ES2533492T3 - Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos contra toxinas de Clostridium difficile y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) con una KD inferior a 10 x 10-10 M medida por resonancia de plasmones superficiales y neutraliza la toxina B de C. difficile, en donde el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, comprende: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 62, 64 y 66; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 68, 70 y 72.

Description

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o subcutáneamente al sujeto.
Ejemplos de enfermedad por C. difficile incluyen colitis mediada por C. difficile, colitis asociada a antibióticos, colitis pseudomembranosa mediada por C. difficile (CPM) o diarrea, o recaída de enfermedad mediada por C. difficile.
5 El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede administrarse solo o en combinación con otro agente terapéutico, por ejemplo, un segundo anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo. El agente terapéutico puede ser: un antibiótico, gamma-globulina policlonal, agente probiótico o vacuna de C. difficile; vancomicina, metronidazol, bacitracina, Saccharomyces boulardii o una vacuna de toxoide de C. difficile; o un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la toxina A de C. difficile.
En una realización particular, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo producido por el clon 3D8 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEC ID Nº: 4 y una secuencia
15 de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEC ID Nº: 1) se administra en combinación con un anticuerpo
o porción de unión a antígeno del mismo producido por el clon 124-152 (es decir, que incluye una secuencia de la región de la cadena ligera variable idéntica a SEC ID Nº: 58 y una secuencia de la región de la cadena pesada variable idéntica a SEC ID Nº: 54).
Se describen procedimientos de preparación de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humano y un transgén de cadena ligera humana con una composición que incluye una exotoxina inactivada, y aislar un anticuerpo del animal. La exotoxina puede inactivarse, por ejemplo, mediante tratamiento con UDP-dialdehído o por mutación (por ejemplo, usando procedimientos
25 recombinantes). El procedimiento puede incluir adicionalmente evaluar la unión del anticuerpo a la exotoxina.
Se describen procedimientos para preparar un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo proporcionando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano o porción de unión a antígeno del mismo de la invención que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile y que expresa el ácido nucleico en una célula huésped.
En este documento también se describe un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de unión a antígeno (por ejemplo, CDR o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 3D8, 1B11 ó 3H2.
35 En este documento también se describe un hibridoma o transfectoma que incluye un ácido nucleico que codifica porciones de unión a antígeno (por ejemplo, CDR o regiones variables) del anticuerpo producido por el clon 124-152, 2A11 ó 1G10.
En este documento también se describe un procedimiento para preparar un hibridoma que expresa un anticuerpo que se une específicamente a una exotoxina de C. difficile inmunizando un animal no humano transgénico que tiene un genoma que incluye un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana con una composición que incluye la exotoxina, en el que la toxina se inactiva; aislando esplenocitos del animal; generando hibridomas de los esplenocitos; y seleccionando un hibridoma que produce un anticuerpo que se une
45 específicamente a la exotoxina.
El tratamiento de seres humanos con anticuerpos monoclonales humanos ofrece varias ventajas. Por ejemplo, es probable que los anticuerpos sean menos inmunogénicos en seres humanos que los anticuerpos no humanos. La terapia es rápida; la inactivación de toxinas puede producirse tan pronto como el anticuerpo llega a los sitios de infección y neutraliza directamente la(s) toxina(s) causante(s) de la enfermedad. Los anticuerpos humanos se localizan en sitios apropiados en seres humanos más eficientemente que los anticuerpos no humanos. Además, el tratamiento es específico para C. difficile, y es poco probable que altere la flora intestinal normal, a diferencia de las terapias con antibióticos tradicionales.
55 Otras características y ventajas de la invención serán evidentes de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una tabla que enumera las secuencias de aminoácidos de las cadenas de VH y VL codificadas por secuencias de ARNm de cada clon. Las letras en minúsculas representan aminoácidos en el péptido líder. Las CDR están subrayadas. El clon 3D8, que expresa 6 regiones V de cadenas ligeras únicas, solo expresaron la secuencia de aminoácidos del grupo I. La Figura 2A es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VL
65 expresada por el clon 3D8. Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima.
