CN113214367A - 一种covid-19冠状病毒重组s1蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种COVID‑19冠状病毒S1重组蛋白及其应用，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。本发明还提供了COVID‑19冠状病毒S1重组蛋白的制备方法，该方法能提高S1重组蛋白在真核细胞中表达量，达到55‑70mg/L。本发明的S1重组蛋白与感染了COVID‑19病毒的病人血清或接种了COVID‑19疫苗的动物血清均有交叉反应，可用于制备多克隆抗体和单克隆抗体、开发抗体或抗原的诊断试剂以及设计和筛选COVID‑19冠状病毒治疗药物。S1‑Fc融合蛋白免疫动物后产生的抗体识别COVID‑19冠状病毒，可用于制备冠状病毒疫苗，市场价值巨大。

Description

一种COVID-19冠状病毒重组S1蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及治疗或重组蛋白的制备及应用领域，主要是涉及一种 COVID-19冠状病毒重组S1蛋白及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，因2019年病毒性肺炎病例而被发现，2020年1月12日被世界卫生组织命名。冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征 (SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。
目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。但许多症状是可以处理的，因此需根据患者临床情况进行治疗。此外，对感染者的辅助护理比较有效。研制针对该病毒的特异性抗体，有助于新型冠状病毒所引起肺炎的诊断和治疗。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供COVID-19冠状病毒重组S1蛋白及其应用。
本发明的另一个目的在于提供该重组S1蛋白的制备方法。
本发明提供的COVID-19冠状病毒重组S1蛋白，包括重组S1-His标签蛋白、和/或重组S1-Fc融合蛋白，所述重组S1-His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组S1-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
本发明提供了所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白的以下任一种应用，
(1)在制备COVID-19冠状病毒疫苗中的应用；
(2)在制备COVID-19冠状病毒诊断试剂或试剂盒中的应用；
(3)在制备COVID-19冠状病毒多克隆抗体或单克隆抗体中的应用；
(4)在制备预防或治疗COVID-19冠状病毒引起疾病的药物中的应用；
(5)在制备抑制或杀灭COVID-19冠状病毒的药物中的应用；
(6)在制备COVID-19冠状病毒高免血清中的应用；
(7)在筛选COVID-19冠状病毒治疗药物中的应用；
(8)在COVID-19冠状病毒疫苗质量检测中的应用；
(9)在检测COVID-19冠状病毒中的应用；
(10)在预防或治疗COVID-19冠状病毒引起疾病中的应用。
上述应用中，优选地，所述诊断试剂为抗体诊断试剂或抗原诊断试剂。
本发明提供了含有所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白S1-His标签蛋白、和/或重组S1-Fc融合蛋白的产品，所述产品为以下任一：
(1)预防或治疗COVID-19冠状病毒的疫苗；
(2)预防或治疗COVID-19冠状病毒的药物；
(3)预防或治疗COVID-19冠状病毒的诊断试剂或试剂盒；
(4)高免血清；
(5)融合蛋白。
本发明提供了所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白的制备方法，用人 IgG的信号肽去替代COVID-19冠状病毒S1蛋白的信号肽。
优选地，是用人IgG重链蛋白的信号肽去替代COVID-19冠状病毒S1 蛋白的信号肽。
所述SARS-CoV2病毒S1-His蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示, 所述SARS-CoV2病毒S1-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
人IgG重链蛋白的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的有益效果在于：本发明提供的COVID-19冠状病毒S1重组蛋白的制备方法，该方法通过改变新冠S蛋白的信号肽为人抗体重链的信号肽从而提高S1重组蛋白在真核细胞中表达量，达到55-70mg/L以上，本发明解决了新冠病毒重组S1蛋白在真核细胞中表达量低、分泌差的国际难题。本发明的S1重组蛋白与感染了COVID-19病毒的病人血清或接种了COVID-19 疫苗的动物血清均有交叉反应，可用于制备多克隆抗体和单克隆抗体、开发抗体或抗原的诊断试剂以及设计和筛选COVID-19冠状病毒治疗药物，具有良好的应用前景。新冠病毒重组S1-Fc融合蛋白免疫小鼠或猴子后很快产生特异识别新冠病毒S1蛋白的抗体，并且可以中和S1蛋白和它的受体 ACE-2蛋白的结合，可以用于新冠病毒疫苗开发，市场价值巨大。
附图说明
图1为S1-His及S1-Fc重组蛋白的SDS-PAGE结果图。A：SARS-CoV-2 重组S1-Fc蛋白SDS-PAGE示意图；B：SARS-CoV-2重组S1-His蛋白 SDS-PAGE示意图。泳道1为Marker，泳道2为重组蛋白。
图2为重组S1-Fc蛋白免疫小鼠血清滴度ELISA检测结果。
图3为重组S1-Fc蛋白免疫兔血清滴度ELISA检测结果。
图4为重组S1-Fc蛋白免疫猕猴血清中IgG和IgM水平ELISA检测图。
图5为基于新冠S1蛋白抗体检测试剂盒的血清学检测结果图。
图6新冠S1蛋白抗体IgG+IgM金标试纸条的疫苗有效性评价结果图。
图7S1-Fc免疫兔和猴抗血清对假病毒的中和作用比较图，A：用 SARS-CoV-2假病毒测定兔血清的中和活性。B：用SARS-CoV-2假病毒测定猴血清的中和活性。横坐标为血清稀释度，纵坐标为中和率。
图8为新冠疫苗定量检测试剂盒标准曲线。
具体实施方式
缩写和定义
