljük ki, és a +148-. helyzetű proldnt szerínnel cseréljük kí, Alternatív lehetőségként ezek a mutáns molekulák egy olyan CTLA4 résszel rendelkezhetnek, mely a -1. helyzetű alanintél a +124. helyzetű aszparaginsavig terjedő
CTLA4 részt öleli fel.
A találmány olyan oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosit, melyek háromszoros mutációt tartalmaznak a CTLA4 extracelluláris doménjében, mint például az ÜÍ04EA2$YS25KIg, E104EA29YS25hIg, L104EA29YS25űIg, ahol a +104. helyzetű leucint egy glutaminsavval cseréltük ki, a +29. helyzetű alanínt tirozinná szabsztituáltuk és a +25. helyzetű szerint lizinre, aszparaginra illetőleg argininra. cseréltük ki. A háromszoros mutáns molekulák továbbá tartalmazzák a. +1. helyzetű metíonintói a +124. pozícióig tartó CTLA4 részeket, a +125. helyzetben egy glutamin kapcsoló aminosav-maradékot, és a +126, helyzetű, glutaminsavtől a +357.
helyzetű lízinig tartó immunglobuiinrészt< A mutáns molekula im77.302/BS/BA3 ZÁZ mungiobulín része szintén mutációnak vethető alá, hogy a +130-, 4-13-6. és +139. helyzetben lévő císzteineket szerínre cseréljük ki, és a +148. helyzetű prolinfc szerínnel cseréljük ki, Alternatív lehetőségként ezek a mutáns molekulák egy olyan CTLA4 részszel rendelkezhetnek, mely a -1. helyzetű ala.nintól a +124. helyzetű aszparagínsavlg terjedő CT.LA4 részt öleli fel.
Az oldható CTLA4 mutáns molekulák további megvalósítási módjai közé tartoznak azok a klméra CTLA4/CD28 homológ mutáns molekulák, melyek kötik a B7-t (Beach, R. J. et al., J. Exp, Med.
180, 2049-2058 (1994)], Ezeknek a klméra CTLA4/CD28 mutáns molekuláknak a példái közé tartoznak a HS1, HS2, HS3, ES4, HS5,
HS6, HS4A, B.S4B, H57, HS8, BS3, KS1Ö, HSli, BS12, HS13 és HS14 (S 773 253 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ) ,
A találmány előnyős megvalósítási módjait képezik az oldható CTLA4 molekulák, úgymint a CTLAálg (melyet a 2. ábrán mutatunk be, és a +1, helyzetű met.ion Irmái kezdődik, és a +357. helyzetű 11zínig tart), és az LiOÓEAzSYIg oldható CT1A4 mutáns (melyet a 15. ábrán mutatunk be, és a +1. helyzetű metíoninnál kezdődik és a +357, helyzetű iizinig fart).
A találmány továbbá olyan nukleinsav-molekuiákat biztosít, melyek a találmány szerinti oldható CTLA4 molekuláknak, megfelelő aminosav-szekvenciákat kódoló nukleotíd-szekvenciákat tartalmaznak. Az egyik megvalósitási módban a nufcleinsav-molskula egy DNS (például cDNS) vagy annak egy hibridje, A CTL.Mlg-t kódoló ONS-t (2. ábra) 1991. május 31-én helyezték letétbe az American Type
Culture CoXleeciom-nái (AT1C), 10801 University Slvd., Manassas,
VA 20110-2209, és ATCC 68629 deponálási számot kapott. Az Llö4EA29YXg~t kódoló DNS-t (szekvenciáját a 3, ábra tartalmazza} 2000. június 20-án lett 'letétbe· helyezve az ATCC-néi, PTA-2Í04 számon. Alternatív lehetőségként a nukleinsav-molekula OS vagy egy hibridje.
CTLA4 HIBRIDEK
A találmány oldható CTLA4 mutáns molekulákat biztosit, melyek legalább a CILA4 extraceííuíáris- dóménjét vagy annak olyan részeit tartalmazzák, melyek kötik a CDSO-t és/vagy CD86-t. A CT LA 4 -extraceííuíáris· része a ti. helyzetű metionintól a. + 124. helyzetű aszparaginsavig tart. (például I. ábra). A CTBA4 extracelluláris része tartalmazhatja a -1. helyzetű alenintői a *124. helyzetű aszparaginsavig: tartó részt ís (például 1. ábra). A CTLA4 extraceííuíáris része a + 95. helyzetű giutamíntól a +120. helyzetű ciszteinig tartó· részt tartalmazhatja. A. CTLA4 extraceliuiáris része a. +1. helyzetű metionintől a + 21. helyzetű ciszteinig tartó részt és a t95. helyzetű gintaminsavtél a +122. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraceííuíáris része a + 1. helyzetű merionintól a + 23. helyzetű tirozinig tartó részt és a +32. helyzetű valintöl a +122. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja, A CTLA4 extraceliuiáris része a +24. helyzetű aianintői a +31. helyzetű gl.utaminsavig tartó részt és a + 95, helyzetű glufcaminsavtól a +122, helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraceííuíáris része a +24. helyzetű alanintól a +31. helyzetű glutaminsavig tartó részt és a + 95. helyzetű giutaminsavtól a +112. helyzetű ízoiencinig tartó reszt tartalmazhatja,
77.S32/SS/SA2
A CTLA4 exfcraceliulárxs' része a 424. helyzetű alanintöl a 431, helyzetű giutaminsavig tartó részt és a 413. helyzetű tlrozintői a 4-122. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhat ja, A CT1A4 extracelluiáris része az 4-50. helyzetű glutaminsavtól az 457. helyzetű glutaminsavig tartó részt, és a 4-95. helyzetű glutaminsavtól a 4122. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluiáris része az 424. helyzetű alanintöl a 431. helyzetű glutaminsavig tartó részt, és a tSö. helyzetű alanintöl az 457, helyzetű glutaminsavig tartó részt és a 495. helyzetű giutaminsavtöl a 4122, helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluiáris része a 450.
helyzetű alanintői az 457, helyzetű glutaminsavig tartó részt és a 4 95, helyzetű giutaminsavtöl a 4-112. helyzetű izoleucínig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluiáris része a 424, helyzetű alanintöl a 431. helyzetű glutaminsavig tartó részt, a 450. helyzetű alanintői a 457, helyzetű glutaminsavig tartó részt; és a 405. helyzetű glutaminsavtól a 4122, helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluláris része a 4.24, helyzetű alanintöl a 494. helyzetű valinig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluiáris része a -I, helyzetű alanintöl a 421, helyzetű ciszteinig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracelluiáris része a +1. helyzetű alanintöl a 421. helyzetű ciszteinig tartó részt tartalmazhatja.
A CTLA4 extracelluiáris része a 495. helyzetű giutamín-savtől a
4122, helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A
CTLA4 extracelluiáris része a -1, helyzetű alanintöl a 494.
helyzetű valiníg tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracel'77 .iCC-C/íCC :'Á,7 luláris része a +1. helyzetű mer ioníntól a + 94. helyzetű valinig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extracalluiáris része +24, helyzetű alanintól a +31. helyzetű gXutaminsavíg tartó részt tartalmazhatja. A. CTLA4 ezfcracelluláris része a -1, helyzetű alanintól a +23. helyzetű tirozinig tarts részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraceiluláris része a +1. helyzetű metionintol a +23.. helyzetű tirozinig tartó részt tartalmazhatja. A CT.LA4 extraceilaláris része a +32. helyzetű val intól a +122.. helyzetű aszparagínsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraeeliuláris része a +113. helyzetű tírozintől a +122. helyzetű aszparaginsavig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraceiluláris része a +95. helyzetű glutaminsavtől a +112. helyzetű izoleucinig tartó részt tartalmazhatja. A CTLA4 extraceiluláris része a +50. helyzetű alanintől a +57. helyzetű glutaminsavig tartó részt tartalmazhatja.
ELJÁRÁSOK A TALÁLMÁNY SZERINTI MOLEKULÁK ELŐÁLLÍTÁSÁRA
A CTLA4 mutáns molekulák expressziója prokarióta sejtekben lehetséges, A proksríőtáfcat leggyakrabban különböző baktériumtörzsek képviselik. A baktériumok gram-pozítivak vagy gram-negatívak lehetnek. Más mikrobiális törzseket is alkalmazhatunk.
A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleotití-szekvenciákat egy az idegen szekvenciák prokarióta sejtekben, mint például E, coliban történő expressziőjára tervezett vektorba inszertalhatjuk. Ezek a vektorok szokásosan alkalmazott prokarióta. kontroli szekvenciákat foglalhatnak magukban, melyeket a bejelentésben ügy határozunk meg, hogy a transzkripció iniciálására szolgáló promotereket foglalja magában, adott esetben egy operátorral “ t ZíU/BS/KAX + .· együtt# és riboszőma kötőhely szekvenciákat együtt, melyek közé olyan általánosan alkalmazott proxnóterek tartoznak, mint a béta-laktamáz (pániéi Hínár) és a Íaktóz (lac) promóter rendszer [Chang et al., Natúré 199 , 1056 {1977)}# a tríptofán (trp) promóter rendszer [Goeddei et al., Nuc.'leic Acids Rés. Et, 4057 (19805] és a lambda eredetű PL promóter és az li-gén riboszómakötö hely [Shimatake et al., Pátere 292, 128 (1981)].
Ezek az expressziös vektorok replikációs origókat és szelekciós markereket, mint például, antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító béta-laktamáz vagy neomicin foszfotranszferáz gént is tartalmazhatnak úgy, hogy a vektorok a baktériumokban replíkálódul tudjanak, és a piazmidokat hordozó sejteket szelektálni lehessen, amikor azt antibiotikumok, úgymint ampioiliin vagy kanax8.itin jelenlétében növesztjük.
Az expressziös plazmidot a prokariőta sejtekbe különböző standard eljárásokkal vihetjük be, ide tartozik, de nem kizárólagosan a CaCi.s-sofck [Cohen, Proc. háti, Acad. Sói. USA 69, 2110 (1972), és Samforook et al,, (szerk.) „Molecular Cloning; A Laboratory Manuai, 2. kiadás, Cold Spring Harcot Press (1989)] és az eiektroporáciö.
A találmány megvalósítása szerint az eukariöta sejtek szintén alkalmas gazdasejtek. Az eukariöta sejtek közé tartoznak például az állati sejtek, akár primer akár halhatatlanná tett sejtek, az élesztő (például Saceharornyces cerevisiae, Schizosaccbaroxsyces pombe és Piohia psstoris), és növényi sejtek, A gazdákként alkalmazható állati sejtek példáit képezi a mielöma, COS és CSŐ sejtek. A CHO sejtek közé tartozik nevezetesen, de nem kizárőla?7,fmzzas./!uz.
gc-san a DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Mole-c. -Génét. 12, 555-556 (1986); Kolkekar, Biochemiatry 36, 10801-10908 (1937)], CHO-Kl (ATCC CCL-61), CHO-Kl Tet-On sejtvonal {Clontech), ECACC 85050302 jelű CHO (CAMR, Salísbury, Mltshire, UK) , CHO 13 klón (GETMG, Genova, IC), CHO B klón (GE1HG, Genova, IT) , ECACC 33061607 jelű CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiitshíre, OK), és az ECACC 92052123 jelű RR-CROK1 (CAHR, Salisbury, Wiltshíre, UK) . A növényi sejtek példái közé tartoznak a dohány (teljes növények, sejttenyészet vagy kaliusz), kukorica, szója és rizs sejtek. Kukorica, szója és rizsmagok is elfogadhatóak.
A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleotid-szekvenciákat egy olyan vektorba illeszthetjük fos, melyet idegen szekvenciáknak egy eukarióta gazdában történő expresszíójára terveztünk. A vektor szabályozó elemei az adott eukarióta gazdától függően változhatnak. Az LI04EA29Ylg-t kódoló nukieinsav-molekulát a pD16Llö4EA29Ylg tartalmazza, és 2ÖÖ0. június 19-én az American Type Culture Coilection-nái (ATCC), 10801 University Blvd., Hanassas, VA 20110-2209 ATCC PTA-2I04 számon helyeztük letétbe. A pD16L104EA2:9iTg vektor a pcDKA3 vektor (INVITROGEN) egy származéka .
Az expressziős vektorokban történő alkalmazásra szolgáié általánosan alkalmazott eukarióta kontroll szekvenciák közé tartoznak az emlős sejtekkel kompatíbilis promoterek és kontroll szekvenciák, mint például a CM7 promőter (CDM8 vektor) és a madár szarkóma vírus (ASV) (nLK vektor) . Egyéb szokásosan alkalmazott promoterek közé tartoznak a Símian vírus 40 (SV40)~bŐI származó korai és késői promőterek (Fisra et al., Kataré 273, 13 (1973))? vagy más vírálís promóterek, úgymint a poliémáből, adenovírus 2-ből és marha papiiloma vírusból származó promőterek. Egy Indukálható promótert, úgymint a hMTll-t (Karin et al., Natúré 299, 797-302) szintén alkalmazhatunk.
A CTLA4 mutáns molekulák eukaríötákban történő expresszilására szolgáló vektorok enhanszer régióknak nevezett szekvenciákat Is hordozhatnak. Ezek fontosak a génexpresszi.6 optimalizálásában és a promóter régiótól 5' vagy 3' irányban találhatók,
Enkarióta sejtekhez való expressziős vektorok nem korlátozó példái közé tartoznak ax emlős gazdasejtek vektorai (például SPV-'l, pHyg, pRSY, pSv2, pTKz (Maniatis); plRES (Clonteoh); pRe/CMV2, pRo/RSV, pSFVl {Life Technologies); pVFakc vektorok, pCbV vektorok, pSGS vektorok (Stratagene), retrovirus vektorok [például pFB vektorok (Stratagene)), p€DHA~3 (Invitrogen) vagy ezek módosított formál, adenovírus vektorok; adeno-asszociált vírus vektorok, bakuiovirus vektorok, élesztő vektorok [például pESC vektorok (Stratagene)] ,
A CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleotiőszekveneiákat az enkarióta gazdasejt genom jóba. Integrálhat juk, és az ott ügy replikálödik, ahogy a gazdagenom replíkálódik. Alternatív lehetőségként a CTLA4 mutáns molekulákat hordozó vektor olyan replikáoiós origókat tartalmazhat, melyek lehetővé teszik az exfrakromoszómáiis replikádét,
A nukl.eot ids zekvenciá k Saocharomycea cerevisía^en történő expresszíójához az endogén élesztő plazmádból, a 2 μ-os körből származó replikácíős origót alkalmazhatjuk [Broeoh, Meth. ünz.
101, 307 (1983)]. Alternatív lehetőségként autonóm replikációt
7?..&C2/gS/RAS nm ,ή -m elősegítő élesztő génemből származó szekvenciák is alkalmazhatóak (lásd például Stinchcomb et al., Natúré: 282, 39 (1979); Tsc.hempe.t et al., Gene 10, 157? és Clarké et ai., Meth. Enz.
101, 300 (1983)1»
Az élesztő vektorok transzkripciós kontroll, szekvenciái köze tartoznak a glikolitikus enzimek szintézisének promóterei (Hess et ai., J. Adv. Snzyrae Reg. 7, 149 (1968); Holland et al.,
Biochemístry 17, 4900 (1978)1. További, a szakterületen ismert promóterek közé tartozik a CMV promóter, a CDM8 vektorban biztosítva (Toyama és Okayama FESS 268, 217-221 (1990); a 3-.fosz.fo~ glicerát kinéz promótere (Hitzeman et al., J. Bioi. Chem. 255, 2073 (19801, és más glikolitikus enzimek promóterei.
Más promőterek indukálhatőak, mivel ezeket környezeti ingerek vagy a sejtek tenyésztőközege szabályozhatja. Ezek közé az indukálható promőterek közé tartoznak a hősokk fehérjék, alkohol dehidrogenáz 2, ízocítokróm C, savas foszfatáz, a nitrogén katabolizmussal kapcsolatos enzimek, és a maitóz és gaiaktőz hasznosítás génjeiből származó promőterek.
A szabályozó szekvenciákat a kódoló szekvenciák 3' végére is helyezhetjük. Ezek a szekvenciák úgy hathatnak, hogy stabilizálják a messzendzser RES~t. Ezek a terminátorok a ködeié szekvenciákat követő 3' nem transzláiédó régióban találhatóak különböző élesztő eredetű és emlős génben.
A növények és növényi sejtek vektorai például, de nem kizárólagosan az Agrobactériem Ti plazmid, karfiol mozaik vírus (CaMV), és paradicsom arany mozaik vírus (TGMV).
Az emlős sejt gazdarendszer transzformációk, általános aspek·zár tusait Axel írta le [OS 4 399 216 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, megadva 1983. augusztus 16-án). Az emlős sejtek a következő eljárásokkal transzformálhatok, de nem kizárólag; transzfekció kalcium-foszfát jelenlétében, mikroinjektálás, elektroporáció vagy virálís vektorokkal végzett transzdukció, Az idegen DNS-szekvenciák növényi, és élesztő genomba való bevitele közé tartoznak (1) mechanikai eljárások, úgymint DNS mi kroin .jektálás a egyedülálló sejtekbe vagy protopiasztokba, a sejtek vortexelése üveggyöngyökkel a DNS jelenlétében, vagy DNS-sel fedett wolfram vagy arany gyöngyök beiövése a sejtekbe vagy protoplasztokba? (2 5 a DNS bevitele oly módon, hogy a membránokat permeábidissá tesszük a makromolekulák számára poiietilénglikol kezeléssel vagy oly módon, hogy nagy feszültségű elektromos impulzusoknak tesszük ki (eiektro-poráció)? vagy (3) lipoezárnák (cDNS-t tartalmazó) alkalmazása, melyek a sejtmembránhoz fuzionálnak.
A CTLA4 mutáns molekulák expresszíóját a szakterületen ismert módszerekkel mutathatjuk ki. Például a mutáns molekulákat Coomassie festett SDS-PAGS gélekkel és a CTLA4-t kötő antitesteket alkalmazó immunbiottolással lehet kimutatni. A fehérjekinyerést szokásos fehérjetisztitási eszközöket alkalmazva hajthatjuk végre, például affinitás kromatográfiával vagy ioncserés kromatográfiávai, hogy lényegében tiszta terméket kapjunk {R. Scopes, „Protein Purifícation, Principies and Praotice, 3, kiadás, Springer-Verlag (1994)].
A találmány továbbá az ezzel az eljárással előállított oldható CTLA4 mutáns fehérjemolekulá.fcat biztosit.
CTLA41G XODONALAPÚ MÜTAGEbEZISS
Az egyik megvalósítási módban helyre irányuló mutagenezíst és egy űj szkrinelési eljárást alkalmaztunk néhány olyan mutációnak az azonosítására a CTLA4 extraceltuláris dóménj-ében, melyek javítják a CDEó-tal szembeni kötési, aviditást. Ebben a megvalósítási módban mutációkat hajtottunk végre a CTLA4 extraoeiiuláris dóménjének a 25. szerint ól a 33. argíninig terjedő régiójában, a Cf szál (49. alanin és öl. treonin), az E szál (93. lizin, 95. glutamínsav és 95. isucin) régióinak maradékaiban, és a 97. metíonintöl a 102'.. tirozini-g tartó régióban, a 103. tirozintől a 107. glicinig tartó régióban, a G szálban a 111. helyzetű glutamin, a 113. fcirozin és a 115.. ízoieucin pozíciókban. Ezeket a helyeket a kimére CD23/CTLA4 fúziós fehérjék vizsgálatai alapján [Eeaoh R. J. et al., J. Exp. Med. ISO, 204.9-2058 (1994)}, és egy olyan modell alapján választottuk ki, mely előre megmondja, hogy mely aminosav-oldalláncok lesznek kitéve az oldószernek, és jelzi, ha bizonyos pozíciókban hiányzik az aminosavmaradék-azonosság vagy -homológía a CD2S és CTLAi között. Valamely aminosavmaradék, mely térbelileo az azonosított aminosav-maradekok szoros közelében helyezkedik el (5-20 angström egység), szintén, a találmány részének tekintendő.
A CD8ö és/vagy CD86 molekulával szemben megváltozott affinitású oldható CTLA4 mutáns molekulák szintetizálására és szűrésére egy kétlépéses- stratégiát alkalmaztunk, A kisértetek a következőkből álltak: először a CTLA4 extraeeiluláris részének egy specifikus kodon jártál mutációk könyvtárát hoztuk létre, és ezeket BlAcore analízissel szűrtök, hogy azonosítsuk a CDBö-nar 7-7 .SöZ/SSáVE vagy CD86-tal szemben megváltozott reaktivitást mutató mutánsokat- A Biacore merő-vizsgálati rendszer (Pharmacia, Plscatanay, bő) egy .felszíni plazmon-rezonancia detektor-rendszert alkalmat, mely lényegében abból áll, hegy a CD861g-t vagy CD861g~t kovalensen köti egy dextrannal fedett szenzor csíphet, ami egy detektorban helyezkedik ei. A tesztmolekulát ezután injektálhatjak be a szenzor csipet tartalmazó kamrába, és a kötődő komplementer fehérje mennyiségét a molekulatömegben bekövetkezett változás alapján mérhetjük. A fehérje fizikailag a szenzor csip dextránnal fedett oldalához kapcsolódik; a molekulatömegben bekövetkezett változást a detektor rendszerrel mérni tudjuk.
A TALÁLMÁNY S2EAIKTT GYŐGYSYELKÉSSÍTMÉMYEK
A találmány gyógyszerkészitményeket foglal magában immunrendszeri betegségek kezelésében történő alkalmazásra, melyek oldható CTLA4 molekulák gyógyászatilag hatásos mennyiségeit tartalmazzák. Bizonyos megvalósítási módokban az immunrendszer! betegségeket a CD28- és/vagy CTLA4-pozitív sejtek CD80- és/vagy a CD86~pozitiv sejtekkel való kölcsönhatásai közvetítik. Az oldható CTLA4 molekulák előnyösen vad típusú szekvenciával rendelkező oldható CTLA4 molekulák és/vagy a CTLA4 extraceiluiáris dóménlében egy vagy több mutációval rendelkező oldható CTLA4 molekulák. A gyógyszerkészítmény oldható CTLA4 fehérj«molekulákat és/vagy a molekulákat kódoló nukleinsav molekulákat és/vagy vektorokat foglalhat magában. Az előnyös megvalósítási módokban az oldható CTLA4 molekulák a 3. ábrán bemutatott CTLA4 extraceiluláris doménjének amínosav-szekvenciájával rendelkeznek (L1Ö4EA29Y). Még előnyösebben az oldható CTIA4 mutáns molekula ?'f SO2/£B/ba2 réz
Λ ?
az. itt ismertetett, 3. ábrán bemutatott L104EA29YIg> A készítmény továbbá más terápiás szereket is tartalmazhat, ezek közé tartoznak, de nem kizárólagosan, az immuns zupp.ressz.lv szerek, HS&ID-ok, kortíkoszteroiüok, glükokortikoídok, gyógyszerek, to•xinok, enzimek, antitestek vagy konjugátumok.
A gyógyszerkészítmény egyik megvalósítási módjában az oldható CTLA4 molekula hatásos mennyiségét önmagában vagy legalább egy másik terápiás szer, ide értve egy immunszuppressziv szert vagy a NSAID-ot, hatásos mennyiségével együtt tartalmazza.
Az oldható CTAA4 hatásos mennyiségei a gyógyszerkészítményben körülbelül 0,1-100 mg/kg beteg testtömeg közötti mennyiség lehet. Egy másik megvalósítási módban a hatásos mennyiség körülbelül 0,5-5 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 5-10 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 10-15 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 15-20 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül· 20-25 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 25-30· mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 30-35 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 35-40 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 40-45 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 45-50 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 50-55 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 55-60 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 60-65 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül €5-70 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 70-7 5 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 75-80· mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 80-85 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül. 85-90 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 90-95 mg/kg beteg testtömeg, körülbelül 95-106 mg/kg beteg testtömeg mennyiség. Az egyik megvalósítási módban a hatásos mennyiség 2 mg/kg beteg testtömeg. Egy másik megvalósítási módban a hatásos mennyiség 10 mg/kg be7? mos/ss/sas rt;
teg testtömeg, Az egyik megvalósítási módban az oldható CTLA4 molekula hatásos mennyisége 2 mg/kg beteg testtömeg. Egy másik megvalósítási módban az oldható GTLA4 molekula hatásos mennyisége 10 mg/kg beteg testtömeg.
