CN117700560B - 抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117700560B CN117700560B CN202311682993.0A CN202311682993A CN117700560B CN 117700560 B CN117700560 B CN 117700560B CN 202311682993 A CN202311682993 A CN 202311682993A CN 117700560 B CN117700560 B CN 117700560B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- clostridium difficile
- amino acid
- monoclonal antibody
- glutamate dehydrogenase
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 101000950981 Bacillus subtilis (strain 168) Catabolic NAD-specific glutamate dehydrogenase RocG Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 102000016901 Glutamate dehydrogenase Human genes 0.000 title claims abstract description 109
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 80
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 54
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 54
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 54
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 33
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 10
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 8
- 208000028235 central diabetes insipidus Diseases 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 8
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 241000648967 Clostridioides difficile ATCC 43255 Species 0.000 description 6
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 6
- 206010054236 Clostridium difficile infection Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 4
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 4
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 4
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 3
- 208000003100 Pseudomembranous Enterocolitis Diseases 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000874889 Euphilotes enoptes Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 2
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036649 Dysbacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027244 Dysbiosis Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 206010037128 Pseudomembranous colitis Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960001931 ampicillin sodium Drugs 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007140 dysbiosis Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 206010022694 intestinal perforation Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000008383 multiple organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 201000002516 toxic megacolon Diseases 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
- G01N2333/90605—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- G01N2333/90611—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general
- G01N2333/90616—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general with a definite EC number (1.4.1.-)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体中，轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链CDR2的氨基酸序列为KVS，轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。上述抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，可以用于制备检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
艰难梭菌(Clostridium difficile，CD)是一种革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，因培养艰难而得名，对氧气非常敏感，在空气中暴露15-20min即可死亡。艰难梭菌最初于1935年被发现，但直到1978年才因其可引起抗生素相关性疾病而受到重视，目前被认为是人类重要的条件致病菌，是院内肠道感染的主要致病菌之一。
