CN106211773B - 用于登革病毒的抗体分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了特异性结合登革病毒的抗体分子。在某些实施方案中，所述抗体分子与登革病毒血清型DV‑1、DV‑2、DV‑3和DV‑4结合。所述抗体分子能够被用于治疗、预防、和/或诊断登革病毒。

Description

用于登革病毒的抗体分子及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2014年提交的美国临时申请号61/938,646的申请、2014年6月27日提交的美国临时申请号62/017,970的申请、以及2014年9月5日提交的美国临时申请号62/046,379的申请的优先权。在先申请的公开内容被认为是本申请的公开内容的一部分(并且全部以引用的方式结合到本文中作为参考)。
序列表
本申请包含一个序列表，所述序列表是以ASCII格式进行电子提交，并且其在此一杯全部引入到本发明中作为参考。所述ASCII副本，创建于2015年1月7日，被命名为P2029-7002WO_SL.txt，并且文件大小为75,052字节。
发明背景
登革病毒是一种正义RNA病毒，属于黄病毒科(Fkaviviridae)的黄病毒属。登革病毒广泛分布于全世界的热带和亚热带地区，并且是通过蚊虫载体传播给人类。在至少8个热带亚洲国家登革病毒是儿童住院治疗和死亡的主要原因(WHO，1997.Dengue haem或者rhagic fever:diagnosis，treatment prevention and control--2nd ed.Geneva:WHO)。目前存在四种登革病毒的血清型(DV-1、DV-2、DV-3和DV-4)，它们每年估计造成50万-100万例登革热病例以及500,000例情况更为严重的登革病毒感染、登革出血热/登革休克综合症(DHF/DSS)(Gubler，D.J.&Meltzer，M.1999Adv Virus Res 53:35-70)。DHF/DSS主要发生在儿童和成年人中，他们将经历与第一次登革病毒感染所不同的血清型的第二次登革病毒感染，并且重要的是其仍然感染具有循环登革特异性母体抗体的婴儿(Burke，D.S.etal.1988Am J Trop Med Hyg 38:172-80；Halstead，S.B.et al.1969Am J Trop Med Hyg18:997-1021；Thein，S.et al.1997Am J Trop Med Hyg 56:566-72)。
血清型不同的登革病毒在氨基酸水平上大约有25-40％的不同，并且具有抗原性差异，而且这种变化还会妨碍针对全部血清型产生的有效治疗。
全部四种登革病毒血清型都显示在病毒表面上的E(包膜)蛋白质。所述E蛋白质有助于病毒附着到宿主细胞上。所述E蛋白包括DI区域(一种九链的β桶)、DII区域(一种涉及与宿主细胞融合的区域)、以及DIII区域(免疫球蛋白样结构域)。在人类中对于E蛋白质的体液应答通常靶向DI区域和DII区域，其中大部分的抗体表现出高交叉血清型反应性及低中和活性。
因此，在本领域中针对登革病毒有必要寻找一种新的预防性及治疗性处理方式，并且特别是针对全部四种血清型的病毒的有效治疗方式。
发明内容
本发明提供，至少部分地提供了，与登革病毒连接的抗体分子，例如，登革病毒E蛋白，并且本发明还包括在这里所公开的功能和结构特性。在某些实施方案中，所述抗体分子连接到EDIII(E蛋白DIII区域)的“A”β链。在某些实施方案中，所述抗体分子连接和/或中和至少1，2，3或者4种登革病毒血清型(例如，DV-1，DV-2，DV-3和DV-4)。在某些实施方案中，所述抗体分子选自表1。在某些实施方案中，所述抗体分子与抗体A11项目包括一种VH S26的缺失和/或一种VH T33V取代。在某些实施方案中，这些突变可以改善一种或多种特性，例如，改善针对一种或多种登革病毒血清型(例如血清型DV-4)的抗体亲和力。在某些实施方案中，所述抗体分子靶向在EDIII上的位点，其在所有四种登革病毒之间是保守的。在这里还提供了编码所述抗体分子的核苷酸分子、表达载体、宿主细胞、药物组合物以及用于产生所述抗体分子的方法。在这里所公开的抗-登革抗体分子可被用于(单独或者与其它试剂或者治疗方式联合)治疗、预防和/或诊断登革病毒，例如DV-1、DV-2、DV-3或者DV-4。
综上所述，在一些方面，本发明公开了一种抗体分子(例如，一种分离抗体分子、重组抗体分子或者人源化抗体分子)，其具有一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或者所有)选自下述目录1的特性：
a)以高亲和力与EDIII(例如，获自任意登革病毒血清型的一种或多种EDIII，例如获自DV-1、DV-1、DV-3或DV-4，例如，获自DV-1、DV-1、DV-3或DV-4的所有四种EDIII)连接，例如，具有少于大约100nM的解离常数(KD)，典型地约为10nM，并且更为典型地，大约10-0.01nM，大约5-0.01nM，大约3-0.05nM，大约1-0.1nM，或者更强，例如少于大约80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05或者0.01nM，
b)以高亲和力与DV-4EDIII连接，例如，具有少于大约100nM的解离常数(KD)，例如，大约10nM，例如大约10-1nM或更强，例如，小于大约10、8、6、5、4或者3nM，
c)以比抗体A11(在这里也被称为4E5A)和/或抗体4E11更高的亲和力与DV-4和/或DV-3EDIII区域结合，例如，至少2、3、4、5、6、8、10、12、15、100、1,000、5,000、或者10,000倍更、高的亲和力，
d)登革病毒(例如，DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的一种或多种，例如，全部DV-1、DV-2、DV-1、DV-3和DV-4)，例如，在一种聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中，
e)与抗体A11和/或抗体4E11相比中和具有增加的IC50的DV-4，例如，至少2、3、4、5、6、8、10、12、25、50、75、100或者1,000倍增加的IC50，例如，在一种聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中，
f)在相对于A11的一个或多个位点上具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，例如，一种保守取代)，例如，在VH和/或VL中，例如，在一个或多个CDR或者框架区域内，
g)相对于A11在重链CDR1区域中具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如，一种取代比方说T33V取代，
h)相对于A11在重链FW1中的位点26上，具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种缺失，
i)相对于A11在重链CDR1区域中具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)例如一种取代比方说T33V突变，同时相对于A11在重链FW1中的位点26上具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种缺失，
j)相对于A11在重链CDR1区域中具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种取代比方说T33V突变，并且具有改善的(例如相对于A11)于至登革病毒连接和/或改善的登革病毒中和性，例如针对一种或多种(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，
k)相对于A11在重链FW1中的位点26上具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种缺失，并且具有例如相对于A11)与登革病毒改善的连接和/或登革病毒改善的中和性，例如针对一种或多种(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，比方说针对DV-4，
l)同时相对于A11在重链CDR1区域中具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种取代比方说T33V取代，以及相对于A11在重链FW1中的位点26上有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代，比方说保守取代)，例如一种缺失，并且具有例如相对于A11)与登革病毒改善的连接和/或登革病毒改善的中和性，例如针对一种或多种(例如所有血清型)DV-1、DV-2、DV-3和DV-4，比方说针对DV-4，
m)针对在附图10A-10B、11和19-21中所列的一种或多种(例如所有的)登革病毒菌株的EDIII显示出改善的结合性，例如一种或多种DV-2菌株、一种或多种DV-3菌株、一种或多种DV-4菌株，例如DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)、以及DENV-4H241中的一种或多种，例如，具有至少2、3、4、5、6、8、10、12、25、50、75、100或者1,000倍高的亲和力，
n)破坏在病毒体表面上的E蛋白的天然结构，例如其会引起病毒的失活，
o)特异性结合至EDIII上的表位，例如与通过A11或者B11单克隆抗体识别的表位相同或者相似的表位，
p)显示出与表1中的抗体(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)相同或者相似的结合亲和力或者特异性，或者它们二者，
q)显示出与表1中所描述的抗体分子(例如，一种重链可变区域以及轻链可变区域)相同或者相似的结合亲和力或者特异性，或者它们二者，例如，D88、A48、F38、F108或者C88，
r)显示出与包括表2中所示氨基酸序列的抗体分子(例如，一种重链可变区域以及轻链可变区域)相同或者相似的结合亲和力或者特异性，或者它们二者，
s)抑制(例如完全抑制)第二抗体分子与EDIII的结合，其中所述第二抗体分子指的是在这里所描述的一种抗体分子，例如一种从表1中选择的抗体分子，比方说D88、A48、F38、F108或者C88，
t)用第二抗体分子将相同或者重叠的表位结合至EDIII，其中所述第二抗体分子指的是在这里所描述的一种抗体分子，例如一种从表1中选择的抗体分子，比方说D88、A48、F38、F108或者C88，
u)用一种第二抗体分子竞争结合并且结合相同表位至EDIII，其中所述第二抗体分子指的是在本发明中所描述的一种抗体分子，例如一种从表1中选择的抗体分子，比方说D88、A48、F38、F108或者C88，
v)具备本发明所描述的抗体分子的一种或多种生物学特性，例如，选自表1的抗体分子，比方说D88、A48、F38、F108或者C88，
w)具有本发明所描述的抗体分子的一种或多种药代动力学特性，例如，选自表1的抗体分子，比方说D88、A48、F38、F108或者C88，或者
x)抑制登革病毒的一种或多种活性，例如中和所述病毒(举例来说，在一种聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中进行测量)。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有一种突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代比如保守取代)，例如相对于A11在重链CDR1区域洪的T33V突变，其与上述目录1的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。在一些实施方案中，所述抗体分子同时具有相对于A11在重链CDR1区域中的突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代比方说保守取代)比方说T33V突变，以及相对于A11在重链FW1中位点26上的突变(例如，一种或多种缺失、插入、取代比方说保守取代)比方说缺失，其与上述目录1的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有相对于A11在重链CDR1区域中的T33V突变，其与上述目录1的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。在某些实施方案中，所述抗体分子相对于A11在重链FW1中位点26上具有一种缺失，其与上述目录1的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。在一些实施方案中，所述抗体分子同时具有相对于A11在重链CDR1区域中的T33V突变以及相对于A11在重链FW1中的位点26上的缺失，其与上述目录1中的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗体分子同时具有一种在相对于A11的重链CDR1区域中的T33V突变以及一种相对于A11在重链FW1中的位点26上的缺失，其与上述目录1中的一种或多种功能特性结合，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或者全部特性)。举例来说，所述抗体分子以高亲和性结合EDIII(例如是DV-1、DV-2、DV-3、或者DV-4的)，具有小于大约100nM的解离常数(KD)，代表性地大约10nM，并且更为代表性地，大约10-0.01nM、大约5-0.01nM、大约3-0.05nM、或者大约1-0.1nM或更高，例如小于大约80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05或者0.01nM。作为进一步的实例，所述抗体分子可以高亲和性结合DV-4EDIII，例如具有小于大约100nM的解离常数，例如大约10nM，例如大约10-1nM或更高，例如小于大约10、8、6、5、4或3nM。此外，所述抗体分子可以与抗体A11和/或抗体4E11相比增加的IC50来中和DV-4，例如，以至少2、3、4、5、6、8、10、12、100、1,000倍增加的IC50，例如在一种聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中。
在某些实施方案中，亲和性是通过竞争ELISA或者SPR进行测量。在一些实施方案中，亲和性是通过BIAc或者e、ELISA或者流式细胞计数的一种或多种进行测量。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子是一种人源化抗体分子，并且具有上述目录1中的一种或多种特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗体分子以高亲和性与EDIII结合，例如，具有比鼠科的抗-登革抗体分子(例如，4E11、A11或B11)的KD低至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％的KD。
在一些实施方案中，所述抗体分子的表达水平比鼠科的抗体分子(例如在本发明中所描述的鼠科的抗-登革抗体分子)的表达水平高，例如高至少大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍。在一些实施方案中，所述抗体分子在哺乳动物细胞中表达，例如人或啮齿动物细胞。
在一些实施方案中，所述抗体分子使一种或多种登革病毒活性降低，所述登革病毒活性具有的IC50(在50％抑制时的浓度)低于鼠科的抗-登革抗体分子(例如在本发明中所描述的鼠科的抗-登革抗体分子)的IC50。在一些实施方案中，所述登革病毒活性被中和，例如，在Tharakaramana等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2013Apr 23；110(17):E1555-64.doi:10.1073/pnas.1303645110.Epub 2013Apr 8中所述的聚焦还原中和试验中，其已通过引证的方式全部并入本发明作为参考，包括所有补充材料。其它能够被用于评估病毒活性的中和作用的相关试验包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)为基础的微量中和(MN)测定(例如在V或者ndam等人，Am J Trop Med Hyg 2002；66:208-212中所描述的)以及荧光抗体细胞分选为基础的DC-SIGN表达树突细胞(DC)测定(例如，在Martin等人，J VirolMethods 2006；134:74-85中所描述的)。
在某些实施方案中，所述抗体分子使登革病毒的传播(例如，降低了宿主(例如人类)和蚊虫之间的传播)降低，例如降低如通过本发明所描述的蚊虫模型测量的至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％。
在另一些实施方案中，所述抗体分子具有提升的降低登革病毒传播的能力(例如，具有降低宿主(例如人类)和蚊虫之间登革病毒传播的改善的能力)，例如比蚊虫抗-登革抗体分子(比方说在本发明中所描述的蚊虫抗-登革抗体分子，例如4E11、A11或者B11)高至少大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍，例如，根据通过本发明所描述的蚊虫模型进行测量。
在另一些实施方案中，所述抗体分子使蚊虫病毒载量(例如，蚊虫携带的病毒数量、和/或传染性)降低，例如降低如通过本发明所描述的蚊虫模型测量的至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或者90％。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有增加的稳定性，例如比蚊虫抗-登革抗体分子(例如在本发明中所描述的蚊虫抗-登革抗体分子，例如4E11、A11或者B11)在体外或体内更为稳定至少大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10倍。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种抗原结合区，例如一种可变区域或其抗原结合片段，其来自本发明所描述的抗体，例如选自表1的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88，或者一种与任意前述序列基本上相同的序列(例如，一种与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或更多的取代、插入或者缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述的抗体(例如一种表1的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一种、两种、三种、或者四种可变区域，或者一种与任意前述序列基本上相同的序列(例如，一种与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或更多的取代、插入或者缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述的抗体(例如一种表1的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一种或者两种重链可变区，或者一种与任意前述序列基本上相同的序列(例如，一种与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或更多的取代、插入或者缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述的抗体(例如一种表1的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88)的至少一种或者两种轻链可变区，或者一种与任意前述序列基本上相同的序列(例如，一种与其至少大约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或更多的取代、插入或者缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括一种在VH区域中的位点33(例如，一种T33V突变)上的缬氨酸，例如相对于4E5A和/或4E11，或者表1中的抗体。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体包括在VH区域中的del26(在位点26上的缺失)，例如相对于4E5A或者表1中的抗体。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子同时包括在位点33上的缬氨酸(例如一种T33V突变)以及在VH区域的del26突变，例如相对于4E5A或者表一中的抗体。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种或者三种互补决定区(CDRs)，来自本发明所描述的抗体(例如一种表1的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88)的重链可变区，或者一种与任意前述序列基本上相同的序列(例如，一种与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或更多的取代、插入或者缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种或者三种CDRs(或者集体所有的CDRs)，其来自包含表3中所示的氨基酸序列的重链可变区。在一些实施方案中，一种或者多种的CDRs(或者集体所有的CDRs)具有一种、两种、三种、四种、五种、六种或者更多变化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相对于在表3中所示的CDRs。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种或者三种CDRs(或者集体所有的CDRs)，其来自包含表3中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，一种或者多种的CDRs(或者集体所有的CDRs)具有一种、两种、三种、四种、五种、六种或者更多变化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相对于在表3中所示的CDRs。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDRs(或者集体所有的CDRs)，其来自包含表3中所示的氨基酸序列的重链和轻链可变区。在一些实施方案中，一种或者多种的CDRs(或者集体所有的CDRs)具有一种、两种、三种、四种、五种、六种或者更多变化，例如，氨基酸取代、插入或者缺失，相对于在表3中所示的CDRs。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的所有六种CDRs，例如，表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者与之相似的CDRs，例如，所述CDR是相同的或者其具有至少一种氨基酸改变，但是不超过两种、三种或者四种改变(例如，取代比如保守取代、缺失或者插入)。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子可包括在本发明中所述的任意的CDR。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的重链可变区的至少一种、两种或者三种Chothia高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自与EDIII接触的那些高度可变环的氨基酸。例如，在一些实施方案中，本发明提供的抗体分子具有SEQ ID NO:9的HCDR1、SEQ ID NO:10的VHCDR2以及SEQ ID NO:5的VHCDR3。本发明提供的抗体分子还可能具有SEQ ID NO:22，24，26，28或30的VHCDR1；SEQ ID NO:10的VHCDR2；以及SEQ ID NO:5的VHCDR3。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，并且任选地与本发明所描述的重链CDR结合，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的轻链可变区的至少一种、两种或者三种Chothia高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自接触EDIII的这些高度可变环的氨基酸。例如，在某些实施方案中，在这里所给出的抗体分子具有SEQ ID NO:6的VHCDR1、SEQ ID NO:7的VHCDR2、以及SEQ ID NO:8的VHCDR3。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的重链可变区的至少一种、两种或者三种Kabat高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自接触EDIII的这些高度可变环的氨基酸。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的轻链可变区的至少一种、两种或者三种Kabat高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自接触EDIII的这些高度可变环的氨基酸。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的重链和轻链可变区的至少一种、两种、三种、四种、五种或者六种高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自接触EDIII的这些高度可变环的氨基酸。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括来自本发明所描述抗体的重链和轻链可变区的全部六种高度可变环，所述抗体例如表1中所述的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，或者至少来自接触EDIII的这些高度可变环的氨基酸，或者密切相关的高度可变环，例如所述高度可变环是相同的或者其具有至少一种氨基酸改变，但是不超过两种、三种或者四种改变(例如，取代比如保守取代、缺失或者插入)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种或者三种高度可变环，其具有与本发明所述抗体的相应的高度可变环相同的规范结构，所述抗体例如是表1中所列的抗体，例如，D88、A48、F38、F108或C88，例如，与本发明所述抗体的重链和/或轻链可变区的至少环1和/或环2相同的规范结构。例如，参见Chothia et al.，(1992)J.Mol.Biol.227:799-817；Tomlinson et al.