CN116693681A - 抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白a的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体中，轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链CDR2的氨基酸序列为LVS，轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。上述抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力，可以用于制备检测幽门螺杆菌的产品和制备治疗幽门螺杆菌感染的产品。

Description

抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(Cag A)的单克隆抗体及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌是伴随人类历史较长的感染细菌之一，在人类各种传染病病原体中，其感染造成的人群规模之大、持续时间之久都十分惊人。幽门螺杆菌全球感染率约为50％(18.9％～87.7％)，在不同地域、不同人群感染率有较大差异。中国幽门螺杆菌人群感染率近50％，不同人群感染率在35.4％～66.4％之间，属于高感染地区，农村感染率高于城市，成人感染率高于儿童。人类是幽门螺杆菌感染的唯一自然宿主，传播途径主要包括“口-口”传播和“粪-口”传播。幽门螺杆菌感染一般具有慢性、持续性特征，并通过与宿主因素、环境因素交互作用引发多种相关疾病，包括消化道和消化道外疾病，其中最常见的包括胃炎、消化不良、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、胃癌，以及免疫性血小板减少性紫癜、不明原因的缺铁性贫血等。
然而，大多数感染幽门螺杆菌的人没有明显临床症状，据统计，大约仅不到0.01％幽门螺杆菌感染者发展为MALT，0.1％～3％发展为胃癌，1％～10％发展为消化性溃疡，10％～15％将发展为幽门螺杆菌相关其他疾病，而在上述疾病的发生发展过程中，毒力因子Cag A和Vac A起到了关键性的作用。所有Hp菌株都含有vacA基因，但只有约65％菌株表达相应毒素；大约有60％Hp菌株含有cagA基因，但一般都表达相应蛋白。Vac A和Cag A是两种既独立又有相关性的蛋白，通常表达Vac A的Hp菌株也表达Cag A，而只有vacA基因，没有cagA基因的Hp菌株则既不会表达CagA也不会产生Vac A。现在普遍根据Hp菌株cagA和vacA及其相应蛋白表达的有无将Hp菌株分成两型：I型，含cagA基因，可表达Cag A蛋白和Vac A毒素，此型为高毒力株；Ⅱ型，不含cagA基因，不表达Cag A蛋白和Vac A毒素，此型为低毒力株。因此，是否表达Cag A蛋白是Hp分型的关键依据，Cag A蛋白可独立起作用，且作用相当重要。在西方国家分离的幽门螺杆菌菌株约60％为Cag A阳性，而几乎所有的东亚型幽门螺杆菌菌株都是Cag A阳性。我国胃癌患者中幽门螺杆菌感染以东亚型CagA阳性菌株为主，有研究报道Cag A阳性Hp感染者患胃癌的危险是Cag A阴性Hp感染者的7.4倍，表明感染Cag A阳性Hp是胃癌发生的危险因素之一。
幽门螺杆菌根除治疗可能带来的问题主要包括肠道菌群失调、胃肠功能一过性调整、人群抗生素耐药率增加、相应费用支出负担增加等，因此对于是否进行根除治疗，临床专家常结合患者具体情况，做出个性化具体判断，而所感染Hp是否为致病性更高的毒株(高毒株)也是临床专家判断的重要依据之一。
幽门螺杆菌感染的诊断技术根据原理可分为抗原-抗体检测技术、基因检测技术、幽门螺杆菌表型特征相关检测技术。其中，粪便Hp抗原检测是一类被普遍接受的幽门螺杆菌现症感染诊断技术，但不同试剂间质量差异较大，其中检测准确度的差异主要与所用抗体的特异性和亲和力有关。另外，目前获得批准用于幽门螺杆菌感染检测的粪便Hp抗原检测试剂的检测靶标以尿素酶和鞭毛蛋白为主，这两种靶标均为所有Hp共有蛋白，只能确定是否为Hp现症感染，不能区分是否为Hp高毒株感染。
为了弥补以上不足，本发明将针对Hp高毒株特异表达的细胞毒素相关蛋白Cag A制备高亲和力高特异性单克隆抗体，在保证检测灵敏度和特异性的同时，增加高毒株鉴别功能，给幽门螺杆菌感染诊断、临床治疗方案确定和治疗效果评估提供重要依据。
发明内容
为此，本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A(Cag A)单克隆抗体，并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，具有很好的特异性和亲和力，可以用于检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，或者用于制备治疗幽门螺杆菌感染的产品。
因此，本发明一个方面涉及一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其中，
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列。
在进一步的方面中，本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
本发明还涉及上述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体，这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区，因此能够识别和结合幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A。
此外，本发明还涉及包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的一种核酸分子，以及包含上述核酸分子的表达载体，所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体，其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本发明涉及一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地，本发明涉及抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株3E4514，保藏号为CGMCC No.45620。
再一方面，本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测幽门螺杆菌或治疗幽门螺杆菌感染的产品中的应用。进一步地，本发明涉及一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段，用于识别和结合幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A。
生物材料保藏说明
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株：小鼠杂交瘤细胞株3E4514，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.45620，保藏日期为：2023年6月7日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明
图1是显示免疫用和筛选用原核表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗原SDS-PAGE电泳图，其中各标号为：M为Marker；1为pET-CagA重组质粒表达抗原全菌体；2为pET-CagA重组质粒表达抗原菌体上清；3为pET-CagA重组质粒表达抗原包涵体沉淀；4为pGEX-CagA重组质粒表达抗原全菌体；5为pGEX-CagA重组质粒表达抗原菌体上清；6为pGEX-CagA重组质粒表达抗原包涵体沉淀；
图2是显示抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体亚类鉴定结果图，经鉴定抗体亚型为IgG1。