艰难梭菌在健康人群中的携带率约为3％，在住院患者中随着住院时间延长和抗菌药物使用增加，携带率可达16-35％。长期服用抗生素导致肠道微生物菌群失调，使耐药的艰难梭菌被筛选出来而大量生长、增殖、定植，引起艰难梭菌感染(Clostridiumdifficile infection，CDI)。临床上约15-25％抗生素相关性腹泻，50-75％抗生素相关性结肠炎和95-100％伪膜性肠炎是由CDI引起。CDI临床症状表现可为各种程度的腹泻、暴发性结肠炎、伪膜性结肠炎、中毒性巨结肠、肠穿孔和败血症和/或多器官功能障碍。近年来，CDI发生频率和严重程度逐年增加，感染人群趋于年轻化，感染场所也逐步转向院外和社区，成为一个严重健康问题。
CDI诊断主要基于临床表现及实验室检查，目前艰难梭菌感染的实验室检测方法主要有便培养、产毒菌株培养(toxicgenic culture，TC)、细胞毒素中和试验(cellculture cytotoxicity neutralization assay，CCCNA)、免疫测定法、核酸扩增实验(NAAT)等。便培养为微生物学检测传统方法，但其周期较长，对厌氧条件要求较高，且无法鉴别菌株是否产毒，限制了其临床应用。产毒菌株培养主要用于检测具有产毒素能力的CD菌株或芽孢，通常被认为是参考方法，更适用于流行病学调査、新方法的评估等用途。细胞毒性中和试验直接检测便标本中的细胞毒素B，观察由细胞毒素引起的细胞病变，然后通过特异性抗血清中和试验确定细胞病变的特异性。CCCNA曾一度被作为CD检测的“金标准”，但由于其敏感度变异范围较大(65％～90％)，检测结果还受到诸如细胞系种类、从症状出现到进行检测之间的时间间隔、患者是否接受过抗菌药物治疗、便滤液标本制备的质量、标本转运时间等多种因素的影响，加之费用昂贵，操作繁琐，故而限制了本方法在临床实验室的开展。艰难梭菌的免疫测定法包括对谷氨酸脱氢酶(GDH)测定和对毒素蛋白的测定。GDH在产毒和非产毒菌株中均有高水平表达，与其他方法相比，GDH测定具有很高的灵敏度和阴性预测值，可作为CDI的筛查试验。对毒素的免疫测定方法具有检测时间短、操作相对简单等优点，从最初的只检测Tcd A到现在的同时检测Tcd A和Tcd B，是临床最常使用的方法。核酸扩增实验主要检测Tcd A，Tcd B和负向调控基因Tcd C以及二元毒素基因(cdt)，具有灵敏度和特异度高的优点，可作为确证方法。但由于灵敏度过高，容易造成假阳性(如无症状携带者)。综合考虑各种方法的敏感性、特异性、费用、报告时间等因素，目前许多专家和一些指南支持采用二步法或三步法进行艰难梭菌诊断。二步法即首先使用免疫法同步联合检测GDH和毒素A、毒素B，二者结果不一致时用核酸扩增进行验证。三步法是先用GDH免疫法或核酸扩增初筛，阳性时进行毒素A、毒素B免疫法检测，若免疫学试验阴性再用核酸扩增确认。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)是CD表面高效表达的抗原性酶蛋白，稳定性较强，在菌体中蛋白含量高于毒素，可作为粪便中CD存在的标志物。GDH检测耗时短，费用低，敏感性为90％，阴性预测值可达99％以上，GDH阴性即可排除CDI，阳性则需进一步进行毒素或毒素基因检测确证。目前，本领域中艰难梭菌谷氨酸脱氢酶免疫检测试剂盒的谷氨酸脱氢酶检测灵敏度为0.75-0.8ng/mL，作为初筛试剂仍会有部分假阴性，造成漏检。为了进一步提高检测灵敏度，本发明针对艰难梭菌谷氨酸脱氢酶制备高亲和力高特异性单克隆抗体，并建立了灵敏度显著高于现有试剂的高灵敏的GDH检测方法，有助于在初筛时减少漏检，避免延误治疗。
发明内容
为此，本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)单克隆抗体，并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别艰难梭菌GDH，与其他多种致病菌不发生交叉反应，与多克隆抗体一起使用对谷氨酸脱氢酶的检测灵敏度为0.25ng/mL，显著高于现有试剂，可以用于粪便样品中艰难梭菌谷氨酸脱氢酶检测。
因此，本发明一个方面涉及一种抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；
所述轻链CDR2的氨基酸序列为KVS或与序列KVS相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列；
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个保守氨基酸替换的氨基酸序列。
在进一步的方面中，本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
本发明还涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体，这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，因此能够识别和结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶。
此外，本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。另一方面，本发明涉及一种抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地，本发明涉及抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株AB9341，保藏号为CGMCC No.45751。
再一方面，本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测艰难梭菌的产品中的应用。进一步地，本发明涉及一种检测艰难梭菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，用于识别和结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶。
生物材料保藏说明
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株：小鼠杂交瘤细胞株AB9341，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.45751，保藏日期为：2023年11月22日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明
图1是显示原核表达艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原SDS-PAGE电泳图，其中各标号为：M为Marker；1为全菌体；2为包涵体；3为纯化后抗原。
图2是显示原核表达艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原活性鉴定结果图，其中A为PBS阴性对照；B为GDH抗原检测为“Ag”阳性。
图3是显示抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体和多克隆抗体活性WB鉴定图。