，(1992)J.Mol.Biol.227:776-798中对于高度可变环规范结构的描述。这些结构可通过在上述文献中所述的表中分析进行确定。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、或者三种(例如全部)CDR，其来自具有如前述表3中所列的氨基酸序列的重链可变区，或者与其基本相同的序列(例如，与其至少大约85％、90％、95％、99％或更加相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或者多种取代、插入或缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、或者三种(例如全部)CDR，其来自具有如前表3中所列的氨基酸序列的轻链可变区，或者与其基本相同的序列(例如，与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或者多种取代、插入或缺失，比方说保守取代)。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、三种、四种、五种或者六种(例如全部)CDR，其来自具有如前表3中所列的氨基酸序列的重链和轻链可变区，或者与其基本相同的序列(例如，与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或者多种取代、插入或缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、或者三种(例如全部)CDR，其来自具有本发明所述抗体的氨基酸序列的重链可变区，例如表1中所述的抗体，比方说D88、A48、F38、F108或C88，或者与其基本相同的序列(例如，与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或者多种取代、插入或缺失，比方说保守取代)。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少噢一种、两种或者三种(例如全部)CDR，其来自具有这里所描述的抗体的氨基酸序列的轻链可变区，例如表1中所述的抗体，比方说D88、A48、F38、F108或C88，或者与其基本相同的序列(例如，与其至少大约85％、90％、95％、99％或更为相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或者多种取代、插入或缺失，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少这里所描述的6种CDR，例如在表2的VL和VH序列中。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在实施方案方面，所述抗体分子具有选自表3的VHCDR1，VHCDR2，VHCDR3，VLCDR1，VLCDR2和VLCDR3。所述六种CDR可以全部是Kabat-定义、全部是Chothia-定义、或者一些是Kabat-定义且另一些是Chothia-定义。举例来说，VHCDR1可以选自SEQ ID NO:3，9，14，15，22，24，26，28或30；VHCDR2可以选自SEQ ID NO:4，10或35；VHCDR3可以是SEQ ID NO:5；VLCDR1可以是SEQ ID NO:6；VLCDR2可以是SEQ ID NO:7；并且VLCDR3可以是SEQ ID NO:8。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体的轻链或者重链可变框架可以选自：(a)一种包括来自人轻链或者重链可变框架的至少80％、85％、87％、90％、92％、93％、95％、97％、98％或者优选100％的氨基酸残基的轻链或者重链可变框架，例如来自人成熟的抗体、人种系序列或者人共有序列的一种轻链或者重链可变框架；(b)一种包括来自人轻链或者重链可变框架的20％到80％、40％到60％、60％到90％、或者70％到95％的氨基酸残基的轻链或者重链可变框架，例如来自人成熟的抗体、人种系序列或者人共有序列的一种轻链或者重链可变框架；(c)一种非人框架(例如，一种啮齿类动物框架)；或者(d)一种非人框架，其被修饰例如从而去除了抗原或细胞毒素的决定因素，例如，免疫的、或者部分人源化的。在一些实施方案中，所述轻链或者重链可变框架区域包括一种轻链或者重链可变框架序列，其至少70，75，80，85，87，88，90，92，94，95，96，97，98，99％相同或者与人种系基因的VH或VL部分的框架相同。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体的VH区域(例如其中框架区域)包括来自人VH区域的一种或多种位点，例如，人重链种系-编码的氨基酸序列，例如在一种或多种(例如全部)的FW1、FW2、FW3、和FW4中发现的位点。在某些实施方案中，优选与在之前段落中讨论的VH残基结合，所述抗-登革抗体的VL区域(例如，其中框架区域)包括来自人VL区域的一种或多种位点，例如，人重链种系-编码的氨基酸序列，例如在一种或多种(例如两种、三种、四种、五种或者全部)的FW1、FW2、FW3和FW4中发现的位点。
例如，在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种或多种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或者全部)残基，依据来自表5的人种系序列的重链或者轻链FW1、FW2、FW3或FW4残基。更为具体的，在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VH种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW1残基；所述抗体分子具有表6的VH种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW2残基；在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VH种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW3残基；并且，在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VH种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VH FW4残基。此外，并且任选与在前文段落中讨论的重链残基结合，在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VL种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW1残基；在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VL种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW2残基；在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VL种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW3残基；并且，在一些实施方案中，所述抗体分子具有表6的VL种系序列的一种或多种(例如至少2、3、4、5、10或15，或者全部)VL FW4残基。在某些实施方案中，所述抗体分子具有一种重链框架VH1-18*01、JH4*01和/或轻链框架Vk4-1*01、Jk2*02。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括一种重链可变区域，其具有至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、十种、十五种、二十种或者更多改变，例如氨基酸取代、插入或者缺失，来自表1的氨基酸序列，例如B11，D88，A48，F38，F108或C88，如在完整可变区中的FR区域的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括一种重链可变区域，其具有一种或多种(例如至少5、10、15或20，或者全部)：表1中抗体(例如A11)的氨基酸序列的在位点3上的Q、在位点5上的V、在位点6上的E的缺失、在位点12上的V、在位点13上的K、在位点20上的K、在位点21上的V、在位点24上的K、在位点26上的S的缺失、在位点33上的V、在位点39上的R、在位点41上的A、在位点43上的G、在位点49上的M、在位点65上的L、在位点68上的R、在位点69上的V、在位点7上的M、在位点77上的T、在位点82上的M、在位点83上的E、在位点85上的R、在位点88上的R、在位点90上的D、在位点98上的A或V或S、以及在位点117上的S。具有一种或多种(例如全部)这些突变的抗体的例子包括A48、B48、C88、F38、F108以及D48。在一些实施方案中，所述人源化的重链包含一种或多种：表1中抗体(例如A11)的氨基酸序列的在位点3上的Q、在位点5上的V、在位点6上的E的缺失、在位点12上的V、在位点13上的K、在位点20上的K、在位点21上的V、在位点24上的K、在位点26上的S的缺失、在位点33上的V、在位点39上的R、在位点41上的A、在位点43上的G、在位点49上的M、在位点65上的L、在位点68上的R、在位点69上的V、在位点7上的M、在位点77上的T、在位点82上的M、在位点83上的E、在位点85上的R、在位点88上的R、在位点90上的D、在位点98上的A或V或S、以及在位点117上的S。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案(以及任选与本发明所述的重链取代基结合，例如在前段落中所述)中，所述抗-登革抗体分子包括一种轻链可变区域，其具有至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、十种、十五种、二十种或者多种氨基酸改变，例如氨基酸取代、插入、或者缺失，来自表1中的氨基酸序列，例如B11、D88、A48、F38、F108或C88，例如，在完整可变区中的FR区域的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体包括一种轻链可变区域，其具有一种或多种(例如，至少5、10、15、或者全部)：表1中一种抗体(例如B11、D88、A48、F38、F108或C88)的氨基酸序列的位点1上的D、位点2上的I、位点7上的S、位点17上的E、位点44上的P、位点62上的V、位点64上的D、位点72上的G、位点80上的S、位点81上的S、位点82上的L、位点83上的Q、位点85上的E、位点89上的V、位点91上的Y、位点104上的Q。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子的重链或者轻链可变区域或它们二者包括一种氨基酸序列，其余本发明所公开的氨基酸基本上相同，例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或者更加的与本发明所述的抗体的可变区域相同，所述抗体例如是表1中的抗体，比方说D88、A48、F38、F108或C88，或者相差只杀1、2、3、4、或5个残基，但不超过40、30、20或10个残基，其来自本发明所述抗体的可变区域。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子的重链或者轻链可变区域或它们二者包括一种氨基酸序列，其通过本发明所述的核苷酸编码，或者一种编码表1中的抗体的核苷酸序列杂交的核苷酸，所述抗体例如D88、A48、F38、F108或C88，或其互补序列，例如在低严谨、中严谨、或者高严谨、或其它在本发明描述的杂交条件下进行。本发明还公开了所述抗-登革抗体分子的重链或者轻链可变区域或者它们二者包括一种通过表4的核苷酸序列编码的氨基酸、或其互补序列，例如，在低严谨、中严谨、或者高严谨、或其它在本发明描述的杂交条件下进行。在一些实施方案中，所述核苷酸的至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多与表4中的序列或其部分相同。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括至少一种、两种、三种、或者四种抗原结合区，例如可变区域，具有在表2中所述的氨基酸序列，或者一种预期基本相同的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更高与其相同的序列，或者与表2中所示的序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基)。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括一种核苷酸编码的VH和/或VL区域，其中所述核苷酸具有一种编码表1中抗体的核苷酸序列，所述抗体例如是D88，A48、F38、F108或者C88，或者一种与任意一种所述核苷酸序列基本上相同的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更高与其相同的序列，或者与表2中所示的序列相差不超过1、2、5、10或15个氨基酸残基)。在一些实施方案中，抗体分子具有在本段中所讨论的结构特征，以及一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些方面，本发明提供了一种抗体分子，任选地具有结合登革病毒的能力，包括：
(a)一种重链免疫球蛋白可变区域片段，包括：
CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列，任选地条件是V是不可变的)，
CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列，任选地条件是L是不可变的)，以及
CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)；
(b)一种轻链可变区域片段，包括：
CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列)，
CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)，以及
CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)。
在一些实施方案中，HCDR1的V是不可变的；在一些实施方案中，HCDR2的L是不可变的；并且，在一些实施方案中，HCDR1的V和HCDR2的L都是不可变的。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括VH FW1，其具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)，或者具有相对于SEQ ID NO:11不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸的序列。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:84具有不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:85具有不超过1、2、3、4或5个突变的氨基酸序列。
在某些方面，本发明提供了一种抗体分子，其具备结合登革病毒的能力，包括：
(a)一种重链免疫球蛋白可变区域片段，包括：
FW1，包括相对于SEQ ID NO:33的位点26的缺失；
CDR1，包括序列DTYMS(SEQ ID NO:14)(或者一种与其相差不超过1、2、或3个氨基酸的序列，任选地条件是T是不可变的)，或者CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一种与其相差不超过1、2、或3个氨基酸的序列，任选地条件是V是不可变的)；
CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列，任选地条件是L是不可变的)，以及
CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)(或者一种与其相差不超过1、2、或3个氨基酸的序列)；以及
(b)一种轻链可变区域片段，包括：
CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列)，
CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一种与其相差不超过1、2、或3个氨基酸的序列)，以及
CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一种与其相差不超过1、2、或3个氨基酸的序列)。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:84具有不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:85具有不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。
在某些方面，本发明提供了一种抗体分子，其任选具有结合登革病毒的能力，包括：
(a)一种重链免疫球蛋白可变区域片段，包括：
CDR1，包括序列DVYMS(SEQ ID NO:3)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列，任选地条件是V是不可变的)，
CDR2，包括序列RIDPENGDTKYDPKLQG(SEQ ID NO:4)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列，任选地条件是L是不可变的)，以及
CDR3，包括序列GWEGFAY(SEQ ID NO:5)或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)，任选地条件是A可用I、K、D或E替换；
(b)一种轻链可变区片段，包括：
CDR1，包括序列RASENVDKYGNSFMH(SEQ ID NO:6)(或者一种与其相差不超过1、2、3、4或5个氨基酸的序列)，任选地条件是Y可用F替换；
CDR2，包括序列RASELQW(SEQ ID NO:7)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)，以及
CDR3，包括序列QRSNEVPWT(SEQ ID NO:8)(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)。
综上所述，在一些实施方案中，重链CDR3为GWEGFIY(SEQ ID NO:90)、GWEGFKY(SEQID NO:91)、GWEGFDY(SEQ ID NO:92)或者GWEGFEY(SEQ ID NO:93)。在一些实施方案中，轻链CDR1为RASENVDKFGNSFMH(SEQ ID NO:94)。换言之，在一些实施方案中，重链的位点105，其为抗体A11中的丙氨酸，可被改变为其它的残基，例如，I、K、D或E。在某些实施方案中，轻链的位点32，其为抗体A11中的酪氨酸，被改变为其它残基，例如F。在一些实施方案中，在这一段落中所描述的突变提高了抗体分子低于EDIII的亲和性和/或其针对一种或多种(或者全部)登革病毒菌株或血清型的中和活性。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)的VH FW1，或者一种具有相对于SEQ IDNO:11不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)的VH FW2，或者一种具有相对于SEQ ID NO:84不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体分子包括具有序列WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一种具有相对于SEQ ID NO:85不超过1、2、3、4、或5个突变的氨基酸序列。
在这些方面的一些实施方案中，所述抗体分子具有结合登革病毒EDIII(E蛋白结构域III)的能力。在某些实施方案中，所述抗体分子包括一种或多种CDR，其中所述CDR具有任意的SEQ ID NOS:3-8，14和35的序列(或者一种与其相差不超过1、2或3个氨基酸的序列)。举例来说，所述抗体分子可包括至少两种、三种、四种、五种或六种CDR，其具备任意的SEQ ID NOS:3-8，14和35序列。
在一些实施方案中，所述抗体分子包括SEQ ID NO:3或14的VH CDR1、SEQ ID NO:4或35的VH CDR2、SEQ ID NO:5的VH CDR3、SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、以及SEQ ID NO:8的VL CDR3。例如，所述抗体分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1、SEQ IDNO:4的VH CDR2、SEQ ID NO:5的VH CDR3、SEQ ID NO:6的VL CDR1、SEQ ID NO:7的VL CDR2、以及SEQ ID NO:8的VL CDR3。
在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％与SEQ ID NO:1相同。
在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％与SEQ ID NO:80相同。
在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种VH氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％与SEQ ID NO:16-21，24，25，27，29，31，32，33，36，80或81任意其中之一相同。在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种VL氨基酸序列，其至少70％、80％、85％、90％、95％、99％或者100％与SEQ ID NO:2或34相同。
在某些实施方案中，所述抗体分子指的是Fab、F(ab')2、Fv、或者一种单链Fv片段(scFv)。在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种重链恒定区，其选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种轻链恒定区，其选自kappa或者lambda的轻链恒定区。
所述抗体分子可以是一种分离的抗体分子和/或一种人源化的抗体分子。在一些实施方案中，所述抗体分子包含一种或多种来源于人框架种系序列的框架区域。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有结合登革病毒EDIII的能力，以小于大约80、70、60、50、40、30、20、10、8、6、4、3、2、1、0.5、0.2、或0.1nM的解离常数(KD)。所述抗体分子可具备结合登革病毒血清型DV-4EDIII的能力，以小于大约10、8、6、5、4或3nM的解离常数(KD)。所述抗体分子可具备与DV-3或DV-4EDIII区域结合的能力，其中以比抗体A11或抗体4E11高至少2、3、4、5、6、8、10、12、100、1000倍的亲和力。所述抗体分子可具备与登革病毒菌株结合的能力，其中所述登革病毒菌株选自DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)和DENV-4H241的一种或多种，其中以比抗体A11或抗体4E11高至少2、3、4、5、6、8、10、12、125、50、75、100、1000倍的亲和力。所述抗体分子可具备中和登革病毒的能力，其中在聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性中和作用的相关试验中。所述抗体分子可具备中和登革病毒的能力，其具备与抗体A11或抗体4E11相比低至少2、3、4、5、6、8、10、12、50、75或者100倍的IC50，其是在聚焦还原中和试验或者一种用于评估病毒活性中和作用的相关试验中。
在一些方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述要求中任一项的抗体分子以及一种药学上可接受的载体、赋形剂或者稳定剂。
本发明还提供了，例如，一种编码这里所述的抗体分子的抗体重链或者轻链可变区域的核苷酸。本发明还提供了，例如，包括上述核苷酸的表达载体。本发明还提供了，例如，包含上述核苷酸的宿主细胞。此外本发明提供了，例如，一种制备如这里所述的的抗体分子或其片段的方法，包括在适用于基因表达的条件下培养所述宿主细胞。
在一些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种这里所述的抗体分子。所述试剂盒包括一种容器，并且所述容器可具有放置于其中的抗体分子。所述试剂盒还可包含一种药学上可接受的载体、赋形剂或者稳定剂，任选地与所述抗体分子混合。所述试剂盒还可包括一种递送装置，例如，其包括一种注射剂或针。所述试剂盒还可包括用于使用的说明书。
在某些方面，本发明提供了一种中和登革病毒的方法，包括：使登革病毒与本发明所述的抗体分子相接触。在一些实施方案中，所述登革病毒是血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4的。
在一些方面，本发明提供了一种治疗登革病毒感染的方法，包括向对其有需要的受试者施用本发明所述的分离的抗体分子，以一种能够有效治疗所述病毒的量。所述方法可进一步包括将一种抗-病毒试剂施用于受试者，例如选自巴洛沙星(balapiravir)、氯喹(chlor oquine)、西戈斯韦(celgosivir)、伊维菌素(ivermectin)或者Carica folia的一种或多种的抗-病毒试剂。在某些实施方案中，所述抗病毒试剂是一种第二抗-登革抗体恩子，例如一种与第一抗-登革抗体分子不同的本发明所述的抗-登革抗体分子。在另一个实施方案中，所述抗病毒试剂选自α-葡糖苷酶I型抑制剂(例如，西戈斯韦(celgosivir))、腺苷核苷抑制剂(例如，NITD008)；RNA依赖性的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂(例如，NITD107)、宿主嘧啶生物合成的抑制剂例如宿主二氢乳清酸脱氧酶(DHODH)(例如，NITD-982和布喹那(brequinar))、病毒NS4B蛋白的抑制剂(例如，NITD-618)以及亚氨基糖(例如，UV-4)。本发明可进一步包括将一种疫苗施用于受试者，例如，一种登革病毒疫苗。在一些实施方案中，所述抗体分子的施用是肠胃外的或者静脉内的。
