JP7174144B2 - Ｈａ－１特異的ｔ細胞受容体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、マイナー組織適合性抗原１（ＨＡ－１）の１つのアレル形態に特異的に結合する単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに関する。さらに、多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを発現する細胞およびＴＣＲを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬として使用するためのＴＣＲ、特に、がんの処置において使用するためのＴＣＲに関する。

この５０年の間、重篤な再生不良性貧血および白血病などの多数の悪性疾患および非悪性疾患の一連の処置として、骨髄移植（ＢＭＴ）および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を使用することに成功してきた。ＢＭＴまたはＨＳＣＴでは、致死量以下の全身照射または高用量の細胞毒性薬のいずれかによって患者自身の造血細胞系が破壊された後、患者は、健康なドナーから造血細胞（すなわち、造血幹細胞）を受ける。ドナーの幹細胞は、ドナーの骨髄に由来するかまたはドナーの動員された造血幹細胞の幹細胞移植の一部であってもよい。移植された細胞が非自己起源、すなわち、健康で、遺伝的に非同一なドナーに由来するため、この手法は、同種異系と呼ばれる。

同種異系ＢＭＴまたはＨＳＣＴの１つの不成功の態様は、宿主による移植片の拒絶によるものであり、これは宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）としても知られ、致死量以下の照射または細胞毒性医薬の移植前レジメンの間の破壊を逃れた患者の残留免疫細胞が、移植されたドナー細胞を「異物」として特定し、次に、免疫応答を誘発して、移植された骨髄または造血幹細胞の拒絶をもたらすものである。

ＢＭＴ／ＨＳＣＴの不成功の別のさらにより深刻な形態は、いわゆる移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であり、これは、事実上、患者（レシピエント）の体細胞に対する、ドナーから移植された骨髄または造血幹細胞に由来する移植された免疫細胞の反応である。ＧｖＨＤは、主に、すべての有核体細胞および血小板によって発現したＭＨＣ分子における差異に起因する。ＭＨＣは、主要組織適合性複合体分子を表し、これについて、２つの主要なクラスが知られている。細胞質タンパク質のペプチド断片を提示または示すＭＨＣクラスＩ分子は、ＧｖＨＤにおいて主要な役割を果たす。ヒトでは、ＭＨＣは、ＨＬＡ複合体（ヒト白血球抗原複合体）とも称され、第６染色体上に位置する。

ＨＬＡ複合体は、多遺伝子性であり、かつ高度に多形性の遺伝子に基づき、このことは、１つの集団の異なる個体において多くの異なるアレル（同じ遺伝子の別の形態）が存在することを意味する。ヒト細胞はそれぞれ、６つの異なるＭＨＣクラスＩアレル（各親からの１つのＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、および－Ｃアレル）、さらに６から８つのＭＨＣクラスＩＩアレルを発現する。ＢＭＴおよびＨＳＣＴの設定では、ＭＨＣ分子それ自体が抗原として作用することができ、すなわち、これらは、ドナーの免疫細胞によって「異物」として特定され得る。よって、ＧｖＨＤ応答は、主に、ドナーとレシピエントのＨＬＡ／ＭＨＣ分子発現の不適合に基づく。したがって、ＧｖＨＤのリスクを最も低くするために、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの表現型に関して不適合の量が最も少なくなるようにドナーを選択することが最も重要である。

ＭＨＣＩ／ＩＩ遺伝子型に関して、ドナーと患者が可能な限り緊密に適合している場合でさえ、全患者の５０％より多くがＧｖＨＤに依然として罹患する。患者がＧｖＨＤを発症するのを防止する１つの可能な方法は、ドナーのＴ細胞はドナーのレパートリーと異なる患者のＨＬＡ分子を認識することによってＧｖＨＤを誘発するため、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体または成熟Ｔ細胞に対して特異的な他の抗体を使用して、移植片からＴ細胞を除去することである。ＢＭＴとＨＳＣＴは、現在、ＨＬＡ適合設定において行われているが、ＧｖＨＤは依然として多数の患者において生じており、この問題を克服する必要性が生じている。

これは、ＨＬＡ遺伝子とは独立して遺伝する、いわゆるマイナー組織適合性抗原（ＭｉＨＡ）における不適合に起因するようである。近年、多数のＭｉＨＡが特定されており（Frontiers in Immunology, Vol. 7, Article 100, March 2016）、これらは、男性に特異的なＹ染色体（Ｈ－Ｙ抗原）または他の染色体（常染色体ＭｉＨＡ）によってコードされている場合がある。常染色体ＭｉＨＡのうち、ＨＡ－１、２、３、４および５と称される抗原は、発見された最初の抗原であり、これらのすべては、ＨＬＡ－Ａ１（ＨＡ－３）の文脈またはＨＬＡ－Ａ２（ＨＡ－１、２、４および５）の文脈のいずれかで提示される。ＨＡ－１のＭｉＨＡを規定するＳＮＰバリアント（一塩基多型）は、ＨＬＡ－Ａ２を発現する患者の６９％で発現され、一方、ＨＡ－２は集団の９５％、ＨＡ－４は１６％およびＨＡ－５は約７％において検出され得ることも知られている。対照的に、ＨＬＡ－Ａ１の文脈で提示されるＨＡ－３は、ＨＬＡ－Ａ１を発現する患者の８８％に見られる（N Engl J Med. 1996 Feb 1;334(5):281-5）。

ＨＡ－１は、ほとんど、造血細胞と癌細胞においてのみ発現されるため、養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）に対する有望な腫瘍特異的標的となる。以前に、ＨＬＡ－Ａ２で拘束されたＨＡ－１に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔ細胞）を単離または生成することに成功している（Haematologica. 2005 Oct;90(10):1415-21）。ＨＡ－１は、アミノ酸配列ＶＬＨＤＤＬＬＥＡ（配列番号２）を有するノナペプチドの形態のエピトープを含み（Science. 1998 Feb 13;279(5353):1054-7）、ＨＭＨＡ１（ＫＩＡＡ０２２３）遺伝子（ｒｓ番号：ｒｓ１８０１２８４）のアレル（ＳＮＰバリアント）に由来する。ＨＭＨＡ１遺伝子座は２つのアレル、ＨＡ－１ＨおよびＨＡ－１Ｒを含み、これらは２つのヌクレオチドが異なり、単一のアミノ酸置換を生じる。第２のノナペプチドエピトープ、すなわちＶＬＲＤＤＬＬＥＡ（配列番号４；Science 13 Feb 1998: Vol. 279, Issue 5353, pp. 1054-1057）は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってあまり効率的に提示されない。アレル多型およびメンデルの分離パターンにより、個体は、ＨＡ－１^Ｈ／Ｈに関してホモ接合性であるか、ＨＡ－１^Ｈ／Ｒに関してヘテロ接合性であるかまたはＨＡ－１^Ｒ／Ｒに関してホモ接合性であるかのいずれかであり得る。

本発明の１つの目的は、ＭｉＨＡ ＨＡ－１の唯一のアレルバリアントに特異的に結合するＴ細胞受容体の提供であった。

本発明は、ＨＡ－１の１つのみのアレルバージョン、すなわちＨＡ－１^Ｈに対して特異的であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明の具体的実施形態では、ＨＬＡ－Ａ２分子によって提示される、またはＨＬＡ－Ａ２分子の文脈でのＨＡ－１^Ｈに対する結合特異性を有するＴ細胞受容体が開示される。本発明は、医薬として使用するための、または悪性腫瘍の治療において使用するためのＴＣＲにも関する。例えば、ＢＭＴ／ＨＳＣＴ患者が、ＨＡ－１ Ｈアレルについてホモ接合性である（好適なＭＨＣ／ＨＬＡ分子上にペプチドＶＬＨＤＤＬＬＥＡを提示する）、すなわち患者がＨＡ－１^Ｈ／Ｈであるか、またはヘテロ接合性、すなわちＨＡ－１^Ｈ／Ｒであるかのいずれかであり、およびドナーが、Ｒアレルに関してホモ接合性、すなわちＨＡ－１^Ｒ／Ｒであり、かつドナーＴ細胞の一部が単離され、本発明のＴＣＲのうちの１つを形質導入され、よって、ＨＡ－１^Ｈアレルに対する特異性を有するＴＣＲを発現し、および形質導入されたドナーＴ細胞が患者に注入され、およびそれ以外の点では患者とドナーがＨＬＡ同一であるかまたはＨＬＡ適合である設定で、ＴＣＲを使用することができる。ＨＡ－１^Ｈに特異的なＴＣＲを発現する注入された組換えドナーＴ細胞によって、好適なＭＨＣ／ＨＬＡ分子の文脈でＨＡ－１^Ｈを発現する患者のいずれかの残留造血器腫瘍細胞が検出および枯渇（細胞毒性活性によって）される。腫瘍の再燃中に再出現する患者の腫瘍細胞の枯渇を可能にするために、このようなＨＡ－１^Ｈ特異的ドナーＴ細胞を将来の注入のために保存することも予想される。本発明の別の態様は、ＢＭＴ／ＨＳＣＴのために計画された患者のプレコンディショニング処置のための本発明のＴＣＲまたは本発明のＴＣＲを発現する組換えＴ細胞の使用である。本発明のＴＣＲまたはこのようなＨＡ－１^Ｈ特異的ＴＣＲを発現する組換えＴ細胞のこのような使用によって、本発明のＴＣＲの組換え発現により、患者の造血細胞に対してアロ反応性であり、よって、ＨＬＡ－Ａ２に関連してＨＡ－１^Ｈを提示する免疫細胞を撲滅するであろうこのような組換えＴ細胞の注入によって、致死量以下の照射が、置き換えられるかまたはサポートされ得ることになる。Ｔ細胞は、ＢＭＴ／ＨＳＣＴのドナーに由来し得る。