图4是显示胶体金免疫层析法检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶结果。其中图A为灵敏度检测图；图B为特异性检测图；C线为对照线，T线显示GDH检测线，S为加样孔；1为产毒型艰难梭菌ATCC43255，2为非产毒型艰难梭菌ATCC700057，3为致病性大肠埃希氏菌，4为肠炎沙门氏菌，5为小肠结肠炎耶尔森菌，6为福氏志贺氏菌，7为鲍氏志贺氏菌，8为金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体，该株抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体可以识别艰难梭菌谷氨酸脱氢酶。具体的制备过程为，以艰难梭菌全菌悬液作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，采用pET-28a载体原核表达艰难梭菌谷氨酸脱氢酶筛选单克隆抗体。筛选后获得一株表达高亲和力高特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为AB9341，其最低检测线为0.25ng/mL，仅与产毒型艰难梭菌和非产毒型艰难梭菌呈现GDH抗原阳性反应，与致病性大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌没有交叉反应，临床样本检测灵敏度为100％，表明本发明高亲和力高特异性的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体AB9341可以用于艰难梭菌感染的检测，具有非常高的灵敏度和特异性。本发明人于2023年11月22日将该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45751。
随后本发明人对小鼠杂交瘤细胞株CGMCC No.45751分泌的单克隆抗体进行测序和免疫球蛋白结构域序列分析，发现其轻链可变区氨基酸序列为：VMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1)，其中CDR1氨基酸序列为QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO.2)，CDR2氨基酸序列为KVS，CDR3氨基酸序列为SQSTHVPYT(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列：EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSHDMSWFRQTPEKGLEWVAYISSGGRT YYPDTVEGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCGRLDNWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4)，其中CDR1氨基酸序列为GFAFSSHD(SEQ ID NO.5)，CDR2氨基酸序列为ISSGGRT(SEQ ID NO.6)，CDR3氨基酸序列为GRLDN(SEQ ID NO.7)。
本发明人通过酶联免疫法和胶体金免疫层析法针对上述单克隆抗体对艰难梭菌谷氨酸脱氢酶检测的亲和力和特异性进行测定，发现其最低检测线为0.25ng/mL，显著高于现有试剂的0.7～0.8ng/mL，仅与产毒型和非产毒型艰难梭菌呈现GDH抗原阳性反应，与其它多种致病菌没有交叉反应，临床样本检测灵敏度为100％。
本领域众所周知，抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要氨基酸序列区，并且上述CDR区氨基酸序列中1个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的结构，因此上述区域内单个保守氨基酸替换仍有可能具备结合相应抗原的特性。因此，对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶。在本发明专利申请中，保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换，例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换，脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换，极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换，碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换，酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换，以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。
本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备各种能够与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成，轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区，轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备，例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后，抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段。在胃蛋白酶的作用下，抗体IgG被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段，F(ab')2片段进一步被还原形成两个Fab'片段。因为上述抗原结合片段仍然能够结合相应的抗原，因此可以应用于制备检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的产品。
本领域技术人员还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体，其只有一条链，是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的，并且可以通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。如此制备的本发明的单链抗体具有结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的特性，可以应用于艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的检测中。
本领域技术人员能够基于上述的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子，也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中，构建得到表达载体，该载体能够表达出抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体，并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段，如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别艰难梭菌谷氨酸脱氢酶，因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术，本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。