本发明还提供了预防方法。在一些实施方案中，一种通过将本发明所公开的抗体分子施用于此时没有感染登革病毒的受试者来预防登革病毒感染的方法。例如，在某些方面，本发明提供了一种降低患者患染登革病毒风险的方法，包括为有此需要的受试者施用本发明所述的分离的抗体分子，以一种有效降低患染病毒风险的剂量。例如，患染登革病毒的风险可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。在一些实施方案中，所述抗体分子可被提供给没有感染登革病毒的患者，带来了感染出现的结果，所述疾病的过程有可能比没有接受所述抗体分子的类似的患者的疾病过程更温和。例如，所述抗体分子可降低登革热症发展(例如，患者更可能经历一种无症状感染)的风险。与没有接受抗体分子的患者相比，登革热症发展的风险可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。在一些实施方案中，与没有接受抗体分子的患者相比，登革热症发展为登革出血热症的风险可被降低，例如，至少25％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多。
本发明还提供了用于降低或者预防登革病毒传播(例如，降低或预防在受试者(例如人)和蚊虫之间的传输)的方法。在某些实施方案中，所述受试者是感染了登革病毒。在另一些实施方案中，所述受试者此时并没有感染登革病毒，但是在登革病毒感染的风险。例如，在某些方面，本发明提供了一种降低或者预防登革病毒传播(例如，降低或者预防登革病毒在受试者(例如人)和蚊虫之间的传播)的方法，包括向受试者施用本发明所述的分离的抗体分子，以一种可有效降低登革病毒传播的剂量。例如，登革病毒的传播，例如，与经由没有接受抗体分子的受试者进行的传播相比，从受试者传播至蚊虫可被降低例如至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％，例如通过本发明所述的蚊虫模型进行测量。因此，在一些实施方案中，登革病毒从感染的蚊虫到未感染的受试者(例如人)的传播可以被进一步降低例如至少大约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％。
在某些方面，本发明提供了一种检测生物样本中登革病毒的方法，包括(i)使样本或受试者(以及可选地，一种参考样本或受试者)与本发明所述的抗体分子接触，在允许产生抗体分子与多肽相互作用的条件下；以及(ii)检测抗体分子和样本或受试者(以及可选地，一种参考样本或受试者)之间的复合体的形态。
在一些方面，本发明提供了一种抗-登革抗体分子，包括一种VH区域，其相对于抗体A11的VH具有一种位点26的缺失。例如，所要求保护的抗-登革抗体分子相对于抗体A11的VH具有大约1-30、5-30、10-30、15-30、或者20-25之间突变的VH区域。
在一些方面，本发明提供了一种具有结合登革病毒能力的抗体分子，其包括一种具有SEQ ID NO:3序列的VH CDR1，或者一种具有相对于SEQ ID NO:3不超过1、2、3、4、5、10或15个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述突变指的是取代，比方说保守取代。
在某些方面，本发明提供了一种具有结合登革病毒能力的抗体分子，其包括一种具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK(SEQ ID NO:11)的VHFW1，或者一种相对于SEQID NO:11具备不超过1、2、3、4、5、10或15个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述突变各自独立地选自缺失和取代比方说保守取代。本段中所述的抗体分子也可以具备本发明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。
在一些方面，本发明提供了一种具有结合登革病毒能力的抗体分子，其包括一种具有序列SEQ ID NO:4的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:4具备不超过1、2、3、4、5、10或15个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述突变是取代，比方说保守取代。本段中所述的抗体分子也可以具备本发明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。
在某些方面，本发明提供了一种具有结合登革病毒能力的抗体分子，其包括一种具有序列WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:84)或WVRQAPEQGLEWMG(SEQ ID NO:85)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO:84或SEQ ID NO:85具备不超过1、2、3、4、5或10个突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述突变各自独立地选自缺失和取代比方说保守取代。本段中所述的抗体分子也可以具备本发明所述的特征，例如在在前段落中所述的特征。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有结合两种或多种(例如三种或四种)登革病毒血清型(例如，选自DV-1，DV-2，DV-3和DV-4)的EDIII的能力，具有一种针对所述两种或多种血清型的每一种具有小于大约80，70，60，50，40，30，20，10，8，6，4，3，2，1，0.5，0.2，0.1，0.05或者0.01nM的解离常数(KD)。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有一种可变区域，其在序列方面是相同的，或者其具有与本发明所描述的可变区域(例如，这里所公开的FR区域)相差1、2、3或4种氨基酸。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子是一种完整抗体或其片段(例如，Fab、F(ab')2、Fv或者单链Fv片段(scFv))。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子是一种单克隆看题或者一种具有单一特异性的抗体。所述抗-登革抗体分子还能够是一种人源化的、嵌合的、骆驼科的(camelid)、鲨鱼(shark)、或者体外生成的抗体分子。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子是一种人源化的抗体分子。抗-登革抗体分子的重链和轻链可以是全长(例如，一种抗体可以包括至少一种或者至少两种完整的重链，以及至少一种或至少两种完整的轻链)，或者可以包括一种抗原结合片段(例如，Fab、F(ab')2、Fv、单链Fv片段、单结构域抗体、双特异性抗体(dAb)、二价或者双特异性抗体或其片段、其单一结构域变体、或者一种camelid抗体)。
在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子具有一种重链恒定区(Fc)，其选自，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；具体地，选自，例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的重链恒定区；更为具体地，IgG1或者IgG2(例如，人IgG1或IgG2)的重链恒定区。在一些实施方案中，所述重链恒定区是人IgG1。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子具有一种轻链恒定区，其选自例如，kappa或lambda(κ，λ)的轻链恒定区，在一下实施方案中是kappa(例如人kappa(κ))。在一些实施方案中，所述恒定区域被改变，例如突变，用于修饰抗-登革抗体分子的特性(例如，用于增加或降低一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数量、效应细胞功能或者补体功能)。例如，所述恒定区域可以在位点234(例如L至A)、235(例如，L至A)、296(例如，M至Y)、297(例如，N至A或G至Q)、298(例如，S至T)、300(例如，T至E)、477(例如，H至K)和478(例如，N至F)上进行突变从而改变Fc受体结合。
在一些实施方案中，所述抗体分子是一种人源化的抗体分子。
在一些实施方案中，所述抗体分子是分离的或重组体。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括人或人源化的片段区域与CDR(互补决定区)的组合。
本发明还提供了包含核苷酸序列的核酸，其编码本发明所述的抗-登革抗体分子的重链和轻链可变区域以及CDRs。例如，本发明提供了一种第一和第二核酸，其分别编码了根据表1(例如D88、A48、F38、F108、或C88，或者基本与其相同的序列)的抗-登革抗体分子的重链和轻链可变区。例如，所述核酸可包括一种核苷酸序列，其编码了根据表1所述的抗-登革抗体分子，例如，D88，A48，F38，F108或C88，或者一种基本与所述核苷酸序列相同的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更多与其相同的序列，或者与来自上述核苷酸序列相差不超过3、6、15、30或45个核苷酸)。在某些实施方案中，所述核酸可包括一种核苷酸序列，其编码至少一种、两种、或者三种CDR，其中所述CDR来自一种具有表2所述的氨基酸序列或者一种基本与其同源的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更多与其相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或
Figure GDA0002940984110000191
取代、插入或缺失，比方说保守取代)的重链可变区。在某些实施方案中，所述核酸可包括一种编码至少一种、两种或三种CDR的核苷酸序列，其中所述CDR来自一种具有表2所述的氨基酸序列或者一种基本与其同源的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更多与其相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或
Figure GDA0002940984110000192
取代、插入或缺失，比方说保守取代)的轻链可变区。在一些实施方案中，所述和苏三可包括一种编码至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDR的核苷酸序列，其中所述CDR来自具有表2所述的氨基酸序列或者一种基本与其同源的序列(例如，一种至少大约85％、90％、95％、99％或更多与其相同的序列，和/或具有一种、两种、三种或
Figure GDA0002940984110000193
取代、插入或缺失，比方说保守取代)的重链和轻链可变区。在一些实施方案中，具有在本段中所讨论的结构特征的核酸编码了一种抗体分子或其部分，其具有一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
本发明还提供了核酸序列，例如一种杂交核酸序列的核酸，所述核酸序列编码表1中的抗体，例如D88、A48、F38、F108或C88或其补体，例如在低严谨、中严谨、高严谨、或这里所述的其它杂交条件下进行。本发明还公开了表1所述的核酸序列，以及他们的补体，例如在低严谨、中严谨、高严谨、或这里所述的其它杂交条件下进行。在一些实施方案中，所述核酸至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多与表4中的序列、其补体、或上述序列的任意部分相同。在一些实施方案中，具有在本段中所讨论的结构特征的核酸编码了一种抗体分子或其部分，其具有一种或多种优异特性，例如针对登革病毒(例如DV-4)的一种增加(例如相对于A11)的亲和性或者中和活性。在一些实施方案中，所述优异特性指的是上述目录1中的特性，例如，特性(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)或者(x)的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或者全部特性)。
在某些方面，本发明的特征在于包含本发明所述核酸的宿主细胞和载体。所述核酸可存在于在相同的宿主细胞或单独宿主细胞中出现的单一载体或单独载体中。所述宿主细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、或者原核细胞例如E.coli。例如，所述哺乳动物细胞可以是一种培养细胞或细胞系。典型的哺乳动物细胞包括人细胞，例如HEK293细胞，淋巴细胞系(例如NS0)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS细胞、卵母细胞、以及来自转基因动物的细胞。
在一些方面，本发明提供了一种提供这里所述的抗体分子的方法。所述方法可包括：提供一种与EDIII抗原特异性结合的抗体分子；使所述抗体(例如，针对恒定区、框架、和/或CDR)产生一种或多种突变，并且评估所述抗体分子是否与EDIII抗原特异性结合，或者评估所述抗体分子在抑制登革病毒功能方面的效力。所述方法可进一步包括纯化所述抗体分子。例如，所述抗体分子可通过一种或多种色谱分析步骤进行纯化，所述色谱分析步骤包括例如亲和色谱分析法，例如蛋白质A色谱分析法。所述方法可进一步包括向受试者施用所述抗体分子，其中受试者例如人或非人动物。
在某些方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包括一种药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，以及本发明所述的所述抗-登革抗体分子的至少其中之一。在一些实施方案中，所述抗体分子与标记物或治疗试剂共轭。在一些实施方案中，所述组合物，例如药物组合物，包括一种抗体分子和第二试剂的组合，所述第二试剂例如一种治疗试剂，或者如本发明所进一步描述的两种或多种前述抗体分子。
本发明所公开的抗体分子能够抑制登革病毒的一种或多种活性。例如，所述抗体分子可破坏在病毒粒子表面上的E蛋白的天然结构，例如引起病毒失活。因此，所述抗体分子可中和病毒，抑制其进入到宿主细胞中的能力，或者降低病毒稳定性。在一些实施方案中，抗体分子中和登革病毒(例如，在聚焦还原中和试验中或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中)，其具有小于或者等于1400、1000、800、600、550、500、450、400、350、300、350、200、150、100、50或25ng/ml的EC50或者FRNT50。在一些实施方案中，所述抗体中和登革病毒(例如，在聚焦还原中和试验中或者一种用于评估病毒活性的中和作用的相关试验中)，其具有小于或者等于20、17.6、15、10、5、4、2、1.4、1或者0.50的IC50。在一些实施方案中，对DV-4的中和作用进行测试，并且在一些实施方案中，对DV-1、DV-2或DV-3的其中之一的中和作用进行测试。
所述受试者可以是哺乳动物，例如，猴子、灵长类动物优选高等灵长类，例如人(例如，具有登革病毒或者具有登革病毒风险的患者)。
本发明还提供了一种治疗受试者中登革病毒的方法，包括对所述受试者施用本发明所述的抗-登革抗体分子，例如一种治疗有效量的抗-登革抗体分子，或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子被施用于患有登革病毒的患者，导致病毒载体的减少和/或至少一种症状的减少，例如选自突发性发热、头痛、肌肉和关节痛体重减轻、中枢神经系统渗入、和/或皮疹。在一些实施方案中，所述抗登革抗体分子被施用于具有感染登革病毒风险的患者，导致受到感染的风险降低或者感染(如果感染发生)严重程度降低。
所述抗-登革抗体分子可通过全身的(例如，口服、肠道外、皮下、静脉、直肠、肌内、腹腔内、鼻内、透皮、或者通过吸入或腔内装置)、局部的、或者通过应用于黏膜例如鼻子、喉咙和支气管施用于受试者。
本发明所述的方法和组合物可被用于与其它治疗方形式组合。在一些实施方案中，本发明所述的方法包括给受试者施用本发明所述的抗-登革抗体分子，与一种第二治疗剂或者用于登革病毒的预防药联合施用，以一种有效治疗或预防所述失调的剂量。所述抗体分子和所述第二试剂可同时或顺序施用。
可以应用所述抗-登革抗体分子和其它治疗形式的任意组合和顺序。所述抗-登革抗体分子和/或其它治疗形式可在活动性感染周期期间、或者在缓解或减少活动性疾病周期期间被进行施用。所述抗-登革抗体分子和其它治疗形式可在治疗之前施用、与治疗同时施用、在治疗后施用、或者在感染缓解期间施用。
在一些方面，本发明提供了用于探测样本中登革病毒存在的方法，例如体内或体外(例如，一种生物样本边说血液或血清)。所述方法可被用于评估(例如，检测在宿主中的这里所描述的失调例如登革病毒的诊断和/或阶段的治疗或进程)。所述方法可包括：(i)使样本(并且任选一种参照，例如一种对照样本)与本发明所述的抗-登革抗体分子接触，或者为受试者施用本发明所述的抗-登革抗体分子，其是在允许相互作用产生的条件下进行，以及(ii)检测是否在抗体分子和样本(并且任选一种参照，例如一种对照样本)之间有复合体的形成。复合体的形成表示登革病毒的存在，并且能够表明对于这里所述的治疗的适宜性和需求。所述方法能够涉及，例如，免疫组织化学、免疫细胞化学、FACS、抗体分子-复合的磁性粒子、ELISA试验、或者PCR技术(例如，RT-PCR)。
典型地，在体内和体外治疗方法中所使用的所述抗-登革抗体分子可用可检测的物质直接或间接地标记，从而促进结合或未结合的结合试剂的检测。合适的可检测物质包括各种各样的生物活性酶、酶活动基、荧光材料、发光材料、顺磁性(例如，核磁共振活性)材料、以及放射性物质。
在一些方面，本发明提供了诊断或治疗试剂盒，其中包括本发明所述的抗-登革抗体分子以及使用说明书。
本发明预测了前文所述方面和/或实施方案的任意其中一种或多种的所有组合，以及与在详细的描述和实施例中阐述的实施方案的任意一种或多种的组合。
本发明所述的组合物和方法的其它特征、目的和优势将通过说明书和附图以及从权利要求书中进行展示。
在此提供了附图和表。
附图说明
这些附图在本文中各自有更为详细的描述。
附图1A-1I显示了多个抗-登革EDIII抗体的氨基酸和核苷酸序列。Kabat CDR以下划线标注，并且某些感兴趣的残基被加框(在优先权文件中以一种灰色背景显示)。
附图2描述了一种使用活病毒的聚焦还原中和试验的结果，显示抗体B11改进DV4的mAb A11中和作用。
附图3显示了抗体A11和B11中和DV4的重复分析。
附图4是多个人源化的EDIII抗体框架的功能分析。
附图5显示了在抗-登革抗体N-端的回复突变上的抗体亲和性。重链FW“04”涉及一种框架类型，其具有与例如mAb B48相同的重链框架氨基酸序列。轻链FW“08”涉及一种框架类型，其具有与例如mAb B48相同的轻链框架氨基酸序列。mAb B48的重链和轻链框架序列在表1和表2中列出。
附图6显示了结合某些点突变导致针对EDIII增加的亲和性。轻链FW“08”涉及一种框架类型，其具有与例如mAb D88相同的轻链框架氨基酸序列。mAb D88的轻链框架序列在表1和表2中列出。
附图7显示了将位点98设置为与其它突变结合的A、V或S的结果。
附图8显示了竞争ELISA的结果，从而确定选定的抗体的EDIII结合亲和性。
附图9显示了选定的抗-登革抗体与四种登革病毒血清型的EDIII的结合。
附图10A概况了选定的登革病毒分离株的EDIII氨基酸序列的系统发育关系。“DENV”指的是登革病毒的缩写，并且DENV-2代表血清型DV-2，DENV-23代表血清型DV-3，并且DENV-4代表血清型DV-4。
附图10B显示了抗体D88与多种登革病毒分离株的结合。*表示用于体外中和作用试验的菌株。
附图11显示了选定的抗-登革抗体针对各种登革病毒菌株的亲和性。
附图12显示了在聚焦还原中和试验中多种抗-登革抗体中和登革病毒血清型DV-4的能力。
附图13显示了在聚焦还原中和试验中多种抗-登革抗体中和登革病毒血清型DV-3的能力。在该试验中使用的是DV-3H87。
附图14显示了在聚焦还原中和试验中多种抗-登革抗体中和登革病毒血清型DV-4的能力。
附图15A-15C显示了依据热变动分析试验(Sypro或者ange)，选定的抗-登革抗体的热稳定性。
附图16显示了在AG129小鼠模型中，抗体D88在感染登革病毒的小鼠的生存方面的作用。
附图17显示了在AG129小鼠模型中，抗体D88在感染登革病毒的小鼠的体重变化方面的作用。
附图18显示了在AG129小鼠模型中，抗体D88在感染登革病毒血清型2(菌株NGC)的小鼠中病毒血症方面的作用。
附图19显示了在聚焦还原中和试验(FRNT)中，抗体D88中和在C6/36昆虫细胞中传播的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的能力。
附图20显示了在聚焦还原中和试验(FRNT)中，抗体D88中和在Vero(猴子)细胞中传播的登革病毒血清型DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的能力。
附图21显示了在聚焦还原中和试验(FRNT)中，抗体D88和A11中和在Vero(猴子)细胞中传播的登革病毒DENV-4菌株H241的能力。
附图22显示了抗体A48、C88和D88的聚集倾向，通过高效分子排阻层析(HP-SEC)进行评估。
附图23描述了抗体D88对于DENV-4的亲和性增益，具有与抗体4E11相比针对DENV-1、DENV-2和DENV-3同时增加的亲和性。
列表说明
这些表在本文中各自有更为详细的描述。
表1总结了示例性抗-登革抗体的序列。
表2描述的是表1中的重链可变区和轻链可变区序列的氨基酸序列。Kabat CDR以下划线标注，Chothia CDR以斜体表示，并且某些感兴趣的残基以一种灰色背景显示。
表3描述的是表1中的CDR的氨基酸序列。
表4总结了用于编码表1中抗体的核酸序列。
表5描述的是在表4中总结的核酸序列。
表6描述的是在本申请中所描述的其它氨基酸序列。
具体实施方式
本发明在这里公开了抗体分子，所述抗体分子以高亲和力和特异性与登革病毒表位(例如EDIII)结合。更方便地，本文中所述的几个抗体分子以高亲和力结合登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-3以及DV-4的EDIII。本发明在这里提供了编码抗体分子核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于形成抗体分子的方法。本发明所公开的所述抗-登革抗体分子可被用于(单独或者与其它试剂或者治疗形式结合)治疗、预防和/或诊断登革病毒，例如DV-1、DV-2、DV-3或DV-4。如在本发明所述使用的，DV-1、DV-2、DV-3以及DV-4有时分别被称为DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。
定义
正如在这所使用的，冠词“一个(a)”和“一种(an)”指的是一种或者多于一种(例如，至少一种)的所述冠词的语法对象。
在这里所使用的术语“或”指的是，非在上下文中明确，否则指的是术语“和/或”，并且可以与术语“和/或”互换使用。
“约(about)”和“大约(approximately)”通常应当指的是对于测定的实际状况或正确的测量结果发生误差的可接受程度。示范性误差程度为给定值或给定值范围的20％之内，典型的在10％之内，并且更为典型的在5％之内
本发明所公开的组合物和方法包含具有特定序列或疾病上与其相同或相似的序列的多肽和核苷酸，例如，其中所述序列至少85％、90％、95％或更高与特定序列相同。在氨基酸序列的情况中，本发明所在这里使用的术语“基本相同”指的是第一氨基酸含有足够的或者最小数目的氨基酸残基，其i)与第二氨基酸序列中的定向氨基酸残基相同，或者ii)第二氨基酸序列中的定向氨基酸残基的保守替换的，使得第一和第二氨基酸序列具有一个共同的结构域和/或共同的功能活性。举例来说，氨基酸序列具有一种共同的结构域，其至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％与参考序列(例如本发明所给定的序列)相同。
在核苷酸序列的环境中，本发明中所使用的术语“基本相同”指的是第一氨基酸含有足够的或者最小数目的核苷酸，其与第二核苷酸序列中的定向核苷酸相同，使得第一和第二核苷酸序列编码一种具有共同功能活性的多肽，或者编码一种共同的结构多肽域或者共同的功能多肽活性。举例来说，核苷酸序列至少大约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％与参考序列(例如本发明所给定的序列)相同。
术语“功能性变体”涉及多肽，其具有一种与天然存在的序列基本相同的氨基酸序列，或者是通过一种基本相同的核苷酸序列进行编码，并且能够具备一种或多种天然存在序列的活性。
为了确定两种氨基酸序列的同一性百分比，或者为了确定两种核苷酸序列的同一性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对(例如，为了最佳比对目的将缺口引入第一和第二氨基酸的其中之一或者二者内，或者为了比较目的忽略非同源序列)。在优选的实施方案中，用于比较目的而对其的参考序列的长度，至少是所述参考序列长度的30％，例如至少40％、50％、60％，例如至少70％、80％、90％、100％。然后，比较在对应氨基酸位点或核苷酸位点上的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列中的位点与在第二序列的相应位点被同样的氨基酸残基湖核苷酸所占据，那么所述分子在这一位点具有同一性。
在两种序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位点数的函数，考虑到空位数和每个空位的长度，需要引入它们进行两种序列的最佳比对。
两种序列之间的序列的比较以及同一性百分比的确定能够通过使用一种数学算法完成。在一些实施方案中，两种氨基酸序列之间的同一性百分比是使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)的算法确定的，其已经合并到GCG程序包(可在http://www.gcg.com中获得)中的GAP程序中，其中使用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵，并且空隙权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6。在某些实施方案中，两种核苷酸序列之间的同一性百分比是使用在GCG程序包(可在http://www.gcg.com中获得)中的GAP程序确定的，使用NWSgapdna.CMP矩阵，并且空隙权重为40、50、60、70或80以及长度权重为1、2、3、4、5或6。一组合适的参数(并且除非另做说明可以使用所述参数)指的是Blossum 62评分的间隙记罚分12分、间隙延伸记罚分4分，移码间隙记罚分5分。
在两种氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比可通过使用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4:11-17)的算法进行确定，所述算法已经合并至ALIGN程序(2.0版)中，其中使用PAM120加权残基表，缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。