本発明によるＴＣＲは、単離および／または精製され、可溶性であるかまたは膜に結合してもよい。

一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない（phenotypically silent）置換を含んでもよい。さらに、本発明のＴＣＲは標識され得る。有用な標識は当技術分野で公知であり、任意選択で様々な長さのリンカーを介して、通常の方法を使用してＴＣＲまたはＴＣＲバリアントに連結され得る。用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。さらに、またはあるいは、アミノ酸配列は、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変され得る。治療剤は、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択されてもよい。免疫エフェクター分子は、例えば、サイトカインであってもよい。薬物動態改変部分は、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。

ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するかまたは活性化するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。

グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本発明において予想される。

薬物または治療実体、例えば、ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に対して小分子化合物を添加することも考えられる。

ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。

一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖タイプのものであり、ここで、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結されている。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドを指し、機能性部分は、配列番号：配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０および配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。

具体的実施形態では、機能性部分は、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。

具体的実施形態は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。より具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つに、治療剤が付随する。

一部の実施形態は、エフェクター細胞、特に機能性ポリペプチドまたは機能性多価ポリペプチドのような免疫エフェクター細胞上に発現される本発明のＴＣＲを指し、ここで、ＩＦＮ－γ分泌は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示されるアミノ酸配列である配列番号２に結合した際にＴＣＲを発現する前述のエフェクター細胞において誘導される。

ここで、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子による提示は、ペプチド、特にエピトープがＭＨＣ分子の結合溝に結合することを意味する。

エピトープを提示するＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２アレルのうちの１つ、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６アレル、好ましくはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１アレルによってコードされていてもよい。

エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号２のアミノ酸配列に対する結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、１０^－７［Ｍ］のＨＡ－１ペプチドの濃度において、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号４に対する結合と比較した場合、少なくとも３倍高い、例えば１０倍高い、２０倍高い、１００倍高い場合がある。

よって、ＨＡ－１^Ｒバリアントを認識するために、ＨＡ－１^Ｈと比較して、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも５，０００、より好ましくは少なくとも８，０００、最も好ましくは少なくとも１０，００００倍高いペプチド濃度が、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のすべてに対して必要とされる。

具体的実施形態では、例えばＴＣＲトランスジェニックＴ細胞対Ｔ２細胞の比が２：１である場合、エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号２のアミノ酸配列に対する結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、１０^－７［Ｍ］のＨＡ－１ペプチド濃度において、５００ｐｇ／ｍｌより多く、例えば１０００ｐｇ／ｍｌより多く、より好ましくは２０００ｐｇ／ｍｌより多く、最も好ましくは３０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよい。

サイトカインおよびケモカインの放出、例えばＩＦＮ－γ分泌は、Ｔ細胞抗体固定化磁気ビーズを使用して、配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列を発現するようにＫ５６２細胞（Greiner et al. 2006, Blood. 2006 Dec 15;108(13):4109-17）を形質導入し、それぞれ、調査されるＴＣＲを発現するＣＤ８^＋濃縮および／もしくはＣＤ８^＋非濃縮ＰＢＭＣと共にインキュベートするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、またはＶＬＨＤＤＬＬＥＡペプチド（配列番号２）もしくはペプチドＶＬＲＤＤＬＬＥＡ（例えば、配列番号４）のいずれかを外部から負荷したＴ２細胞を使用し、次に、調査されるＴＣＲを発現するＣＤ８^＋濃縮および／もしくはＣＤ８^＋非濃縮ＰＢＭＣと共インキュベートするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、測定することができる。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードするかまたは上記のポリペプチドをコードする核酸を指す。

本発明のさらなる態様は、上記の本出願の核酸を含むプラスミドまたはベクターを指す。好ましくは、ベクターは、発現ベクターまたは細胞、特に真核生物の細胞の形質導入もしくはトランスフェクションに好適なベクターである。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマーレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。細胞は、単離されてもよく、または天然に存在しなくてもよい。

本発明の別の態様は、上記の核酸または上記のプラスミドもしくはベクターを含む細胞を指す。より詳細には、細胞は：
ａ）少なくとも１つの上記の核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含んでもよい。

細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型として、ガンマ－デルタＴ細胞、ＮＫ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞が挙げられる。

別の態様は、ＨＡ－１^Ｈに対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。具体的実施形態では、ＨＡ－１^Ｈ特異性を媒介するＴＣＲの一部は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７のアルファ鎖のＣＤＲ３ならびに／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０および配列番号６０のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を含む医薬組成物を指す。

典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。

本発明の別の態様は、医薬として使用するための、特にＨＬＡ適合骨髄および／または幹細胞移植の設定においてがんの処置、特に血液がんの処置において使用するための、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を指し、ここで、患者は、ＨＬＡ適合ドナーからアロ骨髄および／または幹細胞移植を以前に受けたことがあり、ドナーは、ＨＡ－１^Ｈ陰性（よって、ＨＡ－１^Ｒホモ接合性および／またはＨＬＡ－Ａ２陰性）であり、患者（ホモ接合性のＨＡ－１^Ｈまたはヘテロ接合性のＨＡ－１^Ｈ／ＲかつＨＬＡ－Ａ２陽性）は、血液がん細胞の再発もしくは再燃を患っているかまたは予防措置（患者は、再燃／再発の兆候なしに移植後に処置される）を受けている。血液がん細胞の再発を患っている患者は、移植後に患者またはドナーからＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離し、このような単離されたＣＤ８^＋Ｔ細胞にｅｘ ｖｉｖｏで本発明によるＴＣＲを形質導入することによって処置される。血液がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性多形型リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、中枢神経
系リンパ腫、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、リンパ形質性リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ組織）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性化の可能性が不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害からなる群から選択されてもよい。他の血液がんまたは障害は、骨髄異形成障害を含む。

様々なＨＡ－１^Ｈ反応性ＴＣＲを形質導入したＣＤ８^＋Ｔ細胞のＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体結合を示す図である。ＣＤ８ Ｔ細胞を健康なドナーのＰＢＭＣから単離し、６つの異なるＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲおよびＨＡ－１^Ｈを認識しない１つの対照ＴＣＲを形質導入した。形質導入したＣＤ８ Ｔ細胞を、形質導入に関するマーカーとしてマウス定常ベータ領域を使用するＦＡＣＳによって濃縮した。これらの細胞の増殖後に、これらをＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体ならびにＣＤ８およびマウス定常ベータ領域（ｍＣｂ）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。集団をＣＤ８^＋／ｍＣｂ^＋細胞上でゲート化し、多量体／ＣＤ８の染色を示す。 ＨＡ－１^ＨＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２上に提示されたＨＡ－１^Ｈペプチドを認識することを示すグラフである。ＨＡ－１^Ｈペプチドを外部から負荷したＴ２細胞またはＨＡ－１^ＨエピトープをコードするＨＭＨＡ１遺伝子の一部を形質導入したＫ５６２／ＨＬＡ－Ａ２細胞と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。陰性対照として、対照ペプチドを負荷したＴ２細胞および形質導入されていないＫ５６２／ＨＬＡ－Ａ２細胞をそれぞれ使用した。標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって標的細胞の認識を分析した。 ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の機能性アビディティを示すグラフである。（Ａ）段階的濃度のＨＡ－１^Ｈペプチド（１０^－１１Ｍ～１０^－５Ｍ）またはＨＡ－１^Ｒペプチド（１０^－８Ｍ～１０^－５Ｍ）を外部から負荷したＴ２細胞と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。（Ｂ）ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のＨＡ－１^Ｒペプチドに対する機能性アビディティを国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているように、ＨＡ－１特異的ＴＣＲ（ＴＣＲ２）を形質導入したＴ細胞と比較した。本発明によるＴＣＲ１～６（ＴＣＲ＿１、ＴＣＲ＿２、ＴＣＲ＿３、ＴＣＲ＿４、ＴＣＲ＿５、ＴＣＲ＿６）に関するデータは、図３Ａおよび３Ｂにおけるものと同じである。 未改変標的細胞上で、生理学的レベルのＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を示すグラフである。ＨＡ－１^Ｈ陽性（ＬＣＬ１～５）またはＨＡ－１^Ｈ陰性（ＬＣＬ６～７）のいずれかである様々なリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。（Ａ）標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞を陰性対照として使用した。（Ｂ）蛍光マーカーを安定して形質導入したＬＣＬに対する細胞毒性を２時間ごとに共培養物の写真を撮影することによって、ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 未改変標的細胞上で、生理学的レベルのＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を示すグラフである。ＨＡ－１^Ｈ陽性（ＬＣＬ１～５）またはＨＡ－１^Ｈ陰性（ＬＣＬ６～７）のいずれかである様々なリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。（Ａ）標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞を陰性対照として使用した。（Ｂ）蛍光マーカーを安定して形質導入したＬＣＬに対する細胞毒性を２時間ごとに共培養物の写真を撮影することによって、ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。 腫瘍細胞株上に提示されるＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞を様々なＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株と共培養した。（Ａ）標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。（Ｂ）蛍光マーカーを安定して形質導入した腫瘍細胞株に対する細胞毒性を２時間ごとに写真を撮影することによって、ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭを用いて測定した。 腫瘍細胞株上に提示されるＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞を様々なＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株と共培養した。（Ａ）標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。（Ｂ）蛍光マーカーを安定して形質導入した腫瘍細胞株に対する細胞毒性を２時間ごとに写真を撮影することによって、ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭを用いて測定した。 国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているように、ＴＣＲ２と比較した、ＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株を認識および溶解（殺滅）する、ＴＣＲ＿３またはＴＣＲ＿４を発現するＴ細胞の能力を示すグラフである。（Ａ）トランスジェニックＴ細胞を様々なＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株と共培養した。標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。（Ｂ）ＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株に対する細胞毒性をフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞株のうちのＨＡ－１^Ｈ陰性／ＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞とＨＡ－１^Ｈ陽性／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を１：１の比で混合し、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共培養した。４５時間後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陽性）細胞対ＧＦＰ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陰性）細胞の比を計算し、対照ＴＣＲに関して測定した比に対して正規化した。数値が低いほど、Ｔ細胞の細胞毒性によるＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞の溶解を示す。 国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているように、ＴＣＲ２と比較したＴＣＲ＿３とＴＣＲ＿４の認識モチーフの分析を示すグラフである。ＨＡ－１^Ｈペプチド、セリンで連続して置換したそれぞれ個々のアミノ酸残基を有するペプチド、または対照ペプチドを外部から負荷したＴ２細胞と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。 様々なＴＣＲ定常領域の比較を示す。ＴＣＲ＿３を、マウス、最小限にマウス化した、またはヒトのＴＣＲ定常領域のいずれかを用いてクローニングした。（Ａ）トランスジェニックＴ細胞を様々なＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株と共培養した。標準ＥＬＩＳＡを使用して、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。ＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株に対する細胞毒性をフローサイトメトリーによって分析した。腫瘍細胞株のうちのＨＡ－１^Ｈ陰性／ＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞とＨＡ－１^Ｈ陽性／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を１：１の比で混合し、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共培養した。４５時間後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陽性）細胞対ＧＦＰ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陰性）細胞の比を計算し、対照ＴＣＲに関して測定した比に対して正規化した。数値が低いほど、ＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞の溶解を示す。（Ｂ）様々なＨＡ－１^Ｈ陰性（ＯＭＷ、ＢＥＲ）およびＨＡ－１^Ｈ陽性（ＦＨ２２、ＳＬＥ００５、ＳＰＯ－０１０、ＢＭ１６、ＢＳＭ）ＬＣＬ（リンパ芽球様細胞株）と、トランスジェニックＴ細胞を共培養した。標準ＥＬＩＳＡによって共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって、サイトカイン放出を分析した。

