CN107531779A - 血清型交叉反应性登革热中和抗体和其用途 - Google Patents

血清型交叉反应性登革热中和抗体和其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了结合登革热病毒表位的分离的抗体、或其抗原结合片段、以及含有它们的试剂盒、含有它们的组合物、和包含它们的被动疫苗，在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段能够比结合登革热病毒表面糖蛋白更好地结合全登革热病毒颗粒。还公开了使用所述抗体或其抗原结合片段的方法、编码它们的核酸、表达所述核酸的载体、产生它们的宿主、以及制造它们的方法。

Description

血清型交叉反应性登革热中和抗体和其用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月17日提交的新加坡专利申请号10201502068V的优先权益，该新加坡专利申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及一种用于医学目的的制剂或制剂的特定治疗活性。具体来说，本发明涉及结合登革热病毒(或DENV)的抗体和其它药剂、以及使用所述抗体或其它药剂治疗疾病的方法。
背景技术
登革热是世界上最常见的节肢动物传播的病毒性疾病。引起登革热的病毒(即DENV)可以被分成四种不同的感染性血清型，如DENV-1、DENV-2、DENV-3、以及DENV-4。登革热感染的症状包括发热、肌肉疼痛、头痛、低血小板数和低白细胞数、凝血病、出血以及血管渗漏，这可能导致登革热休克综合征。当人在先前的登革热感染之后暴露于登革热病毒时，抗病毒抗体可以增强病毒向宿主细胞中的摄取并且所述患者处于产生登革热的严重形式的更高风险之中。然而，登革热的严重形式也可能在首次感染期间发生。
虽然是最常见的节肢动物传播的病毒性疾病，但是迄今为止，仍没有用于登革热的药物。关于登革热的方法主要是针对预防感染和/或治疗以缓解症状。
因此，需要提供能够中和和/或结合至少一种登革热血清型的药剂。
发明内容
在一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％的序列同一性的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％的序列同一性的CDRH3序列；或一种抗体、或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ ID NO:6具有至少70％的序列同一性的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％的序列同一性的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％的序列同一性的CDRL3序列；或一种抗体、或其抗原结合片段。
在又另一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH3序列；和/或至少一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL3序列；或一种抗体、或其抗原结合片段，其识别全登革热病毒颗粒。
在又另一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段。
在又另一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的分离的抗体。
在又另一个方面，存在抗至少一种登革热病毒血清型的被动疫苗，所述被动疫苗包含如本文所述的分离的抗体、或如本文所述的组合物、或如本文所述的试剂盒。
在又另一个方面，提供了一种治疗受试者的登革热病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段、或如本文所述的组合物、或如本文所述的疫苗。
在又另一个方面，提供了如本文所述的抗体、或其抗原结合片段、或如本文所述的组合物、或如本文所述的试剂盒、或如本文所述的疫苗在制造用于治疗受试者的登革热病毒感染的药物中的用途。
在又另一个方面，提供了一种用于检测样品中的至少一种登革热病毒血清型的方法。在一个实施例中，所述方法包括：(a)将所述样品与如本文所述的分离的抗体、或如本文所述的试剂盒中的至少一种一起孵育；以及(b)检测所述抗体-登革热病毒复合物，其中所述复合物的存在或不存在表明所述样品中登革热病毒的存在或不存在。
在又另一个方面，提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自由以下各项组成的组：(a)编码如本文所述的分离的抗体或其抗体片段的核酸序列；(b)如SEQ IDNO:1和2所示的核酸序列；(c)与(a)或(b)中的序列中的任一个互补的核酸；以及(d)能够在严格条件下与(a)、(b)、或(c)杂交的核酸序列。
在又另一个方面，提供了一种载体，所述载体包含如本文所述的核酸序列。
在又另一个方面，提供了一种用如本文所述的载体转化的宿主。
在又另一个方面，提供了一种制备如本文所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括从如本文所述的宿主获得所述抗体的步骤。
附图说明
在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本发明，其中：
图1示出了针对UV灭活的DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4进行mAb初始筛选的条形图。3C-H5L1抗体克隆(用箭头指出)显示与灭活的登革热病毒颗粒的低结合，且不论血清型(与x轴相邻的底部条柱)。3C-H5L1抗体的表达水平是高的(灰色条柱-顶部条柱)，如在以ng/ml为单位的IgG1的总浓度(右侧y轴)中所看到。因此，图1示出了3C-H5L1抗体的初始表征。
图2示出了显示如通过ELISA所测定的各种抗体克隆在活病毒颗粒上的结合能力的条形图。不同的病毒颗粒按降序示出，其中2641Y08(最上面的条柱)是DENV-4病毒颗粒，4141(从顶部起第二个条柱)是DENV-3病毒颗粒，TSV01(从顶部起第三个条柱)是DENV-2病毒颗粒，并且167(底部条柱)是DENV-1病毒颗粒。3C H5L1抗体的结合特征用箭头突出显示。因此，图2示出了当病毒没有被灭活时，3C H5L1与登革热病毒的所有四种血清型结合。
图3示出了显示如通过ELISA所测定的各种抗体克隆对重组E蛋白的结合能力的条形图。如由指向下的箭头所突出显示，3C H5L1与所有4种DENV血清型的重组E蛋白的结合均是非常弱的。因此，图3(以及图1和图2)示出了3C H5L1抗体的表位在全病毒颗粒上更显著地显示，特别是在存活时。
图4示出了显示用BHK-21细胞(即成纤维细胞)对3C H5L1抗体进行的空斑减少中和测定/测试(PRNT)的结果的曲线图。所使用的病毒株是DENV-1 167、DENV-2TSV01、DENV-3VN32/96以及DENV-4 2641Y08。图4示出了针对所有四种血清型的强效的体外中和能力，其中DENV2是以0.001μg/ml的EC50被中和的，其次是DENV1、DENV4、以及DENV3，它们分别是以0.6μg/ml、0.07μg/ml、以及0.5μg/ml被中和。因此，图4示出了3C H5L1抗体能够中和DENV的所有四种血清型。
图5示出了显示病毒和Fc修饰的3C H5L1抗体(具有LALA突变的3C H5L1，在图5中被命名为3C LALA)的附着前和附着后中和测定的结果的曲线图。对于附着前中和测定，将病毒和修饰的3C H5L1抗体混合，之后将混合物添加到U937-DC-SIGN(即表达DC-SIGN的单核白细胞样人细胞系U937)细胞中以进行感染。对于附着后中和测定，首先在4℃将病毒与细胞一起孵育(以避免病毒的融合和内化)。然后将病毒洗掉，并且添加修饰的3C H5L1抗体，之后将细胞在37℃孵育以引发感染。使用08K3126(即DENV-1病毒)和TSV01(即DENV-2病毒)进行测定。因此，图5示出了修饰的3C H5L1抗体在感染之前或之后存在时可以中和DENV-1血清型和DENV-2血清型这两者。
图6示出了用3C H5L1抗体和用于比较的E蛋白特异性人类单克隆抗体染色的BHK-21细胞(即成纤维细胞)的免疫组织化学图像。将BHK-21细胞感染24小时并且固定，之后用对应的抗体染色。如由暗免疫组织化学图像所示，3C H5L1抗体对DENV-1、DENV-2以及DENV-3显示出弱染色，并且对DENV-4没有显示染色。受感染的细胞在内质网(ER)中产生大量的E蛋白并且对E蛋白具有特异性的抗体因此产生非常亮的染色(参见示出了与E蛋白结合的对照抗体的染色的下部图)。由于3C H5L1仅与E蛋白微弱结合，因此所观测到的亮染色很可能是检测到与细胞表面结合的全病毒颗粒或检测到在释放之前在细胞内新产生的病毒颗粒的结果。图表中的比例尺表示100μm。因此，图6确认了3C H5L1抗体优先结合完整的病毒颗粒并且仅与E蛋白微弱结合。
图7示出了在融合抑制测定中细胞的一系列共聚焦显微镜图像。将10μg/ml的抗体(修饰的(3C-LALA)，顶部右图；野生型(WT)，中部右图；以及对照抗体，底部右图)添加到受感染的C6/36细胞(即白纹伊蚊(Aedes albopictus)克隆)中。然后通过添加酸性缓冲液触发融合。在去除病毒之后，将细胞洗涤，用碘化丙锭(PI)染色并且立即使用共聚焦显微镜成像。PI将融合细胞和单个死细胞染色。被PI染色的核簇表示融合细胞簇。细胞的白场图像被示为显微镜视野中实际细胞数的参考。使用10×放大倍数物镜。顶部左图示出了未感染的细胞中非常少的碘化丙锭(PI)染色(即非常少的亮点)。相反，底部左图示出了受DENV-2感染的细胞显示出显著数目的细胞对碘化丙锭染色呈阳性(即亮点)。图7的右图(用3C-LALA和3C-WT标记)显示出很少的碘化丙锭染色。相对而言，图7的底部右图(用对照抗体HA4标记)显示出许多细胞对碘化丙锭染色阳性。图表中的比例尺表示100μm。因此，图7示出了修饰的3C抗体和野生型3C抗体(即分别是3C-LALA和3C-WT)这两者均可以显著地阻止DENV-2融合到细胞中。
图8示出了在使用不同浓度的修饰的3C抗体的融合抑制测定中细胞的一系列共聚焦显微镜图像。在所述测定中，使用10μg/ml、1μg/ml以及0.1μg/ml的修饰的3C抗体(即3C-LALA)。顶部图示出了浓度与对细胞融合抑制之间的直接关系的趋势，其中经过10μg/ml处理的细胞有非常少的碘化丙锭阳性细胞，经过1μg/ml处理的细胞有更多的碘化丙锭阳性细胞(与10μg/ml相比)并且经过0.1μg/ml处理的细胞有更多的碘化丙锭阳性细胞(与1μg/ml相比)。使用20×放大倍数物镜。图表中的比例尺表示100μm。因此，图8示出了修饰的3C抗体可以显著地阻止登革热病毒的融合。
图9示出了在AG129或IFNAR小鼠模型中体内功效测试的实验计划的示意图。在预防模型和治疗模型中抗体转移和病毒攻击的时间点是参照攻击前或攻击后的天数来示出的。静脉内注射抗体，而腹膜内注射病毒。
图10示出了描绘在小鼠中进行3C H5L1抗体的感染前(即预防)处理的结果的点图。将100μg或10μg的3C H5L1单克隆抗体(mAb)或100μg的对照人类mAb HA4静脉内(i.v.)注射到AG129小鼠体内。在24小时后，用5×106pfu的DENV-1、DENV-2、或DENV-3感染小鼠。在感染之后的第3天，此时是病毒血症的高峰，从小鼠采集血液并且通过qRT-PCR检测病毒并且通过在实时PCR中包括具有已知pfu/ml的病毒原液将病毒标准化为pfu当量/ml血清。空斑形成单位(pfu)等同于感染性病毒颗粒并且在空斑测定中确定。具体来说，A)示出了在mAb转移之后感染了DENV-2株TSV01的小鼠中所检测到的感染的点图(如以pfu当量/ml血清所测量)；B)示出了在mAb转移之后分别感染了DENV-2株D2Y98P或DENV-1株08K3126的小鼠中所检测到的感染的点图(如以pfu当量/ml血清所测量)；以及C)示出了在感染了DENV-3(VN32/96株)的小鼠中所检测到的感染的点图(如以pfu当量/ml血清所测量)。在经过100μg的3C H5L1单克隆抗体处理的小鼠中，在感染之后的第3天没有检测到病毒血症(N.D.)(参见图10C，x轴上最左侧的项目)。因此，图10示出了3C H5L1单克隆抗体可以保护小鼠防止由至少DENV-1血清型、DENV-2血清型以及DENV-3血清型所引起的登革热病毒感染。
图11示出了感染后直到至少30天的小鼠的存活率曲线。在用1×107pfu DENV-2株D2Y98P感染(腹膜内注射)的24小时之前，小鼠接受3C H5L1(即3C)抗体或对照HA4(即HA)抗体，并且监测它们的存活率。图11示出了接受3C H5L1(具有不同的浓度)的所有小鼠均在经历感染之后存活。相反，接受对照抗体的小鼠中无一者在经历感染之后存活。因此，图11示出了3C抗体可以保护小鼠防止由登革热病毒感染所引起的死亡。
图12示出了用修饰的3C抗体(即3C H5L1抗体的LALA突变体)对小鼠进行感染前处理(预防处理)的结果。具体来说，图12示出了修饰的3C抗体在预防登革热感染的抗体依赖性增强(ADE)方面的功效的验证。在不同量的3C H5L1存在下感染K562细胞，所述3C H5L1呈它的未修饰的形式(即IgG1)或呈干扰Fcγ受体结合的突变形式(即具有LALA突变)。图12示出了在经过未修饰的3C H5L1处理的细胞中以所测量的pfu的尖峰所表现的ADE(方框中)。相反，经过修饰的3C H5L1处理的细胞没有显示出所测量的pfu的尖峰。因此，图12示出了将LALA突变引入到3C H5L1抗体中在体外消除了ADE。