在本发明中所述的核苷酸和蛋白质序列可被用来做为“查询序列”，用于进行对公共数据库的搜索，从而例如鉴定其它的家族成员或相关序列。这种搜索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序执行，记分＝100，字长＝12，从而获得与本发明的核苷酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序执行，记分＝50，字长＝3，从而获得与本发明的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得有间隙的排列以达到比较的目的，可以使用Gapped BLAST，该程序的详细说明可参见Altschul等人所著的(1997)NucleicAcidsRes.25：3389。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以用各个程序(例如，XBLAST和BLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
这里所述的术语“在低严谨、中严谨、高严谨或超高严谨条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。可在Current Protocols in Molecular Biology(JohnWiley&Sons，N.Y.6.3.1.-6.3.6.，1989)一书中找到进行杂交反应的指导，而这里将其引入参考。在所述参考文献中描述了水和非水两种方法，并且任意一种都可以使用。本发明中所指的特异性杂交条件指的是如下条件：1)低严谨杂交条件为大约45℃时在6X的氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行杂交，接着在50℃(低严谨条件总洗涤的温度可增加到55℃)的条件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤两次；2)中严谨杂交条件为，大约45℃时在6XSSC中进行杂交，接着在60℃的条件下在0.2XSSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；3)高严谨杂交条件为，大约45℃时在6XSSC中进行杂交，接着在65℃的条件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次；4)超高严谨杂交条件为，65℃时在0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，接着在65℃的条件下在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。超高严谨条件(4)是合适的条件，并且所使用的那些除非是特别指明的。
本领域技术人员应当理解这里所描述的分子可具有另外的保守或者非必须氨基酸取代，这种取代对其功能不产生实质性影响。
一种“保守的氨基酸取代”指的是其中所述氨基酸残基被具有类似侧脸的氨基酸残基取代。具有类似侧脸的氨基酸残基的家族在本领域中已经被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨基酸)、具有无电荷侧链的氨基酸(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果是单链)在本发明的使用中是可以互换的。
术语“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”或“多核苷酸序列”以及“多核苷酸”在本发明的使用中是可以互换的。
如在这里所使用的，术语“分离的”是指从其原有环境或者天然环境(例如，所述天然环境，例如它是天然存在的)中移出的物质。例如，存在于活动物中的天然存在的多肽或者多核苷酸不是分离的，但是与自然系统中某些或者全部共存物质分开的相同的多核苷酸或者多肽则是分离的。所述多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，而且它们仍然是分离的，因为所述载体或这位并不是其在自然中所发现的环境的组成部分。
如在这里所使用的，术语“治疗”，例如一种登革病毒感染，指的是，在实施方案中，当所述的抗体分子被施用，与没有施用抗体相比，被病毒感染的并且经历了所述病毒症状的受试者(例如，人)将经受较轻的症状和/或将恢复的比较快。在实施方案中，当一种感染被治疗时，在针对感染的有效治疗之后，用于检测受试者病毒的分析将检测到较少的病毒。例如，一种使用抗体分子的诊断分析，例如本发明所述的抗体分子，在抗体分子施用用于感染的有效治疗之后，将在患者的生物样本之内检测到较少的病毒或者没有病毒。其它的分析，例如PCR(例如qPCR)也可以被用于监控患者的治疗，从而在病毒感染治疗之后检测患者内的存在，例如减少的存在(或者缺乏)。治疗能够，例如，部分地或者完全地减轻、改善、减除、抑制、减少具体疾病、失调和/或状态(例如登革病毒)的严重程度和/或减少发病率，并且选择地使具体疾病、失调和/或状态(例如登革病毒)的一种或多种营销或症状、特征和/或起因的临床表现减缓。在实施方案中，治疗指的是，没有显示相关疾病、失调和/或状态的某些标志的受试者的治疗，和/或对仅显示疾病、失调和/或状态的早期标志的受试者的治疗。在实施方案中，治疗指的是对表现出相关疾病、失调和/或状态的一种或多种确定标志的受试者的治疗。在实施方案中，治疗指的是确诊为经受登革病毒的受试者的治疗。
正如在这里所使用的，术语“预防”，例如一种登革病毒感染，指的是如果受试者在被暴露于病毒中之前(例如，1天、2天、1周、2周、3周或者1月或更多)接受了所述的抗体，那么所述受试者(例如人)不太可能受到病毒(例如登革病毒)的感染。
正如在这里所使用的，术语“框架”、“FW”和“FR”在本发明的使用中是可以互换的，并且在本文及其优先权文件中具有相同的意义。
在本发明中的组合物和方法的多种方面将在下文中进一步详细描述。另外的定义在本发明的实施方案的全文中提到。
抗-登革抗体分子
抗登革抗体的示例性序列如下文中的表1-表4中所述。
表1.示例性的抗-登革抗体的氨基酸序列中
Figure GDA0002940984110000271
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
9 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
11 VH FW1氨基酸序列，Kabat
84 VH FW2氨基酸序列，Kabat
A48 16 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C88 17 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
9 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
85 VH FW2氨基酸序列，Kabat
F108 81 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
9 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
84 VH FW2氨基酸序列，Kabat
B48 18 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
A68 19 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
A100 20 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C58 21 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
22 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C78 23 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
24 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C68 25 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
26 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
D98 27 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
28 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
D188 29 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
30 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C128 31 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
9 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
C98 32 VH氨基酸序列
2 VL氨基酸序列
3 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
4 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
9 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
A11 33 VH氨基酸序列
34 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
35 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
B11 36 VH氨基酸序列
34 VL氨基酸序列
14 VH CDR1氨基酸序列，Kabat
21 VH CDR2氨基酸序列，Kabat
5 VH CDR3氨基酸序列，Kabat
6 VL CDR1氨基酸序列，Kabat
7 VL CDR2氨基酸序列，Kabat
8 VL CDR3氨基酸序列，Kabat
15 VH CDR1氨基酸序列，Chothia
10 VH CDR2氨基酸序列，Chothia
5 VH CDR3氨基酸序列，Chothia
6 VL CDR1氨基酸序列，Chothia
7 VL CDR2氨基酸序列，Chothia
8 VL CDR3氨基酸序列，Chothia
A11和B11是小鼠抗体，并且表1中的其它抗体是人源化的抗体。
表2.表1中的重链可变区可轻链可变区序列的氨基酸序列的描述。CDR，根据Kabat系统定义的，是下划线的并且是粗体，但是根据Chothia系统定义的CDR是斜体的。某些感兴趣的残基示出为具有灰色背景。缺失是以一种插入符(^)来表示。
Figure GDA0002940984110000361
Figure GDA0002940984110000371
在本申请全文中，参照指的是根据小鼠抗体A11的可变区域的氨基酸位点。小鼠抗体B11的可变区域具有相对于A11的在位点26上的缺失。在表1中的人可变区域序列具有一种在A11的位点6上的谷氨基酸序列的缺失。因此，相对于A11携带有一种缺失的序列使用一种编号系统，其为偏置的。例如，A48重链具有相对于A11的位点6上的一种谷氨基酸序列的缺失。因此，A48VH的位点26(丝氨酸)实际上是A48VH序列(SEQ ID NO:16)的第二十到第五个氨基酸。在另一个实施例中，D88重链具有相对于A11的位点6上的一种谷氨基酸序列的缺失，以及相对于A11的位点26上的一种丝氨酸的缺失。因此，D88VH的位点33(缬氨酸)实际上是A88VH序列(SEQ ID NO:1)的第三十到第一个氨基酸。
所述抗体的某些结构特征可根据表2中的VH和VL序列被注意到。B11具有一种相对于A11VH区域的位点26上的缺失。D88是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域(保持与A11编号一致)的一种在位点26上的缺失以及一种T33V突变。F38是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的一种在位点26上的缺失以及T33V突变和E43G突变。A48是一种人源化的抗体，其具有与A11相同的CDR。C88是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的一种T33V突变。F108是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的一种T33V突变和E43G突变。B48是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的位点26上的缺失。A68是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的一种A98V突变。A100是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的一种A98S突变。C58是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的G27Y突变和F28W突变。C78是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的K31Q突变和T33V突变。C68是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的K31S突变和T33V突变。C98是一种人源化的抗体，其具有相对于A48VH区域的G27A突变。
可以预见表1和表2中的抗体的其它变体。例如，本发明提供了抗体B48+A98V，其具有相对于B48的A98V突变；A48+V2L，其相对于A48具有V2L突变；A48+InsE6，其相对于A48具有InsE6突变；B48+V2L，其相对于B48具有V2L突变；B48+InsE6，其相对于B48具有InsE6突变；D118，其相对于A48具有F28W和T33V突变；D128，其相对于A48具有G27A、F28W和T33V突变；D138，其相对于A48具有G27Y、F28A和T33V突变；D148，其相对于A48具有G27Y和T33V突变；D158，其相对于A48具有G27Y、F28G和T33V突变；D168，其相对于A48具有F28Y和T33V突变；C98，其相对于A48具有T33V和A98V突变；C128，其相对于A48具有T33V和A98S突变；D178，其相对于A48具有Del26、T33V和A98V突变；以及D188，其相对于A48具有Del26、T33V和A98S突变。
表3.表1中的CDR的氨基酸序列的描述。
Figure GDA0002940984110000381
表4.编码表1中抗体的核苷酸序列的中。
Figure GDA0002940984110000391
A48 39 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C88 40 VH核酸序列
38 VL核酸序列
F108 83 VH核酸序列
38 VL核酸序列
B48 41 VH核酸序列
38 VL核酸序列
A68 42 VH核酸序列
38 VL核酸序列
A100 86 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C58 43 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C78 44 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C68 45 VH核酸序列
38 VL核酸序列
D98 46 VH核酸序列
38 VL核酸序列
D188 87 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C128 88 VH核酸序列
38 VL核酸序列
C98 89 VH核酸序列
38 VL核酸序列
A11 47 VH核酸序列
48 VL核酸序列
B11 49 VH核酸序列
48 VL核酸序列
表5.表4的核酸序列
Figure GDA0002940984110000411
Figure GDA0002940984110000421
Figure GDA0002940984110000431
Figure GDA0002940984110000441
表6.附加氨基酸序列。
Figure GDA0002940984110000451
Figure GDA0002940984110000461
Figure GDA0002940984110000471
Figure GDA0002940984110000481
在一些实施方案中，所述抗体分子包括一种相对于A11的VH T33V突变。更为具体的，在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1(例如，D88、F38、F108或者C88)的抗体的VH区域的CDR1，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括所述CDR1以及表1(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)中抗体的VH区域的CDR2和CDR3的其中之一或两者，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1抗体的VH区域的CDR1(例如，D88、A48、F38、F108或C88)结合在表2的VH和/或VL区域中发现的其它1、2、3、4或5(例如全部6种)种CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体病毒包括SEQ ID NO:3的VH CDR1。例如，所述抗-登革抗体分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1，结合表3的VH CDR2和/或VHCDR3，例如，SEQ ID NO:4的VH CDR2和SEQ ID NO:5的VH CDR3。作为进一步的实施例，所述抗-登革抗体分子可包括SEQ ID NO:3的VH CDR1，结合在表2的VH和/或VL区域中发现的其它1、2、3、4或5(例如全部6种)种CDR。
在某些实施方案中，所述抗体分子包括相对于A11的VH F65L突变。在A11的Kabat定义的CDR中，位点65是CDR残基，但是在A11的Chothia定义的CDR中，位点65则是框架残基。在一些实施方案中，针对登革病毒的抗体分子的亲和性是不受F65L突变影响的。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1(例如，D88、A48、F38、F108或C88)抗体的VH区域的CDR2，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括CDR2以及表1(例如，D88、A48、F38、F108或者C88)中抗体的VH区域的CDR1和CDR3的其中之一或两者，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1抗体的VH区域的CDR2(例如，D88、A48、F38、F108或C88)结合在表2的VH和/或VL区域中发现的其它1、2、3、4或5(例如全部6种)种CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体病毒包括SEQ ID NO:4的VH CDR2。例如，所述抗-登革抗体分子可包括SEQ ID NO:4的VH CDR2，结合表3的VH CDR1和/或VHCDR3，例如，SEQ ID NO:3的VHCDR1和SEQ ID NO:5的VH CDR3。作为进一步的实施例，所述抗-登革抗体分子可包括SEQ IDNO:4的VH CDR2，结合在表2的VH和/或VL区域中发现的其它1、2、3、4或5(例如全部6种)种CDR。在某些实施方案中欧，所述抗体分子包括相对于A11的VH F65L突变以及VH T33V突变。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括在相对于A11的VH中的位点26上的S的缺失(del26)。在一些实施方案中，所述抗体分子包括del26突变，结合VH T33V突变和/或VH F65L突变。在某些实施方案中，所述抗体分子包括del26突变以及一种或多种表3的CDR。在某些实施方案中，所述抗体分子包括del26突变，结合在表2的VH和/或VL区域中的1、2、3、4、5或6中CDR，使用CDR的Kabat或者Chothia定义。
如下文的实施例4中所示，重链的N端对突变是耐受的。因此，在一些实施方案中，重链序列的位点1-6具有相对于表1的抗体的1、2、3、4、5或6种突变。在一些实施方案中，一种抗体分子包括在表2中的重链你序列的残基2、3、5或6的一种或多种(例如全部)上的一种取代、插入或者缺失。在某些实施方案中，所述抗体分子包括表2的重链序列的一部分，例如氨基酸位点2-117、3-117、4-117、5-117、6-117、8-117或者10-117。
如下文的实施例5中所示，在VH中的位点27和28是突变耐受的，并且在一些实施方案中对于位点27和/或28的突变增强了结合性。因此，在一些实施方案中，位点27和28的其中之一或者二者具有相对于表1的抗体的突变。
实施例5还显示了在VH的位点98是突变耐受的，并且在一些实施方案中，对于位点98的突变增强了结合性。因此，在一些实施方案中，位点98具有相对于表1的抗体的突变。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括重链恒定区、轻链恒定区以及表2的重链和轻链可变区。在某些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括重链恒定区、轻链恒定区、以及包括表3的1、2、3、4、5或6中CDR的可变区域。
在一些实施方案中，所述重链可变区是一种表1的重链可变区，其中在VH中的残基98可以是任意的氨基酸。在某些实施方案中，残基98可以是任意的无电荷的氨基酸。在一些实施方案中，位点98可以是A、V或S。下文中的实施例5显示了具有在位点98上的A、V或S的抗体具有针对EDIII优异的结合性。
在人源化过程中，多种框架区域(例如，VH FW1)可被回复突变为含有来自小鼠抗体A11或B11的残基。更广泛的来说，在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包含表1的VH区域的全部或者部分的序列。例如，在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1的VH区域的氨基酸5-117、10-117、15-117、20-117、25-117、30-117或者32-117。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括一种VH FW1区域，其选自小鼠VH FW1区域(例如，在A11或者B11中发现的)或者人VH FW1区域(例如，在表1的抗体中发现的区域，或者在人种系VH FW1序列中发现的区域)。在一些实施方案中，所述VH FW1区域相对于表1的VH序列的氨基酸1-31具有不超过1、2、3或4个位点的非同一性。
在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括表1中抗体的VH FW2区域。在一些实施方案中，所述VH FW2区域相对于表1中VH序列的氨基酸37-50具有不超过1、2、3或4个位点的非同一性。具有与获自登革病毒的多种血清型的EDIII交叉反应能力的抗体分子具有某些优异特性。例如，一种治疗方法可被用于治疗或者诊断多种登革血清型。此外，医生为了确定合适的治疗方法并不需要确定患者感染的血清型。因此，在一些实施方案中，所述抗-可等各个抗体分子具有以高亲和力独立结合两种、三种、四种或者多种登革病毒血清型的能力。例如，所述抗体分子可独立地以高亲和力与DV-1和DV-4的EDIII结合；与DV-1和DV-3的EDIII结合；与DV-1和DV-4的EDIII结合；与DV-2和DV-3的EDIII结合；与DV-2和DV-4的EDIII结合；与DV-3和DV-4的EDIII结合；或者与DV-1和DV-2和DV-3的EDIII结合；与DV-1和DV-2和DV-4的EDIII结合；与DV-1和DV-3和DV-4的EDIII结合；与DV-2和DV-3和DV-4的EDIII结合；或者与DV-1和DV-2和DV-3和DV-4的EDIII结合。在某些实施方案中，所述抗体分子可独立地以高亲和力与DV-4的EDIII和一种或多种其它DV血清型的EDIII结合。
上文中所述的登革病毒的每一种血清型回的是含有多种菌株的类型。本发明所述的抗体分子显示了一种良好的反应性宽度，与不同血清型(参见附图11)中的多种菌株结合。因此，在一些实施方案中，本发明所述的抗体分子结合和/或中和一种或多种(例如，至少2、3、4、5、10、15、或者20、25、或者30或更多)的登革病毒菌株，例如选自DENV-4BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4NewCal09、DENV-4Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3Nic10、DENV-3H87、DENV-2Peru95、DENV-2Sing08、DENV-2NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2New Guinea/1944(NGC)、DENV-3Philippines/1956(H87)、DENV-4Mexico/1997(BC287/97)、和DENV-4H241的菌株，所述菌株列入到本发明的表6中(例如，表6所提供的那些针对EDIII序列的菌株)，所述菌株存储于ATCC中，所述菌株列入到针对新兴病毒和虫媒病毒的世界参考中心中(WRCEVA)(获自www.niaid.nih.gov/labsandresources/resources/dmid/wrceva/Pages/default.aspx)，并且所述菌株列入到CDC部分或者载体媒介感染疾病中(获自www2a.cdc.gov/nczved/dvbid/misc/reg.asp)。
在一些实施方案中，所述抗体分子以高亲和力结合至DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的一种或多种。在一些实施方案中，这些血清型中的每一种的E蛋白质的EDIII氨基酸序列指的是在表6中提供的E蛋白序列。