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15
25
35
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La Figura 2B es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VH expresada por el clon 3D8. Los genes del segmento V, del segmento D y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 3A es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VL expresada por el clon 1B11. Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 3B es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VH expresada por el clon 1B11. Los genes del segmento V, del segmento D y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 4A es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VL expresada por el clon 33.3H2 (denominado en este documento 3H2; 33.3H2 y 3H2, se usan indistintamente en este documento). Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 4B es una representación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la cadena de VH expresada por el clon 33.3H2. Los genes del segmento V y del segmento J se enumeran encima de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Las CDR están subrayadas por encima. La Figura 5 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de ELISA que midieron la unión de anticuerpos monoclonales anti-toxina A a toxina A. La Figuras 6A-B son un conjunto de gráficas que representa los resultados de ensayos de neutralización in vitro en presencia y ausencia de anticuerpos monoclonales anti-toxina A. La FIG. 6A representa los resultados de ensayos realizados con células IMR-90. La FIG. 6B representa los resultados de ensayos realizados con células T-84. La Figura 7 es una representación esquemática del polipéptido de la toxina A que indica fragmentos que se analizaron para estudios de mapeo de epítopes. La Figura 8A-B son representaciones esquemáticas de fragmentos de toxina A analizados para estudios de mapeo de epítopes. La Figura 9 es una tabla que enumera los resultados de ensayos in vivo para determinar la protección de ratones de la exposición mortal a toxina A por anticuerpos monoclonales anti-toxina A. La Figura 10 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de acumulación de fluido en el asa ileal de ratón para medir la eficacia de la neutralización de anticuerpos anti-toxina in vivo. La Figura 11A es un diagrama esquemático del periodo de administración de diversos agentes a hámsteres en un modelo de recaída de hámster. La Figura 11B es una gráfica que representa los resultados de los ensayos como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. La Figura 12 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsteres que sobreviven al tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. La Figura 13 es una gráfica que representa los resultados de ensayos en los que se midió la neutralización in vitro de toxina A y toxina B en presencia y ausencia de antisueros policlonales de cabras inmunizadas con toxoide B. “G330” se refiere a muestras en las que se probaron los sueros de la cabra nº 330. “G331” se refiere a muestras en las que se probaron los sueros de la cabra nº 331. La Figura 14 es un diagrama esquemático del periodo de administración de diversos agentes a hámsteres en un modelo de recaída de hámster. La Figura 15 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsteres que sobreviven al tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. Los hámsteres se trataron con vancomicina, vancomicina y 3D8, vancomicina y antisueros de la cabra nº 331,
o vancomicina, 3D8 y antisueros de la cabra nº 331. La Figura 16 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales sanos después del tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. “Goa 331” se refiere a antisueros de la cabra nº 331. La Figura 17 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de hámsteres que sobreviven al tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. Los hámsteres se inmunizaron con un fragmento de la toxina B antes del tratamiento con clindamicina. Los hámsteres se trataron con vancomicina, vancomicina y 3D8, o no recibieron tratamiento. La Figura 18 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de recaída de hámster como el porcentaje de animales sanos después de tratamiento con clindamicina seguido de exposición a C. difficile. Los hámsteres se inmunizaron con un fragmento de toxina B antes del tratamiento con clindamicina. La Figura 19 es un diagrama esquemático del periodo de administración de diversos agentes a hámsteres en un modelo de exposición directa a C. difficile. “331” se refiere a antisueros de la cabra nº 331. “Clinda” se refiere a tratamiento con clindamicina. La Figura 20 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición directa como el porcentaje de hámsteres que sobreviven a exposición directa a C. difficile. La Figura 21 es una gráfica que representa los resultados de ensayos de exposición directa como el porcentaje de animales sanos después de exposición directa a C. difficile. La Figura 22 es una representación de la secuencia de aminoácidos de toxina A de C. difficile. La Figura 23 es una representación de la secuencia de aminoácidos de toxina B de C. difficile.