图13示出了修饰的3C H5L1抗体(即具有LALA突变)的体内验证测试的结果。具体来说，A)示出了用1×107pfu DENV-2株D2Y98P感染(经由腹膜内注射)并且在用DENV2病毒感染之前的24小时经过未修饰的(野生型)3C H5L1、或修饰的3C H5L1(即具有LALA突变)、或HA4对照抗体中的一种处理的小鼠的病毒滴度。在感染之后的三天分析血液中的病毒滴度。当使用1μg的修饰的3C H5L1(即3C H5L1LALA)时，逆转了在注射1μg的3C H5L1之后所观测到的抗体依赖性增强(ADE)(仍参见图10)。B)示出了如A)中所述经过处理的小鼠的存活率曲线，其中经过1μg的修饰的3C H5L1(即3C H5L1LALA)处理的小鼠与经过1μg的未修饰/野生型3C H5L1处理的小鼠相比具有轻微的存活率优势。请注意，在该验证测试中，用于感染AG129小鼠的DENV-2病毒是非常有攻击性的毒株。因此，只有当用10μg或更多的3C H5L1处理时，小鼠才能存活(参见图11)。因此，图13示出了修饰的3C H5L1抗体和未修饰的3CH5L1抗体这两者均以剂量依赖性方式保护小鼠。
图14示出了描绘了经过或没有经过抗体预处理的IFNAR小鼠中的病毒滴度的点图。每只小鼠注射10μg的抗体。使用5×105pfu DENV-1株08K3126和107pfu DENV-2株D2Y98P进行攻击。将小鼠用PBS对照、来自Visterra公司的修饰的抗体513(即具有LALA突变)、或修饰的3C H5L1抗体(即具有LALA突变)处理。图14A)示出了感染了DENV1的IFNAR小鼠中的病毒滴度；以及B)示出了感染了DENV2的IFNAR小鼠中的病毒滴度。在感染之后的第3天测试病毒血症。因此，图14示出了经过修饰的3C H5L1抗体处理的小鼠与经过PBS对照或513Visterra抗体(用LALA突变修饰)处理的小鼠相比具有显著更低的血清病毒滴度。因此，图14示出了修饰的3C H5L1抗体可以比对照抗体更好地降低小鼠的血清病毒滴度。
图15示出了描绘了经过或没有经过抗体预处理的AG129小鼠中的病毒滴度的点图。每只小鼠注射100μg的抗体。使用1.5×106pfu DENV-3株VN32/96和108pfu DENV-4株TVP360进行攻击。将小鼠用PBS对照、来自Visterra公司的修饰的抗体513(即具有LALA突变)、或修饰的3C H5L1抗体(即具有LALA突变)处理。图15A)示出了感染了DENV3的AG129小鼠中的病毒滴度；以及B)示出了感染了DENV4的AG129小鼠中的病毒滴度。在感染之后的第4天测试病毒血症。图15示出了经过修饰的3C H5L1抗体处理的小鼠与经过PBS对照或513Visterra抗体(用LALA突变修饰)处理的小鼠相比具有更低的血清病毒滴度。因此，图15示出了修饰的3C H5L1抗体可以比对照抗体更好地降低小鼠中的血清病毒滴度。
图16示出了在小鼠中用3C H5L1抗体进行感染后处理的分析的结果。用1×107pfuDENV-2株D2Y98P腹膜内(i.p.)感染小鼠。在感染之后的48小时后，静脉内(i.v.)转移100μg的3C-H5L1或对照Ab。图16A)示出了描绘了在抗体处理之后的24小时后(在感染之后的72小时后)测量的病毒滴度(或病毒血症)的点图。图16B)示出了经过3C H5L1抗体或对照抗体处理的AG129小鼠的存活率曲线。图16示出了3C H5L1可以用作登革热病毒感染后的治疗性抗体。
图17示出了接受感染前处理(预防模型)或在用DENV-2D2Y98P进行致死攻击之后接受感染后处理(治疗模型)的小鼠的存活率曲线。在A)中，用10μg或100μg的3C抗体处理AG129小鼠，之后用DENV-2D2Y98P进行致死攻击；并且在B)中，首先感染IFNAR小鼠并且在两天后用100μg的3C抗体或对照抗体处理。图17示出了在感染前或感染后接受3C抗体的小鼠可以在经历登革热病毒的致死攻击后存活。值得注意的是，接受治疗处理的AG129小鼠在感染后的第20天与第35天之间死亡(图16)，而IFNAR小鼠存活直到至少第32天为止(图17B)。这表明与仅缺乏干扰素α/β受体的IFNAR小鼠相比，在AG129小鼠中缺乏干扰素γ受体与缺乏干扰素α/β受体的组合使得它们更容易受到感染。
图18示出了在AG129小鼠中研究3C H5L1抗体的修饰在体内预防DENV-2的作用的结果。用5μg的以下各项静脉内(i.v.)处理AG129小鼠：3C(未修饰/野生型)：没有Fc突变；3C(修饰/LALA)：在Fc部分中有LALA突变；或同种型(wt)：没有Fc突变的同种型对照。一天后，用DENV-2 D2Y98P腹膜内(i.p.)感染小鼠。在感染后的第3天测量病毒血症。图18示出了在低剂量，修饰的3C H5L1在降低AG129小鼠的病毒滴度方面至少与未修饰的3C H5L1一样有效。
图19示出了在IFNAR小鼠或AG129小鼠中研究3C H5L1抗体的修饰在体内治疗DENV-2感染的作用的结果。在用腹膜内(i.p.)注射的DENV-2 D2Y98P感染后的两天后，用100μg的以下各项静脉内(i.v.)处理IFNAR小鼠或AG129小鼠：3C(未修饰/野生型)：没有Fc突变；3C(修饰/LALA)：在Fc部分中有LALA突变；或同种型(wt)：没有Fc突变的同种型对照。在感染后的第3天测量病毒血症。图19示出了3C H5L1的LALA修饰不改变它在AG129小鼠或IFNAR小鼠中降低病毒滴度的功效。
图20示出了对由3C抗体识别的表位的研究结果。在图20A中，3C H5L1与E蛋白突变体的相对结合示于x轴上。使用与野生型蛋白质(wt E蛋白)的结合来将与突变体的结合归一化。使用HEK细胞方法观测到的结合以灰色条柱表示，而在ELISA中观测到的结合以黑色条柱表示。对于K64A、G100A、F108A、Q167A、S274A，仅进行ELISA。对于K122A、I162A、Q200A、E202A、K310A、W391A以及F392A，仅进行HEK细胞表达测定。虚线表示与wt E蛋白相比，结合减少75％，所述wt E蛋白被任意选为用于突变所引起的结合丧失的截止值。在图20B)中，在表位定位测定中所鉴定的残基示于可公开获得的E蛋白二聚体结构(PDB登录号1OAN)上。所鉴定的八个氨基酸(参见表1)在一个E蛋白单体(上部、浅灰色蛋白质)中以白点突出显示并且在第二E蛋白单体(下部、深灰色蛋白质)中以灰点突出显示。请注意，第二E蛋白单体的残基F392在图示中被隐藏，并且因此灰点加起来不是8个。
图21示出了抗体3C H5L1的核苷酸序列和氨基酸序列。
图22示出了具有LALA突变的抗体3C H5L1重链的核苷酸序列和氨基酸序列。突变在氨基酸序列中以粗体字表示。
具体实施方式
登革热病毒是世界的热带地区和亚热带地区的一种常见的健康问题。登革热病毒(或在本文被称为“DENV”)是黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)的约11kb基因组的正义单链RNA病毒。黄病毒编码单个多蛋白，所述单个多蛋白由宿主和病毒蛋白酶加工以产生三种结构蛋白，即衣壳(C)蛋白、前体膜/膜(prM/M)和包膜(E)蛋白、以及七种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、以及NS5)。抗体在针对DENV的保护中起重要作用。
在本公开中，本发明的发明人发现了能够结合DENV的替代抗体(本领域已知的那些抗体的替代抗体)。因此，在一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述抗体包含至少：一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ IDNO:3具有至少70％的序列同一性的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％的序列同一性的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％的序列同一性的CDRH3序列；或一种抗体、或其抗原结合片段。
如本文所用的术语“抗体(antibody)”可以与“抗体(antibodies)”互换使用，指的是本领域已知的常用术语，指的是特异性结合特定抗原的免疫球蛋白。所述术语包括天然产生的免疫球蛋白，这是因为它们是由生物体对抗原作出反应而产生的；以及合成产生或工程化的那些免疫球蛋白。在一个实施例中，所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一个实施例中，所述抗体可以是单克隆抗体。在一个实施例中，术语抗体可以被宽泛地解释成包括完整抗体、抗体片段、以及抗原结合片段，只要它们表现出所期望的生物活性即可。
如本领域所了解，已知典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每一个四聚体由相同的两对多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50kD-70kD)。每一条链的N末端限定了主要负责抗原识别的具有约100个至110个或更多个氨基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指的是这些轻链和重链。每一个可变区进一步细分成高变区(HV)和框架区(FR)。所述高变区包含具有高变序列的三个区域，被称作互补决定区(CDR1、CDR2以及CDR3)，它们由四个框架区(FR1、FR2、FR3、以及FR4)隔开，这些框架区形成β-折叠结构并且用作将HV区保持在适当的位置的支架。每一条重链和轻链的C末端限定了恒定区，所述恒定区由轻链的一个结构域(CL)和重链的三个结构域(CHI、CH2以及CH3)组成。在一个实施例中，所述抗体可以包括全长抗体，所述全长抗体在使用时指的是含有两条重链和两条轻链的抗体，并且所述重链和轻链任选地由二硫键缔合，如在天然产生的抗体的情况下所发生的那样。
在一个实施例中，如本文所述的抗体可以由细胞产生。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以由化学合成产生。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以源自于哺乳动物。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以源自于动物，诸如但不限于小鼠、大鼠、马、猪、或羊。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以使用重组细胞培养系统产生。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是纯化的抗体(例如通过免疫亲和色谱)。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是人类抗体。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是人源化抗体(来自非人类物种的抗体，所述抗体的蛋白质序列已经被修饰以增加它们与在人类中天然产生的抗体变体的相似性)。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是嵌合抗体(通过将来自非人类来源，例如小鼠、大鼠、马或猪的遗传物质与来自人类的遗传物质组合所制备的抗体)。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是多特异性抗体。
如本文所用的术语“分离的”指的是已经与在其最初产生时(无论是在自然界中和/或在实验环境中)、和/或由人工产生、制备、和/或制造时，与其缔合的组分中的至少一些分离的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或多于约99％的最初与其缔合的其它组分相分离。在一个实施例中，所述分离的抗体可以是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或多于约99％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其它组分，那么所述物质是“纯的”。如本文所用，对分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应当包括赋形剂(例如缓冲剂、溶剂、水等)。
同时，如本文所用的短语“抗原结合片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。举例来说，抗原结合片段可以包括但不限于Fab片段、Fab1片段、F(ab')片段、Fv片段、双价抗体、单链抗体分子、三价抗体、四价抗体、线性抗体、以及由抗体片段形成的多特异性抗体。举例来说，抗体片段包括分离的片段；由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；重组单链多肽分子，其中轻链可变区和重链可变区由肽接头连接(“ScFv蛋白”)；以及由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。在一个实施例中，如本文所述的抗原结合片段含有亲本抗体的足够的序列，它是所述亲本抗体的片段，结合与所述亲本抗体结合的相同抗原。在一个实施例中，如本文所述的抗原结合片段以与亲本抗体相当的亲和力结合抗原和/或与亲本抗体竞争结合抗原。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双价抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、以及分离的互补决定区(CDR)。抗体的抗原结合片段可以通过任何手段产生。举例来说，抗体的抗原结合片段可以通过将完整抗体片段化来酶促或化学产生和/或它可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。作为另外一种选择或除此之外，抗体的抗原结合片段可以是完全或部分合成产生的。抗体的抗原结合片段可以任选地包括单链抗体片段。作为另外一种选择或除此之外，抗体的抗原结合片段可以包含多条链，这些链是例如通过二硫键连接在一起的。抗体的抗原结合片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸并且更通常包含至少约200个氨基酸。