如上所述，本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶，因此可以用于制备用于检测艰难梭菌或其谷氨酸脱氢酶的试剂盒，所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶结合反应的试剂盒，例如但不限于胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定、化学发光、免疫印迹、免疫组化方法的试剂盒。
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例进行说明。
实施例1：艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原的制备与活性鉴定
根据NCBI的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公布的艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的全长核苷酸序列(GenBank：M65250.1，1266bp，421aa)设计GDH基因扩增的引物，上游引物为：5'-GCGGATCCTCAGGAAAAGATGTAA-3'(SEQ ID NO.8)；下游引物为：5'-GCGAATTCTTAGTACCATCCTCTTAATT-3'(SEQ ID NO.9)。以艰难梭菌ATCC43255菌株的基因组DNA为模板，扩增GDH全长基因，扩增条件为：95℃5min；95℃45s，58℃45s，72℃60s，共30个循环；再于72℃延伸5min。2％琼脂糖电泳鉴定，结果显示扩增片段的相对分子量约为1266bp。采用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点，将纯化后的PCR产物进行双酶切，连接入pET-28a质粒，获得pET-GDH重组质粒。将测序正确的重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，挑取单菌落于5mL含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于250mL新鲜的LB液体培养基中，培养至对数生长期，加150μl 1mol/L的IPTG诱导液，18℃诱导12-14h。4℃，6000rpm离心收集诱导后的菌体；用25mmol/L Tris-HCl(pH8.5)重悬菌体，超声波破碎，从表达菌中提取包涵体，将粗提的包涵体收集进行Ni柱纯化，首先用平衡缓冲液(25mmol/LTE、1％β-巯基乙醇、6mol/L脲，pH8.5)平衡Ni柱，将粗提的包涵体加入到Ni柱中，待样品完全进入后，用含25mmol/L、250mmol/L咪唑的洗涤液分别洗脱收集目的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，GDH抗原以包涵体形式表达，分子量约为46.3kDa，结果如图1所示。
采用美国TechLab公司的艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒进行GDH抗原活性鉴定，具体步骤为将纯化后GDH抗原稀释至浓度为1μg/mL，取25μl稀释后的抗原，加入50μl酶结合物和750μl稀释液，充分混匀。然后从中取500μl加入到反应板的样本孔，室温孵育反应板15min，再加入300μl清洗缓冲液到反应窗口中，让清洗缓冲液被彻底吸收。滴加100μl底物到反应窗口中，10min后观察并记录实验结果。结果判定：(1)阳性抗原和/或毒素结果：可看见“C”下点状蓝色质控虚线和蓝色“Ag”线和/或“Tox”线。(2)阴性结果：“C”下出现点状蓝色质控虚线，而“Ag”和“Tox”不出现检测线。(3)无效结果：“C”下不出现点状蓝色质控虚线。结果如图2所示，在Ag检测区出现蓝色线，结果表现为艰难梭菌GDH抗原阳性，说明本实验中原核表达的GDH抗原具有活性，可以与TechLab公司艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒中相应的抗体发生特异性反应。
实施例2：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备
采用8周龄BALB/c雌性小鼠进行常规免疫，共免疫4次，每隔3周免疫1次。第1次免疫，先用麦氏比浊管调整艰难梭菌ATCC43255菌株数量为1×109个菌/mL，取1.0mL菌悬液与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经腹股沟两侧和腹腔三点注射，每只0.3mL，菌量相当于6×108个菌/只。第2次和第3次免疫将菌悬液与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化后，经腹腔注射，每只0.5mL。第4次用菌悬液经腹腔注射进行加强免疫，3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞，培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血供阳性对照血清，同时颈脱位处死小鼠，用75％酒精消毒体表，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，充分吸取上清，轻轻震荡离心管底部，振散细胞，在60秒内加入1mL预热过的50％ PEG融合细胞，边加边轻轻摇匀，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合，37℃静置10min，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。具体方法为①碳酸盐包被缓冲液稀释原核表达的GDH抗原，浓度为2.5μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次；加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次。②每孔加入100μl样品稀释液后，分别加入10μl细胞培养上清，室温孵育30min，弃液。③洗版5次，将洗好的酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以去除多余的洗液。④加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体，室温孵育20min。⑤洗板5次。⑥加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温避光孵育10分钟。⑦加入2M H2SO4终止液50μL/孔，终止反应。⑧设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。
共获得4个阳性克隆，分别为ED9272、AB9341、BF1169和EA84810。
实施例3：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体的制备