“抗体”，是指表现所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号传递)的抗体的任何形式。因此，所述抗体以最广泛的意义使用，并明确包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体和多特异性抗体。
“Fc”区域为含有抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
本申请所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇(表位)的多种不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。
本文所用“抑制”或“治疗(treat或treatment)”包括延缓与疾病有关的症状的发展和/或减轻所述疾病将要或预期发展的这些症状的严重程度。所述术语还包括减缓已有症状、防止另外的症状和减缓或防止这些症状的潜在原因。
通过参考以下实施例将更充分地理解本发明。然而，这些实施例不应该理解为限制本发明范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1重组S1蛋白的制备方法
用人IgG1重链的信号肽(SEQ ID NO.4)与SARS-CoV2病毒S1蛋白 (SEQ ID NO.1)连接并插入到哺乳动物细胞表达载体，获得重组质粒，用其转染哺乳动物细胞，在细胞上清液中分泌出高浓度的病毒重组S1蛋白。重组S1-His标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组S1-Fc 融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在293和CHO真核细胞中实现了新冠病毒重组S1-His蛋白和S1-Fc 的高表达。
本发明解决了新冠病毒S1重组蛋白在哺乳细胞中表达后穿细胞膜困难、表达量太低的世界技术难题，瞬转293和CHO细胞上清液中新冠病毒重组 S1-His和S1-Fc融合蛋白表达量分别高达71.7mg/L和55.9mg/L，可以商业化量产。
实施例2重组S1蛋白诱导动物体内产生抗S1抗体
用本发明获得的S1-Fc重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示) 免疫动物，所述动物包括4周龄雌性BALB/c小鼠、12～15周龄雌性新西兰大耳白兔和3～4岁猕猴。简单地说，4周龄雌性BALB/c小鼠用重组S1-Fc 蛋白配合AD20Gold+佐剂免疫(第0、3、7天肌肉注射9.2μg，第9天和第 11天降低到0.575μg)。使用重组S1-Fc蛋白配合AD20Gold+佐剂免疫12～15周龄雌性新西兰大耳白兔(第0、4、7天肌肉注射100μg，第11、14、18 天肌肉注射50μg)。3～4岁猕猴使用重组S1-Fc蛋白配合弗氏完全佐剂启动第一次免疫，并使用重组S1-Fc蛋白配合AD11.10佐剂(该佐剂购自苏州艾迪维信)进行多次加强免疫(第0天使用CFA皮下注射250μg，第4 天、9天、22天和26天使用AD11.10肌肉注射250μg)。采集不同时间点的血液样本，测定抗体水平和中和效价。
对重组S1-Fc蛋白免疫的4周龄雌性BALB/c小鼠在第38天采集血清，用酶标山羊抗小鼠IgG Fc特异性二抗ELISA检测。如图2所示，所有的5 只小鼠都产生了很强的抗S1的IgG抗体(滴度为64,000～256,000)。
对重组S1-Fc蛋白免疫的2只兔子在第27天采集血清进行抗S1抗体滴度检测。与在小鼠中观察到的情况类似，S1-Fc免疫兔对S1蛋白也产生了非常高的结合效价(滴度为100,000或更高)(见图3)。
对重组S1-Fc蛋白免疫的猴子在多个时间多次采集血清进行抗S1蛋白 IgG及IgM亚型抗体的滴度检测。如图4所示，第8天雌性猕猴体内仅检出抗S1蛋白IgG抗体。第15天，在两只猕猴中均检测到较强的抗S1蛋白IgG滴度，IgM水平也可检测到。但在第22天再次使用重组S1-Fc蛋白加强免疫后，anti-S1 IgG滴度仅在第32天大幅升高，而anti-S1 IgM滴度未见明显升高。
实施例3基于重组S1蛋白的抗新冠S1蛋白抗体检测试剂盒开发及其应用
新冠抗S1蛋白抗体检测试剂盒包被板制备方法如下：使用配置于磷酸盐缓冲液(10mM PBS,pH 7.4)中的浓度为1μg/mL的重组SARS-CoV-2 S1-His蛋白进行包被，将100μL的溶液加入96孔ELISA板中，2℃-8℃孵育过夜。并使用3％牛血清白蛋白(BSA)PBS封闭未被重组S1-His蛋白占据的空间，室温孵育1小时后，对包被板进行风干和密封处理备用。
在ELISA试剂盒使用过程中，每个血清样本复孔检测。检测前，人样或标准品在样品稀释缓冲液中以1:20稀释。然后取100μL适当稀释的样品加入S1-6×His包被板的每孔中，37℃振荡孵育0.5小时。每孔加入适量稀释的辣根过氧化物酶结合山羊抗人IgG(H+L)二抗100μL,37℃振荡孵育15 分钟。在加入TMB基质溶液前，使用洗涤缓冲液冲洗5次。避光孵育5-10 分钟后，用0.1M硫酸终止显色并在450nm波长下用microplate分光光度计(ThermoScientific,Multiskan MK3)测量OD读值。
ELISA试剂盒被送往几家医院，以检测其对真实临床样本的敏感性。部分数据见图5。一个研究组包括45个不同临床阶段COVID-19确诊患者的临床样本。如图5的A图所示，45份样本中，SARS-CoV-2抗体阳性44 份，敏感性为97.8％。1周内采集标本21份(第1天1例；第3天3例；第4 天和第5天各7例；第6天2例；第7天1例)COVID-19发病；所有人的 SARS-CoV-2抗体检测均呈阳性。且不同性别和年龄的抗体水平无显著差异 (图5B和5C)。
第1组患者按发病天数(图5的A图)、性别(图5的B图)、年龄图5的 (图5的C图)进行分类。第2组患者(图5的D图)按入院日、住院期间、出院后第14天进行分类。
在另一组研究中，如图5的D图所示，24个临床样本中有23个检测出SARS-CoV-2抗体阳性。按采集次数分类:(1)入院日；(2)住院期间的任何时间；出院后第14天随访。显然，刚到医院的患者的SARS-CoV-2抗体水平是最低的。患者在治疗期间和出院后抗体水平升高。
实施例4基于重组S1蛋白的新冠S1蛋白抗体IgG+IgM金标试纸条开发及其应用
使用重组S1蛋白进行了新冠S1蛋白抗体IgG+IgM金标试纸条的开发，并用该试纸条对接种新冠疫苗后的个体的血清中的抗S1蛋白的IgG及IgM 的抗体进行检测，如图6所示。其中大部分年轻人在接种完新冠疫苗后第14天内均产生了新冠S1抗体IgG，中年人则在20天左右可以测到。但是，仍然有2人检测不到，说明没有产生足够的新冠S1抗体，免疫效果不理想。