如本文所述的抗体可以是任何免疫球蛋白类别的成员，包括但不限于本领域已知的类别中的任一个，例如IgG、IgM、IgA、以及IgD。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是IgG抗体。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是IgG抗体中的任一种，包括但不限于IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体等。在一个实施例中，如本文所述的抗体可以是IgG1抗体。
如本文所用，如本文用于所关注的一个或多个值的术语“约”指的是类似于所述的参考值的值。在一些实施例中，除非另有说明或从上下文中显而易见，术语“约”指的是落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小百分比范围内的值的范围，所述落入为所述的参考值任一方向(大于或小于)(除非这样的数将超过可能值的100％)。
在一个实施例中，SEQ ID NO:3编码3C H5L1抗体的重链CDR1，所述重链CDR1包含GYTFTSNY(SEQ ID NO:3)。在一个实施例中，SEQ ID NO:4编码3C H5L1抗体的重链CDR2，所述重链CDR2包含INPRGGST(SEQ ID NO:4)。在一个实施例中，SEQ ID NO:5编码3C H5L1抗体的重链CDR3，所述重链CDR3包含ARGGRALFYDSYTTPRDGGSWWFDP(SEQ ID NO:5)。本文所述的序列标识号指的是图21中所述的序列。
在一个实施例中，所述分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ ID NO:6具有至少70％的序列同一性的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％的序列同一性的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％的序列同一性的CDRL3序列；或一种抗体、或其抗原结合片段。
在一个实施例中，SEQ ID NO:6编码3C H5L1抗体的轻链CDR1，所述轻链CDR1包含QDIRKY(SEQ ID NO:6)。在一个实施例中，SEQ ID NO:7编码3C H5L1抗体的轻链CDR2，所述轻链CDR2包含DAS(SEQ ID NO:7)。在一个实施例中，SEQ ID NO:8编码3C H5L1抗体的轻链CDR3，所述轻链CDR3包含QQFDDLPIT(SEQ ID NO:8)。本文所述的序列标识号指的是图21中所述的序列。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含至少一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ IDNO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％的序列同一性的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％的序列同一性的CDRH3序列；以及至少一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(d)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ IDNO:6具有至少70％的序列同一性的CDRL1序列；(e)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％的序列同一性的CDRL2序列；(f)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％的序列同一性的CDRL3序列；或一种识别全登革热病毒颗粒的抗体、或其抗原结合片段。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以包含含有如本文所述的CDR的重链氨基酸序列中的至少一个、至少两个、或全部。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以包含含有如本文所述的CDR的轻链氨基酸序列中的至少一个、至少两个、或全部。
如本文所用的术语“CDR”或“互补决定区”指的是编码抗体或其抗原结合片段的一个或多个结构元件的氨基酸序列。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段可以包含如下多肽，所述多肽的氨基酸序列包括与参考抗体中存在的CDR基本上相同的至少一个CDR(例如至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段所包括的CDR可以与参考CDR基本上相同，这是因为它序列上是相同的或与参考CDR相比含有1个、或2个、或3个、或4个、或5个氨基酸取代。在一个实施例中，所包括的CDR可以与参考CDR是基本上相同的，这是因为它与参考CDR显示出至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少81％、或至少82％、或至少83％、或至少84％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性。在一个实施例中，所包括的CDR可以与参考CDR是基本上相同的，这是因为它与参考CDR显示出至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性。在一个实施例中，所包括的CDR可以与参考CDR是基本上相同的，这是因为与参考CDR相比，在所包括的CDR内至少一个、或至少两个氨基酸被缺失、添加、或取代，但是所包括的CDR的氨基酸序列除此之外与参考CDR的氨基酸序列相同。在一个实施例中，所包括的CDR可以与参考CDR是基本上相同的，这是因为与参考CDR相比，在所包括的CDR内1个、或2个、或3个、或4个、或5个氨基酸被缺失、添加、或取代，但是所包括的CDR的氨基酸序列除此之外与参考CDR相同。在一个实施例中，所包括的CDR可以与参考CDR是基本上相同的，这是因为与参考CDR相比，在所包括的CDR内至少一个氨基酸被取代，但是所包括的CDR的氨基酸序列除此之外与参考CDR的氨基酸序列相同。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以包含如下多肽，所述多肽的氨基酸序列包括由本领域技术人员识别为免疫球蛋白可变域的结构元件。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以是具有与免疫球蛋白结合域同源或在很大程度上同源的结合域的多肽蛋白。如本领域技术人员所将了解的那样，抗体是由两条轻链和两条重链构成的，所述轻链和重链各自包含可变区和恒定区。所述轻链可变区包含3个CDR，它们在本文被标示为CDRL1、CDRL2、以及CDRL3，由框架区侧接。所述重链可变区包含3个CDR，它们在本文被标示为CDRH1、CDRH2、以及CDRH3，由框架区侧接。
如本文所用的术语“基本上”指的是表现出所关注的特征或特性的完全或接近完全的限度或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将了解的是，生物现象和化学现象很少(如果有过的话)达到完成和/或进行到完全或实现或避免绝对的结果。术语“基本上”因此在本文用于记录许多生物现象和化学现象中所固有的完全性的潜在缺乏。
在一个实施例中，如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段可以包含至少：一个、或两个或所有重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ ID NO:3具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRH1序列；(b)如SEQID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRH3序列；和/或至少一个、或两个或所有轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ ID NO:6具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％的序列同一性的CDRL3序列；或一种识别全登革热病毒颗粒的抗体、或其抗原结合片段。
在一个实施例中，如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段可以包含至少一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH3序列；和/或至少一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL3序列；或一种识别全登革热病毒颗粒的抗体、或其抗原结合片段。
在一个实施例中，如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段可以包含至少一个、或两个或所有重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH1序列；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH2序列；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH3序列；和/或至少一个、或两个或所有轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL1序列；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL2序列；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL3序列；或一种识别全登革热病毒颗粒的抗体、或其抗原结合片段。
在一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链氨基酸序列或由重链氨基酸序列组成，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2；以及(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3，所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
在另一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链氨基酸序列或由轻链氨基酸序列组成，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2；(c)如SEQID NO:8所示的CDRL3，所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
在又另一个方面，提供了一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含以下各项或由以下各项组成：重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：(a)如SEQ ID NO:3所示的CDRH1；(b)如SEQ ID NO:4所示的CDRH2；(c)如SEQ ID NO:5所示的CDRH3；以及轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：(a)如SEQ ID NO:6所示的CDRL1；(b)如SEQ ID NO:7所示的CDRL2；(c)如SEQ ID NO:8所示的CDRL3，所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
如实验部分中所示，如图2、图3、以及图6中所举例说明，本申请的发明人发现了如本文所述的抗体、或其抗原结合片段能够结合全登革热病毒颗粒。举例来说，图3示出了如本文所述的抗体不能有效地结合4种DENV血清型的重组E蛋白中的任一种。相反，如图2和图6中所示，如本文所述的抗体结合所有四种DENV病毒颗粒。因此，在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段能够比结合(重组可溶性单体)登革热病毒表面糖蛋白更好地结合全登革热病毒颗粒。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可能不能很好地结合单体登革热病毒表面糖蛋白，其为E蛋白。
如本领域已知的那样，登革热病毒(或DENV)具有四种在遗传和抗原性上相关的病毒血清型，被命名为DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4。本公开的发明人发现，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以出乎意料地结合和中和多种登革热病毒血清型。举例来说，在图2中，如本文所述的抗体可以结合所有四种DENV血清型。因此，在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段能够结合和/或中和至少一种登革热病毒颗粒。在一个实施例中，所述登革热病毒颗粒可以是选自由以下各项组成的组的登革热病毒中的至少一种、或至少两种、或至少三种、或全部：DENV血清型1型(DENV-1)、DENV血清型2型(DENV-2)、DENV血清型3型(DENV-3)、以及DENV血清型4型(DENV-4)。在一个实施例中，所述登革热病毒颗粒可以是选自由以下各项组成的组的登革热病毒中的至少一种、或至少两种、或全部：DENV血清型1型(DENV-1)、DENV血清型2型(DENV-2)以及DENV血清型3型(DENV-3)。在一个实施例中，所述登革热病毒颗粒可以是选自由DENV血清型1型(DENV-1)和DENV血清型2型(DENV-2)组成的组的至少一种、或这两种登革热病毒。在所有DENV血清型中，发现所述抗体最有效地中和DENV-2血清型。因此，在一个实施例中，所述登革热病毒可以是DENV血清型2型(DENV-2)。一般来说，“血清型”指的是细菌或病毒的物种内或不同个体的免疫细胞之间的不同变型。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含重链可变区或由重链可变区组成，所述重链可变区由与SEQ ID NO:1具有至少65％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列编码。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含重链可变区或由重链可变区组成，所述重链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO：1编码。在一个实施例中，SEQ ID NO：1是编码3C H5L1重链可变区的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如下的序列：