选取健康的雄性大耳白兔，取1mg的pET-GDH重组质粒表达艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原与1ml的弗氏完全佐剂混合，搅拌器彻底乳化后，在大白兔脊柱两旁进行点皮下注射，每点注射0.2ml；4周后取1mg的蛋白与1ml的弗氏不完全佐剂，搅拌器彻底乳化后于上述部位选不同点进行第二次免疫；于4周后进行第三次加强免疫，用于制备多克隆抗体血清。1周后心脏取血，待血液凝固血块收缩后，5000rpm离心15分钟，将血清分装后置-20℃冰箱中保存备用。使用pET-GDH重组质粒表达艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原作为检测抗原包被酶联板，同样采用间接ELISA法检测纯化的兔抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体的效价，结果显示所制备的兔抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体的效价为1:512000。多抗经纯化后用磷酸盐抗体稀释液调整抗体浓度为1.0mg/mL。
实施例4：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体和多克隆抗体鉴定
取艰难梭菌ATCC43255菌株培养上清液，用蔗糖浓缩至约1/4体积。将培养上清液经10％ SDS-PAGE电泳分离，电泳完毕后取出凝胶进行转膜，条件为4℃，200mA电转移3.0小时；取出PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的TBST室温下封闭1小时；分别加入上述实施例2中制备的小鼠抗GDH单克隆抗体(1:1000稀释)和上述实施例3中制备的兔抗GDH多克隆抗体，4℃振荡孵育过夜；TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG(1:3000稀释)，室温下振荡孵育1h；TBST洗膜3次，化学发光显色(ECL)并拍照。结果如图3所示，四株单克隆抗体和多克隆抗体均可以特异性识别艰难梭菌ATCC43255菌株培养上清液中的天然GDH。
实施例5：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体亲和力鉴定
以实施例2制备的本发明小鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体作为包被抗体，实施例3制备的兔抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体作为检测抗体，建立双抗体夹心法检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶，评价单克隆抗体的亲和力。具体步骤为分别用小鼠抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体包被酶联板，浓度为2.0μg/mL，每孔包被100μL，4℃过夜；用洗液洗板2次；加入110μL/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，每孔加入100μL系列稀释的原核表达GDH抗原，37℃孵育60分钟，弃液。用洗液洗板5次，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的兔抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体，室温孵育60分钟。洗板5次，拍干，每孔加TMB显色液A和B液各50μL，室温避光显色15分钟。加入2M H2SO4终止液50μL/孔，终止反应。酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。结果如表1所示，以AB9341单克隆抗体作为包被抗体时双抗体夹心检测GDH抗原的检测灵敏度最高，最低检测限达到0.25ng/mL，显著高于美国TechLab公司艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原及毒素检测试剂盒(酶联免疫层析法)说明书标明的检测灵敏度0.8ng/mL。
表1抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶高亲和力单克隆抗体的筛选
实施例6：胶体金免疫层析法检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶
采用胶体金免疫层析技术，使用本发明制备的AB9341单克隆抗体和实施例3中制备的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶多克隆抗体建立检测艰难梭菌GDH的胶体金检测方法。在硝酸纤维素膜上C线处包被羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自珠海博美生物科技有限公司)，在T线处包被实施例3中制备的兔抗艰难梭菌GDH多克隆抗体，在金标垫上固定胶体金标记的本发明的小鼠抗艰难梭菌GDH单克隆抗体AB9341。
当待测样本滴加到检测卡的样本孔中时，该样本将在毛细作用下沿着检测卡向前移动。迁移到金标垫时，如果样本中含有艰难梭菌GDH抗原，则与胶体金标记的小鼠抗艰难梭菌GDH单克隆抗体AB9341结合形成免疫复合物。所形成的免疫复合物继续向前迁移，被硝酸纤维素膜上固定的兔抗艰难梭菌GDH多克隆抗体(T线)所捕获，形成“小鼠抗艰难梭菌GDH单克隆抗体AB9341-艰难梭菌GDH-兔抗艰难梭菌GDH多克隆抗体”免疫复合物，产生红色的T线。无论样本中是否含有艰难梭菌GDH，C线区域包被的羊抗鼠IgG均会与过量的小鼠抗艰难梭菌GDH单克隆抗体AB9341相结合，形成红色条带。
取浓度分别为50、10、5.0、1.0、0.5、0.25和0.125ng/mL的原核表达GDH抗原进行检测评价胶体金免疫层析法检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶灵敏度；取浓度为1×107个菌/mL的产毒型艰难梭菌ATCC43255、非产毒型艰难梭菌ATCC700057、致病性大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌菌液进行检测评价胶体金免疫层析法检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶特异性；另外取50例临床确诊艰难梭菌感染患者的粪便样本进行检测评价胶体金免疫层析法的检测性能。具体操作为：将测试卡平放于干燥平面上，分别垂直而缓慢滴加100μL上述样品至测试卡加样孔中。5～15分钟判读结果，15分钟后判读无效。实验结果如图4所示，结果显示使用本发明单克隆抗体AB9341和多克隆抗体建立检测艰难梭菌GDH的胶体金检测方法的检测最低检测线同样为0.25ng/mL；与产毒型艰难梭菌ATCC43255(4B1)和非产毒型艰难梭菌ATCC700057(4B2)均呈GDH抗原阳性反应，而与致病性大肠埃希氏菌、肠炎沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌(4B3～4B8)呈阴性反应；50例临床确诊艰难梭菌感染患者的粪便样本检测均为阳性，阳性率为100％，表明本发明高亲和力高特异性的抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体AB9341可以用于艰难梭菌感染的检测，具有非常高的灵敏度和特异性。