实施例5重组S1蛋白诱导动物体内产生保护性中和抗体
复旦大学金侠教授团队使用SARS-CoV-2假病毒检测了S1-Fc免疫兔或猕猴血清的中和活性。简单地说，热灭活血清样品与200TCID50假病毒在 37℃下预孵育1h。混合物然后被用来感染ACE2-293 T细胞。3天后测定感染细胞的荧光素酶活性。如表1和图7的A图所示，用SARS-CoV-2S1-Fc 融合蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.3)，在免疫后第27天，两只兔均有很高的中和活性，IC50效价>3000,IC90效价分别为501和440。如图7的B 图所示，2只S1-Fc免疫的猕猴在第32天的血清中也观察到极好的中和效价(见表1)。
表1 S1-Fc免疫猴和兔血清的假病毒中和效价
Figure RE-GDA0003139017210000071
数据清楚地表明，本发明表达获得的SARS-CoV-2S1-Fc融合蛋白可以在很短的时间内诱导对SARS-CoV-2很强的中和作用，是COVID-19疫苗开发的一个很好的候选蛋白。
综上所述，获得的新冠病毒重组S1-Fc融合蛋白免疫小鼠、兔子或猴子后均能很快产生特异识别新冠病毒S1蛋白的抗体，并且可以中和S1蛋白和它的受体ACE-2蛋白的结合，可以用于新冠病毒疫苗开发。
实施例6 S1特异鼠单抗配对的新冠疫苗定量试剂盒开发及应用
采用双抗体夹心法(夹心Elisa)原理。96孔板涂有抗SARS-CoV-2S1蛋白多克隆抗体(用S1-Fc免疫新西兰白兔获得)。加入样品后，把游离抗体洗涤取出后。然后将HRP标记的抗SARS-CoV-2S1蛋白抗体添加到平板上，形成包被的抗体-抗原-HRP标记的抗体复合物。通过TMB显色程度检测灭活SARS-CoV-2的含量。
新冠疫苗定量试剂盒包被板制备方法如下：使用配置于碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)中的浓度为2μg/mL的抗S1蛋白兔多抗进行包被，将 100μL的溶液加入96孔ELISA板中，2℃-8℃孵育过夜。用PBS洗涤2次后，并使用20％小牛血清(calf serum)封闭未被占据的空间，室温孵育1.5小时后，对包被板进行风干和密封处理备用。
新冠疫苗定量检测试剂盒使用S1-His蛋白作为标准品(标准曲线如图 8所示)。该试剂盒可定量检出检测样本中的S1组分，灵敏度可达100ng/mL。
序列表
<110> 北京派迪畅科技发展有限公司
<120> 一种COVID-19冠状病毒重组S1蛋白及其应用
<130> KHP201110733.8
<150> 2020103133725
<151> 2020-04-20
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
85 90 95
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
100 105 110
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
115 120 125
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
130 135 140
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
145 150 155 160
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
180 185 190
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
195 200 205
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
210 215 220
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
275 280 285
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
545 550 555 560
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
565 570 575
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
580 585 590
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
595 600 605
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
610 615 620
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
625 630 635 640
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
645 650 655
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
<210> 2
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr
20 25 30
Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly
35 40 45
Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr
50 55 60
Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala
65 70 75 80
Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val
85 90 95
Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn
100 105 110
Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln
115 120 125
Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys
130 135 140
Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys
145 150 155 160
