CN117720651A

CN117720651A - 抗艰难梭菌毒素b的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN117720651A
Application number: CN202311710319.9A
Authority: CN
Inventors: 周逸; 罗威
Original assignee: Beijing Bioneovan Co ltd
Current assignee: Beijing Bioneovan Co ltd
Priority date: 2023-12-13
Filing date: 2023-12-13
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2043-12-13
Also published as: CN117720651B

Abstract

本发明公开了一种抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体中，轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链CDR2的氨基酸序列为LVS，轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。上述抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，可以用于制备检测艰难梭菌毒素B的产品。

Description

抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗艰难梭菌毒素B(Tcd B)的单克隆抗体及其应用。

背景技术

艰难梭菌(Clostridium difficile，CD)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，对氧气非常敏感，在空气中暴露15-20min即可死亡。艰难梭菌最初于1935年被发现，但直到1978年才因为可引起抗生素相关性疾病而受到重视，目前被认为是人类重要的条件致病菌，是院内肠道感染的主要致病菌之一。艰难梭菌在健康人群中的携带率约为3％，在住院患者中随着住院时间延长和抗菌药物使用增加，携带率可达16～35％。长期服用抗生素导致肠道微生物菌群失调，使耐药艰难梭菌被筛选出来而大量生长，引起艰难梭菌感染(Clostridiumdifficile infection，CDI)。临床上约15～25％抗生素相关性腹泻，50～75％抗生素相关性结肠炎和95～100％伪膜性肠炎由CDI引起。CDI临床症状可表现为各种程度的腹泻、暴发性结肠炎、伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔和败血症、多器官功能障碍等。近年来，CDI发生频率和严重程度逐年增加，且感染人群趋于年轻化，感染场所也逐步转向院外和社区，成为一个重要的健康问题。

CDI诊断主要基于临床表现及实验室检查，目前艰难梭菌感染的实验室检测方法主要有便培养、产毒菌株培养、细胞毒素中和试验、核酸扩增实验、免疫测定法等。便培养为微生物学检测传统方法，但其周期较长，对厌氧条件要求较高，且无法鉴别菌株是否产毒，因而限制了其临床应用。产毒菌株培养(toxicgenic culture，TC)主要用于检测具有产毒素能力的CD菌株或芽孢，通常被认为是参考方法，更适用于流行病学调査、新方法的评估等用途。细胞毒性中和试验(cell culture cytotoxicity neutralization assay，CCCNA)直接检测粪便标本中的细胞毒素B，观察由细胞毒素引起的细胞病变，然后通过特异性抗血清中和试验确定细胞病变的特异性。CCCNA曾一度被作为CD检测的“金标准”，但其敏感度变异范围较大(65％～90％)，检测结果还受到诸如细胞系种类、从症状出现到进行检测之间的时间间隔、患者是否接受过抗菌药物治疗、便滤液标本制备的质量、标本转运时间等多种因素的影响，加之费用昂贵，操作繁琐，故而限制了其在临床实验室的开展。核酸扩增实验(NAAT)核酸扩增实验主要检测Tcd A，Tcd B和负向调控基因Tcd C以及二元毒素基因，具有灵敏度和特异度高的优点，可作为确证方法，但由于灵敏度过高，容易造成假阳性。艰难梭菌的免疫测定法包括谷氨酸脱氢酶(GDH)测定和毒素蛋白的测定。GDH在产毒和非产毒菌株中均有高水平表达，其测定具有很高的灵敏度和阴性预测值，可作为CDI的初筛试验。毒素的免疫测定方法从最初的只检测Tcd A到现在的同时检测Tcd A和Tcd B，具有检测时间短、操作相对简单等优点，是临床最常使用的方法。综合考虑各种方法的敏感性、特异性、费用、报告时间等因素，目前临床主要采用二步法或三步法进行艰难梭菌感染诊断。二步法即首先使用免疫法同步联合检测GDH、毒素A和毒素B，二者结果不一致时用核酸扩增进行验证。三步法是先用GDH免疫法或核酸扩增初筛，阳性时进行毒素A、毒素B免疫法检测，若免疫学试验阴性再用核酸扩增确认。

毒素B(～270kDa)是强细胞毒素，能引起剂量依赖性单层上皮组织跨膜电阻降低和渗透性增加，细胞间紧密连接结构破坏，使肠道黏膜细胞发生凋亡、变性、坏死、脱落。以往认为致病性艰难梭菌均产生毒素A和毒素B(A+B+型)，毒素A在毒素B的辅助下发挥毒性作用，但是近年来临床工作中陆续发现仅产生毒素B的艰难梭菌，即A-B+型，同样可引起医院感染性腹泻，且临床症状及结局与A+B+型CD无明显区别，可见毒素B可单独致病。到目前为止，临床上未见仅产生毒素A，即A+B-型艰难梭菌被报道。即所有致病性艰难梭菌均产生毒素B，但不一定都产生毒素A，因此检测毒素B对于艰难梭菌感染性疾病的诊断至关重要。与毒素A一样，毒素B的结构也可分为三个功能区：N-端酶活性区，中间转导区，C-端受体结合区(RBD)。RBD区同时具有高免疫活性，是毒素B免疫检测的主要靶区域。由于全长毒素B分子量很大且结构复杂，常用的大肠杆菌原核表达系统难以表达，导致抗体制备困难，限制了艰难梭菌毒素免疫检测试剂的研制。

目前，本领域中艰难梭菌毒素A和/或毒素B检测试剂盒对毒素B的最低检出限为0.16-2.5ng/mL，临床毒素检测的灵敏度为87.7-90.2％，存在约10％的漏检，延误患者治疗。为此，本发明采用提取制备的艰难梭菌毒素蛋白为免疫原免疫小鼠，采用原核表达的毒素B受体结合区进行筛选，制备高亲和力高特异性抗毒素B单克隆抗体；然后采用原核表达的毒素B受体结合区为免疫原制备多克隆抗体，并建立高灵敏高特异的艰难梭菌毒素B检测方法，最低检出限为0.125ng/mL，临床样本检测灵敏度为100％，有助于在临床诊断时减少漏检。

发明内容

为此，本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗艰难梭菌毒素B(Tcd B)单克隆抗体，并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别艰难梭菌毒素B，具有很好的特异性和亲和力，最低检出限为0.125ng/mL，临床样本检测灵敏度为100％，可特异性识别产毒型艰难梭菌，而与非产毒型艰难梭菌及其它多种肠道致病菌不发生交叉反应，可以用于检测艰难梭菌毒素B。

因此，本发明一个方面涉及一种抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，

所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；

所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列。

在进一步的方面中，本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。

本发明还涉及上述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段或单链抗体，这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，因此能够识别和结合艰难梭菌毒素B。

此外，本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。

另一方面，本发明涉及一种抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地，本发明涉及抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株AB1154，保藏号为CGMCC No.45750。

再一方面，本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测艰难梭菌的产品中的应用。进一步地，本发明涉及一种检测艰难梭菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，用于识别和结合艰难梭菌毒素B。

生物材料保藏说明

本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株：小鼠杂交瘤细胞株AB1154，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.45750，保藏日期为：2023年11月22日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。

附图说明

图1是显示艰难梭菌毒素粗提物中毒素B抗原WB鉴定图。

图2是显示原核表达艰难梭菌毒素B受体结合区抗原SDS-PAGE电泳图，其中M为Marker。

图3是显示原核表达艰难梭菌毒素B受体结合区抗原活性鉴定结果图，其中A为PBS，检测为阴性；B为毒素B受体结合区抗原，检测为“Tox”阳性。

图4是显示抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体和多克隆抗体识别特异性WB鉴定图。

图5是显示胶体金免疫层析法艰难梭菌毒素B检测结果。其中C线为质控对照线，T线显示艰难梭菌毒素B检测结果，S为加样孔；其中A为最低检出限检测结果，B为特异性检测结果；其中1为产毒型艰难梭菌ATCC43255，2为非产毒型艰难梭菌ATCC700057，3为致病性大肠埃希氏菌CICC10372，4为肠炎沙门氏菌CICC24119，5为小肠结肠炎耶尔森菌CICC10869，6为福氏志贺氏菌ATCC12022，7为鲍氏志贺氏菌CICC21680，8为金黄色葡萄球菌ATCC6538。

图6是显示抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154亚类鉴定结果图，经鉴定其为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体，该株抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体可以识别艰难梭菌毒素B。采用提取制备的艰难梭菌毒素蛋白为免疫原免疫小鼠，用原核表达的毒素B受体结合区抗原进行筛选，获得一株分泌识别毒素B受体结合区，最低检出限为0.125ng/mL，临床样本检测灵敏度为100％，可特异性识别产毒型艰难梭菌，而与非产毒型艰难梭菌及其它多种肠道致病菌不发生交叉反应的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为AB1154。本发明人于2023年11月22日将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.45750。

随后本发明人对该株小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体进行了测序和免疫球蛋白结构域序列分析，发现其轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，序列为：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGAPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为117个氨基酸，序列为：VQLQQSGAELVMPGASVRMSCKTSGYTFTDYLMHWVRQGPGQGLEWIGAIDPSGVYTTYNQKFKGKATLTVDESSSTAYIQLISLTSEDSAVYYCARGATVVAGDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.4)，其中CDR1位于25-32aa，氨基酸序列为GYTFTDYL(SEQ ID NO.5)；CDR2位于50-57aa，氨基酸序列为IDPSGVYT(SEQ IDNO.6)；CDR3位于96-106aa，氨基酸序列为ARGATVVAGDY(SEQ ID NO.7)。

本发明人通过酶联免疫法和胶体金免疫层析法针对上述单克隆抗体对艰难梭菌毒素B检测的亲和力和特异性进行测定，发现其最低检测限为0.125ng/mL，高于现有试剂的0.16～2.5ng/mL，临床样本检测灵敏度为100％，仅与产毒型艰难梭菌呈现毒素抗原阳性反应，与非产毒型艰难梭菌及其它多种致病菌没有交叉反应。

本领域众所周知，抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要氨基酸序列区，并且上述CDR区氨基酸序列中1个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的结构，因此上述区域内单个保守氨基酸替换仍有可能具备结合相应抗原的特性。因此，对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合艰难梭菌毒素B。在本发明专利申请中，保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换，例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换，脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换，极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换，碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换，酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换，以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。

本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备各种能够与艰难梭菌毒素B结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成，轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区，轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备，例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后，抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段。在胃蛋白酶的作用下，抗体IgG被降解为一个F(ab')₂片段和一个pFc'片段，F(ab')₂片段进一步被还原形成两个Fab'片段。因为上述抗原结合片段仍然能够结合相应的抗原，因此可以应用于制备检测艰难梭菌毒素B的产品。

本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体，其只有一条链，是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的，并且可以通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。如此制备的本发明的单链抗体具有结合艰难梭菌毒素B的特性，可以应用于艰难梭菌毒素B的检测中。

本领域技术人员能够基于上述的抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子，也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中，构建得到表达载体，该载体能够表达出抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体，并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段，如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别艰难梭菌毒素B，因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术，本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。

如上所述，本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合艰难梭菌毒素B，因此可以用于制备用于检测艰难梭菌或其毒素B的试剂盒，所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌毒素B结合反应的试剂盒，例如但不限于胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定、化学发光、免疫印迹、免疫组化类型的试剂盒。例如，在本发明申请中建立的以小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154作为包被抗体，以兔抗艰难梭菌毒素B受体结合区抗原的多克隆抗体作为检测抗体的双抗体夹心法和胶体金免疫层析检测试剂盒中，检测艰难梭菌毒素B的最低检测限达到0.125ng/mL，检测灵敏度非常高。通过下述实施例7的结果分析，高灵敏度检测是基于本发明的小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154的高亲和性和特异性实现的，因此也可以配合使用小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154作为包被抗体，其他抗艰难梭菌毒素B的单克隆或多克隆抗体作为检测抗体实现高灵敏度的检测。

为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例进行说明。

实施例1：艰难梭菌毒素的提取制备与鉴定

将商业化购买的艰难梭菌ATCC 43255培养液以8000g，4℃离心30min，取上清。缓慢加入研磨好的硫酸铵，使终浓度为60％，4℃，静置24h。8000g，4℃再次离心30min，取沉淀溶解于10ml 10mM Tris-HCl(pH7.5)中。将溶解液加入透析袋中，于500ml 10mM PBS(pH7.4)4℃透析，每6h换液，连续三次。用HiTrap DEAE FF层析柱进行纯化。用结合缓冲液10mM Tris-Cl(pH7.5)平衡柱子至基线稳定，将透析好的毒素样品上柱，流速0.5ml/min。用结合缓冲液洗涤柱子，流速0.5ml/min。用洗脱缓冲液10mM Tris-Cl，500mM NaCl，pH7.5洗脱，时间60min，流速0.5ml/min，收集洗脱液。将洗脱液采用超滤法进行浓缩获得艰难梭菌毒素粗提物，其蛋白含量为1.8mg/mL。

将毒素粗提物经8％的SDS-PAGE电泳分离，电泳完毕后取出凝胶进行转膜，条件为4℃，200mA电转移3.0小时；取出硝酸纤维素膜，用含5％脱脂奶粉的TBST室温下封闭1小时；加入购自abcam公司的小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗(货号ab77583，1:1000稀释)，4℃振荡孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:3000稀释)，室温下振荡孵育1h；TBST洗膜3次，化学发光显色(ECL)并拍照。结果如图1所示，可见毒素B阳性条带，表明所制备的艰难梭菌毒素粗提物中含有毒素B抗原。

实施例2：艰难梭菌毒素B受体结合区抗原的制备与抗原性鉴定

根据NCBI的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公布的艰难梭菌毒素B的全长核苷酸序列(GenBank：KC292162.1，7101bp，2366aa)设计扩增引物，正向引物为：5’-GCGGATCCCTTATGTCAACTAGTGAAGAA-3’(SEQ ID NO.8)，反向引物为：5’-GCGAATTCTTAAGCTGTATCAGGATCAAAATA-3’(SEQ ID NO.9)。以艰难梭菌ATCC43255菌株的基因组DNA为模板，扩增受体结合区1751-2366aa区段的编码基因。将纯化后PCR产物连接入pET-28a质粒(购自帛科生物公司，货号BK-P64467)，获得pET-B1751-2366重组质粒。将测序正确的重组表达质粒转化入感受态细胞，进行诱导表达和纯化，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析发现艰难梭菌毒素B受体结合区1751-2366aa抗原主要以上清形式表达，分子量约为70kDa，结果如图2所示。

采用雅培公司的艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒(国械注进20193402317)进行毒素B受体结合区抗原活性鉴定，具体步骤为将纯化后抗原用PBS稀释至浓度为1.0μg/mL，取25μl抗原溶液，加入50μl酶结合物和750μl稀释液，充分混匀。然后从中取500μl加入到反应板的样本孔，室温孵育反应板15min，再加入300μl清洗缓冲液到反应窗口中，让清洗缓冲液被彻底吸收。滴加100μl底物到反应窗口中，10min后观察并记录实验结果。结果判定：(1)阳性抗原和/或毒素结果：可看见“C”下的点状蓝色质控虚线和蓝色“Ag”线和/或“Tox”线。(2)阴性结果：“C”下出现点状蓝色质控虚线，而“Ag”和“Tox”不出现检测线。(3)无效结果：“C”下不出现点状蓝色质控虚线。结果如图3所示，图3A为PBS对照，仅出现质控线，为阴性反应；图3B为毒素B受体结合区抗原，在“Tox”检测区出现蓝色线，为艰难梭菌毒素阳性，说明本实验中原核表达的毒素B受体结合区抗原具有抗原活性，可以被试剂盒中的毒素B抗体所识别。

实施例3：抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的制备

取实施例1中制备的艰难梭菌毒素粗提物作为免疫原，采用8周龄BALB/c雌性小鼠，抗原加等量弗氏完全佐剂背部及腹腔注射小鼠(50μg/只)；第四周和第八周进行第2次和第3次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂，3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠，用75％酒精消毒体表3-5min，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，充分吸取上清，轻轻震荡离心管底部，振散细胞，在60秒内加入1mL预热过的50％ PEG融合细胞，边加边轻轻摇匀，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，37℃静置10min，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。具体方法为①碳酸盐包被缓冲液稀释原核表达的毒素B受体结合区抗原，浓度均为2.5μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次，200μl/孔；加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，200μl/孔。②每孔加入200μl样品稀释液后，分别加入10μl细胞培养上清，室温孵育30min，弃液。③用1×洗液洗板，每孔300μL，重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以去除多余的洗液。④加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体，室温孵育20min。⑤洗板5次。⑥加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温避光孵育10分钟。⑦加入2M H₂SO₄终止液50μL/孔，终止反应。⑧设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。

共获得3个OD值大于3.0的强阳性克隆，分别为AB1154、B3168和B5211，均可特异性识别艰难梭菌毒素B受体结合区抗原。

实施例4：抗艰难梭菌毒素B受体结合区抗原多克隆抗体的制备

取1.0mg原核表达的毒素B受体结合区抗原与1.0ml的弗氏完全佐剂混合，搅拌器彻底乳化后，在雄性大耳白兔脊柱两旁进行点皮下注射，每点注射0.2ml；4周后进行第二次免疫；8周后进行第三次加强免疫，用于制备多克隆抗体血清。以原核表达的艰难梭菌毒素B受体结合区抗原包被酶联板测定兔多克隆抗体血清效价为1:512000。多抗的纯化按照Millipore公司“Montage antibody purification prosep-G kit”(货号：LSK2ABG60)说明书进行，用磷酸盐缓冲液调整抗体浓度为2.0mg/mL。

实施例5：抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体和多克隆抗体鉴定

取单克隆抗体杂交瘤细胞株，用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，细胞密度为1×10⁷个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。2周后，收集腹水。以Thermo公司Melon GelMonoclonal IgG Purification Kit试剂盒(货号45214)进行抗体纯化，纯化的抗体分装后于-20℃保存。

取实施例1中制备的艰难梭菌毒素粗提物，经8％ SDS-PAGE电泳分离，电泳完毕后取出凝胶进行转膜，条件为4℃，200mA电转移3.0小时；取出PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的TBST室温下封闭1小时；分别加入抗毒素B单克隆抗体或多克隆抗体(1:2000稀释)，4℃振荡孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(1:3000稀释)，室温下振荡孵育1.5小时；TBST洗膜5次，化学发光显色(ECL)并拍照。结果如图4所示，单克隆抗体AB1154、B3168、B5211和多克隆抗体均可以特异性识别艰难梭菌毒素粗提物中的毒素B。

实施例6：Biocore动力学实验检测抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的亲和力

过BIACORE3000生物分子相互作用分析仪进行Biocore动力学实验分析3株抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154、B3168和B5211与艰难梭菌毒素B受体结合区抗原亲和力。抗体用磷酸盐缓冲液稀释后，以5μL/min速率通入抗体进行抗体绑定，通入时间为2min。随后将1mg/mL原核表达毒素B受体结合区抗原以30μl/min速率通入进行结合，通入时间均为8min。结合时间与解离时间相同。Biocore结合动力学实验数据如表1所示，ka表示结合速率常数，反应大分子间作用结合速度；kd表示解离速率常数，反应分子复合物解离速度；KD表示解离平衡常数(KD＝kd/ka)，一般KD值越小代表两者的亲和力越高。表1结果显示，解离平衡常数由小到大的顺序为AB1154<B5211<B3168，表明单克隆抗体对艰难梭菌毒素B受体结合区抗原的亲和力由高到低的顺序为AB1154>B5211>B3168。

表1单克隆抗体亲和常数

实施例7：酶联免疫法检测抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的检测灵敏度

分别以小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154、B3168或B5211作为包被抗体，以兔抗艰难梭菌毒素B受体结合区抗原多克隆抗体作为检测抗体，建立双抗体夹心法检测艰难梭菌毒素B受体结合区抗原，评价检测灵敏度。具体步骤为分别用小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体包被酶联板，浓度为2.0μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次，200μL/孔；加入110μL/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，200μL/孔。每孔加入100μL系列稀释的原核表达艰难梭菌毒素B受体结合区抗原，室温孵育2小时，弃液。用洗液洗板5次，每孔200μL。每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体，室温孵育45分钟。洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液A和B液各50μL，室温避光显色15分钟。每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液终止反应。10分钟内酶标仪测定每孔OD450 nm值。结果如表2所示，以0.15为Cutoff值，以AB1154单克隆抗体作为包被抗体时双抗体夹心检测艰难梭菌毒素B受体结合区抗原灵敏度最高，最低可检测浓度为0.125ng/mL，灵敏度高于现有商品化艰难梭菌毒素B检测试剂盒的毒素B检测灵敏度0.16～2.5ng/mL。

表2艰难梭菌毒素B酶联免疫检测方法检测灵敏度

实施例8：胶体金免疫层析法检测艰难梭菌毒素B

采用胶体金免疫层析技术，使用本发明单克隆抗体AB1154和多克隆抗体建立检测艰难梭菌毒素B的胶体金免疫层析检测方法。在硝酸纤维素膜上依次包被羊抗鼠IgG多克隆抗体(C线)、兔抗艰难梭菌毒素B受体结合区抗原多克隆抗体(T线)，在金标垫上固定胶体金标记的小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154。检测步骤为：将测试卡平放于干燥平面上，分别垂直而缓慢滴加100μL上述样品至测试卡加样孔中。5～15分钟判读结果，15分钟后判读无效。当待测样本滴加到检测卡的样本孔中时，如果样本中含有艰难梭菌毒素B抗原，则与胶体金标记的小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154结合形成免疫复合物。所形成的免疫复合物继续向前迁移，被硝酸纤维素膜上固定的兔抗艰难梭菌毒素B受体结合区抗原多克隆抗体(T线)所捕获，形成免疫复合物“小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154-艰难梭菌毒素B-兔抗艰难梭菌毒素B多克隆抗体”，形成紫红色的T线。无论样本中是否含有艰难梭菌毒素B，C线区域包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体均会与过量的小鼠抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体相结合，形成红色条带。

分别取浓度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625和0ng/mL的原核表达艰难梭菌毒素B受体结合区抗原；浓度为1×10⁷个菌/mL的产毒型艰难梭菌ATCC43255、非产毒型艰难梭菌ATCC700057、致病性大肠埃希氏菌CICC10372、肠炎沙门氏菌CICC24119、小肠结肠炎耶尔森菌CICC10869、福氏志贺氏菌ATCC12022、鲍氏志贺氏菌CICC21680和金黄色葡萄球菌ATCC6538菌液，上述细菌均可商业性购买获得；以及临床确诊为艰难梭菌感染患者的粪便样本50份进行检测。结果如图5所示，使用本发明单克隆抗体AB1154和多克隆抗体建立检测艰难梭菌毒素B的胶体金免疫层析检测方法的检测最低检测线同样为0.125ng/mL，且仅与产毒型艰难梭菌ATCC43255呈阳性反应，与非产毒型艰难梭菌ATCC700057、致病性大肠埃希氏菌CICC10372、肠炎沙门氏菌CICC24119、小肠结肠炎耶尔森菌CICC10869、福氏志贺氏菌ATCC12022、鲍氏志贺氏菌CICC21680和金黄色葡萄球菌ATCC6538呈阴性反应，对于50份临床确诊为艰难梭菌感染患者的粪便样本均检测为阳性，灵敏度为100％。表明本发明抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154可以用于艰难梭菌感染的检测，不与其他多种致病菌发生交叉反应，具有非常高的灵敏度和特异性。

实施例9：抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154亚型分析

采用小鼠抗体亚型快速检测卡(安泰吉(北京)生物技术有限公司，货号TFJ-ISO-M8A-20)鉴定小鼠抗体的重链和轻链亚型。按照说明书操作，首先将抗体稀释为1μg/mL，然后每孔加入100μl稀释好的抗体，静置5-10min后观察记录结果。结果如图6所示，抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154为小鼠IgG1亚型，抗体轻链为Igκ亚型。

实施例10：抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体AB1154可变区序列测定

Trizol法提取单克隆抗体AB1154小鼠杂交瘤细胞株总RNA，采用Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后，根据《重组抗体》(科学出版社，沈倍奋主编，2005年出版)中鼠单抗引物序列，设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的轻链和重链恒定区引物，扩增该抗体轻链和重链基因。PCR扩增程序为：95℃预热2分钟，进行30个循环(95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)，最后72℃延伸7分钟，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在NCBI网站BLAST的IgBLAST模块分析确定小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。

经序列分析后发现，轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGAPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为117个氨基酸，其序列如下：VQLQQSGAELVMPGASVRMSCKTSGYTFTDYLMHWVRQGPGQGLEWIGAIDPSGVYTTYNQKFKGKATLTVDESSSTAYIQLISLTSEDSAVYYCARGATVVAGDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO.4)，其中，CDR1位于25-32aa，氨基酸序列为GYTFTDYL(SEQ ID NO.5)；CDR2位于50-57aa，氨基酸序列为IDPSGVYT(SEQ IDNO.6)；CDR3位于96-106aa，氨基酸序列为ARGATVVAGDY(SEQ ID NO.7)。

Claims

1.一种抗艰难梭菌毒素B的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其特征在于，

2.根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为CGMCCNo.45750的小鼠杂交瘤细胞株AB1154分泌。

4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段或单链抗体。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。

7.一种重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。

8.一种分泌抗艰难梭菌毒素B单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株AB1154，保藏号为CGMCC No.45750。

9.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测艰难梭菌毒素B的产品中的应用。

10.一种检测艰难梭菌毒素B的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。