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de longitud completa, pero que se une específicamente a una toxina. Ejemplos de porciones de unión englobadas dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente constituido por los dominios VLC, VHC, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd constituido 5 por los dominios VHC y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VLC y VHC de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., Nature 341:544-546,1989) que consiste en un dominio VHC; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada que tiene suficiente región estructural para unirse específicamente, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de una región variable. Un porción de unión a antígeno de una región variable de las cadenas ligeras y un porción de unión a antígeno de una región variable de las cadenas pesadas, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, pueden unirse usando procedimientos recombinantes por un ligador sintético que les permite prepararse como una única cadena de proteínas en la que el par de regiones VLC y VHC para formar moléculas monovalentes (conocidas como una única cadena Fv (scFv); véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242:423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también están englobados dentro del término
15 “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo. Estas porciones de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia, y las porciones se criban para la utilidad del mismo modo que los anticuerpos intactos.
El término “anticuerpo monoespecífico” se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo, epítope. Este término incluye un “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal” que como se usa en este documento se refiere a una preparación de anticuerpos o porciones de los mismos con una única composición molecular.
El término anticuerpo “recombinante” como se usa en este documento se refiere a anticuerpos que se preparan, se
25 expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implica cortar y empalmar secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos humanizados, injertados en CDR, quiméricos, generados in vitro (por ejemplo, por expresión en fago), y opcionalmente pueden incluir regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana.
Como se usa en este documento, el término “sustancialmente idéntico” (o “sustancialmente homólogo”) se refiere a
35 una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de nucleótidos de forma que la primera y la segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos tengan actividades similares. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos el 50 % de la afinidad del primer anticuerpo.
Los cálculos de “homología” entre dos secuencias se realizan del siguiente modo. Las secuencias se alinean para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y las secuencias no
45 homólogas pueden ignorarse para los fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia alineada para los fines de comparación es al menos el 50 % de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Si una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en este documento, “identidad” de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a “homología” de aminoácidos o de ácidos nucleicos). La identidad en porcentaje entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que necesita introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
55 La comparación de secuencias y la determinación de la homología en porcentaje entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. La homología en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970, que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización extendida por hueco de 4 y un hueco de desplazamiento de marco de 5.
Como se usa en este documento, el término “se hibrida bajo condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad o muy alta rigurosidad” describe condiciones para la hibridación y el lavado. La orientación para realizar las reacciones de hibridación puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. 65 6.3.1-6.3.6, 1989. Los procedimientos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y puede usarse cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas citadas en este documento son del siguiente modo: 1)
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la unión, por ejemplo, la región constante puede modificarse, por ejemplo, delecionando aminoácidos específicos. Las moléculas expresadas a partir de tales moléculas de ADN truncadas son útiles en los procedimientos descritos en este documento. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una ligera se unen a una toxina, y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno distinto de la toxina, u
5 otro epítope de la toxina.
Los anticuerpos quiméricos pueden producirse por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (u otra especie) se digiere con enzimas de restricción para eliminar la región que codifica la Fc murina, y se sustituye la 10 porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana (véanse Robinson y col., solicitud de patente internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., solicitud de patente europea 184, 187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171,496; Morrison y col., solicitud de patente europea 173,494; Neuberger y col., solicitud internacional WO 86/01533; Cabilly y col., patente de EE.UU. 4,816,567; Cabilly y col., solicitud de patente europea 125,023; Better y col. (1988 Science, 240:1041-1043); Liu y col. (1987) PNAS, 84:3439-3443; Liu y col., 1987, J.
15 Immunol., 139:3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res., 47:999-1005; Wood y col. (1985) Nature, 314:446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl. Cancer Inst., 80:1553-1559). Los anticuerpos quiméricos también puede crearse por técnicas de ADN recombinante en las que el ADN que codifica regiones V murinas puede ligarse a ADN que codifica las regiones constantes humanas.
20 Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina pueden humanizarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez se obtienen los anticuerpos murinos, las regiones variables pueden secuenciarse. Puede determinarse la localización de las CDR y los residuos de la región estructural (véase, Kabat, E.A., y col. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, Departamento de salud y de servicios humanos de Estados Unidos, publicación NIH nº 91-3242, y Chothia, C. y col. (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). Las
25 regiones variables de cadenas ligeras y pesadas pueden ligarse opcionalmente a regiones constantes correspondientes. De hecho, se entiende que cualquiera de los anticuerpos descritos en este documento, que incluye anticuerpos completamente humanos, puede alterarse (por ejemplo, por mutación, sustitución) para contener una región constante sustituta, por ejemplo, región Fc, o porción (porciones) de la misma para lograr, por ejemplo, una estructura de anticuerpo deseada, función (por ejemplo, función efectora), subtipo, alotipo, subclase o similares.