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGCCTGACGTCGAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCAACTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGGGTAATCAACCCTAGGGGTGGTAGCACAGCCAGCGCACAGAAATTCCAGGGAAGAATCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTTTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGGGAAGGGCCCTTTTCTATGATAGTTACACGACCCCCCGAGACGGAGGGTCGTGGTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCACCGTCTCCTCA
(SEQ ID NO：1)。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含轻链可变区或由轻链可变区组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO：2具有至少65％、或至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性的核苷酸序列编码。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含轻链可变区或由轻链可变区组成，所述轻链可变区由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码。在一个实施例中，SEQ IDNO：2是编码3C H5L1轻链的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含如下的序列：
GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCTTCACTTGCCAGGCGAGCCAGGACATTAGGAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTAATCTACGATGCATCCAATTTGAAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATACTACTGTCAACAGTTTGATGATCTCCCGATCACCTTCGGCCAGGGGACACGACTGCAGATTAAACGA(SEQ ID NO：2)。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含以下各项或由以下各项组成：由核苷酸序列SEQ ID NO：1编码的重链可变区和由核苷酸序列SEQ ID NO：2编码的轻链可变区。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：9的氨基酸序列、或与其具有至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述重链可变区包含以下氨基酸序列：
EVQLVQSGPDVEKPGASVKVSCKASGYTFTSNYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPRGGSTASAQKFQGRITMTRDTSTSTVYMELSSLRSDDTAVYYCARGGRALFYDSYTTPRDGGSWWFDPWGQGSLVTVSS(SEQ ID NO：9)。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：SEQ ID NO：10的氨基酸序列、或与其具有至少85％、或至少86％、或至少87％、或至少88％、或至少89％、或至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述轻链可变区包含以下氨基酸序列：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTFTCQASQDIRKYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLKTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDVATYYCQQFDDLPITFGQGTRLQIK(SEQ ID NO：10)。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段包含以下各项或由以下各项组成：包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的重链可变区和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的轻链可变区。
如本文所述的实验部分中所示，针对DENV病毒的抗体可以中和、抑制细胞中的病毒摄取(即抑制病毒融合到靶细胞中)，以及提供防止DENV感染的预防性保护(参见例如图4和图5的中和测定、图7和图8的融合抑制测定、以及图9至图11的体内预防测定)。然而，如本领域已知的那样，一些抗体(本领域已知)可能引起DENV感染的严重临床表现。举例来说，已知本领域已知的抗体会引起抗体依赖性增强(ADE)，这描述了病毒感染效率的不期望的增加。已知抗体依赖性增强发生于当登革热感染在非中和浓度或亚中和浓度的本领域已知的DENV血清型交叉反应性抗体的存在下发生时。在抗体依赖性增强现象中，抗体-病毒复合物附着至包括树突状细胞、巨噬细胞以及单核白细胞在内的循环抗原提呈细胞上的Fc受体，这允许DENV在带有Fc受体的细胞中复制并且与没有与抗体复合的DENV相比，实现更高的全身滴度。整体结果导致登革热的更严重的表现的可能。
为了避免抗体依赖性增强，可以提供消除抗体与Fc受体的潜在结合的修饰。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段可以是修饰的IgG1抗体、或修饰的IgG2抗体、或修饰的IgG3抗体、或修饰的IgG4抗体。在一个实施例中，所述修饰可以提高抗体的体内稳定性。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段可以具有消除抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合的修饰。不希望受理论所束缚，消除抗体与Fcγ受体的结合的修饰可以是有利的，这是因为与FcR的结合减少可以避免感染的ADE(抗体依赖性增强)现象，该现象被认为主要是由与FcR的相互作用所介导的。在一个实施例中，可以在可变区的外部引入LALA突变。在一个实施例中，可以将LALA突变引入到Fc结合域中。具有LALA突变的示例性修饰的抗体非可变(恒定)区呈现于图22中。在一个实施例中，LALA突变可以处于非可变重链区中，如图22中所示。在一个实施例中，具有LALA突变的修饰的抗体可以具有由核苷酸序列SEQ ID NO:11、或氨基酸序列SEQ ID NO:12编码的非可变重链区。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段可以具有包括但不限于糖基化、取代、突变、以及蛋白质序列修饰的修饰。在一个实施例中，修饰可以是LALA突变，如本领域先前所述的那样。应当了解的是，修饰抗体以包含LALA突变的方法是本领域已知的并且本领域技术人员将熟知将这样的修饰包括到如本文所述的抗体中。在一个实施例中，LALA突变先前已经描述于WO2012130831A1中。
如图12中的体外分析中所示，如本文所述的修饰的抗体如所预期消除了通常在抗体依赖性增强中所观测到的病毒滴度的尖峰。当在小鼠中以低浓度测试抗体时，如图13中所示，对如本文所述的抗体的修饰仅略微降低小鼠的病毒滴度(如对于所使用的低量病毒所预期的那样)，但是重要的是，没有引起如对于没有Fc修饰的抗体所观测到的病毒血症的增加(图13A)。当与如本文所述的对照未修饰的抗体相比时，具有Fc修饰的抗体略微提高了小鼠的存活率(图13B)。当作为预防性感染前处理给予时，如本文所述的抗体显著降低病毒滴度(参见图14和图15)。当作为治疗性处理给予时(即提供抗体作为感染后处理)，如本文所述的抗体可以显著地降低病毒滴度并且提高小鼠存活率(图16)，即使是在登革热病毒的致死攻击之后(图17B)。有趣的是，当与未修饰的抗体相比时，修饰的抗体在降低小鼠的病毒滴度方面的功效没有显示出变化(图18和图19)。因此，当综合考虑时，结果证实如本文所述的抗体在具有或没有所述修饰的情况下均可以提高小鼠的存活率。在引起ADE的未修饰的抗体的非常低浓度(即低于实现病毒中和所需的最低浓度)下，Fc修饰可以在体外和在小鼠中消除增强效应。
因此，在另一个方面，本发明提供了如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段用于治疗。由于如本文所述的抗体似乎能够中和登革热病毒而不引起不必要的抗体依赖性增强，因此在一个实施例中，如本文所述的抗体、或其抗原结合片段可以用于治疗患有由至少一种登革热病毒血清型所引起的登革热的受试者，无论是在病毒的首次感染期间还是在病毒的再次感染期间。
在一个实施例中，如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段可以进一步包含药剂，所述药剂包括但不限于抗病毒剂、免疫粘附分子、成像剂、治疗剂等。
在又另一个方面，提供了一种组合物，所述组合物包含如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。
在又另一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的分离的抗体。在一个实施例中，所述试剂盒可以进一步包括药剂，所述药剂包括但不限于抗病毒剂、免疫粘附分子、成像剂、治疗剂等。在一个实施例中，所述试剂盒可以用于治疗受试者的登革热病毒感染。
在一个实施例中，所述成像剂可以选自由以下各项组成的组：放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记以及生物素。
在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以对登革热病毒颗粒中存在的表位具有特异性。在一个实施例中，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以对包含至少一个如下氨基酸的表位具有特异性、或识别、或结合、或能够结合所述表位，所述氨基酸包括但不限于(如图20中所示的用于表位定位的DENV-2的)K122、I162、以及S274。在一个实施例中，所述抗体可以识别、结合、或能够结合以下各项、或对以下各项具有特异性：选自由K122、I162、以及S274组成的组的登革热病毒肽的氨基酸中的至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或全部。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段，其中当所述表位包含选自由K122、I162、以及S274组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少一个、或至少两个、全部时，所述表位可以进一步包含选自由G100、W101、K310、W391、以及F392组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少一个。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段，其中所述表位包含选自由G100、W101、K122、I162、S274、K310、W391以及F392组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个、或至少七个、或全部。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段对包含以下各项或由以下各项组成的表位具有特异性：登革热病毒糖蛋白的G100、W101、K122、I162、S274、K310、W391以及F392。在一个实施例中，所述抗体、或其抗原结合片段对包含以下各项或由以下各项组成的表位具有特异性：从DENV2中获得的登革热病毒糖蛋白的G100、W101、K122、I162、S274、K310、W391以及F392。