在一些实施方案中，本发明所公开的抗体分子并不会刺激抗体依赖性激活作用(ADE)。ADE在Balsitis等人，Lethal Antibody Enhancement of Dengue Disease in MiceIs Prevented by Fc Modification，PLoS Pathog 6(2):e1000790.doi:10.1371/journal.ppat.1000790中进行了更为详细的描述。简单地说，ADE描述了一种情况，其中人经历由于不同血清型的登革病毒的两种连续的登革感染，并且第一感染的发生是的第二感染更为严重(例如，更可能发展成为登革出血热)。用于ADE的机制可以是一种抗-登革抗体同时与病毒以及与宿主细胞上的抗体Fc受体结合，增强传染性。从本发明所公开的FRNT实施方案中能够清楚的发现，本发明提供了多种抗体分子，其降低了，而不是增强，所述传染性。因此，在某些实施方案中，本发明所述的抗体分子不能够激活患者体内的ADE。在一些实施方案中，所述抗体抑制经由ITA抗体(例如，患者的内因性抗体)诱导的ADE。
在某些实施方案中，所述抗体分子结合在EDIII上的线性的或者构象的表位。
正如在这里所使用的，术语“抗体分子”涉及一种蛋白质，其包括至少一种免疫球蛋白变体区域序列。术语抗体分子包括，例如，全长的抗体、成熟抗体以及抗体的抗原结合片段。例如，抗体分子能包括一种重链(H)可变区域序列(在本发明中缩写为VH)以及一种轻链(L)可变区域序列(在本发明中缩写为VL)。在另一个实施例中，抗体分子包括两种重链(H)可变区域序列以及两种轻链(L)可变区域序列，因而形成了两种抗原结合位点，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变结构域抗体、双链抗体(Dab)(二价体并且有双特异性)、以及嵌合(例如人源化的)抗体，其可通过整个抗体的修饰或者用重组DNA方法重新合成而产生。这些功能性抗体片段维持了选择性与其给的抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可来自抗体的任意类型，其包括，但不限于，IgG、IgA、IgM、IgD以及IgE，以及来自抗体的任意子类型。所述抗体可以是单克隆或者多克隆的。所述抗体可以是人、人源化的、CDR-嫁接的，或者在体外产生的抗体。所述抗体能够具有一种重链恒定区，其选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4。所述抗体还可以具有一种轻链恒定区，其选自，例如，kappa或者lambda。
抗原结合片段的实例包括：(i)一种Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1区域构成的单价片段；(ii)一种F(ab')2片段，一种具有通过在铰链区上的二硫键结合的两个Fab片段的二价片段；(iii)一种由VH和CH1区域构成的Fd片段；(iv)一种由抗体单臂的VL和VH区域构成的Fv片段；(v)一种双特抗体(dAb)片段，其是有VH区域古城；(vi)一种骆驼的或骆驼化的可变区域；(vii)一种单链Fv(scFv)，参见，例如，Bird等人.(1988)Science 242:423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)的文献；(viii)一种单区域抗体。这些抗体片段可使用任意适合的方法获得，包括本领域技术人员已知的一些常见的技术，并且所述片段可被筛选用于在与完整抗体相同的方式中应用。
术语“抗体”包括完整的分子以及其功能片段。所述抗体的恒定区能够被改变，例如，突变，从而修饰所述抗体的特性(例如，用于增加或者减少一种或多种：Fc受体结合性、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应细胞功能、或者补体功能)。
本发明所公开的抗体还可以是单结构域抗体。所述单结构域抗体可包括其互补决定域是单结构域多肽一部分的抗体。实施例包括，但不限于，重链抗体、天然没有轻链的抗体、从常规4-链抗体衍生的单结构域抗体、工程化抗体和单结构域支架，其不同于从抗体衍生的那些支架。单结构域抗体可以是本领域中任一种单结构域或者任一将来的单结构域抗体。单结构域抗体可以源自任意种类，其包括，但不限于，小鼠、人、骆驼、美洲驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。依据一些方面，单结构域抗体是一种天然存在的单结构域抗体，其已知为缺少轻链的重链抗体。例如，这样的单结构域抗体在WO 9404678中已经被公开。为了清楚起见，这种从天然缺少轻链的重链抗体衍生的可变结构域被称为VHH或nanobody，从而将其于四链免疫球蛋白的常规VH相区别。这种VHH分子可以来自在骆驼科(Camelidae)物种，例如在骆驼、美洲驼、单峰骆驼、羊驼和驮马中产生的抗体。除了骆驼科之外的其它物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体；这种VHHs在本发明所公开的范围内。
所述VH和VL区域可被细分为被称为“互补决定区(CDR)”的高变区，其散布于被称为“框架区(FR)”的更保守的区域中。已经通过一些方法精确地限定了所述框架区和CDRs的范围(参见Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242；Chothia，C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917)；以及采用Oxf或者d Molecular's AbM抗体建模软件的所述AbM定义。参见，通常例如抗体可变区域的蛋白质序列和结构分析。在抗体工程实验室手册中(Ed.:Duebel，S.and Kontermann，R.，Springer-Verlag，Heidelberg)。在一些实施方案中，使用了下述的定义：重链可变区域的CDR1的AbM定义以及针对其它CDRs的kabat定义。在某些实施方案中，kabat定义用于所有的CDRs。此外，针对Kabat或者AbM描述的实施方案中，CDRs还可以使用chothia高变环来实现。每个VH和VL一般都包括三种CDRs和四种FRs，从氨基端至羧基端按照下列顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
正如在本发明中所使用的，“免疫球蛋白可变区域序列”指的是一种氨基酸序列，其能够形成一种免疫球蛋白可变区域的结构。举例来说，所述序列可包括一种天然存在的可变区域的氨基酸序列的全部或者一部分。例如，所述序列可包括或者不包括一种、两种或者多种N-或者C-端氨基酸，或者可包括其它与所述蛋白质结构的构型相同的改变。
术语“抗原结合区域”指的是一种抗体分子的一部分，其包括形成一种结合E蛋白或其表位的界面的决定簇。针对蛋白质(或者蛋白质模拟物)，所述抗原结合区域典型地包括一种或多种环(至少了，例如，四种氨基酸或者氨基酸模拟物)，其形成了一种结合E蛋白质的界面。典型地，抗体分子的抗原决定区域包括至少一种或两种CDRs，或者更为典型地至少三种、四种、五种或者六种CDRs。
正如在本发明中所使用的，术语“单克隆抗体”或者“单克隆抗体组合物”指的是单一分子组合物的抗体分子制备物。一种单克隆抗体组合物表现出针对一种具体表位的单结合特异性和亲和力。一种单克隆抗体能够通过杂交瘤技术制备。或者通过不适用杂交瘤技术的方法(例如重组方法)制备。
一种“有效的人”蛋白指的是一种蛋白质，其不能诱发中和抗体应答，例如，所述人抗-鼠抗体(HAMA)应答。HAMA可以在许多情况下成为问题，例如，如果所述抗体分子被重复施用，例如在慢性或周期性的疾病状况的治疗中。HAMA应答可能使潜在的重复抗体施用无效，其是由于从血清中增加的抗体清除(参见，例如，Saleh等人，CancerImmunol.Immunother.，32:180-190(1990))以及还会由于潜在的过敏反应(参见，例如，LoBuglio等人，Hybridoma，5:5117-5123(1986))。
所述抗体分子可以是一种多克隆抗体或者一种单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体可以是重组制备，例如通过任何合适的噬菌体展示或者组合方法进行制备。
本领域已知多种用于产生抗体的噬菌体展示或者组合方法(如在这里所描述的，例如，Ladner等人，U.S.Patent No.5,223,409；Kang等人，International PublicationNo.WO 92/18619；Dower et al.International Publication No.WO 91/17271；Winter等人，International Publication WO 92/20791；Markland等人，InternationalPublication No.WO 92/15679；Breitling等人，International Publication WO 93/01288；McCafferty等人，International Publication No.WO 92/01047；Garrard等人，International Publication No.WO 92/09690；Ladner等人，International PublicationNo.WO 90/02809；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人，(1992)HumAntibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人，(1989)Science 246:1275-1281；Griffths等人，(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol 226:889-896；Clackson等人，(1991)Nature 352:624-628；Gram等人，(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等人，(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；以及Barbas等人，(1991)PNAS 88:7978-7982，上述文献的全部内容已经通过引用并入到本发明中)。
在一些实施方案中，所述抗体是一种完整的人抗体(例如，一种在小鼠中产生的抗体，其已经被基因工程化从而从人免疫球蛋白序列产生一种抗体)，或者一种非人抗体，例如啮齿类动物(小鼠或大鼠)、山羊、灵长类动物(例如猴子)、骆驼抗体。在某些实施方案中，所述非人抗体是啮齿类动物(小鼠或大鼠)抗体。用于生成啮齿类动物(小鼠或大鼠)的方法在本领域中是已知的。
人单克隆抗体能够使用携带有人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠来产生。获自这些用感兴趣的抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞可被用于制备杂交瘤，所述杂交瘤分泌对来自人蛋白的表位具有特异性亲和性的人mAb(参见例如，Wood etal.International Application WO 91/00906，Kucherlapati et al.PCT publicationWO 91/10741；Lonberg et al.International Application WO 92/03918；Kay etal.International Application 92/03917；Lonberg，N.et al.1994Nature 368:856-859；Green，L.L.et al.1994Nature Genet.7:13-21；M或者rison，S.L.etal.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855；Bruggeman et al.1993Year Immunol7:33-40；Tuaillon et al.1993PNAS 90:3720-3724；Bruggeman et al.1991Eur JImmunol 21:1323-1326)。
一种抗体可指的是那种，其中所可变区域或其部分，例如CDRs，是在非-人体组织(例如鼠或小鼠)中生成。嵌合的，CDR-移植的，及人源化的抗体也涵盖在内。在非人体组织(例如鼠或小鼠)中生成并且在之后进行修饰(例如，在可变片段或恒定区中)从而降低在人体中抗原性的抗体，也涵盖在内。
嵌合抗体可以通过任何适合的重组DNA技术进行制备。其中的很多技术是本领域所公知的(参见Robinson et al.，International Patent Publication PCT/US86/02269；Akira，et al.，European Patent Application 184，187；Taniguchi，M.，European PatentApplication 171，496；M或者rison et al.，European Patent Application 173，494；Neuberger et al.，International Application WO 86/01533；Cabilly etal.U.S.Patent No.4,816,567；Cabilly et al.，European Patent Application 125，023；Better et al.(1988Science 240:1041-1043)；Liu et al.(1987)PNAS 84:3439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139:3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84:214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47:999-1005；Wood et al.(1985)Nature 314:446-449；and Shaw et al.，1988，J.Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。
一种人源化或者CDR-移植的抗体将具有用供体CDR替换的至少一种或两种但通常所有三种受体CDRs(重免疫球蛋白链和/或轻免疫球蛋白链的)。所述抗体可以用至少一部分非人CDR进行替换或者仅包含一部分的CDRs可以用非人CDRs进行替换。只需要替换需要将人源化的抗体结合到EDIII的数量的CDRs。在一些实施方案中，所述供体将是啮齿类动物抗体，例如，鼠或小鼠抗体，并且所述受体将是人框架或者人共有框架。典型地，所述提供CDRs的免疫球蛋白被称为“供体”，并且提供框架的免疫球蛋白被称为“受体”。在一些实施方案中，所述供体免疫球蛋白是非人的(例如，啮齿类动物)。所述受体框架代表性地是一种天然存在(例如，人)的框架或者一种共有框架，或者序列大约85％或更高，例如90％、95％、99％或更高与其相同的框架。
正如在本发明中所使用的，术语“共有序列”指的是一种相关序列家族中最经常出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(例如参见，Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987))。在一种蛋白家族中，共有序列上的每一个位点都被该家族中该位点上最经常出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现的频率相等，那么其中的任何一个氨基酸都可以包含在共有序列中。“共有序列”指的是共有免疫球蛋白序列中的框架区。
一种抗体可以通过任何合适的方法进行人源化，其中其中某些方法在本领域中是已知的(例如参见，M或者rison，S.L.，1985，Science 229:1202-1207，by Oi et al.，1986，BioTechniques 4:214，and by Queen et al.US 5,585,089，US 5,693,761以及US 5,693,762，这些文献的全部内容已经通过引用并入到本发明中)。
人源化或CDR-移植的抗体能够通过CDR移植或者CDR取代进行制备，其中免疫球蛋白链的一种、两种或者全部CDR可以被取代。参见，例如，U.S.Patent 5,225,539；Jones etal.1986Nature 321:552-525；Verhoeyan et al.1988Science 239:1534；Beidler etal.1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US 5,225,539，这些文献的全部内容已经通过引用并入到本发明中。Winter描述的是一种CDR移植方法，其可被用于制备人源化抗体(UKPatent Application GB 2188638A，filed on March 26，1987；Winter US 5,225,539)，该文献的全部内容已经通过引用并入到本发明中。
本发明还提供了人源化抗体，其中具体的氨基酸可以被取代、缺失或者添加。用于从供体中选择氨基酸的标准在例如，US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16栏中进行了描述，该文献的全部内容已经通过引用并入到本发明中。其它用于人源化抗体的技术在1992Ian12月23日公开的Padlan等人EP 519596A1中进行描述。
所述抗体分子可以是一种单链抗体。一种单链抗体(scFV)可以被工程化(参见，例如，Colcher，D.et al.(1999)Ann N Y Acad Sci 880:263-80；和Reiter，Y.(1996)ClinCancer Res 2:245-52))。所述单链抗体可以被二聚体化或多聚体化用于产生针对相同目标蛋白对的不同表位具有特异性的多价抗体。
在一些实施方案中，所述抗体分子具有一种重链恒定区域，其选自例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD和IgE的重链恒定区；具体的，选自例如，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的(例如，人)重链恒定区。在另一个实施方案中，所述抗体分子具有一种轻链恒定区，其选自，例如kappa或者lambda的(例如，人)轻链恒定区。所述恒定区能够被改变，例如突变，从而对抗体的特性进行修饰(例如增加或者降低一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数量、效应器细胞功能、和/或补体功能)。在一些实施方案中，所述抗体具有效应功能，并且能够固定补体。在另一个实施方案中，所述抗体并不会回复效应器细胞或者固定受体。例如，它可以是同位素或亚型、片段或其它突变体，其不支持结合到Fc受体，例如，它具有一个诱变的或缺失的Fc受体结合区。
所述抗体恒定区在一些实施方案中是被改变的。用于改变一种抗体恒定区的方法在本领域中是已知的。具有改变的功能的抗体，例如针对效应器配体改变的亲和性，例如，在细胞上的FcR，或者补体的C1成分可以通过用一种不同的残基取代至少一种在抗体恒定区中的氨基酸残基来制备(参见，EP 388,151A1，U.S.Pat.No.5,624,821和U.S.Pat.No.5,648,260，上述文献的全部内容已经通过引用并入到本文中)。氨基酸突变，其稳定了在人IgG4中的氨基酸结构，如S228P(EU命名法，在Kabat命名法中为S241P)也涵盖在范围之内。相似类型的改变将被描述如果应用于小鼠，或者其它种类的免疫球蛋白将减少或者消除这些功能。
在一些实施方案中，在所述抗-登革抗体分子中的氨基酸是规范氨基酸。在一些实施方案中，所述抗-登革抗体分子包括天然产生的氨基酸；其类似物、衍生物和酮类物质；具有变体侧链的氨基酸类似物；和/或所有上述物质中的任意一种的全部立体异构体。所述抗-登革抗体分子可包括氨基酸的D或者L光学异构体以及拟态。
抗-登革抗体分子的多肽可以是直链或者支链的，其可包括修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。所述抗体分子还可以被修饰，例如，通过二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或其它任何操作，例如与标记组分共轭。所述多肽可以从天然来源中被分离，可以是通过重组技术从原核生物或真核生物宿主进行制备，或者可以是一种合成方法的产物。
所述抗-登革抗体分子可单独以为结合的形式使用，或者可以结合一种物质，例如毒素或其部分(例如，一种治疗药物；化合物发射辐射；植物、真菌或细菌开元的分子；或者一种生物蛋白(例如一种蛋白质毒素))或者颗粒(例如，一种重组病毒颗粒，例如通过病毒性外壳蛋白)。例如，所述抗-登革抗体可以耦合于放射性同位素，例如α-，β-，或γ-放射体，或者β-和γ-放射体。
抗体分子可衍生或者链接到另一种功能分子上(例如，其它的肽或蛋白质)。正如本发明所使用的，“衍生”抗体分子可以是已经被修饰的。衍生化的方法包括，但不限于，荧光部分、放射性同位素、毒素、酶或亲和配体如生物素的添加。因此，抗体分子包括本发明所述的衍生以及别的修饰形式的抗体，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可被功能性结合(通过化学结合、基因融合、非共价键联合或其它方式)至一种或多种其它分子实体，例如其它抗体(例如，一种双特异性抗体或者双特抗体)、可检测的试剂、毒素、药物学试剂、和/或一种能接到抗体或抗体片段与另一种分子作用的蛋白质或肽(例如链亲和素核心区或多聚组氨酸标签)。
一些类型的衍生抗体分子可通过交联两种或多种抗体(相同类型的或者不同类型的，例如，从而构成双特异性抗体)制备。合适的交联剂包括那些具有由适当间隔区隔开的两个不同反应基团的异型双功能的(例如，间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同型双功能(例如，双琥珀酰亚胺基辛二酸盐)的交联剂。这些交联剂可以从PierceChemical Company，Rockf或者d，Ill买到。
能衍生(或标记)抗-登革抗体分子的有用的可检测试剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光物质、生物发光物质、荧光发射金属原子例如铕(Eu)、和其它镧系元素、和放射性物质(如下文中所述的)。代表性的荧光检测试剂包括荧光素、异硫氰荧光素、若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。一种抗体还可通过可检测的酶，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶等等来衍生。当利用可检测的酶来衍生抗体时，可以通过加入另外的试剂，使酶利用加入的试剂产生可检测的反应产物来进行检测。例如，当可检测试剂是辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯会产生可检测的显色反应产物。抗体分子还可以用辅基(例如，抗生蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素)来衍生。例如，可以用生物素来衍生抗体，通过间接测定链亲和素或亲和素的结合来进行检测。合适的荧光材料的例子包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白。
标记的抗体分子可以用于多种环境，例如可用于诊断和/或实验，包括(i)利用标准技术，例如亲和色谱或免疫沉淀来分离预定的抗原；(ii)为了评估预定的抗原(例如细胞裂解产物或血清样品中的SARS病毒粒子)表达的丰度和方式对该蛋白质进行检测；(iii)作为临床试验程序的一部分，监测组织中蛋白质的水平，以确定约定的治疗方案的疗效。
可以将抗体分子与另一种分子实体偶联，典型的情况是与标记物，治疗制剂(例如，细胞毒性制剂或抑制细胞生长的制剂)或半分子(moiety)偶联。在诊断或治疗应用中可以使用放射性同位素。能与所述抗-登革抗体耦合的放射性同位素包括，但不限于，α-，β-或γ-发射源，或者β-和γ-发射源。所述放射性同位素包括，但不限于，碘(131I或125I)、钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、铑(188Rh)、硫(35S)、碳(14C)、氚(3H)、铬(51Cr)、氯(36Cl)、钴(57Co或58Co)、铁(59Fe)、硒(75Se)或镓(67Ga)。可用作治疗剂的放射性同位素包括钇(90Y)、镥(177Lu)、锕(225Ac)、镨、砹(211At)、铼(186Re)、铋(212Bi或213Bi)、和铑(188Rh)。可用作标签的放射性同位素，例如，例如在诊断中应用，包括碘(131I或125I)、铟(111In)、锝(99mTc)、磷(32P)、碳(14C)、以及氚(3H)，或者一种或多种上述所列的治疗同位素。
本发明提供了放射性标记的抗体分子以及标记所述抗体分子的方法。在一些实施方案中，公开了标记抗体分子的方法。所述方法包括使抗体分子与螯合剂接触，从而制备共轭的抗体。所述共轭抗体是用放射性同位素进行放射性标记，例如，111铟、90钇和177镥，从而制备一种标记的抗体分子。
正如在上文中所讨论的那样，所述抗体分子可被共轭至治疗制剂。已经提到了治疗有效的放射性同位素。其它的治疗制剂的实例包括抗-病毒制剂。
在一些方面，本发明提供了一种提供本发明所述的抗体分子的方法。所述方法包括：提供一种抗原，例如一种登革病毒E蛋白质或其部分；得到一种特异性了解所述抗原的抗体分子；评估抗体分子，在调节抗原活性和/或有机体表达所述抗原方面的效力，例如登革病毒。所述方法可进一步包括向受试者(例如，人)施用所述抗体分子，包括其衍生物(例如，一种人源化的抗
本发明提供了一种分离的核苷酸分子，其编码上述抗体分子、载体及其宿主细胞。所述核苷酸分子包括，但不限于，RNA、基因组DNA以及cDNA。
动物模型
本发明所公开的抗体分子可以在动物模型中进行评估。例如，动物模型可被用于检测本发明所述描述的抗体分子在降低登革病毒感染、复制和/或传播方面的功效。能够被用于评估本发明所述的抗体分子的示例性动物模型包括，但不限于，AG129小鼠模型(例如，正如在Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64；Johnson et al.J Virol.1999；73(1):783-6中所描述的)；非小鼠适应的小鼠模型(例如，在Tan等人PLoS Negl Trop Dis.2010；4(4):e672中描述的非小鼠适应的DENV-2D2Y98P小鼠模型)；人源化的小鼠模型(例如，在Sridharan等人，J Virol.2013；87(21):11648-58中描述的模型)；非人灵长类模型(例如，在Goncalvez等人，Proc Natl Acad Sci U SA.2007；104(22):9422-7中描述的模型)；以及蚊虫模型(例如，在Vu等人，PLoS Negl TropDis.2010；4(7):e757中描述的模型)。
所述AG129小鼠菌株，其同时缺少I型和II型干扰素受体，回的是一种动物模型，所述模型复制了在登革热临床病例中观察到的某些疾病临床表现，包括病毒血症和其它病症(Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64；Johnsonet al.J Virol.1999；73(1):783-6)。所述模型在抗病毒治疗的评估中是有效的，并且能够被用于证明原理研究。简单地说，所述AG129(其在IFN-α/β和IFN-γ受体方面不足)小鼠用登革病毒进行攻击，并且使用一种候选的治疗抗体分子。典型地，病毒血症(在血液样本中的病毒滴度)指的是实验的终点。病毒血症能够用例如定量的RT-PCR进行测量。在实施例10中描述了一种示例的AG129小鼠模型。
非小鼠适应的小鼠模型可使用例如一种非小鼠适应的DEN2病毒菌株(D2Y98P)进行制备，其一经腹腔内施用在AG129小鼠内是高度传染的(Tan et al.PLoS Negl TropDis.2010；4(4):e672)。具有高剂量D2Y98P的感染诱导细胞因子、大规模器官损伤、以及严重的血管渗漏，导致在病毒血症的高峰期时动物出血和快速死亡。具有低剂量D2Y98P的感染能够导致在相关气管内的无症状的病毒扩散和复制，然后在病毒清除几天后动物非麻痹性死亡，与人体中的疾病运动相似。脾损伤、肝功能损害和血管通透性增加，但没有出血，能够在垂死的动物中观察到，这表明未受损伤血管完整性，在登革休克综合征中的一种基本功能。
人源化的小鼠模型能够例如通过人CD34+胚胎肝细胞过继转移到NOD-scidIl2rg-/-(NSG)小鼠中来产生，其增进了人血小板、单核细胞/巨噬细胞和肝细胞的显著水平(Sridharan et al.J Virol.2013；87(21):11648-58)。这些小鼠用登革病毒例如DENV血清型2(DENV-2)的感染能够重现在人体内登革病毒感染的某些性能特征，例如，瞬态白细胞减少和血小板减少。
非人灵长类模型可以例如在DENV攻击后年幼恒河猴体内进行制备，如在oncalvez等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(22):9422-7中所描述的。感染猴子的病毒血症滴度能够通过例如定量PCR或焦点形成单位(CFU)检测进行确定。
蚊虫模型也可以用于评估抗体针对登革热病毒的抑制活性，例如，病毒感染的中和或者受试者和蚊子之间的传输的减少。登革热病毒是一种蚊虫传播的RNA病毒。某些登革热病毒可以增加在体内的适应度优势，这可能导致较高可能性的人-到-蚊虫传播(Vu等人，PLoS Negl Trop Dis.2010；4(7):e757)。为了建立一个蚊子模型，含有病毒和抗体的血液可以被供给到蚊虫。在蚊虫腹部的病毒载量能够通过qRT-PCR来测量。一种典型的蚊虫模型在实施例13中进行描述。
药物组合物和试剂盒
在一些方面，本发明提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包括本发明所述的抗-登革抗体分子，与药学上可接受的载体一起配制。正如在本发明中所使用的那样，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂、吸收延迟剂等等。所述载体能够适用于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。在某些实施方案中，在所述药物组合物中少于大约5％，例如少于大约4％、3％、2％或1％，的抗体分子作为聚集体存在。在其它实施方案中，在所述药物组合物中少于大约96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％或者更多的抗体分子作为单体存在。在一些实施方案中，抗体聚集体或者抗体单体的水平是通过色谱分析，例如，高效尺寸排阻色谱分析(HP-SEC)进行确定的。
所述组合物可以有多种形式。例如，这些形式包括液体、半固体和固体剂型，如溶液(例如可注射和可输注的液体)、分散剂或悬浮剂、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式及治疗应用。典型的合适组合物是注射和输注溶液形式。施用的合适方式是胃肠外方式(例如，静脉注射、皮下注射、腹膜注射、肌肉注射)。在一些实施方案中，所述抗体分子是通过静脉输注或者注射进行施用。在某些实施方案中，所述抗体分子是通过肌肉注射或者皮下注射进行施用。
本发明中所使用的短语“胃肠外施用(pareneral administration)”和“肠胃外地施用(administered parennterally)”指的是除肠内和局部施用之外的施用方式，通常为注射方式，并且非限制性地包括静脉、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外和胸骨内注射和输注。
典型地治疗组合物在制备和存储过程中，通常必须是无菌并且稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳剂、分散剂、脂质体或适合高抗体浓度的其它有序结构形式。无菌注射溶液可通过将活性化合物(抗体或抗体部分)以所需的浓度在合适的溶剂中溶解后，与需要的其它联用组分的一种或多种成分，然后进行过滤除菌。通常，分散剂可通过将活性化合物与无菌载体混合后进行制备，所述无菌载体含有基本分散介质和其它上文所列的需要成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉状物，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法能够产生所述活性成分与源自已无菌过滤的溶液的任何所需附加成分的粉状物。溶液的流动性可通过一些方法来保持，例如，通过利用如卵磷脂这种涂层、通过在分散相的情况下保持所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂。注射用组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的药剂形成，例如硬脂酸盐和明胶。
所述抗体分子可以通过多种方法进行施用。一些是本领域所已知的，并且针对多种治疗应用，合适的施用途径/方式是静脉注射或者输注。例如，抗体分子能够以小于10mg/min的速率通过静脉输注进行施用；优选小于或等于5mg/min从而达到大约1到100mg/m2的剂量，优选大约5到50mg/m2，大约7到25mg/m2并且更为优选地大约10mg/m2。正如本领域技术人员可以理解的那样，施用的途径和/或方式取决于所希望达到的结果。在某些实施方案中，所述活性化合物可以用保护该化合物免于快速释放的载体进行制备，例如一种控释剂型，包括植入物、透皮贴片、以及微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解聚合物、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于这些制剂的多种制备方法已被专利保护或通常被本领域技术人员所熟知。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New Y或者k，1978。
在某些实施方案中，抗体分子能够例如与惰性稀释剂或者可同化的可使用载体一起口服施用。所述抗体分子(以及其它成分，如果需要)也可以包在硬或软的胶囊壳中，压缩在片剂中或直接并入到受试者的饮食中。对于口服治疗施用，所述抗体分子可以与赋形剂一起加入，并以可摄入的片剂、颊含片、糖锭、胶囊、酏剂、悬浮体、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。除胃肠外给药外，在施用抗体分子时，可能需要用防止药物的失活的某种材料来包裹所述化合物或共同给予所述化合物。治疗组合物还能够用医疗器械进行施用，并且其中某些是本领域所公知的。
对给药方案进行调整从而提高所需的反应(例如，治疗反应)。例如，可以以单次剂量施用，也可以在一段时间内以几个分开的剂量进行施用，或者所述剂量可以根据治疗状况所出现的紧急事件的预示来按比例进行减少或增加。以剂量单元形式制备肠胃外组合物对于方便施用和剂量均匀性是尤其有利的。这里用到的剂量单位形式是指作为治疗受试者的单位剂量的生理区分的单位；每个单位包含预定量的活性化合物，经计算可以与要求的药物载体协同作用，产生需要的治疗效果。本发明对剂量单位形式的说明是依据(a)抗体的独特性质和要达到的特定治疗或预防效果，和(b)不同个体对抗体治疗敏感性的差异造成药物配制的内在局限性。
抗体分子的治疗或预防有效量的示例性非限制的范围是0.1-20mg/kg，更为优选的1-10mg/kg。所述抗体分子可通过静脉输注进行施用，其以小于10mg/min的速率，优选小于或等于5mg/min，用以达到大约1到100mg/m2的剂量，优选大约5到50mg/m2，大约7到25mg/m2，并且更为优选大约10mg/m2。需要注意的是，剂量值可以随着所要缓解的疾病的症状和类型进行变化。还应当理解的是，对于任何特定的受试者而言，具体的剂量用法应当是随时间根据个体需要以及管理或监督组合物给药的人员的专业判断来调节的，并且在此给出的剂量范围仅仅是示例性的，而不意在限制所要求保护的组合物的范围或实施。
本发明所述的药物组合物包括“治疗有效量”或“预防有效量”的抗体分子。“治疗有效量”指的是在服用时能在一定剂量下以及必要的时间段内，有效地达到预期治疗效果的有效剂量。治疗有效量的改性抗体或抗体片段可根据多种因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体和抗体部分在所述个体中激发所述反应的能力。治疗有效量同时也指的是抗体分子治疗效果要大于其带来的任何毒性或有害性的剂量。与未治疗者相比，“治疗有效剂量”优选抑制至少大约20％的可测量参数，更为优选至少大约40％，甚至更优选至少大约60％，并且仍然更为优选至少大约80％。所述可测量参数可以是，例如，病毒载量、高热、头痛、肌肉或关节痛、皮肤红疹、出血、降低的血小板水平、以及降低的血压。可以用能预测抗体分子在登革病毒内功效的动物模型系统来评估抗体分子抑制可测量参数的能力。可选择的，组合物的这种特性能够通过检验抗体分子用于中和登革病毒例如通过体外分析关注制剂的能力来进行评估。
“预防有效量”指的是在必要的剂量下以及一段时间内，有效地达到预防治疗效果的有效剂量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或早期用于受试者，因此预防有效量将会低于治疗有效量。
在本发明中还公开了一种试剂盒，其包括本发明所述的抗体分子。所述试剂盒可包含一种或多种其它成分，所述成分包括：使用说明书；其它试剂，例如标记物、治疗制剂、用于螯合的试剂或其它将抗体偶联到标记物或治疗制剂上的试剂、辐射防护组分；制备施用的SARS蛋白或抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体和给受试者施用药物的装置或其它材料。
核酸
本发明的特征还在于包含编码本发明所述的抗-登革抗体分子的重链和轻链可变区域和CDRs的核苷酸序列的核酸。例如，本发明的特征在于分别编码抗-登革抗体分子的重链和轻链可变区域的第一核酸和第二核酸，所述抗-登革抗体分子选自一种或多种本发明所述的抗体分子例如表1的抗体，或抗体的一部分例如表2的可变区域。所述核酸可以包括一种核苷酸序列，其可编码在本发明所述表中的任意一种氨基酸序列，或者与其基本相同的序列(例如，与其有至少大约85％，90％，95％，99％或更多同一性的序列，或者与本发明表中所示的序列相异不超过3，6，15，30，或45个核苷酸的序列)。
在某些实施方案中，所述核酸可以包括一种核苷酸序列，其编码来自重链可变区域的至少一种、两种或三种CDRs，所述重链可变区域具有本发明表中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述核酸能够一种核苷酸序列，其编码来自轻链可变区域的至少一种、两种、或三种CDRs，所述轻链可变区域具有本发明表中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述核酸可包括一种核苷酸序列，其编码来自重链和轻链可变区域的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDRs，所述重链和轻链可变区域具有本发明表中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。
在某些实施方案中，所述核酸可以包括一种核苷酸序列，其编码来自重链可变区域的至少一种、两种或三种CDRs，所述重链可变区域具有本发明表5中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述核酸能够一种核苷酸序列，其编码来自轻链可变区域的至少一种、两种、或三种CDRs，所述轻链可变区域具有本发明表5中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述核酸可包括一种核苷酸序列，其编码来自重链和轻链可变区域的至少一种、两种、三种、四种、五种或六种CDRs，所述重链和轻链可变区域具有本发明表5中所列的氨基酸序列或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。
在某些实施方案中，所述核酸包括本发明表5中所列的核苷酸或者基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。在一些实施方案中，所述核酸包括本发明表5中所列的部分核苷酸或者基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或具有一种或多种取代，比方说保守取代)。所述部分可编码，例如，一种可变区域(例如，VH或VL)；一种、两种、或三种或多种CDRs；或者一种、两种、三种或四种或多种框架区域。
本发明所公开的核酸包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。所述多核苷酸可以是单链的或双链的，并且如果是单链则可能是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可以通过非核苷酸成分进行中断。聚合后，可以对多核苷酸作进一步修饰，如通过连接标记组分。所述核苷酸可以是一种重组多核苷酸、或者基因组，cDNA，半合成或合成来源的多核苷酸，它们或不天然存在，或以非自然排列方式与其它多核苷酸连接。
在一些方面，本发明的特征在于含有本发明在此所述的核苷酸的宿主细胞和载体。所述核苷酸可存在于单个载体或者分离的载体中，所述载体存在于相同的宿主细胞或者分离的宿主细胞中，如下面将详细描述的。
载体
本发明进一步提供了载体，其包括编码本发明所描述的抗体分子的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述载体包括编码本发明所描述的抗体分子的核苷酸。在一些实施方案中，所述载体包括本发明所描述的核苷酸序列。所述载体包括，但不限于，病毒、质粒、黏质体、λ噬菌体、或者酵母菌人工染色体(YAC)。
可采用多种载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，其衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录酶病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或者SV40病毒。另一类载体利用RNA元件，其衍生自RNA病毒例如Semliki森林病毒，东方马脑炎病毒和黄病毒。
此外，有DNA整合入其染色体的细胞可以通过引入一个或多个标记来进行选择，所述标记使得可选择转染的宿主细胞。所述标记可为营养缺陷的宿主提供例如质子转移，抗微生物剂抗性，(例如，抗生素)，或者对重金属如铜的抗性等等。可选择的标记基因可以直接连接至被表达的DNA，或者通过共转化引入到同一细胞中。优化mRNA的合成还可能需要其他的附加元件。这些元件可以包括剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦制备了用于表达的含有构型的表达载体或DNA序列，便可以将表达载体转染/引入至合适的宿主细胞中。多种技术可被用于得到这种，例如，原生质体融合，磷酸钙沉淀，电穿孔，逆转录病毒转导，病毒转染，基因枪，基于脂质的转染或其它常规技术。在原生质体融合的情况下，所述细胞在介质中生长，并针对适当活性进行筛选。
依据本申请说明书，用于培养所得的转染细胞以及用于恢复所生产的抗体分子的方法和条件对于本领域技术人员来说是公知的，并且可以根据特异性表达载体和应用的哺乳类宿主细胞进行改变或优化。
细胞
本发明还提供了含有核酸的宿主细胞，所述核酸编码本发明所述的抗体分子。例如，所述宿主细胞可包括表5中的核酸，基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列，和/或能够在本发明所描述的严格条件下杂交的能力)，或者所述核酸其中之一的一部分。此外，所述宿主细胞可包括编码表2或表3的氨基酸序列的核酸，或基本上与其同源的序列(例如，与其具有至少大约85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列)，或者所述核酸其中之一的一部分。
在一些实施方案中，所述宿主细胞进行基因工程化从而包括编码抗体分子的核酸。
在某些实施方案中，所述宿主细胞通过使用一种表达盒进行基因工程化。术语“表达盒”指的是核苷酸序列，其能印象基因在于这种序列相容的宿主中的表达。所述盒可以包括启动子、具有内含子或不具有内含子的开放式阅读框、以及终止信号。还可以使用影响表达必须的或优异的额外因素，例如，诱导型启动子。
本发明还提供了包括在这里所描述的载体的宿主细胞。
所述细胞可以是，但不限于，真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括，但不限于，Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞、以及MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括，但不限于，Sf9细胞。
抗-登革抗体分子的应用
本发明所公开的抗体分子具有在体外和在体内进行诊断、治疗和预防的用途。在一些实施方案中，所述抗体分子中和中和登革病毒。例如，所述分子可以被施用于培养中的细胞，在体外和在体内，或者施用于受试者，例如人受试者，例如在体内，用于中和登革病毒。因此，在一些方面，本发明提供了一种治疗受试者中登革病毒感染的方法，包括向受试者施用本发明所述的抗体分子，因而登革病毒感染被治疗。例如，这些抗体分子可以被施用于培养中的细胞，在体外和在体内，或者施用于受试者，例如在体内，从而治疗、预防、和/或诊断登革病毒感染。
正如在这里所使用的，术语“受试者”意欲包括人和非人动物。在一些实施方案中，所述受试者施人受试者，例如感染有登革病毒的人患者或者具有感染登革病毒风险的人患者。术语“非人动物”包括哺乳动物或非哺乳动物，例如非人灵长类动物。在一些实施方案中，所述受试者是人。本发明所述的方法和组合物施用于治疗感染有登革病毒的人患者。感染登革病毒的患者包括哪些已经暴露于病毒但是(至少暂时地)无症状的患者、患有登革热的患者、患有登革出血热的患者、以及患有登革热休克综合征的患者。
治疗登革病毒的方法
登革病毒显示了在病毒表面上的E(包膜)蛋白质。所述E蛋白有助于病毒附着至宿主细胞。所述E大白包括DI区域(九链的β桶)，以及DIII区域(胞外区域)。虽然不希望受理论的束缚，但是在一些实施方案中，本发明所述的抗体分子可铜鼓欧结合至其E蛋白DIII(EDIII)区域来综合登革病毒，例如，通过预防病毒与宿主细胞融合、预防病毒连接至宿主细胞、扰乱E蛋白的结构、或者去稳定所述病毒。
登革热是一种传染病，通常为蚊传播的，由登革病毒引起。初次感染之后通常是短暂的无症状期，通常为4-7天。有时感染的患者并不会出现任何登革热症状。但是，在表现出登革热的患者中，典型的症状是突发性发热(有时超过40℃)、头痛、肌肉和关节痛、皮疹。在所述感染的发热阶段，表现出发烧、疼痛和头痛。在一些患者中，所述发热阶段之后是关键阶段(与登革休克综合征和登革出血热有关)，其中患者可能经历在胸腔和腹腔中积液，通过循环的流体的枯竭，供应不足的血液至重要器官、以及出血。这之后为恢复阶段。在一些实施方案中，本发明所述的抗体分子被施用于在无症状期、发热阶段、关键阶段和/或恢复阶段的患者。
登革病毒一般是依据体格检查和患者报告的症状进行诊断。一种可能的诊断能够在患者表现出发烧以及选自恶心/呕吐、皮疹、广义疼痛、减少的白血细胞的水平或正止血带试验中的至少两种症状下进行。表明登革热的其他试验包括用于降低白血细胞数量的试验、低的血小板水平的试验、代谢性酸中毒试验、来自肝的转氨酶升高的水平试验、血液浓缩试验、血白蛋白减少试验、通过超声波检测流体试验(表明登革休克综合征)、低于20毫米汞柱的脉压试验(表明登革休克综合征)、延迟的毛细血管再充盈(表明周围血管崩溃)。因此，在一些实施方案中，抗体分子被施用于满足上述条件的患者。
本发明所描述的某些抗体分子能够治疗至少两种、三种或四种登革病毒血清型。因此，在某些实施方案中，所述抗体分子被施用于感染有登革病毒或者具有感染登革病毒风险的患者，当没有测试被执行用于确定登革病毒的血清型，例如登革病毒的血清型可能是未知的。在一些实施方案中，所述登革病毒是血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4。
所述抗体分子一般是以保持患者系统中抗体的治疗有效量水平的频率进行施用，直至患者恢复。例如，所述抗体分子可以一种频率进行施用，所述频率获得一种可满足至少大约1、2、5、10、20、30或40个抗体与每个病毒粒子结合的血清浓度。在一些实施方案中，所述抗体分子每1，2，3，4，5，6或7天进行施用。
施用多种抗体分子的方法是本领域已知的并且在下文中进行了描述。所使用的合适剂量的抗体分子将依据受试者的年龄和体重以及所使用的具体药物。
所述抗体分子可就独自进行使用，或者耦合至第二制剂进行使用例如抗-病毒制剂、毒素、或蛋白质。例如一种第二抗登革抗体。这种方法包括：单独施用抗体分子或与第二制剂耦合的抗体分子至需要所述治疗的受试者。所述抗体分子可以被用于递送多种治疗剂，例如毒素或抗-病毒制剂或者它们的混合物。
联合疗法
所述抗-登革抗体分子可与其他的治疗剂联合使用。例如，所述联合治疗剂可以包括抗-登革抗体分子与一种或多种另外的治疗剂，例如抗-病毒制剂(包括其他的抗-登革抗体)、疫苗(包括登革病毒疫苗)、或增强免疫应答的制剂共同配置和/或共同施用。在另一个实施方案中，所述抗体分子与其他治疗方案联合施用，例如静脉内水合、退烧制剂(例如对乙酰氨基酚)，或输血法。所述联合疗法可有利地施用更低剂量的所施用治疗制剂，因而避免可能的毒性或与多种单个治疗相关的并发症。
在此所用的“联合”施用指的是，在将两种(或多种)不同治疗递送至受试者之前，或者指受试者在经受病症折磨期间。在一个实施方案中，两种或多种治疗进行预防地递送，例如，在所述受试者感染或诊断为登革病毒之前。在另一个实施方案中，所述两种或多种治疗可在受试者被诊断具有登革病毒滞后进行递送。在一些实施方案中，在一种治疗的递送仍在进行时开始给与第二种递送，所以存在重叠。有时这可参照本发明所述的“同时给予”或“并行(concurrent)给予”。在另一个实施方案中，一种治疗的递送在其他治疗递送开始之前结束。在任一情况的实施方案中，由于联合施用因而所述治疗更为有效。例如，第二治疗更为有效，例如，较少量的第二种治疗仍可见到相同效果、或者如与在第一治疗缺少是施用第二治疗相比，第二治疗可更大程度降低症状、或者第一治疗可见到类似的情况。在一些实施方案中，递送可使所述症状降低，或者其他与病症相关的参数比递送一种治疗而其他治疗缺少时所见更大。所述两种治疗的效果可以部分地累加、全部地累加或者超过累加。这样递送可时递送第一治疗的效果在递送第二治疗时仍可检测到。
所述抗-病毒制剂可以是，例如巴拉匹韦(balapiravir)、氯喹、西戈斯韦(celgosivir)、伊佛霉素、或者Carica folia。
所述疫苗可以是，例如，活的、衰减的、重组的登革血清型1、2、3和4病毒(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT01488890)；CYD四阶登革热疫苗(例如，通过SanofiPasteur的临床试验NCT00730288)，嵌合的登革血清型(1、2、3、4)(例如，通过Sanofi的临床试验NCT00730288)，CYD登革热疫苗(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT00993447)，四价活衰减的登革热疫苗(例如通过GlaxoSmithKline的临床试验NCT00322049)，四价登革热疫苗(TVDV)(例如，根据美国陆军医学研究司令部资助的临床试验NCT01502358)，嵌合的四价登革热(血清型1、2、3、4)(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT00842530)，登革热冻干疫苗(例如，通过Butantan Institute的临床试验NCT01696422)，ChimeriVaxTM四价登革热疫苗(通过Sanofi的临床试验NCT00617344)，二价CYD-1，3登革热(Vero)(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT00740155)，二价CYD-2，4登革热(Vero)(例如，通过SanofiPasteur的临床试验NCT00740155)，四价混合的VDV-2/CYD-1，3，4登革热(Vero)(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT00740155)，四价CYD-1，2，3，4登革热(Vero)(例如，通过Sanofi Pasteur的临床试验NCT00740155)，rDEN1delta30或者rDEN2/4delta30(ME)(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00458120)，修饰的活四价嵌合登革热疫苗(SC或ID)(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT01110551)，登革热病毒(例如，根据美国陆军医疗装备发展机构的临床试验NCT00384670)，用于登革热病毒子类型2的临床研究性疫苗(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT01073306)，F17(例如，根据美国陆军医学研究司令部资助的临床试验NCT01843621)，转然后的F17或者转染后的F19(例如，根据美国陆军医学研究司令部资助的临床试验NCT00468858)，DENVax(例如，根据Inviragen Inc.的临床试验NCT01511250)，D1ME(登革热-1前膜蛋白/鞘膜DNA疫苗)(例如，根据U.S.Army Office of the Surgeon General的临床试验NCT00290147)，用于DEN1的临床研究性疫苗(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT01084291)，活衰减的四价登革热疫苗(例如，根据沃尔特·里德陆军研究所的临床试验NCT00350337)，rDEN4delta30-200，201(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00270699)，TetraVax-DV-TV003或者rDEN2Δ30-7169(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT02021968)，TetraVax-DV任选混合(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT01436422)，DEN4候选疫苗(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00919178)，rDEN4delta30-4995(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00322946)，rDEN3delta30/31-7164(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00831012)，TDENV-PIV(例如，根据美国陆军医学研究司令部资助的临床试验NCT01502735)，rDEN3-3'D4delta30(例如，通过国家急性和传染性疾病研究院的临床试验NCT00712803)，V180(例如，通过Merck Sharp&Dohme C或者p.的临床试验NCT01477580)，或者DEN1-80E(例如，通过Hawaii Biotech，Inc.的临床试验NCT00936429)。
