JP7483746B2 - Ｍａｇｅａ１特異的ｔ細胞受容体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、ＭＡＧＥＡ１由来のペプチドに対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに関する。さらに、多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを発現する細胞およびＴＣＲを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬として使用するためのＴＣＲ、特に、がんの処置において使用するためのＴＣＲに関する。

メラノーマ関連抗原１とも呼ばれるＭＡＧＥＡ１は、互いに高い相同性を有するいくつかのタンパク質をコードするＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥＡ抗原は、がん／精巣抗原（ＣＴＡ）のファミリーに属し、分子レベルで同定された最初のヒト腫瘍関連抗原であった（Science 1991. 254: 1643-1647/ republished in J. Immunol. 2007; 178:2617-2621）。ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーは、第Ｘｐ２８染色体に位置する１２個の相同性の高い遺伝子を含む。これらの発現は、非小細胞肺がん、膀胱がん、食道、頭頚部がんおよび肉腫、ならびにメラノーマ、ある特定の種類の乳がんなどの様々な組織学的起源のがんにおいて、また生殖細胞において（Front Med (Lausanne). 2017; 4: 18.）、一貫して検出される。ＭＡＧＥＡ１は、細胞質（cytosolic）／細胞質（cytoplasmic）タンパク質であり、ＭＡＧＥＡ１タンパク質に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩバックグラウンドで、すなわち、ＨＬＡ分子上に提示される。より詳細には、ＭＡＧＥＡ１由来のエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２分子上に提示され、抗原免疫原性であること、およびこれにより、がん免疫療法に関する標的として適合することが示される。免疫療法の技術分野における複数の臨床試験が既に、ＭＡＧＥＡタンパク質を標的として行われている（clinicaltrials.gov）。前記抗原の免疫原性と組み合わせた、多数の患者を有するメラノーマおよび肺がんのような広範囲の腫瘍実体におけるＭＡＧＥＡ１の発現（Lancet Oncol 2003; 4: 104-09）は、Ｔ細胞媒介免疫療法に対する有望な標的として、ＭＡＧＥＡ１を適格とする。養子細胞移入（ＡＣＴ）を使用するがん免疫療法の原理は、患者自身の免疫系を利用する高度に腫瘍特異的ながん処置を可能にする。ＡＣＴは、ＭＡＧＥＡ１のような細胞内タンパク質に由来する既定のエピトープに対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作された、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大された自己の（患者由来の）Ｔ細胞を使用する。よって、腫瘍特異的／拘束性抗原であるＭＡＧＥＡ１のみを標的とし、したがって、がん免疫療法に対する並外れた可能性を有する効率性の高いＴＣＲに対する需要が依然として存在する。よって、ＭＡＧＥＡ１を標的とするこのような特異的ＴＣＲに対する需要が存在する。

本発明の１つの目的は、ＭＡＧＥＡ１に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の提供であった。

具体的な実施形態では、単離されたＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む。

ＴＣＲは、アミノ酸配列である配列番号１またはその断片を特異的に認識する。具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２および／またはＨＬＡ－Ａ２６結合形態、好ましくはＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する。より詳細には、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７およびＨＬＡ－Ａ^＊２６：０１からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識し、より好ましくは、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識し、さらにより好ましくは、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する。

本発明のＴＣＲは、高い腫瘍細胞認識能、高い腫瘍細胞殺滅能および高い機能性アビディティを示すため、特に有用である。さらに、ＴＣＲは、有効な腫瘍退縮に対して有利である、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３の分泌をあまり示さない。

好ましくは、ＴＣＲは、他のＭＡＧＥＡファミリーのメンバーに対する交差反応性を有さない。

本発明の別の目的は、ＭＡＧＥＡ１に対して特異的である機能性ＴＣＲを発現するＴ細胞の提供である。

本発明によるＴＣＲは、単離および／または精製され、可溶性であるかまたは膜に結合してもよい。

一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない（phenotypically silent）置換を含んでもよい。さらに、本発明のＴＣＲは標識され得る。有用な標識は当技術分野で公知であり、任意選択で様々な長さのリンカーを介して、通常の方法を使用してＴＣＲまたはＴＣＲバリアントに連結され得る。用語「標識」または「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。さらに、またはあるいは、アミノ酸配列は、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変され得る。治療剤は、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択されてもよい。免疫エフェクター分子は、例えば、サイトカインであってもよい。薬物動態改変部分は、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。

ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するかもしくは活性化するために、またはトランスジェニックＴＣＲ自体を遮断するかもしくは活性化するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本発明において予想される。

薬物または治療実体、例えば、ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に対して小分子化合物を添加することも考えられる。

ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。

一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖タイプのものであり、ここで、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結されている。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列のうちの１つを含み、好ましくは、機能性部分が、配列番号２、３、４および５、６、７のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。

具体的実施形態では、機能性部分は、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。

具体的実施形態は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。より具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つに、治療剤が付随する。

一部の実施形態は、機能性ポリペプチドまたは機能性多価ポリペプチドとして、エフェクター細胞、特に免疫エフェクター細胞上に発現される本発明のＴＣＲを指し、ここで、ＩＦＮ－γ分泌は、アミノ酸配列である配列番号２のＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合した際にＴＣＲを発現する前述のエフェクター細胞において誘導される。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードするかまたは上記のポリペプチドをコードする核酸を指す。

本発明のさらなる態様は、上記の本出願の核酸を含むプラスミドまたはベクターを指す。好ましくは、ベクターは、発現ベクターまたは細胞、特に真核生物の細胞の形質導入もしくはトランスフェクションに好適なベクターである。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマーレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。細胞は、単離された初代細胞であっても天然に存在しなくてもよい。

本発明の別の態様は、上記の核酸または上記のプラスミドもしくはベクターを含む細胞を指す。より詳細には、細胞は：
ａ）少なくとも１つの上記の核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含んでもよい。

細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型は、改変されたかまたは未改変の、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。

別の態様は、ＭＡＧＥＡ１に対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。具体的な実施形態では、ＭＡＧＥＡ１特異性を媒介するＴＣＲの部分は、配列番号４のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＭＡＧＥＡ１特異性を媒介するＴＣＲの部分は、配列番号２、３、４および５、６、７のアミノ酸配列を含む。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を含む医薬組成物を指す。

典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。

本発明の別の態様は、医薬として使用するための、特にがんの処置において使用するための、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を指す。がんは、血液がんであっても固形腫瘍であってもよい。がんは、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択されてもよい。