图3是显示幽门螺杆菌鞭毛蛋白和细胞毒素相关蛋白胶体金免疫层析联合检测方法结果示意图。其中C线为质控对照线，T 1线显示幽门螺杆菌鞭毛蛋白检测结果，T 2线显示幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A检测结果。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体，该株抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体可以识别幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A。以pET-28a载体原核表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的N末端相对保守区作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体，采用pGEX-4T-1载体原核表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株。筛选后获得一株表达高亲和力高特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，命名为3E4514。2023年6月7日将该细胞株进行于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.45620，保藏日期为2023年6月7日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
本发明人对该株小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体进行了测序，单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISYRASKSVSTSG YSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEEAPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为115个氨基酸，其序列如下：EVKLVESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMSWVRQTPEKRLEWVASVSGRNTPFYPDSVKGRFTISRDNARHILYLQMSSLRSEDTAMYYCACGFESPYDYWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFTFNTYA(SEQID NO.5)；CDR2位于51-57aa，氨基酸序列为VSGRNTP(SEQ ID NO.6)；CDR3位于96-105aa，氨基酸序列为ACGFESPYDY(SEQ ID NO.7)。经测定，上述单克隆抗体对幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A具有高特异性和高亲和力。
众所周知，抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要序列，并且氨基酸序列中1个或2个保守氨基酸替换一般不会改变蛋白质的性质。因此，对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个或2个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A。保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换，例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换，脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换，极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换，碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换，酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换，以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。
此外，本领域众所周知，抗体或其抗原结合片段中，轻链或重链各CDR之外为骨架区，CDR序列与骨架区序列之间增加少数氨基酸，例如增加1个或2个氨基酸对抗体或其抗原结合片段的立体结构影响较小，因此仍然可以识别和结合相应抗原。因此，本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR1序列除了是SEQ ID NO.2所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列。同样地，本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR2序列除了是序列LVS或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列；本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR3序列除了是SEQ ID NO.3所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列；本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR1序列除了是SEQ ID NO.5所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列，本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR2序列除了是SEQ IDNO.6所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列；本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR3序列除了是SEQ ID NO.7所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外，还可以是包含上述序列的序列。
还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备各种能够与幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A结合的各种抗体片段，即抗原结合片段，例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域，由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成，轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区，轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备，例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后，抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段。在胃蛋白酶的作用下，抗体IgG被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段，F(ab')2片段进一步被还原形成两个Fab'片段。上述抗原结合片段可以应用于制备检测幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的产品和治疗幽门螺杆菌患者的治疗产品。