如本文所用的术语“表位”具有它如本领域中所了解的含义。本领域的普通技术人员将了解的是，表位也被称为抗原决定簇，是抗原中由免疫系统识别，特别是由抗体、B细胞、或T细胞识别的分子区域。将进一步了解的是，表位可以由糖、脂质、或氨基酸构成。蛋白质抗原的表位基于它们的结构和与互补位(抗体中识别表位的部分)的相互作用被分成两类，即构象表位和线性表位。构象表位由抗原的氨基酸序列的不连续部分构成，并且这些表位基于抗原的三维表面特征和形状或三级结构与互补位相互作用。线性表位基于它们的一级结构与互补位相互作用并且线性表位是由来自抗原的氨基酸的连续序列形成的。在一个实施例中，被鉴定为如本文所述的抗体的结合位点的氨基酸是以它在本领域中的常规缩写来描述的。举例来说，G指的是甘氨酸并且G之后的数字指的是与登革热病毒蛋白质单体的起点相比该氨基酸的相对位置，所述登革热病毒蛋白质单体是由两个相同的单体组成的二聚体E蛋白复合物的一部分，如具有PDB登录号1OAN(RCSB PDB(蛋白质数据库)ID：1OAN；DOI：10.2210/pdb1oan/pdb)的结构中所示。如本领域所公认的那样，W指的是色氨酸，K指的是赖氨酸，I指的是异亮氨酸，S指的是丝氨酸，并且F指的是苯丙氨酸。表位也可以跨越多个E蛋白二聚体，因为它们聚集在病毒颗粒上。
如图7、图8、图14、图15、以及图18中所示，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以用于预防性治疗。因此，在又另一个方面，本发明提供了一种被动疫苗。在一个实施例中，抗至少一种登革热病毒血清型的被动疫苗可以包括如本文所述的分离的抗体或如本文所述的组合物或如本文所述的试剂盒。如本文所用的术语“疫苗”指的是旨在提供免疫保护，例如针对致病因子的免疫保护的组合物。在一个实施例中，可以在暴露于所述致病因子(例如登革热病毒)之前、期间、和/或之后施用所述疫苗。如本文所用的术语“被动疫苗”可以与“被动免疫接种”互换使用，用于指的是其中向受试者施用抗体的免疫接种。
如图16、图17B、以及图19中所示，如本文所述的抗体、或抗原结合片段可以用于病毒感染后的治疗性治疗。因此，在又另一个方面，提供了一种治疗受试者的登革热病毒感染的方法。在一个实施例中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的分离的抗体、或其抗原结合片段、或如本文所述的组合物、或如本文所述的疫苗。在一个实施例中，所述方法进一步包括施用至少一种另外的治疗。在一个实施例中，所述至少一种另外的治疗可以是抗病毒治疗和/或抗炎剂。在又另一个实施例中，所述另外的治疗可以与所述分离的抗体、或其抗原结合片段一起或分开向患者施用。
如本文在整个本公开中所用的术语“受试者”可以与术语“患者”互换使用，指的是可以接受如本文所述的所提供的组合物、或抗体、或抗原结合片段的施用的任何生物体。举例来说，所述施用可以用于实验、诊断、预防、美容、和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物、和/或人类)。在一个实施例中，所述受试者可以是哺乳动物。在一个实施例中，所述哺乳动物可以是人类。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”(也是“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)指的是部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、延迟特定疾病、病症、和/或病况(如登革热)的一个或多个症状、特征、和/或病因的发作、降低其严重程度、和/或减少其发病率的物质(例如如本文所述的抗体、抗原结合片段或组合物)的任何施用。这样的治疗可以是对没有表现出相关疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或仅表现出所述疾病、病症、和/或病况的早期体征的受试者的治疗。作为另外一种选择或除此之外，这样的治疗可以是对表现出相关疾病、病症和/或病况的一个或多个确定体征的受试者的治疗。在一些实施例中，治疗可以是对已经被诊断为患有相关疾病、病症和/或病况的受试者的治疗。在一些实施例中，治疗可以是对已知有一个或多个易感因素的受试者的治疗，所述易感因素与患相关疾病、病症、和/或病况的风险增加具有统计学相关性。
在又另一个方面，提供了如本文所述的抗体、或其抗原结合片段或如本文所述的组合物、或如本文所述的试剂盒、或如本文所述的疫苗在制造用于治疗受试者的登革热病毒感染的药物的用途。在一个实施例中，所述药物可以与至少一种另外的治疗一起施用。在一个实施例中，所述至少一种另外的治疗可以是抗病毒治疗。
如本文所用，在整个本公开中，术语“抗病毒治疗”指的是特别用于通过抑制病毒颗粒、使病毒颗粒失活、或破坏病毒颗粒来治疗病毒感染的一类药物或治疗。在一个实施例中，抗病毒剂可以是或包含任何化学类别(例如小分子、金属、核酸、多肽、脂质和/或碳水化合物)的化合物。在一个实施例中，抗病毒治疗或抗病毒剂可以是或可以包含抗体或抗体模拟物。在一个实施例中，抗病毒剂或抗病毒治疗可以是或可以包含核酸剂(例如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA等)或其模拟物。在一个实施例中，抗病毒治疗或抗病毒剂可以是或可以包含天然存在的化合物(例如小分子)。在一个实施例中，抗病毒治疗或抗病毒剂可以是或可以具有人工产生和/或人工修饰的化学结构。
在又另一个实施例中，所述另外的治疗可以与所述分离的抗体、或其抗原结合片段一起或分开向患者施用。
如图4中所示，如本文所述的抗体可以用于结合至少一种登革热病毒血清型。因此，在又另一个方面，提供了一种用于在样品中检测至少一种登革热病毒血清型的方法。在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：将所述样品与如本文所述的分离的抗体、或如本文所述的试剂盒中的至少一种一起孵育；以及检测抗体-登革热病毒复合物，其中所述复合物的存在或不存在表明所述样品中登革热病毒的存在或不存在。在样品中检测登革热病毒血清型的方法的细节是本领域已知的并且本领域技术人员将能够执行所述方法而没有额外的实验负担。
在又另一个方面，提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包括但不限于(a)编码如本文所述的分离的抗体、或其抗体片段的核酸序列；(b)如SEQ ID NO:1和2所示的核酸序列；(c)与如本文所述的序列(即(a)或(b))中的任一个互补的核酸；(d)能够在严格条件下与(a)、(b)、或(c)杂交的核酸序列；等。
如本文所用的术语“核酸”在它的最广泛的意义上指的是被并入或可以被并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一个实施例中，核酸可以是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一个实施例中，术语“核酸”指的是单个核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一个实施例中，术语“核酸”指的是包含单个核酸残基的寡核苷酸链。如本文所用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用。在一个实施例中，“核酸”包括RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯骨架的类似物。
如本文所用的术语“严格条件”指的是那些条件。通过PCR，使用在载体的非可变部分中结合的引物(5'TGTCCACTCCCAGGTCCAAG(SEQ ID NO:13)和5'TTTCCTTTATTAGCCAGAGG(SEQ ID NO:14))来扩增重链和轻链质粒中的抗体可变区，并且使用桑格测序(Sangersequencing)对所得的PCR产物进行测序以确认如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所限定的正确序列。
在又另一个方面，提供了一种载体，所述载体包含如本文所述的核酸序列。如本文所用的术语“载体”指的是核酸分子，所述核酸分子能够转运与它缔合的另一核酸。在一个实施例中，载体可能够在诸如真核细胞和/或原核细胞的宿主细胞中对与它们连接的核酸进行染色体外复制和/或表达。载体可能够引导可操作地连接的基因的表达，在本文被称为“表达载体”。
在又另一个方面，提供了一种宿主，所述宿主是用如本文所述的载体转化的。在一个实施例中，所述宿主是细胞。在一个实施例中，所述宿主可以是细胞，它可以包括但不限于人类细胞、细菌细胞、动物细胞、真菌细胞、两栖动物细胞、植物细胞等，已知它们能够产生如本文所述的抗体、或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述细胞是细胞系。
在一个实施例中，所述细胞系可以是由本领域已知的细胞产生的，例如人类胚肾293细胞(HEK293)、CHO、293、293e、植物细胞、昆虫细胞等。
本领域技术人员将认识到的是，抗体或其抗原结合片段的产生可以在动物中进行。因此，在一个实施例中，所述宿主可以是非人类转基因动物。
在另一个方面，提供了一种制造如本文所述的抗体、或抗原结合片段的方法，所述方法包括从如本文所述的宿主获得抗体的步骤。
本文说明性描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，举例来说，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的和所述的特征或其部分的任何等同方案，而应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。
本发明已经在本文中被广泛地并且一般地描述。落入一般性公开内的较窄的类和次一般性分类中的每一个也形成本发明的一部分。这包括带有从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制的本发明之一般性描述，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。
其它实施方案在所附权利要求书和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明因此也在马库什组的任何单个成员或成员的子组的方面来描述。
实验部分
材料
Ab 3C H5L1的序列是从来自患有急性登革热感染的患者的成浆细胞中分离的，如Xu和Hadinoto等,J.Immunol,2012年12月15日；189(12):5877-85(Doi:10.4049/jimmunol.1201688)(其内容以引用的方式并入本文)中所述。用FACSAria将单个CD19+CD20-CD38高CD27高成浆细胞分选到含有Tris缓冲液和RNA酶抑制剂的96孔板中，并且立即冷冻。在解冻之后，根据由(Smith等2009.Rapid generation of fully human monoclonalantibodies specific to a vaccinating antigen(对疫苗接种抗原具有特异性的完全人类单克隆抗体的快速产生),Nat Protoc 4:372-384，其内容以引用的方式并入本文)公开的方案，通过RT-PCR从单个B细胞分别扩增人类IgG重链和κ轻链的mRNA。将重链和轻链的可变区克隆到IgG1表达质粒中(由加拿大的国家研究委员会生物技术研究所(NationalResearch Council Biotechnology Research Institute,Canada)许可)。使用293fectin将重链和轻链质粒共转染到HEK293-6E细胞中以瞬时表达抗体。使用蛋白A珠粒从培养上清液中纯化分泌的IgG1抗体。
方法
使抗体在HEK293e细胞中重组表达并且在ELISA、中和测定、免疫荧光中测试以及在小鼠中体内测试。
病毒
所使用的所有病毒是在C6/36蚊子细胞(ATCC)中产生的。使用以下患者分离登革热病毒株：DENV1-05K2916，也被称为“167”(EU081234)；DENV-1-08K3126(由新加坡的环境卫生研究所(Environmental Health Institute,Singapore)分离)；DENV2-TSV01(AY037116.1)；DENV-2D2Y98P(JF327392.1)；DENV3-VN32/96(EU482459)；DENV4-2641Y08(由新加坡的环境卫生研究所分离)；以及DENV-4TVP360(WHO参考毒株)。
ELISA(酶联免疫吸附测定)
对于DENV特异性ELISA(图1)，将MaxiSorp板(Nunc公司)用PEG沉淀的热灭活的DENV血清型1型-4型包被。将板用PBS、0.05％Tween 20(PBST)以及3％脱脂乳封闭。在室温下将来自表达Ab的HEK细胞的上清液在包被病毒的板上孵育1小时，之后用PBST洗涤并且用二级抗人类IgG-HRP(西格玛公司(Sigma))检测结合病毒的抗体。通过包括已知浓度的IgG标准的IgG特异性ELISA测定IgG的绝对浓度。在图2中，将ELISA板用4G2抗体(结合所有四种血清型的E蛋白，来自ATCC)包被并且用酪蛋白封闭。然后将板与活病毒颗粒一起孵育并且洗涤，之后添加抗体。在包被有150ng/孔的DENV-1、DENV-2、DENV-3或DENV-4的E蛋白的板上测量E蛋白特异性抗体，所述E蛋白是在S2细胞中产生的，如(Umashankar等2008,Differential cholesterol binding by class II fusion proteins determinesmembrane fusion properties(II类融合蛋白的差异胆固醇结合决定了膜融合特性),JVirol 82:9245-9253，其内容以引用的方式并入本文)中所述。使用293HEK细胞上清液或纯化的抗体进行筛选。使用来自数个登革热免疫健康供体的汇集血清作为阳性对照。使用3,3,5,5-四甲基联苯胺HRP底物溶液(TMB，西格玛公司)作为所有ELISA的底物。将是背景的2倍的OD值定义为阳性信号。
空斑减少中和测定