異なるドナー（ドナーＡまたはＢ；灰色または黒色の棒）に由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するエフェクターによるＭＡＧＥＡ１_ＫＶＬ（配列番号１）ペプチド（ＫＶＬ）を負荷したＴ２細胞の特異的認識を示すグラフである。完全マウスＣ領域（ｍｕｒＣ）を有するＴＣＲバージョンに関して、ＩＦＮ－γの分泌によって測定されたＴＣＲ媒介性標的認識を左のグラフに示し、最小限にマウス化されたヒトＣ領域（ｍｍＣ）に関しては真中のグラフに示す。ベンチマーク対照ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを形質導入したエフェクターによって媒介される認識を右側に示す。対照として、無関係のＡＳＴＮ－１ペプチド（配列番号２８）を負荷したＴ２細胞を、本発明のＴＣＲまたは対照ＴＣＲ（Ｃｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ）を発現するＴ細胞と共にインキュベートした。 ３つの異なるエフェクター細胞調製物（影付きの白色、淡灰色および暗灰色の棒）において発現されたＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３によるＫＶＬペプチドを負荷したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）の特異的認識の際のＩＦＮ－γ分泌を示すグラフである。負荷されていないＬＣＬを各エフェクター細胞（無地の棒、白色、淡灰色および暗灰色）と共培養した場合には、認識は観察されない。ボックスは、提示および認識を担うＨＬＡアレルを示す。ＨＬＡ－Ａに対してヘテロ接合性のＬＣＬの場合には（アスタリスクによって示される）、他のＨＬＡ－Ａに関するペプチドの認識は除外され得る（データは示さず）。 ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するエフェクター（上のグラフ）またはベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（下のグラフ）によって媒介される異なる起源の様々な腫瘍細胞株の認識を示すグラフである。エフェクター細胞は、３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ；白色、淡灰色または暗灰色の棒）に由来した。ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞（無地の棒）または形質導入されていない対照細胞（影付きの棒）による標的認識は、ＩＦＮ－γ分泌を測定することによって検出した。ＫＶＬペプチドを負荷したかまたは無関係のＡＳＴＮ１ペプチドを負荷したＴ２細胞は、標的対照としての役割を果たし、各グラフの右側に示される（Ｔ２＋ＫＶＬ、Ｔ２＋ＡＳＴＮ１）。 腫瘍細胞株ＵＡＣＣ－６２（Ａ）のＴＣＲ媒介性溶解を示すグラフである。細胞の溶解は、蛍光標識された標的細胞の消失によって測定した。腫瘍細胞は、未改変のまま（黒色）または陽性対照としてＫＶＬペプチドを負荷して（灰色）試験した。標的を、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３（上のグラフ）、ベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（真中のグラフ）を発現するかまたは形質導入されていない（下のグラフ）３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ、黒塗りの丸）に由来するエフェクター細胞と最大１４４時間共培養した。単独で培養した標的細胞を、参照（白抜きの丸）として各グラフに示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いて２時間ごとにイメージを撮り、分析し、１４４時間にわたりウェル当たりの標的細胞数を示す。 ＮＣＩ－Ｈ１７０３（Ｂ）のＴＣＲ媒介性溶解を示すグラフである。細胞の溶解は、蛍光標識された標的細胞の消失によって測定した。腫瘍細胞は、未改変のまま（黒色）または陽性対照としてＫＶＬペプチドを負荷して（灰色）試験した。標的を、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３（上のグラフ）、ベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（真中のグラフ）を発現するかまたは形質導入されていない（下のグラフ）３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ、黒塗りの丸）に由来するエフェクター細胞と最大１４４時間共培養した。単独で培養した標的細胞を、参照（白抜きの丸）として各グラフに示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いて２時間ごとにイメージを撮り、分析し、１４４時間にわたりウェル当たりの標的細胞数を示す。 Ｓａｏｓ－２（Ｃ）のＴＣＲ媒介性溶解を示すグラフである。細胞の溶解は、蛍光標識された標的細胞の消失によって測定した。腫瘍細胞は、未改変のまま（黒色）または陽性対照としてＫＶＬペプチドを負荷して（灰色）試験した。標的を、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３（上のグラフ）、ベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（真中のグラフ）を発現するかまたは形質導入されていない（下のグラフ）３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ、黒塗りの丸）に由来するエフェクター細胞と最大１４４時間共培養した。単独で培養した標的細胞を、参照（白抜きの丸）として各グラフに示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いて２時間ごとにイメージを撮り、分析し、１４４時間にわたりウェル当たりの標的細胞数を示す。 ６４７－Ｖ（Ｄ）のＴＣＲ媒介性溶解を示すグラフである。細胞の溶解は、蛍光標識された標的細胞の消失によって測定した。腫瘍細胞は、未改変のまま（黒色）または陽性対照としてＫＶＬペプチドを負荷して（灰色）試験した。標的を、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３（上のグラフ）、ベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（真中のグラフ）を発現するかまたは形質導入されていない（下のグラフ）３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ、黒塗りの丸）に由来するエフェクター細胞と最大１４４時間共培養した。単独で培養した標的細胞を、参照（白抜きの丸）として各グラフに示す。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍを用いて２時間ごとにイメージを撮り、分析し、１４４時間にわたりウェル当たりの標的細胞数を示す。 ３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ；白色、淡灰色または暗灰色の棒）に由来するベンチマークｃｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを形質導入したか（無地の棒）または形質導入されていない（影付きの棒）エフェクターとの共培養後に、トレオニン置換スキャンのためのペプチドを負荷したＴ２細胞の認識を示すグラフである。ＴＣＲの元のＭＡＧＥＡ１由来のエピトープＫＶＬの認識を左側に示す。ｘ軸に示されるエピトープ配列は、元のＡＡのトレオニンとの交換に関する位置を示す。元のＡＡの交換により排除された認識を黒枠で強調する。標的認識は、Ｔ細胞媒介性ＩＦＮ－γ分泌を測定することによって検出された。 ３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ；白色、淡灰色または暗灰色の棒）に由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したか（無地の棒）または形質導入されていない（影付きの棒）エフェクターとの共培養後に、トレオニン置換スキャンのためのペプチドを負荷したＴ２細胞の認識を示すグラフである。ＴＣＲの元のＭＡＧＥＡ１由来のエピトープＫＶＬの認識を左側に示す。ｘ軸に示されるエピトープ配列は、元のＡＡのトレオニンとの交換に関する位置を示す。元のＡＡの交換により排除された認識を黒枠で強調する。標的認識は、Ｔ細胞媒介性ＩＦＮ－γ分泌を測定することによって検出された。 ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ａ）、Ｋ５６２細胞（Ｂ）およびＬＣＬ細胞（Ｃ）のＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３媒介性認識を示すグラフである。標的細胞の認識は、Ｔ細胞媒介性ＩＦＮ－γ分泌を測定することによって検出された。ｘ軸上に示されるように、細胞株およびＴ２細胞に、対照としてのＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（＋ＫＶＬ）もしくはＡＳＴＮ１由来のＫＶＬペプチド（＋ＡＳＴＮ１）を負荷したか、またはＭＡＧＥＡ１、ＡＳＴＮ１もしくは１３種のＭＡＧＥファミリーのメンバーをコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトした。標的を、２名のドナー（淡灰色または暗灰色）に由来するＴＣＲを形質導入したか（無地の棒）または形質導入されていない（影付きの棒）エフェクター細胞と共培養した。単独で培養した標的細胞（標的のみ）によって媒介されるバックグラウンドを白い棒で与える。破線は、ＩＦＮ－γの標的と無関係のバックグラウンド分泌を示す。 健康な組織に由来するかまたは健康なヒト組織に相当する人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来する未改変（負荷されていない）またはＫＶＬを負荷した標的細胞のＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３媒介性認識を示すグラフである。標的細胞の認識は、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入した３名の異なるドナー（ドナーＡ、ＢまたはＣ；白色、淡灰色または暗灰色の棒）に由来するＴ細胞によるＩＦＮ－γの分泌を測定することによって検出された。標的単独（標的のみ）のバックグラウンドＩＦＮ－γの分泌は、対照として各細胞型について示され、ＴＣＲによって認識される、エピトープＫＶＬを負荷したＴ２細胞（Ｔ２＋ＫＶＬ）の認識およびエフェクター単独（エフェクターのみ）によるバックグラウンドは、グラフの右側に示される。 正常細胞のエフェクター細胞との共培養の位相差顕微鏡で撮影した代表的写真を示す。ＫＶＬを負荷した標的細胞のすべてについて明らかなＴＣＲ媒介性溶解が存在するが（細胞層の完全な破壊）、ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、未改変の正常細胞を溶解しない。 ＭＡＧＥＡ１およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１の二重陽性腫瘍細胞株に応答してＩＦＮ－γを産生するＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞集団の能力を示すグラフである。ＦＨ１、ＦＨ２ ＦＨ３およびＦＨ４は、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲを指し、ＦＨ１：Ｖα＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号７ Ｖβ＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号５；ＦＨ２：Ｖα＝配列番号１１ Ｖβ＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号９、ＦＨ３：Ｖα＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号１５ Ｖβ＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号１３；ＦＨ１：Ｖα＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号１９ Ｖβ＝国際公開第’３３８号パンフレットの配列番号１７。Ｒ３７Ｐ１Ｃ９は、国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＭＡＧＡ１－ＴＣＲを指す。 ＭＡＧＥＡ１およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１二重陽性腫瘍細胞株を溶解するＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞集団の能力を示すグラフである。ＦＨ１、ＦＨ２ ＦＨ３およびＦＨ４は、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲを指す（図１０を参照されたい）。Ｒ３７Ｐ１Ｃ９は、国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＭＡＧＡ１－ＴＣＲを指す。ＵＴＤ：形質導入されていない。 様々なＫＶＬペプチドに特異的なＴＣＲの機能性アビディティを示すグラフである。機能性アビディティは、トランスジェニックＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の間の個々の非共有結合性相互作用の多重親和性（multiple affinity）の蓄積された強度を指す。ＦＨ１、ＦＨ２ ＦＨ３およびＦＨ４は、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲを指す（図１０を参照されたい）。Ｒ３７Ｐ１Ｃ９は、国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＭＡＧＡ１－ＴＣＲを指す。 エピトープ配列における重要なアミノ酸を決定するために、セリン残基を使用して、ＭＡＧＥＡ１_ＫＶＬペプチドにおいて個々のアミノ酸を系統的に置き換えること（セリンスキャン）を示すグラフである。 様々なＴＣＲを形質導入したＴ細胞のＴＨ２特異的サイトカインＩＬ－４の分泌パターンを示すグラフである。ＵＴ：トランスフェクトされていない。Ｔ１３６７は、国際公開第２０１４／１１８２３６号パンフレットに開示されたＴＣＲを示す。標的のみ：腫瘍細胞をＴＣＲなしで培養する。 様々なＴＣＲを形質導入したＴ細胞のＴＨ２特異的サイトカインＩＬ－５の分泌パターンを示すグラフである。ＵＴ：トランスフェクトされていない。Ｔ１３６７は、国際公開第２０１４／１１８２３６号パンフレットに開示されたＴＣＲを示す。標的のみ：腫瘍細胞をＴＣＲなしで培養する。 様々なＴＣＲを形質導入したＴ細胞のＴＨ２特異的サイトカインＩＬ－１３の分泌パターンを示すグラフである。ＵＴ：トランスフェクトされていない。Ｔ１３６７は、国際公開第２０１４／１１８２３６号パンフレットに開示されたＴＣＲを示す。標的のみ：腫瘍細胞をＴＣＲなしで培養する。

本発明の詳細な記載
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。

以下に例示的に記載されるように、本発明は、本明細書において具体的に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で、好適に実践され得る。

本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらにではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。

本記載および特許請求の範囲において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。

本発明の目的のために用語「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。

不定冠詞または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±１０％、好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。

技術的用語は、それらの一般的な意味または当業者にとっての意味で使用される。具体的な意味が特定の用語によって伝えられる場合、用語の定義は以下にその用語が使用される文脈において与えられる。

ＴＣＲバックグラウンド
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。

典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖と１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合し得る。

本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」は、ＴＣＲα鎖可変領域を指す。本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」は、ＴＣＲβ鎖可変領域を指す。

ＴＣＲ遺伝子座および遺伝子は、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ学名命名法（ＩＭＧＴデータベース、www. IMGT.org；Giudicelli, V., et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT(登録商標) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979；T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）を使用して命名される。

標的
本明細書に記載のＴＣＲに対する標的は、ＭＡＧＥＡ１（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４９８８．４）由来のペプチドＫＶＬ（配列番号１）である。

ＴＣＲ特異的配列
一部の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関し、ここで、
－ ＴＣＲα鎖は、配列番号４の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。

具体的な実施形態は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む単離されたＴＣＲを指す。

一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。

好ましい実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含むＴＣＲに関する。

そのトランスジェニック形態において、実施例において使用されるＴ細胞クローンＴ１５．８－４．３－８３を起源とするＴＣＲは、配列番号４の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む。特に、本発明のＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。

実施例を見ると分かるように、本発明によるＴＣＲは、ＭＡＧＥＡ１に対して特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対しては非常に低い交差反応性しか示さない。

他の実施形態は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関する。

具体的な実施形態は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを指す。よって、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１の配列番号１のＭＡＧＥＡ１ペプチドとの複合体に対して特異的である本明細書に記載のＴＣＲは、ＴＲＡＶ１９^＊０１遺伝子によってコードされたＶα鎖およびＴＲＡＶ３０^＊０１遺伝子によってコードされたＶβ遺伝子を含む。

他の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲを指し、ここで、
－ 可変ＴＣＲα領域は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号３に示されるＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるＣＤＲ３領域を含む。

複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標） １０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、改変Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680；Invitrogen Corporation；Vector NTI Advance^TM10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて実施される。

本発明によるＴＣＲは、単離または精製される。「単離される」は、本発明の文脈において、ＴＣＲが、元々天然に存在した状況下で存在しないことを意味する。「精製される」は、本発明の文脈において、例えば、ＴＣＲが、他のタンパク質およびＴＣＲが元々由来する細胞の非タンパク質部分を含まないかまたは実質的に含まないことを意味する。