Egy betegnek beadott immuntzuppresstiv szer mennyisége különböző tényezőktől függően változhat, ide értve a gyógyszer hatásosságát egy adott betegnél és a gyógyszer toxikusságát (azaz toierálhatöságát; egy adott betegnél.
A metotrexátot szokásosan körülbelül 0,1-40 mg/hét mennyiségben adjuk be, ahol a szokásos dózis 5-30 mg per hét. A metotrexátot növekvő mennyiségben is be adhatjuk a betegnek: körülbelül 0,1-5 mg/hét, körülbelül 5-10 mg/hét, körülbelül 10-15 mg/hét, körülbelül 15-20 mg/hét, körülbelül 20-25 mg/hét, körülbelül 25-30 mg/hét, körülbelül 30-35 mg/hét, vagy körülbelül 35-4 0 mg/hét. Az egyik megvalósítási módban az ímmunsznppressziv szer hatásos mennyisége, ide értve a metotrexátot, körülbelül 10-30 mg/hét mennyiség.
A metotrexát hatásos mennyisége 0,1-40 mg/hét között van. Az egyik megvalósítási módban a hatásos mennyiség körülbelül 0,1-5 mg/hét, körülbelül 5—10 mg/hét, körülbelül 10-15 mg/hét, körülbelül. 15-20 mg/hét, körülbelül 20-25 mg/hét, körülbelül 25-30 mg/hét, körülbelül 30-35 mg/hét vagy körülbelül 35-40 mg/hét. Az egyik megvalósítási módban metotrexátot körülbelül 10-30 mg/hét mennyiségben adjuk be.
A oiklefoszfamídot, mely egy alkílezőszer, körülbelül 1-10 mg/kg testtomeg/nap mennyiségben adhatjuk be.
A eiklosporínt (például ÖE0kA1/0 , mely ciiosporin A-ként Is ' .SÜÜSZ/HAK .TÁJ
9 ismert, szokásosan körülbelül 1-10' mg/kg testtömeg/nep mennyiségben. adjuk be, Szokásosan 2,5-4 mg/testtömeg/nap közötti dózisokat használunk.
A klorokint vagy hidroxi-kiorokinf (például ?LAQO£N1LR5 szokásosan körülbelül 100-1000 mg napi dózisban adjuk be. Előnyösen körülbelül 200-000 mg közötti napi dózisokat adunk be.
A szul.faszalasint (például AZOLFIDINE EN-tabs*; szokásosan körülbelül 50-5000 mg/nap mennyiségben adjuk be, a szokásos dózis körülbelül 2000-0000 mg/nap felnőtteknél. A gyerekek esetében a dózis szokásosan 5-100 mg/kg testtömeg, legfeljebb 2 gramm naponta.
Két beadási típusnál formulázunk aranysókat:: az injekciónál vagy az orális beadásnál. Az injektálható aranysukat szokásosan körülbelül 5-100 mg dózisokban írjuk elő minden 2-4 hétben. Az orálisan beadott aranysókat általában 1-10 mg/nap dózisokban írják fel.
A D-peniciliamint vagy peníoillamint ÍCOPRIMIOERí szokásosan körülbelül 50-2000 mg/nap dózisban adjuk be, az előnyös dózisok, körülbelül 125 mg/nap mennyiségtől 1500 rag/nap mennyiségig terjednek.
Az azatioprint szokásosan körülbelül 10-250 mg/nap dózisban adjuk be. Az előnyös dózisok körülbelül 25-200 mg/nap között változnak.
Az anakinra (például KlRERET^s egy interieukin-1 receptor antagonísta. Az anakinra szokásos dózisa körülbelül 10—250 mg/nap, a javasolt dózis körülbelül 100 mg/nap.
Az Infliximab (RemicadeR5 egy kimére monoklonális antitest, •n,»Ö2Z.SS/RM TÁJ mely a tumor nekrózis faktor alfát (ThEa) köti, Sz infiximabot szokásosan körülbelül 1-2Q: mg/kg testtömeg dózisokban adjuk be minden négy-nyolc hétben. Minden négy-nyolc hétben körülbelül 3-10 mg/kg testtömeg dózisokat adhatunk be a betegtől, függően.
Az stanecerp (például EbBREI/u egy dimer fúziós fehérje, mely köti a tumor nekrőzis faktort (ΤΝΓ), és blokkolja a kölcsönhatásokat a TEF receptorokkal. Az etaneroept szokásosan beadott dózisa körülbelül 1Ö-100 mg/hét a felnőttek esetében, ahol az előnyös dózis körülbelül 50 mg hetente. A fiatal egyedek dózisai körülbelül 0,1-50 mg/kg testtömeg/hét között vannak, maximum körülbelül 50 rag/hét.
A iefinnomidot (ARAVAÁ szokásosan 1 és 100 mg/nap közötti dózisokban adjuk be. A szokásos napi dózis körülbelül 10-2.0 mg/nap.
A gyógyszerkészítmények előnyösen megfelelő hordozókat és adjuvánsofcat tsrtalraaznafc, melyek olyan anyagokat foglalnak magukban, melyek a találmány szerinti molekulával, kombinálva (például egy oldható CTLAi molekulával, például az L104EA29Y~naÍ; megtartják a molekula aktivitását, és nem reaktívak a beteg immunrendszerével . Ezek közé a hordozók és adjuvánsok közé tartóznák például, de nem kizárólagosan, a humán ssérum-albumin; az ioncserélők, aluminium-oxid, iecítin, puffer anyagok, úgymint foszfátok, gliein, szorbinsav, káiiom-szorbát és sók vagy elektrolitok, úgymint protamín-szulfát. Egyéb példák közé tartoznak a szokásos gyógyszerészeti hordozóanyagok, úgymint foszfáttal pufferoifc só-oldat; viz; emulziók, úgymint olaj/viz emulzió; és különböző típusú nedvesítőszerek. Egyéb hordozók közé tartoznak a steril, oldatok? tabletták, ide értve a bevont tablettákat és kapszulákat. Jellemzően az ilyen hordozók kötőanyagokat tartalmaznak, úgymint keményítőt, tejet, cukrot, az agyag bizonyos· típusait, zselatint, sztearinsavakat vagy sóit, magnézium- vagy kalcium-sztearátot, talkumét, növényi zsírokat vagy olajokat, gumikat, glikolokat vagy más ismert kötőanyagokat. Az ilyen hordozóanyagok tartalmazhatnak íz- és színadalékokat vagy más alkotórészeket.. Az ilyen hordozókat tartalmazó· készítményeket jól ismert hagyományos módszerekkel formuláébatjük. Ezek a készítmények különböző lipidkészítményekben is formaIázhatok, úgymint például iiposzömákban valamint különböző polimer készítményekben, például polimer mikrogömbökfoen.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények hagyományos beadási módszerekkel adhatók be, ezek közé tartozik nem korlátozó módon az intravénás (i.v.) beadás, az intraperitoneális (i.p. ; beadás, az intr-amuszkuláris {i.m.} beadás, a szubkután beadás, szájon át történő beadás, kúpként vagy helyileg történő beadás vagy egy lassú hstóanyag-ieadású eszköz, mint például egy miniozmotikus pumpa beépítése a betegbe.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények különböző dózisformákban lehetnek, melyek közé nem korlátozó módon a folyékony oldatok vagy szusspenziők, tabletták, pirulák, porok, kúpok, polimer mikrokapszolák vagy mikrovezi'kulumok, liposzómák és injekcióban vagy infúzióban beadható oldatok tartoznak. Az előnyös forma a beadás módjától és a. terápiás alkalmazástól függ.
A találmány szerinti készítmények beadásának leghatásosabb módja és a dozírozásí mód a betegség súlyosságától és lefolyásé77.80Z/BZ/EAZ TÁJ tói, a beteg egészségi állapotától ás a kezelésre adott válaszától és a kezelőorvos döntésétől függ. Következésképpen a készítmény dózisait az adott beteghez keli títrálni.
Az oldható CTLA4 mutáns molekulák beadhatók a betegnek olyan mennyiségben és ideig (például olyan hosszú ideig és/vagy annyi alkalommal? mely elegendő ahhoz, hogy meggátoljuk, hogy az endogén. 87 (például CD8ú és/vagy CD85) molekulák a megfelelő ligandumaikhoz kötődjenek a betegben. Az endogén 87/ligandum kötődés blokádja ezáltal meggátolja, a kölcsönhatást a 87-pozl.tiv sejtek (például CD80- és/vagy CDSb-pozitiv sejtek): és a €028és/vagy CTLAí-pozitív sejtek között. A terápiás szer dózisa számos tényezőtől függ, ezek közé tartósnak nem korlátozó módon az érintett szövet típusa, a kezelendő autoimmun betegség típusa, a betegség súlyossága, a beteg egészségi állapota és a beteg válasza a szerekkel történő kezelésre. Következésképpen a szerek dózisa változhat a betegtől és a beadás módjától függően. Az oldható CTLA4 mutáns molekulákat 0,1-20,0 mg/kg beteg testtömege/nap mennyiségben adhatjuk be, előnyösen 0,5-10,0 mg/kg/'nap mennyiségben. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények beadását különböző időn. át hajthatjuk végre. Az egyik megvalósítási módban a találmány szerinti gyógyszerkészítményt egy vagy több órán át adhatjuk be. Továbbá a beadást a betegség súlyosságától függően valamint a. szakterületen ismert. egyéb tényezőktől függően megismételhetjük.
A TALÁLMÁNY SZEP.IKTX ELJÁRÁSOK
A találmány eljárásokat biztosít as ímmunrendszeri betegségek és az autoimmun betegségek kezelésére egy betegben, mely során a ?7.§co/ss/!V.2 tá-j betegnek oldható CTLA4 vagy egy CTLA4 mutáns molekula hatásos mennyiségét adjuk be, mely molekula kötődik a CD8Q és/vagy CD86 molekulákhoz a CD80- és/vagy CD8ö-pozítiv sejteken, ezáltal meggátolja, hogy az endogén CD80 és/vagy CD86 molekulák a T-sejteken lévő CTLM-hez és/vagy C328-hoz kötődjenek. Az eljárások során egy terápiás: készítményt, mely a találmány szerinti oldható CTLA4 vagy CTLA4 mutáns molekulákat tartalmazza, egy betegnek adjak be olyan mennyiségben, mely hatásos az immunrendszer! betegségekkel kapcsolatos tünetek legalább egyikének enyhítésében. Továbbá a találmány az immunrendszer! betegségek hosszú távú terápiáját biztosíthatja a T~sejt/B7-pozitiv sejt kölcsönhatások blokkolásával, ezáltal gátolva a kostimulátor jelek általi T-sejt aktiválást/stimulálást, úgy mint a B7 kötődését a CDz8~hoz, mely T-sejt energia vagy tolerancia kiváltásához vezet.
A találmány szerinti oldható CTLA4 vagy CTLA4 mutáns molekulák inhibitor tulajdonságokat mutatnak in vivő. Olyan körülmények között, ahol a T-sejt/Bi-pozítiv sejt kölcsönhatások, például T-se j t/B-'Sejt kölcsönhatások f ordulnak elő a T-sejtek és 37 -pozitív sejtek közötti érintkezés eredményeként, a bevitt •CTLA4 molekulák kötődése a B7~pozitiv sejtekkel, például 3sejtekkel reagálva, zavarhatja, azaz gátolhatja a T~sejt/Bl-pozítiv sejt kölcsönhatásokat, mely az immunválaszok szabályozását eredményezi. A T-sejt válaszok gátlása egy oldható CTLA.4 molekula beadásával az autoimmun rendellenességek kezelésénél is hasznos lehet. Számos autoi-amun rendellenességet eredményez az autóantigénekkel reaktív T-sejtek nem. megfelelő aktiváciőja, melyek elősegítik a betegség patológiájában részt vevő citokínek és 77.δΟΖ/8£/ί?Α2 ZÁJ autoantitestek termelődését. Az L104EA29YIg molekula beadása egy autoimmun. rendellenességben szenvedő vagy arra érzékeny betegnek, meggátolhatja az autoreaktiv T-sejtek aktiválódását, és csökkentheti vagy megszűntetheti a betegség tüneteit. Sz az eljárás tartalmazhatja a találmány szerinti Llö4EA29Ylg molekula beadását önmagában vagy további lígandumokkal együtt, mint például azokkal a ligandumo-kkal, melyek reaktívak az IL~2-vel, Ib-4-gyei vagy a γ-interferonnal.
A találmány eljárásokat biztosit az immunválaszok szabályozására. Az immunválaszokat a találmány szerinti oldható CTLA4 vagy CTEA4 mutáns molekulák expresszioját korlátozza (csökkenti) oly módon, hogy gátol vagy blokkol egy már folyamatban lévő immunválaszt, vagy lehetséges, hogy meggátolja az Immunválasz kiváltását. A találmány szerinti oldható CTLA4 vagy CTLA4 mutáns molekulák meggátolhatják az aktivált T-sejtek funkcióit, mint például a T-limfoolta prolii©rációt és a citokínszekréciőt a T-sejt válaszok szuppresszíőjávsl vagy a T-sejtekben specifikus tolerancia índukálásávai, vagy mindkettővel. Továbbá a találmány szerinti oldható CTLA4 vagy CT1A4 mutáns molekulák zavarva a CTLA4/CD28/S7 reakcióutat gátolhatják a T-sejt proiiferáclót és/vagy a citokin szekréciót, és csökkent szöveti lebomlást és
T-sejt érzéketlenséget vagy energiát eredményeznek.
A találmány továbbá eljárásokat biztosit szerv- vagy szövetátültetések kilökődésének gátlására betegekben, mely során legalább egy oldható CTLA4 vagy CTLA4 molekula, például Llö4EA29/lg hatásos mennyiségét adjuk be a. betegnek a transzplantáció előtt, alatt és/vagy után. Sgy másik megvalósítási módban a találmány 77.832/3£./aa2 TÁJ szerinti eljárás során a. betegnek legalább egy oldható CTLA4-t vagy egy CTLA4 mutáns molekulát adunk be legalább egy másik terápiás szerrel együtt, ezek közé tartozik nem korlátozó módon egy gyógyszer, egy komin, egy enzim, egy antitest vagy egy konjugátum,
A szerv- vagy szöveti transzplantátum bármilyen átültetésre megfelelő szerv- vagy szövet lehet,. Az egyik előnyös megvalósítási módban az átültetett szövet egy hasnyálmirigy-szövet lehet. Az egyik előnyös megvalósítási módban az átültetett szövetet hasnyálmirigy szigetsejtek képezik, A találmány eljárásokat Is biztosit az 1-es és/vagy 2-es tipusü diabétesz kezelésére betegekben a ssigétsejt átültetés kilökődésének meggátlássval.
A találmány továbbá eljárást biztosit a hasnyálmirigy sziget átültetés kilökődés meggátlására egy betegben, ahol a beteg egy átültetett szövet reeipien.se. Jellemzően a szövet átültetésekben a graft kilökődését az indítja el, hogy a T-sejtek idegennek ismerik fel, ezt egy olyan immunválasz követ, mely elpusztítja a graftot, Egy oldható CTíA.4 molekula beadása a találmány szerinti eljárásban, gátolja a T-iimfocita proiíferáeiot és/vagy a citokin szekréciót, mely lecsökkent szöveti lebomlást és antigén-specifikus T-sejt érzéketlenseg kiváltását eredményezi, mely hosszú távú graftbefogadást eredményezhet, anélkül, hogy szükség lenne általános immunszuppresszlóra,
A találmány egyik előnyös megvalósítási módja az L104SA2üYTg oldható CTLA4 mutáns molekula alkalmazását tartalmazza a működőképes GTLA4- és CD28~pozitiv sejtek SG-pozítiv sejtekkel való kölcsönhatásainak szabályozására, az immunrendszer.i betegségek,
7?,eü2/BS,/:?AS λ’Ζj mint például a diabétesz kezelésére és/vagy az immunválaszok csökkentésére. A találmány szerinti LlO4EA22Ylg egy oldható CTLA4 mutáns molekula, mely legalább két aminosav-cserét tartalma z, a leucin (L) glutaminsavra (£) van kicserélve a 4104, helyzetben, és az alanin (A) tirozinra (Y) van cserélve a 429. helyzetben. Az Llö4EA2SYIg molekula további mutációkat tartalmazhat az itt meghatározott két mutáció mellett.
Az eljárás továbbá tartalmazhatja az oldható CTLA4 mutáns molekulákkal együtt egy alap insann-szuppressz.lv kezelés beadását is a betegnek. Az alap immunszuppressziv kezelés tartalmazhat ide nem korlátozó utódon; : ciklosporint, azatioprint, metot.resátot, ciklofoszfamidot, limfocita immunglobulint, ,anti-CD3 antitesteket, Rho (O> immunglobulint, adrenokortikoszteroidokat, szuifaszaiazint, FR-506. metozszaieut, mikofenoiát-motef üt (CELLCEFT;, ló antl-humán tímocita globnllnt (ATGAb;, humanizált anti-TAC-ot (HAT), bazilíximabot (S1MULECT), nyűi antí-humán tímocita globuiint (THYMOGLüöüLlN>, szírolimuszt vagy talidomidot, metotrezátot, klorofcint, hídroxi-klorokínt, szulfaszalazínt, szuifaszalazopírint, let lunomidot, aranysukat, D-penioillamint, a.zatioprint, anafcinrát, íníiximabot, etanerceptet, TNFa blokkolókat vagy egy olyan biológiai szert, mely egy gyulladásos eltekint céloz meg. Az egyik előnyös megvalósítási módban az alap immunszuppressziv kezelés sztsroidmentes. Előnyösebben az alap immunszuppressziv kezelés rapa.mici.nt es antl-humán IL-2 RmAb-t foglal magában.
A találmány egyik megvalósítási módja egy molekula alkalmazását tartalmazza a δ? és a CTLA4 közötti kölcsönhatás blokkolásá77 ,802/WPAK 707 *
* szabára egy immunszuppresszív szerrel együtt egy immunválasz lyozására abbéi a célbői, hogy egy immunrendszer! betegséget, mint például diabéteszt kezeljünk. A B7/CTLA4 kölcsönhatás blokkolására használt molekula egy oldható CTLA4 lehet, mint például CTLA4Ig, CTLA4Ig/CD28!g vagy L104EA29Ylg, egy oldható CD28, mint például CD23Ig, egy oldható B7 (B7-1 vagy B7-2), úgymint B7lg, ant.i-CTI:A4 monokionáiis antitestek, arti-CD28 monoklonálís antitestek vagy antl-B? monoklonálís antitestek.
A találmány szerint kezelt betegek közé tartoznak az emlős egyedek, ide értve az embert, majmot, emberszabású majmot, kutyát, macskát, szarvasmarhát, lovat, kecskét, sertést, nyalat, egeret és patkányt.
A találmány különböző eljárásokat biztosit, lokálisakat és szisztémásakat, a találmány szerinti terápiás készítmények, úgy mint az oldható CTLA4 molekula önmagában vagy egy immunszuppressziv szerrel és/vagy más terápiás szerekkel történő beadására. A módszerek közé tartozik az intravénás, az, az intramuszkuláris, intraperitoneális, orális inhaláciős vagy szubkután módok, valamint egy beépíthető pumpa, folytonos infúzió, génterápia, iiposzómák, kúpok, helyi kezelések, vezikuiumok, kapszulák és injekciós módszerek. A terápiás szert, melyet egy hordozóval keverünk össze, szokásos módon liofiiizaljuk a tároláshoz, és vízzel vagy egy semleges pH-jú (körülbelül ρΉ-7-δ, például ph=?,S) pufferolt sóoldattal állítjuk helyre a beadás előtt.
A szakterület szokásos gyakorlata szerint a találmány szerinti készítményeket az agyadnak valamilyen gyógyászatilag elfogadható formában adhatjuk be, A találmány megvalósítása szerint az •y?.3ö'2/Bs/x.%s táj szerinti oldható CTLA4 eljárások során egy betegnek a találmány .molekulákat adjuk be, hogy szabályozzuk a CD28- és/vagy CTLA4-pozitív sejtek 37 pozitív sejtekkel való kölcsönhatásait. A 87-pozitív sejteket a találmány szerinti oldható CTLA4 molekulák vagy fragmense! vagy származékai egy hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe, hogy egy oldható CTLA4/37 komplexeket képezzünk. A komplexek akadályozzák az endogén CT1A4 és CD28 molekulák kölcsönhatásait a B7 család molekuláival.
Az oldható CTLA4 mutáns molekulák a betegnek olyan mennyiségben és annyi, ideig (például olyan hosszá ideig és/vagy annyi alkalommal) adhatók be, mely elegendő ahhoz, hogy meggátolják, hogy az endogén 37 molekulák a megfelelő ligandumaikhoz kötődjenek a betegben. Az endogén B7./ligandum kötődés biokádja ezáltal meggátolja a kölcsönhatást a B7-pozitív sejtek és a CD23és/vagy CTLA4-pozitív sejtek között.
A. terápiás szer dózisa számos tényezőtől függ, ezek közé tartoznak nem korlátozó módon az érintett szövet típusa, a kezelendő autoiismun betegség típusa, a betegség súlyossága, a beteg egészségi állapota és a beteg válasza a szerekkel történő kezelésre. Következésképpen a szerek dózisa változhat a betegtől és a beadás módjától függően. Az oldható CTLA4 mutáns molekulákat 0,1-100,0 mg/kg beteg testtömege/nap mennyiségben adhatjuk be.
A találmány szintén felöleli a találmány szerinti készítmények együttes alkalmazását más gyógyszerekkel együtt az immunrendszeri betegségek kezelésére, Például a diabétesz a találmány szerinti molekulákkal és a korlátozás szándéka nélkül a immunszuppresszív szerekkel, úgymint, kortikoszteroídokkal, ciklo7?,80:2/SS/SAZ TÁJ sporinnal [Mathiosen, Cancer Lett. 4J (2), 151-156 <1989), predni2onnal, azatioprinnel (R. Handschumacher, „Drugs Used fór Immunosuppression'·, 1264-1276], TNFa blokkolókkal vagy antsgonistákkal [New England Journal of Nedioine 340, 253-259 (1999); The Láncét 354, 1932-39 {199:9), Annáié of Internál Medicina 130, 478-486 (1999)) vagy egyéb, valamely gyulladásos eltekint megcélzó biológiai. ágenssel, nem szteroid gyulladásellenes szerekkel/Ccx-2 inhibitorokkal, hid.roxi-'klorokinnel, szu-ifaszalazopriinnel, aranysókkal, etanercepttel., inf iximabbal, rapamioínnel, mi kofenolát-motef i 1 lel, azatioprónnel, takroizmusszál, baziliximabbal, eitoxánna-1, interferon bé'ta-la-val, interferon béta-lb-vel, glatzramer-aeetátta.l, mltoxantron-hidrokloriddal, anak'inrával és/vagy más biológiai anyaggal.