实施例7：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体AB9341亚型分析
取AB9341杂交瘤细胞株，用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，细胞密度为1×107个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL。2周后，收集腹水。以Thermo公司Melon GelMonoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化，纯化的抗体分装后于-20℃保存。采用Pierce Papid Isotyping Kit-Mouse试剂盒抗体亚型鉴定，首先用样本稀释液将抗体稀释为100ng/mL，然后每孔加入150μl稀释好的抗体，5-10min后观察记录结果。结果显示除对照C线之外仅在G1处有明显红色条带，表明此单克隆抗体为小鼠IgG1亚型。
实施例8：抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体AB9341可变区序列测定
培养小鼠杂交瘤细胞株AB9341，Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，逆转录cDNA后，采用由北京擎科生物科技有限公司合成的小鼠单克隆抗体Fab段引物序列进行PCR扩增，95℃预热2min，以95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒进行30个循环，最后72℃延伸5min，连接pMD18-T载体，大肠杆菌JM109表达，挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在NCBI网站BLAST模块中的IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。
经序列分析后发现，轻链可变区氨基酸序列为110个氨基酸，其序列如下：VMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1)，其中CDR1位于25-35aa，氨基酸序列为QSLVHSNGNTY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于53-55aa，氨基酸序列为KVS；CDR3位于92-100aa，氨基酸序列为SQSTHVPYT(SEQ ID NO.3)。
重链可变区氨基酸序列为110个氨基酸，其序列如下：EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSHDMSWFRQTPEKGLEWVAYISSGGRT YYPDTVEGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCGRLDNWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4)，其中CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFAFSSHD(SEQ IDNO.5)；CDR2位于51-57aa，氨基酸序列为ISSGGRT(SEQ ID NO.6)；CDR3位于96-100aa，氨基酸序列为GRLDN(SEQ ID NO.7)。
Claims (10)
1.一种抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其特征在于，
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列；
所述轻链CDR2的氨基酸序列为KVS；
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列；
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列；
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列；且
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列。
2. 根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为CGMCC No.45751的小鼠杂交瘤细胞株AB9341分泌。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8. 一种分泌抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株AB9341，保藏号为CGMCC No.45751。
9.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的产品中的应用。
10.一种检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311682993.0A CN117700560B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311682993.0A CN117700560B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117700560A CN117700560A (zh) | 2024-03-15 |
| CN117700560B true CN117700560B (zh) | 2024-05-31 |
Family
ID=90149104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311682993.0A Active CN117700560B (zh) | 2023-12-08 | 2023-12-08 | 抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117700560B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965375A (en) * | 1997-04-04 | 1999-10-12 | Biosite Diagnostics | Diagnostic tests and kits for Clostridium difficile |
| CN109336979A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-15 | 宁夏医科大学 | 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用 |
| CN112661849A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-16 | 杭州贤至生物科技有限公司 | 一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用 |