本発明の詳細な記載
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。

以下に例示的に記載されるように、本発明は、本明細書において具体的に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で、好適に実践され得る。

本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらにではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。

本記載および特許請求の範囲において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。

本発明の目的のために用語「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。

不定冠詞または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±１０％、好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。

技術的用語は、それらの一般的な意味または当業者にとっての意味で使用される。具体的な意味が特定の用語によって伝えられる場合、用語の定義は以下にその用語が使用される文脈において与えられる。

ＴＣＲバックグラウンド
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。

典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖と１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合し得る。

本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」は、ＴＣＲα鎖可変領域を指す。本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」は、ＴＣＲβ鎖可変領域を指す。

ＴＣＲ遺伝子座および遺伝子は、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ学名命名法（ＩＭＧＴデータベース、www. IMGT.org；Giudicelli, V., et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT(登録商標) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979；T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）を使用して命名される。

標的
本発明の第１の態様は、ＨＡ－１の１つのアレルバリアントに対して特異的な単離されたＴＣＲに関する。このアレルバリアントは、一塩基多型のものである。

特に、ＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列（ＶＬＨＤＤＬＬＥＡ）を特異的に認識する。

典型的には、ＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗原のペプチド断片を認識する。

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系または複合体は、ヒトの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質をコードする遺伝子複合体である。ＨＬＡ－Ａ^＊０２は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座における１つの特定のクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）アレル群である。ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１は、特異的なＨＬＡ－Ａ^＊０２サブアレルである。

よって、特定の実施形態では、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２アレルによってコードされるＭＨＣ分子、好ましくはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされる分子またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６によってコードされる分子、より好ましくはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされる分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列を特異的に認識する。

ＴＣＲは、ＨＡ－１^Ｈに対して高度に特異的であり、他のペプチド、特にアレルバリエーションＨＡ－１^Ｒに対して交差反応性を実質的に示さない。このことは、ＴＣＲがＨＡ－１アレルバリエーションを認識しないことを意味する。言い換えれば、ＴＣＲは、配列番号４のアミノ酸配列を認識しない。交差反応性は、本明細書に記載されているように、ＩＦＮ－γ分泌によって測定することができる。

用語「に対して特異的な」は、本発明の文脈において、ＴＣＲが標的に特異的に結合していることを意味する。

本明細書において使用される用語「アレルバリエーション」および「アレルバージョン」は、同一である。

好ましい実施形態では、ＴＣＲの認識モチーフは、配列番号１２７に示される配列を少なくとも含む。具体的実施形態では、ＴＣＲの認識モチーフは、配列番号１２７に示す配列からなる。ここで、認識モチーフは、セリン置換によって決定することができる。

モチーフの認識によって、例えば、ＩＦＮ－γ分泌アッセイにおいて決定される、ＴＣＲの活性化に影響を及ぼすエピトープのアミノ酸が規定される。特に、結合エピトープにおけるアミノ酸残基の影響は、アミノ酸置換スキャン、例えば、セリンスキャンによって決定することができる。

セリンスキャンでは、セリンによって連続的に置換されるそれぞれ個々のアミノ酸残基を有するエピトープペプチドが使用される。ペプチドによって、例えば、ＩＦＮ－γ分泌によって決定されるＴＣＲ活性化が有意に低下する場合、置換された位置が認識モチーフに属することが示される。有意な低下は、置換されていないペプチド配列、すなわち置換されていないエピトープと比較して、少なくとも３分の１、好ましくは少なくとも５分の１、より好ましくは少なくとも１０分の１にＩＦＮ－γ分泌が低下することであり得る。

ＴＣＲ特異的配列
ＴＣＲのＴＣＲα鎖のＣＤＲ３は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有してもよい。

ＴＣＲのＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０および配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有してもよい。

一部の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関し、
ａ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号７の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、または
ｂ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号１７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、または
ｃ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、または
ｄ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号３７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、または
ｅ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号４７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、または
ｆ） － ＴＣＲα鎖は、配列番号５７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。

より具体的な実施形態は、単離されたＴＣＲに関し、ＴＣＲは、
ａ） － 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｂ） － 配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｃ） － 配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、
ｄ） － 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｅ） － 配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｆ） － 配列番号５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号６０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む。

好ましい実施形態は、ＣＤＲによって、特に上記のＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖のＣＤＲ３によって定義される単離されたＴＣＲに関し、組換えＴＣＲ配列は、マウス化Ｃα領域およびＣβ領域を含有するよう改変される。

一部の実施形態は、単離されたＴＣＲに関し、ＴＣＲは、
ａ）配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｂ）配列番号２１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｃ）配列番号３１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｄ）配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｅ）配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｆ）配列番号６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む。

「少なくとも８０％同一」、特に「少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する」は、本明細書において使用する場合、アミノ酸配列が、示されたアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを含む。

一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、
ａ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｂ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号２１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｃ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｄ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｅ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｆ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む。

例示的な実施形態は、単離されたＴＣＲを指し、ＴＣＲは、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｄ）配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｅ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号５２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｆ）配列番号６１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号６２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む。

以下の表は、本発明の例示的なＴＣＲの概要を示す

実施例を見ると分かるように、本発明によるＴＣＲは、ＨＡ－１^Ｈに対して特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対しては非常に低い交差反応性しか示さない。

複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ^（商標） １０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、改変Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680；Invitrogen Corporation；Vector NTI Advance^TM10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて実施される。

本発明によるＴＣＲは、単離または精製される。「単離される」は、本発明の文脈において、ＴＣＲが、元々天然に存在した状況下で存在しないことを意味する。「精製される」は、本発明の文脈において、例えば、ＴＣＲが、他のタンパク質およびＴＣＲが元々由来する細胞の非タンパク質部分を含まないかまたは実質的に含まないことを意味する。

一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含んでもよい。

「表現型に影響しない置換」は、「保存的アミノ酸置換」とも称される。「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者によって理解されており、好ましくは、正電荷残基（Ｈ、Ｋ、およびＲ）をコードするコドンは、正電荷残基をコードするコドンで置換され、負電荷残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは、負電荷残基をコードするコドンで置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＹ）をコードするコドンは、中性極性残基をコードするコドンで置換され、中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、およびＷ）をコードするコドンは、中性非極性残基をコードするコドンで置換されることを意味する。これらのバリエーションは、自発的に生じてもよく、ランダム突然変異誘発によって導入されてもよく、または定方向突然変異誘発によって導入されてもよい。これらの変化は、これらのポリペプチドの本質的な特性を破壊することなくなされ得る。当業者は、バリアントアミノ酸および／またはそれらをコードする核酸を容易かつ日常的にスクリーニングし、これらのバリエーションがリガンド結合能を実質的に低下させるかまたは破壊するかどうかを当技術分野で公知の方法によって決定することができる。

当業者は、ＴＣＲをコードする核酸も改変され得ることを理解する。核酸配列全体における有益な改変は、配列のコドン最適化を含む。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において行うべきではない。

本発明の一部の実施形態によれば、ＴＣＲのアミノ酸配列は、検出可能な標識、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変される。

検出可能な標識に関する非限定的な例は、放射標識、蛍光標識、核酸プローブ、酵素および造影試薬である。ＴＣＲに付随し得る治療剤としては、放射性化合物、免疫調節薬、酵素または化学療法剤が挙げられる。治療剤は、化合物が標的部位でゆっくり放出され得るように、ＴＣＲに連結したリポソームによって封入され得る。このことによって、体内での輸送中の損傷が避けられ、ＴＣＲの関連する抗原提示細胞への結合後に、治療剤、例えば、毒素が最大の効果を有することが保障される。治療剤の他の例は、