将BHK-21细胞(1×105个/孔)接种到24孔板中并且在37℃培养过夜。将在无血清培养基中稀释到不同浓度(30μg/ml-0.3μg/ml)的抗体3C与等体积的DENV混合并且在室温孵育2小时。将病毒-抗体混合物(100μl)转移到24孔板中并且在37℃孵育1小时，之后添加等体积的含有10％FCS和0.8％甲基纤维素的RPMI。在4.5天之后，将细胞用3.7％福尔马林固定。弃去覆盖层并且将细胞用含有0.8％PFA的结晶紫染色。通过眼睛对空斑进行计数并且在Graphpad Prism软件中使用三参数非线性曲线拟合计算PRNT50值。
免疫组织化学
将BHK-21细胞接种到96孔板中并且在37℃用DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4以MOI 1感染1小时。在去除含有5％FCS的病毒RPMI之后，将1％青霉素/链霉素添加到细胞中并且在37℃孵育细胞。在室温(RT)将感染后48小时的细胞用4％PFA固定20分钟。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将所有洗涤进行10分钟。在室温将细胞用1×PBS+0.05％Triton X-100透化15分钟，继而在室温封闭(1×PBS+1％BSA)1小时。将细胞在室温与抗体3C(1μg/ml)一起孵育1小时，洗涤并且在室温与抗人类IgG-AlexaFluor488一起孵育1小时。在两次洗涤之后，在室温添加Hoechst33342，持续5分钟。使用具有AlexaFluor488特异性吸收滤光片和激发滤光片的Olympus共聚焦显微镜将抗体结合可视化。
中和的机制：附着前和附着后中和测定
进行附着前和附着后中和测定以评估一旦病毒颗粒已经与靶细胞结合，3C抗体是否仍将能够中和。使用U937-DC-SIGN细胞进行所述测定。所述方案改编自Matthew等,Journal of Virology 2009:6494-6507(其内容以引用的方式并入本文)和Crill等,Journal of Virology 2001:7769-7773(其内容以引用的方式并入本文)。对于附着前中和测定，将细胞预冷。将恒定量的病毒与10μg/ml-0.001μg/ml最终浓度的抗体混合并且在4℃孵育1小时。将抗体-病毒混合物添加到预冷的细胞中并且在4℃孵育1小时。将细胞洗涤三次，然后在37℃孵育48小时。将细胞洗涤，固定，用结合E蛋白和NS1蛋白的抗体进行细胞内染色并且通过流式细胞术分析。使用Prism(Graphpad公司)软件绘制每个Ab浓度的受感染细胞的百分比的图以计算EC50。对于附着后中和测定，将细胞预冷。添加病毒(与上述相同的量)并且在4℃孵育1小时。将细胞洗涤三次。以10μg/ml-0.001μg/ml的最终浓度添加抗体并且在4℃孵育1小时。将细胞洗涤三次，然后在37℃孵育48小时。如附着前测定那样进行细胞的染色。
如图5中所示，在病毒与细胞附着前和附着后均观测到中和作用。然而，在附着前实验中存在更有效的中和的趋势。
中和的机制：融合抑制
成功感染的一个必要部分是登革热病毒颗粒与宿主细胞的融合。一旦病毒与宿主膜融合，病毒RNA就可以被释放到细胞质中并且可以被翻译，从而引发病毒的复制。在病毒由细胞摄取之后，在内体中发生融合事件，这是由该细胞隔室中的低pH值所触发。已知一些登革热抗体能够阻断该融合事件。用于体外对此进行测试的方法是使用C6/36细胞，所述细胞具有类似于人类内体的细胞膜组成。在体外降低pH值时，受感染细胞融合。这些融合体是可渗透的并且将核用碘化丙锭(PI)染色。所述方法由Rajamanonmani等,Journal ofGeneral Virology 2009(90)799-809(其内容以引用的方式并入本文)详细描述。简单地说，将每孔500,000个C6/36细胞与DENV-2TSV01MOI 0.01混合并且在28℃在96孔板中孵育72小时。然后将不同浓度的抗体添加到细胞中并且在28℃孵育1小时。添加0.5M的MES缓冲液(pH 5)(最终浓度0.0125M)以诱导合胞体形成(在37℃下1小时)。去除培养基并且将于RPMI溶液中0.025mg/ml的碘化丙锭(PI)添加到细胞中并且在28℃孵育30分钟。然后立即使用共聚焦显微镜将细胞成像。
抗体依赖性增强(ADE)测定
在37℃将等体积的恒定量的病毒和递减量的抗体3C(从30μg/ml开始)孵育1小时。然后将这些病毒-抗体混合物转移到在圆底96孔板中预先等分的K562细胞中并且在37℃孵育1小时。将细胞用PBS洗涤两次并且在含有FCS的RPMI培养基中孵育72小时。如对于空斑减少中和测定所述，使用基于BHK-21细胞的空斑测定和结晶紫染色，测定受感染的K562细胞的上清液中的病毒。
小鼠模型
将在Sv129背景(AG129)小鼠上的干扰素α/β/γ受体敲除小鼠(英国的U&KUniversal公司)和在C57BL-6背景(IFNAR)小鼠上的干扰素α/β受体敲除小鼠(最初来自瑞士EPFL的Michel Aguet教授)在SPF条件下关养在新加坡的生物资源中心(BRC)(Biological Resource Center,Singapore)。动物实验是根据新加坡的农业食品和兽医局(Agri-Food and Veterinary Authority，AVA)和国家实验室动物研究咨询委员会(National Advisory Committee for Laboratory Animal Research，NACLAR)的规则和指导方针进行的。所述实验是由新加坡生物资源中心的机构审查委员会(Institutionalreview board)审查和批准的。
使用以下病毒株进行感染：DENV-1 08K3126、DENV-2TSV01或D2Y98P、DENV-3VN-32/96、DENV-4TVP360。
体内测定：感染前处理(预防性)
经由后眼眶窦来静脉内注射于100μl的PBS中的Ab。使用RPMI培养基中的DENV将小鼠腹膜内感染24小时。在感染后的三天后，将小鼠从后眼眶窦取血到含有20μl柠檬酸钠作为抗凝剂的管中。将血液管以1000g离心5分钟并且收集血浆并且冷冻用于随后的分析。
体内测定：感染后处理(治疗性)
使用RPMI培养基中的DENV腹膜内感染小鼠。在感染48小时后，经由后眼眶窦静脉内注射Ab 3C H5L1。24小时后(感染后的第3天)，经由后眼眶窦将血液采集到含有20μl柠檬酸钠作为抗凝剂的管中。将血液管以1000g离心5分钟并且收集血浆并且冷冻用于随后的分析。
在预防模型中针对所有四种DENV血清型的功效和Ab 3C与公开的治疗性登革热抗体的比较
在图14和图15中，使用AG129小鼠或IFNAR小鼠评估针对DENV-1、DENV-2、DENV-3以及DENV-4的抗体的预防性保护。在感染后的第3天或第4天测试病毒血症。在AG129小鼠和IFNAR小鼠中的功效是非常相似的(比较图19A和图19B)。IFN-γ受体似乎对功效没有影响，至少是在感染后的早期。如“体内测定：感染前处理(预防性)”中所述，用抗体处理小鼠。在相同的实验中，将抗体3C的功效与来自Visterra公司的抗体513的功效(描述序列的专利被公开)相比较。这两个抗体批次是由中外株式会社(Chugai)同时生产的，并且这两种抗体在Fc部分中均含有LALA突变。如“体内测定：感染前处理(预防性)”中所述，用抗体处理小鼠。对于DENV-1和DENV-2每种抗体使用10μg，并且对于DENV-3和DENV-4每种抗体使用100μg。结果显示3C对所有四种DENV血清型都比Ab 513更有效地减少病毒血症。
在治疗模型中针对DENV-2的功效
DENV-2D2Y98P引起死亡并且因此使用DENV-2模型来评估Ab 3C的保护能力。
3C的表位
使DENV-2的许多全长E蛋白突变体在HEK293细胞中瞬时表达并且通过流式细胞术测试3C与这些转染的HEK细胞的结合。
此外，也使E蛋白的可溶性部分在S2细胞中表达。DENV-2(毒株TSV01)的各种突变体和野生型形式被表达，纯化并且用于ELISA中。E蛋白含有V5标签并且将板用抗V5抗体包被，继而添加各E蛋白。这种夹心方法与其中将E蛋白直接包被到板上的ELISA相比增加了3C的结合，这可能是因为E蛋白的多聚化。
使用QuikChange定点诱变试剂盒(安捷伦基因组公司(Agilent Genomics))引入突变。将HEK293细胞以100,000个细胞/孔接种到24孔板中并且孵育过夜。然后使用293transfectin，根据制造商的方案将细胞用含有DENV-2TSV01的prM和E蛋白的1μgpcDNA3.1转染。在感染后72小时，收获细胞并且通过流式细胞术分析：将转染的HEK细胞与3C抗体一起孵育，继而与抗人类IgG-FITC一起孵育。为了测试E蛋白突变体的表达，使用对DENV-2EDIII具有特异性的抗体3H5(来自ATCC)，继而与抗小鼠IgG-FITC一起孵育。使用下式计算相对结合：3C对E蛋白突变体x的相对结合＝[(针对突变体x用3C/抗人类IgG染色的FITC阳性细胞％)/(针对突变体x用3H5/抗小鼠IgG染色的FITC阳性细胞％)]/[(针对野生型E蛋白用3C/抗人类IgG染色的FITC阳性细胞％)/(针对野生型E蛋白用3H5/抗小鼠IgG染色的FITC阳性细胞％)]。
对于ELISA，使许多E蛋白突变体(E蛋白的可溶性部分)在S2细胞中表达，如部分“ELISA”中所述。使用QuikChange定点诱变试剂盒(安捷伦基因组公司)引入突变。E蛋白构建体也含有V5标签。使用螯合琼脂糖凝胶珠粒纯化E蛋白突变体。将Nunc免疫测定ELISA板用小鼠抗V5标签抗体包被。在用含3％牛奶的PBST封闭之后，将5μg/ml的E蛋白突变体添加到孔中，持续2小时。在洗涤后，将抗体3C按一式两份添加到所有E蛋白突变体中并且在室温孵育1小时。用抗人类IgG-HRP检测3C。使用TMB底物进行显色反应。作为阳性对照，使用具有不同表位的三种人类登革热抗体的混合物。该阳性对照的结合对所有E蛋白突变体均是相似的并且因此与每一种突变体结合的3C的值仅除以与野生型E蛋白结合的3C的值。
使许多DENV-2的全长E蛋白突变体在HEK293细胞中瞬时表达并且通过流式细胞术测试3C与这些转染的HEK细胞的结合。此外，也使E蛋白的可溶性部分在S2细胞中表达。使DENV-2(毒株TSV01)的各种突变体和野生型形式表达，纯化并且用于ELISA中。E蛋白含有V5标签并且将板用抗V5抗体包被，继而添加各E蛋白。这种夹心方法与其中将E蛋白直接包被到板上的ELISA相比增加了3C的结合，这可能是因为E蛋白的多聚化。
在图20中，3C与E蛋白突变体的相对结合示于x轴上。使用与野生型蛋白质(wt E蛋白)的结合来将与突变体的结合归一化。使用HEK细胞方法所观测到的结合以灰色条柱示出，而在ELISA中所观测到的结合以黑色条柱示出。对于K64A、G100A、F108A、Q167A、以及S274A，仅进行ELISA。对于K122A、I162A、Q200A、E202A、K310A、W391A、以及F392A，仅进行HEK细胞表达测定。虚线表示与wt E蛋白相比，结合减少75％，所述wt E蛋白被任意选为用于突变所引起的结合丧失的截止值。
表1：在HEK和/或ELISA测定中3C H5L1与E蛋白突变体的相对结合。E蛋白中引起结合丧失大于75％的氨基酸取代以粗体字突出显示。这些突出显示的氨基酸在这里使用的测定中定义了3C H5L1的表位。
H HEK ELISA
E49A 0.9957073 0.6953955
K64A 0.4441286
Q77A 0.3799409 0.7472253
G100A 0.1862654
W101A 0.1646154 0.2416909
F108 0.8061085
K122A 0.2701714
N134A 1.076023 0.2214801
N153A 0.5353212 0.805963
T155A 0.6206209 0.8386407
E161A 1.069562
I162A 0.2423869
Q167A 0.7740121
S169A 0.9633535 0.784286
Q200A 0.394081
E202A 2.024244
N203A 0.7187698 0.7201147
S274A 0.08588301
K295A 1.036517 0.189356
K310A 0.150000
R323A 0.4162633 0.3338105
W391A 0.144225
F392A 0.1325641
阴性 0.01564103 0.070000
wt 1.000000 1.000000
总结
3C H5L1抗体在体外结合和中和DENV-2，并且在较小程度上但仍非常强效地(以mM至nM范围的EC50)结合和中和DENV-1、DENV-3、DENV-4。3C H5L1抗体确实结合全病毒颗粒并且不是有效地结合重组E蛋白。3C H5L1抗体在体内对所有四种DENV血清型都具有显著的体内功效并且防止因致死DENV-2株所导致的死亡。通过在3C H5L1的Fc部分中引入修饰(如LALA突变)可完全消除在低量3C H5L1的情况下所观测到的抗体依赖性增强(即ADE)而不会损害体内功效。所观测到的针对四种血清型的功效和针对致死DENV-2的保护是由针对登革热病毒(即DENV)的其它已知的抗体不能满足的。虽然本领域已知的非常强效的中和抗体通常对一种血清型具有特异性，但是如本文所述的抗体已经被证实对多种DENV血清型具有中和能力。实际上，在体内，如本文所述的抗体对所有四种DENV血清型显示均是强效的。
序列表
<110> 新加坡科技研究局
新加坡国立大学
<120> 血清型交叉反应性登革热抗体和其用途
<130> 9869SG3767
<150> SG10201502068V
<151> 2015-03-17
<160> 12
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 重链可变区
<400> 1
gaggtccagc tggtacagtc tgggcctgac gtcgagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agcaactata tacactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggggta atcaacccta ggggtggtag cacagccagc 180
gcacagaaat tccagggaag aatcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtttac 240
atggaactga gcagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggggga 300
agggcccttt tctatgatag ttacacgacc ccccgagacg gagggtcgtg gtggttcgac 360
ccctggggcc agggaagcct ggtcaccgtc tcctca 396
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 轻链可变区
<400> 2
gacatccagt tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
ttcacttgcc aggcgagcca ggacattagg aagtatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct aatctacgat gcatccaatt tgaaaacagg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacatacta ctgtcaacag tttgatgatc tcccgatcac cttcggccag 300
gggacacgac tgcagattaa acga 324
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRH1
<400> 3
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn Tyr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRH2
<400> 4
Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 5
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRH3
<400> 5
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
1 5 10 15
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro
20 25
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRL1
<400> 6
Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
1 5
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRL2
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 7
Asp Ala Ser Xaa
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CDRL3
<400> 8
Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile Thr
1 5
<210> 9
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 重链可变区
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Val Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Arg Gly Gly Ser Thr Ala Ser Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Tyr Asp Ser Tyr Thr Thr Pro Arg
100 105 110
Asp Gly Gly Ser Trp Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 轻链可变区
<400> 10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Phe Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Arg Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Asp Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Gln Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 具有LALA突变的3C H5L1重链恒定区
<400> 11
gcttccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagtc gacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagtggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagtag tgtggtgacc gtgccctcca gtagtttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagt aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaggc cgccggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagt cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agtacgtacc gtgtggtcag tgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag tctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagtgacatc 780
gccgtggagt gggagagtaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agtaagctca ccgtggacaa gagtaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagtc tctccctgtc tccg 984
<210> 12
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 具有LALA突变的3C H5L1重链恒定区
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (117)..(118)
<223> LALA突变
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325

Claims (33)

1.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：
一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(a)SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的CDRH1序列；
(b)SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％的序列同一性的CDRH2序列；
(c)SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％的序列同一性的CDRH3序列；
或抗体、或其抗原结合片段。
2.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：
一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(a)SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ ID NO:6具有至少70％的序列同一性的CDRL1序列；
(b)SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％的序列同一性的CDRL2序列；
(c)SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％的序列同一性的CDRL3序列；
或抗体、或其抗原结合片段。
3.如权利要求1或2所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：
一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(a)SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与SEQ ID NO:3具有至少70％的序列同一性的CDRH1序列；
(b)SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与SEQ ID NO:4具有至少70％的序列同一性的CDRH2序列；
(c)SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与SEQ ID NO:5具有至少70％的序列同一性的CDRH3序列；以及
至少一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(d)SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与SEQ ID NO:6具有至少70％的序列同一性的CDRL1序列；
(e)SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与SEQ ID NO:7具有至少70％的序列同一性的CDRL2序列；
(f)SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与SEQ ID NO:8具有至少70％的序列同一性的CDRL3序列；
或抗体、或其抗原结合片段，其识别全登革热病毒颗粒。
4.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含至少：
一个重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(a)SEQ ID NO:3所示的CDRH1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH1序列；
(b)SEQ ID NO:4所示的CDRH2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH2序列；
(c)SEQ ID NO:5所示的CDRH3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRH3序列；和/或
至少一个轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的至少一个CDR：
(a)SEQ ID NO:6所示的CDRL1、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL1序列；
(b)SEQ ID NO:7所示的CDRL2、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL2序列；
(c)SEQ ID NO:8所示的CDRL3、或源于其的与其有1个或2个氨基酸不同的CDRL3序列；
或抗体、或其抗原结合片段，其识别全登革热病毒颗粒。
5.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：
(a)SEQ ID NO:3所示的CDRH1；
(b)SEQ ID NO:4所示的CDRH2；以及
(c)SEQ ID NO:5所示的CDRH3；
所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
6.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：
(a)SEQ ID NO:6所示的CDRL1；
(b)SEQ ID NO:7所示的CDRL2；
(c)SEQ ID NO:8所示的CDRL3；
所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
7.一种分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：
重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：
(a)SEQ ID NO:3所示的CDRH1；
(b)SEQ ID NO:4所示的CDRH2；
(c)SEQ ID NO:5所示的CDRH3；以及
轻链氨基酸序列，所述轻链氨基酸序列包含选自由以下各项组成的组的所有CDR：
(a)SEQ ID NO:6所示的CDRL1；
(b)SEQ ID NO:7所示的CDRL2；
(c)SEQ ID NO:8所示的CDRL3；
所述分离的抗体、或其抗原结合片段识别全登革热病毒颗粒。
8.一种抗体、或其抗原结合片段，所述抗体、或其抗原结合片段对包含选自由K122、I162、以及S274组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少一个的表位具有特异性。