一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含んでもよい。

「表現型に影響しない置換」は、「保存的アミノ酸置換」とも称される。「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者によって理解されており、好ましくは、正電荷残基（Ｈ、Ｋ、およびＲ）をコードするコドンは、正電荷残基をコードするコドンで置換され、負電荷残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは、負電荷残基をコードするコドンで置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＹ）をコードするコドンは、中性極性残基をコードするコドンで置換され、中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、およびＷ）をコードするコドンは、中性非極性残基をコードするコドンで置換されることを意味する。これらのバリエーションは、自発的に生じてもよく、ランダム突然変異誘発によって導入されてもよく、または定方向突然変異誘発によって導入されてもよい。これらの変化は、これらのポリペプチドの本質的な特性を破壊することなくなされ得る。当業者は、バリアントアミノ酸および／またはそれらをコードする核酸を容易かつ日常的にスクリーニングし、これらのバリエーションがリガンド結合能を実質的に低下させるかまたは破壊するかどうかを当技術分野で公知の方法によって決定することができる。

当業者は、ＴＣＲをコードする核酸も改変され得ることを理解する。核酸配列全体における有益な改変は、配列のコドン最適化を含む。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において行うべきではない。

本発明の一部の実施形態によれば、ＴＣＲのアミノ酸配列は、検出可能な標識、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変される。

検出可能な標識に関する非限定的な例は、放射標識、蛍光標識、核酸プローブ、酵素および造影試薬である。ＴＣＲに付随し得る治療剤としては、放射性化合物、免疫調節薬、酵素または化学療法剤が挙げられる。治療剤は、化合物が標的部位でゆっくり放出され得るように、ＴＣＲに連結したリポソームによって封入され得る。このことによって、体内での輸送中の損傷が避けられ、ＴＣＲの関連する抗原提示細胞への結合後に、治療剤、例えば、毒素が最大の効果を有することが保障される。治療剤の他の例は、

ペプチド細胞毒素、すなわちリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどの、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有するタンパク質またはペプチドである。小分子細胞毒性剤、すなわち７００ダルトン未満の分子量を有する、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有する化合物。このような化合物は、細胞毒性作用を有することが可能な毒性金属を含有し得る。さらに、これらの小分子細胞毒製剤は、プロドラッグ、すなわち細胞毒性剤を放出するために、生理的条件下で、崩壊されるかまたは変換される化合物も含むことが理解されるべきである。このような薬剤としては、例えば、ドセタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリチアマイシン、エトポシド、イフォスファミド、イリノテカン、ポルフィマーナトリウム フォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、ミトキサントロン、オーリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５およびアスタチン２１３が挙げられる。例えば、キレート剤、免疫刺激薬としても知られる免疫賦活剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子によって放射性核種をＴＣＲまたはその誘導体に付随させ得る。例示的な免疫賦活剤は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γなどのサイトカイン、抗Ｔ細胞またはＮＫ細胞決定基抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む抗体またはその断片；抗体様結合特性を有する代替タンパク質足場；スーパー抗原、すなわちポリクローナルＴ細胞活性化および大量のサイトカイン放出をもたらすＴ細胞の非特異的活性化を引き起こす抗原、およびその変異体；ＩＬ－８、血小板因子４、メラノーマ成長刺激タンパク質などのケモカイン、補体活性化因子；異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドである。

ヒトＴリンパ球における抗原受容体分子（Ｔ細胞受容体分子）は、細胞表面でＣＤ３（Ｔ３）分子複合体と非共有結合により会合している。この複合体の抗ＣＤ３モノクローナル抗体による撹乱により、Ｔ細胞活性化が誘導される。よって、一部の実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能性断片またはバリアントと会合した（通常は、アルファまたはベータ鎖のＮまたはＣ末端への融合により）本明細書に記載されているＴＣＲを指す。本明細書に記載の組成物および方法において使用するのに好適な抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む分子）ならびにドメイン抗体（親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメインＤｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含む）またはアフィボディ（操作されたタンパク質Ａ足場アフィボディ（Ｓｗｅｄｅｎ）を含む）もしくはアンチカリン（操作されたアンチカリンＰｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む）などの抗体様結合特性を示す代替タンパク質足場が挙げられる。

治療剤は、好ましくは、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫エフェクター分子はサイトカインである。

薬物動態改変部分は、例えば、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基は、当業者に公知のいくつかの方法によって付随させ得る。好ましい実施形態では、ユニットはＴＣＲに共有結合により連結される。本発明によるＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変されてもよい。特に、ＴＣＲの可溶性形態は、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変される。薬物動態改変部分は、治療薬の薬物動態プロファイルに対する有益な変化、例えば、血漿中半減期の改善、免疫原性の低減または増強、および溶解度の改善を達成し得る。

本発明によるＴＣＲは、可溶性であっても、または膜に結合していてもよい。用語「可溶性」は、例えば、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的化剤として使用するための、可溶性形態である（すなわち、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有さない）ＴＣＲを指す。安定性のために、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、好ましくは、例えば、国際公開第０３／０２０７６３号パンフレットに記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有する。本発明のαβヘテロ二量体に存在する定常ドメインの一方または両方は、Ｃ末端（単数または複数）で、例えば、最大１５、または最大１０もしくは最大８もしくはそれより少ないアミノ酸で切断されてもよい。養子治療において使用するために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされてもよい。ＴＣＲは、それぞれアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインの間に天然に見られるものに対応するジスルフィド結合を含有してもよく、さらにまたはあるいは非天然ジスルフィド結合が存在してもよい。

よって、ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。

他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。１つの例は、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235に記載された誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」である。簡潔には、その二量体化がＡＰ１９０３／ＣＩＰなどの小分子二量体化薬に依存し、改変されたエフェクター細胞においてアポトーシスの急速な誘導をもたらすカスパーゼ９ドメインを発現させるために、エフェクター宿主細胞は周知の方法によって改変される。この系は、例えば、欧州特許第２１７３８６９号明細書に記載されている。他の「自殺」「安全スイッチ」に関する例は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＤ２０の発現とそれに続く抗ＣＤ２０抗体を使用する枯渇、またはｍｙｃタグ（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）がある。

グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本明細書において予想される。当技術分野で公知であるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列に依存し（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）および／またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結されている。Ｎ連結は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。結合分子へのＮ連結グリコシル化部位の付加は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１つまたは複数のトリペプチド配列を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって、従来より達成されている。Ｏ連結グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の出発配列への付加またはそれによる置換によって導入され得る。

ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的連結または酵素的連結によるものである。使用される連結方式によって、糖類は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、例えば、ＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝露することによって化学的に、またはエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることによって酵素的に達成され得る。

小分子化合物などの薬物をＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に付加することも考えられる。連結は、共有結合、または静電力によるなど非共有結合的相互作用によって達成され得る。当技術分野で公知の様々なリンカーは、薬物コンジュゲートを形成するために用いることができる。

ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。よって、一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖は、エピトープタグを含むように改変されてもよい。

エピトープタグは、本発明のＴＣＲに組み込むことができるタグの有用な例である。エピトープタグは、特異的抗体の結合を可能にし、したがって、患者の体内の可溶性ＴＣＲもしくは宿主細胞または培養（宿主）細胞の結合および移動の特定および追跡を可能にするアミノ酸の短いストレッチである。エピトープタグと、故にタグ付けされたＴＣＲの検出は、いくつかの異なる技法を使用して達成され得る。

タグは、前記タグに対して特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって、本発明のＴＣＲを有する宿主細胞の刺激および増殖のためにさらに用いることができる。

一般的に、ＴＣＲは、一部の事例では、ＴＣＲの標的抗原との親和性およびオフレートを改変する様々な変異で改変され得る。特に、変異は、親和性を増加させるおよび／またはオフレートを低下させる場合がある。よって、ＴＣＲの少なくとも１つのＣＤＲおよびその可変ドメインフレームワーク領域が変異し得る。

しかし、好ましい実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲ領域は、改変されないかまたは実施例におけるＴＣＲ受容体に関するようにｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟を受けない。このことは、ＣＤＲ領域が天然に存在する配列を有することを意味する。これは有利であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって、ＴＣＲ分子に対する免疫原性がもたらされ得るからである。これより、治療効果および処置を低下または不活性化する抗薬物抗体の産生がもたらされ、ならびに／または有害作用が誘導される場合がある。

変異は、１つまたは複数の置換、欠失または挿入であってもよい。これらの変異は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Example in Sambrook, Molecular Cloning - 4th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素に基づくクローニング、ライゲーションに依存しないクローニング手順によって導入され得る。

交差反応性のリスクを伴う理論的に予測できないＴＣＲ特異性は、内因性ＴＣＲ鎖と外因性ＴＣＲ鎖の間の誤対合に起因して生じ得る。ＴＣＲ配列の誤対合を避けるために、組換えＴＣＲ配列は、いくつかの異なる形質導入されたＴＣＲ鎖の正しい対合を効率的に増強することが示された技術である、最低限のマウス化Ｃα領域およびＣβ領域を含有するように改変されてもよい。ＴＣＲのマウス化（すなわち、アルファおよびベータ鎖ヒト定常領域をそれらのマウスのカウンターパートによって交換すること）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面での発現を改善するために通常適用される技法である。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効率的に会合する；および／または優先的に互いに対合し、所望の抗原特異性のＴＣＲを発現するようｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変されているが、それらの「オリジナルの」ＴＣＲを依然として保持および発現するヒトＴ細胞上で混合ＴＣＲを形成しにくいと考えられる。

マウス化ＴＣＲの発現の改善を代表する９つのアミノ酸が特定されており（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖定常領域におけるアミノ酸残基のうちの１つまたはすべてをそれらのマウスのカウンターパート残基で置換することが予測される。この技法は、「最低限のマウス化（minimal murinization）」とも称され、細胞表面の発現を増強するという利点をもたらすが、同時に、アミノ酸配列における「外来の」アミノ酸残基の数を低減し、それによって、免疫原性のリスクを低減する。

一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲを指し、ＴＣＲは、一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結している。

好適な一本鎖ＴＣＲ形態は、可変ＴＣＲα領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した可変ＴＣＲβ領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含む。あるいは、第１のセグメントは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよい。上記一本鎖ＴＣＲは、第１の鎖と第２の鎖の間にジスルフィド結合をさらに含んでもよく、リンカー配列の長さとジスルフィド結合の位置は、第１のセグメントと第２のセグメントの可変ドメイン配列が実質的にネイティブＴ細胞受容体におけるのと同様に変異によって配向されるようなものである。より具体的には、第１のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、かつジスルフィド結合は、第１の鎖と第２の鎖の間にもたらされてもよい。リンカー配列は、ＴＣＲの機能を損なわない任意の配列であってもよい。