| CN116239683A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-06-09 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗艰难梭菌毒素b的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| CN116693681A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-09-05 | 北京新兴四寰生物技术有限公司 | 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 |
-
2023
- 2023-12-08 CN CN202311682993.0A patent/CN117700560B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5965375A (en) * | 1997-04-04 | 1999-10-12 | Biosite Diagnostics | Diagnostic tests and kits for Clostridium difficile |
| CN109336979A (zh) * | 2018-11-16 | 2019-02-15 | 宁夏医科大学 | 一种艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的纳米抗体、编码序列及其筛选方法和应用 |
| CN112661849A (zh) * | 2020-12-17 | 2021-04-16 | 杭州贤至生物科技有限公司 | 一种艰难梭菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法和应用 |
| CN116239683A (zh) * | 2023-02-15 | 2023-06-09 | 兰州生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗艰难梭菌毒素b的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| CN116693681A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-09-05 | 北京新兴四寰生物技术有限公司 | 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Antigen-Specific vs. Neutralizing Antibodies Against Conditioned Media of Patients With Clostridioides difficile Infection: A Prospective Exploratory Study;Sophie Roth等;Front Microbiol;20220224;第13卷;第1-9页 * |
| 艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的表达及抗原性分析;王建霞等;军事医学;20160925;第40卷(第9期);第710-712、732页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117700560A (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116693681B (zh) | 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 | |
| JP2003511697A (ja) | 便中の酸耐性微生物を検出するためのイムノクロマトグラフィー迅速試験 | |
| CN110616192B (zh) | 一种抗人神经丝轻链(nefl)的单克隆抗体及其应用 | |
| CN115724958B (zh) | 抗诺如病毒gⅱ基因组衣壳蛋白vp1的单克隆抗体及其应用 | |
| EP0461180A1 (en) | Development of a monoclonal antibody based detection system for listeria monocytogenes | |
| CN116355091A (zh) | 一种抗人神经丝轻链的单克隆抗体21d2-30d3及其产品和应用 | |
| CN104745534B (zh) | 一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2h4及单克隆抗体 | |
| CN109180810A (zh) | 特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白和/或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| CN116836940B (zh) | 一种氧化低密度脂蛋白的单克隆抗体及分泌其单克隆抗体的杂交瘤细胞株与应用 | |
| CN117700560B (zh) | 抗艰难梭菌谷氨酸脱氢酶的单克隆抗体及其应用 | |
| NO174153B (no) | Antigen og monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro,samt immunologiske reagenser inneholdende disse | |
| Eisenstein et al. | Isolation and characterization of a monoclonal antibody directed against type 1 fimbriae organelles from Escherichia coli | |
| CN117720651B (zh) | 抗艰难梭菌毒素b的单克隆抗体及其应用 | |
| KR101851332B1 (ko) | 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트 | |
| CN117700540A (zh) | 抗艰难梭菌毒素a的单克隆抗体及其应用 | |
| KR101806522B1 (ko) | 병원성 대장균에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트 | |
| CN118393137B (zh) | 一种肠道保护菌的检测试剂盒及其应用 | |
| EP0915158A2 (en) | Improvements in or relating to detection of salmonella | |
| CN118406142A (zh) | 抗a族链球菌m蛋白保守表位肽的单克隆抗体及其应用 | |
| CN116769040B (zh) | 鼠抗gdh杂交瘤细胞株，单克隆抗体及应用 | |
| CN116655802B (zh) | 类鼻疽菌Hcp1蛋白的融合蛋白、单克隆抗体、杂交瘤细胞株及用途 | |
| US20230296605A1 (en) | Antibody for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof | |
| TWI527903B (zh) | 肉毒桿菌ａ型毒素融合瘤細胞株、其單株抗體、及包含該單株抗體的免疫檢測試劑及套組 | |
| CN115991766A (zh) | 一种细菌抗原检测试剂盒及其应用 | |
| CN118791620A (zh) | 抗糖原磷酸化酶gpbb单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |