CN115925906A - 抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用。所述单克隆抗体中,轻链CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,轻链CDR2的氨基酸序列为RTS,轻链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示;重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。上述抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体可以覆盖多个新型冠状病毒变异株,同时具有很好的特异性和亲和力,可以应用于制备检测新型冠状病毒产品和制备治疗新型冠状病毒患者的产品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
新型冠状病毒侵染机体后,首先可以检测到的是病毒核酸,随后是病毒合成的病毒蛋白,即抗原,最后是机体产生针对病毒多种抗原成分的特异性抗体,因此新型冠状病毒感染的实验室检测包括针对病毒基因的核酸检测、针对病毒自身蛋白的抗原检测和针对特异性抗体的抗体检测,其中核酸检测和抗原检测均属于病原学检查,是患者感染病原体的直接证据。相比抗体检测,抗原检测可以提前2-3周实现早期诊断。
目前新型冠状病毒抗原检测主要是基于双抗体夹心原理,需要高亲和力和高特异性的单克隆抗体。但是由于新型冠状病毒变异快,在全球范围内已经发现约4000种新冠病毒变异毒株,其中对人类危害较大,传染力较强的主要有五种变异株,分别为Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron,如果所采用的单克隆抗体不能识别所有毒株,将造成漏检,给疫情防控带来极大风险。因此,筛选制备针对不同毒株间保守性表位,同时又具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体技术难度非常大,是新型冠状病毒抗原检测试剂研发的关键。
此外,疾病的靶向治疗是指治疗药物进入体内后,通过特定的导向机制与靶器官、靶细胞或靶病原体特异性结合,从而使药物更直接地发挥作用,达到针对性治疗的目的。利用靶向性递送药物进行治疗,可以极大提高药物在病灶部位浓度,在提高疗效的同时降低毒副作用。靶向治疗主要包括生物靶向和物理化学靶向。生物靶向治疗即通过将靶向分子与药物偶联,对特定靶点进行给药治疗。近年来,利用具有高亲和性及特异性的单克隆抗体与治疗药物偶联,获得的靶向性药物进行治疗,具有良好的治疗效果,成为生物靶向给药治疗的热点与主要领域。而涵盖所有毒株且具有高亲和性及特异性的单克隆抗体正是这种生物靶向治疗得以成功的关键因素。因此,获得高覆盖、高亲和力及特异性的单克隆抗体对于生物靶向治疗尤为重要。
目前,对于新型冠状病毒感染治疗的研究主要集中在口服药物治疗及中和性抗体治疗两方面,目前尚缺少利用靶向新型冠状病毒病原体的高覆盖、高亲和力及特异性单克隆抗体进行生物靶向药物治疗的研究。
发明内容
为此,本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体,并且经过实验获得的单克隆抗体能够识别五种主要新型冠状病毒毒株,且具有很好的特异性和亲和力,可以用于检测新型冠状病毒或其核蛋白或者用于制备治疗新型冠状病毒感染的产品。
因此,本发明一个方面涉及一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括轻链可变区和重链可变区,轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,其中,
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR2的氨基酸序列为RTS或与序列RTS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列。
在进一步的方面中,本发明还涉及一种单克隆抗体或其抗原结合片段,所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列,所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。在进一步的方面中,本发明还涉及的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.45247的小鼠杂交瘤细胞株TCE1103分泌的单克隆抗体。
本发明还涉及上述的单克隆抗体或其抗原结合片段,所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体,这些抗体或抗原结合片段由于保留了轻链和重链的可变区,因此能够识别和结合新型冠状病毒核蛋白。
此外,本发明还涉及一种包含编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸的核酸分子,以及包含上述核酸分子的表达载体,所述表达载体能够表达上述的抗体或其抗原结合片段。同时本发明还涉及包含上述核酸分子或上述表达载体的重组体,其可以产生上述抗体或其抗原结合片段。
另一方面,本发明涉及一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌上述的单克隆抗体。进一步地,本发明涉及抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株TCE1103,保藏号为CGMCC No.45247。
再一方面,本发明涉及上述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测新型冠状病毒或治疗新型冠状病毒感染的产品中的应用。进一步地,本发明涉及一种检测新型冠状病毒的试剂盒,所述试剂盒包含上述单克隆抗体或其抗原结合片段,用于识别和结合新型冠状病毒核蛋白。
生物材料保藏说明
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株:小鼠杂交瘤细胞株TCE1103,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.45247,保藏日期为:2022年08月17日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
附图说明
图1是显示新型冠状病毒核蛋白原核表达的SDS-PAGE电泳图,其中各标号为:M为Marker;1为全菌体裂解液;2为菌体超声上清液;3为纯化的NP融合蛋白。
图2是显示抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体亚类鉴定结果图,经鉴定抗体亚型为IgG1。
图3是显示抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体胶体金免疫层析法检测核蛋白的结果判断示意图,其中阳性为两条紫红色条带出现。一条位于检测区(T线)内,另一条位于质控区(C线)内。检测区(T线)条带颜色可深可浅,均为阳性结果。阴性为仅质控区(C线)出现一条紫红色条带,检测区(T)内无条带出现。无效为质控区(C线)未出现紫红色条带,无论检测区(T线)是否出现条带,均为结果无效。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种利用融合的杂交瘤细胞株制备的抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体,该株抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体可以识别五种主要致病毒株的核蛋白。
以在五种主要致病毒株的核蛋白间保守的优势表位合成肽(经KLH偶联)作为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体,采用真核表达的新型冠状病毒核蛋白筛选单克隆抗体杂交瘤细胞株,筛选后获得一株表达高覆盖、高亲和力及特异性的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株,命名为TCE1103。将该细胞株于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏,保藏号为CGMCC No.45247,保藏日期为2022年08月17日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编100101。
本发明人对该株小鼠杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体进行了测序,单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列为111个氨基酸,其序列如下:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYG NSFMLWYQQKPGQPPKLLIYRTSNLDSGVP ARFSGSGSRTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSYDDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于27-36aa,氨基酸序列为ESVDNYGNSF(SEQ ID NO.2);CDR2位于54-56aa,氨基酸序列为RTS;CDR3位于93-101aa,氨基酸序列为QQSYDDPYT(SEQ ID NO.3)。重链可变区氨基酸序列为110个氨基酸,其序列如下:VQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGVNPKNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRWDYWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于25-32aa,氨基酸序列为GYTFTEYT(SEQID NO.5);CDR2位于50-57aa,氨基酸序列为VNPKNGGT(SEQ ID NO.6);CDR3位于96-100aa,氨基酸序列为TRWDY(SEQ ID NO.7)。经测定,上述单克隆抗体对新型冠状病毒核蛋白具有高覆盖、高亲和力及特异性。
众所周知,抗体重链CDR区和轻链CDR区是识别和结合相应抗原的重要序列,并且氨基酸序列中1个或2个保守氨基酸替换一般不会改变或稍微改变蛋白质的性质。因此,对轻链CDR1和/或轻链CDR2和/或轻链CDR3和/或重链CDR1和/或重链CDR2和/或重链CDR3进行1个或2个保守氨基酸替换后所得到的单克隆抗体或其抗原结合片段仍能够识别和结合新型冠状病毒核蛋白。保守氨基酸替换是指蛋白质中某一氨基酸被另一化学上相似的氨基酸所替换,例如芳香族氨基酸Phe、Trp、Tyr之间的相互替换,脂肪族性氨基酸Ala、Gly、Leu、Ile、Val之间的相互替换,极性氨基酸Gln、Asn之间的相互替换,碱性氨基酸Lys、Arg、His之间的相互替换,酸性氨基酸Asp、Glu之间的相互替换,以及羟基氨基酸Ser、Thr之间的相互替换等。
此外,本领域众所周知,抗体或其抗原结合片段中,轻链或重链各CDR之外为骨架区,CDR序列与骨架区序列之间增加少数氨基酸,例如增加1个或2个氨基酸对抗体或其抗原结合片段的立体结构影响较小,因此仍然可以识别和结合相应抗原。因此,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR1序列除了是SEQ ID NO.2所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列。同样地,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR2序列除了是RTS或与序列RTS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段轻链CDR3序列除了是SEQ ID NO.3所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR1序列除了是SEQ ID NO.5所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列,本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR2序列除了是SEQ IDNO.6所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列;本发明单克隆抗体或其抗原结合片段重链CDR3序列除了是SEQ ID NO.7所示序列或与其相比具有1个或2个保守氨基酸替换的序列之外,还可以是包含上述序列的序列。
还可以通过本领域现有技术,从本发明的单克隆抗体制备各种能够与新型冠状病毒核蛋白结合的各种抗体片段,即抗原结合片段,例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')2。Fab片段是抗体结构中可以与抗原结合的区域,由一条完整的轻链与重链的可变区VH和恒定区CH1结构域(Fd段)组成,轻链与重链均存在一个恒定区与一个可变区,轻重链间存在二硫键链接。抗原结合片段可以如下制备,例如使用木瓜蛋白酶酶解作用后,抗体IgG被降解为两个Fab片段及一个Fc片段(结晶片段)。在胃蛋白酶的作用下,抗体IgG被降解为一个F(ab')2片段和一个pFc'片段,F(ab')2片段进一步被还原形成两个Fab'片段。上述抗原结合片段可以应用于制备检测新型冠状病毒或其核蛋白的产品和治疗新型冠状病毒患者的治疗产品。
还可以通过本领域现有技术,从本发明的单克隆抗体制备单链抗体(scFv)。单链抗体是由抗体重链可变区和轻链可变区通过数个氨基酸的短肽linker连接而成的抗体,其只有一条链,是一种人工合成的抗体。短肽linker的长度以及氨基酸组成是本领域众所周知的,并且可以通过简单的重复实验可以确定针对本发明的单克隆抗体的可以使用的短肽linker。单链抗体可以通过基因工程技术在例如大肠杆菌中表达。单链抗体分子量小、穿透力强并且抗原性弱等优点,可以应用于新型冠状病毒或其核蛋白的检测、新型冠状病毒患者的诊断和治疗产品中。
可以通过本领域的现有技术,将本发明的单克隆抗体的轻链恒定区和重链恒定区替换成人抗体氨基酸序列,从而使本发明的鼠单克隆抗体进行人源化改造得到人源化抗体,以便用于对人新型冠状病毒患者进行抗体治疗,以减少鼠源抗体对人机体的免疫副反应。因此本发明的人源化单克隆抗体可以应用于新型冠状病毒或其核蛋白的检测、新型冠状病毒患者的诊断和治疗产品中。
本领域技术人员能够基于上述的抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体可变区的氨基酸序列设计、合成编码其的核酸分子,也能够将合成的核酸分子插入到核酸载体中,构建得到表达载体,该载体能够表达出抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。本领域技术人员还能够将所合成的核酸分子或者构建的表达载体导入生物体如细胞、细菌、酵母等中得到重组体,并经由上述重组体表达生产本发明的抗体或其抗原结合片段,如此表达的抗体或其抗原结合片段能够结合和识别新型冠状病毒核蛋白,因此上述的核酸分子、表达载体以及重组体处于本发明的权利要求书保护范围内。并且上述的技术均属于本领域众所周知的技术,本领域技术人员无需创造性劳动即可开展。
如上所述,本发明的抗体或其抗原结合片段能够识别和结合新型冠状病毒不同毒株核蛋白,因此可以用于制备用于检测新型冠状病毒或其核蛋白的试剂盒,所述试剂盒可以是任何利用了本发明抗体或其抗原结合片段与新型冠状病毒核蛋白的结合反应的试剂盒,例如但不限于胶体金免疫层析、荧光免疫层析、酶联免疫吸附测定、化学发光、免疫组化类型的试剂盒。对于采用胶体金免疫层析技术检测新型冠状病毒或新型冠状病毒核抗原的试剂盒而言,胶体金标记抗体的亲和力和特异性对于该检测方法是至关重要的,其决定着试剂盒的灵敏度和特异性性能。由于本发明抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体具有高覆盖、高亲和力及特异性,其适宜作为胶体金标记抗体,本发明的抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体或者针对其它表位区段的其他任何抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆或多克隆抗体均可以作为检测线(T线)包被抗体。作为质控可以使用本领域常规使用的抗体对,例如可以使用胶体金标记的鸡IgY抗体,并用羊抗鸡IgY抗体包被质控线(C线)。