本発明の文脈において、「機能性」ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、例えば、少なくとも実質的な生物学的活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換によって改変されたＴＣＲまたはＴＣＲバリアントを意味することになる。ＴＣＲのαおよび／またはβ鎖の場合には、このことは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に前記ＴＣＲの特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合、および／または特異的ペプチド：ＭＨＣ相互作用の際の機能的シグナル伝達を発揮するＴ細胞受容体（改変されていないαおよび／もしくはβ鎖を有するかまたは別の発明の融合タンパク質αおよび／またはβ鎖を有する）を形成することが可能なままであることを意味することになる。

具体的実施形態では、ＴＣＲは、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるよう改変されてもよく、ここで、前記エピトープタグは、６から１５アミノ酸、好ましくは９から１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ＴＣＲは、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるように改変されてもよく、ここで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、いずれも離れて配置されているかまたはタンデムに直接配置されている２つ以上のエピトープタグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物学的活性（単数または複数）（「機能性」）を維持する限り、２、３、４、５またはさらに多くのエピトープタグを含有し得る。

好ましいのは、本発明による機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であり、ここで、前記エピトープタグは、以下に限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または他の従来のタグ、例えば、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｔ７－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）－タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、もしくはＧＦＰ－タグから選択され、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは、高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および同第４，８５１，３４１号明細書を参照されたい）。高品質の試薬をその検出に使用することが可能であるため、ｍｙｃタグが好ましくは使用され得る。エピトープタグは、当然のことながら、抗体による認識の他に、１つまたは複数の追加の機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者に周知である。

ＴＣＲバリアント
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチドを指す。

機能性部分は、ＴＣＲの抗原への、特に抗原－ＭＨＣ複合体への結合を媒介し得る。

一実施形態では、機能性部分は、本明細書に記載されているＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。

ＴＣＲバリアント分子、ＴＣＲ受容体の結合特性を有してもよいが、エフェクター細胞（Ｔ細胞以外）のシグナル伝達ドメイン、特にＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わされてもよい。したがって、一部の実施形態は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わせた、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むタンパク質を指す。

本発明の別の態様は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。この態様の一実施形態では、少なくとも２つのＴＣＲ分子が、リンカー部分を介して連結し、多価複合体を形成する。好ましくは、複合体は水溶性であるため、リンカー部分はそれに従って選択されるべきである。リンカー部分は、形成された複合体の構造的多様性が最小限になるように、ＴＣＲ分子上の規定の位置に結合可能であることが好ましい。本態様の一実施形態は、本発明のＴＣＲ複合体によって提供され、ここで、ポリマー鎖またはペプチドリンカー配列は、ＴＣＲの可変領域配列内に位置していない各ＴＣＲのアミノ酸残基間に伸びている。本発明の複合体は、医学において使用するためのものであってもよく、リンカー部分は、それらの医薬適合性、例えば、それらの免疫原性に関して選択されるべきである。上記の望ましい基準を満たすリンカー部分の例は、当技術分野、例えば、抗体断片を連結する技術分野において公知である。

リンカーの例は、親水性ポリマーおよびペプチドリンカーである。親水性ポリマーに関する例は、ポリアルキレングリコールである。このクラスの最も一般的に使用されるものは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧに基づく。しかし、他のものは、他の好適な、必要に応じて置換された、ポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール、およびエチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体に基づく。ペプチドリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカー、またはその上にＴＣＲ分子が結合し得る多量体ドメインを生成するように機能する。

一実施形態は、多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、前記ＴＣＲの少なくとも１つに、治療剤が付随している。

サイトカインおよびケモカインの放出
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、ＩＦＮ－γの分泌は、エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ^＊０２結合形態への結合によって誘導される。

エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ^＊０２結合形態への結合によって誘導されるＩＦＮ－γの分泌は、５００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、例えば１０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、２０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、より好ましくは４０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、最も好ましくは６０００ｐｇ／ｍｌよりさらにより多くてもよい。ＩＦＮ－γの分泌は、無関係のペプチド（例えば、配列番号２８）のＨＬＡ－Ａ^＊０２結合形態への結合と比較して、配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ^＊０２結合形態への結合の場合には、少なくとも５倍、より高くてもよい。

「エフェクター細胞」は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型は、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞を含む。

本発明は、標的アミノ酸配列である配列番号１またはＨＬＡ－Ａ^＊２、好ましくはまたはそのＨＬＡ－Ａ^＊２：０１結合形態に結合するＴＣＲまたはその断片を同定するための方法であって、候補ＴＣＲまたはその断片を配列番号１のアミノ酸配列またはＨＬＡ－Ａ^＊２、好ましくはまたはそのＨＬＡ－Ａ^＊２：０１結合形態と接触させることと、候補ＴＣＲまたはその断片が標的に結合するおよび／または免疫応答を媒介するか否かを決定することとを含む方法にも関する。

候補ＴＣＲまたはその断片が免疫応答を媒介するかどうかは、例えば、サイトカイン分泌、例えば、ＩＦＮ－γ分泌の測定によって決定することができる。上述のように、サイトカイン分泌は、アミノ酸配列である配列番号１をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトされたＫ５６２細胞（または他のＡＰＣ）が調査されるＴＣＲまたはＴＣＲの断片を含む分子を発現するＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣと共にインキュベートされるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定することができる。

特定の実施形態では、本発明のＴＣＲは、Ｔｈ２サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３の分泌をあまり示さない。これは、Ｔｈ２サイトカイン応答が腫瘍進行を増加させる可能性があるため（Jager MJ, Desjardins L, Kivela T, Damato BE (eds): Current Concepts in Uveal Melanoma. Dev Ophthalmol. Basel, Karger, 2012, vol 49, pp 137-149、J Immunother. 2018 Oct;41(8):369-378）、有利である可能性がある。

核酸、ベクター
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または本明細書に記載されているＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に関する。

「核酸分子」は、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖または二本鎖であってもよく、天然源から合成または得られてもよく（例えば、単離および／または精製されてもよく）、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有してもよく、および天然、非天然または改変されたヌクレオチド間の連結、例えば、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結などを含有してもよい。好ましくは、本明細書に記載の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に連結することによって、生細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から得られる分子を指す。本発明の目的として、複製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製であっても、またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であってもよい。核酸は、当技術分野で公知の、または市販の（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒおよび同様の会社からの）手順を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Sambrook et al.を参照されたく、例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるか、またはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な改変ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成され得る。核酸は、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能性部分もしくは機能性バリアントのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。

本開示は、単離または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。このようなバリアントヌクレオチド配列は、ＭＡＧＥＡ１を特異的に認識する機能性ＴＣＲをコードする。

本開示は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列または本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離または精製された核酸も提供する。

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシーな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に濃い量で、標的配列（本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件には、ヌクレオチド配列に適合したほんの僅かな小さな領域（例えば、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、または散在する僅かな不適合を含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。このような相補性の小領域は、１４～１７塩基またはそれより多い塩基の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションにより、それらの区別が容易になる。比較的高ストリンジェンシーな条件としては、例えば、約５０～７０℃の温度で、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたはそれと同等なものによって提供されるような、低塩条件および／または高温条件が挙げられる。このような高ストリンジェンシーな条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間の不適合をほとんど許容せず、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。ホルムアミド添加量を増加させることによって、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に認識されている。

本明細書の他の箇所で既に記載されているように、ＴＣＲをコードする核酸は改変されてもよい。核酸配列全体における有用な改変は、コドン最適化であり得る。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において起こらない。

別の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸を含むベクターを指す。

ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターである。

「ベクター」は、核酸配列を、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に運ぶための能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、および好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して操作された核酸である。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、および／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターであってもよい。ベクターは、複製開始点として、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者にとって公知の他の遺伝要素も含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結した本発明による核酸を含む発現ベクターである。

好ましくは、ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルスベクター、より具体的には、ガンマ－レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。

細胞、細胞株
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。

一部の実施形態では、細胞は、単離されるかまたは天然に存在しない。

具体的実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または前記核酸を含むベクターを含んでもよい。

細胞中では、上記ＴＣＲをコードする核酸配列を含む上記ベクターが導入されてもよく、または前記ＴＣＲをコードするｉｖｔＲＮＡが導入されてもよい。細胞は、Ｔ細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えば、Engels et al.（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。一次ヒトＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入は、例えば、Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。

用語「トランスフェクション」と「形質導入」は交換可能であり、外因性核酸配列が、宿主細胞、例えば、真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、上述の方法に限定されないが、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクションおよびレトロウイルスまたは形質導入またはトランスフェクションに好適な他のウイルスによる上述の感染を含む任意の数の手段よって達成され得る。

一部の実施形態は、
ａ）本明細書に記載されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む細胞を指す。

一部の実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であってもよい。好ましくは、細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。

幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、自己再生能および長期間存続する能力によって特徴付けられる、分化の程度の低いＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団である。ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの細胞がそれらの抗原に遭遇すると、これらは、一部の静止したままのＴＳＣＭと共に、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）へとさらに分化する（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残っているＴＳＣＭ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで耐性免疫記憶を構築する能力を示し、したがって、養子Ｔ細胞療法に関する重要なＴ細胞亜集団であると考えられる（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。幹細胞メモリーＴ細胞亜集団にＴ細胞プールを限定するために、免疫磁気選択を使用することができる。（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44）を参照されたい。

ＴＣＲを標的とする抗体
本発明の別の態様は、ＭＡＧＥＡ１に対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。一実施形態では、ＭＡＧＥＡ１に対する特異性を媒介するＴＣＲの一部は、配列番号４、および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。

抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲの活性をモジュレートし得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲのＭＡＧＥＡ１との結合をブロックする場合もあり、ブロックしない場合もある。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲの治療活性をモジュレートするため、または診断目的で使用され得る。

医薬組成物、医学的処置およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを含む医薬組成物、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。

本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、許容される担体または担体材料と混合した用量で、このような医薬組成物によって、疾患が処置されるかまたは少なくとも緩和され得るように使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）、当技術分野の公知の状態である充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および他の材料を含み得る。

用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生体活性の有効性を妨げない、非毒性材料を定義する。担体の選択は、適用に依存する。

医薬組成物は、活性成分の活性を増強するかまたは処置を補う追加の成分を含有してもよい。このような追加の成分および／または因子は、相乗効果を達成するかまたは有害もしくは望ましくない作用を最小限にするための、医薬組成物の一部であり得る。

本発明の活性成分の製剤化または調製および適用／薬物治療のための技法は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに公開されている。適当な適用は、非経口適用、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射および髄腔内、直接脳室内、静脈内、節内、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射は、患者にとって好ましい処置である。

好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、注入または注射である。

注射用組成物は、少なくとも１つの有効成分、例えば、ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞集団（例えば、処置される患者に対して自己であるかまたは同種間である）を含む薬学的に許容される流体組成物である。有効成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解されるかまたは懸濁され、さらに、組成物は、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の１つまたは複数の非毒性補助剤を含んでもよい。本開示の融合タンパク質と共に使用するのに有用な、このような注射用組成物は従来的なものであり、適当な製剤は、当業者に周知である。