其他的治疗可以是，例如，高渗乳酸钠、活化的重组人因子VII、或抗-d(例如，根据医学教育和研究的研究生院的临床试验NCT01443247)。
在某些实施方案中，其他的抗-病毒制剂是一种第二抗-登革抗体分子，例如，与第一抗-登革抗体分子不同的抗-登革抗体分子。示例的能够联合施用的抗-登革抗体分子包括，但不限于，表1中所列的抗体的任意组合(例如，两种或两种以上的D88，F38，A48，C88，F108，B48，A68，A100，C58，C78，C68，D98，A11(也称为单克隆抗体4E5A(Tharakaraman etal.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64))或者B11的任意组合)；单克隆抗体4E11(Thullier et al.，J Biotechnol.1999；69(2-3):183-90)；人抗体14c10(HM14c10)(Teoh et al.Sci Transl Med.2012Jun 20；4(139):139ra83)；人单克隆抗体1F4，2D22以及5J7(de Alwis et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2012；109(19):7439-44)；人单克隆抗体DV1.1，DV1.6，DV3.7，DV4.4，DV5.1，DV6.1，DV7.5，DV8.1，DV10.16，DV13.4，DV13.8，DV14.5，DV14.5，DV15.7，DV16.5，DV16.8，DV17.6，DV18.21，DV18.4，DV19.3，DV20.1，DV21.1，DV21.5，DV22.3，DV22.3LALA，DV23.13，DV25.5，DV27.2，DV28.1，DV28.8，DV34.4，DV35.3，DV38.1，DV51.6，DV52.1，DV53.4，DV54.7，DV55.1，DV56.12，DV54.7，DV57.4，DV59.3，DV60.3，DV61.2，DV62.5，DV63.1，DV64.3，DV65.5，DV66.1，DV67.9，DV68.2，DV69.6，DV70.1，DV71.1，DV74.4，DV75.9，DV76.5，DV77.5，DV78.6，DV79.3，DV82.11，DV82.11LALA，DV86.2，DV87.1，DV87.1LALA，DV90.3，DV257.13，DV291.7，DV415.8和DV470.12(Beltramello et al.，Cell Host Microbe.2010；8(3):271-83)；人单克隆抗体3-147，58/5，2F5，2G4，5F9，和135.3(Dejnirattisai et al.，Science.2010；328(5979):745-8)；mAb 2H12(Midgley et al.J Immunol.2012；188(10):4971-9)；人源化的单克隆抗体1A5(Goncalvez et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2007；104(22):9422-7)；以及人单克隆抗体1C19(Smith et al.，MBio.2013；4(6):e00873-13)；或者在下述文献中公开的任意抗体：Lai，C.和Purcell，R的WO 05/056600(例如，抗体1A5和5H2)；Lanzavecchia，A.等人的WO2010/043977；Dimitrov等人的WO2013/173348；Macary等人的US2013/0259871；Fink等人的WO 2013/089647；Setthapramote等人的WO 2013/035345；Han-Chung Wu等人的US 8,637,035；或者Sasisekharan，R等人的WO 2014/025546；或者任意上述抗体的衍生物(例如，其人或人源化的形式)。
可以与本发明所述的抗-登革抗体联合使用的其他的治疗制剂包括，但不限于，例如，α-葡糖苷酶I抑制剂(例如，在Rath或者e et al.，Antiviral Res.2011；92(3):453-60中描述的西戈斯韦)；腺苷核苷抑制剂(例如，在Yin et al.，Proc Natl Acad Sci U SA.2009；106(48):20435-9中描述的NITD008)；NS3和/或其辅因子NS2B抑制剂(例如，阻断结合NS3中口袋的NS2B的化合物，例如[5-氨基-1-(苯基)磺酰基-吡唑-3-基]化合物，如在Lescar et al.，Antiviral Res.2008；80(2):94-101中所描述的)；RNA-依赖的RNA聚合酶(RdRp)抑制剂(例如，在Noble et al.，J Virol.2013；87(9):5291-5中描述的NITD107)；宿主嘧啶生物合成抑制剂，例如，宿主二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)(例如，在Wang et al.，JVirol.2011；85(13):6548-56中描述的NITD-982和布喹那(brequinar))抑制剂；病毒性的NS4B蛋白质抑制剂(例如，在Xie et al.，J Virol.2011；85(21):11183-95中描述的NITD-618)；以及亚氨基糖类(例如，在Perry et al.，Antiviral Res.2013；98(1):35-43中描述的UV-4)。
诊断方法
在一些方面，本发明提供了一种用于检测体外或体内(例如，在受试者中想象的体内)登革病毒E蛋白存在的诊断方法(例如，在生物样本中，例如血液样本)。所述方法包括：(i)将样本与本繁忙所述的抗体分子接触，或者将抗体分子施用于受试者；(任选地)(ii)将参考样本，例如对照样本(例如，对照生物样本，例如等离子体或血液)或对照受试者与本繁忙所述的抗体分子接触；以及(iii)检测在抗体分子和样本或受试者，或者对照样本或受试者之间的复合体的形成，其中，相对于对照样本或受试者，在样本或受试者中的复合体的形成中的一种变化，例如，统计学上显著的变化，表明在样本中登革病毒的存在。所述抗体分子能够直接或间接地用可检测的物质进行标记，从而促进结合或未结合抗体的检测。合适的可检测的物质包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料，如上文和下面比较详细的内容所描述的那样。
术语“样本”，其指的是用于检测多肽所使用的样本，包括，单不限于，细胞、细胞裂解物、蛋白质或者细胞膜提取物、体液例如血液、或组织样品。
在抗体分子和登革热病毒蛋白质之间的复合物构型可以通过检测或观察结合到登革病毒蛋白的抗体分子或者未结合的抗体分子进行检测。可以使用任何合适的检测试验，并且常见的检测试验包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学法。除标记抗体分子之外，能够在样本中对登革病毒蛋白质的存在进行分析，通过用可检测的物质标记的标准与未标记的抗体分子的竞争性免疫分析。在这种分析方法中，生物样本，标记的标准以及抗体分子可进行结合，并且确定结合到未标记的结合分子上的标记标准的量。在样本中的登革病毒蛋白质的量与结合到抗体分子的标记标准的量成反比。
实施例
实施例1：抗-登革抗体的结构指导的设计
表位和模板鉴定
在登革病毒E蛋白质二聚体内存在多种中和表位。这些表位包括例如在EDI、EDII、EDIII、融合环、EDI/II铰链以及EDIII“A”β-链中的区域。EDI和EDII在人体重视免疫显性的，并且能够诱导微弱中和但高度交叉反应性的抗体。EDIII能够诱导有效中和抗体。针对融合环的抗体，位于EDII中，通常表现出交叉血清型反应性，但中和活性不强。针对EDI/II铰链区域的抗体能够表现出有效中和性，但是由于表位区域的低保守性因而通常是血清型特异性的。针对EDIII A-链的抗体通常部分由于所述区域到抗体的较高的可达性，但是通常具有限制的交叉血清型反应性。
为了程式化一种广泛活性的并且针对登革病毒具有高度有效的中和抗体，小鼠mAb 4E11可作为模板抗体，因为其会连接到EDIII A-链表位区域，并且表现出针对DENV-1，DENV-2和DENV-3的强效中和作用，同时对DENV-4不表现出强效中和作用。4E11对于DENV-4具有非常低的(μM)结合性。一种方法被用于增加的4E11与DENV-4的分子接触，用来增加针对DENV-4DE亲和力以及中和效力。要做到这一点。产生了，生成的具有EDIII的4E11结构模型，然后进行分析以确定4E11的血清型特异性结合决定因素。
技术和工具发展
用于蛋白质工程的传计算方法通常依赖于能量基础方法。由这些方法所得到的结果通常对于在一种结构或模型中精确的原子位置高度敏感，因此这些方法通常要求所述蛋白质-蛋白质复合物的高分辨率和特性的晶体结构或相似的数据，用于准确建模和优异突变预测。此外，用于蛋白质工程的传统能量基础方法通常不会包含抗体特异性特性和知识。
不同的方法是使用经验信息学，并且具体为残基配对倾向法(Tharakaraman K.etal.(2013)Proc Natl Acad Sci U S A.23；110(17):E1555-64)。针对登革病毒的广泛交叉反应抗体工程是通过评估针对给定表位环境的抗体决定簇残基的配对倾向(“适当性”)进行的，所述登革病毒具有光谱活性和增加的体内效能。何种适合度矩阵基于抗体-抗原结构经验数据，并且与其他的方法相比对于精确原子位置较不敏感。因此，这种方法可以有效用于增强抗体-抗原计算分子对接的准确度，并且用于增加清河性-增强突变的预测以及对于亲和性成熟的位置的识别。
应用：针对结合所有四种DENV血清型的pM-nM的工程模型
制备4E11-EDIII结构模型，并且对亲和性-增强的突变/位置进行预测。例如，在特异性位点上对个体突变进行预测，并且对位置进行选择用于合理的、关键组合文库的创立。正如在附图23中所示，所产生的人源化抗体D88证明了，相对于抗体4E11，在对DENV1-3改善亲和力的同事对DENV1-3的10,000倍的亲和性增益。
4E11mAb A11与mAb 4E11的比较
在Tharakaraman et al.，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中提供了对于抗-登革抗体4E11(所述抗体在Thullier et al.，J Biotechnol.1999Apr15；69(2-3):183-90进行了描述)和A11(4E5A)二者之间的对比。与4E11相比，4E5A具有五个点突变，在A55E(VH)、R31K(VL)、N57E(VL)、E59Q(VL)和S60W(VL)(Tharakaraman et al.，2013，Proc Natll Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64)上。
实施例2：De126提高DV-4中和活性
B11是一种抗-登革抗体，其与A11(4E5A)相比具有在框架1(FR1)中S26的重链缺失。4G2是一种对照抗-登革抗体。针对来自四种登革病毒血清型的EDIII的每一种抗体的中和活性是通过聚焦还原中和试验(FRNT)进行测试的。
当登革病毒感染宿主是非洲绿猴肾(Vero)细胞，所述聚焦还原中和试验检测所形成的病灶。简单地说，抗体的稀释物与等体积的稀释的病毒进行混合，并且将混合物转移至非洲绿猴肾(Vero)细胞单层，并且检测病灶。数据表示为相对传染性。FRNT50代表达到50％病毒中和作用所需要的抗体浓度。关于聚焦还原中和试验更为详细的协议可以在Tharakaraman et al.，2013，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中找到。
附图2的四个图组显示每种抗体针对登革病毒血清型的典型菌株的中和活性。附图3是每种抗体针对登革病毒血清型DV-4的重复试验。所述结果概括在附图2底部的表中，其中显示了每种抗体针对病毒(以
Figure GDA0002940984110000671
)的IC50。
出乎意料的，在框架1区域中的一种氨基酸的缺失赋予在B11上的增加的DV-4中和活性。更为具体的，与具有
Figure GDA0002940984110000672
的IC50的A11相比，抗体B11改善了DV-4的中和作用，得到
Figure GDA0002940984110000673
的IC50。这些结果表明B11获得比A11低大约8到大约12倍的IC50。根据B11优异的中和活性，形成了B11的人源化变体。
实施例3：人源化的抗-登革抗体
附图4描述了一些与A11和B11的相关的人源化抗体。对多种人源化框架进行测试。最右边的四列显示了针对登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-4和DV-4的EDIII，每一种抗体的亲和性。在重链FW3(将抗体B48+A98V与抗体B48相比)中的A98V突变改善将结合DV-4增加了大约5倍，但是维持或改善与其他血清型的结合。
实施例4：人源化的抗-登革抗体的回复突变
为了增强对于EDIII的抗体亲和性，特别是在DV-4中，需要对选定的人源化抗体的重链N-端进行多种回复突变。附图5显示出，D48，其是一种完整的N-端小鼠回复突变，相对于具有完整人源化N-端的抗体具有在亲和性方面大约两倍的提升。另外，回复突变导致针对EDIII-DV-4的类似的、略低的、或者略高的亲和性。
在附图5的上表和下表中的最右一列显示了对于DV-4的人源化抗体亲和力是在7.494和26.89nM之间。这种结合活性的保留表明存在一种相当数量的用于N-末端区域突变的公差，例如在重链的位置1-6中。
实施例5：通过亲和力增强的突变在抗体亲和力方面的改进
为了进一步改善人源化抗体针对DV-4的亲和力，可对多种亲和力增强突变单独或者组合测试。在附图6中，对下述突变进行测试：T33V，del26，G27A，G27Y，F28W，F28G，F28A和F28Y，全部在VH中。与单独的T33V突变(在抗体C88中)相比，Del26和T33V一起(在抗体D88中)被发现可将对于EDIII-DV-4的亲和力提升大约4倍。在抗体D88中发现的双del26和T33V突变还使亲和力提升至超过具有单独的del26突变的抗体。在结合方面的这种附加的或协同的改进是不期望的。
根据附图6可以发现，显然数个突变可以在不降低亲和力或者仅在亲和力上适度减少下进行组合(例如，在抗体D118中的F28W和T33V，在抗体D98中的G27A和T33V，在抗体D148中的G27Y和T33V，在抗体108中的G27Y和F28W和T33V，以及在抗体D128中的G27A和F28W和T33V)。该实验表明，所述抗体对在位置27和28上的取代具有一些抗性。
然后，测试在VH中位置98上的突变与其他突变的组合。原始人源化序列在位置98上具有A。附图7显示，相对于98S或98A，对于T33V突变而言，98V将DV-4的结合性提升了大约两倍(参见表的上面三行)。所述表的下面三行显示，对于双突变del26+T33V而言，对于位置98的突变并不具有很大的影响。因此，所述抗体分子对残基98的突变具有一些抗性。
实施例6：在人源化抗-登革抗体方面的其他结合性研究
检测人源化抗-登革抗体结合来自登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-3和DV-4的EDIII的能力。附图8显示的是通过竞争ELISA分析确定的抗体亲和力，以及附图9显示的是通过SPR确定的抗体亲和力。当所有的人源化抗体具有强亲和力(例如，全部低于或等于24.35nM，并且多个出于位于亚纳摩尔(sub-nanomolar)范围内)时，一些抗体具有特别强的结合性。例如，C88和D88以超过C98大约20倍高的亲和力结合至DV-1。附图9中的对于DV-2和DV-3全部三种抗体具有大约相同的亲和力。在附图9中的抗体，对于DV-4，D88具有最强的亲和力。
不仅在血清型之间存在登革病毒的遗传和抗原多样性，还在血清型中存在这样的登革病毒的遗传和抗原多样性。为了更为彻底地研究抗-登革病毒抗体的结合宽度，进行一系列的分析从而鉴定菌株序列组，所述一组菌株序列组进一步捕获登革病毒序列多样性，尤其在EDIII中。首先，将登革病毒的>3,500E蛋白质序列从NCBI GenBank中分离，用于分析在EDIII中的氨基酸多样性。通过这种分析，确定21菌株EDIII序列组，并且对其进行选择用于更为完全地表达登革病毒多样性。更为具体的，那些序列表达所有基因型，所述基因型具有来自主要流行地区(临床相关菌株)的最近的循环和最近的分离株的证据。在任何可能的时候选择挑战性的分离株，例如，那些具有在表位区域附近或之内的多样性位置。此外，包括原型菌株。在附图10A中总结了所述选定的21种登革病毒分离株组的EDIII氨基酸序列的亲缘关系。在附图10B中显示了抗体D88结合二十一种不同的登革菌株的EDIII蛋白质组的结果。正如在附图10B中所示的，抗体D88表现出结合登革病毒的全部范围。
实施例7：人源化的抗-登革抗体与来自多个血清型DV-2，DV-3和DV-4菌株的EDIII 的结合
对D88(附图11，最右列)和C88(从右数第二列)检测其与从登革病毒多种菌株中分离的EDIII结合的能力。在最左边的两列中表明了所述菌株的血清型和地理位置。一般而言，所述抗体表现出一种好的结合性宽度，表明他们可能对广泛的登革病毒菌株有效。
实施例8：人源化抗-登革抗体在一种聚焦还原中和试验中中和登革病毒
人源化抗体具有在聚焦还原中和试验中中和DV-1，DV-2，DV-3和DV-4的能力。在上文的实施例2中对所述分析进行了描述。附图12、13和14显示了这些使用代表性的DV-3和DV-4菌株的实验结果。在这些分析中人源化抗体在中和登革病毒方面是有效的。例如，与小鼠抗-登革抗体A11相比，A48、C98和D88取得了针对DV-1较低的EC50(附图12)。附图13显示的是，抗体D88、D188和D128具有针对这种DV-3菌株的在426-506ng/ml范围内的EC50。此外，与小鼠抗-登革抗体A11相比，D88、D188和D128具有针对DV-4较低的EC50(附图14)。人源化抗体还具备中和DV-1和DV-2的能力(数据并未显示)。令人意想不到的是，人源化抗体将得到比小鼠抗-登革抗体较高的活性。至少部分地基于在这里所示的结合数据以及已知登革分离物的序列分析，如在本发明中所描述的人源化抗-登革抗体分子可能具有广泛的中和能力，包括在这里所列的典型的登革病毒多样性的那些菌株的所有血清型和基因型。
实施例9：人源化抗体的热稳定性是通过热偏移分析测试
通过使用试剂Sypro或者ange的热偏移分析对选定的人源化抗体的稳定性进行分析。试验结果记录在附图15A、15B和15C中。通常，人源化抗体显示优异的稳定性，常常具备大约64到68之间的Tm。
实施例10：用于登革病毒的小鼠模型
在本发明中所描述的抗体分子可以在动物模型中进行功效检测。在Tharakaramanet al.，2013，Proc Natl Acad Sci U S A.2013；110(17):E1555-64中描述来了上述的一种模型，AG129小鼠模型。所述同时缺少I型干扰素受体和II型干扰素受体的AG129小鼠模型，是一种常用的动物模型，其可复制在登革热临床病例中观察到的一些疾病临床表现，包括病毒血症和其他病症。感染AG129的小鼠可能经历与在脑中DENV复制相关的神经功能损伤，其仅仅会在感染有病毒的人患者中被罕见地观察到。这往往导致在病毒攻击大约18天后感染AG129的小鼠死亡((Stein，D.A.，et al.，J Antimicrob Chemother，2008.62(3):p.555-65.；Johnson AJ，Roehrig JT.J Virol.1999Jan；73(1):783-6)。尽管缺少与人感染的相似性，但是这种模式在抗病毒治疗的评估中是有用的，并且能够在原理研究的证据中使用。简单地说，所述AG129(其缺少IFN-α/β和IFN-γ受体)小鼠受到登革病毒的攻击，并且施用一种候选治疗抗体分子。典型地，病毒血(在血液样本中的病毒滴度)是实验的终点。病毒血能够用例如定量RT-PCR进行测量。在这种研究中，病毒血症、体重变化以及残存物在用DENV-2的New Guinea C(NGC)株感染之后被作为疾病信号。在这个实施例中显示的结果证明了在DENV-2小鼠模型中抗体D88的强体内抑制活性。
将动物根据笼子区组随机分配到组中，每一个中包含10个。在病毒攻击前一天，用抗体D88、不相关的同种型匹配对照mAb(CmAb)或者安慰剂对动物进行处理。将其中并没有被病毒攻击的一组小鼠用D88进行处理，并且将其作为毒性对照。还将一组小鼠作为正常对照，并且并不对其进行处理或者并不用病毒对其进行攻击，用于监测处理和控制技术对免疫功能低下的AG129小鼠的效果。在最小必须培养基中制备病毒的10-1稀释液((106.8CCID50(细胞培养感染剂量50％)/ml)。将0.4ml的稀释病毒(106.4CCID50/动物)腹腔内(i.p.)注射到小鼠。每天对死亡率进行观测共31天。在第0天对小鼠进行称重，并且在1dpi(感染后天数)开始每隔一天对小鼠进行称重。在3dpi时从所有的动物中收集血清用于通过qRT-PCR量化病毒血。
附图16显示的是，在感染登革病毒之后，施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠生存率。如在附图16中所示，大约90％的用25mg/kg的D88处理的小鼠以及大约60％的用25mg/kg的D88处理的小鼠存活至第31天，而用CmAb或PBS处理的对照小鼠全部在第17天或第17天之前死亡。
附图17显示的是，在感染登革病毒之后，施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠的平均体重变化。还对用D88(25mg/kg)或者PBS处理但是没有感染登革病毒(模拟)的小鼠进行测试。如在附图17中所示，施用抗体D88的小鼠甚至在感染后31天都没有显著的体重变化，而施用CmAb或PBS的小鼠在第15天时有显著的体重减轻。作为对照，用D88或PBS处理但是没有感染登革病毒的小鼠则不会表现出表观重量变化。
附图18显示的是，在登革病毒感染之后，在施用D88(25mg/kg)、D88(5mg/kg)、CmAb或PBS的小鼠中的病毒血滴度。结果以外推PFU每毫升以及基因拷贝数等同物(GCE)/ml进行表达。P值<0.001的显著性用符号***进行表示。如在附图18中所示，与用25mg/kg的D88或5mg/kg的D88的小鼠相比，施用CmAb(同种型对照)或PBS的小鼠具有较高的病毒血滴度。
这些结果表明，单一全身施用的抗体D88导致循环病毒滴度迅速减少。抗体D88分别为在25mg/kg和5mg/kg下的9/10以及6/10的动物提供强有效的保护，继续存在DENV-2致死攻击。抗体D88表明，感染3天之后在病毒滴度方面的显著并剂量依赖的降低，病毒血峰天数。
实施例11.体内针对ADE的保护
本发明所述的抗体分子可在动物模型中针对功效进行测试。在Balsitis et al.，2010(Lethal antibody enhancement of dengue disease in mice is prevented by Fcmodification，PLoS Pathogens，2010Feb 12；6(2):e1000790)中描述了一种这样的模型，即在AG129小鼠中抗体增强的重症登革病毒感染。简单的说，在用登革病毒(例如D2S10)攻击前1天，将登革病毒增强的抗体(例如，DV1抗血清或者4G2单克隆抗体)施用于AG129小鼠。在攻击前(预防)1天或者攻击后(治疗)1或2天施用候选的抗体分子。代表性地，死亡率是实验的重点；血清中的病毒血和炎症性细胞因子(例如TNF-α)水平也可以作为端点。
实施例12.在昆虫和哺乳动物细胞中繁殖的登革病毒血清型的中和。
在上文的实施例2中描述了通过聚焦还原中和试验(FRNT)检测了针对四种登革病毒血清型的人源化抗体的中和活性。在昆虫细胞或者哺乳动物细胞中繁殖四种登革病毒血清型(DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4)，并且将其用于感染宿主Vero(猴子)细胞。附图16-18显示了这些具有典型DENV-1-4菌株实验对的结果。数据代表了相对感染性。例如，所述EC50或者FRNT50值代表完成50％的病毒中和所需要的抗体浓度。正如在附图16-18中所示，所述检测的抗体在中和昆虫和哺乳动物细胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株方面是有效的。
附图19显示了抗体D88中和在C6/36昆虫细胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株。所述结果总结在附图19的底部的表中，其中显示了针对典型的DENV-1，DENV-2，DENV-3and DENV-4菌株(ng/ml)的EC50值。对DENV-1菌株Hawaii/1944、DENV-2菌株NewGuinea/1944(NGC)、DENV-3菌株Philippines/1956(H87)、和DENV-4菌株Mexico/1997(BC287/97)进行检测。
附图20显示了抗体D88中和Vero细胞中繁殖的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4菌株。所述结果显示为针对典型的DENV-1，DENV-2，DENV-3and DENV-4菌株(ng/ml)的FRNT50值。对DENV-1菌株Hawaii/1944、DENV-2菌株New Guinea/1944(NGC)、DENV-3菌株Philippines/1956(H87)和DENV-4菌株Mexico/1997(BC287/97)进行检测。
附图21显示了抗体D88和A11中和Vero细胞中繁殖的DENV-4菌株H241。所述结果总结在附图21的底部的表中，其中显示了针对DENV-4菌株H241的抗体EC50值。
这些结果表明抗体D88有效地中和了全部四种DENV血清型，EC50值<1μg/ml。抗体D88有效地中和了所述攻击的DENV-4菌株H241，其以100nM亲和力结合。
实施例13.针对登革病毒的蚊虫模型用于评估抗体的抑制活性。