由于本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段能够特异性结合新型冠状病毒核蛋白,因此所述抗体或其抗原结合片段或者人源化抗体可以用于制备治疗新型冠状病毒感染的产品,例如药物。治疗可以是例如但不限于靶向治疗,在靶向治疗中,本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或人源化抗体与新型冠状病毒治疗药物进行偶联,通过本发明的抗体或其抗原结合片段或人源化抗体将所偶联药物靶向至新型冠状病毒,从而提高治疗效果。
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果,以下结合具体实施例进行说明。
实施例1:新型冠状病毒核蛋白优势表位肽的筛选与合成
根据Genebank中公布的不同新型冠状病毒毒株的核蛋白全长蛋白序列,在BLAST中进行多序列比对,确定在不同毒株间具有保守性的氨基酸区段,然后采用Goldkey生物信息学软件进行表位分析预测,筛选优势表位区段,最终筛选确定得分最高,且在目前发现的主要变异毒株中高度保守的优势表位区段为第360至380位氨基酸序列YKTFPPTEPKKDKKKKADETQ(SEQ ID NO.8),得分最高为5.14558。将该新型冠状病毒核蛋白优势表位肽用于后续免疫小鼠,以筛选杂交细胞瘤并制备单克隆抗体。优势表位肽的合成及KLH偶联委托上海德翅生物科技有限公司完成。
实施例2:新型冠状病毒核蛋白全长蛋白的原核表达与纯化
根据Genebank中公布的新型冠状病毒原始株核蛋白全长基因序列,由北京擎科生物科技有限公司合成全长基因,并连接入pET-32a质粒中,获得重组质粒pET-32a-NP。将重组质粒转化入BL21感受态细胞,挑取单菌落于2mL含氨苄西林钠的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,次日接种于200mL新鲜的LB液体培养基中,37℃、160rpm培养4h至对数生长期,加120μl 1mol/L的IPTG诱导液,15℃诱导12-14h。4℃,6000rpm离心10min收集诱导后的菌体;用25mmol/L Tris-HCl(pH8.5)重悬菌体,冰浴超声;4℃,12000rpm离心10min收集上清备用。进行SDS-PAGE凝胶电泳,分析核蛋白主要以可溶形式表达在上清液中。将pET-32a-NP重组质粒表达抗原经Ni柱进行纯化,分别收集蛋白峰,SDS-PAGE电泳分析纯化产物,NP融合蛋白的分子量约为63.8kDa,纯度达到免疫原纯度要求,其结果如图1所示。
实施例3:抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体的制备
选取健康的雄性大耳白兔,取1mg的NP融合蛋白与1ml的弗氏完全佐剂混合,搅拌器彻底乳化后,在大白兔脊柱两旁进行多点皮下注射,每点注不少于0.1ml;4周后取1mg的蛋白与1ml的弗氏不完全佐剂,搅拌器彻底乳化后于上述部位选不同点进行第二次免疫;于4周后进行第三次加强免疫,用于制备多克隆抗体血清。1周后心脏取血,待血液凝固血块收缩后,5000rpm离心15分钟,将血清分装后置-20℃冰箱中保存备用。多抗的纯化按照“Montage antibody purification prosep-G kit”说明书进行,用抗体稀释液调整抗体浓度为1.0mg/mL。
采用间接ELISA法检测纯化的兔抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体的效价。用碳酸盐包被缓冲液将购自东方海洋(北京)医学研究院有限公司的真核细胞表达新型冠状病毒N蛋白(货号DFHY-Ag-1301)稀释成浓度为1.0μg/mL,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,每孔200μl;每孔加入100μl封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,每孔200μl;用抗体稀释液稀释浓度为1.0mg/mL的兔抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体,稀释比例为1:2000、1:8000、1:32000、1:128000、1:512000、1:2048000和1:8192000,以每孔100μl加样并设置空白孔(100μl抗体稀释液);37℃孵育30min;用洗液洗板5次,每孔200μl;HRP标记的羊抗兔二抗37℃孵育20min;用洗液洗板5次,每孔200μl;加新鲜配制的底物溶液,每孔100μl,37℃孵育10分钟;每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应,采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值,终止后10分钟内读值。结果如表1所示,所制备的兔抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体的效价为1:2048000(OD值=0.285)。
表1兔抗新型冠状病毒核蛋白多克隆抗体的效价测定
稀释比例 | 1:2000 | 1:8000 | 1:32000 | 1:128000 | 1:512000 | 1:2048000 | 1:8192000 |
OD值 | 3.478 | 3.140 | 2.909 | 1.328 | 0.663 | 0.285 | 0.096 |
实施例4:杂交瘤细胞株建立