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
165 170 175
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
180 185 190
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
195 200 205
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
210 215 220
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
225 230 235 240
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
245 250 255
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
260 265 270
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
275 280 285
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
290 295 300
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
305 310 315 320
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
325 330 335
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
340 345 350
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
355 360 365
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
370 375 380
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
385 390 395 400
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
405 410 415
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
420 425 430
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
580 585 590
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
675 680 685
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg His His His His His His
690 695 700
<210> 3
<211> 930
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr
20 25 30
Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly
35 40 45
Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr
50 55 60
Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala
65 70 75 80
Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys
130 135 140
Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys
145 150 155 160
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165 170 175
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
180 185 190
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
195 200 205
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
210 215 220
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
225 230 235 240
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
245 250 255
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
260 265 270
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
275 280 285
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
290 295 300
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
305 310 315 320
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325 330 335
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
340 345 350
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
355 360 365
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
370 375 380
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
385 390 395 400
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
405 410 415
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala
420 425 430
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
435 440 445
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
450 455 460
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
465 470 475 480
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
580 585 590
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
595 600 605
Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu
610 615 620
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625 630 635 640
Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
645 650 655
Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser
660 665 670
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
675 680 685
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp
690 695 700
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705 710 715 720
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
725 730 735
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
740 745 750
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
755 760 765
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
770 775 780
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
785 790 795 800
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
805 810 815
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
820 825 830
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
835 840 845
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
850 855 860
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
865 870 875 880
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
885 890 895
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
900 905 910
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
915 920 925
Gly Lys
930
<210> 4
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
20 25

Claims (9)

1.一种COVID-19冠状病毒重组S1蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白的以下任一种应用，
(1)在制备COVID-19冠状病毒疫苗中的应用；
(2)在制备COVID-19冠状病毒诊断试剂或试剂盒中的应用；
(3)在制备COVID-19冠状病毒多克隆抗体或单克隆抗体中的应用；
(4)在制备预防或治疗COVID-19冠状病毒引起疾病的药物中的应用；
(5)在制备抑制或杀灭COVID-19冠状病毒的药物中的应用；
(6)在制备COVID-19冠状病毒高免血清中的应用；
(7)在筛选COVID-19冠状病毒治疗药物中的应用；
(8)在COVID-19冠状病毒疫苗质量检测中的应用；
(9)在检测COVID-19冠状病毒中的应用；
(10)在预防或治疗COVID-19冠状病毒引起疾病中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂为抗体诊断试剂或抗原诊断试剂。
4.含有权利要求1所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白的产品，所述产品为以下任一：
(1)预防或治疗COVID-19冠状病毒的疫苗；
(2)预防或治疗COVID-19冠状病毒的药物；
(3)预防或治疗COVID-19冠状病毒的诊断试剂或试剂盒；
(4)高免血清；
(5)融合蛋白。
5.权利要求1所述COVID-19冠状病毒重组S1蛋白的制备方法，其特征在于，用人IgG的信号肽去替代COVID-19冠状病毒S1蛋白的信号肽。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，用人IgG重链蛋白的信号肽去替代COVID-19冠状病毒S1蛋白的信号肽。
7.以权利要求1所述的COVID-19冠状病毒重组S1蛋白为免疫原，制得的单克隆抗体。
8.以权利要求1所述的COVID-19冠状病毒重组S1蛋白为免疫原，制得的多克隆抗体。
9.一种提高S1重组蛋白在真核细胞中表达量的方法，其特征在于，人IgG1重链的信号肽与SARS-CoV2病毒S1蛋白连接并插入到哺乳动物细胞表达载体，获得重组质粒，用其转染哺乳动物细胞，在细胞上清液中获得高浓度的病毒重组S1蛋白；所述人IgG1重链的信号肽序列如SEQ ID NO.4所示，所述SARS-CoV2病毒S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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