本发明所述的抗体分子是在蚊虫模型中对其功效进行测试。登革病毒是一种蚊虫传播的RNA病毒。某些登革病毒能够体内显示合适的优势，其可能导致较高的人-到-蚊虫传播可能性(Vu et al.，PLoS Negl Trop Dis.2010；4(7):e757)。为了构建蚊虫模型从而评估抗体针对登革病毒的抑制活性，将含有病毒的血液与在多种稀释度下的抗体混合，并且在37℃下温育30分钟。将抗体-掺加的血液添加到蚊虫喂食器中，并且喂养所述蚊虫大约1个小时。对蚊虫进行冷麻醉，并且选择充血的那些。在血液喂养7天后收集所述蚊虫的腹部。病毒载量可通过qRT-PCR进行测量。蚊虫腹部感染的比例科能够计算为感染腹部的数量除以PCR检测的腹部的总数。
实施例14.抗-登革抗体的HP-SEC评价
使用高效尺寸排阻色谱(HP-SEC)分析用于评估在非变性、非压力条件下的抗-登革抗体聚合倾向。这种方法考虑到抗体二聚物和来自单体的聚合物的区别。二聚物和聚合物可致使免疫原性增加的风险。
在这种研究中，抗体被纯化至1mg/ml，并且通过一种尺寸排阻柱，例如PhenomenexBioSep s3000，使用PBS作为流动相，流速为1ml/min。
附图22显示了抗体D88的典型的色谱图，其显示高于98％的呈现为单体的抗体(仅通过蛋白质A色谱分析纯化)。正如在附图22的底部表中所总结的那样，99.15％的抗体A48、98.37％的抗体C88以及99.59％的抗体D88在样品中表现为单体。
通过引用的合并
在此所提到的所有出版物和专利的整体披露内容在此作为参考被引用，如同对每个单独出版物或专利进行特定且单独的说明从而作为参考引用所述出版物或专利一样。
等同方案
虽然本文论述了本发明在这里所述的组合物和方法多个特定实施方案，但上述说明仅仅具有例证性并不具备限制性。对于本领域技术人员来说，参考此说明书和下面的权利要求对本发明进行很多变化是显而易见的。本发明的全部范围应该由所附权利要求、等同实施方案的全部范围、本发明说明书以及所述修改来决定。
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Claims (120)

1.一种具有结合登革病毒能力的抗体分子，包括：
(a) 一种重链免疫球蛋白可变区域片段，包括：
CDR1，由序列DVYMS (SEQ ID NO: 3)或DTYMS (SEQ ID NO: 14)组成，
CDR2，由序列RIDPENGDTKYDPKLQG (SEQ ID NO: 4)组成，以及
CDR3，由序列GWEGFAY (SEQ ID NO: 5)组成；以及
(b) 一种轻链免疫球蛋白可变区域片段，包括：
CDR1，由序列RASENVDKYGNSFMH (SEQ ID NO: 6)组成，
CDR2，由序列 RASELQW (SEQ ID NO: 7)组成，以及
CDR3，由序列QRSNEVPWT (SEQ ID NO: 8)组成。
2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中包括具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK (SEQ ID NO: 11)的VH FW1，具有相对于SEQ ID NO: 11不超过5个突变的氨基酸序列，或者包括相对于SEQ ID NO：33位点26缺失的VH FW1。
3.根据权利要求1所述的抗体分子，其中包括具有相对于SEQ ID NO: 11不超过4个突变的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体分子，其中包括具有相对于SEQ ID NO: 11不超过3个突变的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗体分子，其中包括具有相对于SEQ ID NO: 11不超过2个突变的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗体分子，其中包括具有相对于SEQ ID NO: 11不超过1个突变的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括具有序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIK (SEQ ID NO: 11)的VH FW1。
8.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO:84)或者WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85)的VH FW2，或者一种相对于SEQ ID NO: 84或85具有不超过5个突变的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括一种相对于SEQ ID NO: 84或85具有不超过4个突变的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括一种相对于SEQ ID NO: 84或85具有不超过3个突变的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括一种相对于SEQ ID NO: 84或85具有不超过2个突变的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括一种相对于SEQ ID NO: 84或85具有不超过1个突变的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括具有序列WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO:84)或者WVRQAPEQGLEWMG (SEQ ID NO: 85)的VH FW2。
14.根据权利要求1所述的抗体分子，其能够结合登革病毒EDIII（E蛋白结构域III)。
15.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括由SEQ ID NO: 3所述序列组成的VH CDR1、由SEQ ID NO: 4所述序列组成的VH CDR2、由SEQ ID NO: 5所述序列组成的VH CDR3、由SEQID NO: 6所述序列组成的VL CDR1、由SEQ ID NO: 7所述序列组成的VL CDR2、以及由SEQID NO: 8所述序列组成的VL CDR3。
16.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括至少70%与SEQ ID NO: 1、16-21、23、25、27、29、31、32、80或81相同的VH氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括SEQ ID NO: 1、16-21、23、25、27、29、31、32、80或81的VH氨基酸序列。
18.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括至少70%与SEQ ID NO: 2相同的VL氨基酸序列。
19.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括SEQ ID NO: 2的VL氨基酸序列。
20. 根据权利要求1所述的抗体分子，其包括SEQ ID NO: 1的VH氨基酸序列和SEQ IDNO：2的VL氨基酸序列。
21.根据权利要求1所述的抗体分子，其为Fab、F(ab')2、Fv、或者一种单链Fv片段（scFv）。
22.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括选自IgG1、 IgG2、 IgG3和 IgG4的重链恒定区。
23.根据权利要求1所述的抗体分子，其包括选自kappa或者lambda的轻链恒定区的轻链恒定区。
24.根据权利要求1所述的抗体分子，其为一种分离的抗体分子。
25.根据权利要求1所述的抗体分子，其为一种人源化的抗体分子。
26.根据权利要求1所述的抗体分子，其包含一种或多种来源于人框架种系序列的框架区域。
27.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于80nM的解离常数（KD）。
28.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于70nM的解离常数（KD）。
29.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于60nM的解离常数（KD）。
30.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于50nM的解离常数（KD）。
31.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于40nM的解离常数（KD）。
32.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于30nM的解离常数（KD）。
33.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于20nM的解离常数（KD）。
34.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于10nM的解离常数（KD）。
35.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于8 nM的解离常数（KD）。
36.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于6 nM的解离常数（KD）。
37.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于4 nM的解离常数（KD）。
38.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于3 nM的解离常数（KD）。
39.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于2 nM的解离常数（KD）。
40.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于1 nM的解离常数（KD）。
41.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于0.5nM的解离常数（KD）。
42.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于0.2nM的解离常数（KD）。
43.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于0.1nM的解离常数（KD）。
44.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于0.05nM的解离常数（KD）。
45.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有结合登革病毒EDIII的能力，具有小于0.01nM的解离常数（KD）。
46.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于10 nM的解离常数（KD）。
47.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于8 nM的解离常数（KD）。
48.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于6 nM的解离常数（KD）。
49.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于5 nM的解离常数（KD）。
50.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于4 nM的解离常数（KD）。
51.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备结合登革病毒血清型DV-4 EDIII的能力，具有小于3 nM的解离常数（KD）。
52.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少2倍的亲和力。
53.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少3倍的亲和力。
54.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少4倍的亲和力。
55.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少5倍的亲和力。
56.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少6倍的亲和力。
57.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少8倍的亲和力。
58.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少10倍的亲和力。
59.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少12倍的亲和力。
60.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少15倍的亲和力。
61.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少100倍的亲和力。
62.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少1000倍的亲和力。
63.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少5000倍的亲和力。
64.根据权利要求1所述的抗体分子，其具有与DV-4或DV-3EDIII区域结合的能力，具有比抗体A11或抗体4E11高至少10000倍的亲和力。
65.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少2倍的亲和力。
66.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少3倍的亲和力。
67.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少4倍的亲和力。
68.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少5倍的亲和力。
69.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少6倍的亲和力。
70.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少8倍的亲和力。
71.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少10倍的亲和力。
72.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少12倍的亲和力。
73.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少25倍的亲和力。
74.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少50倍的亲和力。
75.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少75倍的亲和力。
76.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少100倍的亲和力。
77.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备与登革病毒菌株结合的能力，所述登革病毒菌株选自DENV-4 BC2、DENV-4-Sing10、DENV-4 NewCal09、DENV-4 Phil56、DENV-3Sing09、DENV-3 Nic10、DENV-3 H87、DENV-2 Peru95、DENV-2 Sing08、DENV-2 NGC、DENV-1Hawaii/1944、DENV-2 New Guinea/1944 (NGC)、DENV-3 Philippines/1956 (H87)、DENV-4Mexico/1997 (BC287/97)和DENV-4 H241，具有比抗体A11或抗体4E11高至少1000倍的亲和力。
78.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力。
79.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少2倍的IC50。
80.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少3倍的IC50。
81.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少4倍的IC50。
82.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少5倍的IC50。
83.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少6倍的IC50。
84.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少8倍的IC50。
85.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少10倍的IC50。
86.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少12倍的IC50。
87.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少25倍的IC50。
88.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少50倍的IC50。
89.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少75倍的IC50。
90.根据权利要求1所述的抗体分子，其具备在聚焦还原中和试验中中和登革病毒的能力，具有与抗体A11或抗体4E11相比低至少100倍的IC50。
91.一种药物组合物，包括权利要求1-90任一项所述的抗体分子以及一种药学上可接受的载体、赋形剂或者稳定剂。
92.一种编码权利要求1-90任一项所述的抗体分子的抗体重链或者轻链可变区域的核苷酸。
93.一种包含权利要求92所述的核苷酸的表达载体。
94.一种包含权利要求92所述的核苷酸的宿主细胞。
95.一种制备抗体分子或其片段的方法，包括在适用于基因表达的条件下培养权利要求94所述的宿主细胞。
96.一种试剂盒，包括一种具有将权利要求1-90任一项所述的抗体分子放置于其中的容器；药学上可接受的载体、赋形剂或者稳定剂；以及任选一种递送装置。
97.根据权利要求96所述的试剂盒，其中所述递送装置包括一种注射剂或针。
98.根据权利要求96所述的试剂盒，进一步包括用于使用的说明书。
99.权利要求1-90任一项所述的抗体分子在制备用于中和登革病毒的产品中的用途。
100.根据权利要求99所述的用途，其中所述登革病毒具有血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4。
101.权利要求1-90任一项中的抗体分子在制备用于治疗受试者的登革病毒的药物中的应用。
102.根据权利要求101所述的应用，其中所述的抗体分子或药物组合物与一种抗-病毒制剂结合使用。
103.根据权利要求102所述的应用，其中所述抗-病毒制剂选自巴洛沙星（balapiravir）、氯喹（chloroquine）、西戈斯韦（celgosivir）、伊维菌素 （ivermectin）或者Carica folia的一种或多种。
104.根据权利要求102所述的应用，其中所述抗-病毒制剂为选自以下的抗-登革抗体：抗体D88，其包含含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的可变重链(VH)和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的可变轻链(VL)；F38，其包含含有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；A48，其包含含有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；C88，其包含含有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；F108，其包含含有SEQ IDNO:81所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸的VL；B48，其包含含有SEQID NO:18所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；A68，其包含含有SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；A100，其包含含有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；C58，其包含含有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；C78，其包含含有SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列的VL；C68，其包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；D98，其包含含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；D188，其包含含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；C128，其包含含有SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；C98，其包含含有SEQ IDNO:32所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的VL；A11，其包含含有SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；B11，其包含含有SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列的VL；4E11、14c10 (HM14c10)、1F4、2D22、5J7、DV1.1、DV1.6、DV3.7、DV4.4、DV5.1、DV6.1、DV7.5、DV8.1、DV10.16、DV13.4、 DV13.8、DV14.5、DV15.7、DV16.5、DV16.8， DV17.6，DV18.21、 DV18.4、DV19.3、DV20.1、DV21.1、DV21.5、DV22.3、 DV22.3 LALA、DV23.13、DV25.5、DV27.2、DV28.1、DV28.8、DV34.4、DV35.3、DV38.1、DV51.6、DV52.1、DV53.4、DV54.7、DV55.1、DV56.12、DV57.4、 DV59.3、DV60.3、DV61.2、DV62.5、DV63.1、DV64.3、DV65.5、DV66.1、 DV67.9、DV68.2、DV69.6、DV70.1、DV71.1、DV74.4、DV75.9、DV76.5、DV77.5、DV78.6、DV79.3、DV82.11、DV82.11 LALA、DV86.2、DV87.1、DV87.1 LALA、DV90.3、DV257.13、DV291.7、DV415.8、DV470.12、3-147、58/5、2F5、2G4、5F9、135.3、2H12、1A5或1C19。
105.根据权利要求102所述的应用，其中所述抗-病毒制剂选自α-葡糖苷酶I抑制剂、腺苷核苷抑制剂、NS3 和/或其辅因子NS2B抑制剂、RNA-依赖的RNA聚合酶 (RdRp) 抑制剂、宿主嘧啶生物合成抑制剂、病毒性的NS4B蛋白质抑制剂或者亚氨基糖类的一种或多种。
106.根据权利要求105所述的应用，其中所述α-葡糖苷酶I抑制剂是西戈斯韦，所述腺苷核苷抑制剂是NITD008，所述NS3 和/或其辅因子NS2B抑制剂是[5-氨基-1-(苯基)磺酰基-吡唑-3-基] 化合物，所述RNA-依赖的RNA聚合酶 (RdRp) 抑制剂是NITD107，所述宿主嘧啶生物合成抑制剂是选自NITD-982和布喹那的宿主二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）抑制剂，所述病毒性的NS4B蛋白质抑制剂是NITD-618或者所述亚氨基糖类是UV-4。
107.根据权利要求101所述的应用，其中所述的抗体分子或药物组合物进一步与一种疫苗结合使用。
108.根据权利要求101所述的应用，其中所述抗体分子或药物组合物用于肠胃外。
109.根据权利要求101所述的应用，其中所述抗体分子或药物组合物用于静脉内。
110.根据权利要求101所述的应用，其中所述抗体分子中和登革病毒血清型DV-1、DV-2、DV-3或DV-4中的一种、两种、三种或者全部。
111.根据权利要求101所述的应用，其中所述受试者被登革病毒感染或者在被登革病毒感染的风险中。
112.根据权利要求101所述的应用，其中所述的抗体分子或药物组合物用于在所述受试者被暴露于登革病毒之前或在登革病毒的一种或多种临床表现的发病之前。
113.根据权利要求91所述的药物组合物在制备用于治疗受试者中登革病毒的药物中的应用。
114.权利要求1-90任一项中的抗体分子在制备用于预防受试者登革病毒感染的药物中的应用。
115.权利要求1-90任一项中的抗体分子在制备用于降低患者接触登革病毒风险的药物中的应用。
116.权利要求1-90任一项中的抗体分子在制备用于降低登革病毒在受试者和蚊虫之间的传播的药物中的应用。
117.权利要求1-90中任一项中的抗体分子在制备用于检测生物样本中登革病毒的产品中的用途，其中，所述产品用于方法，所述方法包括（i）在允许产生抗体分子与多肽相互作用的条件下，使样本或受试者，以及任选地，一种参考样本或受试者，与所述抗体分子接触；以及（ii）检测抗体分子和样本或受试者，以及任选地，一种参考样本或受试者，之间的复合体的形态。
118.根据权利要求91所述的药物组合物在制备用于预防受试者登革病毒感染的药物中的应用。
119.根据权利要求91所述的药物组合物在制备用于降低患者接触登革病毒风险的药物中的应用。
120.根据权利要求91所述的药物组合物在制备用于降低登革病毒在受试者和蚊虫之间的传播的药物中的应用。
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