取KLH偶联新型冠状病毒核蛋白优势表位肽作为免疫原,采用8周龄BALB/c雌性小鼠,抗原加等量弗氏完全佐剂背部及腹腔注射小鼠(50μg/只);第四周和第八周进行第2次和第3次相同剂量免疫,用福氏不完全佐剂,3天后取脾细胞进行融合。复苏SP20骨髓瘤细胞,培养至其处于对数生长期。取免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血供阳性对照血清,同时颈脱位处死小鼠,用75%酒精消毒体表3-5min,取其脾脏,制备脾细胞悬浮液。
取上述脾细胞与骨髓瘤细胞按照5:1的比例,在无血清的DMEM培养基中混匀,1500rpm离心5分钟,充分吸取上清,轻轻震荡离心管底部,振散细胞,在45-60秒内加入1mL预热过的50%PEG融合细胞,边加边轻轻摇匀,加完后静置90秒,加入无血清的DMEM培养基终止融合(第一分钟加1mL,第二分钟加2mL,第三分钟加8mL),37℃静置10min,1500rpm离心5分钟,沉淀用HAT培养基悬浮,分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中,37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。细胞培养箱中培养5天后,用HAT培养基换液一次,第10天用HAT培养基换液,等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时,同样采用间接ELISA法筛选阳性克隆。
用碳酸盐包被缓冲液稀释购自东方海洋(北京)医学研究院有限公司的真核细胞表达新型冠状病毒N蛋白(货号DFHY-Ag-1301),浓度为1.0μg/ml,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,200μl/孔;加入110μl/孔封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,200μl/孔。每孔加入200μl样品稀释液后,分别加入10μl细胞培养上清,室温孵育30min,弃液。用1×洗液洗板,每孔200μL,重复洗涤5次。将洗好的酶标板倒置于吸水纸上,用力拍打以去除多余的洗液。加入100μl/孔HRP标记的抗鼠IgG抗体,室温孵育20min。洗板5次。加新鲜配制的底物溶液,100μl/孔,室温避光孵育10分钟。加入2M H2SO4终止液50μL/孔,终止反应。设定酶标仪检测波长450nm,测定每孔OD值,终止后10分钟内读值。
共获得11个阳性克隆,选择其中检测值最高(OD450nm=3.327)的克隆株进行后续实验,定名为小鼠杂交瘤细胞株TCE1103。
实施例5:抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体制备及其亚型分析
TCE1103杂交瘤细胞株,用含10%胎牛血清的1640培养基培养。每只BALB/c雄性小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡。10天后收集细胞,用10mL生理盐水重悬细胞,每只小鼠腹腔注射0.5mL(细胞密度大约为1×107个/mL)。2周后,收集腹水。以Thermo公司Melon GelMonoclonal IgG Purification Kit试剂盒进行抗体纯化,纯化后的抗体分装后于-20℃保存。
采用Pierce Papid Isotyping Kit-Mouse试剂盒抗体亚型鉴定,首先用样本稀释液将抗体稀释为100ng/mL,然后每孔加入150μl稀释好的抗体,5-10min后观察记录结果。结果显示此单克隆抗体为小鼠IgG1亚型,如图2所示。
实施例6:抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体可变区序列测定
培养小鼠杂交瘤细胞株TCE1103,Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA,Thermo Fisher公司High Capacity cDNA Rever Transcription Kit试剂盒逆转录cDNA后,根据《重组抗体》(科学出版社,沈倍奋主编,2005年出版)中鼠单抗引物序列,设计并由北京擎科生物科技有限公司合成该抗体的重轻链引物,PCR扩增(扩增程序为:95℃预热1min,进行30个循环(95℃30秒,58℃30秒,72℃45秒),最后72℃延伸5min),连接PMD18-T载体,大肠杆菌HB109表达,挑选阳性克隆进行测序。将测定序列在BLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)比对分析小鼠来源单克隆抗体CDR区序列。
经序列分析后发现,轻链可变区氨基酸序列为111个氨基酸,其序列如下:DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGNSFMLWYQQKPGQPPKLLIYRTSNLDSGVP ARFSGSGSRTDFTLTINPVEAEDVATYYCQQSYDDPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.1),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于27-36aa,氨基酸序列为ESVDNYGNSF(SEQ ID NO.2);CDR2位于54-56aa,氨基酸序列为RTS(SEQ ID NO.3);CDR3位于93-101aa,氨基酸序列为QQSYDDPYT(SEQ ID NO.3)。