还可以通过本领域现有技术，从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体，其只有一条链，是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的，并且可以通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。单链抗体分子量小、穿透力强并且抗原性弱等优点，可以应用于幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的检测、幽门螺杆菌感染患者的诊断和治疗产品中。
可以通过本领域的现有技术，将本发明的单克隆抗体的轻链恒定区和重链恒定区替换成人抗体氨基酸序列，从而使本发明的鼠单克隆抗体进行人源化改造得到人源化抗体，以便用于对人幽门螺杆菌患者进行抗体治疗，以减少鼠源抗体对人机体的免疫副反应。因此本发明的人源化单克隆抗体可以应用于幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的检测、幽门螺杆菌感染患者的诊断和治疗产品中。
本领域技术人员能够基于上述的抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子，也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中，构建得到表达载体，该载体能够表达出抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体，并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段，如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术，本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。
如上所述，本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，因此可以用于制备用于检测幽门螺杆菌或其细胞毒素相关蛋白A的试剂盒，所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A结合反应的试剂盒，例如但不限于胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定、化学发光、免疫组化类型的试剂盒。
由于本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，因此所述抗体或其抗原结合片段或者人源化抗体可以用于制备治疗幽门螺杆菌感染的产品，例如药物。治疗可以是例如但不限于抗体治疗和靶向治疗。在抗体治疗中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体与幽门螺杆菌分泌的细胞毒素相关蛋白A相结合，从而消除或者降低细胞毒素相关蛋白A的毒性作用，从而获得治疗效果。在靶向治疗中，本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体与幽门螺杆菌治疗药物进行偶联，通过本发明的抗体或其抗原结合片段或人源化抗体将所偶联药物靶向至幽门螺杆菌，从而提高治疗效果。
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例进行说明。
实施例1：筛选用和免疫用幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A抗原的制备
从NCBI的Genebank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载公布的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的氨基酸序列(登录号AB017921.1)，全长1227个氨基酸，选择序列相对较为保守的N末端1-540氨基酸区段，分别采用原核表达质粒pET-28a和pGEX-4T-1进行原核表达，表达的基因工程抗原分别作为抗体筛选用抗原和免疫用抗原。
由北京擎科新业生物技术有限公司合成幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白N末端1-540氨基酸区段的编码基因，采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，通过双酶切，将细胞毒素相关蛋白N末端1-540氨基酸区段的编码基因分别插入同样经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pET-28a质粒和pGEX-4T-1质粒中，获得pET-CagA重组质粒和pGEX-CagA重组质粒。将测序正确的重组表达质粒转化入BL21感受态细胞，挑取单菌落于3mL含氨苄西林钠的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日接种于250mL新鲜的LB液体培养基中，37℃、160rpm培养4h至对数生长期，加150μl 1mol/L的IPTG诱导液，18℃诱导12-14h。4℃，6000rpm离心10min收集诱导后的菌体；用25mmol/L Tris-HCl(pH8.5)重悬菌体，冰浴超声；4℃，12000rpm离心10min收集上清备用。进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析发现pET-CagA和pGEX-CagA表达的细胞毒素相关蛋白N末端1-540氨基酸区段抗原均主要以包涵体形式表达，分子量分别约为60kDa和90kDa，结果如图1所示。
将pET-CagA重组质粒表达抗原经Ni柱进行纯化，pGEX-CagA重组质粒表达抗原经GST柱进行纯化，分别收集蛋白峰，SDS-PAGE电泳分析纯化产物，利用Gel-ProR AnalyzerVersion 3.0软件分析纯化后重组表达抗原的纯度，pET-CagA重组质粒表达抗原纯度为96.89％，pGEX-CagA重组质粒表达抗原纯度为97.43％。
实施例2：抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体的制备
取纯化后pGEX-CagA重组质粒表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的N末端1-540氨基酸区段作为免疫原，采用8周龄BALB/c雌性小鼠，优势表位抗原加等量弗氏完全佐剂背部及腹腔注射小鼠(50μg/只)；第四周和第八周进行第2次和第3次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂，3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞，培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血供阳性对照血清，同时颈脱位处死小鼠，用75％酒精消毒体表3-5min，取其脾脏，制备脾细胞悬浮液。
取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5：1的比例，在无血清的DMEM培养基中混匀，1500rpm离心5分钟，充分吸取上清，轻轻震荡离心管底部，振散细胞，在45-60秒内加入1mL预热过的50％ PEG融合细胞，边加边轻轻摇匀，加完后静置90秒，加入无血清的DMEM培养基终止融合(第一分钟加1mL，第二分钟加2mL，第三分钟加8mL)，37℃静置10min，1500rpm离心5分钟，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃、5％ CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HAT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，采用间接ELISA法筛选阳性克隆。具体方法为①碳酸盐包被缓冲液稀释pET-CagA重组质粒表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白N末端1-540氨基酸区段，浓度为2.5μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次，200μl/孔；加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，200μl/孔。②每孔加入200μl样品稀释液后，分别加入10μl细胞培养上清，室温孵育30min，弃液。③用1×洗液洗板，每孔300μL，重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上，用力拍打以去除多余的洗液。④加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体，室温孵育20min。⑤洗板，操作同步骤3。⑥加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温避光孵育10分钟。⑦加入2M H2SO4终止液50μL/孔，终止反应。⑧设定酶标仪检测波长450nm，测定每孔OD值，终止后10分钟内读值。
共获得12个阳性克隆，选择其中检测值最高(OD450nm＝3.375)的克隆株进行后续实验，定名为小鼠杂交瘤细胞株3E4514。
实施例3：抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体的制备
选取健康的雄性大耳白兔，取1mg的pET-CagA重组质粒表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的N末端1-540氨基酸区段作为免疫原与1ml的弗氏完全佐剂混合，搅拌器彻底乳化后，在大白兔脊柱两旁进行点皮下注射，每点注不少于0.1ml；4周后取1mg的蛋白与1ml的弗氏不完全佐剂，搅拌器彻底乳化后于上述部位选不同点进行第二次免疫；于4周后进行第三次加强免疫，用于制备多克隆抗体血清。1周后心脏取血，待血液凝固血块收缩后，5000rpm离心15分钟，将血清分装后置-20℃冰箱中保存备用。多抗的纯化按照“Montageantibody purification prosep-G kit”说明书进行，用磷酸盐抗体稀释液调整抗体浓度为1.0mg/mL。使用pGEX-CagA重组质粒表达幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白N末端1-540氨基酸区段作为检测抗原包被酶联板，采用间接ELISA法检测纯化的兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体的效价。
用碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释成浓度为2.5μg/mL，每孔包被100μl，4℃过夜；用洗液洗板2次，每孔200μl；每孔加入100μl封闭液室温封闭6小时；用洗液洗板5次，每孔200μl；用抗体稀释液稀释浓度为1.0mg/mL的兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体，稀释比例为1:2000、1:8000、1:32000、1:128000、1:256000、1:512000和1:1024000，以每孔100μl加样并设置空白孔(100μl抗体稀释液)；37℃孵育30min；用洗液洗板5次，每孔200μl；HRP标记的羊抗兔二抗37℃孵育20min；用洗液洗板5次，每孔200μl；加新鲜配制的底物溶液，每孔100μl，37℃孵育10分钟；每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应，采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值，终止后10分钟内读值。结果如表1所示，所制备的兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体的效价为1:512000(OD值＝0.302)。
表1兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体的效价测定
稀释比例 1:2000 1:8000 1:32000 1:128000 1:256000 1:512000 1:1024000
OD值 3.522 3.179 2.431 1.294 0.558 0.302 0.127
实施例4：抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514制备及其亚型分析
取3E4514杂交瘤细胞株，用含10％胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞，用10mL生理盐水重悬细胞，每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×107个/mL)。2周后，收集腹水。以Thermo公司Melon GelMonoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化，纯化的抗体分装后于-20℃保存。
采用Pierce Papid Isotyping Kit-Mouse试剂盒抗体亚型鉴定，首先用样本稀释液将抗体稀释为100ng/mL，然后每孔加入150μl稀释好的抗体，5-10min后观察记录结果。结果显示除对照C线之外仅在G1处有明显红色条带，表明此单克隆抗体为小鼠IgG1亚型，如图2所示。
实施例5：抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体可变区序列测定
培养小鼠杂交瘤细胞株3E4514，Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后，根据《重组抗体》(科学出版社，沈倍奋主编，2005年出版)中鼠单抗引物序列，设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的重轻链引物，PCR扩增(扩增程序为：95℃预热1min，进行30个循环(95℃30秒，58℃30秒，72℃45秒)，最后72℃延伸5min)，连接pMD18-T载体，大肠杆菌JM109表达，挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。
经序列分析后发现，轻链可变区氨基酸序列为109个氨基酸，其序列如下：DIVLTQSPASLAVSLGQRTTISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEEAPSWKS(SEQ ID NO.1)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于27-36aa，氨基酸序列为KSVSTSGYSY(SEQ ID NO.2)；CDR2位于54-56aa，氨基酸序列为LVS；CDR3位于93-100aa，氨基酸序列为QHIRELTR(SEQ ID NO.3)。
重链可变区氨基酸序列为115个氨基酸，其序列如下：EVKLVESGGALVKPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMSWVRQTPEKRLEWVASVSGRNTPFYPDSVKGRFTISRDNARHILYLQMSSLRSEDTAMYYCACGF ESPYDYWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4)，其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1位于26-33aa，氨基酸序列为GFTFNTYA(SEQ ID NO.5)；CDR2位于51-57aa，氨基酸序列为VSGRNTP(SEQ ID NO.6)；CDR3位于96-105aa，氨基酸序列为ACGFESPYDY(SEQ ID NO.7)。
实施例6：幽门螺杆菌鞭毛蛋白和细胞毒素相关蛋白联合检测方法建立
采用胶体金免疫层析技术，使用本发明高亲和力高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体建立联合检测人粪便样本中细胞毒素相关蛋白A和幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原的胶体金检测方法。在硝酸纤维素膜上依次包被羊抗鼠IgG多克隆抗体(菲鹏生物股份有限公司)(C线)、兔抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体(东方海洋(北京)医学研究院有限公司)(T1线)和兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体(T2线)，在金标垫上分别固定胶体金标记的羊抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体(东方海洋(北京)医学研究院有限公司)和本发明小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514。
检测卡制备工艺为：1)包被缓冲液：采用PBS(pH7.4)作为包被缓冲液；2)包被浓度：兔抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体包被浓度分别为1.5mg/mL，兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体的包被浓度为2.0mg/mL，羊抗鼠IgG多克隆抗体包被浓度为1.0mg/mL；3)NC膜干燥时间：包被NC膜后干燥大于24小时；4)最佳标记量：小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514和羊抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体标记浓度均为25μg/mL；5)喷金量：金标垫按照4μL/cm进行喷金；6)金标垫干燥时间：6～8小时；8)膜条宽度：切割的膜条宽度应不小于3.5mm。
当待测样本滴加到检测卡的样本孔中时，该样本将在毛细作用下沿着检测卡向前移动。迁移到金标垫时，如果样本中含有幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原和/或幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，则分别与胶体金标记的羊抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体和/或小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514结合形成免疫复合物“羊抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体-幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原”和/或“小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514-幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A”。所形成的免疫复合物继续向前迁移，分别被硝酸纤维素膜上固定的兔抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体(T1线)和/或兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体(T2线)所捕获，形成免疫复合物“羊抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体-幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原-兔抗幽门螺杆菌鞭毛蛋白多克隆抗体”和/或“小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514-幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A-兔抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A多克隆抗体”，形成紫红色的T线。无论样本中是否含有幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原和/或幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A，C线区域包被的羊抗鼠IgG多克隆抗体均会与过量的小鼠抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体相结合，形成紫红色条带。检测结果和结果解释如表2和图3所示：
表2幽门螺杆菌鞭毛蛋白和细胞毒素相关蛋白联合检测结果解释
实施例7：对临床粪便样本的检测
取大约0.1g(约一粒黄豆大小)粪便样本，放入装有样品稀释液的采便器中，旋紧瓶盖。左右摇晃震荡混匀10秒钟，拧开采便器顶端白色小帽。将测试卡平放于干燥平面上，垂直而缓慢滴加2～3滴混匀后的样品(约100μL)至测试卡加样端中心。5～15分钟判读，15分钟后判读无效。
共检测临床通过尿素呼气试验和基因检测技术确定的36例幽门螺杆菌高毒株感染患者、9例幽门螺杆菌低毒株感染患者和35例未感染幽门螺杆菌的健康对照的粪便样本，结果显示采用本发明单克隆抗体所建立的幽门螺杆菌鞭毛蛋白和细胞毒素相关蛋白联合检测方法，检测结果与尿素呼气试验和基因检测结果符合率为100％。36例幽门螺杆菌高毒株感染患者的粪便样本均检测为T1和T2两条带阳性，对应于表2中的检测结果1，幽门螺杆菌感染阳性，为高毒株感染；9例幽门螺杆菌低毒株感染患者的粪便样本均检测为T1条带阳性，对应于表2中的检测结果2，幽门螺杆菌感染阳性，为低毒株感染；35例未感染幽门螺杆菌的健康对照的粪便样本均检测为仅C线条带阳性，对应于表2中的检测结果4，幽门螺杆菌感染阴性。
综上所述，本发明高亲和力高特异性的抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A单克隆抗体3E4514可以用于幽门螺杆菌高毒株感染的检测，具有非常高的灵敏度和特异性。采用胶体金免疫层析技术，使用本发明高亲和力高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体建立的人粪便样本中细胞毒素相关蛋白A和幽门螺杆菌鞭毛蛋白抗原联合检测技术，在保证试剂灵敏度和特异性的同时，仅通过一次加样便增加了高毒株鉴别功能，可以为幽门螺杆菌感染诊断、临床治疗方案确定和治疗效果评估提供重要依据。

Claims (11)

1.一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体或其抗原结合片段，包括轻链可变区和重链可变区，轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3，其特征在于，
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述轻链CDR2的氨基酸序列为LVS或与序列LVS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列；
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列，或者包含上述序列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为CGMCC No.45620的小鼠杂交瘤细胞株3E4514分泌。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组体，其特征在于，所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.一种抗幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌权利要求1或2所述单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株3E4514，保藏号为CGMCC No.45620。
10.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测幽门螺杆菌或治疗幽门螺杆菌感染的产品中的应用。
11.一种检测幽门螺杆菌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
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