ペプチド細胞毒素、すなわちリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどの、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有するタンパク質またはペプチドである。小分子細胞毒性剤、すなわち７００ダルトン未満の分子量を有する、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有する化合物。このような化合物は、細胞毒性作用を有することが可能な毒性金属を含有し得る。さらに、これらの小分子細胞毒製剤は、プロドラッグ、すなわち細胞毒性剤を放出するために、生理的条件下で、崩壊されるかまたは変換される化合物も含むことが理解されるべきである。このような薬剤としては、例えば、ドセタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリチアマイシン、エトポシド、イフォスファミド、イリノテカン、ポルフィマーナトリウム フォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、ミトキサントロン、オーリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５およびアスタチン２１３が挙げられる。例えば、キレート剤、免疫刺激薬としても知られる免疫賦活剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子によって放射性核種をＴＣＲまたはその誘導体に付随させ得る。例示的な免疫賦活剤は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γなどのサイトカイン、抗Ｔ細胞またはＮＫ細胞決定基抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む抗体またはその断片；抗体様結合特性を有する代替タンパク質足場；スーパー抗原、すなわちポリクローナルＴ細胞活性化および大量のサイトカイン放出をもたらすＴ細胞の非特異的活性化を引き起こす抗原、およびその変異体；ＩＬ－８、血小板因子４、メラノーマ成長刺激タンパク質などのケモカイン、補体活性化因子；異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドである。

ヒトＴリンパ球における抗原受容体分子（Ｔ細胞受容体分子）は、細胞表面でＣＤ３（Ｔ３）分子複合体と非共有結合により会合している。この複合体の抗ＣＤ３モノクローナル抗体による撹乱により、Ｔ細胞活性化が誘導される。よって、一部の実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能性断片またはバリアントと会合した（通常は、アルファまたはベータ鎖のＮまたはＣ末端への融合により）本明細書に記載されているＴＣＲを指す。本明細書に記載の組成物および方法において使用するのに好適な抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む分子）ならびにドメイン抗体（親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメインＤｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含む）またはアフィボディ（操作されたタンパク質Ａ足場アフィボディ（Ｓｗｅｄｅｎ）を含む）もしくはアンチカリン（操作されたアンチカリンＰｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む）などの抗体様結合特性を示す代替タンパク質足場が挙げられる。

治療剤は、好ましくは、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫エフェクター分子はサイトカインである。

薬物動態改変部分は、例えば、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基は、当業者に公知のいくつかの方法によって付随させ得る。好ましい実施形態では、ユニットはＴＣＲに共有結合により連結される。本発明によるＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変されてもよい。特に、ＴＣＲの可溶性形態は、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変される。薬物動態改変部分は、治療薬の薬物動態プロファイルに対する有益な変化、例えば、血漿中半減期の改善、免疫原性の低減または増強、および溶解度の改善を達成し得る。

本発明によるＴＣＲは、可溶性であっても、または膜に結合していてもよい。用語「可溶性」は、例えば、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的化剤として使用するための、可溶性形態である（すなわち、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有さない）ＴＣＲを指す。安定性のために、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、好ましくは、例えば、国際公開第０３／０２０７６３号パンフレットに記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有する。本発明のαβヘテロ二量体に存在する定常ドメインの一方または両方は、Ｃ末端（単数または複数）で、例えば、最大１５、または最大１０もしくは最大８もしくはそれより少ないアミノ酸で切断されてもよい。養子治療において使用するために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされてもよい。ＴＣＲは、それぞれアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインの間に天然に見られるものに対応するジスルフィド結合を含有してもよく、さらにまたはあるいは非天然ジスルフィド結合が存在してもよい。

よって、ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。

他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。１つの例は、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235に記載された誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」である。簡潔には、その二量体化がＡＰ１９０３／ＣＩＰなどの小分子二量体化薬に依存し、改変されたエフェクター細胞においてアポトーシスの急速な誘導をもたらすカスパーゼ９ドメインを発現させるために、エフェクター宿主細胞は周知の方法によって改変される。この系は、例えば、欧州特許第２１７３８６９号明細書に記載されている。他の「自殺」「安全スイッチ」に関する例は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＤ２０の発現とそれに続く抗ＣＤ２０抗体を使用する枯渇、切断されたＥＧＦＲの発現とそれに続く抗ＥＧＦＲ抗体を使用する枯渇（Wang et al, Blood, 2011 Aug 4;118(5):1255-63）またはｍｙｃタグ（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）がある。

グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本明細書において予想される。当技術分野で公知であるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列に依存し（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）および／またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結されている。Ｎ連結は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。結合分子へのＮ連結グリコシル化部位の付加は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１つまたは複数のトリペプチド配列を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって、従来より達成されている。Ｏ連結グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の出発配列への付加またはそれによる置換によって導入され得る。

ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的連結または酵素的連結によるものである。使用される連結方式によって、糖類は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、例えば、ＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝露することによって化学的に、またはエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることによって酵素的に達成され得る。

小分子化合物などの薬物をＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に付加することも考えられる。連結は、共有結合、または静電力によるなど非共有結合的相互作用によって達成され得る。当技術分野で公知の様々なリンカーは、薬物コンジュゲートを形成するために用いることができる。

ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。よって、一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖は、エピトープタグを含むように改変されてもよい。

エピトープタグは、本発明のＴＣＲに組み込むことができるタグの有用な例である。エピトープタグは、特異的抗体の結合を可能にし、したがって、患者の体内の可溶性ＴＣＲもしくは宿主細胞または培養（宿主）細胞の結合および移動の特定および追跡を可能にするアミノ酸の短いストレッチである。エピトープタグと、故にタグ付けされたＴＣＲの検出は、いくつかの異なる技法を使用して達成され得る。

タグは、前記タグに対して特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって、本発明のＴＣＲを有する宿主細胞の刺激および増殖のためにさらに用いることができる。

一般的に、ＴＣＲは、一部の事例では、ＴＣＲの標的抗原との親和性およびオフレートを改変する様々な変異で改変され得る。特に、変異は、親和性を増加させるおよび／またはオフレートを低下させる場合がある。よって、ＴＣＲの少なくとも１つのＣＤＲおよびその可変ドメインフレームワーク領域が変異し得る。

しかし、好ましい実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲ領域は、改変されないかまたは実施例におけるＴＣＲ受容体に関するようにｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟を受けない。このことは、ＣＤＲ領域が天然に存在する配列を有することを意味する。これは有利であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって、ＴＣＲ分子に対する免疫原性がもたらされ得るからである。これより、治療効果および処置を低下または不活性化する抗薬物抗体の産生がもたらされ、ならびに／または有害作用が誘導される場合がある。

変異は、１つまたは複数の置換、欠失または挿入であってもよい。これらの変異は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Example in Sambrook, Molecular Cloning - 4th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素に基づくクローニング、ライゲーションに依存しないクローニング手順によって導入され得る。

交差反応性のリスクを伴う理論的に予測できないＴＣＲ特異性は、内因性ＴＣＲ鎖と外因性ＴＣＲ鎖の間の誤対合に起因して生じ得る。ＴＣＲ配列の誤対合を避けるために、組換えＴＣＲ配列は、いくつかの異なる形質導入されたＴＣＲ鎖の正しい対合を効率的に増強することが示された技術である、マウス化Ｃα領域およびＣβ領域を含有するように改変されてもよい。ＴＣＲのマウス化（すなわち、アルファおよびベータ鎖ヒト定常領域をそれらのマウスのカウンターパートによって交換すること）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面での発現を改善するために通常適用される技法である。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効率的に会合する；および／または優先的に互いに対合し、所望の抗原特異性のＴＣＲを発現するようｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変されているが、それらの「オリジナルの」、すなわち内因性のＴＣＲを依然として保持および発現するヒトＴ細胞上で混合ＴＣＲを形成しにくいと考えられる。

マウス化ＴＣＲの発現の改善を代表する９つのアミノ酸が特定されており（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖定常領域におけるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つまたはすべてをそれらのマウスのカウンターパート残基で置換することが予測される。この技法は、「最低限のマウス化（minimal murinization）」とも称され、細胞表面の発現を増強するという利点をもたらすが、同時に、アミノ酸配列における「外来の」アミノ酸残基の数を低減し、それによって、免疫原性のリスクを低減する。よって、一部の実施形態では、ＴＣＲ配列は、最小限のマウス化ＣαおよびＣβ領域を含有するように改変されてもよい。

一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲを指し、ＴＣＲは、一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結している。

好適な一本鎖ＴＣＲ形態は、可変ＴＣＲα領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した可変ＴＣＲβ領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含む。あるいは、第１のセグメントは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよい。上記一本鎖ＴＣＲは、第１の鎖と第２の鎖の間にジスルフィド結合をさらに含んでもよく、リンカー配列の長さとジスルフィド結合の位置は、第１のセグメントと第２のセグメントの可変ドメイン配列が実質的にネイティブＴＣＲにおけるのと同様に変異によって配向されるようなものである。より具体的には、第１のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、かつジスルフィド結合は、第１の鎖と第２の鎖の間にもたらされてもよい。リンカー配列は、ＴＣＲの機能を損なわない任意の配列であってもよい。

本発明の文脈において、「機能性」ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、例えば、少なくとも実質的な生物学的活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換によって改変されたＴＣＲまたはＴＣＲバリアントを意味することになる。ＴＣＲのαおよび／またはβ鎖の場合には、このことは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に前記ＴＣＲの特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合、および／または特異的ペプチド：ＭＨＣ相互作用の際の機能的シグナル伝達を発揮するＴ細胞受容体（改変されていないαおよび／もしくはβ鎖を有するかまたは別の発明の融合タンパク質αおよび／またはβ鎖を有する）を形成することが可能なままであることを意味することになる。