重链可变区氨基酸序列为110个氨基酸,其序列如下:VQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGVNPKNGGTSYN QKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRW DYWGQGTTLTVS(SEQ ID NO.4),其中带有下划线的序列依次为CDR1、CDR2和CDR3,其中,CDR1位于25-32aa,氨基酸序列为GYTFTEYT(SEQ ID NO.5);CDR2位于50-57aa,氨基酸序列为VNPKNGGT(SEQ ID NO.6);CDR3位于96-100aa,氨基酸序列为TRWDY(SEQ ID NO.7)。
实施例7:抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体活性测定
采用间接酶联免疫吸附测定法检测所制备的单克隆抗体对新型冠状病毒核蛋白的免疫检测性能。为了检查本发明单克隆抗体检测的特异性和亲和力,实验时同时检测购自东方海洋(北京)医学研究院有限公司的新型冠状病毒N蛋白(货号DFHY-Ag-1301)、SARS病毒N蛋白(货号DFHY-Ag-SARS)、MERS病毒N蛋白(货号DFHY-Ag-MERS)和呼吸道合胞病毒蛋白(货号DFHY-Ag-RSV)。
用碳酸盐包被缓冲液分别将各个蛋白稀释成浓度为1.0μg/mL,每孔包被100μl,4℃过夜;用洗液洗板2次,每孔200μl;每孔加入100μl封闭液室温封闭6小时;用洗液洗板5次,每孔200μl;用抗体稀释液将浓度为1.0mg/mL的小鼠抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体进行梯度稀释,稀释比例为1:2000、1:8000、1:32000、1:128000、1:512000、1:2048000和1:8192000,以每孔100μl加样并设置空白孔(100μl抗体稀释液);37℃孵育30min;用洗液洗板5次,每孔200μl;HRP标记的山羊抗小鼠二抗37℃孵育20min;用洗液洗板5次,每孔200μl;加新鲜配制的底物溶液,每孔100μl,37℃孵育10分钟;每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应,采用酶标仪波长450nm测定各孔的吸光值,结果如表2所示,所制备的单克隆抗体可以特异性识别新型冠状病毒核蛋白,对同属于冠状病毒的SARS病毒和MERS病毒的N蛋白,以及呼吸道合胞病毒蛋白均没有非特异性反应,表明所制备的单克隆抗体具有非常高的特异性。并且所制备的单克隆抗体的效价达到1:2048000(OD值=0.251),表明所制备的单克隆抗体对新型冠状病毒核蛋白具有非常高的亲和力。
表2小鼠抗新型冠状病毒核蛋白单克隆抗体的效价测定(OD值)
实施例8:对新型冠状病毒培养物检测的最低检测线
采用胶体金免疫层析技术,使用本发明高亲和力高特异性的单克隆抗体作为标记抗体,本发明的多克隆抗体作为T线的包被抗体,检测新型冠状病毒培养物中的新型冠状病毒(2019-nCoV)N蛋白。检测卡含有:1)胶体金标记小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和胶体金标记的鸡IgY抗体;2)固定有一条检测线(T线)和一条质控线(C线)的硝酸纤维素膜。T线固定有包被用兔抗新型冠状病毒N蛋白多克隆抗体,即用兔抗新型冠状病毒N蛋白多克隆抗体包被;C线固定有羊抗鸡IgY抗体,即用羊抗鸡IgY抗体包被。检测卡制备工艺为:1)包被缓冲液:采用PBS(pH7.4)作为包被缓冲液;2)包被浓度:抗新型冠状病毒N蛋白多克隆抗体的包被浓度为2.0mg/mL,羊抗鸡IgY抗体包被浓度为1.0mg/mL;3)NC膜干燥时间:包被NC膜后干燥大于24小时;4)最佳标记量:抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体标记浓度为20μg/mL、鸡IgY抗体标记浓度为20μg/mL;5)胶体金标记物混合比例:抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体-标记用胶体金标记物和鸡IgY抗体胶体金标记物溶液混合比例为8:1;6)喷金量:金标垫按照4μL/cm进行喷金;7)金标垫干燥时间:6~8小时;8)膜条宽度:切割的膜条宽度应不小于3.0mm。
当待测样本滴加到检测卡的样本孔中时,该样本将在毛细作用下沿着检测卡向前移动。如果样本中含有N抗原,则与胶体金标记的标记用小鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体结合,该复合物会被硝酸纤维素膜上固定的包被用兔抗新型冠状病毒N蛋白多克隆抗体捕获,形成紫红色的T线。无论样本中是否含有N抗原,C线区域均会形成紫红色条带。结果判断标准如图3所示。阳性:两条紫红色条带出现,其中一条位于检测区(T线)内,另一条位于质控区(C线)内,检测区(T线)条带颜色可深可浅,均为阳性结果。阴性:仅质控区(C线)出现一条紫红色条带,检测区(T)内无条带出现。无效:质控区(C线)未出现紫红色条带,无论检测区(T线)是否出现条带,结果均为无效,需重新取检测卡重测。
将新型冠状病毒培养物用阴性基质(含健康人阴性鼻拭子的样本提取液)稀释至1.9×104TCID50/mL,用圣湘生物科技股份有限公司的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)对样本进行检测,检测结果为阳性,Ct值(N基因)为28.09,Ct值(ORF1ab)为26.56。将该样本用阴性基质按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128和1/256比例,梯度稀释成8个稀释浓度,使用本发明的胶体金免疫层析方法进行检测,每个样本重复检测20次。检测时,将检测卡平放在桌面上,将80μl梯度稀释的病毒培养物加入检测卡的加样孔中。等待检测卡视窗中条带出现,15min时读取检测,20min后判读结果无效。结果详见表3。以具有95%阳性检出率的病毒水平为最低检测限,使用本发明高亲和力高特异性的单克隆抗体和多克隆抗体,采用胶体金免疫层析技术检测新型冠状病毒培养物的最低检测线为2.969×102TCID50/mL。
表3对新型冠状病毒培养物检测的最低检测线
实施例9:对新型冠状病毒感染者临床样本的检测
如实施例8中所述,采用基于本发明高覆盖、高亲和力及特异性的单克隆抗体和多克隆抗体建立的新型冠状病毒核蛋白胶体金免疫层析检测技术,对临床样本进行检测,共检测848例临床试验样本,其中,新型冠状病毒核酸检测阳性样本238例,采样自急性感染期,在症状出现0~7日内,涵盖新型冠状病毒Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron变异毒株。新型冠状病毒核酸检测阴性样本610例,主要为具有发热或其他呼吸道症状等新型冠状病毒肺炎相关临床表现的且新冠核酸阴性的,在症状出现0~7天的受试者样本。检测结果显示本发明检测技术的检测灵敏度为98.28%,95%CI为[99.36%,95.28%];特异性为99.51%,95%CI为[98.56%,99.83%]。另外,检测了50例含常见呼吸道其他交叉病原体的样本,检测结果均为阴性,表明常见的呼吸道病原体对本发明检测技术的检测结果无干扰或交叉影响。
综上所述,采用基于本发明高覆盖、高亲和力及特异性的单克隆抗体和多克隆抗体建立的新型冠状病毒核蛋白胶体金免疫层析检测技术适用于新型冠状病毒感染的早期检测,涵盖多种常见新型冠状病毒毒株,具有非常高的灵敏度和特异性。
Claims (11)
1.一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段,包括轻链可变区和重链可变区,轻链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,重链可变区包括CDR1、CDR2和CDR3,其特征在于,
所述轻链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示序列或与SEQ ID NO.2所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR2的氨基酸序列为RTS或与序列RTS相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述轻链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示序列或与SEQ ID NO.3所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示序列或与SEQ ID NO.5所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示序列或与SEQ ID NO.6所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列;
所述重链CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示序列或与SEQ ID NO.7所示序列相比具有1个或2个保守氨基酸替换的氨基酸序列,或者包含上述序列的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述轻链可变区序列为SEQ ID NO.1所示序列,所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示序列。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体,其特征在于,其由保藏号为CGMCC No.45247的小鼠杂交瘤细胞株TCE1103分泌。
4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或抗原结合片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链抗体或人源化抗体。
5.一种核酸分子,其特征在于,所述核酸包含编码权利要求1至4任一项所述抗体或其抗原结合片段的核酸。
6.一种表达载体,其特征在于,所述表达载体包含权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组体,其特征在于,所述重组体包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.一种抗新型冠状病毒核蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其特征在于,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌权利要求1或2所述单克隆抗体。
9.根据权利要求7所述的单克隆抗体杂交瘤细胞株,其特征在于,所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为小鼠杂交瘤细胞株TCE1103,保藏号为CGMCC No.45247。
10.权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测新型冠状病毒或治疗新型冠状病毒感染的产品中的应用。
11.一种检测新型冠状病毒的试剂盒,其特征在于,包含权利要求1至4任一项所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
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