Az oldható CTLA4 molekulákat (előnyösen Llö-4EA29YIg~t) a következő szerek, közül, eggyel vagy többel együtt alkalmazhatjuk egy immun válasz szabályozására: oldható gp3S {..CD 40 I ígsndumkéoi (ÜD40L) , CQ154-k.ént, T-BAM-ként, TRAP-ként is ismert) , oldható CD29, oldható CDiö, oldható CD80 [például ATCC 63627), oldható CD86, oldható CD23 (például 63628), oldható CD56, oldható Thy-1, oldható CD3, oldható TCR, oldható VLA-4, oldható VCAd-1, oldható
LECAM-1, oldható ELAA-1, oldható CD44, gp39-cel reaktív antitestek (például ATCC HB-10916, ATCC NB-12055 és ATCC RS-12056), CDiO-nei reaktív antitestek (például ATCC RS-19916, ATCC HB-12055 és ATCC HB-120SS), CDáC-nel reaktív antitestek (például ATCC HB-9110), a B?~t.el reaktív antitestek (például ATCC HB-253, ATCC CRL-2223,
ATCC CEL-2226, ATCC HB-301, ATCC HB-11341, stb,), a CD28-oal reaktív antitestek (például ATCC HB-1.1944 és az mAb 3.3, melyet ?7.8<i2/BS/RA2 táj
Martin és munkatársai ismertettek, J. Clín, Immun. 4(1), 18-22 <19-80) 1 . Az LFA-I-gyel reaktív antitestek (például ATCC HB-9S79 és ATCC TiS-213), az lFA-2-vei reaktív antitestek, az IL-2-vei reaktív antitestek., az IL-12-vel reaktív antitestek, az IFd~gam~ mával reaktív antitestek, a CD2-vei reaktív antitestek, a CDáS-cal reaktív antitestek, valamely ICAM-mal (például ICAM--1 (ATCC CRL-2252), ICÁM-2 és ICÁM-3) reaktív antitestek, CTLA4~gyel reaktív antitestek (például ATCC HB-304},. Thy-l-gyel reaktív antitestek, a CD56-éal reaktív antitestek, a CDÖ-mal reaktív antitestek, CD 29cél reaktív antitestek, TCR-rel reaktív antitestek, VLA-4-gyeí reaktív antitestek, VCAM-1--gyei reaktív antitestek, LE-CAM-1 -gyei reaktív antitestek, ELAM-'l-gyel reaktív antitestek, CD44-gyel reaktív antitestek. Bizonyos megvalósítási módokban a moneklonálís antitesteket részesítjük előnyben. Más megvalósítási, módokban az antitest-fragmensek az előnyösek. A szakemberek számára könnyen érthető, hegy a kombináció a találmány szerinti oldható CTLA4 molekulákat és egy másik immunszuppresszív szert, oldható CTIA4 molekulákat és két másik immunszuppressziv szert, oldható CTLA4 molekulákat és három másik ímmunszuppressziv szert, stb. foglalhat magában. Az optimális kombináció és dózisok meghatározása megállapítható és optimalizálható a szakterületen jól ismert módszereket alkalmazva.
Néhány specifikus kombináció a következőket tartalmazza: L104EA29YIg és CDBö monoklonális antitestek (mAb-k)? LlO4EA29Yig és CD86 mAb-k? L104SA29Ylg, CDSO mAb-k és CD86 mAb-k?
DÍ04EA29Ylg és gp39 mAb-k? LIÖ4£A29YIg és CD 40 mAb-k?
1104CA29YIg és CD2S mAb-k; LlG4EA29Ylg, CDSO és CD86 mAb-k, és gp-39 mA.b-k? D104EA29YIg, CD30 és CDS6 .tób-k és CD40 mAb~k; és Llö4SA29YIg, anti-LFAl mAb, és anti-gp-39 mAb. A gp3'9 mAb specifikus példája az KEI, Egyéb kombinációk ís könnyen felismerhetők és érthetők a szakemberek számára.
A találmány szerinti oldható CTLA4 molekulák, például as L104EA29YIg, beadható mint egyedüli hatóanyag, vagy beadható más gyógyszerekkel együtt inununmoduláió beadási módokban, vagy más gyuliadáselienes szerekkel, például az siló- vagy zenograft heveny vagy idült kilökődésének vagy gyulladásnak vagy autoimmun rendellenességek kezelésére vagy megelőzésére vagy tolerancia kiváltására, Például együtt alkalmazható egy kaloineurin inhibitorral, például ciklosporin A-val vagy FKöDé-tai, egy imunszuppresszív makroliddal, például rapamicinnel vagy egy származékával (például 40-0-(2~hidroxí) ~eti.l~rapam.icin) ,* egy limfocíta-homing szerrel, például FTY72ö~szai vagy ennek egy analógjával; kortíkoszteroidokkal; ciklofoszfamiddai? azatíoprénnel; metotrexáttal.; letiunomiddal vagy egy analógjával; mizoribinnel; míkofenoísavvai; mikofenolát-motefillel; IS-dezoxi-spergualínnal vagy analógjával; Ímmunsznppressziv monoklonális antitestekkel, például ieukocíta receptorok elleni, például MBÜ, CD2., CDS, CDs, CDila/CD18, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD4 5, CDS8, CD137, ICCS, CDI 50 ÍSLAM), 0X40, 4-ΊΒΒ vagy ügandumai elleni monoklonális antitestekkel; vagy más immunmodulátor vegyületekkel, például CTLA4/CD28~Ig~vei vagy más adhéziós molekula inhibitorokkal, például mAb—kkei vagy kis molekulatömege inhibitorokkal, ide értve az LFA-1 antagonistákat, szelefctin. antagonistákat és vLA-4 antagonistákat. A vegyület különösen egy olyan vegyölettel
7? .Í ÖZ/ZK/OU TÁV együtt használható fel, mely .akadályozza a CD40-t és lígandumát, például a CD40 elleni antitestekkel ás a CD40-L elleni antitestekkel.
Ahol a találmány szerinti oldható CT1A4 mutáns molekulákat más irimunszuppresszív/immunmodulátor vagy gyuliadáseiienes kezeléssel együtt adjuk be, például, ahogy fentebb meghatározó uk, az együtt beadott immun»zuppressziv, imrtunmodulátor vagy gyulladásellenes vegyület dózisai természetesen az együtt alkalmazott gyógyszer típusától függden, például hogy az egy szterold vagy oiklosporín, az alkalmazott meghatározott gyógyszertől, a kezelendő állapottól, stb. függően változnak.
Az előzőeknek megfelelően a találmány egy további vonatkozásában a fentebb meghatározott eljárásokat biztosítja, mely során egy találmány szerinti oldható CT2A4 molekulák, például CTLA4 és/vagy tlö4EA29YÍg terápiásán hatásos mennyiségét adjuk be szabad formában vagy gyógyászatilag elfogadható só formájában együtt, például egyidejűleg vagy egymás után egy második gyógyszer hatóanyaggal, ahol a második gyógyszerhatóanyag egy fentebb jelzett immunszuppressziv, immunmodulátor vagy gyuiladáseiienes szer.
Továbbá terápiás kombinációkat biztosítunk, például egy kitet, melyek tartalmaznak egy oldható CTLA4 molekulát, szabad formában vagy gyógyászatilag elfogadható só formájában, együttes vagy egymás utáni alkalmazásra, és legalább egy olyan gyógyszerkészítményt, mely tartalmaz egy immunszuppresszánst, immunmodulátort vagy gyuiladáseiienes szert például NSAID-ot, alakékor tikoidot vagy kortikoszteroidot. A kit tartalmazhat egy beadásra vonatkozó használati útmutatót. A találmány szerinti ki63.
teket. valamely találmány szerinti eljárásban alkalmazhatjuk.
A találmány egy másik megvalósítási módjában a szövet- vagy szerv átültetés kilökődését úgy gátoljuk meg egy betegben, hogy oldható CTLM-fc és T-sejt-mentesitett csontvelő-sejteket adunk be a betegnek, A T-sejt-mentesített· csontvelő beadása hozzávetőleg ugyanabban az időben fordulhat elő, mikor az egyedbe a szövetet vagy szervet átültetjük, vagy attól eltérő időpontban, A csontvelő hozzávetőleg ugyanabban az időben történő beadása azt jelzi, hogy a csontvelőt a szövet- vagy szervtranszpiantátum beadási eljárás előkésztése részeként adjuk be. Nem szükséges, hogy a csontvelőt pontosan ugyanabban az időpontban adjuk be (azaz perceken belül), mint amikor a szervet beültetjük.
Az előnyös megvalósítási módokban a T-sejt-mentesitett csontvelőt a szervátültetés előtt adjuk bs. A sajátos megvalósítási módok a T-sejt-mentesitett csontvelő egy napon belüli, tizenkét órán belüli vagy hat órán belüli beadását foglalják magukban a szilárd szerv átültetéséhez képest. Mindazonáltal a T-sejt-mentesitett csontvelő beadható korábban is, feltéve, hogy a Tsejt-mentesitett csontvelő hatásait még elérjük a szerv- vagy szovetátüitetéssel kapcsolatban. Alternatív megvalósítási módokban kívánatos lehet, hogy a T-sejt-mentesített csontvelőt a szervátültetés után adjuk be.
Egy másik megvalósítási módban egy betegnek a T-sejtmentesített csontvelő egy dózisát (tolerizáiö dózis) adjuk be, majd a T-sejt-mentesitett csontvelő egy további dózisát (beültetési dózis) adjuk be. Bizonyos megvalósítási módokban az ímmunszuppressziv szer legalább egy vagy több típusba tartozó ligán•?7 mez/sz/Rss zT dumokat tartalmas, melyek megakadályozzák a CD28 antigén kötődését a CD80 és/vagy CDSE antigénhez. Ahogy fentebb ismertettük, a iigandum előnyösen egy mutáns CTLA4 molekula, úgymint L104EA29ilg.
Továbbá a T-sejt mentesített csontvelő mennyisége szokásos kísérletezéssel meghatározható és tapasztalati úton optimalizál” ható. Például a T-sejt mentesített csontvelő szokásos kísérletezés során hátrálható, hogy meghatározzuk azt a mennyiséget, mely elegendő a kívánt hatások eléréséhez,
A találmány szerinti eljárások a gyakorlatban úgy ís megvalósíthatók, hogy az oldható CTLA.4 mutáns molekula mellett a T-sejt mentesitett csontvelő két vagy több dózisát is beadjuk a betegnek Önmagában vagy egy vagy több immunszuppresszlv szerrel együtt.
Ahogy ismertettük, a találmány szerinti eljárásokban az oldható CTLA4 vagy mutáns CTLA4 molekula beadását számos különböző módon végrehajthatjuk, ide tartoznak a lokális vagy szisztémás beadási módok. Például az oldható CTLA4 mutáns molekulákat beadhatjuk intravénásán, intramuszkulárlsan vagy intraperitoneáiisan. Alternatív lehetőségként a mutáns CTLA4 beadható orálisan vagy szubkután. A. szakemberek számára a beadás más módszerei is nyilvánvalóak, A T-sejt mentesitett csontvelő számos eltérő, a szakemberek számára ismert módon beadható. Ennek egyik példája az intravénás infúziós módszer.
Az imunszuppresszív szer (ékjét beadhatjuk az oldható CTEA4 mutáns beadása előtt és/vagy után a szerv/szövetátültetés előtt vagy után. Előnyösen a csontvelőt és az immunszuppresszlv szert rnaozz-m/sAS táj az oldható CTLA4 mutáns molekula beadása előtt, adjuk be. Az egyik megvalósítási módban a T-sejt mentesített csontvelő egy első dózisát (tolerizáló dózis) és az immunszuppresszív szert hozzávetőleg ugyanabban az időpontban adjuk be, mint amikor a szervátültetés történik.
A következő példákat, abból a célból mutatjuk be, hogy szemléltessük a találmányt. A módszer és az eredmények a kezeléssel elérendő cél és az alkalmazott eljárások függvényében változhatnak. A példákkal semmilyen módon sem kívánjuk korlátozni a találmány oltalmi körét.
PÉLDÁK
1. PÉLDA
Ez a példa azoknak az eljárásoknak a leírását adja meg, melyeket az oldható CTLA4 mutáns molekulákat kódoló nukleotid-szekvenciák létrehozására alkalmaztunk. Egy egyszeres mutáns L.lö4EIg~t hoztunk létre, és a CD80 és/vagy CDS δ kötési kinetikájára teszteltük. Az L104Elg egyszeres CTLA4 mutáns molekulát kódoló nakieínsav-molekulát használtuk tempiátként az LlQ4SAz9YIg kétszeres CTLA4 mutáns molekula, az L104SA29YIg létrehozására, melyet a CD80 és/vagy CD8 6 kötési kinetikájára teszteltük,
CT1A4JO kodonalapű s;ütegenezls
Egy mutagenezises és egy szkrinelési stratégiát dolgoztunk ki azoknak a mutáns CTLA4rg molekuláknak az azonosítására, melyeknek alacsonyabb a őlsszociáciős sebességük sebesség) a
CD86 molekulákról. Egyszeres mutáns nukiectidszekvenciákat hoztunk létre CTLA4Xg-t alkalmazva tempiátként (5 844 095, 5 851 795 és 5885 796 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leTÁJ írások; ATCC azonösitószám: 68629] . Mutagén. oügonukleotid PCR primőröket terveztünk egy specifikus kodon rántom mutageneziséhez bármilyen bázist megengedve a kodon 1. és 2. helyzetében, de csak guanin vagy tűin lehetett a 3. helyzetben (XXG/T; WG/T-ként is ismert). Ezen a módon egy amínosavat kódoló specifikus kodon ráncom mutációja hajtható végre műd a 20 aminosavvá. Ezt figyelembe véve az XXG/T rauta genezis 32 potenciális kodont eredményes, mely mind a 20 amínosavat kódolhatja. A FCR-termékeket, melyek a CTLAilg -M97-G.107 (lásd az 1. vagy 2. ábrát) szoros közelségében kódolnak mutációkat, Sacz/Xbai-gysi emésztettük, és hasonlóan hasított CTLAilg πΕΝ expressziős vektorba szubklónozfcuk. Ezt a módszert használtuk az egyszeres·
LlOiEIg CTLA-4 mutáns molekula. létrehozására.
A CTLA4Ig S2S-R33~ánsk közelében történő mutagenezishez: először egy néma éhei restrikciós helyet vittük be ennek a huroknak, az 5’ végére FCR primer-írányitott mutagenezissel, A FCR termékeket dhel/Xfoal-gyel emésztettük, és hasonlóan hasított CTLAilg vagy LlOiEIg expressziős vektorokba klónoztuk. Ezt az eljárást használtuk a kettős CTLA4 mutáns L104EA29YI.g létrehozására (3. ábra). Fontosabban az LlOiEIg egyszeres CTLAi mutáns molekulát kódoló nuklelnsav-molekulát használtuk terápiáiként az L10iEA.29YIg kétszeres CTLAi mutáns molekula létrehozására.
2. PÉLDA
A következő példa az 1. példában leirt szerkezetekből expresszált egyszeres és· kétszeres mutáns CILA polipeptidek azonosítására szolgáló szűrési módszereket szolgáltat, mely poripeptidek a B7 molekulákkal szemben, nagyobb kötési avíditást mn77,S0Z/HS7Rft2 'Ü tatnak a nem mutáns CTLA4lg molekulákhoz képest.
A jelenlegi in vitro és ín vivő vizsgálatok azt jelzik, hogy a CTLAilg önmagában képtelen teljesen blokkolni az antigénspecifikus aktivált T~sejtek beindítását. A CTLAilg-vel és a CDSO-ra vagy CD86-ra specifikus monoklonális antitestekkel végzett in vitro vizsgálatok azt jelzik, hogy az anti-CD8ö monoklonális antitest, nem fokosra a CTLA4ig gátlást. Azonban az anti-CD86 monoklonális antitest fokozza a gátlást, ami azt jelzi, hogy a CTLAilg nem volt hatásos a CDS6 kölcsönhatások gátlásában. Ezek az adatok alátámasztják Linsley és munkatársai korábbi megállapításait (Immunity 1, 793-801 [1994)1, akik kimutatták, hogy a CD80-közvetitett celluláris válaszok gátlásához hozzávetőleg 100-szor kisebb CTLAilg koncentrációk szükségesek, mint a CDSC-közvetített válaszokhoz. Ezeknek a megállapításoknak az alapján feltételeztük, hogy a oldható CTLA4 mutáns molekulák, melyeknek nagyobb az aviditása a CDSδ-tal szemben, mint a vadtipusú CTLAá-nek, jobban képesek lesznek blokkolni az antigénspecifikus aktivált sejtek beindulását, mint a CTLAilg.
Ebből a célból, a 8. példában leírt oldható CTLA4 mutáns molekulákat szűrtük egy új szűrési eljárást alkalmazva különböző mutációk azonosítására. a CTLAi extracellulárís doménjében, melyek javítják a CDSö-nal és CD86-tsl szembeni kötési avidítast.
Ez a szűrési stratégia hatékony eszközt biztosit a láthatólag lassabb „off sebességgel rendelkező mutánsok közvetlen azonosítására anélkül, hogy fehérjetisztításra vagy mennyiségi meghatározásra szükség lenne, mivel az „off sebesség meghatározása koneentráciőfüggetien [O?Shanessy et al., Anal, Bíochem. 212,
7í.söz/Bs/ros -ár
457-468 (1993)1 .
COS sejteket transzfekfcáltunk különálló miniprep tisztított plszmid DNS-sel, és néhány napig szaporítottuk. Háromnapos kondicionált tenyésztő közeget vittünk fel a BiAcore bioszenzor csípőkre (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), melyek oldható CD8OIg-vel vagy CD861g-vel voltak fedve. A mutáns fehérjék specifikus kötését és disszociációját felszíni p la zws- rezonanciával mértük (0' Shanessy D, J. et al., Anal. Biochem. 212,4 57-468 (1997) j. Az összes kísérletet BIAcore™ vagy BIAcore5* 2000 bioszenzorokon futtattuk le 25’O-on. A ligandumokat kutatási. tisztaságú NCM5 szenzor csipen (Pharmacia) ímmofoílisáltuk standard N-etil-kd -(dímetii-amlno-propil)-karbodiimid-ü-hiároxiszukcinimíd-kapesolást alkalmazva íJohnsson, B. et al., Anal.
Biochem, 198, 268-277 (1991); Khiiko S. d. et al., ú. Bioi.
Chem. 268, 5425-75434 (1993)].
Szűrési eljárás cellás szövettenyésztő lemezeken növesztett COS sejteket átmenetileg mutáns CiLA4ig~t kódoló DNS-sel transzfektáltuk, A ssekrétáit oldható mutáns CTLA4Ig-t tartalmazó tenyésztöközeget 3 nappal később összegyűjtöttük.
A kondicionált COS sejttenyésztő tápközeget hagytuk, hogy átfolyjon a BlAoore bioszenzor csipeken, melyeket CD86!g~vel vagy
CDSOig-vel derivatízártunk (ahogy Greane és munkatársai leírták, öl Bioi, Chem. 271, 26762-26771 (1996)], és a mutáns molekulákat a vad típusú CTLA4ig~nél megfigyeitnéi lassabb o.f f-sebességek alapján azonosítottuk. A kiválasztott tápközeg-mintáknak megfelelő DNS-eket szekvenálfuk, és több DKS-t preparáltunk, hogy
77.3QZ/SS/j?A?:.yÁJ
0.5 nagyméretű COS sejt átmeneti transzfekciót hajtsunk végre, melybői a CTLAálg mutáns fehérjét a tenyésztőközeg protein A-val történő tisztítását kővetően preparáltuk..
A BIAcore analízis körülmények és egyensúlyi kötési adatok analízisét hajtottuk végre J. Greene és munkatársai müvében [J. Bioi. Chem. 271, 26762-26771 (1996)] és a bejelentésben leírt módon.
BIAcore adatana fizis
A szenscgram alapvonalakat zéró válaszegységre (RU) normaiizáltuk az elemzés előtt. A mintákat álderivatizált áramló sejteken futtattuk át, hegy meghatározzuk a háttér válaszegység (RU) értékeket, mely az oldatok közötti fő fénytörési index eltéréseknek köszönhető. Az egyensúlyi disszooiációs állandókat (¾) kiszámoltuk a C függvényében ábrázolt Rf:<5 görbékből, ahol az Req a steady-state válasz mínusz egy álderivatizált csipen lévő válasz, és C az analit möikenoeutrácicje, A kötődési görbéket kereskedelemben kapható nem lineáris görbe illesztő szoftverrel (Prism, GraphPAD szoftver) analizáltuk.
A kísérleti adatokat először az „egy Iigandum kötődése egy receptorhoz. modellhez illesztettük (egyheiyes modell, azaz egyszerű rangmuír rendszer, A+B AB) és az egyensúlyi asszociációs konstansokat (Ky=dA]. »[B] \ (AB]) kiszámoltuk az B-R^ax«C/(K^+C) egyenletből. Ezt követően az adatokat a lígandnmkötés legegyszerűbb kéthelyes modelljéhez illesztettük (azaz egy olyan receptorhoz, mely két egymással nem kölcsönható független kötési hellyel rendelkezik, melyet a következő egyenlet ír le:
Íh^i+C) ? ? mos/ez/rak táj
Ennek a két modellnek az illeszkedését vizuálisan analizáltuk, összehasonlítva a kísérleti adatokat, és statisztikailag is elemeztük a négyzetes Összegek F-tesztlével. A legegyszerűbb egy'ne'lyes modellt választottuk a legjobb illesztésként, kivéve, mikor a kéthelyes modell szignifikánsan jobban illeszkedett (p<0,1).
Asszociációs és dísszociációs analíziseket hajtottunk végre BrA evaiuatIon 2.1 szoftvert (Pharmacia; alkalmazva. A kon asszociációs sebességi állandókat két módon számoltuk ki, homogén egyhelyes kölcsönhatásokat és párhuzamos kéthelyes kölcsönhatásokat feltételezve. Az egyhelyes kölcsönhatásokhoz, a kon értékekét az (1-exp v0) egyenlet alapján számoltuk ki, ahol Rt egy adott t időben adott válasz; Req a steady-state válasz; t^ az injekció kezdetének ideje; és ks~d:.R/dt'=K.kCsri*CKo.ff, ahol C az analit koncentrációja, melyet monomer kötési helyekben kifejezve számoltunk ki. A kéthelyes kölcsönhatások esetében a kon értékeket az Rt-P-ech.(1-exp ü/ t R-es-sz (1-exp 0) egyenlet szerint számoltuk ki. Mindegyik modellnél a ko?. értékeket a C-vei szemben ábrázolt ks görbék számított meredekségéből (körülbelül 70%-cs maximális asszociáció) határoztuk meg.
A. disszociáciős adatokat az egyhelyes (AS-A+B) vagy kéthelyes (AiBj-Ai+Bj) modellek szerint elemeztük, és a sebességi állandókat (koít·) a legjobban illeszkedő görbékből számoltuk ki. A kötési hely modellt használtuk, kivéve, amikor a maradékok nagyobbak voltak, mint a gépi háttér (2-iORü, gép szerint), mely esetben a kéthelyes modellt alkalmaztuk. A receptor betöltés félidőket a tj./z™0,693./kOff összefüggést alkalmazva számoltuk ki.
tíw/bs/h» ráz
Áramlási cltomefcrfa
L307.4 egérféle mAb-t (antí-CDvO) vásároltunk a eseten.
Dickínsontői {San Jose, Kalifornia) és 112.2 mAb~t (antí~B7-ö, CD86 ként ís ismert) a Fharmíngentől (San Síego, Kalifornia). Az immunfestéshez a CDSO-pozítív és/vagy CD85~pozitív CHO sejteket eltávolitottuk a tenyésztoedényeíkböl oly módon, hogy foszfáttal puff erőit söoldatban (PBS) inkubál tűk, mely 10 md EDTA-t. tartalmazott. A CHO sejteket íl-lüxlíój először mAb-kkei vagy immunglobulin fúziós fehérjékkel ínkubáituk 10% magzati borjüszérumot (EBS) tartalmazó DMEM-ben, majd mostuk és fluoreszesin-izotiocianáttai konjugált kecske anti-egér vagy anti-humán immunglobulin második reagenssel (Tago, Burlingame, Kalifornia) inkufoáltuk. A sejteket utoljára mostuk, majd egy EACScan-en (Beeton
Diók inson) analizáltuk.