具体的実施形態では、ＴＣＲは、機能性ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるよう改変されてもよく、ここで、前記エピトープタグは、６から１５アミノ酸、好ましくは９から１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ＴＣＲは、機能性ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるように改変されてもよく、ここで、前記ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、いずれも離れて配置されているかまたはタンデムに直接配置されている２つ以上のエピトープタグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物学的活性（単数または複数）（「機能性」）を維持する限り、２、３、４、５またはさらに多くのエピトープタグを含有し得る。

好ましいのは、本発明による機能性ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質であり、ここで、前記エピトープタグは、以下に限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または他の従来のタグ、例えば、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｔ７－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）－タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、もしくはＧＦＰ－タグから選択され、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは、高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および同第４，８５１，３４１号明細書を参照されたい）。高品質の試薬をその検出に使用することが可能であるため、ｍｙｃタグが好ましくは使用され得る。エピトープタグは、当然のことながら、抗体による認識の他に、１つまたは複数の追加の機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者に周知である。

ＴＣＲ断片およびバリアント
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドを指す。機能性部分は、配列番号：配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７ 配列番号５７、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０ 配列番号５０および配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含んでもよい。

具体的実施形態では、ポリペプチドは、例えば、可溶性形態のＴＣＲ単独の機能性部分であってもよい。あるいは、ポリペプチドは、他のドメインと組み合わされてもよい。

機能性部分は、ＴＣＲの抗原への、特に抗原－ＭＨＣ複合体への結合を媒介し得る。

一実施形態では、機能性部分は、本明細書に記載されているＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。

ＴＣＲバリアント分子、すなわちＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドを他のドメインと組み合わせる分子は、ＴＣＲ受容体の結合特性を有してもよいが、エフェクター細胞（Ｔ細胞以外）のシグナル伝達ドメイン、特にＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わされてもよい。したがって、一部の実施形態は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わせた、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むタンパク質を指す。

「結合」は、標的と特異的かつ非共有結合により会合、一体化または結合する能力を指す。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。この態様の一実施形態では、少なくとも２つのＴＣＲ分子が、リンカー部分を介して連結し、多価複合体を形成する。好ましくは、複合体は水溶性であるため、リンカー部分はそれに従って選択されるべきである。リンカー部分は、形成された複合体の構造的多様性が最小限になるように、ＴＣＲ分子上の規定の位置に結合可能であることが好ましい。本態様の一実施形態は、本発明のＴＣＲ複合体によって提供され、ここで、ポリマー鎖またはペプチドリンカー配列は、ＴＣＲの可変領域配列内に位置していない各ＴＣＲのアミノ酸残基間に伸びている。本発明の複合体は、医学において使用するためのものであってもよく、リンカー部分は、それらの医薬適合性、例えば、それらの免疫原性に関して選択されるべきである。上記の望ましい基準を満たすリンカー部分の例は、当技術分野、例えば、抗体断片を連結する技術分野において公知である。

リンカーの例は、親水性ポリマーおよびペプチドリンカーである。親水性ポリマーに関する例は、ポリアルキレングリコールである。このクラスの最も一般的に使用されるものは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧに基づく。しかし、他のものは、他の好適な、必要に応じて置換された、ポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール、およびエチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体に基づく。ペプチドリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカー、またはその上にＴＣＲ分子が結合し得る多量体ドメインを生成するように機能する。

一実施形態は、多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、前記ＴＣＲの少なくとも１つに、治療剤が付随している。

サイトカインおよびケモカインの放出
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、ＩＦＮ－γ分泌は、エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子により提示される配列番号２のアミノ酸配列に対する結合によって誘導される。

エフェクター細胞上で発現される本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列への結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列に結合する場合、１０^－７［Ｍ］のＨＡ－１ペプチド濃度において、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号４への結合と比較して、少なくとも３倍多く、好ましくは少なくとも１０倍多く、より好ましくは少なくとも２０倍多く、さらにより好ましくは少なくとも５０倍多く、最も好ましくは少なくとも１００倍多くてもよい。

エフェクター細胞上で発現される本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列への結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列に結合する場合、１０^－６［Ｍ］のＨＡ－１ペプチド濃度において、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号４への結合と比較して、少なくとも３倍多く、好ましくは少なくとも１０倍多く、より好ましくは少なくとも２０倍多く、さらにより好ましくは少なくとも５０倍多く、最も好ましくは少なくとも１００倍多くてもよい。

エフェクター細胞上で発現される本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列への結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列に結合する場合、１０^－５［Ｍ］のＨＡ－１ペプチド濃度において、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号４への結合と比較して、少なくとも３倍多く、例えば１０倍多く、好ましくは少なくとも１０倍多く、例えば少なくとも２０倍多く、少なくとも５０倍多く、少なくとも１００倍多くてもよい。

よって、ＨＡ－１^Ｒバリアントを認識するために、ＨＡ－１^Ｈと比較して、少なくとも１，０００、好ましくは少なくとも５，０００、より好ましくは少なくとも８，０００、最も好ましくは少なくとも１０，００００倍高いペプチド濃度が、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のすべてに対して必要とされる。

具体的実施形態では、例えば、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞対Ｔ２細胞の比が２：１である場合、エフェクター細胞上で発現される本発明のＴＣＲの、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列への結合によって誘導されるＩＦＮ－γ分泌は、１０^－７［Ｍ］のＨＡ－１ペプチド濃度において、５００ｐｇ／ｍｌより多く、例えば１０００ｐｇ／ｍｌより多く、より好ましくは２０００ｐｇ／ｍｌより多く、最も好ましくは３０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよい。

「エフェクター細胞」は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型は、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞を含む。

本発明は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６によってコードされた分子によって、好ましくはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６によってコードされた分子によって提示される、配列番号２の標的アミノ酸配列またはそのＨＬＡ－Ａ２結合形態、好ましくは配列番号２に結合するＴＣＲまたはその断片を特定するための方法であって、候補ＴＣＲまたはその断片を、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６によってコードされた分子によって、好ましくはＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によってコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列またはそのＨＬＡ－Ａ０２結合形態、好ましくは配列番号２と接触させることと、候補ＴＣＲまたはその断片が標的に結合するかどうかおよび／または免疫応答を媒介するかどうかを決定することとを含む方法にも関する。

候補ＴＣＲまたはその断片が免疫応答を媒介するかどうかは、例えば、サイトカイン分泌、例えば、ＩＦＮ－γ分泌の測定によって決定することができる。上述のように、サイトカイン分泌は、アミノ酸配列である配列番号２をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトされたＫ５６２細胞（または他のＡＰＣ）が調査されるＴＣＲまたはＴＣＲの断片を含む分子を発現するＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣと共にインキュベートされるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定することができる。

核酸、ベクター
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または本明細書に記載されているＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に関する。

以下の表は、各ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を示す：

「核酸分子」は、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖または二本鎖であってもよく、天然源から合成または得られてもよく（例えば、単離および／または精製されてもよく）、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有してもよく、および天然、非天然または改変されたヌクレオチド間の連結、例えば、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結などを含有してもよい。好ましくは、本明細書に記載の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に連結することによって、生細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から得られる分子を指す。本発明の目的として、複製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製であっても、またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であってもよい。核酸は、当技術分野で公知の、または市販の（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒおよび同様の会社からの）手順を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Sambrook et al.を参照されたく、核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるか、またはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な改変ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成され得る。核酸は、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能性部分もしくは機能性バリアントのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。

本開示は、単離または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。このようなバリアントヌクレオチド配列は、ＨＡ－１^Ｈ抗原を特異的に認識する機能性ＴＣＲをコードする。

本開示は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列または本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離または精製された核酸も提供する。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシーな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に濃い量で、標的配列（本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件には、ヌクレオチド配列に適合したほんの僅かな小さな領域（例えば、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、または散在する僅かな不適合を含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。このような相補性の小領域は、１４～１７塩基またはそれより多い塩基の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションにより、それらの区別が容易になる。比較的高ストリンジェンシーな条件としては、例えば、約５０～７０℃の温度で、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたはそれと同等なものによって提供されるような、低塩条件および／または高温条件が挙げられる。このような高ストリンジェンシーな条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間の不適合をほとんど許容せず、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。ホルムアミド添加量を増加させることによって、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に認識されている。

本明細書の他の箇所で既に記載されているように、ＴＣＲをコードする核酸は改変されてもよい。核酸配列全体における有用な改変は、コドン最適化であり得る。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において起こらない。別の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸を含むベクターを指す。

ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターである。

「ベクター」は、核酸配列を、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に運ぶための能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、および好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して操作された核酸である。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、および／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターであってもよい。ベクターは、複製開始点として、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者にとって公知の他の遺伝要素も含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結した本発明による核酸を含む発現ベクターである。

好ましくは、ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルス、より具体的には、ガンマ－レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。

細胞、細胞株
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。

一部の実施形態では、細胞は、単離されるかまたは天然に存在しない。

具体的実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または前記核酸を含むベクターを含んでもよい。

細胞中では、上記ＴＣＲをコードする核酸配列を含む上記ベクターが導入されてもよく、または前記ＴＣＲをコードするｉｖｔＲＮＡが導入されてもよい。細胞は、Ｔ細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えば、Engels et al.（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。一次ヒトＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入は、例えば、Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。

用語「トランスフェクション」と「形質導入」は交換可能であり、外因性核酸配列が、宿主細胞、例えば、真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、上述の方法に限定されないが、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクションおよびレトロウイルスまたは形質導入またはトランスフェクションに好適な他のウイルスによる上述の感染を含む任意の数の手段よって達成され得る。

一部の実施形態は、
ａ）本明細書に記載されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む細胞を指す。

一部の実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であってもよい。好ましくは、細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。

一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。

幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、自己再生能および長期間存続する能力によって特徴付けられる、分化の程度の低いＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団である。ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの細胞がそれらの抗原に遭遇すると、これらは、一部の静止したままのＴＳＣＭと共に、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）へとさらに分化する（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残っているＴＳＣＭ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで耐性免疫記憶を構築する能力を示し、したがって、養子Ｔ細胞療法に関する重要なＴ細胞亜集団であると考えられる（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。幹細胞メモリーＴ細胞亜集団にＴ細胞プールを限定するために、免疫磁気選択を使用することができる。（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44）を参照されたい。

ＴＣＲを標的とする抗体
本発明の別の態様は、ＨＡ－１^Ｈに対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。一実施形態では、ＨＡ－１^Ｈに対する特異性を媒介するＴＣＲの一部は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７および配列番号５７のアルファ鎖のＣＤＲ３ならびに／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０ 配列番号５０および配列番号６０のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。

抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲの活性をモジュレートし得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲのＨＡ－１^Ｈとの結合をブロックする場合もあり、ブロックしない場合もある。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲの治療活性をモジュレートするため、または診断目的で使用され得る。

医薬組成物、医学的処置およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを含む医薬組成物、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。

本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、許容される担体または担体材料と混合した用量で、このような医薬組成物によって、疾患が処置されるかまたは少なくとも緩和され得るように使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）、当技術分野の公知の状態である充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および他の材料を含み得る。

用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生体活性の有効性を妨げない、非毒性材料を定義する。担体の選択は、適用に依存する。

医薬組成物は、活性成分の活性を増強するかまたは処置を補う追加の成分を含有してもよい。このような追加の成分および／または因子は、相乗効果を達成するかまたは有害もしくは望ましくない作用を最小限にするための、医薬組成物の一部であり得る。

本発明の活性成分の製剤化または調製および適用／薬物治療のための技法は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに公開されている。適当な適用は、非経口適用、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射および髄腔内、直接脳室内、静脈内、節内、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射は、患者にとって好ましい処置である。

好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、注入または注射である。

注射用組成物は、少なくとも１つの有効成分、例えば、ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞集団（例えば、処置される患者に対して自己であるかまたは同種間である）を含む薬学的に許容される流体組成物である。有効成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解されるかまたは懸濁され、さらに、組成物は、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の１つまたは複数の非毒性補助剤を含んでもよい。本開示の融合タンパク質と共に使用するのに有用な、このような注射用組成物は従来的なものであり、適当な製剤は、当業者に周知である。

典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。

したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または医薬として使用するための本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。

一部の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、がんの処置において使用するための前記ＴＣＲを含む細胞を指す。

一実施形態では、がんは、血液がんである。

血液がんは、固形腫瘍を形成せず、したがって、体内に主に分散される血液のがんとも言われる。

血液がんは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性多形型リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、中枢神経系リンパ腫、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、リンパ形質性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ組織）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性化の可能性が不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害からなる群から選択されてもよい。他の血液がんまたは障害は、骨髄異形成障害を含む。

（ｉ）本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、（ｉｉ）組換えＴＣＲをコードする核酸を含むウイルス粒子、（ｉｉｉ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲを発現するよう改変された、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞、（ｉｖ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲをコードする核酸のうちの１つまたは複数を含有する医薬組成物およびキットも本明細書において企図されている。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクター粒子（または組換えＴＣＲを発現するよう、本明細書に記載のベクター粒子を使用して改変されたＴ細胞）を含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書にさらに記載されている本開示の方法において、対象に投与することができる。

本明細書に記載されている改変Ｔ細胞を含む組成物は、公知の技法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において、または本開示に基づいて、当業者に明らかとなるそのバリエーションにおいて利用することができる。

一部の実施形態では、細胞は、最初に、それらを培養培地から回収し、次いで、細胞を洗浄し、培地および投与に好適な容器系（「薬学的に許容される」担体）において、治療有効量で濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であってもよいが、水中５％のデキストロースまたは乳酸リンゲル液も利用することができる。注入培地にヒト血清アルブミンを補充してもよい。

組成物中の有効治療のための細胞数は、典型的には、１０より多い細胞、かつ最大１０^６、１０^８または１０^９以下の細胞であり、１０^１０より多い細胞でもよい。細胞数は、組成物が、その中に含まれる細胞の種類に応じて意図される最終的用途に応じて変わることになる。例えば、特定の抗原に対して特異的である細胞が望ましい場合、次いで、集団は、７０％を超え、一般的には８０％、８５％および９０～９５％を超えるこのような細胞を含有することになる。本発明において提供される用途では、細胞は、一般的には１リットル以下の体積中にあり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１ｍｌ当たり１０^６を超える細胞であり、一般的には１ｍｌ当たり１０^７を超え、一般的には１ｍｌ当たり１０^８を超える。臨床的に関連する数の免疫細胞は、１０^９、１０^１０または１０^１１の細胞に累積的に等しいかまたはそれを超える複数の注入物中に配分され得る。本発明において提供される医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉体、水性、または凍結乾燥形態であってもよい。好適な医薬担体の例は、当技術分野において公知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。安定化剤、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、組成物を体内での分解から保護することができる。注射による投与が意図される組成物中には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含まれてもよい。

本明細書に記載されている組換えＴＣＲ、または本発明において提供される組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングされてもよい。キットは、任意選択で、１つまたは複数の成分、例えば、使用説明書、デバイス、および追加の試薬、ならびに本方法を実践するためのコンポーネント、例えば、チューブ、容器およびシリンジを含んでもよい。例示的なキットは、組換えＴＣＲをコードする核酸、組換えＴＣＲポリペプチド、または本発明において提供されるウイルスを含んでもよく、任意選択で、使用説明書、対象においてウイルスを検出するためのデバイス、組成物を対象に投与するためのデバイス、および組成物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。

目的の遺伝子（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本明細書において企図されている。目的の配列（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするウイルスベクターおよび任意選択で免疫チェックポイント阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において企図されている。

本明細書において企図されるキットは、本明細書に開示されたＴＣＲのうちのいずれか１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を実行するためのキットも含む。特に、このような診断キットは、適当な増幅プライマーおよび検出プライマーならびに本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを検出するために、ディープシーケンシングを実施するための他の関連試薬のセットを含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明におけるキットは、抗体または他の結合分子などの、本明細書に開示されたＴＣＲを検出するための試薬を含んでもよい。診断キットは、本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの存在を決定するため、または本明細書に開示されたＴＣＲの存在を決定するための説明書も含有し得る。キットは、説明書を含有してもよい。説明書は、典型的には、キットに含まれる成分、対象の適切な状態を決定するための方法を含む投与のための方法、適切な投薬量、および適切な投与方法を説明する有形の表現を含む。説明書は、処置時間の持続期間にわたって対象をモニタリングするためのガイダンスも含み得る。

本発明において提供されるキットは、本明細書に記載の組成物を対象に投与するためのデバイスも含み得る。医薬またはワクチンを投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかが、本発明において提供されるキットに含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに対応するものであり、例えば、高圧注射用デバイスなどの無針注射用デバイスは、高圧注射によって損傷を受けなかったウイルスと共に、キット中に含まれてもよいが、典型的には、高圧注射によって損傷を受けたウイルスと共に、キット中に含まれることはない。

本発明において提供されるキットは、化合物、例えば、Ｔ細胞活性化因子または刺激物質、またはＴＬＲアゴニスト、例えば、対象に対するＴＬＲ４アゴニストを投与するためのデバイスも含んでよい。医薬を対象に投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかは、本発明において提供されるキット中に含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットの、化合物を投与するためのデバイスは、化合物投与の所望の方法に対応するものであろう。

[実施例１]
ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈ多量体に結合する。
ＨＡ－１^Ｈ反応性Ｔ細胞クローンを単離するためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの主な手法を使用した。主な系は、抗原提示細胞としてＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性ドナーの成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を、および応答細胞として自己のＣＤ８^＋濃縮Ｔ細胞を使用する。ヒトＨＭＨＡ１遺伝子（ＡＲＦＡＥＧＬＥＫＬＫＥＣＶＬＨＤＤＬＬＥＡＲＲＰＲＡＨＥＣＬ；配列番号１２６）の３１個のアミノ酸をコードする、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）が、特定抗原の供給源としての役割を果たす。ｍＤＣへの電気穿孔後に、ＨＭＨＡ１をコードするｉｖｔＲＮＡがタンパク質へと翻訳され、次にプロセシングされ、ｍＤＣ上のＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１分子によってペプチドとして提示される。同じドナーからのｉｖｔＲＮＡがトランスフェクトされたｍＤＣとのＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養によって、対応するＴＣＲの供給源としての役割を果たす抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ誘導がもたらされる。抗原特異的Ｔ細胞は、様々な方法によって濃縮されてもよく、限界希釈またはＦＡＣＳに基づく単一細胞選別によってクローニングされる。ＨＡ－１^Ｈ反応性Ｔ細胞クローンのＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列を次世代シーケンシングによって特定し、ＴＣＲ定常領域をそれらのマウスカウンターパートと交換した後、レトロウイルスベクターｐＥＳ．１２－６中にクローニングする。健康なドナーのＰＢＭＣをフィコール勾配遠心分離によって単離する。ＣＤ８ Ｔ細胞を陰性磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって濃縮し、非組織培養２４ウェルプレート中で、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で刺激する。広宿主性レトロウイルス粒子を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の、レトロウイルスプラスミドをコードするそれぞれのＴＣＲおよび２つの発現プラスミドによるトランスフェクションによって生成する。刺激後２日目に、ＣＤ８ Ｔ細胞に形質導入し、１２日目に、形質導入されたＣＤ８^＋細胞を、形質導入のマーカーとしてマウスの定常ベータ領域を使用するＦＡＣＳによって濃縮し、次いで、急速増殖プロトコールによって増殖させる（Riddell SR, Science, 1992 Jul 10;257(5067):238-41）。

結果：
ＣＤ８ Ｔ細胞をＨＡ－１^Ｈ反応性Ｔ細胞クローンから単離された６つの異なるＴＣＲおよびＨＡ－１^Ｈを認識しない１つの対照ＴＣＲで形質導入した。単離されたＴＣＲのヌクレオチド配列をＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ^（商標）アルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してコドン最適化し、定常領域をマウス化した。コドン最適化およびマウス化したＴＣＲを本明細書に記載のすべてのさらなる実験に使用した。これらをＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体（ｉｍｍｕｎＡｗａｒｅ）およびＣＤ８に対する抗体およびマウス定常ベータ領域で染色した。ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞集団の１つを除いたすべてが、ＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体に非常に効率的に結合した（＞９０％）；ＴＣＲ＿６だけがより低いパーセンテージのＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体陽性細胞を示した（３７％）。対照ＴＣＲに関しては、ＨＡ－１^Ｈ－ＭＨＣ多量体染色は観察されなかった。これらの結果は、ＨＡ－１^Ｈ反応性Ｔ細胞クローンから単離されたＴＣＲが、健康なドナーのＴ細胞においてトランスジーンとして発現され得ることを示す。（図１）

[実施例２]
ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈ陽性標的細胞を認識する
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のＨＡ－１^Ｈ特異性を、以下のプロトコールに従って確認した：

標的細胞として、Ｔ２細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１^ｐｏｓ）に、飽和量（１０^－５ Ｍ）の ＨＡ－１^Ｈペプチド（配列番号２）または対照ペプチドＡｓｔｎ１ Ｐ１２６８Ｌ（ＫＬＹＧＬＤＷＡＥＬ）を負荷する。さらに、Ｋ５６２細胞をＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１およびＨＡ－１^ＨエピトープをコードするＨＭＨＡ１遺伝子の一部で形質導入する。ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１のみで形質導入されたＫ５６２細胞を対照として使用する。２０，０００個のＴ細胞と１０，０００個の標的細胞を使用して、各標的細胞株をＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と、２：１の比で共培養する。２０～２４時間後、共培養上清のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。

結果：
ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈを負荷したＴ２細胞とＨＭＨＡ１を形質導入したＫ５６２細胞を認識したが、対照標的細胞はいずれも認識しなかった。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞だけが、対照ペプチドを負荷したＴ２細胞を認識した。これらの結果は、ＨＡ－１^Ｈ反応性Ｔ細胞クローンから単離したＴＣＲは、健康なドナーのＴ細胞にトランスフェクトされた場合に機能性であることを示す。（図２）

[実施例３]
ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｒ－ペプチドを負荷した標的細胞を認識しない
２つのバリアントＨＡ－１^ＨおよびＨＡ－１^Ｒを認識する際の差を分析するために、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に負荷された２つのバリアントに対するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の機能性アビディティを分析した：

Ｔ２細胞に、異なる濃度でＨＡ－１^Ｈペプチド（１０^－１１Ｍ～１０^－５Ｍ）とＨＡ－１^Ｒペプチド（１０^－８Ｍ～１０^－５Ｍ）を外部から負荷し、２０，０００個のＴ細胞と１０，０００個のＴ２細胞を使用して、２：１の比でＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共培養する。２０～２４時間後、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。

結果：
ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１をコードした分子に負荷したＨＡ－１^Ｈペプチドに対する最も高い機能性アビディティは、ＴＣＲ＿３とＴＣＲ＿４によって示され、最も低い機能性アビディティはＴＣＲ＿２によって示された。ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の一部によるＨＡ－１^Ｒの非常に僅かな認識のみが、非生理学的な高いペプチド濃度（１０^－５Ｍ）で観察され、ＨＡ－１^Ｒバリアントの認識については、ＨＡ－１^Ｈと比較して少なくとも１０，００００倍高いペプチド濃度が、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のすべてについて必要とされた。これらの結果は、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲが、ＨＡ－１^Ｈバリアントに対して非常に特異的であることを示す。さらに、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１をコードした分子に負荷したＨＡ－１^Ｒペプチドに対する機能性アビディティを国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているＴＣＲ（ＴＣＲ２）と比較した。本明細書に記載のＴＣＲとは対照的に、このＴＣＲは、ＨＡ－１^Ｒペプチドを１０^－６Ｍの濃度でも認識し、１０^－５Ｍの濃度では有意により多くのＩＦＮ－γを放出し、本明細書に記載のＴＣＲのすべてが、国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているＴＣＲよりもより特異的であることを示す。（図３Ａおよび３Ｂ）

[実施例４]
ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈ陽性ＬＣＬを認識する
未改変標的細胞における生理学的レベルのＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を分析するために、Ｔ細胞を様々はリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）と共培養し、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のサイトカイン放出および細胞毒性を分析した：

７つのＬＣＬのＤＮＡを単離し（Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＨＡ－１をコードするＨＭＨＡ１遺伝子の一部をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、シーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に送る。シーケンシングの結果に基づき、ＬＣＬをＨＡ－１^Ｈ陽性（ＨＡ－１^Ｈ／ＨおよびＨＡ－１^Ｈ／Ｒ）またはＨＡ－１^Ｈ陰性（ＨＡ－１^Ｒ／Ｒ）群のいずれかに割り当てた。サイトカイン放出を分析するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞とＬＣＬを、２０，０００個のＴ細胞と１０，０００個のＴ２細胞を使用して、２：１の比で共培養する。２０～２４時間後、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。細胞毒性アッセイのために、蛍光マーカー遺伝子を形質導入した１００，０００個のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と２０，０００個のＬＣＬを用いて、エフェクター対標的比が５：１になるように共培養をセットアップする。蛍光標的細胞の減少（全積分強度（ＲＣＵ×μｍ^２／イメージ、ＲＣＵ＝赤色の較正単位）は、肝細胞モニタリング（ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭ）を使用して、２０時間の全期間にわたって２時間ごとに測定する。

結果：
すべてのＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈ陽性ＬＣＬ（ＬＣＬ１～５）と共培養した場合、ＩＦＮ－γを放出したが、ＨＡ－１^Ｈ陰性ＬＣＬ（ＬＣＬ６～７）とは共培養後も放出しなかった。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、いずれのＬＣＬも認識しなかった。さらに、ＨＡ－１^Ｈ陽性ＬＣＬは、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって溶解された。形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞を陰性対照として使用し、これらはＬＣＬを溶解しなかった。これらの結果は、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１をコードした分子に負荷されたＨＡ－１^Ｈを生理学的レベルで認識することができることを示す。（図４Ａおよび４Ｂ）

[実施例５]
ＨＡ－１Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＡ－１Ｈ陽性腫瘍細胞株を認識する
腫瘍細胞株上に提示されたＨＡ－１^Ｈを認識するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を分析するために、Ｔ細胞を様々なＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株と共培養した。

腫瘍細胞株のＤＮＡを単離し（Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ＨＡ－１をコードするＨＭＨＡ１遺伝子の一部をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、次のシーケンシング（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のためにゲルから抽出する。ＨＡ－１^Ｈ陽性（ＨＡ－１^Ｈ／ＨおよびＨＡ－１^Ｈ／Ｒ）腫瘍細胞株を実験のために使用する。サイトカイン放出を分析するために、ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と腫瘍細胞株を２０，０００個のＴ細胞と１０，０００個のＴ２細胞を使用して、２：１の比で共培養する。２０～２４時間後、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。細胞毒性アッセイのために、蛍光マーカー遺伝子を形質導入した１００，０００個のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と２０，０００個の腫瘍細胞を用いて、約５：１のエフェクター対標的比になるように共培養をセットアップする。蛍光標的細胞の減少（全積分強度（ＲＣＵ×μｍ^２／イメージ、ＲＣＵ＝赤色の較正単位）は、肝細胞モニタリング（ＩｎｃｕＣｙｔｅ^{（登録商標）} ＺＯＯＭ）を使用して、２０時間の全期間にわたって２時間ごとに測定する。

結果：
ＴＣＲ＿２以外のすべてのＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、腫瘍細胞株と共培養した場合、ＩＦＮ－γを放出した。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞株を認識しなかった。ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、腫瘍細胞株に対する細胞毒性活性も示す。サイトカイン放出データと一致して、ＴＣＲ＿２は、標的細胞をあまり効率的に溶解しなかった。形質導入されていないＣＤ８ Ｔ細胞を陰性対照として使用した。（図５Ａおよび５Ｂ）

[実施例６]
ＴＣＲ＿３およびＴＣＲ＿４を発現するＴ細胞は、以前に記載したＴＣＲと同等レベルでＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株を認識する
国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載のＴＣＲ２を発現するＴ細胞に対して、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によるＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株の認識を比較するために、２０，０００個のＴ細胞と１０，０００個の腫瘍細胞を共培養する。２０時間後、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。細胞毒性アッセイのために、１０，０００個のＨＡ－１^Ｈ陰性／ＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞およびｍＣｈｅｒｒｙ発現腫瘍細胞株の１０，０００個の細胞を２０，０００個のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共培養する。４５時間後、フローサイトメトリーによって試料を分析し、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陽性）細胞のＧＦＰ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陰性）細胞に対する比を計算し、対照ＴＣＲについて測定した比に対して正規化する。

結果：
ＴＣＲ＿３およびＴＣＲ＿４を発現するＴ細胞は、ＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株との共培養後に、国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載のＴＣＲ２を発現するＴ細胞と同様の量のＩＦＮ－γを放出した（図６Ａ）。ＴＣＲ＿３およびＴＣＲ＿４を発現するＴ細胞は、様々な腫瘍細胞株に対して、ＴＣＲ２と同等の細胞毒性活性も示す（図６Ｂ）。

[実施例７]
ＴＣＲ認識モチーフ
ＴＣＲの特異的認識モチーフの分析のために、セリン置換スキャンを実施する。エピトープの元々のアミノ酸のセリンによる単一置換によって、ＴＣＲ媒介性認識に必須であるペプチド内の位置を特定することができる。認識モチーフを定義するために、様々なＨＡ－１ ＴＣＲ（ＴＣＲ＿３、ＴＣＲ＿４および国際公開第２０１８０５８００２号パンフレットに記載されているＴＣＲ２）を発現するエフェクターＴ細胞をＨＡ－１Ｈペプチド（配列番号２）、それぞれセリンで連続的に置換された個々のアミノ酸残基を有するペプチド、または対照ペプチドを負荷したＴ２細胞と共培養する。Ｔ２細胞に、飽和濃度（１０^－５Ｍ）のペプチドを別々に負荷し、洗浄し、１：１のＥ：Ｔでエフェクター細胞と共培養する。共培養の約２０時間後に、上清を回収し、分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡで分析する。対照ＴＣＲを発現するＴ細胞を陰性対照として使用する。

結果：
ＴＣＲ＿３およびＴＣＲ＿４は、より少ないペプチドしか認識されなかったＴＣＲ２（国際公開第２０１８０５８００２号パンフレット）と比較して、セリンのより特異的な認識パターンを示す。

様々なＴＣＲ定常領域の比較
様々なＴＣＲ定常領域の作用を比較するために、ＴＣＲ＿３をマウス定常領域、最小限にマウス化した（Sommermeyer and Uckert, 2010, J. Immunol.）定常領域およびヒト定常領域に関してクローニングする。様々なＴＣＲ定常領域に関するＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によるＨＡ－１^Ｈ陽性腫瘍細胞株またはＬＣＬの認識を２０，０００個のＴ細胞、１０，０００個の腫瘍細胞の共培養によって試験する。２０～２４時間後、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析する。細胞毒性アッセイのために、１０，０００個のＨＡ－１^Ｈ陰性／ＧＦＰ陽性Ｋ５６２細胞およびｍＣｈｅｒｒｙ発現腫瘍細胞株の１０，０００個の細胞を２０，０００個のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞と共培養する。４５時間後、フローサイトメトリーによって試料を分析し、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陽性）細胞のＧＦＰ陽性（ＨＡ－１^Ｈ陰性）細胞に対する比を計算し、対照ＴＣＲについて測定した比に対して正規化する。

結果：
予期された通り、ＨＡ－１^Ｈ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の反応性は、マウス化定常領域の代わりに最小限にマウス化されたＴＣＲ定常領域またはヒトＴＣＲ定常領域を使用する場合、僅かに低下する（図８ＡおよびＢ）。しかし、ヒトＴＣＲ定常領域に関してさえ、Ｔ細胞は、依然としてＩＦＮ－γを特異的に放出し、ＨＡ－１^Ｈ陽性標的細胞との共培養後に細胞毒性作用を示す。

本記載は、以下の実施形態をさらに含む。

実施形態１：マイナー組織適合性抗原１（ＨＡ－１）の１つのアレルバリアントに特異的な、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。

実施形態２．ＨＡ－１のアレルバリアントが、ＨＡ－１^Ｈである、実施形態１に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態３．アミノ酸配列である配列番号２またはその断片を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態４．アミノ酸配列である配列番号４またはその断片を認識しない、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態５．ＴＣＲの認識モチーフが、配列番号１２７に示された配列を少なくとも含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態６．配列番号２のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態７．ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態８．配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７および配列番号５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖を含む、先行する実施形態のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態９．配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０ 配列番号５０および配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１０．
ａ） － 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｂ） － 配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号１８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｃ） － 配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、
ｄ） － 配列番号３５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号３８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｅ） － 配列番号４５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号４８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖、または
ｆ） － 配列番号５５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号５７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号６０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１１．ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、
ａ） － 可変ＴＣＲα領域が、配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｂ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号２１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｃ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｄ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｅ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むか、または
ｆ） － 可変ＴＣＲα領域は、配列番号６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含む
先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１２．
ａ）配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号１２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｂ）配列番号２１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号２２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｃ）配列番号３１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｄ）配列番号４１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｅ）配列番号５１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号５２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｆ）配列番号６１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１３ ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号１２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｂ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｃ）配列番号３１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｄ）配列番号４１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｅ）配列番号５１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号５２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域、または
ｆ）配列番号６１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号６２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１４．ＴＣＲが精製される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１５．そのアミノ酸配列が、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１６．そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態修飾部分を含むよう改変されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１７．治療剤が、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択される、実施形態１６に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１８．免疫エフェクター分子が、サイトカインである、実施形態１７に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１９．可溶性であるかまたは膜に結合している、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２０．薬物動態修飾部分が、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せである、実施形態１６に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２１．一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、リンカー配列によって連結している、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２２．ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖が、エピトープタグを含むように改変されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２３．組換えＴＣＲ配列が、最小限にマウス化されたＣα領域およびＣβ領域を含有するように改変され得る、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２４．実施形態１から２１のいずれかのＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０および配列番号６０のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、単離されたポリペプチド。

実施形態２５．機能性部分が、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む、実施形態２４に記載の単離されたポリペプチド。

実施形態２６．実施形態１から２３のいずれか１つで実現されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。

実施形態２７．前記ＴＣＲの少なくとも１つに治療剤が付随している、多価ＴＣＲ複合体。

実施形態２８．ＩＦＮ－γ分泌が、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される、配列番号２のアミノ酸配列に結合することによって誘導される、実施形態１から２３に記載の単離されたＴＣＲ、実施形態２４および２５に記載のポリペプチドならびに実施形態２５および２６に記載の多価ＴＣＲ複合体。

実施形態２９．実施形態１から２２のいずれか１つに記載のＴＣＲをコードするか、または実施形態２４から２５に記載のポリペプチドをコードする核酸。

実施形態３０．核酸がコドン最適化されている、実施形態２９に記載の核酸。

実施形態３１．実施形態２９または３０の核酸を含むベクター。

実施形態３２．発現ベクターである、実施形態３１に記載のベクター。

実施形態３３．レトロウイルスベクターである、実施形態３１または３２に記載のベクター。

実施形態３４．レンチウイルスベクターである、実施形態３１または３２に記載のベクター。

実施形態３５．実施形態１から２３に記載のＴＣＲを発現する細胞。

実施形態３６．単離されるか、または天然に存在しない、実施形態３４に記載の細胞。

実施形態３７．実施形態２９または３０に記載の核酸を含む細胞または実施形態３１から３５に記載のベクター。

実施形態３８．
ａ）実施形態２９または３０で実現されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、
ｂ）実施形態１から２３のいずれか１つで実現されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および実施形態１から２３のいずれか１つで実現されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、実施形態３５から３７に記載の細胞。

実施形態３９．末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態３５から３８のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４０．Ｔ細胞である、実施形態３５から３８のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４１．ＨＡ－１の１つのアレルバリアントに対する特異性を媒介する、実施形態１から２３に記載のＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。

実施形態４２．ＨＡ－１の１つのアレルバリアントに対する特異性を媒介するＴＣＲの一部が、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７のアルファ鎖のＣＤＲ３、および／または配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０および配列番号６０のベータ鎖のＣＤＲ３を含む、実施形態４０に記載の抗体またはその抗原結合断片。

実施形態４３．ＨＡ－１のアレルバリアントが、ＨＡ－１^Ｈである、実施形態４１または４２に記載の抗体またはその抗原結合断片。

実施形態４４．実施形態１から２２に記載のＴＣＲを含む医薬組成物、実施形態２４から２５に記載のポリペプチド、実施形態２７から２８のいずれか１つに記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２９もしくは３０に記載の核酸、実施形態３１から３４に記載のベクター、実施形態３５から４０のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態４１から４２に記載の抗体。

実施形態４５．少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、実施形態４４に記載の医薬組成物。

実施形態４６．医薬として使用するための、実施形態１から２３に記載のＴＣＲ、実施形態２４から２５に記載のポリペプチド、実施形態２７から２８のいずれか１つに記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２９もしくは３０に記載の核酸、実施形態３１から３４に記載のベクター、実施形態３４から３９のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態４１から４３に記載の抗体。

実施形態４７．がんの処置において使用するための、実施形態１から２３に記載のＴＣＲ、実施形態２４から２５に記載のポリペプチド、実施形態２６から２７のいずれか１つに記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２９もしくは３０に記載の核酸、実施形態３５から４０のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４８．がんが、血液がんである、実施形態４５に記載の、使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸または細胞。

実施形態４９．血液がんが、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、混合表現型急性白血病（ＭＰＡＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、Ｂ細胞性多形型リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、中枢神経系リンパ腫、ＣＤ３７＋樹状細胞リンパ腫、リンパ形質性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ組織）の節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性化の可能性が不明なＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性障害および骨髄異形成障害からなる群から選択される、実施形態４５に記載の、使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸または細胞。

Claims (14)

1. マイナー組織適合性抗原１（ＨＡ－１^Ｈ）のアレルバリアントに特異的な、単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
   配列番号２５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、並びに
   配列番号２８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号３０の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む、前記単離されたＴＣＲ。
2. アミノ酸配列である配列番号２またはその断片を特異的に認識する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
3. アミノ酸配列である配列番号４またはその断片を認識しない、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
4. 前記ＴＣＲの認識モチーフが、配列番号１２７に示される配列を少なくとも含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
5. 配列番号３１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
6. 配列番号３１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
7. 配列番号３３のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３４のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ。
8. 請求項１から７のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、前記機能性部分が、配列番号３１のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、単離されたポリペプチド。
9. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
10. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするかまたは請求項８に記載のポリペプチドをコードする核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
12. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲを発現する細胞。
13. 請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項８に記載のポリペプチド、請求項９に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項１０に記載の核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載の細胞を含む医薬組成物。
14. がんの処置のための、請求項１３に記載の医薬組成物。
    

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