9.如权利要求8所述的抗体、或其抗原结合片段，其中当所述表位包含选自由K122、I162、以及S274组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少一个时，所述表位进一步包含选自由以下各项组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少一个：G100、W101、K310、W391、以及F392。
10.如权利要求8或9所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述表位包含选自由以下各项组成的组的登革热病毒糖蛋白的氨基酸中的至少三个：G100、W101、K122、I162、S274、K310、W391以及F392。
11.如权利要求1至10中任一项所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体能够比结合登革热病毒表面糖蛋白更好地结合全登革热病毒颗粒。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述糖蛋白是E蛋白。
13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述登革热病毒颗粒是选自由以下各项组成的组的至少一种登革热病毒：DENV血清型1型(DENV-1)、DENV血清型2型(DENV-2)、DENV血清型3型(DENV-3)、以及DENV血清型4型(DENV-4)。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由与SEQ ID NO:1具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列编码的重链可变区。
15.如权利要求14所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由所述核苷酸序列SEQ ID NO:1编码的重链可变区。
16.如权利要求1至15中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性的核苷酸序列编码的轻链可变区。
17.如权利要求16所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由所述核苷酸序列SEQ ID NO:2编码的轻链可变区。
18.如权利要求1至17中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体、或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列、或与其具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。
19.如权利要求1至18中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体、或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、或与其具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。
20.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
21.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述抗体是修饰的IgG1抗体、修饰的IgG2抗体、修饰的IgG3抗体、或修饰的IgG4抗体。
22.如权利要求21所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，其中所述修饰消除了抗体与Fcγ受体(FcγR)的结合。
23.如前述权利要求中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段，所述分离的抗体、或其抗原结合片段用于治疗中。
24.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段。
25.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体。
26.一种针对至少一种登革热病毒血清型的被动疫苗，所述被动疫苗包括如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体或如权利要求24所述的组合物或如权利要求25所述的试剂盒。
27.一种治疗受试者的登革热病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体、或其抗原结合片段或如权利要求24所述的组合物、或如权利要求26所述的疫苗。
28.如权利要求1至22中任一项所述的抗体、或其抗原结合片段或如权利要求24所述的组合物、或如权利要求25所述的试剂盒、或如权利要求26所述的疫苗在制造用于治疗受试者的登革热病毒感染的药物的用途。
29.一种用于在样品中检测至少一种登革热病毒血清型的方法，所述方法包括：
a.将所述样品与如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体、或如权利要求25所述的试剂盒中的至少一种一起孵育，以及
b.检测抗体-登革热病毒复合物，其中所述复合物的存在或不存在表明所述样品中登革热病毒的存在或不存在。
30.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自由以下各项组成的组：
a.编码如权利要求1至22中任一项所述的分离的抗体、或其抗体片段的核酸序列；
b.SEQ ID NO:1和2中所示的核酸序列；
c.与(a)或(b)中的所述序列中的任一个互补的核酸；以及
d.能够在严格条件下与(a)、(b)、或(c)杂交的核酸序列。
31.一种载体，所述载体包含如权利要求30所述的核酸序列。
32.一种宿主，所述宿主由如权利要求31所述的载体转化。
33.一种制造如权利要求1至22中任一项所述的抗体、或抗原结合片段的方法，所述方法包括从如权利要求32所述的宿主获得所述抗体的步骤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590943A (zh) * 2018-06-12 2019-12-20 赖思佳 抗登革热病毒抗体及其应用
WO2022001803A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 神州细胞工程有限公司 一种降低病毒ade效应的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8
SG10201607778XA (en) * 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
TWI769185B (zh) 2016-10-27 2022-07-01 海樂源有限公司 登革熱類病毒顆粒、抗登革熱病毒抗體、及含其之組合物
TWI827585B (zh) 2018-03-15 2024-01-01 日商中外製藥股份有限公司 對茲卡病毒具有交叉反應性的抗登革病毒抗體及其使用方法
TWI737918B (zh) * 2018-06-12 2021-09-01 國防醫學院 抗登革病毒抗體及其應用
CN109929033B (zh) * 2019-03-15 2020-06-02 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种特异性结合四种血清型登革病毒的人源抗体
WO2022163845A1 (ja) * 2021-01-31 2022-08-04 株式会社バランス・イースト 検査システム、検査方法、プログラム、およびコンピュータが読み取り可能な記憶媒体

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687926A (zh) * 2007-05-23 2010-03-31 哮喘和气道Crc有限公司 中和抗体
CN102272155A (zh) * 2008-10-13 2011-12-07 生物医学研究所 登革热病毒中和抗体及其用途
WO2013089647A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Agency For Science, Technology And Research Binding molecules against dengue virus and uses thereof
WO2013173348A1 (en) * 2012-05-14 2013-11-21 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Cross-reactive antibodies against dengue virus and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028879A1 (en) 2000-10-05 2002-04-11 Case Western Reserve University Suppressor of human breast cancer cell growth
US8470976B2 (en) 2006-06-17 2013-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting macromolecules into the nucleus
EP3590965A1 (en) 2011-03-29 2020-01-08 Roche Glycart AG Antibody fc variants
CN106211773B (zh) * 2014-02-11 2021-09-03 威特拉公司 用于登革病毒的抗体分子及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101687926A (zh) * 2007-05-23 2010-03-31 哮喘和气道Crc有限公司 中和抗体
CN102272155A (zh) * 2008-10-13 2011-12-07 生物医学研究所 登革热病毒中和抗体及其用途
WO2013089647A1 (en) * 2011-12-16 2013-06-20 Agency For Science, Technology And Research Binding molecules against dengue virus and uses thereof
WO2013173348A1 (en) * 2012-05-14 2013-11-21 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Cross-reactive antibodies against dengue virus and uses thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTINA BELTRAMELLO等: "The human immune response to dengue virus is dominated by highly cross-reactive antibodies endowed with neutralizing and enhancing activity", 《CELL HOST MICROBE》 *
MEIHUI XU等: "Plasmablasts generated during repeated dengue infection are virus glycoprotein–specific and bind to multiple virus serotypes", 《J IMMUNOL》 *
RUKLANTHI DE ALWIS等: "Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions", 《PROC NATL ACAD SCI U S A》 *
SCOTT A SMITH等: "The potent and broadly neutralizing human dengue virus-specific monoclonal antibody 1C19 reveals a unique cross-reactive epitope on the Bc loop of domain II of the envelope protein", 《MBIO.》 *
WANWISA DEJNIRATTISAI等: "A new class of highly potent, broadly neutralizing antibodies isolated from viremic patients infected with dengue virus", 《NATURE IMMUNOL.》 *
WEN-YANG TSAI等: "High-avidity and potently neutralizing cross-reactive human monoclonal antibodies derived from secondary dengue virus infection", 《J VIROL.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590943A (zh) * 2018-06-12 2019-12-20 赖思佳 抗登革热病毒抗体及其应用
CN110590943B (zh) * 2018-06-12 2022-11-25 赖思佳 抗登革热病毒抗体及其应用
WO2022001803A1 (zh) * 2020-06-28 2022-01-06 神州细胞工程有限公司 一种降低病毒ade效应的方法

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