SAS-PACA és méretki zá.résos__ivomaj7£^raria
SDS-PAGE-t hajtottunk végre Tris/glícin 4-20%-os akrilamid géleken (Ncvex, San Diego, CA). Az analaiti kai géleket Coomassie kékkel festettük, és a nedves gél képeit digitális szkennelessel kaptuk meg. A CTLAilg-t (25 pg) és LloiSA2sYIg-t (25 pg) méretkizárásos kromatográfiával analizáltuk egy TSK-GEL G300 3¾ oszlopot (7,8x300 mm, Tcsohaas, Montgomeryville, PA) alkalmazva, melyet 0,02% BAPb-t tartalmazó foszfáttal pufferoit sóoldattal egyensúlyoztunk ki, 1,0 ml/perc átfolyási sebességnél.
iiom/hc ’ j ö%... 1¾ zts
Egyláncú CTL&4XCi2ös“t készítettünk a korábban leirt módon [Línsley et al,, J. Bioi. Chem. 27Q., 15417-1544 (1995)1. Röviden, egy onkosztatin M CTLAI (OMGTLAi) expresszibe piazmidot alkalmaztunk templútként , ,a GAGGTGATAAAGCTTGAGCAÁTGGGTGTACTGCTCACAGAG menetírányű iforward) prímért (17. számú szekvencia) úgy választottuk meg, hogy a vektorban levő szekvenciákkal illeszkedjen; és a. GTGGTGTATTGGTGTAGATCAATGAGAATCTGGGCAGGGTTG (18. számú szekvencia) reyerz primer a CTLA4· extracelluláris dómén)ében lévő utolsó hét aminosavnafc {azaz a 118-124. aminosavaknak) feleit meg, és tartalmazott egy restrikciós enzim helyet és egy stop kodont (TGA) . A reverz primer egy C12.0S (ciszteinről szerinre a 120. helyzetben) mutációt határozott meg. Pontosabban, a fentebb bemutatott rever z primer GGA. nukleotid-s-zekvenciáját (34-36, nukleotidok) a következő nukleotid-szekvenciák egyikével cseréltük ki; AGA, GGA, TG A, GGA, ÁCT vagy GGT. A szakterületen jártasak számára érthető, hogy a GGA. nukle-otíd-szekvenoia a ciszteint kódoló TGC kodon megfordított komplementer szekvenciája. Hasonló módon, az AGA. GGA, IGA, CGÁ, ACT vagy GGT a s zer i n meg fordit o11 komplementer szekvenciái. A polímeráz láncreakció termékeit HindTII/Xbal-qyel emésztettük, és közvetlenül a tLH expressziós vektorba (Bristol-Myers Squibb Company, Fritceton, Hu) szuhklónoztuk. Az L104EÁ29yXcjgoS-t azonos módon készítettük el. Mindegyik szerkezetet DNS szekvenálással ellenőriztük.
A nagy avldltású mutánsok azonosítása ás biokémiai jellemzése
A mutagenezishez huszonnégy aminosavat választottunk ki, és a kapott -'2300 mutáns fehérjét felszíni piazmon-rezonanciával. (SÁR; fentebb leírva) a CDBőlg kötésre vizsgáltuk. A mutagenezís lényeges hatásait a II. táblázatban lentebb foglaljuk össze. A CDR-1 régióban lévő bizonyos aminosavak random mutagenezise (S25-R33) láthatólag nem változtatta meg a ligandamkötésfc. Az •n.SÖZ/BE/R&Z. TÁJ r·<
? J· *
E31 és R33 és az Μ97-ΎΙ02 maradékok mutagenezise láthatóan lecsökkent lígandumkötést eredményezett·. Az 325, A29 és T30, K33, L96, Y103, L1G4 és G105 maradékok mutagenezise kicsi „on és/vagy kicsi „off sebességekkel rendelkező fehérjéket eredményezett. Ezek az eredmények megerősítik a korábbi megállapításainkat, hogy a CDR-l (S25-R33) régióban lévő maradékok és az M37YlOG-foen vagy közelében, lévő maradékok befolyásolják a ligandumkötődést (Peach et al., J. Exp. Med, ISO, 2349-2058 (1994)],
Az S25, T3G, K93, L96, 2103 és G105 helyek mutagenezi.se néhány olyan fehérje azonosításához vezetett, melyeknek kisebb „off sebességük volt a CD8őTg-vel szemben. Mindazonáltal ezekben az esetekben a kisebb „off sebesség egy kisebb „on sebességgel járt együtt, ami egy olyan átlagos CD88Ig~vel szembeni aviditást eredményezett, ami látszólag hasonló a vad típusú
CTLAfTg-néi látottakhoz. Továbbá a K93 mntagenezise jelentős aggregáciöt eredményezett, mely a megfigyelt kinetikai változásként lehetett felelős.
Az LIO'4 random műtagenezise, majd a COS sejtek transzfekciőja és a tenyésztő közeg minták SPE-es szűrése as inas-obi Lizáit. CD86Ig-n, hat tápközeg-mintát eredményezett, mely olyan mutáns fehérjéket tartalmazott, amiknek hozzávetőleg 2-szer kisebb „off sebességük volt, mint a vad típusú CTLA4Ig~nek. Amikor az ezeknek a mutánsoknak megfelelő cDNS~t szekvenáltuk, úgy találtuk, hogy mindegyik egy leuoinröl glutaminra történő mutációt kódol (L104S). Láthatóan a 184-es leuoin aszparaginsavra történő cseréje (1.1048} nincs hatással a CDSölg kötésre.
Ezután a mutagenezist a fentebb leirt módon megismételtük ?'?,8G2/BB/t?AS TÁJ i < ;
minden IX. táblázatban felsorolt helynél, de ekkor L104E~t használtunk PCP. fcemplátként a vad típusú CTLAálg helyett, As SER analízissel, melyhez megint immobilízált CDSSlg-t használtunk, hat tenyésztőközeg mintát azonosítottunk a 29. aianín mutagenézéséből,, melyben olyan fehérjék vannak, amiknek hozzávetőleg 4-szer kisebb az „off sebességük, mint a vad típusú CTLAÜg-nsk. A két leglassúbb tirozinszubsztitűcíő volt (L1Ö4EA29Y}, kettő ieucin-szubsztitűcíö (L1Ö4EA29L.) , egy tríptofán-szubsztitúciő (L104EA29W; és egy treonin-szubsztítűcíé volt (I1Ö4SA29T). Láthatóan, nem azonosítottunk kis „off sebességű mutáns, amikor a 29. helyzetű alanint önmagában a vad típusú CTLAiig-ben vetjük alá a mutációnak.
A tisztított L1Ö4E és ilO4SA£9Yrg relatív molekulatömegét és aggregáciős állapotát SDS~PAGE~vaI és méretkizárásos kromatográfiéval mértük. Az L104EA29YIg (-1 pg; 3. sáv} és az LlÖéEIg (--img; 2. sáv) láthatólag ugyanolyan az elektroforetíkus mobilétású, mint a CTLA4Xg (-Img; 1. sáv} redukáló (-50 kDa; +βΜΕ; plusz 2-merkaptoetanoi} és nem redukáló (--100 kDa; -βΜΕ) körülmények között (14A. ábra). A méretkizárásos kromatográfia azt mutatja, hogy az LiO4EÁ29¥Ig (14C. ábra; láthatólag ugyanolyan mobilitása mint a dímer CTLádig (14B. ábra·. A 14B. ábrán a fő csúcsok proteindimert képviselnek, míg a gyorsabban eiuálodő kicsi csúcs nagyobb molekulatömegű aggregátumokat képvisel. A CTLA4Ig hozzávetőleg 5,0%-a volt jelen nagyobb molekulatömegé aggregátumként, de nem volt jele az L.lÖ4EA39YIg vagy az LlöiEIg aggregácíöjának. Tehát az L104Elg-vel vagy L104EA3S¥lg-vel tapasztalt erősebb kötődés a CD36Ig-hez nem járul hozzá a mntagenezis által kiváltott aggregáciőhoz.
..3G2/SS/ZA3 TÁV
Egyensúlyi és kinetikai kötési mérévizsgálat
Egyensúlyi és kinetikai kötési mérővizsgálatot hajtottunk végre a protein A-val tisztított C?LA4Ig~n, LlG4EIg~n és L104EA29YIg~.n felszíni plazmonrezonaneíát (SPR) alkalmazva. Az eredményeket as I. táblázatban lentebb ismertetjük. A megfigyelt egyensúlyi dissrociációs állandókat (Ka? h táblázat) a koncentrációk egy adott tartományán (5,0-200 nbj létrehozott kötési görbékből számoltuk ki. Az Llö:4EA29YJg erősebben kötődik a CDS6.Ig-hez mint «z HOiEIg vagy a. CTLAílg. As L104EA29Ylg-nek az LlOiEIg-nél (6,06 rák vagy CTLA4Ig-nél (13,9 nK) kisebb Kd~je (3,21 ní»í) ast jelzi, hogy as L104EA29Ylg-nek nagyobb a kötési aviditása a CDSélg-vei szemben. Az L.104EA29YIg-nek as Liő4EIg-nél (4,4? nM) vagy CTLAiignél (6,51 nM> kisebb Kd-je (3,66 nM) azt jelzi, hogy az L104EA29YIg-~nek nagyobb a kötési aviditása a CDSOlg-vel szemben.
A kinetikai kötési analízis feltárta, hogy a CTLAiig, LlOiElg és L104'EA29Ylg CD8:Q~nal szembeni kötésének összehasonlító »on sebességei hasonlóak, mint a CDséig „on sebességei (II táblázat) , Azonban ezeknek a molekuláknak az „off sebessége nem egyforma (I. táblázat). A CTLA4Ig-vel összehasonlítva az LlD4EA29YIg-nek hozzávetőleg 2-szer kisebb „off sebessége van a CDBÖIg—vel szemben, és hozzávetőleg 4-szer kisebb „off sebessége van a CD86lg~vel szemben. Az L104E· az L104EA29Ylg és CTLA4Ig közötti „off sebességekkel bír. Mivel ezeknek a mutációknak a beépítése jelentő-sen nem volt hatással az „on sebességekre, az LlöiEA29Ylg-nél megfigyelt CDSOlg-vei és CD86lg~vel szembeni aviditás megnövekedése elsődlegesen az „off sebességek csökkenésének köszönhető.
Annak meghatározására, hogy az L104EA29fIg CD66Ig-veI és 'z/moz/ss/mm *
CDSOlg-vel szembeni avíditásának növekedése azoknak a mutációknak köszönhető-e, melyek hatással, vannak arra az útra, .mellyel mindegyik monomer dimerré kapcsolódik, vagy arra van avíditása, hogy a mindegyik monomerbe bevitt szerkezeti változásokat fokozza, a CT LA 4 és L104EA2.9Y extracaiiuláris dóménak egyláncú szerkezeteit készítettük el, mintán a 120. helyzetű eiszteint szerínre mutagenízártuk a fentebb leírt módon és Linsley at ai, által leírtak szerint (J. Bioi. Chem, 270, '15417-15424 (1995) (84) j . a CTLA4XCi20s és L104EA2.9yXc.i20'S tisztított fehérjékről gél permeációs kromatográfiásra! kimutattuk, hogy monomerek [Linsley et al., (1995),· fentebb), mielőtt a ügandamkötő tulajdonságaikat SPR-rel analizáltuk volna. Az eredmények azt mutatták, hogy mindkét monomer fehérje CD8híg-vei szembeni kötési affinitása hozzávetőleg 35-80-szor kisebb, mint amit a megfelelő dimereknéi láttunk (Ί. táblázati. Sz megerősítette azokat a korábban nyilvánosságra hozott adatokat, melyek megállapították, hogy a CTLA4 tíimerizáciőja szükséges a nagy avlditású lígandumkötéshez (Greene et al., J. Bioi, Chem. 271, 28762-26771 (1996)).
Az L104EA'29YXci20s hozzávetőleg 2-szer nagyobb affinitással kötődik a CD8őIg-hez és a CDSSIg-hez is, mint a CT'LA4Xcl20s. A megnövekedett affinitás a hozzávetőleg háromszor kisebb dísszociációs sebességnek köszönhető mindkét ligandum esetében. Tehát az L1G4EA29Y erősebb iigandumkötése legvalószínűbb, hogy annak köszönhető, hogy a szerkezeti változásokat fokozni képes, melyeket mindegyik monomer láncba beépítettünk, és nem azoknak a változásoknak, melyek a molekula dímerizáiödását befolyásolják.
Az aviditást fokozó mutációk a.fa a 1 ve zkedése és szerkezeti analízise
7'?.β02/3£/κΛΚ gáz
A CTLA.4 extracelluláris laV-szerű doménjének oldat szerkezetét a közelmúltban határozták meg NM.R spektroszkópiával (Metzler et al.., Natúré Sfcruofc. Bioi. 527-5.31 (199-7):. Ez lehetővé tette a 104-es létein és 2'9-es alanin pontos elhelyezését a háromdimenziós redoben (15Ά-Β. ábra). A. 104-es levőin az erősen konzerválődott MYPPPY aminosav-szekvencía közelében helyezkedik el. A 29-es alanin a CDP-l (S.25-R33) régió C-terminális végének közelében helyezkedik el, mely térbelilég szomszédos sz PÍYPPPY régióval, Noha jelentős kölcsönhatás van ennek a két régiónak az alapjánál lévő bázisok között, láthatólag nincs közvetlen kölcsönhatás az L104 és A29 között, bár mindkettő egy folytonos hidrofor mag részét képezi a fehérjében, A két avidítást fokozó mutáns szerkezeti következményeit modellezéssel mértük. Az A29Y mutáció könnyen beilleszthető a CDR-1 (S25-R33) régió és az HYPEPY régió közé, és arra szolgálhat, hogy stabilizálja az HYPPPY régió konformációját. A vad típusú CTLAá-ben az 1104 erőteljes hídrofób kölcsönhatásokat alakit ki az L96-tal és a 794gyel az HYPPPY régió közeiében. Nagyon valószínűtlen, hogy a giutamínsav-mutáció az 1104-hez hasonló konformációt alakít ki, két okból. Először is, nincs megfelelő fér a hosszabb giutaminsav-oldaliá.n.c illesztésére a szerkezetbe anélkül, hogy a COR-l-t (S25-R33 régió) jelentősen megzavarná. Másodsorban a glnfaminsav-oldaliánc negatív töltése elrejtésének nagy lenne az energetikai ára a hldrofób régióban. Ehelyett a modellező vizsgálatok azt jósolják, hogy a giutami.nsav oldallánc kipattan a felszínről, ahol a töltése oldással stabilizálható, Sgy ilyen konformációs változás könnyen végrehajtható a G105-tei a régiókban lévő többi aminosav-maradék minimális torzításával.
A nagy avldltású mutánsok kötődé se a CEHd-t vagy CDlá-t expresz·A CTLAálg és mutáns molekulák stabilan transzfektálf CD8CT és CD86' CHO sejtekhez való kötődésének FACS analízisét (9, ábra] hajtottuk végre az itt leírt módon. A CD80“pozitív és 008β-~ροζί~ tiv CHO sejteket a CTLAálg, L104EA29Yfg vagy LlöéSIg növekvő koncentrációival Inkubáltuk, és ezután mostuk. A kötött Immunglobulin fúziós fehérjét fiuoreszceín-izctiocíanát-kcnjugált kecske anti-humán immunglobulint alkalmazva detektáltuk.
Ahogy azt a 9. ábrán bemutatjuk, a CD30~pozitiv vagy CDfő-pozltív CHO sejteket (1,5 x 101} OTLéilg-vel (fekete négyzetek), bíO4SA29YIg-vel (körök) vagy L104ElG-vel (háromszögek) ínkuháltuk a jelzett koncentrációkban 2 érán át 2'3aG~on, mostuk, és flucreszcein-izotiocianát-konjugált kecske anti-humán immunglobulin antitesttel inkubáltuk. összesen 5 000 életképes sejten analizáltuk a kötést (egyszeri meghatározás) egy FACScan-en, és az átlagos fluoreszcencia intenzitást (őri) az adathisztogrammokből határoztuk meg FC-LYSYS-t alkalmazva. Az adatokat a csak a második reagenssel inkubáit sejteken mért háttér fluoreszcenciával korrigáltuk (HFI - 7) . A kontroll LS méh (80 pg/mi)
MFKlO-f eredményez. Ezek az eredmények négy független kísérletre reprezentatívak.
Az L104EAzHYlg, L104SIg és CTLAilg kötődése a humán CDöO-nal transzfektáit CHO sejtekhez hozzávetőleg azonos (9A. ábra). Az
LlOAEAzáYIg és LlöíEig erősebben kötődik a humán CD86-tal stabilan transzfektáit CHO sejtekhez, mint a CTLAilg (9B. ábra).
77.S02/SE/KS.Z TÁJ
7Q >
Funkcionál is zaérdvixspá'lat'ök
Humán CDá-pozitiv T-sejteket izoláltunk ixmuunmágneses negatív szelekcióval [Linsiey et al., J. Exp. Med. .176, 1S9Ö-16G4 (1992)]. Az izolált CD4~poxitiv T-sejteket forboi-mirísztát-acetáttal (HMA) és CDSO-pozitív vagy CD86-pozitív CHO sejtekkel stimuláltuk az inhibitor títráló koncentrációinak jelenlétében. A CDá-pozitív T~aejkeket (6-10 x lö“/ce!ia) 1 nM PMA jelenlétében tenyésztettük besugárzott CHO-sejt stimuiátorokkai vagy azok nélkül, A proliferatív válaszokat 1 pCi/oella [unj-támláin hozzáadásával mértük a 72 őrás tenyésztés utolsó 7 órájában. A FMA és CD80~poziélv CHO, vagy CD86-pozltív CHO stimulált T-sejtek gátlását hajtottuk végre L104EA29Yig-vei és CTLA4ig-vel·, Az eredményeket a 10. ábrán mutatjuk be. Az llQ4EA29YIg jobban, gátolja a CBSO-pozitiv PMA kezelt CEO sejtek proliierációját, mint a CTLAálg (IGA. ábra) . Az L104EA29YTg a CD36~pozitív PMA-kezelt CHO sejtek proliferációjának gátlásában is hatásosabb, mint a CTLAélg (10B. ábra) . Tehát az L194EA29YIg a T-sejtek CD80- és CD86-közvetitett kostimulációjának is hatásosabb inhibitora.
A 11. ábra a fentebb készített aiiostimuiáit humán T-sejtek, továbbá CDSO-t és CD86-t expresszáló, PM-nefc nevezett humán. B-limfoblasztoid sejtvonailal (LCL) allostimulált (T-sejtek 3,OxlOVcelia és ÜM 8,GxlO^/ceiia koncentrációban) T-sejtek L104EA29¥lg-vel és CTLAálg-vei végzett gátlását mutatja. Az elsődleges ailostímuláolő 6 napig fordult elő, majd a sejteket '’H-timidin pulzálásos kezelésnek vetettük alá ? órán át, mielőtt a radioaktív jel beépülését meghatároztuk.
A második allostimaláoiőt a következőképpen hajtottuk végre, í?.3S2,'S.B/8A2 TÁJ
Hétnapos primer allostímuláit T-sejbeket gyűjtöttünk ossza a ümfoei. ta elkülönítő tápközegről (L.SM) (1CN, Aurora, OH) és 24 órán át pihentettük. A T-sejteker ezután újra stimuláltuk (másodszor) a CTLAilg vagy LlOiEAzsYIg titrálő mennyiségeinek jelenlétében, PM hozzáadásával ugyanolyan arányban mint fentebb. A stimuláció 3 napig tartott, majd a sejteket radioaktív jellel puizálva megjelöltük, és összegyűjtöttük a fentebb leírt módon. Az. Llö4SA29YIg hatását a primer allostimulált T-segtekre a HA. ábrán mutatjuk be. Az LlO4SA29YIg hatását a szekunder allostitulált T-segtekre a US. ábrán mutatjuk be. Az L104EA29YIg. a primer és szekunder T-sejt. proiíferatív válaszokat is jobban gátolja mint a CTLAilg.
A citokín termelés mérésére (12, ábra) két példányban szekunder ailoskimuláciös lemezeket állítottunk fel. Három nap múlva a tenyésztő közeget ELISA kiteket (Biosource, Camarilio, CA) használva mértük, a gyártó által javasolt körülményeket alkalmazva, ügy találtuk, hogy az LluiEAzöYIg sokkal hatásosabb, mint a CTLAilg a T-sejt 1L-2, IL-i és v-lFH cítokin termelés gátlásában egy szekunder allogén stimulust követően (12A-C. ábrák).
Az Llö4EA29YIg és CTLAilg hatásait a kevert limfocita válaszra (MLR) a 13. ábrán mutatjuk be. Két mag ómból perifériás vér mononvkleáris sejteket (BBMC-k, 3,5 z 10’ sejt/eella mindegyik majomból) tisztítottunk limfocita szeparációs tápközegről (LSM) és 2 gg/ml íitobemagglutíninnei (PnA) kevertük össze. A sejteket 3 napig stimuláltuk, majd radioaktív jellel pulzálő kezelést végeztünk 16 órával az összegyűjtés előtt. Az L104EA29YIg jobban gátolja a majom T-sejt proliferácíöt, mint a CTLAilg,
Z.802/SE/PA2 TÁV *
>< :
i. táblázat
As egyensúlyi és látszólagos kinetikai állandókat adjuk meg &
következő táblázatban (az értékek három: különböze származó átlagok ± standard eltérés): kísérletből nM
Xsmobilizált Analife. <xX05) NfV1 k««£ Cxl03> S1
fehérj e
CDS0lg CTLAálg 3# 4410,29 2,2110,18 6,5111,08
CDBOlg LXOőhlg 3Z02x0,05 1,3510,OS 4,4710#36
CDBOlg 1104SA29YXg 2,96±ö,20 1,08+0,05 3,6610, 41
CDS0lg CTLA4XCi20:s 12#011,0 230110 105125
CDBOlg L104£A2SYXc$a9s 8# 310,26 71±5 85,012,5
CDS6lg CTXAáXg 5,9510,57 8,16+0,52 13,9+2,27
CDS híg L104SÍU 7,0310,22 4,2610,11 6,06+0,05
CDB€Ig L104EA29YIg 6, 42x0# 40 2f0610,03 2.3,2110,23
CDS 6lg € ’i r A 4 X.- χ 2 os 16,510,5 840155 511117
CDSuIg Llö4SAzSyXJcu&s 11,411,6 300110 267120
XI. táblázat
A CTLA4Tg mutagenezisének hatását a CDBOlg kötésre a felsorolt helyeknél a fentebb leirt SPR-rel határoztuk meg. Az uralkodó hatást egy „+ jellel jelezzük.
Mütagenezís helye A mntagenezis hatása
Nincs látható hatás kicsi „on seb./kicsi „off seb. Csökkent 1igandumköt é s
825 1
22 6 e
G27 +
K28 4*
A2 9
1 T30
! p, 31
77mo2/K£/xmygÁj
rálássa! bejuttatott Isofiurane keveréke) egy hasi középvonali bemetszésen keresztül. A lés-vese és iép-vastagbél közegeket úgy osztottuk szét, hogy a lép a hasnyálmirigy farki részével együtt legyen mozgatható. A hasnyálmirigy fejét és a duodenum második részét a hocher manővert követően elmozditbatövá tettük. Heparin (2Ό0 0/kg) beadása után az aortába kanült tettünk épp az elágazás felett, es az állatból vért vettünk. Hideg jégkását helyeztünk azonnal a bursa ómen tál is. minor-ba, és a hasnyálmirigy teste mögé. A hasnyálmirigy testét és nyakát óvatosan kivágtuk ügyelve arra, hogy a hasnyálmirigy burkát ne sértsük meg. A közös epevezetéket, a fő és mellék hasnyálmirigy-vezetékeket azonosítottuk, és összekötöttük, és a hasnyálmirigy fejét kivágtuk a duodenum második részéből.
A rhesus-majóm. szigetizolálást a humán szigetizolálás automatizált módszerével [Rioordi, Diabetes 37, 413 (1988), Ranuncolí, Cell Transplant 3, 409 (2000)} végeztük kisebb módosításokkal, liberázt (Roehe/Boehringer Mannheim, Indpls, IN) alkalmazva 0,47-0,71 ng/ml koncentrációban. Sgy hármas réteget, megszakitásós Suroficoil gradienst (1,108, 1,097, l,037e-s sűrűség), Meditech, Hérádon, VA) és egy Cobe 2991 vérsejt feldolgozót (Gambro, Lakewooá, CO) használtunk a szigetek tisztítására a hasnyáimirígy-emésztményhői. A végső szígetkészitmány mintáit ditizonnal (Sigma, St.» Louis, MO) festettük, és a készítményt ügy vizsgáltuk meg, hogy megszámoltuk a szigetek számát a következő mérettartományok mindegyikében: 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350 és 350-400 pm. Az adatokat matematikailag konvertáltuk, hogy meghatározzuk a 150 pm~ss átlagos átmérő•'.n táj *
vei rendelkező szigetek számát, és szigetekvivalensként (1EQ) fejeztük ki [Ricordí C, et al., Aota Di ebe tol. Lat. 27, 185-195 í1990sj.
sx
Teljes pankreatekt.ómiát hajtottunk végre duodenektömia és szplenocdtömia nélkül legalább egy héttel az átültetés előtt, A hasnyálmirigy farkát és testét kivágtuk a iépartéria és véna mentén, melyeket megtartottunk, óvatosan összekötve és csak hasnyálmirigy ágakra osztva. Az elülső .mezenféri.kus és középső vastagbél vénákat azonosítottuk, és megőriztük, mialatt a hasnyálmirigy testét kivágtuk. A kapu és felső mezentéríkus vénákat azonosítottuk, és a hasnyálmirigy vénákat összekötöttük é.s szétosztottuk.,
A duodenumot eimozdithatévá tettük, és a pankresti.ko-duódénális ereket, melyek a hasnyálmirigyből· eredtek, összekötöttük, és szétosztottuk, a duódénál!.s elágazásokat épen hagyva, A közös epevezetéket azonosítottuk, és védték, mialatt a hasnyálmirigy feje és a duodenum V-hurka között tompa vágást ejtettünk, A hasnyálmirigy fő- és mellék-vezetékeit összekötöttük, szétosztottuk, és a hasnyálmirigyet, kivágtuk a hasüregből, Az összes állatot intravénás glükóz tolerancia tesztnek vetettük alá, hogy kiértékeljük a pankreatektömia eljárás hatásosságát. Mindegyikről lejegyeztük., hogy c-peptid-negativak a szigetétőltétés előtt.