30 Los anticuerpos anti-toxina pueden secuenciarse usando técnicas reconocidas en la técnicas. Las moléculas de anticuerpo injertadas en CDR o las inmunoglobulinas pueden producirse por injerto en CDR o sustitución de CDR en la que pueden sustituirse una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.225.539; Jones y col., 1986, Nature, 321:552-525; Verhoeyan y col., 1988, Science, 239:1534; Beidler y col., 1988, J. Immunol., 141:4053-4060; y Winter, patente de EE.UU. 5.225.539.
35 Winter describe un procedimiento de injerto en CDR que puede usarse para preparar los anticuerpos de la presente invención (solicitud de patente de RU GB 2188638A presentada el 26 de marzo de 1987; Winter, patente de EE.UU. 5.225.539). Por ejemplo, todas las CDR de un anticuerpo particular pueden sustituirse con al menos una parte de una CDR humana (por ejemplo, una CDR del clon 3D8 como se muestra en la Tablas 1 y 2 y/o clon 124-152 como
40 se muestra en la Tablas 3 y 4, anteriormente) o sólo pueden sustituirse algunas de las CDR. Solo es necesario sustituir el número de CDR requerido para la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado (por ejemplo, una exotoxina de C. difficile).
Los anticuerpos humanizados pueden generarse reemplazando secuencias de la región variable Fv que no
45 participan directamente en la unión a antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Los procedimientos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L., 1985, Science, 229:1202-1207, por Oi y col., 1986, BioTechniques, 4:214, y por Queen y col., patente de EE.UU. 5.585.089, patente de EE.UU. 5.693.761 y patente de EE.UU. 5.693.762. Aquellos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican toda o parte de las regiones variables Fv de
50 inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tal ácido nucleico son muy conocidas para aquellos expertos en la materia y, por ejemplo, pueden obtenerse de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada como se ha descrito anteriormente. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, puede entonces clonarse en un vector de expresión apropiado. Otras técnicas para humanizar anticuerpos se describen en Padlan y col., documento EP 519596 A1 publicado el 23
55 de diciembre de 1992.
También están dentro del alcance de la invención anticuerpos en los que aminoácidos específicos han sido sustituidos, delecionados o añadidos. En particular, anticuerpos preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región estructural tales como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, un pequeño número seleccionado de 60 residuos de región estructural aceptora de la cadena de inmunoglobulina puede sustituirse con los aminoácidos donantes correspondientes. Las localizaciones preferidas de las sustituciones incluyen residuos de aminoácidos adyacentes a la CDR o que pueden interaccionar con una CDR (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.585.089). Los criterios para seleccionar aminoácidos del donante se describen en la patente de EE.UU. 5.585.089 (por ejemplo, columnas 12-16). La región estructural aceptora puede ser una secuencia de región estructural
65 humana de anticuerpo maduro o una secuencia consenso.
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Las pautas de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante el tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación 5 unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas de dosificación unitarias de la invención son dictadas por y dependen directamente de (a)
10 las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la materia del mezclado por incorporación de un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente eficaz de un
15 anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención es 0,1-60 mg/kg, por ejemplo, 0,5-25 mg/kg, 1-2 mg/kg o 0,75-10 mg/kg. Debe entenderse adicionalmente que para cualquier sujeto particular, pautas de dosificación específicas deberán ajustarse con el tiempo según las necesidades del individuo y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación expuestos en este documento solo son a modo de ejemplo y no pretenden limitar ni el alcance ni la práctica de la composición
20 reivindicada.
También están dentro del alcance de la invención kits que incluyen un anticuerpo anti-toxina B de la invención o porción de unión a antígeno del mismo. Los kits pueden incluir uno o varios elementos que incluyen: instrucciones para su uso; otros reactivos, por ejemplo, una marca, un agente terapéutico o un agente útil para quelar, o de otro
25 modo acoplar, un anticuerpo a una marca o agente terapéutico, u otros materiales para preparar el anticuerpo para su administración; vehículos farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto.
Las diversas combinaciones de anticuerpos pueden envasarse juntas. Por ejemplo, un kit puede incluir anticuerpos
30 que se unen a la toxina A (por ejemplo, anticuerpos que incluyen las regiones de cadenas pesadas y ligeras variables de anticuerpos 3D8) y anticuerpos de la invención que se unen a la toxina B, por ejemplo, 124-152, y opcionalmente otros anticuerpos que se unen a la toxina B (por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-toxina B humanos, por ejemplo, 2A11 y/o 1G10, o antisueros policlonales reactivos con la toxina B). Los anticuerpos pueden mezclarse juntos, o envasarse por separado dentro del kit.
35 Las instrucciones para su uso pueden incluir instrucciones para aplicación terapéutica que incluyen dosificaciones sugeridas y/o modos de administración, por ejemplo, en un paciente con un síntoma de CDAD. Otras instrucciones pueden incluir instrucciones sobre el acoplamiento del anticuerpo a un quelante, una marca o un agente terapéutico,
o para la purificación de un anticuerpo conjugado, por ejemplo, de componentes de conjugación sin reaccionar.
40 El kit puede incluir una marca detectable, un agente terapéutico y/o un reactivo útil para quelar o de otro modo acoplar una marca o agente terapéutico al anticuerpo. Los agentes de acoplamiento incluyen agentes tales como Nhidroxisuccinimida (NHS). En tales casos, el kit puede incluir uno o más de un recipiente de reacción para llevar a cabo la reacción o un dispositivo de separación, por ejemplo, una columna cromatográfica para su uso en la
45 separación del producto final a partir de materiales de partida o productos intermedios de reacción.
El kit puede contener adicionalmente al menos un reactivo adicional tal como un agente de diagnóstico o terapéutico, por ejemplo, un agente de diagnóstico o terapéutico como se describe en este documento y/o uno o más anticuerpos anti-toxina o anti-C. difficile adicionales (o porciones de los mismos), formulados según sea
50 apropiado, en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.
Otros kits pueden incluir ácidos nucleicos optimizados que codifican anticuerpos anti-toxina e instrucciones para la expresión de los ácidos nucleicos.
55 5. Procedimientos y composiciones terapéuticas
Las nuevas proteínas y anticuerpos tienen utilidades terapéuticas, profilácticas y de diagnóstico in vitro e in vivo. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden administrarse a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo. La invención también proporciona anticuerpos para su uso in vivo, para tratar, inhibir, prevenir recaída y/o diagnóstico de C.
60 difficile y enfermedad asociada a C. difficile en un sujeto.
Como se usa en este documento, el término “sujeto” pretende incluir animales humanos y no humanos. El término “animales no humanos” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos tales como primates no humanos, pollos, ratones, perros, gatos, cerdos, vacas y caballos.
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anticuerpos también pueden administrarse en combinaciones con una vacuna de C. difficile, por ejemplo, una vacuna de toxoide.
6. Otros procedimientos
5 Un anticuerpo anti-toxina (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar toxinas por técnicas convencionales tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, un anticuerpo anti-toxina puede usarse para detectar la toxina (por ejemplo, en una muestra de heces), por ejemplo, para cribar muestras para la presencia de C. difficile. Los anticuerpos anti-toxina pueden usarse diagnósticamente para monitorizar niveles de la toxina en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para, por ejemplo, determinar la eficacia de una pauta de tratamiento dada.
Ejemplificación
15 En todos los ejemplos se usaron los siguientes materiales y procedimientos, a menos que se establezca de otro modo.
Materiales y procedimientos
En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, tecnología de ADN recombinante, inmunología (especialmente, por ejemplo, tecnología de anticuerpos) y técnicas convencionales en la preparación de polipéptidos. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A
25 Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y col., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); y Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel y col., John Wiley & Sons (1992).
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos monoclonales anti-toxina A
35 La toxina A de C. difficile se obtuvo tanto de Techlab, Inc. (Blacksburg, Va) como por producción recombinante. La toxina se purificó y se inactivó antes de la inmunización. La inactivación se realizó mediante tratamiento con UDPdialdehído reactivo que produce la alquilación de residuos catalíticos a la vez que preserva la estructura de toxinas nativas. Para el protocolo detallado véase Genth y col., Inf and Immun. 68(3):1094-1101, 2000. Brevemente, la toxina A purificada se incubó con UDP-2',3'-dialdehído (0,1-10 mM) en tampón durante 18 horas a 37 ºC, se filtró a través de un filtro de 100 kDa de corte para eliminar el UDP-2',3'-dialdehído sin reaccionar y se lavó con tampón. La toxina A inactivada (toxoide A) se usó para la inmunización.
Ratones transgénicos HCo7, generados como se ha descrito anteriormente en la sección titulada “Generación de
45 anticuerpos monoclonales humanos en ratones HuMAb” y suministrados por Medarex, Milpitas, CA, se inmunizaron intraperitonealmente 6-12 veces cada uno con 10 µg de toxoide en adyuvante RIBI. En los ratones transgénicos HCo7, el gen de la cadena ligera kappa de ratón endógena se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chen y col. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen de la cadena pesada de ratón endógena se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la publicación PCT WO 01/09187. Los ratones transgénicos HCo7 llevan un transgén de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild y col., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, y el transgén de la cadena pesada humana de HCo7 como se describe en las patentes de EE.UU. nº 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. El suero se recogió de cada ratón y se sometió a ensayo para determinar la reactividad para la toxina A por ELISA y la neutralización de citotoxicidad en células IMR-90. A los ratones que dieron positivo para el antisuero reactivo para la toxina A y neutralizante se les
55 inyectaron 5-10 µg de toxoide A mediante la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron y los bazos se aislaron para la fusión con hibridomas aproximadamente 3 días después de realizarse la inyección en la vena de la cola.
Se generaron hibridomas clónicos y se cribaron por ELISA. Los porcentajes de los clones positivos para la cadena ligera kappa/gamma, específicos para antígeno y neutralizantes identificados cribando clones generados a partir de cuatro fusiones de hibridomas separadas se enumeran en la Tabla 5.
Tabla 5
Fusión
% de positivos para kappa/gamma % de específicos para antígeno % de neutralizantes
1
5,7 (94/1632) 3,4 (56/1632) 0,7 (12/1632)
2
0,2 (1/384) 0 (0/384) 0 (0/384)
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Estos resultados indican que los anticuerpos monoclonales anti-toxina A protegen de la enterotoxicidad mediada por toxina A in vivo. Los datos del asa ligada de ratón muestran que estos anticuerpos monoclonales pueden proteger de la lesión de la mucosa cuando se administran sistémicamente.
5 Ejemplo 7. Protección de hámsteres de la recaída de C. difficile con anticuerpos anti-toxina A
3D8 se probó en un modelo de recaída de hámster. Los hámsteres son sensibles a los efectos tóxicos de toxinas de
C. difficile y normalmente mueren en el transcurso de 2-3 días desde que recibieron una dosis única de clindamicina en presencia de C. difficile. Para probar la eficacia de 3D8 en hámsteres se usó un modelo de recaída. En este modelo, a los hámsteres se les administró una dosis de clindamicina y una dosis de esporas B1 de C. difficile un día después. Un conjunto de hámsteres de control no recibió antibiótico ni anticuerpo adicional. Un segundo conjunto de hámsteres de control se trató con 10 mg/kg/día de vancomicina. La vancomicina es un antibiótico usado en el tratamiento de enfermedad por C. difficile. Como se muestra en la Figura 11A, un conjunto de prueba de hámsteres recibió 10 mg/kg/día de vancomicina y 2 mg/kg/día de un antisuero policlonal de conejo producido contra la toxina A
15 cada día durante siete días después de la exposición a C. difficile como se indica por las flechas en la figura. Un segundo conjunto de prueba de hámsteres recibió 10 mg/kg/día de vancomicina y 50 mg/kg/día de 3D8 a los mismos intervalos de tiempo. La supervivencia de los hámsteres se representó frente al tiempo y se muestra en la Figura 11B.
La Figura 11B muestra que todos los hámsteres que sólo recibieron clindamicina y C. difficile (diamantes) murieron en el transcurso de dos días desde la exposición a las bacterias. El doce por ciento (2/17) de los hámsteres tratados con vancomicina (cuadrados) sobrevivió a la exposición a bacterias; el ochenta y ocho por ciento (15/17) murió en el transcurso de ocho días. El cuarenta y uno por ciento (7/17) de los hámsteres tratados con vancomicina y 3D8 (cruces) sobrevivieron a la exposición; el cincuenta y nueve (10/17) por ciento murió en el transcurso de siete días.
25 El sesenta y cuatro por ciento (7/11) de los hámsteres tratados con vancomicina y suero de conejo policlonal (triángulos) sobrevivieron a la exposición a bacterias; el treinta y seis por ciento (4/11) murió en el transcurso de nueve días. Estos datos también se representan en la Figura 12 el porcentaje de supervivientes totales en cada grupo de tratamiento. Como se muestra en la figura, el porcentaje de supervivientes fue el mayor (sesenta y cuatro por ciento) en el grupo que recibió vancomicina y suero de conejo policlonal. El grupo que recibió 3D8 y vancomicina tuvo la segunda tasa de supervivencia mayor (cuarenta y uno por ciento). Sólo sobrevivió el doce por ciento de los hámsteres tratados con vancomicina. Murieron todos aquellos sin tratamiento. Estos datos muestran que los anticuerpos anti-toxina policlonales y monoclonales protegen de la recaída de la enfermedad por C. difficile in vivo cuando se administran después de la infección.
35 Ejemplo 8. Producción de anticuerpos anti-toxina A para administración en seres humanos
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesadas y cadenas ligeras variables del anticuerpo 3D8 se clonaron en un vector pIE-Ugamma1F usando metodología convencional de ADN recombinante. El vector se amplificó en E. coli, se purificó y se transfectó en células CHO-dg44. Las células transfectadas se sembraron en placa a 4 x 105 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se seleccionaron para el vector transfección con G418. Un clon, designado 1D3, se seleccionó originariamente por la resistencia a G418, luego se ensayó junto con otros transfectomas para la producción de IgG. 1D3 tuvo un mayor nivel de producción de IgG con respecto a otros transfectantes durante varias rondas de expansión. La expresión del anticuerpo 3D8 se amplificó por crecimiento en presencia de concentraciones crecientes de metotrexato. Se eligió un cultivo que podía crecer en metotrexato 175
45 nM para clonar células individuales para el desarrollo adicional. La siembra del cultivo en placas de 96 pocillos a baja densidad permitió la generación de cultivos que se produjeron a partir de una única célula o clones. Los cultivos se cribaron para la producción de IgG humana, y la célula que produce el mayor nivel de IgG se seleccionó para su uso posterior. El clon amplificado por metotrexato se expandió para producir un banco de células que incluye múltiples viales congelados de células.
Para preparar anticuerpos de células transfectadas, las células de un clon aisladas de las etapas se cultivan y se expanden como un inóculo para un biorreactor. El biorreactor contiene normalmente un volumen de 500 litros de medio de cultivo. Las células se cultivan en el biorreactor hasta que cae la viabilidad celular, que indica que se ha producido una concentración máxima de anticuerpo en el cultivo. Las células se eliminan por filtración. El filtrado se
55 aplica a una columna de proteína A. Los anticuerpos se unen a la columna y se eluyen con un lavado a bajo pH. A continuación, los anticuerpos se aplican a una columna de Q-Sepharose para eliminar contaminantes residuales tales como proteínas de células CHO, ADN y otros contaminantes (por ejemplo, contaminantes víricos, si están presentes). Los anticuerpos se eluyen de la columna de Q-Sepharose, se nanofiltran, se concentran y se lavan en un tampón tal como PBS. Entonces, la preparación se separa asépticamente en alícuotas en viales para administración.
Ejemplo 9. Preparación y caracterización de anticuerpos policlonales anti-toxina B
A dos cabras nubias (nº 330 y nº 331) se les inyectaron intramuscularmente 50 µg de toxina B inactivada con UDP
65 dialdehído (Techlab) y adyuvante completo de Freund. Las dosis de refuerzo de 25 µg de toxoide B con adyuvante incompleto de Freund se administraron intramuscularmente a intervalos de dos semanas. Los sangrados de prueba
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