典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。

したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または医薬として使用するための本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。

一部の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、がんの処置において使用するための前記ＴＣＲを含む細胞を指す。

一実施形態では、がんは、血液がんまたは固形腫瘍である。

血液がんは、固形腫瘍を形成せず、したがって、体内に主に分散される血液のがんとも言われる。血液がんの例は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である。固形腫瘍には２つの主要なタイプ、すなわち肉腫および癌が存在する。肉腫は、例えば、血管、骨、脂肪組織、靭帯、リンパ管、筋肉または腱の腫瘍である。

一実施形態では、がんは、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される。

（ｉ）本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、（ｉｉ）組換えＴＣＲをコードする核酸を含むウイルス粒子、（ｉｉｉ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲを発現するよう改変された、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞、（ｉｖ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲをコードする核酸のうちの１つまたは複数を含有する医薬組成物およびキットも本明細書において企図されている。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクター粒子（または組換えＴＣＲを発現するよう、本明細書に記載のベクター粒子を使用して改変されたＴ細胞）を含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書にさらに記載されている本開示の方法において、対象に投与することができる。

本明細書に記載されている改変Ｔ細胞を含む組成物は、公知の技法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において、または本開示に基づいて、当業者に明らかとなるそのバリエーションにおいて利用することができる。

一部の実施形態では、細胞は、最初に、それらを培養培地から回収し、次いで、細胞を洗浄し、培地および投与に好適な容器系（「薬学的に許容される」担体）において、治療有効量で濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であってもよいが、水中５％のデキストロースまたは乳酸リンゲル液も利用することができる。注入培地にヒト血清アルブミンを補充してもよい。

組成物中の有効治療のための細胞数は、典型的には、１０より多い細胞、かつ最大１０^６、１０^８または１０^９以下の細胞であり、１０^１０より多い細胞でもよい。細胞数は、組成物が、その中に含まれる細胞の種類に応じて意図される最終的用途に応じて変わることになる。本発明において提供される用途では、細胞は、一般的には１リットル以下の体積中にあり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１ｍｌ当たり１０^６を超える細胞であり、一般的には１ｍｌ当たり１０^７を超え、一般的には１ｍｌ当たり１０^８を超える。臨床的に関連する数の免疫細胞は、１０^９、１０^１０または１０^１１の細胞に累積的に等しいかまたはそれを超える複数の注入物中に配分され得る。本発明において提供される医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉体、水性、または凍結乾燥形態であってもよい。好適な医薬担体の例は、当技術分野において公知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。安定化剤、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、組成物を体内での分解から保護することができる。注射による投与が意図される組成物中には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含まれてもよい。

本明細書に記載されている組換えＴＣＲ、または本発明において提供される組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングされてもよい。キットは、任意選択で、１つまたは複数の成分、例えば、使用説明書、デバイス、および追加の試薬、ならびに本方法を実践するためのコンポーネント、例えば、チューブ、容器およびシリンジを含んでもよい。例示的なキットは、組換えＴＣＲをコードする核酸、組換えＴＣＲポリペプチド、または本発明において提供されるウイルスを含んでもよく、任意選択で、使用説明書、対象においてウイルスを検出するためのデバイス、および組成物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。

目的の遺伝子（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本明細書において企図されている。目的の配列（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするウイルスベクターおよび任意選択で免疫チェックポイント阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において企図されている。

本明細書において企図されるキットは、本明細書に開示されたＴＣＲのうちのいずれか１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を実行するためのキットも含む。特に、このような診断キットは、適当な増幅プライマーおよび検出プライマーならびに本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを検出するために、ディープシーケンシングを実施するための他の関連試薬のセットを含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明におけるキットは、抗体または他の結合分子などの、本明細書に開示されたＴＣＲを検出するための試薬を含んでもよい。診断キットは、本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの存在を決定するため、または本明細書に開示されたＴＣＲの存在を決定するための説明書も含有し得る。キットは、説明書を含有してもよい。説明書は、典型的には、キットに含まれる成分、対象の適切な状態を決定するための方法を含む投与のための方法、適切な投薬量、および適切な投与方法を説明する有形の表現を含む。説明書は、処置時間の持続期間にわたって対象をモニタリングするためのガイダンスも含み得る。

本発明において提供されるキットは、本明細書に記載の組成物を対象に投与するためのデバイスも含み得る。医薬またはワクチンを投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかが、本発明において提供されるキットに含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに対応するものであり、例えば、高圧注射用デバイスなどの無針注射用デバイスは、高圧注射によって損傷を受けなかったウイルスと共に、キット中に含まれてもよいが、典型的には、高圧注射によって損傷を受けたウイルスと共に、キット中に含まれることはない。

本発明において提供されるキットは、化合物、例えば、Ｔ細胞活性化因子または刺激物質、またはＴＬＲアゴニスト、例えば、対象に対するＴＬＲ４アゴニストを投与するためのデバイスも含んでよい。医薬を対象に投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかは、本発明において提供されるキット中に含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットの、化合物を投与するためのデバイスは、化合物投与の所望の方法に対応するものであろう。

実験
１．実験：ＭＡＧＥＡ１特異的ＴＣＲの単離
ＭＡＧＥＡ１由来のエピトープに対する特異性および目的のいずれかのＭＨＣ分子に対する拘束性を有するＴ細胞を単離するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアプローチを使用した。プライミング系は、抗原提示細胞としてＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陰性ドナーの成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を使用し、抗原に特異的なＴ細胞応答および自己のＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡大を開始する。ミニ遺伝子（配列番号２７）をコードし、ＭＡＧＥＡ１由来のペプチドＫＶＬＥＹＶＩＫＶ（配列番号１において参照される）を含有するアミノ酸配列へと翻訳されるｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）は、特異的抗原の供給源としての役割を果たす。同時に、ヒトのＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１をコードするｉｖｔＲＮＡを、ｍＤＣにトランスフェクトされる拘束エレメントの供給源として使用し、この専用のＨＬＡアレルについてアロジェニックプライミングを設定した（国際公開第２００７／０１７２０１号パンフレットに記載されている）。ｍＤＣへの電気穿孔後に、ミニ遺伝子をコードするｉｖｔＲＮＡは、タンパク質へと翻訳され、次に、プロセシングされ、同時にトランスフェクトされたｍＤＣによって発現されるトランスジェニックＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１分子によってペプチドとして提示される。同じドナーに由来するＴ細胞のｉｖｔＲＮＡがトランスフェクトされたｍＤＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養によって、対応するＴＣＲの供給源としての役割を果たす抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ誘導がもたらされる。拡大後に、抗原特異的Ｔ細胞を濃縮し、希釈を制限するかまたはＦＡＣＳに基づく単一細胞選別によって単一細胞をクローニングすることができる。

１．１ 実験のレイアウト
高親和性ＴＣＲの単離および同定のためのＴ細胞の樹状細胞によるプライミングは、以下のプロトコールに従ったアロジェニックＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１分子によるペプチド提示を使用して達成した：

成熟樹状細胞は、Ｊｏｎｕｌｅｉｔら（Jonuleit et al. 1997, Eur. J. Immunol. 1997, 27:3135-3142）に従って、ＤＣのための好適な成熟カクテルを使用して、８日以内に生成した。抗原提示細胞（８日のｍＤＣ）は健康なドナーに由来し、ＭＧ＿Ｘ１をコードする２０μｇのｉｖｔＲＮＡおよびアロジェニックＨＬＡ分子（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）をコードする２０μｇのｉｖｔＲＮＡを用いる電気穿孔によって細胞にトランスフェクトした。次に、調製されたｍＤＣを、ＩＬ－７（０日目に５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２（２～３日ごとに５０Ｕ／ｍｌ）を補充した好適な細胞培地中、３７℃（６％のＣＯ_２）で、約１４日間、健康なドナーの自己のＣＤ８^＋濃縮ＰＢＭＣと１：２０の比で共培養した。次に、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１ ＭＡＧＥＡ１_{２７８～２８６}多量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）を使用して、ＭＡＧＥＡ１_{２７８～２８６}特異的細胞を同定し、次に、ＦＡＣＳ技術を使用する単一細胞選別によって分離した。

１．２ 結果
記載したｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアプローチによって、候補ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するＴ細胞クローンが同定された。ＮＧＳ分析を使用してＴＣＲ配列を特定し、再構築して、機能性および安全性についてのＴＣＲの完全な特徴付けのために、好適なエフェクターＴ細胞において遺伝子導入により発現させた。

２．実験：エピトープの特異性
遺伝子導入により発現した、組換えＴＣＲの機能性を確認するために、ＴＣＲを形質導入したエフェクターＴ細胞をペプチドを負荷したＴ２細胞（標的細胞）と共培養した。特異的ペプチド：ＭＨＣ複合体のＴＣＲ媒介性認識により、ＴＣＲを発現するＴ細胞の活性化およびある種のサイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γの分泌がもたらされる。共培養上清において分泌されたＩＦＮ－γを分析するために、ＥＬＩＳＡを実施した。

２．２ 実験のレイアウト
ＨＬＡ－Ａ^＊０２を発現するＴ２細胞に飽和量のペプチド（１０^－５Ｍ）を負荷した。ＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（配列番号１）を負荷したＴ２細胞は陽性標的としての役割を果たし、無関係のＡＳＴＮ１ペプチド（配列番号２８）を負荷したＴ２細胞は陰性標的としての役割を果たした。エフェクター細胞として、２名の異なるドナーに由来するＣＤ８濃縮Ｔ細胞集団に形質導入して、組換えＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を安定して発現させた。エフェクターは、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３の２つの異なるバージョンを発現するように調製し、一つのバージョンはマウスＣ領域（ｍｕｒＣ）を有し、一つのバージョンはヒトの最小限にマウス化されたＣ領域（ｍｍＣ）を有した。対照のＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲ（ベンチマークＴＣＲ）も２名の異なるドナーに由来するＴ細胞において発現し、分析された。

エフェクター細胞と標的細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２．５：１のＥ：Ｔで共培養させた。共培養の約２０時間後に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によって分析した。

２．３ 結果
ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、ＫＶＬペプチドを負荷したＴ２細胞と共に培養した際にのみＩＦＮ－γを分泌し、トランスジェニックＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３によって媒介される、提示されたペプチド：ＭＨＣ複合体の特異的認識が示され、その機能性が証明された。陰性標的である、無関係のＡＳＴＮ１ペプチド（配列番号２８、ＫＬＹＧＬＤＷＡＥＬ）を負荷したＴ２細胞は認識されなかった（図１）。トランスジェニックＴＣＲは、ＴＣＲのＣ領域とは無関係に、特異的標的認識およびＩＦＮ－γの分泌を媒介する。

３．実験：拘束の分析
ＴＣＲは、ある種のＭＨＣ分子と組み合わせた場合にのみそれらの特異的エピトープを認識するため、抗原の発現レベルだけでなく、標的細胞のＨＬＡ型も（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで）標的を陽性または陰性の標的であると規定する。言い換えれば、ＨＬＡ型に依存して、ＴＣＲベースのＡＣＴに関する処置レジメンに患者を含めることも含めないこともある。

ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に加えて、どのＨＬＡ分子が、ＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチドを負荷され得るか、かつＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するＴ細胞によって認識され得るかを評価するために、詳細な拘束分析を実施した。したがって、ヨーロッパ人および北アメリカのコーカサス人において最も頻度の高いＨＬＡアロタイプを網羅する５３種のＬＣＬ細胞株（ＥＢＶにより形質転換されたＢ細胞）をＡＰＣ（抗原提示細胞）として使用し、ＫＶＬペプチドを負荷されていないかまたは負荷されたＴＣＲを発現するエフェクター（図２）と共培養した。

３．１ 実験のレイアウト：
５３種のＬＣＬ細胞株に、飽和量のＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（１０^－５Ｍ；配列番号１）を約１．５時間負荷し、洗浄し、次に、異なるエフェクター調製物に由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するエフェクターと共培養した。負荷されていないＬＣＬを対照として使用した。共培養は、９６ウェル丸底プレートにおいて１：１のＥ：Ｔで設定し、約２０時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ、ＢＤヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡセット）によってＩＦＮ－γのレベルを分析した。

３．２ 結果
ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３の拘束分析は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１に提示される場合だけでなく、様々な程度で、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６、およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７に提示される、そのＭＡＧＥＡ１由来のエピトープをも認識するＴＣＲの能力を示す。図２は、負荷されていないＬＣＬに関して検出されたバックグラウンドレベルを超えるペプチド特異的認識をもたらすこれらのＬＣＬ（試験した５３個のうち）に関するデータのみを示す。

４．実験：腫瘍細胞の認識
Ｔ細胞受容体の有効性、特異性および臨床適用に対するその適合性を分析するために、腫瘍細胞株のセットを、ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞と共培養した際のＩＦＮ－γ分泌を測定することによって、ＴＣＲ媒介性認識について試験した。

４．１ 実験のレイアウト（図３）：
３名の異なるドナーに由来するエフェクター細胞にＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３およびベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを形質導入した。ＴＣＲを形質導入したかまたは形質導入されていないエフェクターを、様々な腫瘍細胞株と共培養した。細胞株Ｕ２６６、ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＵＡＣＣ－６２、Ｓａｏｓ－２およびＭｅｌ６２４．３８（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１＋）およびＨＬＡ－Ａ２をトランスフェクトした細胞株ＫＹＯ－１およびＯＰＭ－２（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１＋）は、陽性標的としての役割を果たした。細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７５５、６４７－ＶおよびＣＭＫ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１－）、未改変のＯＰＭ－２およびＫＹＯ－１（ＨＬＡ－Ａ２－／ＭＡＧＥＡ１＋）は、陰性標的としての役割を果たした。細胞株のＨＬＡ－Ａ２発現をＦＡＣＳによって分析し（データは示さず）、ｑＰＣＲを使用してＭＡＧＥＡ１発現データを作成し、当業者に公知の公共に利用可能なデータベースから抽出した。対照として、すべてのエフェクターも、飽和濃度（１０^－５Ｍ）のＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（配列番号１）または無関係のＡＳＴＮ１ペプチド（配列番号２８）を負荷したＴ２細胞と共培養した。共培養のために、エフェクターと標的を２．５：１のＥ：Ｔで、９６ウェル丸底プレートに播種し、約２０時間の共培養後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γのレベルを分析した。

４．２ 結果（図３）
腫瘍細胞を効果的に認識するＴＣＲの能力を、Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクターを様々な腫瘍細胞株のセットと共培養することによって評価した。図３に示されるように、Ｔ１５．８－４．３－８３とＣｔｒｌ ＭＡＧＡ１－ＴＣＲの両方が、ＨＬＡ－Ａ２陽性およびＭＡＧＡ１陽性の腫瘍細胞株Ｕ２６６、ＮＣｉ－Ｈ１７０３、ＵＡＣＣ－６２、Ｓａｏｓ－２およびＭｅｌ６２４．３８の特異的認識を媒介した。ＫＹＯ－１およびＯＰＭ－２細胞は、ＨＬＡ－Ａ２をコードするｉｖｔＲＮＡによるトランスフェクション後にのみ認識された。

トランスフェクトされていないＫＹＯ－１およびＯＰＭ－２（ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ１陽性）ならびにＮＣＩ－Ｈ１７５５、６４７－ＶおよびＣＭＫ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１－）は、陰性対照としての役割を果たした。抗原ＭＡＧＥＡ１が発現されなかったか、または必要な拘束エレメントが存在しなかった場合は常に、陰性対照は認識されなかった。ＭＡＧＥＡ１陽性細胞株およびＨＬＡ－Ａ２陽性細胞株のみの有効な認識は、ＴＣＲの高度に有効かつ特異的な腫瘍細胞認識を示す。

４．３実験のレイアウト（図１０）
２０．０００個のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２０．０００個の腫瘍細胞と共培養した。メラノーマ細胞株ＵＡＣＣ－２５７、メラノーマ細胞株ＵＡＣＣ－６２または骨肉腫細胞株ＳＡＯＳ－２のいずれかとの２０時間の共培養後に、標準的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを実施する。４０００ｐｇを超える値は、三次多項式を使用して推定する。

４．５ 結果（図１０）
ＭＡＧＥＡ１およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１二重陽性腫瘍細胞株に応答してＩＦＮ－γを産生するＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞集団の能力を評価した。Ｔ１５．８－４．３－８３は、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲ ＦＨ１、ＦＨ２、ＦＨ３およびＦＨ４ならびに国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＲ３７Ｐ１Ｃ９と比較して、３種の細胞株すべて、ＵＡＣＣ－２５７、ＵＡＣＣ－６２またはＳＡＯＳ－２に対して増強された腫瘍細胞認識能を示す。ＵＡＣＣ－６２は、Ｔ１５．８－４．３－８３にのみ認識される。

５．実験：腫瘍細胞の死滅
腫瘍細胞を認識するだけでなく効率的に溶解し、これにより、腫瘍細胞を死滅させるＴＣＲの能力は、最も重要であり、臨床的に適切である。ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３の殺滅能を分析するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍデバイスを使用して、６日にわたって長期死滅アッセイを実施した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）デバイスは、細胞のライブイメージングを可能にする顕微鏡に基づくシステムである。腫瘍細胞株のセットを９６ウェル平底プレートのウェル中に播種し、３名の異なるドナーに由来するＴＣＲを発現するエフェクターと共培養した。腫瘍細胞株は、核に拘束される赤色蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を安定して発現し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍシステムが、各ウェルにおける赤色蛍光細胞の正確な数を決定することを可能にした。経時的にウェル当たりの増加した細胞数が腫瘍細胞の成長を示し、一方、ウェル当たりの細胞数の低下はＴＣＲ媒介性死滅を示すことになる。

５．１ 実験のレイアウト（図４Ａ～４Ｄ）
腫瘍細胞株６４７－Ｖ（膀胱尿路上皮癌）、ＵＡＣＣ－６２（メラノーマ）、Ｓａｏｓ－２（骨の骨肉腫）およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（肺腺癌）に、製造業者の使用説明書に従って、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） ＮｕｃＬｉｇｈｔ（商標） Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔを使用することによって、核に拘束される赤色蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を安定して形質導入した。腫瘍細胞を９６ウェル平底プレートに播種し、一晩、プラスチックに付着させた。陽性対照として、腫瘍細胞に、飽和濃度のＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（１０^－５Ｍ）を約１．５時間負荷させ、洗浄し、次いで、共培養に使用した。ＫＶＬを負荷したか、または未改変の腫瘍細胞を、単独で培養したか、または３名の異なるドナーに由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクターと共培養した。形質導入されていないエフェクターとの共培養は、陰性対照としての役割を果たした。２時間ごとに、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍシステムを用いて写真を撮り、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍソフトウェア（バージョン２０１６Ｂ）を用いて分析した。

５．２ 結果（図４Ａ～４Ｄ）
図４Ａ～４Ｄは、それぞれ、赤色蛍光標的細胞株６４７－Ｖ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１－）、ＵＡＣＣ－６２（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１＋）、Ｓａｏｓ－２（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１＋）およびＮＣＩ－Ｈ１７０３（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１＋）のＴＣＲ媒介性の、抗原特異的溶解を示す。形質導入されていないエフェクター細胞は、腫瘍細胞のいずれの成長（経時的な細胞数の増加）にも影響を及ぼさないが、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクター細胞は、抗原ＭＡＧＥＡ１およびＨＬＡ－Ａ２を発現する腫瘍細胞ＮＣＩ－Ｈ１７０３、ＵＡＣＣ－６２およびＳａｏｓ－２を効率的に死滅させる（経時的な細胞数の減少）。ＭＡＧＥＡ１陰性の６４７－Ｖ細胞は死滅しない。すべての腫瘍細胞は、対照としてのＫＶＬペプチドを人工的に負荷した場合に死滅する。参照として、ＫＶＬペプチドを負荷していないかまたは負荷した、単独で培養した腫瘍細胞も分析し、各グラフに成長を示す。

５．３ 実験のレイアウト（図１１）
２０．０００個のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞を７．５００個のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標） ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓを形質導入したＳＡＯＳ－２細胞と共培養する。共培養開始の１日前に、腫瘍細胞を播種した。エフェクター細胞を添加した後、培養プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（登録商標）デバイスに移し、３７℃および６％のＣＯ_２で、７２時間にわたり、赤色蛍光細胞の拡大をモニターし、４時間ごとに写真を撮る。各測定点におけるウェル当たりの赤色蛍光腫瘍細胞の細胞数（ｌ／ｍｍ^２）を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ（登録商標）ソフトウェアを使用して計算する。各測定点は、３つの技術的反復の平均を表す。

５．４ 結果（図１１）
形質導入されていないＴ細胞の存在下で培養したＳＡＯＳ－２細胞は、強力な増殖を示す。異なるＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の共培養は、ＳＡＯＳ－２細胞数の減少を誘導する。興味深いことに、死滅の速度および程度は、異なるＴＣＲトランスジェニックエフェクター細胞間で変化する。ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３は、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲ ＦＨ１、ＦＨ２、ＦＨ３およびＦＨ４ならびに国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＲ３７Ｐ１Ｃ９と比較して、ＭＡＧＥＡ１およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１二重陽性腫瘍細胞株を溶解する最も高い能力を示す。

６．実験：ＴＣＲエピトープ認識モチーフ
ＴＣＲの特異的エピトープ認識モチーフの詳細な分析のために、トレオニン置換スキャンおよび／またはセリンスキャンを実施した。エピトープの元のアミノ酸をトレオニン（それぞれ、またはセリン）で置換することによって、ＴＣＲ媒介性認識に必須であるエピトープ内の位置を特定することができる。この認識は、ペプチドのＨＬＡ分子への適切な結合およびペプチド：ＭＨＣ複合体のＴＣＲ自体との相互作用に依存し、いずれも、１つの単一アミノ酸の置換によって影響を受け得る。

６．１ 実験のレイアウト（図５および６）
ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８のエピトープ認識モチーフを特異的に規定するために、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現する３名の異なるドナー由来のエフェクターおよびベンチマークＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを発現するエフェクターを調製した。Ｔ細胞を、ＴＣＲの特異的エピトープＫＶＬ（配列番号１）を負荷したか、またはトレオニンで連続的に置換された（トレオニン置換スキャン）それぞれ個々のアミノ酸残基を有するペプチドを負荷したＴ２細胞と共培養した。Ｔ２細胞に、飽和濃度（１０^－５Ｍ）のペプチドを別々に負荷し、洗浄し、１：１のＥ：Ｔでエフェクターと共培養した。約２０時間の共培養後に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分泌されたＩＦＮ－γを分析した。

６．２ 結果（図５および６）
ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したか（図６に示される）またはベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥＡ１－ＴＣＲを形質導入した（図５に示される）エフェクターに関するトレオニン置換スキャンの結果は、それらのエピトープおよびエピトープ由来の誘導体に対する個々のＴＣＲの別個の特異性を実証する。参照として、ＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬエピトープの認識を、各グラフの左側に示す。ベンチマークＣｔｒｌ．ＭＡＧＥ Ａ１－ＴＣＲは、位置４および７のトレオニン置換を有するペプチドを認識しない（ＥおよびＩ、図５）。

対照的に、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３は、ペプチド認識がないことによって示されるように（図６）、位置１、３および５（Ｋ、ＬおよびＹ）におけるアミノ酸置換に対して感受性が高いようである。

エピトープ内の単一アミノ酸の交換は、両方のＴＣＲによって媒介される認識を顕著に妨害し、それらの高い選択的認識パターンを証明し、認識に関して重要であると考えられる位置は、２つの分析されたＴＣＲで顕著に異なっている。

６．３ 実験のレイアウト（図１３）
２０．０００個のＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を、２０．０００個の１０^－５Ｍのペプチドを負荷したＴ２細胞と共培養する。２０時間の共培養後に、標準的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを実施する（４０００ｐｇを超える値は、三次多項式を使用して推定する）。上記のトレオニン残基の代わりに、セリン残基を使用して、ＭＡＧＥＡ１_ＫＶＬペプチドにおける個々のアミノ酸を系統的に置き換える（セリンスキャン）。

６．４ 結果（図１３）
Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したＴ細胞は、ＦＨ１またはＲ３７Ｐ１Ｃ９ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞とは異なる固定位置を有する異なる認識モチーフを示す（セリンスキャンによる）。

トレオニンスキャンとセリンスキャンの組合せは、エピトープにおける１番目の位置（リシン）およびエピトープにおける５番目の位置（チロシン）が、Ｔ１５．８－４．３－８３ ＴＣＲにとって特に重要であると考えられることを示す。

７．実験：ＭＡＧＥファミリーのメンバー
ＭＡＧＥファミリーの１３個のメンバーは、ＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチドと非常に類似する（２～４個のアミノ酸ミスマッチのみ）ペプチド配列を含有し、潜在的なＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３媒介性の交差認識をさらに調査するために、インデプス分析を行った。ＭＡＧＥファミリーのメンバーの発現は、がんおよび精巣においてだけでなく、生命維持に必要な器官においても記載されており、タンパク質由来のペプチドの潜在的な交差認識が、臨床開発のためのＴＣＲに対する除外基準であるとする。

他のＭＡＧＥファミリーのメンバーを起源とする内因的に処理され、提示されるペプチドの認識について調査するために、ＭＡＧＥＡ１エピトープＫＶＬＥＹＶＩＫＶに類似するペプチド配列を含有するＭＡＧＥファミリーの１３個のメンバーすべてが、異なる起源の３つの細胞株において組換え発現された。細胞株を共培養し、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するエフェクターと共に組換えＭＡＧＥファミリーのメンバーを発現させることによって、タンパク質由来のＭＡＧＥペプチドの潜在的な交差認識を分析した。

７．１ 実験のレイアウト
ＭＡＧＥファミリーのメンバーＭＡＧＥＡ８（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（受託）：ＮＭ＿００１１６６４００．１）、ＭＡＧＥＡ９（ＮＭ＿００５３６５．４）、ＭＡＧＥＡ１１（ＮＭ＿００５３６６．４）、ＭＡＧＥＢ１（ＮＭ＿００２３６３．４）、ＭＡＧＥＢ２（ＮＭ＿００２３６３．４）、ＭＡＧＥＢ３（ＮＭ＿００２３６５．４）、ＭＡＧＥＢ５（ＮＭ＿００１２７１７５２．１）、ＭＡＧＥＢ１６（ＮＭ＿００１０９９９２１．１）、ＭＡＧＥＢ１７（ＮＭ＿００１２７７３０７．１）、ＭＡＧＥＢ１８（ＮＭ＿１７３６９９．３）、ＭＡＧＥＣ２（ＮＭ＿０１６２４９．３）、ＭＡＧＥＤ２（ＮＭ＿０１４５９９．５）およびＭＡＧＥＥ２（ＮＭ＿１３８７０３．４）をコードするｉｖｔＲＮＡを生成した。ＭＡＧＥＡ１（ＮＭ＿００４９８８．４）およびＡＳＴＮ１ペプチドＫＬＹをコードするｉｖｔＲＮＡを陽性および陰性対照ＲＮＡとして生成した。腫瘍細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－）、ＬＣＬ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－）およびＨＬＡ－Ａ２を形質導入したＫ５６２（ＭＡＧＥ－）に、１３個のＭＡＧＥファミリーのメンバー、ＭＡＧＥＡ１またはＡＳＴＮ１ペプチドＫＬＹのいずれかをコードする２０μｇのｉｖｔＲＮＡを別々にトランスフェクトした。ＭＡＧＥファミリーのメンバーのトランスジェニック発現をＦＡＣＳによって分析した（データは示さず）。対照として、Ｔ２細胞および３種の細胞株に、ＭＡＧＥＡ１由来のＫＶＬペプチド（１０^－５Ｍ）またはＡＳＴＮ１由来のＫＶＬペプチド（１０^－５Ｍ）のいずれかをさらに負荷した。ペプチドを負荷した対照細胞およびトランスフェクトした細胞株をトランスフェクションの３時間後に、９６ウェル丸底プレートに播種し、２名のドナーに由来する形質導入されていないかまたはＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクターを１：１のＥ：Ｔ比で共培養した。約２０時間の共培養後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分泌されたＩＦＮ－γを分析した。

７．２ 結果
図７は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（Ａ）、Ｋ５６２細胞（Ｂ）およびＬＣＬ細胞（Ｃ）において発現された組換えＭＡＧＥファミリーのメンバーのＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３媒介性認識を示す。Ｔ２細胞ならびにＫＶＬペプチドまたはＡＳＴＮ１ペプチドを外部から負荷したＨＥＫ ２９３Ｔ、Ｋ５６２またはＬＣＬ細胞の認識は、対照としての役割を果たした。形質導入されていないエフェクターは、いずれの特異的認識も示さなかったが、２名のドナーに由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクターは、完全長ＭＡＧＥＡ１をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトした３つの細胞株すべてを特異的に認識した。これは、ＭＡＧＥＡ１をコードするＲＮＡのＭＡＧＥＡ１タンパク質への効率的な翻訳およびタンパク質由来ＫＶＬペプチドのプロテオソームプロセシングとその後の細胞表面におけるＨＬＡ－Ａ２分子によるエピトープの負荷および提示を示す。ＡＳＴＮ１ペプチドをトランスフェクトした細胞株のいずれについても認識されず、バックグラウンドレベルを超える組換え発現されたＭＡＧＥファミリーのメンバーのいずれも認識されなかった。標的細胞の人工的負荷（以前に記載されている）の際に認識され得る、ＭＡＧＥファミリーのメンバーに由来するペプチドは、内因的に発現されたＭＡＧＥタンパク質からプロセシングされないか、ＭＨＣ分子に負荷されないか、または細胞表面に提示されないかのいずれかである。したがって、これらのペプチドは、免疫原性Ｔ細胞エピトープとして適格ではなく、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３媒介性交差認識に対する臨床的に適切な標的であるとも考えられない。

８．実験：正常細胞の分析
ＴＣＲの安全プロファイルを調査するために、異なる起源の健康な組織に由来する細胞のＴＣＲ媒介性認識が調査され、除外されなければならない。したがって、ＴＣＲを発現するエフェクターを、腎臓（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌによって得られる腎皮質上皮細胞）、肺（Ｌｏｎｚａによって得られる肺線維芽細胞）、およびｉＰＳ由来の肝細胞、心筋細胞、および内皮細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓによって得られる）に由来する正常細胞と共培養した。調査した細胞は、抗原ＭＡＧＥＡ１に対して内因的に陰性であり、したがって、潜在的なＭＡＧＥＡ１に関連しないオフターゲット毒性の特定が可能になった。

８．１ 実験のレイアウト
正常細胞を解凍し、供給業者に指定されたように、共培養前の１週間培養した。細胞を９６ウェル平底プレートに播種し、３名の異なるドナーに由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したかまたは形質導入されていないエフェクター（データは示さず）と共培養した。標的細胞のＨＬＡ－Ａ２発現を、抗体染色およびＦＡＣＳによって確認し（データは示さず）、標的細胞を未改変または対照としてのＭＡＧＥＡ１由来ＫＶＬ（配列番号１）ペプチドの過剰量（１０^－５Ｍ）を負荷したかのいずれかで試験した。対照として、エフェクター細胞および標的細胞を単独で播種し、Ｔ２細胞にＴＣＲのエピトープＫＶＬ（１０^－５Ｍ；配列番号１）を負荷した。約２０時間の共培養後に、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって分析した。約４８時間の共培養後に、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍデバイス（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）で位相差イメージを撮影し、接着標的細胞の溶解および剥離について潜在的な毒性効果を可視化した。

８．２ 結果
図８に示されるように、３名のドナーに由来するＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を形質導入したエフェクターの共培養により、人工的にＫＶＬペプチドを負荷した細胞のみの認識がもたらされ、ＭＨＣ分子の文脈で、それらの細胞表面にＴＣＲのエピトープを適切に提示する標的細胞の能力を表した。未改変正常細胞は、トランスジェニックＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３を発現するエフェクターによって認識されず、調査された受容体の好ましい安全プロファイルを示した。

標的細胞においてＴＣＲを形質導入したエフェクターによって媒介される潜在的な毒性効果を可視化するために、単独で培養したか、ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３で形質導入したエフェクターと共培養した異なる標的細胞、またはＴＣＲを発現するエフェクターと共培養したＫＶＬペプチドを負荷した標的細胞について位相差イメージを撮影した。図９は、３名のドナーのうちの１名に由来するエフェクター細胞との共培養の代表的な写真を示す。ＫＶＬを負荷した標的細胞のすべてに明らかなＴＣＲ媒介性溶解が存在するが（細胞層の完全な崩壊）、ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、未改変の正常細胞を溶解しない。

９ 実験：機能性アビディティ
様々なＫＶＬペプチドに特異的なＴＣＲの機能性アビディティを測定するために、段階的な量のＫＶＬペプチドを負荷したＴ２細胞との共培養において、最大半量の相対的ＩＦＮ－γ放出（ＥＣ５０値）が決定される。

機能性アビディティは、トランスジェニックＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の間の個々の非共有結合による相互作用の多重親和性の蓄積された強度を指す。

９．１ 実験のレイアウト（図１２）
ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞集団の機能性アビディティを、段階的な量のＫＶＬペプチド（１０^－４Ｍ～１０^－１２Ｍ）を負荷したＴ２細胞との共培養において、最大半量の相対的ＩＦＮ－γ放出（ＥＣ５０値）として決定する。２０時間の共培養後に、標準的ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡを実施する（４０００ｐｇを超える値は、三次多項式を使用して推定する）。

９．２ 結果（図１２）
様々なＫＶＬ特異的ＴＣＲは、それらの機能性アビディティにおいて、ＫＶＬペプチドを負荷したＴ２細胞と異なる。ＴＣＲ Ｔ１５．８－４．３－８３は、低いＥＣ５０値、すなわち、国際公開第２０１８／１７０３３８号パンフレットに開示されたＴＣＲ ＦＨ１、ＦＨ２、ＦＨ３およびＦＨ４ならびに国際公開第２０１８／１０４４３８号パンフレットに開示されたＲ３７Ｐ１Ｃ９と比較して、ＫＶＬペプチドを負荷した２種の細胞の高い機能性アビディティを示す。

１０ 実験：サイトカイン分泌
異なるＴＣＲを形質導入したＴ細胞のＴＨ２特異的サイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３のＴＣＲ分泌パターンを比較する。Ｔｈ２型の炎症は、腫瘍成長を容易にすることが提唱されている（Jager MJ, Desjardins L, Kivela T, Damato BE (eds): Current Concepts in Uveal Melanoma. Dev Ophthalmol. Basel, Karger, 2012, vol 49, pp 137-149、J Immunother. 2018 Oct;41(8):369-378）。したがって、低いまたは検出不能な分泌レベルのＴｈ２は、腫瘍退縮に有利であり得る。

１０．１ 実験のレイアウト（図１４）
２０．０００個のＴＣＲトランスジェニックエフェクターＴ細胞を、丸底の９６ウェルプレートにおいて、２０．０００個の腫瘍細胞と共培養する。ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）システムのプロトコールに従って、ＭＩＬＬＩＰＰＬＥＸ（登録商標） ＭＡＰ Ｋｉｔを使用して、分泌されたサイトカインに関して、無細胞上清を分析した。

１０．２ 結果（図１４）
Ｔ１３６７ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、いくつかのＴＨ２サイトカイン、特にＩＬ－４、ＩＬ－５およびＩＬ－１３を分泌する。１５．８－４．３－８３ ＴＣＲを形質導入したＴ細胞は、ＴＨ２サイトカインの同等の分泌を示さないが、国際公開第２０１４／１１８２３６号パンフレットに開示されたＴ１３６７は、これらのサイトカインのかなりの分泌を示す。

本出願は、以下の実施形態をさらに含む。

実施形態１：ＭＡＧＥＡ１に対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。

実施形態２：アミノ酸配列である配列番号１またはその断片を特異的に認識する、実施形態１に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態３：配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２および／またはＨＬＡ－Ａ２６結合形態、好ましくはＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する、実施形態１および２に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態４：ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態５：ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態６：ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する実施形態のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態７：
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態８：配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態９：配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１０：配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１１：配列番号１０または配列番号１２のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１または配列番号１３のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１２：ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、
－ 可変ＴＣＲα領域が、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域が、配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１３：ＴＣＲが精製される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１４：そのアミノ酸配列が、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１５：そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態修飾部分を含むよう改変されている、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１６：治療剤が、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択される、実施形態１５に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１７：免疫エフェクター分子が、サイトカインである、実施形態１６に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１８：可溶性であるかまたは膜に結合している、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態１９：薬物動態修飾部分が、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せである、実施形態１５に記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２０：一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、リンカー配列によって連結している、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２１：ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖が、エピトープタグを含むように改変されている、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。

実施形態２２：実施形態１から２１のいずれかのＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、単離されたポリペプチド。

実施形態２３：機能性部分が、配列番号２、３、４、５、６、および７のアミノ酸配列を含む、実施形態１から２１のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチド。

実施形態２４：機能性部分が、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む、実施形態２１に記載の単離されたポリペプチド。

実施形態２５：実施形態１から２１のいずれか１つで実現されている。

実施形態２６：ＩＦＮ－γ分泌が、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１にコードされた分子によって提示される、配列番号１のアミノ酸配列に結合することによって誘導される、実施形態１から２１に記載の単離されたＴＣＲ、実施形態２２から２４に記載のポリペプチドならびに実施形態２５に記載の多価ＴＣＲ複合体。

実施形態２７：実施形態１から２１のいずれか１つに記載のＴＣＲをコードするか、または実施形態２２から２４に記載のポリペプチドをコードする核酸。

実施形態２８：実施形態２７の核酸を含むベクター。

実施形態２９：発現ベクターである、実施形態２８に記載のベクター。

実施形態３０：レトロウイルスベクターである、実施形態２８または２９に記載のベクター。

実施形態３１：レンチウイルスベクターである、実施形態２８または２９に記載のベクター。

実施形態３２：実施形態１から２１に記載のＴＣＲを発現する細胞。

実施形態３３：単離されるか、または天然に存在しない、実施形態３２に記載の細胞。

実施形態３４：実施形態２７に記載の核酸または実施形態２８から３１に記載のベクターを含む、実施形態３２および３３に記載の細胞。

実施形態３５：
ａ）実施形態２７で実現されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）実施形態１から２１のいずれか１つで実現されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および実施形態１から２１のいずれか１つで実現されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、実施形態３２から３４に記載の細胞。

実施形態３６：末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態３２から３５のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態３７：Ｔ細胞である、実施形態３２から３６のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態３８：ＭＡＧＥＡ１に対する特異性を媒介する、実施形態１から２１に記載のＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。

実施形態３９：ＭＡＧＥＡ１特異性を媒介するＴＣＲの部分が、配列番号２、３、４、５、６、および７に示されるＣＤＲ、好ましくは配列番号４のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３、より好ましくは配列番号２、３および４に示されるアルファ鎖のＣＤＲおよび配列番号５、６および７のベータ鎖のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、実施形態３８に記載の抗体。

実施形態４０：実施形態１から２１に記載のＴＣＲを含む医薬組成物、実施形態２２から２４に記載のポリペプチド、実施形態２５に記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２７に記載の核酸、実施形態２８から３１に記載のベクター、実施形態３２から３７のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態３８から３９に記載の抗体。

実施形態４１：少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、実施形態４０に記載の医薬組成物。

実施形態４２：医薬として使用するための、実施形態１から２１に記載のＴＣＲ、実施形態２２から２４に記載のポリペプチド、実施形態２５に記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２７に記載の核酸、実施形態２８から３１に記載のベクター、実施形態３２から３７のいずれか１つに記載の細胞、または実施形態３８から３９に記載の抗体。

実施形態４３：がんの処置において使用するための、実施形態１から２１に記載のＴＣＲ、実施形態２２から２４に記載のポリペプチド、実施形態２５に記載の多価ＴＣＲ複合体、実施形態２７に記載の核酸、請求項２８から３１に記載のベクター、または実施形態３２から３７のいずれか１つに記載の細胞。

実施形態４４：がんが、血液がんまたは固形腫瘍である、実施形態４３に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。

実施形態４５：がんが、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、実施形態４３および４４に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。

実施形態４６：がんが、好ましくは、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、実施形態４３および４４に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。

Claims (12)

1. ＭＡＧＥＡ１に対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
   － 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、並びに、
   － 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
   を含み、
   配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する、前記ＴＣＲ。
2. 前記配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態が、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
3. 配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
4. 請求項１から３のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、前記機能性部分が、配列番号２、３、４、５、６および７のアミノ酸配列を含み、前記機能性部分は、ＴＣＲの抗原への結合を媒介する、単離されたポリペプチド。
5. 請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
6. ＩＦＮ－γ分泌が、
   ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０４、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１６、またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１７の遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態への、
   エフェクター細胞上に発現された、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ、請求項４に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の多価ＴＣＲ複合体の結合
   によって誘導される、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたＴＣＲ、請求項４に記載のポリペプチド、または請求項５に記載の多価ＴＣＲ複合体。
7. 請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲをコードするかまたは請求項４に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸。
8. 請求項７に記載の核酸を含むベクター。
9. 請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲを発現する細胞。
10. ＭＡＧＥＡ１に対する特異性を媒介する請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲの部分に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片。
11. 医薬として使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の細胞。
12. 前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択されるがんの処置において使用するための、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項４に記載のポリペプチド、請求項５に記載の多価ＴＣＲ複合体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の細胞。