Az eqy éjszakán át tenyésztett szigeteket transzplantációs tápközegekben mostuk, mely 2,5% humán szérűt? albuminnal kiegészített RPM1 1640 tápközeget tartalmazott, és megszámláltuk, hogy meghatározzuk az EIQ számát. A szigeteket ezután pelle7';.ÖG2/3£/ZAS ZÁC *
tízáituk, és 20 ml, 200 egység hepárinnal kiegészített transzplantációs tápközegben újrssszuszpendáltuk. IntrahepatIkus szigetátültetést hajtottunk végre a szigetek gravitációs elvezetésével a jobb véna col Ica. szigmoidjába vagy elágazásába a portállá vénába vezetve egy 22-es méretű intravénás katéterrel.
Á vévgrid&ősr víwpáíat<a, ír mi ínbeadás és a .bíídködés magba távozása: Az éhezési és étkezés utáni vérgiükóz-színteket naponta kétszer vizsgáltuk (reggeli előtt és ebéd után; £űlszárással, majd a vert egy glükométer elit-kei teszteltük (Bayer, Slk.ha.rt, IN). Inzulint (NPH, ültralente; Síi Lilly, Indianapolís, IN) adtunk be naponta háromszor, megpróbálva az éhezési vérglükózt 30-0 mg/di-néi kisebb szinten tartani a transzplantáció előtt álló pankreatektomlzáit állatokban vagy azokban az állatokban, melyek kilökték az alíograftjaikat.
Kísérleti csoportok és ϊηηιβχτφρ^βοχν ©Ijárások. Két kezelési eljárást teszteltünk: (1) Egmonton protokel tarkolímusz, szirolimusz és antí~IL~2E mAb alkalmazásával [Shapíro, A., Mi J. et al., N. Eng. 0. Med. 343, 230-238 (2000)] és (2) L1Ö4EA29Y—Eomoníon eljárás - L104EA2Oííg-t, szírolimuszt és autí~lL-2R mAb-t alkalmazva. A kontroli csoport olyan recípienseket foglalt magában, melyeket „alap immunszuppressziv kezelési móddal' kezeltük, mely rapamicint és csak anti~IL~2R~í tartalmazott. íarfcolimuszt adtunk 0,05 mg/kg mennyiségben napi kétszeri beadási módban, a műtét utáni Ö-14. napon (5~S célszint), és 0,06 mg/kg nap mennyiségben (3-5 oéiszint) a műtét utáni 15-120. napon. Intravénásán LI04EA29YIg-t adtunk be a műtét közben (10 mg/kg) és a műtét utáni 4., (15 mg/kg), 14., 28., 42., 56., 70., 84,, 98«, 112., 126. napon (20 mg/kg), hogy a •J7.gO2/8E/RSg TÁS szérumot 30 pg/mi-néi nagyobb szinten tartsuk, A kiméra antihumán 1L-2R rmáb-t (0,3 mg/kg i.v.) műtét közben és az operáció utáni 4. napon, Szirolimuszt (Rapamnne®) adtunk be szájon át 1,25 mg/kg mennyiségben napi kétszeri beadási módban, (10-15. célszintek) a 0-50, műtét utáni napon, X mg/kg mennyiségben napi kétszeri beadási módban, (7-10-es céiszintek) az 50-100, operáció utáni napon, és ezután fokozatosan csökkentettük, hogy a dozirozást a 130. műtét utáni napra befejezzük. A szirolimuszt (RapamaneO?) és t arkol.imuszt (Erograféü az Emory Universíty Bospital Pharmacytöl vásároltuk. A kiméra antí-humán 1L-2E mAb-t (Simuiect©) a hovartís Pharma AG-től (Bázel, Svájc) szereztük be,
Nekropsx:i.e: Az összes recipienst a Yorkés Veterinary Staff teljes felboncolását végrehajtotta a halálukkor.
A& anti-donor antitestek kimutetéea: A kimutatható donorspecifikus aiioantítest jelenlétét áramlási citometriát alkalmazva határoztuk meg. A perifériás vérleukociták szolgáltak célsejtekként az átültetés előtti analízishez. Az átültetés időpontjában kapott mezentéríkus nyirokcsomókból izolált leukociták voltak a célsejtek a transzplantáció utáni vizsgálatokhoz.
Statxs«t.ikák: A szigetátültetések túlélését a kísérleti csoportok között összehasonlítottuk Hann-öíhítney-Wi iooxon teszttel (Armítage et al., Stazístioal methods ín Medicai Research, Blackwell Scientific Pubiication, Oxford).
aafci-dosox onxim-kapcsoXt iaaatmspo'fc vizsgálat: A válaszokat interferon-γ (lFM-γ) enzim-kapcsolt immunspot (ELISpot) vizsgálatokkal mértük recipíens és donor álatokból kapott perifériás vérleukocitákat alkalmazva, Azonos számban besugárzott szimulátorokat (donor leukociták) és válaszadókat (recipiens ieukcci77. SG2/BS/:’A2 70-7 *
ták) adtunk az észter-cellulóz aljú lemezekre (Mi.lli.pore, Bedford, MA) , melyet befogó- antitestekkel, egér anti-humán IRE-y-val (G2~4 klón; Mabtech, Svédország) fedtük. 14-16 órás inku-bálás után biotinilesett egér anti-humán IBM-v-t (7-B6~l klón; Mabtech, Svédország) adtunk hozzá, a kötetlen antitestet eltávolítofctuk, és torma-peroxidáz-Avidin D-t (Vector, Búr1ingámé, CA) adtunk hozzá. A foltokat u-amino-S-etii-karbazoltal (Szama) fejlesztettük ki. Mindegyik folt egy IFN-y-szekrefcáló sejtet képvisel? ezeknek a sejteknek a gyakoriságát úgy határozhatjuk meg, hogy a tétre jött foltok számát osztjuk a szélesített válaszadó sejtek számával.
CD28 reakciéúb blokád-alapú terápia meghosszabbítja a sziget allograftok túlélését a rhosus makákókbaa. Diabéteszt váltottunk ki a recipiens állatok műtéti pankreatektőmiájával, és átültetés előtti intravénás glükóz tolerancia teszttel ellenőriztük. Donor-recipiens párosításokat határoztunk meg a korábban meghatározott fő hisztokompatibiiitási alfelek egy paneljét alkalmazva (8 1'. osztály és 12 II. osztály) (Lobashevsky A. et ai., lissue Antigens 54, 254-263 (1933); Knapp L. A. et ai., lissue Antigens 50, 657-661 (1997); Watkíns D. I., Crit. Rév. immunoi. 15, 1-29 (1995)]. A párosítások maximálták a diszparitást az I. és II. osztályú lókuszok között. A kilökődést úgy határoztuk meg, mint amikor két egymás utáni éhezés! vér glükóz érték 125 mg/dl-néi nagyobb az egymás utáni napokon. Az allogén szigetek intraportális infúziója (> 10 000 lEQ/kg) az euglikémia és az inzulinfüggetlenség kezdeti heiyreáliitödását eredményezte a diabéteszét majmoknál mindkét csoportban.
*
A pankreatektomisált mafcákők LlöáEAfSilg/rapamicin/antí-IL-óR mAb kezelése jelentesse meghosszabbította a sziget aliograft fennmaradást {204, ISO, 216, >220 illetőleg 56 nap). Az L104EA29Ylg/rapamicin/anti~lL~2E kezelés az állatok megfelelő ginköz kontrollját eredményezte, melyet az éhezést plazma glükóz szintek jeleznek (5. és 168. ábra), Továbbá ezeknek az állatoknak nincs szüksége inzulinpötlásos kezelésre jelentősen, hosszabb ideig (6. ábra). Ezzel szerben, azok az állatok, melyek csak az alapkezelést kapták (rapamicin/aati~TL~2R mAb), egy héten belül kilökték a beültetett szigeteket (16C. ábra). A kontroll állatok az éhezést plazma glükóz jelentősen megnövekedett szintjeit mutatták (5. ábra) . Továbbá a kontroll állatoknak inzul.inpőtlásos terápiára volt szükségük a szigetátültetés után egy héten belül (6. ábra) , Az LI04EA29YIg kezelést kapó öt állat közül négy kiIbkődés-mentesexx életben maradt a kezelési idő alatt (III. táblázat)., Az intravénás glükóz tolerancia teszt, az inzulin és a glükőzszintek mérésével igazolta a szigetfunkciót az átültetés után <reprezentatív állat, 7, és 16D. ábra).
XXI. táblá&ab Sziget aliograft túlélés és kezelés
lEQ/kg Túlélés* Kezelés MAC hibás ilieszk,(n)
X. oszt. 11. oszt.
RKf-7 22,250 204 LEA292/Rapa/«IL-2 R X-, Z.
Ruf-7 17,087 ISO LEA29Y/Eupa/aIL~2R ND
Rre-7 20,2 6 6 216 LEA29Y/Hapa/aIL-2R ’·>
Wt-6 16,033 56 LEA297/Rapa/alL-2R 2.
üdv-6 8,201 >220 LEá29Y/Rapa/aIL~2R 1
7?.S02/öe:/sa2 záz
P.Qz-6 12,980 7 8s.pa/alL-2R 2 5
E1B-7 10,903 7 Rapa/alL-2R 1 4 * Inzulin függetlenség, ND, egy sincs kikutatva a tipizált allélekben
Az átültetés utáni 100. napon a rapamicin dózisát folyamatosan csökkentettük, és a 120. napra nullára csökkentettük- Az állatok folyamatosan inzulin-függetlenek maradtak, .míg az LlO4EA29YIg monoterápiát kapták. Az átültetés utáni ~15ö. napon a megmaradt szigetrecipíensefc megkapták az utolsó L104EA29Yig dózist, abbahagyva a további iwtunsznppresszív kezelést.
Ahogy várható volt, -1-2 hónappal a kezelés megszakítása után a recipiensek hiperglikemiásakká váltak, és külső inzulinkezelésre veit szükség. A szövettani elemzés mononakleáris beszűrödé St mutatott ki, ami alapján nagyon valószínűsíthető volt a kilökődés a glükóz kontroll elvesztés kőroktanaként (17. ábra). Egy intravénás glükóz tolerancia tesztben, az L104EA2 ilYig/rapamicin/sntí~LL~2R mAb kezelést kapó tesztállatofc normális glükóz szinteket mutattak a szlgetátültetés után <7. és 16D. ábra).
Az anti-donor IFN-v-termelő sejtek gyakoriságát ELISpct vizsgálattal mutattuk ki, és egy Immunspot képalkotó rendszert alkalmazva elemeztük. A csak immunszuppressziv kezelést kapó állatok a donor-reaktív IFNy termelő T-sejtek (8414,6 sejtek) szignifikánsan megnövekedett számát mutatták, míg az Llö4EA29Ylg kezelést kapó állatoknál nem volt kimutatható válasz (2+0,56 sejt),
A® kezelés meggátolja az anti-donor T- és B-sejt válasrok primiag-ját, A primíng-on átesett ailoreaktiv T-sejtek gyakoriságát hatásosan mutathatjuk ki ELISpct vizsgálatot alkalmazva, mely meg tudja különböztetni az 1ΕΝ-γ termelést egysejt szinten. A szigetreeipiensekbol származó perifériás vérmintákat ?7moz/8E/r?m_TÁj különböző időpontokban elemeztük az átültetés előtt és után is arra a képességre, hogy IFb-y-i hoznak-e létre a donor antigénre adott válaszban. A csak alapkezelés szerint kezeit állatok gyorsan alakítottak ki mérhető donorellenes választ, mely egybeesett a kilökődéssel 1 héttel az átültetés után. Ezzel szemben a donorellenes TFE-γ-termelő sejtek gyakorisága az L104EAz9Ylgtartaimű beadási módot kapó állatokban nem volt kimutatható, mig a terápiát visszavontuk {reprezentál Ív állatok, 18A. és 8 ábra) . Tehát az LlG4EA.29¥lg kezelés hatásosan blokkolja a donorellenes T-sejt-válaszokat, melyet az IEE-y-termelő képességgel mértünk.
Áramlási citometriát használtunk a donoréilenes antitestválaszok kialakulásának megvizsgálására. A kontroll csoporton beiül egy állat erős antí-donor Ab választ hozott létre, míg másoknak nem sikerült kimutatható választ kialakítani, valószínűleg azért, mert azelőtt fájdalommentesen elpusztítottuk, mielőtt az antitestválasz mérhető volt {18.C. ábra) . Ezzel szemben az Öt állat közül négynek nem sikerült antitest-választ létrehoznia mialatt az L104SA29YIg kezelést kapta. Ez Összhangban áll a korábban ismertetett eredményekkel , melyeknél CTLA-4 lg·-1 alkalmaztak egy sziget-átültetési modellben (Levisetti M. G. et al.., J. Immunoi. 159, 5187-5131 {1997)) valamint a xti vese allograft modellben végzett kísérleteinkkel, ahol a reciplensek nem tudtak antidonor antitesteket létrehozni (Pearson T. et al,, (kivonat.) . A 17ts American Soeiety of Transplant Physician Annual Meetlng programjai és kivonatai, Chicago, 1997, május 10-14., Chicago, American Soeiety of Transplant Ehysácians), Az öt recipiens közül. egy állat egy kilökodési epizódon esett át, bár I,lö4E.A.291g kezelést kapott, és ezután egy antí-donor antitest választ aiarntsz/ss/ZAZ ráz kitett ki. Ahogy várható volt,, a megmaradt négy, LÍ04FA29fIg kezelést kapó állat következetesen anti-donor antitest válaszokat alakított ki a kilökődés ideje körül (-200 nap az átültetés után,· SO nap az- L104SA29Ylg utolsó dózisa után) .
A szigetátültetés gyorsan válhat az 1-es típusé brittlediabéteszéé betegek -életmentő kezelésévé. A közelmúltban -megjelent szteroidmentes immunszuppresszív módszereket leíró beszámolók, mely módszerek sikeres inzulin függetlenséget eredményeztek a szigetátültetés után, megújult optimizmust okoztak a szigetétültetés gyakorlati alkalmazása kérdésében. Míg a giükokortikordok kizárása az immunszuppresszív kezelési módokból jelentős lépésnek számított az 1-es típusú diabétesz kezelésére tett erőfeszítésekben, a primer ixmr-unszuppressziö kalcineuron inhibitor terápiájába vetett bizalom korlátozta ennek, a módszernek az alkalmazását. A kalcineurin inhibitoroknak számos nem kívánt mellékhatása van, ezek közé tartozik a nef.rotoxicitás, diabétesz, alacsony vérnyomás, a megromlott lipídmetabolízmus ás híruzit.izmus [Kábán B. D. et al., d, Engl. 6. Med. 321, 1725-1738 (1989); Group TUSMFíS; A eomparison of. taroollmus (FK506) and cyolosporíne fór ímmnnosnppression in iiver transplantanion; the O.S. Multicenter FK50-6- Liver Study Group. H. Engl, J. Med. 331, 1110-1115 (1994); de Matton AM. et al., Am. u. Kidney Disease 35, 333-346 (2600)J. Még amikor a gyógyszerszintet alacsonyan tartották, akkor ís jelentős mellékhatások alakulhatnak ki. Ez különösen igaz a diabéteszes betegpopuiációra, ahol a vesefunkció már károsodhatott. Valóban, a legújabban Edmonton-ból úgy számoltak be, hogy két beteg, akiknek közepesen megemelkedett átültetés előtti kreat.ini.n-szi.ntjük volt, jelentősen csókként a 'urnöz/ss/mo ra·;
vesefunkciójuk a kaieíneurin inhibitor terápia alatt, és végül ennek a gyógyszernek a beadását meg kellett szűntetni (Ryan E, A. et al., Diabetes 50, 710-719 (2901)]. Ugyanezen a beszámoló szerint a recipiensek kétharmadában ugyanilyen szintű glükózántolerancia alakult ki, egynegyedüknél pedig nyilvánvaló átültetés utáni diabétesz, melyekről ágy gondolták, hogy a tarkolímusz alkalmazásával kapcsolatosak, Ez kihangsúlyozza egy kaleineurin inbibítormentes ímmunszuppresszív módszer, különösen a szigetátültetés vonzó voltát és alapvető természetét.
A T-sejt kostímulátor reakcíőutak blokádja a nem toxikus itmiunszuppressziv és potenciálisan tolerogén módszerek kialakításának vonzó stratégiája. Ez a módszer azokat a T-seiteket célozza meg, melyek az „1. szignált kapják a győgyszerbeadás Ideje alatt. Például a peritranszpiantáoiós időszak alatti kezelésről azt gondoljuk, hogy az az ailospecítikos T-sejbeket impotenssé tette az új szervvel vagy szövettel való találkozáskor, míg más T-sejtek nem károsodtak (Li Y. et al., Nat. Med. 5, 1298-1302 (1999)}, A CD287B7 reakcióét blokádja igen Ígéretesnek mutatkozik az autoimmunitás és transzplantáció kísérleti modelljeiben, ezt egy különösen vonzó immunszuppresszlv céllá téve a szigetátüitetésfoen, ahol valószínűleg mind autó- mind alloímmun akadályok léteznek. A CD28 blokád lehetőségét írják le egy nagy állat transzplantációs modellben Levisetti M. G. és munkatársai [J. Immunoi. 159, 5187-5191 (1997)7. Úgy találták, hogy a CTLA1-tűvel végzett kezelés szignifikánsan, bár mérsékelten meghosszabbítja a sziget-allograft fennmaradását a nem humán főemlősökben (Levisetti M. G. et al., J. Immunoi. 159, 5187-5191 (1997)). A CTLAi-Ig monoterápia csak kissé hosszabbította meg a vese77.30Ζ/ΒΚ/ΡΛΒ ZAJ «ο allograft fennmaradását [Pearson ?. et sí., (Kivonat) A l?sn American Society of 'Transpiant Physician Annus! beating programjai és kivonatai, Chicago, 1997, május 10-14., Chicago, American Society of Transpiant Physicians) , A közelmúltban meg jelent néhány beszámoló a szigetailograftok hosszú távú fennmaradásáról a nem humán főemlős modellekben. Az anti-CD40L mAb kezelésről kimutatták, hogy ennek vannak a leghatásosabb eredményei eddig, azonban hasonlóan a vese átültetési modellt alkalmazó kísérletekhez, tolex'anciát nem értek el, mivel a kezelés megszüntetése kilökődést eredményezett (Kanyon, N. S. et al., Proc. háti. Acad. Sci. USA 96, 8132-8137 (1999); Klrk A. D. et al,, hat. Med, 5, 686-693 (1999)1, Sgy másik biztató beszámolóban, Thomas és munkatársai (Diabetes 50, 1227-1236 (2001)] a közelmúltban leírták, hogy egy anti~CD3 immunotoxin és a SSG immunmoduiátor szer (Í5~dezoxispergnalin) alkalmazása erőteljesen meghosszabbítja a sziget fennmaradását a sztereptozotocin-indukált diabéteszéé főemlősökben. Ezek a beszámolók bár biztatóak, olyan terápeutikumokat hasznainak, melyeknek a klinikai potenciálja ebben az időpontban még bizonytalan.
A rhesus sziget allograft modellben a L104EA29Ylg-t, a CTLA4~Tg egy mutáns formáját alkalmazva kapott in vivő adatok összhangban állnak az in vítro bizonyítékkal, mely azt jelzi, hogy ez a második generációs molekula hatásosabb inhibitora a T-sejt válaszoknak, mint a szülő molekula. Figyelembe véve, hogy a CTLAá-lg már hatásosnak mutatkozott a pikkelysömörös betegek egy klinikai kísérletében [Abrams J. R. et ai,, J. din. Invest. 103, 1243-1252 (1999)), jelentős volt a lelkesedés a primer szuppresszánsként
11Ö4EA29Y2g-t alkalmazó kísérletekben. Es teljesen kompatibilis,
77.S0Z/SS/KSS 'TÁJ sv #
ha nem szinergikus a klinikailag elismert immunszuppresszlv szerekkel (anti-IL-2R mAb és rapamicin}, lehetővé téve a klinikai kísérletek tervezését. Az LX04EA29YIg~vel már megtörténtek az első humán kísérletek a reuma to-id artritiszes betegekben, és veseátültetésen átesett betegekben.. Sár a tarkolimusz-síapű eljárás és az Llö4EA29YIg késelési módszer közvetlen összehasonlítására nem tettek kísérletet a nem. humán .főemlősökben ismertetett nem tolerálható toxícitások miatt [bontgomery, S. P,. et al ., Am.
J. Transplant. 1 (Suppl·. 1.), 433 (2001)}, az eredményeink azt sejtetik, hogy az LlÖ4EA2.9Yl'.g~nek megvan az a képessége, hogy legalább olyan hatásos legyen primer irmnunszuppresszánsként mint a tarkolímusz.
Bgy Aj kaloineu.rin ihhibitor/szteroid-mentes immunszuppreszszív módszert írunk le, mely jelentős kilökődés elleni védelmet biztosít, és meghosszabbítja a sziget aliograftok túlélését a nem humán főemlősökben, Az I»104£A29YIg biológiai ágens egy hatásos immunszuppresszáns. Az L104SA29YIg a tarkolimuszt helyettesítheti az Edmonton~protokoiiban, ezáltal megszünteti a kaiéineurín inhibitor nem kívánt mellékhatásait.
A találmány szakterületén jártasak számára nyilvánvaló, hogy a találmány a fentebb specifikusan tárgyaltaktól eltérő formában is 'megvalósítható' anélkül, hogy a találmány lényegétől vagy alapvető jellemzőitől eltérnénk. A találmány fentebb leírt sajátos megvalósítási módjai éppen ezért a bemutatást szolgálják a korlátozás szándéka nélkül. A találmány oltalmi körét a csatolt igénypontok határozzák meg, és nem korlátozódnak a leírásban eddig bemutatott példákra,
7?,S-02/BE/RR2 TÁJ
Szekvenciák jegyzékének kötetlen szövege <210> 3 <223> Mesterséges szekvencia leírása; CTLAálg szekvencia <210> 4 <223> Mesterséges szekvencia leírása: CTLAálg szekvencia x>. 4». .X V «ϋ <223> Mesterséges szekvencia leírása: L104£A2931g szekvencia <210> δ <223> Mesterséges szekvencia leírása: LÍö4EA291Ig szekvencia <21ö> 7 <22 3> Mesterséges szekvencia leírása: L104EIg szekvencia <210> 8' <223> Mesterséges szekvencia leírása: LÍOlEIg szekvencia <21ö> 9 <223> Mesterséges szekvencia leírása: LlOIEAzéLlg szekvencia < 21 ν i 0 <22.3> Mesterséges szekvencia leírása: L1Ö4&&29L1 •<223> Mesterséges szekvencia leírása: L104EA29TXg szekvencia k /\ t C·.
*·. Z 3. V S X 2 <22:3> Mesterséges szekvencia leírása: L104EA29TIg szekvencia <223> Mesterséges szekvencia leírása:
104EA29Mlc szekvencia <223> Mesterséges szekvencia leírása: L104EA29WIc szekvencia <223> Mesterséges szekvencia <21ö> 16 <223:> Mesterséges szekvencia órása: CTLA4Ia szekvencia :TLA4Iq szekvencia.
kosztatin M CTLAi
Mesterséges szekvencia leírása: On (OMCTLA4) menetirányú primer <210> 18 <223> Mesterséges .szekvencia leírása: Onkosztatin M CT1A4
OMCTLA4) reverz primer
SEQOEEGE LTSTTBG <11G> Larsen, Christian 5.
Pearaos, Thomas C.
Adams, Andrew B.
<120> METHOOS 5Ό PROJECTING ALLOSENEIC IHLET TRANSPLÁNT 031NG EOLUSLE CTl.Ai MUTÁLT MOLSCÜL-ES <130> D017.3NP / 50436.620501 <140 10/155,514 <140 2002-05-23 <150.> 60/293,40.2 <150 200:-05-23 <160> 18
1.'Ί· Palentln versien 3.1 <210> 1 <211> 630 <212> ?;ü <213> Homo sapiens <4:00> 1
sfcgggfcgtac tgefccacaea gaggacgcfcg eteagteigg tcefcigeaeí: eefcytilieca 60
sgcaiggega goatggoaai goacgfcggcc cagccfcgetg tggtacfcggc cagcagccga 120
ggcaicgcea goifctglgég tgayiafcgca í> k—..:.- a g...a aagecacfcga ggtccgggfcg 100
aeselyct! c cgeeegeiga cagoeaggty acfcgaagtefc. gtgeggcaac e t a c a.. . ga t g 240
yggeatgsgt tgaect i a el. agacgatfccc aietgcacgg gcaectccag tggaaatcaa 300
ginsacéléa ctatccaagy setgayyyoo a3gyaesegg gaeictacat cfcgcaaggig 360
gagctcatgt aceeacegce atsctaeetg ggcatsggea sogyaaocea gafctsatgta 42 0
attgat-ccag aaccgígccc agafcfcefcgac tteeteetet gga Lcctige agoayttsgi 400:
teggggttgt ifcfcttfcatag elitetccfcc acagetgtfcfc clttyagcaa ssiyctssag 540:
aaaagaagcc etcttacaac aggggfcctafc gfcgaaaafcgc ccc ca a ca ga gceag&etgc SOI
gaaaagcaat lfccagectta fctttatfceec afceaafc 636
<210>
<2:11> 212
<2:12 > PÉT
<2I3o Homo
<400>
tfet Giy Vai Len Len Thr Gin Arg TO: lea Leli Ser Lea Vai Len Alá ί ' 5 ’ 10 15
Í7152/SS/RS» TÓ
9S
<4 00> 3 atgggtgtáC tgetca.caca gaggaegetg eteagtetgg tccttgcact c-ctgt.ttcca 60
ag-cafggega geatggcaat gcscgfggcc cégértgetg tggtactggc es..;:Ca g -M a 120
ggcatcgeta g-efcttgtgtg tgagtatgca tcrccaggca aaqceactga gglccggglg 180
ac.agtg-cfctc ggr:«ggctg« eagccaggtg- actgaagtct gtgcggcaac ctscstgstg 240
gggaatgagt tgaccfctcct agat-gattee atctgcac-gg gcacctccag tg-gaa-at-caa 300
gfc-gaacctca •ctat ccaagg aetgagggec atggaeacgg gactctacat ctgcaag-gtg 360
gag-tcatgt acccaccgcc ataetsoetg ggcataggca acgcaaecca gatttatgta 42C<
attgafeccag aaccqtgocc agattetgat caggagecctt esteitctga caaa-act cac 430:
scateeccsc -cgcecccagc acetgaactc etgggtggst cgtcsqé ;::tt cetet í: ck:c 50
essaaaccea aggacacect catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
.gacgtgagee •a cga aga ee c tgaggteaag ttcaactggt acgtggacgg ogtggaggtg 660
est 3.3. tg cea .·:: g a e a agg e e gcgggaggag cagt&caaca gcscgtaccg ggtggtcagc 720
gt:cct csccg tcctcceeca ggaetggctg aatggcasgg agtaeaagtg caaggtct.cc 780
aa c a aa g c c c tcccagcccc ea'tegagaaa aeca tér ma aageeaaagg geagcccega 840
gsaccacagg tgtacaccct gcccccatcc eggeatgage tgaeesagaa ceaggtcagc 900
ctgacctgcc tggteaaagg ctfcetaf ccc: agcgac.ateg cegtcgagfcg ggagagcaat 900
gg-gcagocg-g agaacaacta C e 6 Q'<5.0oCQ eetcccgtgc t g ga ct ccga. cg-gcfccct-tc 1020
ttcctcta.ca gcaagcfccac cgt.ggac.a-ag agcaggtggc agcaggggaa cgtefctctea 1090
tgcfceqtga tgcatgaggc tctgcacaa.o cactseacgc agaacsgeet cteecígcet 1140
eegggtaaat ga 1152
<210 > 4 <210 383 <212> PRT <213> Artifiola1 Seguence <220 <223> D'eseriptlors of Artifíeíal Sequan-cej CTLA4Ig se-quence <400 4
Met Gly Vei Lett 1 Lee 5 Thr Gla Arg thr Lee 10 Les Ser Let Val Lee 15 Alá
hes Les Phe Pro 20 Ser .Met A la Ser Met 25 Als Met Ara Vei Alá 30 Gitt Pro
Alá Val Val Lee 35 Al a Ser Ser Arg 4 0: Gly Ile Alá Ser Phe 45 Val Gye Gitt
7 . 802/SiÍ/üAB TÁJ
Tyx- Alá Sex Pro Gly Lys Alá ΤΡ.χ· SIu Val Arg Val Thr Val lea Arg 50 55 63
Gla Áia Ásp Ser Gin Val Thr Gin Val Cye Alá Alá Thr Tyr Met Met 05 10 75 50
Gly Asn GI;.· Lea Thr Phe Lea Asp Asp Ser He Cys Thr Gly Thr Ser 55 00 ' 95
Ser Gly .Asn Gin Val Asn Lea Thr Π« Sin Gly Lea Arg Alá Mer Ásp 100 105 110
Tixr Gly Lea Tyr He Gys Lys Val Gla Len Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 * 120 125
Tyx· Lea Gly Tie Gly Asa Gly Thr Gin He Tyr Val He Asp Pro Gla 130 ' HÍ H
Pro Cys Pro Aso Sex Asn Gin Gla Pro Lys Ser Ser Ásó Lys Thr Kis 145 * 150 ' 155 ‘ * ISO
Thr Sex? Pro Pro Ser Pro Alá Pro Glx; Len Len Gly Gly Sex- Ser Val
155
170 n;
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thx' Len Met 11« Ser Arg Thx? ISO IS5 100
Pro Gin Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Kis Gin Asp Pro Gl;.· 105 200 205
Vei Lys Phe Asn Trp ryx Val Asp Gly Var Gin Val Kis Aan Alá Lys 210 ' 21.5 220
Thx Lys Px?o Ax'xí Gla Gin Glx; Tyx Aaa Se?: Thr Ty;?' Arg Vei Val. Ser 225 230 235 ' ' 240
Val Lea Thr Val Len Kis Gin Asp Trp Len Asn Gly Lys Gin Tyx? Lys 24 5 - - · n/e
Cys Lys Val Ser Aon Lys Ara Len Pro- Alá Pro He Gin Lys Thr He 260 265 270
Sex? Lys Alá Lys Gly Glx· Pro Arg Gin Pro Gin Var Tyr Thr Lea Pro
275 200 205
77,VíG/S£/PAr_.yÁJ
101
Pxo Sex Arg Asp Gin Leu Thr Lys Áss Gin Val Ser Len Thr Cys Len 230 232 300
Val Lys Gly Phe· Tyr Pro Ser Asp Ile Ale Val Glu Trp Gin Ser Asn
305 310 315 320
Gly Gin Pro Glo Asn Áss Tyx Lys Thr Thr Pro Pro Val Len Asp Sex
320 330 335
Asp Glv Sár She Xshe Len. Tyr Ser Lys Len Thr Val Aso Lvs Ser Ara '34 0 34 5 .350
Trp Gin Gin Gly Aso Val Phe Ser Cys Ser Val Gat His Glu Alá Len 350 360 365
Lls Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Len Sex Pro Gly Lys 370 375 380 <210> 5 <211> 1152 <212> DMA <213> Arrílicisl Seqoeaca <22 0>
<223> Desoripfcion of Artifíclal Seqcaoee: L104EA297Iq seguence <400> 5
atgggt.gt ac tgotcacaea gang a cg·.^ t g ctcagtcrgg tccttgcact cctgtttcca 60:
aeca.rgg oga gcatg-gcaat gcacgtggcc oa g c ·. j x. g c·.. g tggtactggc oagcagccga 120
gqca.fccgcxa gcf.tt:gtgfcg tgagtatgca <. χ.. L:<j '—L y Ο J aaratactga ggtccgggtg 16(i
•acegtgcttc ggcaggctga cs-gceaggtg aetgsagtct gtgcggcaac ct&catgatg 240
gggaatgagt L gax'e‘5 rost. aga ·: gattcc atctgcacgg gcac-ctceag tggaaatcaa 300
gtqaacctoa etateoaagg scfegagggcc atggacacgg gací r: hasat. ctgcaaggtg 300
gagctcatgt « :Ü€C3CÜO;C€· a '> a '... f s cg a q ggcataggca soggaacooa ga rrt.ahgra 420
artgatccag a&eegtgcee agattetgat caggagccca aatcttcfcga ceaaactcac 430
.aestccee&c O Gvt ű. i-·!.. C‘ ÍJ<- acctgaact-c ctggggggat egteagtett cctcttcooe 54 0
ccaaaaccca aggacaccct catgstcfccc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 600
g a cgi ga g c c :<3 q. üj cl t.gaggxcaag ttcaactggfc acgtggacgg egtggaggtg 560
catasigeca ací&eaa&g cc gcgggaggag csgtacssca gcscgfcaccg fcgtggtcegc 720
g t, P L ca c cq a. ΟΌí> v.‘ :5 O C-3 ggaetggctg áatggeaagg agtacaagtg rasqgt x:tcc 780
aaeaaagccc ea <, cgag&au accatctcca e a q c u q q gcaq ccccq a 8 40
??.eö2/8JS/KA2 TÁJ
102
gaaocacagg tgtecaooet p'...·.··.·'... Ό·..· coggstgagc tgacoaagaa ccaggtcsgc 300
ergaccrgcc Lggteaaagg ettctare a·::: agcgaeatcg ccgtggagtg ggagagcaat 360
gggeagecgg agaacaacta. eaagaocaog octeeogtgo tggaetccga cggotcctte 1020
ttcotoraca geaagetcae cgtggaoaag ageagytggc agcaggggaa cgfcettctca 1030
tgetecotga tgeatgagge tctgoacaao cactacacge; agaagagcct etcecrgtct 1140
ocgggtaaat ga 1152 <2107 6 <2117 383 <2127 PRT <2137 Ari..:, iiieia.l Segue-n-oe <22 0>
<223> Oescription o:' Arhifieiai Senuence: L104EA23Tig seqnenee <4Q0;> 6
Hét Gly Tsd Lea Lea Thr Gla Arg Thr Lee Lea Ser Len Val Lea Alá 1 5 ' 10 1.5
Lea Leu The Pro Ser Mer Alá Ser Két Alá Kei Kis Val Ais Gla Pro 20 25 30
Alá Val Val Lea Alá Ser Ser Arg Giy He Aie Sex- Phe val Cys Gla 35 40' 45
Tyr Alá Ser Pro Giy Lys Tyr Thr Gla Val. Arg Val Thr Va.l. Lem. Αχ-g 50 55 60
Gin Alá Asp Ser Gin Vei Tar Gla Val Gye Aie Alá Thr Tyr Két Két 65 10 75 60
Gly Asn Gin Lea Thr Phe Lea Asp Asp Ser lie Gye Thr Gly Thr Ser 85 ' 30 05
Ser' Giy Asn Gin Val Asn Len Thr Tle Gin Gly Lea Arg Alá Hét Asp 100 105 110
Thr Giy Lea Tyr; lie Cys Lys Val Gin Lea Két Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125
Tyr Gla Giy lie Giy Asr Giy Thr Gin lie Tyr Val lie Asp Pro Gla 130 ' i35 140
Pro Gys Pro Asp Ser Asp Gin Gla Pro Lys Ser Ser Asp Los Thr Kis 145 150 155 160
77.302/BS/KS.2 TÁJ
TF-.r Ser Pro Pro· Ser Pro Alá Pro Cin Len .Len Gly Gly Ser: Sor Val 165 17 0 ' 17 S
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro lys Asp Thr Le a Mer He Ser Arg Thr 130 285 ISO
Pro Gin Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Gin Asp Pro Glu 135 000 205
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp· Gly Val Gin Val Hís Asm. Alá lys 21Ö 215 “ 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
225 ' 220 235 ’ ' 210
Vai Len Thr Val len Hls Gin lep Trp Leu Asn Gly Lys Gla Tyr Lys ;45
250 *55
Cys Lys Val Ser Asn Lys Alá Len Pro Alá Pro Tle Gin Lys Thx- Tle 260 265 270
Ser Lys Alá Lys Gly Gin Pro Arg Gla Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro 275 * * 280 285
Pro Ser Arg Asp Gin Len Thr Lys Asn Gin Val Ser Len Thr Gys Len 290 235 300
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Tie Alá Val Gin Trp Gin Ser Asn 305 310 315 320
Ily Gin Pro Gin Asn Asn· Tyr· Lys Thr- Thr Pro Pro Val Len Asp Ser 325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Len Tyr Ser Lys Len Thr Val Asp Lys Ser' Arg 340 345 ' 350
Trp Gin. Gin Gly Asn Val Phe. Ser Gys Ser Vai Met His Gin Alá Len 355 360 365
Pia Asn Sis Tyr Thr Gin Lys Ser' Len Ser Len Ser Pro Gly Lys 370 375 300 <210.·· 7 <211> 1152 <212 > PNA <213> Axfc'ificial Segnence
77.S02/SE/H4U TÁT <22 0>
<223> Desoription of Artíiocisl Sequenoex L104Slg: seqaeace <400> 7
atgggtgtac rgctcacaca gaggaegotg oecagtesgg écoLégcsőt ocsgfettooa 60
agcatggcga •gcatggcaat gon '.jgt gg oo cagccé goL.y éggL.actggc <?· í.í ei Ο Ο Ω el 120
ggcatogcta gctttgtgtg tgsgtatgea fcctcesggea aagceacfc-gs gcLccggcLg 190
soagtgostc ggcaggctga oagccaggfcg actgaagtct gtgcggcaac ctacatgatg 290
gggaatgagt t g a cc'.. 1. cos aga tgs 3:: atcfcgcacgg gC 5: oo fcccag tggaaatca-a 300
gtgaa-cctoa ctatccasgg actgsgggcc sé gcv ősege·· gaoto Laciit: etgcaaggtg 360
gagctoatg't aoccaccgcc atactacgag ggoataggoa acqgaacoca gáté L atgts 420
attgatccag & a ο c g t. g c c c agattcfcgat csggagccoa aatetfcotga cssaactcac 430
s-caéccccac cgtccccagc acctgaactc eégggggyafc egteagtetí: cetet toccc 540
ccsaaaccea aggacaeecfc cségatctcc cggaccccLg agg·: oacstg cgéggtggtg 600
gscgtgagcc aogaagaccc tgaggtcaag étcaactggt sCq :. gyaegg cgtggaggtg 660
catentecos sgacasagcc gogggaggag ca g:t tuOS a es. geacg é sccg: tgtggtcsgc 720
gtootcaocg Lo c fc ·.;'.. <. c ·... a ggacfcggotg aatggoaagg agfcacaagfeg ess cg te t. c c 7 30
asoa.aagcec ·..o c... sí g·,—‘.j · j c cat.ega.gaaa aecatefccca aagccaaagg gcagceoega 84 0
gsaccacagg tgfcacao-ccfc gceeecatcc egggatgage tgaccasgaa ecaggtcagc 000
o ·.. g e.:.:ce ·.. ··.: Lggteaaagg oí: Scfeatooc agcgaoatcg cegtggagfcg ggagagcaat 960
gggcagccgg agaseasets gaagac cgog ·.. ·.. t o c c gr. g o i. g g'oC e o c g s cggctecfctc 1020
ttértetaca ge&sg c scac cg s ggacaa g agoaggfeggo agcaggggaa cgtcttctca 1030
tgoi.ccgt ga Lgoatgaggc tcfcgeacaae cactaeaoge sgaagagcet ctceetgtct 1140
cogggtsaat ge 1132
<210.> 8 <?··> 393 <212c PRT <213> Áréifiolái Hegaen·::;::
<22 0>
<223> Lescrirtíoa oi: Art!siclai Segiienoe: L104Eig seqnaece <4 00.> 3
He·: Gly Val Leu Leu Thr Glr Arg Thr Len Len Ser Le:.: Vei Leu Alá
5 10 IS
Leu Len Phe Pro Ser Hét Ale Ser Mec Aia Hét Hls Vei Aia Gin Pro·
23 30
77,802/í>E/:&&2 TÁJ
Als Val 'Vai Leu Aia Ser Ser Arg Giy Tie Aia Ser Phe Val Cvs Gin 35 40' 43
Tyr Alá Ser Pro Giy L:ys Alá Th::' Gin Vai Arg Vai Thr Vai Leu Arg 50 55 60
Gin Aia Asp Ser Gin Vai Thr Giu Val Cys Aia Aia Thr Tyr Met Mefc 65 VG 75 ' SŰ
Giy Asn Giu Leu Thr Phe Lan Asp Aso Ser Tie Cys Thr Giy rh.r Ser 55 3ű 55
Ser Giy Asn Gin Vsl Asn Les Thr He Gin Giy Len Arg Aia Lfet Asp 1G0 1Ű5 ' '3.5,0
Thr Giy Leu Tyr lle Cys Lys Vai Giu Leu Mer Tyr Pro Pro Pro Tyr515 ' 120 125
Tyr Gin Giy Iie Giy Asn Giy Thr Gin He Tyr Val iie Asn Pro Gin 130 ' 3,35 ' 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Gin Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 145 155 3.55 * ' ISO
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ai.a Pro Giu Leu Leu Giy Giy Ser Ser Vai 165 1.70 3.75
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Len Met iie Ser Arg Thr ISO ' 185 ISO
Pro Gin Vai Thr 'Cys Val. Vai Vai Asp Vai Ser Kis Gin Asp Pro Gin 155 2G0 205
Vai. Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Giy Vai Giu Vai Kis Asn Aia Lys
2133
215
Thr Lys· Pro Arg Gin Giu Gin Tyr- Asn Ser Thr Tyr' Arg Va3. Vai Ser :?5
230
240
Vai Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Len Aon Giy Lys Gin Tyr Lys 243; 2330 ' ' 255
Cys Lys Vai. Ser Asn Lys Aia Len Pro Aia Pro Iie Giu Lys Thr iie 260 255 270
Ser Lys Aia Lys Gi.y Gin Pro Áru Gin Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro 2 733 280 25 5
7.3Ö2/SS/8&S_TÁJ $
Pro Ser 220 Arg Asp Gin Len. Thr 295 Lys Asn Gin Val. Ser 300 Len Thr Cys Len
Val. 305 Lys Giy Phe Tyr Pro 310 Sor Asp Tie Al.a Val. 315 Gin Trp Gin Ser Aon 320
Gly Gin Pro Gla Asn 32 5 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Vei nea Asp 335 Ser
Asp Giy Sor Phe 340 Phe Len Tyr Ser Lys 34 5 hon Thr Vsi Asp Lys 31H1 Sor Ara
Trp Gin. Gin 355 Gly Asn Val PhO Sor 350 cys Ser Vai Hét Sis 365 G1 a ;'O. a Len
His Asn 370 His Tyr Thr Gin Lys 375 Sor Len Sor Len Ser 380 Pro Gly Lys
<210> 3 <2ΐι> :.i5?
<212> DMA <213> .Aríf.j.eí.ajL Seqaence <220>
<223> Deseriphion of Artif icial. S egnen oe; 1.10 4 EA2 9. L Lg seqnance
<403> 3 at-gggtgtac tgorcacaca gaggaogatg eteagtetgg tcottgoact cchgtttcoa 30
agcatggcga geatggcaai gon cg ·, gg oo csgcetgctg tggtactggc cagcagcoga 120
ggcatcgefca gctttgtghg tgagrahgcs teteoaggea aattgactga ggcccgggtg 180
acagtgctte ggcaggctga cagocaggtc achgaagtet gtgcggoaac ctacatgsig 2 40
gggaatgagt tgacettooh agatgabLcc ntohgoocgg gO<l\..l___g tggaaatoaa 300
ghgaaccr ca chatccaagg aetgaggg.ee atggacacgg gactsrácát ctccaaggtg 360
gagcrcatgt aa ccgcc a hactacgag ggoataggoa acggaaocce gattta tata 420
et-tgareoag aaccgtgccc agahtetgat eaggagccoa aatottctga caassotcac 4SÖ
acatcccoac cgfcecccsgc scoLgascte nfcggggggat cgtoagtctfc CC-rCl lCoCC 54 ö
ccasaaocca aggscaccct osrgatctce oggocceotg aggtoaoatg cgtggt.ggtg 600
gang hgagcc acgasgacec cgaggtcaag rtcoachggt acgtggacgg cgtggaggtg 660
estaalgcca agacaaagcc gogggaggag cagtaoaaco g ...agt ao cg tgtggtcagc 720
gtcctcaccg L cct gcacea ggactggetg aatggoaagg agtacaagtg caaggtctcc 780
ascaaagcco ccccagocce o at cg agaaa sccatctcca aagccaaagg goagccccga 840
7?,$52/3£/KSa TÁJ
107
gaaccaoagg tgrácsecet gocoouat.ee cgggatgsgc tgscuaagsa uuaggt uage 300
utgacctgcc tggtceaagg cttctatccc sgugacstcg cegtggagtg ggsgagusst 9S0
qggcsgocgg agsscaacts caagacoacg C'w mmg'.. gu tggactccga cggctccttn 1020
érceturacs gcssgetese cgéggacsag agcaggtggo ageaggngaa ogtettctca 1080
rgetcégtea rqcs '.gagge r er.gcso·:: au uactacaugc agaagsgcet ctuectgtet 1140
cegggtaaat ga 1152
<2Τ0> 10 <21i> 783 <212> PRT <213> Arti.fi elaí Sequence <22Ő>
<223> Oescriptio-n of Art1ficial Seqnence;: L104ílA2$LTg sequence <400> 10
Met: Giy Vei Leu Len Thr Gin Arg Thr Leu len Ser Le);· Val Len Aia
5 ’ 10: 15
Len Len Phe Pro Ser Met Als Ser Mer Alá Met Hús Val Alá Gin Pro 20 25 30 ele Val Val Len Alá Ser Ser Arg Oly lle Alá Ser Phe Val Cys Gin 35 40 4 5
Tyr Alá Ser Pro Giy Lys Leu Th.r Gin Val. Arc Vsl Thr Val Len Arc 50 55 00
Gin Alá Asp Ser Gin Val Thr Gin Val Cys: Alá Alá Thr Tyr Met Met 05 70 75 00
Giy Asn Gin Len Thr Phe leu Asp Asp Ser Iie Cys Thr G.J.y Thr Ser 85 ' 90 ' 95
Ser Giy Asn Gin Val Asn len Thr Tle Gin Giy Len Arg Aia Met Asp 100 103 ' 110
Thr Giy Len Tyr lle Cys lys Val Gin Leu Met. Tyr Pro Pro· Pro Tyr 115 ' ' 120 125
Tyr Gin G.ly lle Giy Asn Giy Thr Gin He Tyr Val He Asn Pro Gin 130 “ 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Gin Pro lys Ser Ser Asp Lys Thr His 11:5 150 155 ' ISO
77.8SA/SK/K&2 TTC
T'hx· Sex- Pro Pro Sex- Pro Aia Pro 165
Glu Leu· Len Giy Giy Ser Ser Vai 170 175
Phe Len Phe Pro Pro Lys Pxro Lys ISO
Asp Thr Len hier Tie Ser Arg Thr 185 190:
Pro Gin Vai Thr Cys Vai Vai Vai 195 200
Asp Vai Ser His Gin Asp Pro Gin 205
Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 210 215
Giy Va.i Gin Vai Pia Asn Aia Lya 220
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr 2:25 ’ ' 230
Asn Ser Thx' Tyr Arg Vai vai Ser 235 270
Vai Len Thr Vai Len His Sir; Asp 2-15
Trp Lee Asn Giy Lys Gin Tyr' Lys 250 255
Cys Lys Val Sor Asn Lys Ara Les 200
Pro Aia Pro lie Gin Lys Thr Tie 265 270
Sor lys; Aia Lys Giy Gin Pro Arg 275 230
Gin Pro Gin. Vai Tyr Thr Len Pro 285
Pro Sor Arg Asp Glu Len Thr Lys 290 ' 205
Asn Gin Vai Ser Len Thr Gys Len 300
Vai Lys Giy Phe Tyr Pro Ser Asn 305 ' '310 lie Alá Vai Gin Trp Cin Ser Asn 315 ' 320
Giy Gin Pro Glu Asn Asn Tyr' Lys 325
Thr Thr Pro Pro Val Len Asp S-er 330 335
Áss Giy Sor Phe Phe Les Tyr Ser 34 0
Lys Len Thr Val Asp Lys Ser Arg 335 350
Trp Gin Gin Giy Asn Vai Phe Ser 355 300
Cys Ser Vai Mefc His Gin Aia Len. 5S5 his Asn Pis Tyr Thr Gin Lys Ser 370 375
Len Ser Len Ser Pro Giy Lys 380 <210> li <2TI> 1152 <212 > OGA <2T3> Arfcifieial Sequence
7A7V1/SK/RAS OA?
<220>
·<223> Description of Asrfcificiai Sequence: Le.04LA29TIg aeqixeace <4·0·0> 11
atgcqrgtan tgcrnacaca gaggacgcfcg etcagtefgg reettgeaet: mtgtttma 60
agcatggcga qcar gqcaar gnacgtggnn nagmtgctg nggtactggc cagcagmga 120
ggcetcgcta gctrtgtgtg Lgag-t a r gua tetenaggea aaactantgs gat ccqg gr. g· 160
acagtgctrc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtet ctg egqc a a c ntacstyatg 24.0
gggaatgagt r gacetrent sgatgattoc stotgesegg gcsectmag tggaaatcaa 300
gr qan ccr na cnatmasgg scrgagggce stggacaegg g a C ·.. '·.. t si'O 2 t ctgcaaggtg ISO
qagctcaLgt anncsengne alantacgag gyestaggra aegg&amea gatttatgta 420
attgstccag aamg rgem agattctoal: raygagnres sarntterga caaaactcan 480
a cate eecac ο g<.. e c n n ag c amtgsscrn ctggggggat cgtengrott ccgetteege 54 0
ccaaaacccs aggacacccr eatgarcfc .cc cggacccctg aggteseatg cgLggtggfg 600
gacgtgagm acgaagamn tgaggfceaag ttcsaetggt angtggangg cgtggsggtg 660
ca C a a L g c ca agsnaaagnc gcgggaggag o „ g u&u a a ca goacgfcancg tgfggtcagn 72Ü
gt cannacng tentgeanna ggactggctg aatggnaagg agtacaagtg caaggtctnn ISO-
aacaaagccr: tennagemn catcgagasa a c na t r t ma a a g m a a agg g c a g c c e cg a 84 0
qaaccacsgg tgt acscmt gccmnatcc cgggatgagn tgaccaagaa neaggteage S00:
•ctqacctgcc rggtcaaagg Cu ·.. c r a f c cc agngacarng ccgi: ggsgt g ggagageast S60:
gggcagccgg sqaaeaacta casgannacg ccLccegtgr tggaetccga ngqct nntte 1020:
<. uCvtca ea gcaagcfceao cgfcggacasg agnaggt: ggc sgeagggyaa cgtcrtntca 1Ö8O:
rgefmgtga tgcatgagge totgcacano eactacsere agaagagmt ctccctgt el: 1240:
mgggtsaat ga 1152
<210 11 <21O 38 3 <210 22 <213> Arái ficial Sequence <220 <220 Deseription of Artificial Sequence: L10iSA2STIq sagnanne <400 12
Mez Gly Val Len Len Thr Gin Arg Or Len Lee Ser Len Val Len Alá
5 2 0' 15
Len Len Phe Pro Ser Met Alá Ser M-efc Ais Get His Vai Alá Gin arc
25 30
77.892/Í5E/8A2 TÁL iiO
Alá Val Vei Len Alá Ser Ser Arg Gly lle Aia Ser Phe Vai Cys Gla. 35 40- 45
Tyr Aia Ser Pxo Gly Lys Thr Thr Gin Val Arg· Vai Thr Vei len Arg 55 55 SO
Gin Ais Asp Ser Gin Vei Thr Gin Vei Gys; Alá Alá Thx: Tyr Bei: Sfet 55 Tö 75 SO
Gly Asn Gin Lest Thr Phe Len Asp Asp Ser lle Cys Thr· Gly Thr Ser.· 5 5 ' 35 35
Ser Gly Asn Gin Vei Asn Les Thr lie Gin Giy Len Arg Alá Get Asp 100 IÖS 110
Thr Giy Lsu Tyr lle Cys Lys Vei Gla Leu Kefe Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 ' 120 ” 125
Tyr Gin Giy lle Gly Asa Gly Thr Gin lle Tyr Val lle Asp Pro Gin 130 135 140
Pro Cys Pro Asp Ser' Asp Gin Gin Pro: Lys Sor? Ser Asp Lys Thr His 145 150 155 ISO
Thr Sex? Pro Pro Ser Pro Alá Pro Gin Letx Len Giy Gly Sex: Ser- Vei 1S5 IVÓ ' 175
Pia; Len Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Len Get lle Sex: Arg Thr 180 ' ~ 135 ISO
Pro Gin Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Kis Gla Asp Pro Gla 195 200 205
Val Lys: Phe Asn Tre Tvx: VAX Asn Gly Val Gin Vei His Asn Alá Les 215 ' ' 215 ' 220
Thx' Lys Pro Arg Gla Gla Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Vei Sex:
225 ' 235 ' 255 240
Val Len Thr- Vei Lsv í-üs Gin Asp Trp Lón Am:. Gly Lys Gin Tyr Lys 245 250 255
Cys Lys Vei Ser Asrí Lys A.Le Len Pro Aia Pro lle Gin Lys Thr lle
60
Ti ?L
Ser Lys Alá Lys Giy Gin Pro Arg Gin Pro Gin Val Tyr Thr Lan Pro 225 ' ' 200 285
77.302/ST/2AX J:Á7
Pro Ser 500 Arg Asp Gla Leu Thr 355 Lya Asa Sin Val Ser 350 Lee Thr Cys Lea
Val· 305 Lya Giy Phe Tyr Pro 310 Ser Ásp 15 Alá Val 315 Gia Trp Gin Ser' Asa. 320
Giy Gin Pro Gla Asn 53 5 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Vai Len Asp 335 Ser
Asp Giy Ser Pha 34 0 Pihe LSC Tyr Ser Lys 545 Lee Thr val Asp Lys 350 Ser Arg
Trp Gin Gin 355 Giy Asn Val Pihe Ser 355 Gys Ser Val he r Hl a 355 Gla A. is Len
Kis Asn His Tyr Thr Gw. lya Ser Is.: Ser Len Se r. Pro Giy Lys
370 375 330
<310> 13
<511 > 1152
< 512 > SNA
<213> Arillőiéi Segnence
<520>
<223> Lesoriptioa of Art!fiolái Seqaence; 1104EA2Wíg seqaence
<4 0 ö > 13
stgggtgreo t0; · ·· £’,<sC3 vá gaggaogotg croagtcrgg tccttgcact octgr tcca 60
agcatggcga gcatggcsat gcacgoggcc eagcctgotg tgghactggo CeiCí GGí£ CC C ·:: 12 0
ggcstcgcta gctttgrgtg tgagtatgca <. c c ocao ooa aatggactga ggtoogggtg ISO
aosgtgctto ggoaggctga cagccaggrg acigsagtor gtgoggcsao otacafgatg 540
gggaatgagt tgscctfccet agatgattcc a t «j c g c a o gg gcaootccsg tggsaatcss 300
gtgaacctca ei.atcoaagq sci gagggoc sfcggacacgg gactctacat ctgcaaggtg 300
gagetestgt accca oogcc S ·; 3eÍ. :uOOág ggc.ata.ggca soggssoocs gatttatgfca 420
attgarooag aaccgtgcco agattotgat cagqsgcccs aatct iotgs caaaact cár: 430
So A t vCCC íiC cgr ooucagc aectgaaetc ctggggggar ogtcsgictt ootcttoccc 5 40
ccsaaaccce aggsoaecet oatgatctcc cggaeccctg aggtoaoatg ogtggtggtg 600
g s c g r o a go o CC vj[ o-G'-γ db <· <- tgaggtoaag ttoaactggfc acgrggacgg ogtggsggtg 6 60
eatsai.gcoa ::;<LÍ5 CS g: <JC C gcgggaggag ... ·Σϊt a e<; <s ca gcacgtaccg tgtggtoagc 720
gr cor wc c g tcctgcacos ggscrggctg a.at ggcasgg sgracaagtg caaggtctcc 780
aaeaaagcce tcocáncoca catogagass aecstcteca aa go ess agg gcegcccoya 840
?7«;SS2'/SB/'M2 TÁV
gaaccacagg tgtacaccct g cc c c c a t c c cqggatqsgo tgaccaagaa ecsggtcagc 306
olgacclgcc Iggtcaaagg cttctatcec agogacatog ecgtggagtg ggagagcsat 363
qggeageegg agaseascta caagaooaog cctccegtgc t ggaet oega cggctccttc 1620
Iteetclaea gcaagetcac ogtggacaag agcsqgtgge agcaqgggaa cgtettelea 1080
tgetcogtga. tgcatgsgge tctgcacaac cactacaegc agaagagcct cl ecet q Let 1140
eegggtaaat SS 1152
<21ö> 14 <21 le 383 <212 > PRT <213> Artifí.cial Seguence <220>
<2'23> GescrSptroe of Artífieial Seqa«x:ce: L104LA23GTg seqaence <4 00:> 14
Mot Gly Val Laa Les 'thr Gin Arg Thr Lse Lsu Ser Lea Val Len Alá 1 5 16 15
Len Len Rhe Pro Ser Mot Alá Ser Mot Alá Ma;: His Val Alá Glr; Pro 23 25 lö
Alá Val Val Lea Alá Ser Sár Arg Gly lle Alá Ser Phe Val Cys Gla 35 4 0 45
Tyr Alá Ser Pro oly Lys Trp Thr Gla Val Arg Val Thr Val Les Arg 50 55 60
Gin Alá .Asp Ser Gla Val Thr Glu Val Cys Alá Ara Thr Tyr' Mát Met SS 70 ' 75 80
Gly Asm Gin Lee Thr Phe Lee Asp Asp Ser lle Cys Thr Gly 'Thr Ser 35 SO 95
Ser Gly .Áss Glr· Val Asm Lee Th.r lle Olln Cly Lee Arg Alá Met Asp 100 105 110
Thr Gly Lee Tyr 11« Cys Lys Val Gle Lee Met Tyr Pro Pro Pro Tyr 115 120 125
Tyr Gle Gly lle Gly Ase Gly Thr Gle lle Tyr val lle Asp Pro Gle 130 135 llö
Pro Cys Pro· Asp Ser Asp Gle Gr« Pro Lys. Sex' Sár Asp Lys Thr Hls 145 ' 150 155 ISO
77.382/88/ΚΛ2 TÁJ
113
Thr Ser Ρ ΓΟ Pro Ser 165 Pro Alá Pro G a o Lea 170 Le a Gly Gly Ser Ser 175 Val
Phe Leu Phe Pro ISO Pro Lys Pro Lys Asp 105 Thr Les Siet: lle Ser 190 .Arg Thr
Pro Gla Var 195 Thr Gye Val Vei Val 200 Asp Val Ser Ars Gla 205 Asp Pro Gin
Val Lys 210 Phe Asn Trp Tyr Val 215 Asp Gly Val Gla Val 220 his Asn Al. a Lys
Thr 225 Lys Pro Arg Gla Gla 230 Gin Tyr Asn Ser Thr 235 Tyr Arg Val Val Ser 240:
Vei Len Thr Val tea 24 5 His Gin Asp Trp Len 2:50 Asxr Gly Lys Gla Tyr 255 Lys
Gye Lys Val Ser 2 0 0 Asn Lys Al a Len Pro 265 Sv.t. ::í Pro Lle Gla Lys 276 Thr lle
Ser Lys Aia 275 Lys Gly Gin Pro Arg 280 Gla Pro Gl n Val. Tyr 20 5 Thr Len Pro
Pro Ser 2 90 Arg Asp Gin Tara. Thr 295 Lys As n •’.:.a. Val Ser 300 Le a Thr Cys Len
Val 305 Lys Gly Phe Tyr Pro 316 Ser Asp lle Alá. Val 315 Gla Trp Gin Ser Asn 320
Oly Gin Pro Gla Asn 325 Asn Tyr Lys Thr Thr 330 Pro Pro Val Len Asp 335 Ser
Asp Gly Ser Phe 34 ö Phe Len Tyr Ser n y s 345 reá Thr vei Aso Lvs 350: Ser' Arg
Trp Gin Gin 355 Gly Asn Val Phe Ser 360 Cys Ser Val Get His 365 Gla Ara Le a
His Asn 370 his Tyr Thr Gin Lys 375 Ser Les. Ser Len Ser 330 Pro Gly Lys
<210> 15 <2:ll> 1152 <2:12> ΟΤΑ <213> A:ot:ίficial. Sequenee .,.802/BK/RftS
114 <220>
<225> Deroript:io.a Art ifid el Segueno-e: CTLA4Ig sequenca <400> 15
atgggtgtae tgctcacaca gaggaogctg ctcagtclgg teettgeset cctgtttcca 6:0
agc&tggcga gcatg-gcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 12Q:
íJCJCís .£.'£'·2 CÍ8C gél: LtgtgLg tgagtatgca totccaggca aagooactga ggtccgggtg 130
acagtgct1e ggcaggctga sacccaggtg actgaagtet gtgcggca&c ctacatgatg 26 0
gggaatgagt tgacottcct agatgattoc st etgcsogg gcsceícosg t CJí£:b33 CCaC 50 0
gtgaacctca ctatccaagg actgagggoc atggacacgg gsctetacst ctgcaaggtg 550
gagotcatgt acccaccgcc atactacotg ggcataggca acggaaccca gatttatgta 610
3 G !..ΰί.·ΐ·ί. '—CiA.íj aaccgtgccc agattotgat caggagccca aatcttotga caaasctcac 6 80
3 SS í, CC C C ci C ugtccceace i.CCCCci.íiC *c c etggggggat ogteagtett cctcttcccc 560
ccaaaac*.c.ca aggacaccet catgstetoe CCCíi CCC’CCC aggtcacatg cgaggtggiy 500
gaogfcgagcc a o g aag accc tgaggtcaag ttcsaetggt acgtggaegg cgtggaggtg 650
oataatgoca c; C S <833 3 C C C gugguuggag oagtacaaoa QC&CCC :<3 C Cíí tgtggtcagc 20
gtcctcaocg tcctgc-acca ggaotggctg astggcaagg agtacsa gtg ί83.3ϊ)ί·ί5\) Í8:)-C.C 80
aa-caaagccc CC '.· sh c ee ec catc-gagaaa acosLetuce aagccsaagg íjC3 '8 CCC CC ;:i 84 0
gaaec&cagg tgtacsceet g c c c c c a fc co egggatgage tgaccaagaa ccaggtoagc 000
C i. Q 3.CC LÍJ Cí.) tggtoísa agg cttctatccc agcgacat.cg ccgtggagtg ggagagcaat 960
gggeagccgy agaacaaeta C& 3<j&cc&cg Í--C L.C ÍJ <- MÁG tggactccga eggetccttc 1020
ttcctctaca gcaagcl cac cglggacaag ageaggtgge agcaggggaa cgtottctoa 108 0
tgctocglga tgcatgaggo tctgcacaec caotácsego agaagagcct ó- ó- cet C 0. <. 116 0
eogggtaaat ga 1152
<210> <211> <212> <213> 15 383 PPG Ari l.flcial Seguence
<22G>
<22 Sn E>esorj.p;:.lwr· el: 2rti.íleiül Seguence: CTL&áig sequecce
<400 16
Két. Gly Val Leu Lea Thr Gin Arg TLí: Leu Leu Ser Leu Val Leu Alá
5 10 15
Leu Leu Phe· Pro Ser Met Alá Ser Met Aia Met His Val Alá Gin Pro
25 30
77.SÖS/KE/SAX TÁJ ro
Alá Val Val Leu Alá Ser Ser Arg Gly Ile Alá Ser Phe Val Cys Gin SS 40 45
Tyr Ara Ser Pro Gly Lys Alá Th?r Glu Val Arg Val Thr Val Le?.· Arg SO 55 OG
Gin Alá Asp Ser Gin Var Thr Gin Val Cys Alá Alá Thr Tyr Get Hat OS 70 75 80
Gly Asn Gin Len Thr The Le?.· Asp Lap Ser Ile Cys ri?r Gly Tar Ser 85 ' 00 ' 05
Ser Gly Asn Gin Vsi Asn Len Thr Ile Gin G.ly Len Arg Alá Pfet Asp 100 105 IlQ
Thr Giy Lee Tyr iie Cys Lys Val Gin Lee Met Tyr Pro Pro Ara Tyr 115 ' ' 120 ” 125
Tyr Len Gly Ile Gly Asr Gly The? Gin Ile Tyr Vei Ile Asp Pro Gl?r ISO ~ ' 135 ’ 140
Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gin Gin Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr Hls
L4S ’ ISO ’ 155 100
Thr Ser Pro Pro Ser Pro Alá Pro Gin Lex3 Len Gly G.ly Ser Ser Vei 165 170 175
Phe Len Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Len Met iie Ser A?:g Thr 180 ’ ’ 185 ISO
Pro Gin Vei Thr Cys Val Vei Val Asp Val Ser Hls Gin Asr Pro Gin 105 ' S:00 ' 105
Vei Lys The Asn Trp Tyr Vei Asp Gly Val Gin Vei His Asv Alá nys 210 ' 215 ' ' 220:
Thr Lys Pro Arg Gin Cl?e Gin Tyr Aon Ser Thr Tyr Arg Vei Vei Sex·
225 ' ' 280 235 ' ' 240
Val Len Thr Val Len Ilis Cin Asp Trp Len Asn Giy Lys Gin Tyr Lys 24 5 ' 250 255
Cys Lys Val Ser Asn Lys Álla Len Pro A.la Pro Ile Gin Lys Thr Ile 260 265 270
Se:;: Lys Alá Lys Gly Sin Pro Arg Gin Pro Gin Val. Tyr Thr Len Pro 275 ' ' 280 285
77.Ö02/8E/PAS TÁJ * 4
116
Pro Ser Arg Asp Glu Lee Thr Lys Asn Gin. Val Sex- Leu Thr Cys Leu 290- 295 300
Val Lys Gly Phe Tyr ?ro Ser Asp He Alá Val Gla Trp Gla Ser Asn 301 110 ’ 315 320
Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyx Lys Thr Thx: Pro Pro Val Lea Asp Sex:
325 330 335
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Len Thx· Vei Asp Lys Sex Arc 330 345 350
Tro Gin Gin. Gly Asxs Vei Phe Sex Cys Sex Val Met His Gin Ara Lea 355 360 365
Pis Asn His Tyr Thx· Gin Lys Sex Lan Sex' Leu Sex· Pro Gly Lys 370 375 330 <210a 17 <2x1> 41 <212> ONA <213> Axtixioiai Seguexioe <220 <223> Descxxption of: Art; x íar:isl Seqaexioex QncöStatin M CTLA4 :0>MC'TLA4) forward prxxaex:
<400 17 gaggtgataa agctteacca atgg.gtgt.se égctoaoaea g 41 <210 13 <21.0 42 <212> O <210· Art:i.f lolal Sequence <22 00' <22 0 öeso.x'iptLón of .Ártiílolal Seguenoe: Oncoséafcin M CTLA4 {OÍ4CTLA4} rever.se primer <400> 18 gtggtgtatt ggéctagaéo aatcsgaatx: tgqqcaoqgi: to 42

Claims (7)

1. Egy oldható CTLA4 mutáns molekula alkalmazása szigetsejt átültetés kilökődésének gátlására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula magában foglalja a CTLA4 egy mutált extracelluláris dóménjét, ahol. a CTLA4 mutált extraeellnlárls dóménje rendelkezik
a) egy olyan, aminosav-szekvenciával, amely al helyzetben metioninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 3. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és *124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 3. ábrán látható?
b) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely ti helyzetben metioninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 19, ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és *124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 19. ábrán látható;
c) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely +1 helyzetben metion innal kezdődik és +12.4 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 20, ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 20, ábrán látható;
d) egy olyan aminosav-saskvenciával, amely +1 helyzetben metioninnai kezdődik és +1:24 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 21. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 21. ábrán látható? vagy
e) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely +1 helyzetben
77.S02/SZ/ZAS 'Uő mstíoninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 22. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 22. ébrén látható.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a szigetsejt átültetés diabetea kezelése céljából végzett.
.
3. A 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a diabetes 1. vagy 2. típusú diabetes.
4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a szigetsejt átültetés kapszulázott szigetsejteket foglal magában.
5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol szigetsejt átültetés kilökődésének gátlása magában foglalja as oldható CTLA4 mutáns molekulának a szigetsejt átültetés előtt, alatt vagy után való beadását.
6. Az 1 - 5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az extraceiiuláris dómén egy nem-CTLA4-részhez fuzionált.
7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a nem-CTLA4-rész egy immunglobu1in-rész .
8. A 7. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunglobulin-x'ész egy immunglobulin konstans régié vagy annak része.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunglobulin konstans régié vagy annak, része effektor funkciót csökkentő egy vagy több mutációt foglal magában.
10. A. 8. vagy 9. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunglobulin. konstans régió egy immunglobulin molekula csukló, CH2 vagy CHS régióját foglalja magában.
11. A 8 - 10. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ?7.3í;27s£/.ues TÁJ ahol az immunglobulin konstans régió vagy annak része egy humán vagy majom, immungiofouiin konstans régiót foglal magában.
12. Az előző igénypontok bárrvelyike szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula;
a) a 3. ábrán bemutatott Llö4SA29Tlg, amely a -1 helyzetű Aia-nal vagy a al helyzetű Met-nal. kezdődik, és a + 357 helyzetű Lys-nel végződik (26 helyzetű Ala-nal kezdődő és 383 helyzetű Lys-ne .1 végződő, vagy 27 helyzetű Met-nal kezdődé és 383 helyzetű Lys-nel végződő SEQ I'D NO; 8);
b) a 19. ábrán bemutatott LlOlElg, amely -1 helyzetű Ala-nal vagy +1 helyzetű Met-nel kezdődik, és a -+357 helyzetű Lys-nel végződik (£6 helyzetű Ala-nal kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nel végződd, vagy 27, helyzetű Net-nal kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nei végződő SSQ 1D NO: 8).;
e) a 20. ábrán bemutatott L104Eá29Llg, amely a -.1 helyzetű ála-nal vagy a +1 helyzetű Met-nai kezdődik, és a +357 helyzetű Lys-nel végződik (26 helyzetű Ala-nal kezdődő és a 383 helyzetű Lys-ne1 végződő, vagy 27 helyzetű Met-nai kezdődő és a 383. helyzetű Lys-ne1 végződő SSQ ID NO;10);
d) a 21. ábrán bemutatott L104SA29TXg, amely a -1 helyzetű ála-nal vagy a +1 helyzetű Met-nai kezdődik, és a +357 helyzetű Lys-nel végződik (26 helyzetű Ala-n&i kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nel végződő, vagy 27 helyzetű det-nal kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nel végződd SEQ TO NO:12); vagy
e) a 22. ábrán bemutatott L104Sé29WXg, amely a -1 helyzetű ála-nal vagy a +1 helyzetű Met-nai kezdődik, és a +357 helyzetű Lys-nel végződik (26 helyzetű ála-nal kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nel végződő, vagy 27 helyzetű Met-nal
77 .Sft2/SE/K?,2 TÁJ
120 kezdődő és a 383 helyzetű Lys-nel végződő SEQ ID RCoIi)·.
13. Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekulát az ímmunszuppressziv vegyületek, immunmodulator vegyületek és gynlladásgátló vegyületek által alkotott csoportból választott legalább egy további vegyülettel kombinációban alkalmazzuk,
14. A 13, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vegyület az anakinra, adrenokortikoszteroidok, azatnioprine, ba.siiixlmab, kaicíneurin inhibitorok, chioroquine, kortikoszteroidok, oiklosporin, prednizon, ciklofőszfamid, cytoxan, 1.5-dezoxi-spergualln és analógjai, D-peniciiiamín, efanercept, glatiramer-acetát, ΕΤΪ720 és analógjai, glukokortikoidok, aranysók, 16 anti-humán thymocita globulin (ATGAhE , humanizált antí-TAC (HAT), hidroxi-chioroquine, infliximab, Interferon béta-la, interferon béta-lb, lefiunomid és analógjai, Iimfocifca immunglobulin, iimfocita homing ágensek, methoxsaien, methotrexate, mitox&ntrou hidrokiorld, mikofenolsav, mikofenolát raofefc.il, mizoribine, NSAlD-ok, nyúl anfci-buraán thymocita globul.in, Rho (D) immunglobulin, sirolimus (rapamycin) és származékai [például 40-0-(2-hidroxi-efii)-rapamycin), suiphasalszopyrine, sulfasalzine, tacroiimas (FE-306), thaiidomide, TKFs; blokkolok és gyulladás kei tő citokint célzó biológiai ágensek, TOR inhibitorok, CD4ö-neí és CDI54-gyei interíeráló vegyületek, oldható gp39, oldható CD29, oldható CD40, oldható CD80 (például ATCC 6.862?) , oldható CD86, oldható CD28, oldható CDSE, oldható Thy-1, oldható CD3, oldható TCR, oldható VLA-4, oldható
VCAM-1, oldható DECAM-l, oldható ELAM-1, oldható CD44, gp39~cei reagáló antitestek (például ATCC uB-10916, ATCC HB-1205S és ATCC
H3-12056), CDiö-nei reagáló antitestek (például ATCC HB-9110), 87-tel
121 reagáló antitestek (például ATCC HB--253, ATCC CRL-2223, ATCC CRL-2226, ATCC HB-301, ATCC HSII341), €D28-oal reagáló^ antitestek (például ATCC B3-11944 vagy mAb 9.3), LEA-l-gyei reagáló antitestek, (például ATCC HB-9579 és ATCC Tiö-213), LFA~2~vei reagáló antitestek, It-2-vei reagáló antitestek, IL-12-vei reagáló antitestek, IRb-gammávai reagáló antitestek, CD2-vel reagáló antitestek, CD48~cal reagáló antitestek, bármely ICAM-mal [például TCAM-l-gyel (ATCC CRL-2252), ICAM-2-vel és ICARÍ-3-mai] reagáló antitestek, CTLA4~gyel reagáló antitestek (például ATCC H8-3Ö4) , Tny-I-gyel reagáló antitestek, CD56~tal reagáló antitestek, CD3-mai reagáló antitestek, CDzS-cel reagáló antitestek, TCR-rel reagáló antitestek, VLA-4-gyel. reagáló antitestek, VCAM-I-gyel reagáló antitestek, LECAM-l-oyel reagáló antitestek, ELAM-l-gyei reagáló antitestek, CD44-gyel reagáló antitestek, leukocíta receptorok (például MHC, CD2, CDs, CD4, CDlia/CDI8, CD7, CD25, CD27, 87, CD40, CD45, CDS8, CD137,
ICOS, CDI50 (SLAdj, 0X40, 4-1BB vagy ligandamaik, CTIA4/CD28-lg) monoklonálís antitestjel, LFA-1 antagonisták, selectin antagonisták és V1A-4 antagonisták és antí-humán 1L-2 R monoklonálís antitestek (mAb-k) által alkotott csoportbői kiválasztott.
15. A 13. vagy 14. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula és a további vegyület együtt adandó be, ló, A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az oldható C7LA4 mutáns molekula és a további vegyület együtt vagy egymást követben adandó be.
17. Az 1 - 12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a szigetsejt átültetés kilökődésének gátlása magában foglal
77, 602/BB/BAS í&?
egy további, ir^iuns-zuppres-sziv kezelési rendet is·.
18·. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a további immunsznppressziv kezelési rend giakokortikoid-mentes.
19. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a további immunszuppressziv kezelési rend magában foglal egy kortikoszteroidot.
20. A 17 ~ 19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a további immunszuppressziv kezelési rend kaicineurín-inhibitor-mentes <
21. A 17 - 20. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a további immnnsznppressziv kezelési rend magában foglal egy vagy több 14. igénypont szerinti vegyületet.
22. A 17 - 21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a további immanszappresszlv kezelési rend magában foglal egy TOR inhibitort és/vagy egy I.L-2-t. célzó biológiai ágenst.
23. A .22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a TOR inhibitor rapamiein ísírolismns; vagy annak egy származéka.
24.. A 22. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az IL-2-t célzó biológiai ágens egy IL-2-vei reagáló antitest vagy egy antí-hamán IL-2R monoklonális antitest.
25. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antí-humán
IL--2R monoklonális antitest basiliximab,
26. A 17 - 25. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a további immanszappressziv kezelési rend magában foglal mikotenoisavat vagy mikofenolát mofeti.lt.
27. A 16. igénypont, szerinti alkalmazás, ahol a további immunszuppressziv kezelési rend magában foglal egy olyan vegyü7?,,332./B£/PA2 TÁJ
123 letet, amely CDiO CD154~hez való kötődésével interferál.
23« A 27, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a C040 CD154~hez való kötődésével interferáló vegyűlet egy anti-CD4ö antitest.
29, A 27. igénypont. szerinti alkalmazás, ahol a CD4Ö CDi54~haz való kötődésével interferáló vegyűlet egy antí-CDISi antitest,
30- Az előző igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a szigetsejt átültetés kilökődésének gátlása magában foglalja T-sejt mentesített esontveiösejtek beadását,
31, A 30. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a T-sejt mentesített csontveiősejtek beadása közelítőleg ugyanabban az időben történik, mint a szigetsejt transzplantátum bevitele.
32, A 30. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a T-sejt mentesített csontvelősejtek beadása a szigetsejt transzplantátum bevitele előtt történik,
33, A 30 - 32, igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a T-sejt mentesített csontveiősejtek beadása magában foglal egy első dózist és egy második dózist,
34, Egy oldható CTLA4 mutáns molekula egy szioetaejt átültetés kilökődésének gátlására szolgáló eljárásban való alkalmazásra, ahol az oldható CTLA4 mutáns molekula megában foglalja a CTLA4 egy mutált extracellsláris doménjét, ahol a CTLA4 mutált extraceliuláris dóménje rendelkezik
a) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely +1 helyzetben metioninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 3. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 3. ábrán látható;
7?'.8-Q2/S®/3Á3 TÁJ
b) egy olyan aminosav-szekvenoiával, amely +1 helyzetben metioninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 19. ábrán látható, vagy -1 helyzetben .alaninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 19. ábrán látható;
c) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely +1 helyzetben metioninnal kezdődik és +124 helyzetben, aszparaginsavval végződik, ahogy a 20. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 20. ábrán látható;
d) egy olyan amínosav-szefcvenciávai, amely +1 helyzetben metioninnal kezdődik és +124 helyzetben, aszparaginsavval végződik, ahogy a 21. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 21. ábrán látható; vagy
e) egy olyan aminosav-szekvenciával, amely +1 helyzetben metioninnal kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a .22. ábrán látható, vagy -1 helyzetben alaninnai kezdődik és +124 helyzetben aszparaginsavval végződik, ahogy a 22. ábrán látható.
HU0401590A 2001-05-23 2002-05-23 Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával HU229680B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29340201P 2001-05-23 2001-05-23
PCT/US2002/016708 WO2002094202A2 (en) 2001-05-23 2002-05-23 Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble ctla4 mutant molecules

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0401590A2 HUP0401590A2 (hu) 2004-11-29
HUP0401590A3 HUP0401590A3 (en) 2012-09-28
HU229680B1 true HU229680B1 (hu) 2014-04-28

Family

ID=23128937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0401590A HU229680B1 (hu) 2001-05-23 2002-05-23 Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával

Country Status (17)

Country Link
US (2) US7304033B2 (hu)
EP (1) EP1397153B1 (hu)
JP (1) JP4837880B2 (hu)
AT (1) ATE390931T1 (hu)
AU (1) AU2002305716B2 (hu)
CA (1) CA2447921C (hu)
CY (1) CY1108127T1 (hu)
CZ (1) CZ305380B6 (hu)
DE (1) DE60225914T2 (hu)
DK (1) DK1397153T3 (hu)
ES (1) ES2302811T3 (hu)
HU (1) HU229680B1 (hu)
MX (1) MXPA03010568A (hu)
NO (1) NO332465B1 (hu)
PL (1) PL204899B1 (hu)
PT (1) PT1397153E (hu)
WO (1) WO2002094202A2 (hu)

Families Citing this family (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US6887471B1 (en) * 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
EP0892643B2 (en) * 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) * 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
KR20030007899A (ko) * 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
TWI322153B (en) * 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
AU2002243905B2 (en) * 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
PL204899B1 (pl) * 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
ES2354610T5 (es) * 2002-12-23 2020-09-14 Bristol Myers Squibb Co Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína
WO2004058800A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
BRPI0413326A (pt) * 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel
US20070009517A1 (en) * 2003-08-25 2007-01-11 Mark De Boer Method of inducing immune tolerance
MX2007012222A (es) * 2005-04-06 2007-12-06 Bristol Myers Squibb Co Metodo para tratamiento de trastornos inmunes asociados con trasplante de injerto con moleculas mutantes ctla4 solubles.
US20090118162A1 (en) * 2005-06-07 2009-05-07 Regents Of The University Of Colorado Inhibitors of serine protease activity and their use in methods and compositions for treatment of graft rejection and promotion of graft survival
US8715649B2 (en) * 2005-06-07 2014-05-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods of use for alpha-1 antitrypsin having no significant serine protease inhibitor activity
US9457070B2 (en) 2005-06-07 2016-10-04 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses of alpha 1-antitrypsin for early intervention in bone marrow transplantation and treatment of graft versus host disease
AU2006292827B2 (en) * 2005-08-09 2013-02-14 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing CTLA4-IG and uses thereof
WO2007047539A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-26 Medtronic, Inc. Localized delivery to the lymphatic system
AR058568A1 (es) * 2005-12-20 2008-02-13 Bristol Myers Squibb Co Metodos para producir una composicion con moleculas ctla4-ig a partir de un medio de cultivo
PL2253644T3 (pl) * 2005-12-20 2014-04-30 Bristol Myers Squibb Co Kompozycje i sposoby wytwarzania kompozycji
US7510844B2 (en) 2006-01-24 2009-03-31 Bristol-Myers Squibb Company CD86 and CD80 receptor competition assays
US20090029904A1 (en) * 2006-07-21 2009-01-29 Sean Oldham Compositions and methods for treatment of insulin-resistance diseases
WO2008014035A2 (en) * 2006-07-25 2008-01-31 The Regents Of The University Of California Modulation of nkg2d and method for treating or preventing solid organ allograft rejection
CA2658000C (en) * 2006-08-18 2017-02-07 Argos Therapeutics, Inc. Use of cd83 in combination therapies
GB0620934D0 (en) * 2006-10-20 2006-11-29 Cambridge Antibody Tech Protein variants
EP2612868B1 (en) * 2007-11-01 2018-08-15 Astellas Pharma Inc. Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
US20090191608A1 (en) * 2008-01-22 2009-07-30 Baylor Research Institute Pancreatic Islet Cell Preparation and Transplantation
US8986253B2 (en) 2008-01-25 2015-03-24 Tandem Diabetes Care, Inc. Two chamber pumps and related methods
US7915222B2 (en) * 2008-05-05 2011-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Method of preventing the development of rheumatoid arthritis in subjects with undifferentiated arthritis
US8408421B2 (en) 2008-09-16 2013-04-02 Tandem Diabetes Care, Inc. Flow regulating stopcocks and related methods
CA2737461A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Tandem Diabetes Care, Inc. Solute concentration measurement device and related methods
WO2010040105A2 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd86 antagonist multi-target binding proteins
EP2365823B1 (en) * 2008-10-30 2016-11-30 Yeda Research And Development Company Ltd. Anti third party central memory t cells, methods of producing same and use of same in transplantation and disease treatment
CA2937492C (en) 2008-11-11 2019-08-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Inhibition of mammalian target of rapamycin
EP2459251B1 (en) 2009-07-30 2014-03-12 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
EP2464219B1 (en) 2009-08-14 2019-10-23 Revivicor, Inc. Multi-transgenic pigs for diabetes treatment
US9283211B1 (en) 2009-11-11 2016-03-15 Rapamycin Holdings, Llc Oral rapamycin preparation and use for stomatitis
KR20130049775A (ko) 2010-03-12 2013-05-14 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. Ｃｔｌａ４ 단백질 및 이의 용도
US9527912B2 (en) 2010-05-17 2016-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Prevention of immunological rejection of transplanted stem cells by leukocyte costimulatory molecule blockade
CA2810631A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Yeda Research And Development Co. Ltd. An immunosuppressive drug combination for a stable and long term engraftment
CN103282047B (zh) 2010-09-08 2016-08-24 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中枢记忆性t细胞在抗白血病/淋巴瘤治疗中的用途
CN104774871A (zh) 2011-02-14 2015-07-15 雷维维科公司 用于血管化异种移植物及其衍生物的异种移植的遗传修饰的猪
CN103930130B (zh) 2011-09-08 2016-07-06 耶达研究及发展有限公司 抗第三方中央型记忆t细胞、其产生方法以及其在移植和疾病治疗中的应用
US9180242B2 (en) 2012-05-17 2015-11-10 Tandem Diabetes Care, Inc. Methods and devices for multiple fluid transfer
US8735359B2 (en) 2012-05-24 2014-05-27 Orban Biotech Llc Combinations of modalities for the treatment of diabetes
US9555186B2 (en) 2012-06-05 2017-01-31 Tandem Diabetes Care, Inc. Infusion pump system with disposable cartridge having pressure venting and pressure feedback
MX2015000237A (es) * 2012-06-27 2015-08-14 Orban Biotech Llc Proteinas de fusion ctla4 para el tratamiento de la diabetes.
US20140112958A1 (en) 2012-10-24 2014-04-24 Mwm Biomodels Gmbh Pancreatic islets of transgenic LEA29Y animals for treating diabetes
WO2014160328A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Mtor inhibitors for prevention of intestinal polyp growth
US9173998B2 (en) 2013-03-14 2015-11-03 Tandem Diabetes Care, Inc. System and method for detecting occlusions in an infusion pump
SG11201506919XA (en) 2013-03-28 2015-10-29 Bristol Myers Squibb Co Methods for identifying patients at risk for costimulation blockade resistant rejection
WO2014182601A1 (en) * 2013-05-08 2014-11-13 Children's Medical Center Corporation A method of preventing and treating type 1 diabetes, allograft rejection and lung fibrosis (by targeting the atp/p2x7r axis)
PT3091991T (pt) * 2013-12-13 2020-02-04 Swedish Stromabio Ab Composições imunomodulatórias
US9700544B2 (en) 2013-12-31 2017-07-11 Neal K Vail Oral rapamycin nanoparticle preparations
ES2900426T3 (es) 2013-12-31 2022-03-16 Rapamycin Holdings Llc Preparaciones orales y uso de nanopartículas de rapamicina
GB2523399B (en) 2014-02-25 2019-03-13 Orban Tihamer A composition comprising ten overlapping peptide fragments of the entire preproinsulin sequence
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9512229B2 (en) 2015-03-03 2016-12-06 Kymab Limited Synergistic combinations of OX40L antibodies for the treatment of GVHD
KR20240046641A (ko) 2015-04-17 2024-04-09 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 조율가능한 친화성을 갖는 면역조절 단백질
CA2991690A1 (en) 2015-07-16 2017-01-19 Yeda Research And Development Co. Ltd. Genetically modified anti-third party central memory t cells and use of same in immunotherapy
WO2017019214A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Musc Foundation For Research Development Donor organ pre-treatment formulation
IT201800000534A1 (it) * 2018-01-03 2019-07-03 Procedimenti per la promozione della crescita cellulare degli isolotti pancreatici.
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN110392736A (zh) 2017-01-18 2019-10-29 耶达研究及发展有限公司 遗传修饰的反抑细胞及其在免疫治疗中的用途
US10751368B2 (en) 2017-01-18 2020-08-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of transplantation and disease treatment
MA50360A (fr) 2017-10-10 2020-08-19 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices de variants de ctla-4 et leurs utilisations
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
CN115089718A (zh) * 2021-11-30 2022-09-23 杭州瑞普晨创科技有限公司 用于异种移植的免疫抑制剂组合和免疫抑制方法

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6685941B1 (en) 1988-11-23 2004-02-03 The Regents Of The University Of Michigan Methods of treating autoimmune disease via CTLA-4Ig
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
CA2003455C (en) 1988-11-23 2000-02-22 Craig B. Thompson Immunotherapy involving cd28 stimulation
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5580756A (en) 1990-03-26 1996-12-03 Bristol-Myers Squibb Co. B7Ig fusion protein
US7070776B1 (en) 1990-03-26 2006-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods for blocking binding of CD28 receptor to B7
US5851795A (en) 1991-06-27 1998-12-22 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 molecules and uses thereof
US5770197A (en) 1991-06-27 1998-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Methods for regulating the immune response using B7 binding molecules and IL4-binding molecules
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
DE122007000078I2 (de) 1991-06-27 2011-01-13 Bristol Myers Squibb Co CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
US5958403A (en) * 1992-02-28 1999-09-28 Beth Israel Hospital Association Methods and compounds for prevention of graft rejection
JPH07508711A (ja) 1992-04-07 1995-09-28 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン Ｃｄ２８経路免疫調節
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
US5773253A (en) 1993-01-22 1998-06-30 Bristol-Myers Squibb Company MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof
ATE293686T1 (de) 1993-06-04 2005-05-15 Us Navy Verfahren zur selektiven stimulierung der t- zellproliferation.
AU7107794A (en) 1993-06-10 1995-01-03 Regents Of The University Of Michigan, The Cd28 pathway immunosuppression
WO1995006481A1 (en) 1993-09-02 1995-03-09 Trustees Of Dartmouth College Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance
US5683693A (en) 1994-04-25 1997-11-04 Trustees Of Dartmouth College Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
US6719972B1 (en) 1994-06-03 2004-04-13 Repligen Corporation Methods of inhibiting T cell proliferation or IL-2 accumulation with CTLA4- specific antibodies
AU2701895A (en) 1994-06-07 1996-01-05 Regents Of The University Of Minnesota Methods for inhibiting antigen specific t cell responses
WO1996014865A1 (en) 1994-11-10 1996-05-23 Repligen Corporation Methods for inhibiting graft versus host disease in bone marrow transplantation
US5876950A (en) 1995-01-26 1999-03-02 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy
GB9506844D0 (en) 1995-04-03 1995-05-24 Armitage Ian M Pharmaceutical microencapsulation
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
US7041634B2 (en) * 1995-09-27 2006-05-09 Emory University Method of inhibiting immune system destruction of transplanted viable cells
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0892643B2 (en) 1996-03-20 2009-09-02 Bristol-Myers Squibb Company Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith
KR19980066046A (ko) 1997-01-18 1998-10-15 정용훈 고역가의 CTLA4-Ig 융합단백질
ZA98533B (en) * 1997-01-31 1999-07-22 Bristol Myers Squibb Co Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof.
US20030219863A1 (en) 1997-01-31 2003-11-27 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
CA2291338A1 (en) 1997-06-11 1998-12-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Composition and method to prevent graft rejection and other counter-adaptive t lymphocyte mediated immune responses
JP2002502824A (ja) 1998-02-04 2002-01-29 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレイション 同種移植における補刺激遮断および混合キメラ現象
IL126681A0 (en) 1998-10-21 1999-08-17 Opperbas Holding Bv Treatment of trauma-related conditions
JP2003520828A (ja) 2000-01-27 2003-07-08 ジェネティクス インスティテュート，エルエルシー Ｃｔｌａ４（ｃｄ１５２）に対する抗体、これを含む結合体、およびその使用
AU2001264936A1 (en) 2000-05-23 2001-12-03 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ctla4 gene
AU2006203199B2 (en) * 2000-05-26 2009-02-12 Bristol-Myers Squibb Company Soluble CTLA4 mutant molecules and uses thereof
US7094874B2 (en) * 2000-05-26 2006-08-22 Bristol-Myers Squibb Co. Soluble CTLA4 mutant molecules
UY26723A1 (es) 2000-05-26 2001-12-28 Bristol Myers Squibb Co Moléculas mutantes de ctla4 solubles y usos de las mismas
KR20030007899A (ko) 2000-06-09 2003-01-23 브리스톨-마이어스스퀴브컴파니 림프구성 신호의 차단 및 ｌｆａ-1 매개 접착의 차단을통한 세포-매개 면역 반응의 조절 방법
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
TWI322153B (en) 2000-07-03 2010-03-21 Bristol Myers Squibb Co Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
AU2002243905B2 (en) 2001-01-26 2007-11-08 Emory University Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
US20030031652A1 (en) 2001-04-16 2003-02-13 Bernhard Hering Systems and methods for inducing mixed chimerism
PL204899B1 (pl) * 2001-05-23 2010-02-26 Bristol Myers Squibb Co Zastosowanie rozpuszczalnej zmutowanej cząsteczki CTLA4
WO2004058800A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Bristol-Myers Squibb Company Mammalian cell culture processes for protein production
ES2354610T5 (es) 2002-12-23 2020-09-14 Bristol Myers Squibb Co Mejora de la calidad del producto en procedimientos de cultivo de células de mamífero para la producción de proteína
BRPI0413326A (pt) 2003-08-04 2006-10-10 Bristol Myers Squibb Co métodos para tratar doença cardiovasculares empregando-se uma molécula ctla4 solúvel

Also Published As

Publication number Publication date
NO20035176L (no) 2004-01-05
JP2004535402A (ja) 2004-11-25
AU2002305716B8 (en) 2002-12-03
DK1397153T3 (da) 2008-05-26
US20080160022A1 (en) 2008-07-03
CA2447921C (en) 2011-08-09
DE60225914D1 (de) 2008-05-15
EP1397153A2 (en) 2004-03-17
MXPA03010568A (es) 2005-03-07
EP1397153A4 (en) 2006-01-04
WO2002094202A3 (en) 2003-06-26
HUP0401590A2 (hu) 2004-11-29
EP1397153B1 (en) 2008-04-02
HUP0401590A3 (en) 2012-09-28
NO332465B1 (no) 2012-09-24
ATE390931T1 (de) 2008-04-15
CZ305380B6 (cs) 2015-08-26
PL364578A1 (en) 2004-12-13
US20030022836A1 (en) 2003-01-30
WO2002094202B1 (en) 2003-07-31
CA2447921A1 (en) 2002-11-28
AU2002305716B2 (en) 2007-10-25
JP4837880B2 (ja) 2011-12-14
NO20035176D0 (no) 2003-11-21
DE60225914T2 (de) 2009-07-23
ES2302811T3 (es) 2008-08-01
CZ20033188A3 (cs) 2005-04-13
PT1397153E (pt) 2008-06-12
US7829534B2 (en) 2010-11-09
CY1108127T1 (el) 2014-02-12
WO2002094202A2 (en) 2002-11-28
PL204899B1 (pl) 2010-02-26
US7304033B2 (en) 2007-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU229680B1 (hu) Eljárások allogén sziget átültetés védelmére oldható CTLA4 mutáns molekulák alkalmazásával
TWI322153B (en) Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule
KR101235484B1 (ko) 가용성 ｃｔｌａ4 돌연변이체 분자를 이용하여 이식편이식과 연관된 면역 장애를 치료하는 방법
JP4328525B2 (ja) 可溶性ｃｔｌａ４突然変異体分子およびその用途
AU2002305716A1 (en) Methods for protecting allogeneic islet transplant using soluble CTLA4 mutant molecules
CA2436139A1 (en) Methods of inducing organ transplant tolerance and correcting hemoglobinopathies
DK1536234T3 (en) SOLUBLE MUTANT CTLA4 MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees