UA128200C2 - Удосконалені способи підвищення продуктивності антитіл у культурах клітин ссавців і зведення до мінімуму агрегації у процесах виділення і очищення, одержання композицій та стабільні композиції антитіл, одержані цими способами - Google Patents

Удосконалені способи підвищення продуктивності антитіл у культурах клітин ссавців і зведення до мінімуму агрегації у процесах виділення і очищення, одержання композицій та стабільні композиції антитіл, одержані цими способами Download PDF

Info

Publication number
UA128200C2
UA128200C2 UAA201908477A UAA201908477A UA128200C2 UA 128200 C2 UA128200 C2 UA 128200C2 UA A201908477 A UAA201908477 A UA A201908477A UA A201908477 A UAA201908477 A UA A201908477A UA 128200 C2 UA128200 C2 UA 128200C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
buffer
antigen
composition
binding protein
polysorbate
Prior art date
Application number
UAA201908477A
Other languages
English (en)
Inventor
Дере Раджив Мхаласакант
Пісал Самбхаджи Шанкар
Писал Самбхаджи Шанкар
Педді Редді Срінівас Редді
Педди Редди Сринивас Редди
Сінгх Дігамбер Чахар
Сингх Дигамбер Чахар
Еолекар Ліна Равіндра
Еолекар Лина Равиндра
Чоухан Панкадж Сінгх
Чоухан Панкадж Сингх
Аваласкар Ніхіл Даттатрей
Аваласкар Нихил Даттатрей
Original Assignee
Серум Інстітьют Оф Індія Прайвет Лімітед
Серум Инститьют Оф Индия Прайвет Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Серум Інстітьют Оф Індія Прайвет Лімітед, Серум Инститьют Оф Индия Прайвет Лимитед filed Critical Серум Інстітьют Оф Індія Прайвет Лімітед
Publication of UA128200C2 publication Critical patent/UA128200C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39516—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from serum, plasma
    • A61K39/39525—Purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Винахід стосується ефективної платформи для виробництва і одержання композицій антитіл, яка забезпечує: і) технологію культивування клітин з удосконаленою стратегією підживлення, що забезпечує підвищений титр антитіл від 2 до 5 г/л; іі) удосконалений процес очищення, який демонструє оптимальну ступінь вилучення антитіл у відсотках, високий вміст мономерів, мінімальну агрегацію/утворення частинок, мінімальні рівні домішок; ііі) висококонцентровану стабільну рідку композицію з оптимальною осмоляльністю і низькою в'язкістю при різних коливаннях температури, яка не піддається агрегації. Переважні антитіла включають моноклональні антитіла IgG1, специфічні до епітопу вірусу денге в домені III білка Е, і моноклональні антитіла IgG1, специфічні до поверхневого глікопротеїну G вірусу сказу.

Description

(57) Реферат:
Винахід стосується ефективної платформи для виробництва і одержання композицій антитіл, яка забезпечує: ї) технологію культивування клітин з удосконаленою стратегією підживлення, що забезпечує підвищений титр антитіл від 2 до 5 г/л; ії) удосконалений процес очищення, який демонструє оптимальну ступінь вилучення антитіл у відсотках, високий вміст мономерів, мінімальну агрегацію/утворення частинок, мінімальні рівні домішок; ії) висококонцентровану стабільну рідку композицію з оптимальною осмоляльністю і низькою в'язкістю при різних коливаннях температури, яка не піддається агрегації. Переважні антитіла включають моноклональні антитіла Ідс1, специфічні до епітопу вірусу денге в домені Ш білка Е, і моноклональні антитіла Ідес1, специфічні до поверхневого глікопротеїну С вірусу сказу.
Передумови створення винаходу
Нарощування біомаси, виділення і очищення, а також одержання композиції часто є фактором, який обмежує швидкість процесу на початкових етапах включення біопрепаратів в клінічні дослідження. Так, наприклад, лихоманка Денге є найпоширенішим вірусним захворюванням, що передається комарами. Половина світового населення проживає в зонах ризику захворювання лихоманкою Денге, що за розрахунковими даними призводить щорічно до 390 мільйонів випадків зараження в рік по всьому світу. На даний момент затверджені противірусні засоби для лікування лихоманки Денге відсутні, а випробування останніх вакцин не виправдали очікувань. Найбільш перспективна експериментальна вакцина нещодавно продемонструвала обмежену ефективність, за оцінками приблизно 30-60 956 при обмеженому або статистично незначущому захисті від ЮБЕММ-2. Нещодавно був визначений не імунодомінантний, але функціонально значущий епітоп в домені І білка Е та розробляється сконструйоване антитіло АБ513, яке проявляє високу афінність зв'язування і широко нейтралізує різні генотипи в усіх чотирьох серотипах (див. Ват 5бавзізеКНагап єї а! Сеї! 162, 1-12, 30 липня 2015 р.; Затіг Внаїй єї аї, Маїиге, 25 квітня 2013 р.; 496 7446: 504-507). Таким чином, стосовно світової медичної потреби в моноклональних антитілах до вірусу Денге останні оцінки показують, що щорічно по всьому світу відбувається до 390 мільйонів випадків зараження вірусом Денге, з яких »90 мільйонів призводять до розвитку захворювання, що робить ОЕММ загрозою світового масштабу. Якщо припустити, що 3095 з 16 мільйонів діагностованих випадків лихоманки Денге призводять до госпіталізації то близько 5 мільйонів людей потребують зазначених моноклональних антитіл до вірусу Денге, таким чином, "очищені антитіла" з титром понад 4 г/л є обов'язковою умовою для задоволення світової потреби у життєво важливих антитілах. Крім того, тягар, лихоманки Денге є високим в країнах, що розвиваються, в яких якість електропостачання та холодильної техніки часто є недостатньою, у зв'язку з чим стабільність антитіл при коливаннях температури є для цих регіонів більш значущою.
Наявність технологічної платформи для виготовлення і одержання композицій усіх експериментальних моноклональних антитіл-кандидатів (тАб) дозволила б істотно скоротити час і ресурси, необхідні для розробки технології. Це може мати значний вплив на кількість клінічних кандидатів, які можуть бути включені у клінічні дослідження. Крім того, технології, що розробляються для початкових етапів клінічних досліджень, в тому числі з використанням платформи, можуть бути неоптимальними щодо виробничої економіки, виходу, обсягу пулів, продуктивності та можуть бути непридатними для виробництва обсягів, необхідних для більш пізніх етапів, або промислового виробництва. Ще одним важливим аспектом є швидкість розробки технологій з урахуванням того, що ця розробка потрібна перед включенням терапевтичного кандидата у клінічні дослідження (див. Абііпам А. бп!иКІа єї а! Удоцгпаї ої
Спготаїйїодгарпну В, 848 (2007) 28-39).
Як правило, середовища для культивування клітин ссавців засновані на комерційно доступних складах культуральних середовищ, включаючи, наприклад, ОМЕМ або Нат'5 Е12.
Найчастіше склади середовищ недостатньо збагачені для підтримки зростаючих темпів росту клітин і біологічної експресії білка. Залишається потреба в удосконалених середовищах для культивування клітин, добавках і способах культивування клітин для покращеного продукування білка. Згідно з опублікованими даними було досягнуто підвищення титру антитіл в клітинній культурі до рівня 22 г/л. Див. ЕР. М/ипт, Маї Віоїесппої. 22 (2004) 1393. Крім того, в перфузійних реакторах можливе досягнення набагато більш високої щільності клітин, ніж у реакторах періодичної дії або періодичної дії з підживленням (див. буеп боттепеїй єї а! Спетіса)
Епадіпеегіпуд апа Ргосевзвзіпд 44 (2005) 1123-1137). Проте перфузійні технології є складними, дорогими і можуть бути пов'язані з проблемами стерильності і небажаною неоднорідністю профілю глікозилювання. Додавання гідролізатів, що не містять компоненти тваринного походження (Васіо ТС Уеавзіоїіа(є, Рпуїопе Реріопе), у середовище з певним хімічним складом є загальним підходом до оперативного збільшення щільності клітин, життєздатності культури і продуктивності. Гідролізати - це білкові переварити, що складаються з амінокислот, малих пептидів, вуглеводів, вітамінів і мінералів, які вносять в середовища живильні добавки.
Гідролізати нетваринного походження з сої, пшениці і дріжджів широко застосовуються в середовищах для культивування клітин і підживленнях для покращення титру антитіл (див.
О59284371). Проте у зв'язку зі складністю складу, розкидом між партіями, небажаним підвищенням в'язкості культури, дріжджовий екстракт і гідролізати можуть бути значущим джерелом мінливості середовища. У зв'язку із непростим складом продуктів антитіл, які включають ізоформи і мікрогетерогенності, ефективність технології культивування клітин може мати значний вплив на якість і активність продукту, зокрема відносно глікозилювання, посттранскрипційних модифікацій і профілів домішок.
При підвищених концентраціях білки, зокрема, антитіла, найчастіше демонструють характерні проблеми, включаючи агрегацію, преципітацію, гелеутворення, знижену стабільність іл або підвищену в'язкість.
Загальновизнано, що антитіла здатні утворювати агрегати і частинки в розчині, оскільки вони піддаються деградації, агрегації, денатурації або модифікаціям хімічної структури, що призводить до втрати біологічної активності в процесі виробництва і/або зберігання з плином часу. Утворення агрегатів антитіл можливе при експресії культур клітин, виділенні і очищенні, одержанні композицій і зберіганні. Зібрані клітини культури, як правило, містять велику кількість агрегатів, які утворюються в процесі культивування (див. Оєдіапу Ми доштаї ої Спготаюдгарну
А, 1457 (2016) 66-75). Шляхи деградації білків можуть вносити хімічну нестабільність (наприклад, будь-який процес, пов'язаний з модифікацією білка шляхом утворення або розщеплення зв'язків, з утворенням нових хімічних сполук) або фізичну нестабільність (наприклад, зміни в структурі вищого порядку білка). Трьеома найбільш поширеними шляхами деградації білків є агрегація, дезамідування і окислення. Сієїапа еї а/ Стйса! Немієм/в5 іп
Тпегарешіс ЮОгид Саптієг Зувівт5 10 (4): 307-377 (1993). Крім того, білки також є чутливими, наприклад, до рн, іонної силі, теплової напруги, зсувних напруг і дотичних напруг на поверхні розділу фаз, які можуть призводити до агрегації і нестабільності. З метою збереження біологічної активності білка композиція повинна зберігати незмінною конформаційну цілісність щонайменше серцевинної послідовності амінокислот білка, одночасно захищаючи множинні функціональні групи від руйнування.
Важлива проблема, яка викликана утворенням агрегатів, полягає в тому, що така композиція при її введенні може закупорити шприц або насосний пристрій, що небезпечно для пацієнта.
Такого роду модифікації білків можуть також надавати їм імуногенні властивості, що може призвести до утворення антитіл проти лікарського препарату у пацієнта і в результаті знизити доступність такого лікарського препарату при його подальших ін'єкціях або погіршити ситуацію за рахунок індукції аутоїмунної реакції. Важливою метою розробки композицій антитіл є збереження розчинності, стабільності та біологічної активності білків.
Зо Попередні підходи до вирішення проблем нестабільності білкових терапевтичних композицій включали ліофілізацію лікарського препарату з подальшим розведенням безпосередньо або за короткий час перед введенням. Проте ліофілізовані композиції антитіл пов'язані з рядом обмежень, що включають тривалий процес ліофілізації і, як наслідок, високу вартість виробництва. Крім того, перед введенням пацієнтам необхідним є точне асептичне розведення ліофілізованої композиції медичними працівниками. Для стадії розведення потрібні певні спеціальні процедури, а саме: (1) повільне додавання стерильного розчинника (тобто води для внутрішньовенного введення і 5 95 водного розчину глюкози для ін'єкцій) у флакон, що містить ліофілізовані антитіла, в асептичних умовах і дуже обережне перемішування флакона шляхом обертання протягом 30 секунд з метою уникнення піноутворення; (2) може виникнути необхідність відстоювання розведених антитіл при кімнатній температурі протягом як мінімум 20 хвилин до освітлення розчину; (3) розведений препарат необхідно ввести протягом шести (б) годин після розведення. Така процедура розведення є трудомісткою, а обмеження за часом після розведення може бути пов'язане з великими незручностями при введенні композиції пацієнтам, що призведе до значного обсягу відходів в разі неправильного розведення або якщо розведена доза не була використана протягом шести (б) годин і підлягає утилізації. Таким чином, з міркувань зручності для клінічних спеціалістів і пацієнтів, а також технологічності бажано використовувати рідку композицію. Проте рідкі фармацевтичні композиції білкових терапевтичних засобів, тобто антитіла, повинні зберігати стабільність протягом тривалого часу, містити безпечну і ефективну кількість фармацевтичної композиції.
Видалення агрегатів набагато складніше за видалення технологічних домішок у зв'язку з подібними біофізичними характеристиками агрегатів і мономерів, різними джерелами і типами агрегатів, а також недостатньою вивченістю механізму агрегації.
Однією з останніх проблем, виявлених у ході розробки композицій лікарських форм моноклональних антитіл з високою концентрацією, є утворення білковоподібних невидимих і видимих частинок у процесі виробництва і тривалого зберігання. Рівень білковоподібних та інших частинок в композиціях дО стає все більш важливим показником при очищенні і одержанні композицій (див. Кіаиб5 Ууисппег єї а! доштпаї ої Рнапптасецііса! бсієпсев, мої. 99, по. 8, серпень 2010 року). Крім того, рідка композиція повинна зберігати стабільність при різних температурах, зокрема 2-8 "С,257"0,40"С1 5576.
Для багатьох препаратів антитіл, призначених для медичного застосування, необхідним є застосування стабілізаторів для запобігання денатурації, агрегації і іншим змінам білків перед застосуванням препарату. За опублікованими даними в рідких композиціях антитіл (люцентіс, авастин) як стабілізатори використовують манітол і трегалозу (див. Зивити Оспіуата єї аї
Віоспітіса Віорпузіса Ада 1844 (2014 року) 2041-2052) 0О520160137727; МО2009120684; 58568720). Проте трегалоза є дорогою і економічно недоцільною для великомасштабних процесів.
Крім того, внутрішньовенне введення антитіл, як правило, здійснюється у вигляді інфузії, а не болюса, у зв'язку з чим необхідним є розведення композиції тАб, включаючи введення допоміжних речовин, з одержанням рідин, придатних для внутрішньовенного введення.
Одержане розведення допоміжних речовин, зокрема поверхнево-активних речовин, до концентрації нижче необхідної для запобігання агрегації в процесі перемішування призводить до утворення агрегатів і невидимих частинок при обережному перемішуванні після розведення в ПВХ їі поліолефінових мішках для внутрішньовенних вливань, що містять 0,9 95 фізіологічний розчин.
Для видалення агрегатів використовується хроматографія гідрофобної взаємодії, керамічний гідроксиапатит і катіонообмінні смоли, однак ці методи не ідеальні. Більшість раніше опублікованих технологій очищення антитіл в значній мірі базується на використанні хроматографії гідрофобної взаємодії у поєднанні із хроматографією на основі зв'язування з білком А, аніонообмінною хроматографією, катіонообмінною хроматографією в складі трьох - або чотириступеневого процесу (див. УМО2010141039, УМО2014/207763, УМО2013066707,
МО2015099165, УМУО2014102814, УМО2015038888, УУО2004087761). Проте смоли для хроматографії гідрофобної взаємодії вимагають великих кількостей солей, які є дорогими, демонструють низьку зв'язувальну здатність, можуть бути складними в утилізації і несумісними з конструкційними матеріалами буферних резервуарів і резервуарів для зберігання продукції.
Крім того, різниця в щільності між буферами, використовуваними для стадії хроматографії гідрофобної взаємодії, може викликати проблеми стабільності шару. Для відділення агрегатів від мономера також можна використовувати керамічний гідроксиапатит, але смолу, змішану з керамікою, буває дуже важко зняти без пошкодження смоли. У зв'язку з цим зберігання смоли за
Зо межами колонки для повторного застосування в подальшому виробничому циклі може виявитися неможливим (див. 5игаппе АїІдіпдїоп дошигпаї! ої Спготаїодгарпну В, 848 (2007) 64-78).
Встановлено, що триступінчасті комбінації катіонообмінної, аніонообмінної проточної хроматографії, хроматографії гідрофобної взаємодії і катіонообмінної хроматографії з комбінованим режимом забезпечують достатнє очищення моноклональних антитіл, одержаних з яєчників китайського хом'ячка, від домішкових білків клітин-хазяїв. Проте такі схеми очищення загалом не використовуються у промислових процесах виділення і очищення у зв'язку із необхідністю розробки послідовності очищення окремо для кожного тАБб.
Таким чином, існує нагальна незадоволена потреба в ефективній платформі для виробництва і одержання композицій антитіл, яка відповідає ряду критеріїв, включаючи стійкість, надійність і масштабованість, зокрема, платформі, яка забезпечує: і) титр антитіл від 2 г/л до 5 г/л; ії) мінімальну агрегацію/утворення частинок в процесах культивування клітин, очищення та отримання композицій; ії) вдосконалене очищення, що забезпечує оптимальний ступінь вилучення антитіл у відсотках, високий вміст мономерів і мінімальні рівні домішок; ім) висококонцентровану композицію антитіл з низькою в'язкістю, яка не піддається агрегації і утворенню невидимих частинок і таким чином демонструє довгострокову стабільність.
Короткий опис винаходу
Заявник несподівано виявив: а) Склад і стратегію підживлення, в яких враховується склад поживних речовин, накопичення побічних продуктів і баланс між стимуляцією росту і об'ємною продуктивністю, в яких, зокрема, параметри процесу культивування клітин ссавців, такі як конкретне основне живильне середовище, використання концентрованого основного середовища як живильного розчину, використання різних живильних розчинів у поєднанні з певною стратегією підживлення, підтримання концентрацій лактатів і аміаку на низькому рівні, забезпечують підвищення росту клітин, довговічність клітин і експресію білків, таким чином зумовлюючи підвищений титр антитіл. р) Певну концентрацію солей в складі буфера на стадіях афінної хроматографії на основі зв'язування з білком А і катіонообмінної хроматографії, яка зводить до мінімуму агрегацію, таким чином забезпечуючи досягнення вмісту мономерів понад 99 95 зі ступенем вилучення понад 80 95.
с) Рідкі композиції антитіл, які не містять домішкових частинок, до складу яких входить сахароза у комбінації з гістидином, аргініном, полісорбатом 80, хлоридом натрію, які забезпечують підвищену активність і стабільність, знижують в'язкість висококонцентрованих розчинів антитіл при температурі 2-8 "С протягом щонайменше 9 місяців, при 25 "С протягом щонайменше 1 місяця, при 40 "С протягом щонайменше 42 діб, при 55"С протягом щонайменше 2 діб у порівнянні з композицією, яка не містить сахарозу.
Перелік фігур: 1. Фіг. 1. Блок-схема. Технологія виділення і очищення моноклональних антитіл 2. Фіг. 2. Блок-схема. Технологія одержання композиції моноклональних антитіл
Опис винаходу
Терапевтичні білюи даного винаходу включають, серед іншого, антигензв'язуючий білок, гуманізоване антитіло, химерне антитіло, людське антитіло, біспецифічне антитіло, полівалентне антитіло, поліспецифічне антитіло, антигензв'язуючі фрагменти білка, поліклональні, моноклональні, діатіла, нанотіла, одновалентні, гетерокон'югати, поліспецифічні, аутоїмунні антитіла, одноланцюгові антитіла, РГар-фрагменти, Е(ару2-фрагменти, фрагменти, одержані за допомогою бібліотеки експресії ар, антиідіотипічні (анти-і4) антитіла, епітопзв'язуючі фрагменти і СОК-вмісні фрагменти або їх комбінації.
В одному варіанті здійснення даного винаходу терапевтичний білок являє собою антигензв'язуючий білок або імуноглобулін; більш переважно Ідс і найбільш переважно молекулу ДО1. У першому аспекті даного варіанту здійснення імуноглобулін/антитіло являє собою ІДС1 людини (алотип 113) з легим каппа-ланцюгом людини, специфічним до епітопу вірусу Денге в домені ІІІ білка Е. У другому аспекті даного варіанту здійснення антитіло являє собою повністю людське моноклональне антитіло Ідс1, специфічне до поверхневого глікопротеїну З вірусу сказу. У третьому аспекті даного варіанту здійснення терапевтичний білок може бути вибраний з групи, що містить одну або більше речовин, вибраних із СТР19,
СА57, СВ4098, ВУМРабр8, МароуА, Мабув-1ї, Мар 57,17С07, 2810, АБ513/МІ5513, М2970-8389,
Маб2гЕ8, 2022, ОМ5сНиМабр, ЗСН5БІт, НМ руб, НнМВ руб, НмМВ рмв8, 0832-6, 088, ЕЗ38, А48,
С88, 108, 848, Аб8, А100, 058, С78, С68, 098, 0188, С128, С98, АТ11, В11, 81706, 81483,
К16С9, К1406, К1809, К16Е7, К1709, К16Е5, антитіл, одержаних шляхом модифікації 4Е11А,
Зо адатацепта, абциксимаба, адалімумаба, афліберцепта, алефацепта, алемтузумаба, трастузумаба, базиліксімаба, бевацизумаба, белатацепта, бектумомаба, цертолізумаба, цетуксимаба, даклізумаба, екулізумаба, ефалізумаба, ентанерцепта, гемтузумаба, іоритумомаба, інфліксімаба, муромонаба-СОЗ3, омалізумаба, палівізумаба; панітумумаба, пертузумаба, ранібізумаба, рілонацепта, ритуксимаба, тозітумомаба, трастузумаба, занолімаба, ніволумаба, пембролізумаба, пПА20, АМЕ-І33, ІМО-303, залутумумаба, німотузумаба, сп »
К5В-102, МА1-1, 5С100, 5С101, 52103, муромонаба-СОЗ, ОКТАА, ібрітумомаба, гемтузумаба, мотавізумаба, інфліксімаба, пегфілграстина, СОР-571, етанерцепта, АВХ-СВІ, АВХ-ІЇ 8, АВХ-
МАЇ, пемтумомаба, ІхВаїшт-5, АВХ-МАЇї, пемтумомаба, Тегех, А51405, наталізумаба, НиВвС-Ї,
ІОЕС-131, МІ А-І; САТ-152; Уб695, САТ-192, САТ-213, ВАЗ-Ес, І утрпоєтаї-В, ТВАЇЇ -ВІтАБ, бевацизумаба, омалізумаба, ефалізумаба, МІ М-02, НиМах-їЇ. 15, НиМах-Іпіат, НиМах-Сапсег,
НиМах-І утрпота, НиМах-ТАС, кленоліксімаба, люміліксімаба, ВЕС2, ІМС-ІСІ 1, ОСІОЇ, лабетузумаба, арцитумомаба, епратузумаба, такатузумаба, цетуксимаба, мієломацида,
Ї КоСіде, простацида, іпілімумаба, МОХ-0О60, МОХ-070, МОХ-018, МОХ-1106, МОХ-1103, МОХ- 1333, МОХ-214, МОХ-1100, МОХ-С04, МОоХ-1388, МОХ-066, МОХ-1307, На5-ТА2у, га-3019, вМ5-66513, 5аМ-30, 5аМ-40, тоцилізумаба, С5-1008, ІОМ-Ї, голімумаба, СМТО 1275, СМТО 95,
СМТО 328, меполізумаба, МОКІОЇ, МОКІ 02, МОК2О1, вісілізумаба, Ни2АБЕ, волоциксімаба, ІМО-
І, МСМ2201, даклізумаба, НСО 122, СОРФВФб6О, РКО542, С 14, ореговомаба, едреколомаба, етарацизумаба, атезолізумаба, іплімумаба, могамулізумаба, лінтузумаба, НирІО, Гут-1, ефалізумаба, ІСМ3, галіксімаба, екулізумаба, обінутузумаба, пекселізумаба, ГОР-ОЇ, пиАЗЗ,
МУХ-65250, сібротузумаба, офатумумаба, химерного КУУ-2871, пи35193, пи! К26; біватузумаба, раксібакумаба, спі4.18, ЗЕ8, ВС8, пинНМЕСІ, МОКАБ-003, МОНАБ-004, МОВАБ-009, деносумаба,
РАО-140, 1009023, пиМікреїта-1, М1-0401, М1-501, кантузумаба, НимМе01, 8Не, сптТМТт-1/В, бавітуксімаба, пи0д591, Нері-Ї, Репіасеа, абаговомаба, тозітумомаба, устекінумаба, 105А07,
СМАЇ 61, 2МАЗ21.
В іншому аспекті даного варіанту здійснення терапевтичний білок являє собою антитіло, що характеризується афінністю зв'язування з епітопами, присутніми у вірусі Денге, вірусі сказу,
РСВ, вірусі віспи мавп, вірусі грипу, вірусі Зіка, вірусі Західного Нілу, вірусі жовтої лихоманки, вірусі чикунгунья, ВПГ, ЦМВ, МЕКХЗ, вірусі Ебола, вірусі Епштейна-Барра, вірусі вітряної віспи, вірусі паротиту, вірусі кору, вірусі поліомієліту, риновірусі, аденовірусі, вірусі гепатиту А, вірусі бо гепатиту В, вірусі гепатиту С, норовірусі, тогавірусі, альфа-вірусі, вірусі краснухи, вірусі ВІЛ,
вірусі Марбург, вірусі Ебола, вірусі папіломи людини, вірусі поліоми, метапневмовірусі, коронавірусі, вірусі везикулярного стоматиту і Венесуельского енцефаломієліту коней.
У ще одному аспекті даного варіанту здійснення ізоелектрична точка (рі) зазначеного антигензв'язуючого білка становить 7,5-8,5, більш переважно від приблизно 7,8 до приблизно 8,2, найбільш переважно 8,12.
Зокрема антигензв'язуючий білок являє собою терапевтичне, профілактичне або діагностичне антитіло, як описано в МУО2014025546, У/О2015122995, УМО2015123362,
УМО2006084006, УУХО2017027805 і УМО2017165736, зміст яких включено в даний опис у всій повноті за допомогою посилання. Більш переважно терапевтичний білок являє собою антитіло, що характеризується 80 95 схожістю з МІ5513 (Зед ІЮ 1 або 5еяд ІО 2). В іншому переважному аспекті даного варіанту здійснення терапевтичний білок являє собою антитіло, що характеризується більш ніж 80 95 схожістю з моноклональним антитілом до вірусу сказу (5ед І
З і Зед ІО 4).
Дуже добре відомо, що для експресії терапевтичного білка в описаних тут способах можна використовувати будь-яку клітину-хазяїна. Клітини можуть бути дикими або створеними методами генної інженерії для включення рекомбінантної послідовності нуклеїнових кислот, наприклад, гена, який кодує необхідний поліпептид (наприклад, антитіло).
У другому варіанті здійснення даного винаходу клітинна лінія, яка використовується для експресії терапевтичних білків, вибрана з групи, що включає, крім іншого, СНО, СНОК15М о5- ко, а5-СНО, СНО БиХ-В11, СНО-К1Т, В5С-1, клітини мієломи М50О, клітини СМ-1, що містять точку початку реплікації 5М40 (СО5), бО5-1, 005-7, РЗХЗА98.653, С127, 293 ЕВМА, М5А 293,
Соіюо25, 0937, клітини 5Р2, І-клітини, клітини мезонефросу людини (НЕК 293), клітини нирок новонародженого хом'яка (ВНК 21), клітини нирок африканської зеленої мавпи МЕКО-76, клітини НЕГА, МЕКО, ВНК, МОСК, клітини УМІЗ8, МІН-3ТЗ3, М/138, ВТ483, Не578тТ, НТВ2, ВТ20,
Т47О, М50 (клітинна лінія мієломи миші, яка ендогенно не продукує ніяких ланцюгів імуноглобулінів), СКІ7О3О, клітини Не5З78В5ї, РЕК.Сб, 5Р2/0-А914, клітинну лінію мієломи, клітинну лінію гібридоми, клітини легенів людини (М/138), клітини сітківки, лінію гепатоми людини (Нер 02) і клітини гібридоми.
В іншому аспекті другого варіанту здійснення клітини-хазяїни тварин або ссавців включають, серед іншого, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), такі як СНО-КІ (АТС СС -61), ОС144 (Спабіп еї аїі, 1986, от. Сеї!! Моїес. Сепеї, 12: 555-556; апа КоїКекКаг єї а!., 1997, Віоснет., 36: 10901-10909), 5НВ87 сеПСно-ОохХВ11 (с. Ойацшб апа ГА Спавзіп, 1980 Ргос. Маї!. Асад. 5сі., 77: 4216-4220. І Н Стаї, апа Г А Снавзіп 1982, Моїес. Сеї!. Віоі., 2: 93-96), клітинну лінію СНО-КІ Тег-Оп (Сіопіесі), СНО, позначені ЕСАСС 85050302 (САМЕ, Солобері, Уїлтшир, Великобританія), СНО клон 13 (СЕЇМа, Генуя, Італія), СНО клон В (СЕІМа, Генуя, Італія), СНО-КІ1/5Е, позначені
ЕСАСС 93061607 (САМЕ, Солебері, Уїлтшир, Великобританія), ВВА-СНОК'Т, позначені ЕСАСС 92052129 (САМЕ, Солеобері, Уїлтшир, Великобританія), СНОКІвм (Едтопазз еї аї, Мої. Віоїесн. 34: 179-190 (2006), СНО-5 (Ріспієї еї аї., ВіоїесппоЇ. Віоепд. 108: 386-942 (2011), дигідрофолатредуктаза-негативні клітини СНО (СНО/-ОНЕРВ, Опацб апа Спавзіп, 1980, Ргос. Маї!.
Асад. 5сі. ОБА, 77: 4216), і клітини дрі2.СНО (пат. США Мо 5,721,121); клітини нирок мавп СМІ1, трансформовані 540 (клітини СО5, С0бО5-7, АТСС СВІ-1651); ембріональні клітини нирок людини (наприклад, клітини 293 або клітини 293, субклоновані для росту в суспензійній культурі,
Станат еї аї., 1977, У. Сзеп. Мігої., 36:59); клітини нирок новонародженого хом'яка (ВНК, АТОС
СОЇ -10); клітини САР, клітини АСЕТ.НМ, клітини нирок мавп (СМ 1, АТСС СС -70); клітини нирок зеленої африканської мавпи (МЕНО-76, АТСС СВІ-1587; МЕНО, АТСС СС -81); мишачі клітини зЗепоїї (ТМ4, Майнег, 1980, Вісі. Вергод., 23:243-251); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА, АТОС СС -2); клітини нирок собаки (МОСК, АТСС СС -34); клітини легенів людини (М/138, АТСС СОЇ -75); клітини гепатоми людини (НЕР-С2, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози мишей (ММТ 060562, АТСС СОЇ -51); клітини печінки сірого щура (ВВІ ЗА, АТСС СВІ -
БО 1442); клітини ТА1 (МаїНег, 1982, Апп. МУ Асад. 5сі., 383: 44-68); клітини МОВ 5 і клітини Е54.
У першому аспекті другого варіанту здійснення клітинна лінія, яка використовується для експресії терапевтичних білків, являє собою клітини яєчника китайського хом'ячка; більш конкретно лінія являє собою СНОКІТЗМ (25-КО або 125-СНО.
У третьому варіанті здійснення даного винаходу клітини культивують в періодичному, періодичному з підживленням або безперервному режимі; більш конкретно в періодичному режимі з підживленням. Дуже добре відомо, що фахівець в даній області техніки може вносити зміни в технологію, описану в даному винаході, відповідно до доступних засобів і індивідуальних потреб. Більш конкретно процес культивування клітин здійснюється в періодичному режимі з підживленням, що забезпечує підвищений ріст клітин, довговічність клітин і підвищену експресію білків, тобто це забезпечує вихід щонайменше 2 г/л, переважно в діапазон від З г/л до близько 6 г/л.
У першому аспекті третього варіанту здійснення культивування проводиться в колбі, біореакторі, біореакторі бакового типу, біореакторі мішечного типу або одноразовому біореакторі. Переважно зазначений біореактор вибраний з групи біореактора з механічним перемішуванням, бульбашкового колонкового біореактора, ерліфтного біореактора, біореактора з псевдозрідженим шаром або біореактора з наповнювачем; і зазначений біореактор має об'єм, вибраний із 1 л, 2л, З л, 5 л, 10 л, 20 л, 100 л, 200 л, 250 л, 350 л, 500 л, 1000 л, 1500 л, 3000 л, 5000 л, 10000 л, 20000 л і 30000 л.
У другому аспекті третього варіанту здійснення зазначені середовища і способи культивування клітин можна використовувати для підвищення виходу антитіл на приблизно 5 95, 10 ув, 15 У, 20 95, ЗО У, 40 95, 50 У, 60 95, 70 У, 80 У, 90 Уо, 100 95, 110 95, 120 У, 130 95, 140 Ор, 150 95, 160 9», 180 95 або 200 95, більш переважно від приблизно 40 95 до 60 95 за результатами вимірювань протягом двох тижнів. Період часу періодичного способу з підживленням може становити від приблизно 12 до 20 діб; від приблизно 15 до 20 діб або від приблизно 15 до 18 діб.
У четвертому варіанті здійснення даного винаходу середовище для культивування клітин вибране з групи, що включає одну або білоше СО СНО, СО ОрісСнО мМ, СО гопісно м (І їе
Тесппоіодіев); Ех-Сеї! м СО СНО (5ідта АїІагіст)у; РгоОСнНО "М 5 (І опа); ВаїапСО тм СНО СгоУйй А (Ігміпе 5сіепійіс); СОМаМа» (Нусіопе); Сеймепіо м СНО-100 (ЕМО Міїпірогє); СеїЇ мепіо 200 (Мегск
МіПроге); Се мепіо 220 (Метгск МриПроге); Асіїрго (Нусіопе) і їх комбінації. Переважно середовище для культивування клітин вибране з СеїЇ Мепіо 220 (Мегск), АСТІРКО (НусСіопе/СЕ) або сірсо м Бупатів "м Медішт (Тпегто Рі5пег).
У середовище для культивування клітин далі додають глюкозу і інші живильні розчини з метою збільшення росту клітин, довговічності клітин, експресії білків і виходу. Фахівцям в даній галузі техніки повинно бути дуже добре відомо, що живильні розчини можуть бути введені у вигляді швидкого болюса або поступового крапельного вливання.
Додавання живильного розчину у середовище для культивування клітин з метою підживлення включає: початкове підживлення живильним розчином А в обсязі 0,05-0,5 95 об'єму реактора, переважно 0,1-0,2 95 об'єму реактора, починаючи з 4 доби; підживлення живильним розчином А в обсязі 0,1-0,5 95 об'єму реактора на 6, 8, 10,11 їі 13 добу; живильний розчин В у обсязі менше 8 95 об'єму реактора з 2 доби по 14 добу через день або безперервно; підживлення живильним розчином С в обсязі щонайменше 8 95 об'єму реактора протягом щонайменше 2 послідовних діб, починаючи з 2 доби або З доби з проміжком, що становить 2 послідовних доби, до 12 діб, 14 діб, 15 діб, 16 діб або 18 діб.
Підживлення живильним розчином О в обсязі щонайменше 0,5 95 об'єму реактора протягом щонайменше 2 послідовних діб, починаючи з 4 доби або 5 доби, через день або безперервно або з проміжком, що становить 2 послідовних доби, до 12 діб, 14 діб, 15 діб, 16 діб або 18 діб.
Додатково підживлення щонайменше одним живильним розчином, вибраним з ЕйПісіепігеєй "М А,
Етпісіепібеєй "м В, ЕйісіепіРеєй "м С та піногасника С бом Сопіпа.
У переважному аспекті четвертого варіанту здійснення зазначений живильний розчин А, живильний розчин В, живильний розчин С, живильний розчин Ю один або більше вибрані з групи, що включає глюкозу, добавку Сеї!Ї Воозі7м 5 (Нусіопе), ЕХ-СЕЇ ЇЇ 293 (бідта Аїагісн), добавки Сеї!Ї Воові 7а і 75 (Нусіопе), ЗХ Асіїрго (Нусіопе/СЕ), СеїЇ Мепіо 220 (1Х теаїйт), ЕХ-
СЕС Аймапсей"м СНО ГРеей 1, ЕПісіепібеєй "м А, Ейісіепібвеа"м В і Епісіепієвей "мМ С і їх комбінації.
У найбільш переважному аспекті четвертого варіанту здійснення зазначений живильний розчин А являє собою добавку СеїЇ Воов5і м 5 (Нусіопе); живильний розчин В являє собою ЕХ-
СЕ 293 (Зідта Аїагісп), живильний розчин С являє собою добавки Сеї!Ї Воо5і 7а (Нусіопе), живильний розчин О являє собою добавки Сеї! Воові 7р (Нусіопе). Додатково в середовище для культивування клітин додають 10 95 ЗХ Асіїрго (Нусіопе) на З добу та 8 95 СеїЇ Мепіо 220 (Х тедішт) на 7 добу культивування клітин. Фахівцю в даній галузі техніки повинно бути дуже добре відомо, що обсяг додавання живильного розчину може коливатися у межах! 95 обсягу і-1 доба.
Ще один аспект четвертого варіанту здійснення включає умови культивування клітин для збільшення росту і довговічності клітин та експресії білків. Наведені нижче умови культивування бо клітин, які використовуються в процесі, включають, серед іншого: б рН середовища для культивування клітин в діапазоні від 6,5 до 7,5; осмоляльність середовища для культивування в діапазоні 250-500 моОсм/кг; більш переважно 400-500 мосм/кг.
Вміст розчиненого кисню в діапазоні 10-60 95; переважно 20-40 95; більш переважно 30 95.
Температура культивування клітин в діапазоні від 30"С до 38"С; перша температура переважно 36-37 "С і додатково друга температура переважно 30-35 "С.
Концентрація глюкози підтримується на рівні нижче 7 Фо; переважно від 4 9о до 5 95.
Збір клітин при зниженні життєздатності до 80 95;
При цьому умови культивування клітин підтримуються таким чином, що концентрація вторинних метаболітів, таких як лактат, не перевищує 5 г/л, а концентрація аміаку не перевищує 5 ммоль/л.
У п'ятому варіанті здійснення даного винаходу зазначений терапевтичний білок, одержаний із зібраних клітин, піддають процесу очищення, що включає такі стадії: ї) афінна хроматографія, ії) вірусна інактивація, її) іонообмінна хроматографія, ім) фільтрація; при цьому загальна ступінь вилучення процесу становить понад 7095, а кінцевий очищений терапевтичний білок має ступінь чистоти/вміст мономера щонайменше 9095, переважно понад 9895. Вміст інших домішок, включаючи залишкову клітинну ДНК, залишковий клітинний білок і залишковий білок А, в кінцевому очищеному терапевтичному білка становить менше 1 95.
У загальному аспекті п'ятого варіанту здійснення автори даного винаходу досягли успіху в подоланні проблеми агрегації терапевтичного білка в процесі виділення і очищення зазначеного білка шляхом використання: ії) солі на стадії промивки афінною хроматографією, ії) лінійного градієнта сольового розчину для елюювання на стадії іонообмінної хроматографії. У переважному аспекті зазначеного варіанту здійснення концентрація солі буферів, використовуваних при очищенні, знаходиться в діапазоні 30-500 мМ, більш переважно концентрація солі буферів, використовуваних при очищенні, знаходиться в діапазоні 50-300 мМ.
У першому аспекті п'ятого варіанту здійснення афінна хроматографія вибрана з групи, що включає одну або більше хроматографій з білком А, хроматографій з білком С, хроматографій з білком Ї і їх комбінації; переважно використовувана афінна хроматографія являє собою хроматографію з білком А.
Зо У другому аспекті п'ятого варіанту здійснення смола, яка використовується для хроматографії з білком А, вибрана з групи, що включає одну або більше ЕбПтипо А,
КапСарАТМ, Марзеїесі ЗикКе "м, Марзеїесі зиКе ГХ, Мабрзеїесі Хіга, гРгоївіп А Зерпагозе Еаві
Ром", РогохФ МарСаріийге А, Ат5рпеге "м Ргоївіп А Л/ЛМ/1203, Ргозер НС, Ргозер ШКга і Ргозер
ОНга Ріє; переважно смола для афінної хроматографії з білюм А являє собою Марзеїесі
ЗМИиКетм, ЕвпПтипо А, Капсар А або Рого5 МабСаріиге; більш переважно смола для афінної хроматографії з білюом А являє собою Марзеїесі 5иКе "мМ,
У третьому аспекті п'ятого варіанту здійснення промивний буфер, який використовується для хроматографії з білком А, вибраний з групи, що містить один або більше з 10-30 мМ фосфатний буфер, переважно 20 мМ фосфатний буфер; 100-150 мМ Масі, переважно 150 мМ Масі; 0,05 95 полісорбат 80; рН 7,0:50,2. 10-30 мМ фосфатний буфер, переважно 20 мМ фосфатний буфер; 250 мМ - 1 М Масі, переважно 1 М Масі; 0,05 95 полісорбат 80; рН 7,0:0,2. 1-30 мМ фосфатний буфер, переважно 10 мМ фосфатний буфер; 100-150 мм масі, переважно 125 мМ Масі; 0,05 95 полісорбат 80; рН 7,0:50,2.
У четвертому аспекті п'ятого варіанту здійснення елюювальний буфер, який використовується для хроматографії з білком А, містить 10-30 мМ цитратний буфер; рН 3,0:20,5 і додатково 0,01-0,05 95 (в/0б) полісорбат 80; переважно елюювальний буфер містить 20 мМ цитратний буфер; рН 3,0:-0,2 і додатково 0,025 95 (в/об) полісорбат 80.
У п'ятому аспекті п'ятого варіанту здійснення елюат, одержаний на стадії афінної хроматографії, піддають вірусній інактивації і зниженню вірусного навантаження. Фахівцю в даній галузі техніки повинно бути дуже добре відомо, що вірусна інактивація і зниження вірусного навантаження в елюаті можуть бути здійснені способом, обраним окремо або в поєднанні з групи, що містить обробку середовищем з певним рівнем рН, обробку поверхнево- активною речовиною, термообробку і фільтрацію для зниження вірусного навантаження. У переважному аспекті даного варіанту здійснення вірусна інактивація здійснюється шляхом впливу на елюат середовища з низьким рівнем рн, тобто 3,3-3,5, протягом 50-100 хвилин. Далі рН елюату нейтралізують, піддаючи його впливу нейтралізуючого буфера, тобто 1 М трис- цитратного буфера з рН 7,0-0,2. Фахівцям в даній галузі техніки повинно бути дуже добре відомо, що як альтернативу для ефективної нейтралізації РН елюату можна використовувати 60 будь-який інший сумісний буфер.
У шостому аспекті п'ятого варіанту здійснення елюат вірусної інактивації піддають іонообмінній хроматографії. В одному з аспектів даного варіанту здійснення іонообмінна хроматографія являє собою катіонообмінну хроматографію, аніонообмінну хроматографію або їх комбінацію; хроматографія може здійснюватися в режимі "зв'язування і елюювання" або в "проточному режимі" У переважному аспекті даного варіанту здійснення катіонообмінна і аніонообмінна хроматографія здійснюються послідовно в будь-якому порядку. В іншому аспекті п'ятого варіанту здійснення зазначена смола для хроматографії в деяких випадках являє собою мультимодальну смолу, таку як смола Саріо ММС (СЕ Неайвсаге).
У сьомому аспекті п'ятого варіанту здійснення елюат після вірусної інактивації піддають катіонообмінній хроматографії. У переважному аспекті даного варіанту здійснення параметри хроматографії, включаючи смолу для хроматографії та буферні умови, вибрані таким чином, що позитивно заряджений терапевтичний білок зв'язується зі смолою для хроматографії, тоді як негативно заряджені молекули надходять в елюат, додатково терапевтичні білки піддають елююванню з використанням сольового градієнта. У переважному аспекті даного варіанту здійснення смола для катіонообмінної хроматографії вибрана з групи, що включає одну або більше груп на основі сульфонату (наприклад, Мопоб5, Міпі5, Зоцгсе 155 і 305, 5Р
ЗЕРНАНОБЕФ Равзі БРіом, 5Р ЗЕРНАКОЗЕФ Нідп Регоптапсе виробництва компанії СЕ
Неанйпсаге, ТОМОРЕАКІФ 5Р-6505 і 5Р-650М виробництва компанії Тозхой, МАСКО-РКЕРФ
Нідп 5 виробництва компанії Віокай, Сегатіс НурегО 5, ТЕІЗАСЕКМ Ф М і І. 5 5Р і Зрпегодех І 5
ЗР виробництва компанії РаїЇ Тесппоіодіе5); групи на основі сульфоетилу (наприклад,
ЕКАСТОСЕЇ Я 5Е виробництва компанії ЕМО, РОКОБЯЕ 5-10 і 5-20 виробництва компанії
Арріїєйд Віозузієетв5); групи на основі сульфопропілу (наприклад, ТК Се! 5Р 5РММ ії БР-БРМІ-НА виробництва компанії То5хОпй, РОКОБФ Н5З-20, Н5 50 і РОКО5ФО Х5 виробництва компанії І іїе
Тесппоіодіе5); групи на основі сульфоіїзобутилу (наприклад, ЕКАСТОСБ Є ЕМО 503 виробництва компанії ЕМО); групи на основі сульфоксиетилу (наприклад, ЗЕ52, 5Е53З і Ехргез5- оп З виробництва компанії М/пайтап); групи на основі карбоксиметилу (наприклад, СМ
ЗЕРНАКОБЕФ Равбі РІом/у виробництва компанії СЕ Неаййсаге, Нуагосе СМ виробництва компанії Віоспгот І абз Іпс., МАСКО-РКЕРФ СМ виробництва компанії Віокайд, Сегатіс Нурего
СМ, ТКІЗАСКМУІ Ф М СМ, ТКІЗБАСЕМІ Ф | 5 СМ виробництва компанії Раї! Тесппоіодіє5, Маїгех
Зо СЕ ОРІМЕФ С500 ії С200 виробництва компанії Мійроге, СМ52, СМ32, СМ23З і Ехргев5-Їоп С виробництва компанії М/пайтап, ТОМОРЕАКІФ СМ-6505, СМ-65О0М і СМ-650С виробництва компанії То50й); групи на основі сульфонової і карбонової кислот (наприклад, ВАКЕКНВОМОФ
Сатоху-ЗиМоп виробництва компанії 9.Т. ВаКег); групи на основі карбонової кислоти (наприклад, М/Р СВХ виробництва компанії У.Т. Вакег, ОПОУМУМЕХФ МАС-3 виробництва компанії
Бом Гідцій БЗерагайоп5, АМВЕКІІТЕФ Умеак Сайоп Ехспапдег5, СОУУЕХФ Умеак Сайоп
Ехспапдег і ОІАІОМЕе Ууеак Сайоп Ехспапдегє виробництва компанії Зідта-Аїагіспй і
ЕКАСТОСЕЇ ДЖ ЕМО СОО- виробництва компанії ЕМО); групи на основі сульфонової кислоти (наприклад, НуагосеїЇ 5Р виробництва компанії Віоспгот І арх Іпс., ООУММЕХФ Ріпе Меп 5ігопа
Асій Сайоп Кезіп виробництва компанії Юом/ Гіди берагайоп5, ОМО5рпеге 5, М/Р. Зи!иопіс виробництва компанії .).Т. ВаКег, мембрана ЗАКТОВІМОЯЮ 5 виробництва компанії Запогішив,
АМВЕКИСІТЕФ 5ігопуд Сайоп Ехспапдег5, ООМУЕХО 5ігопуд Сайоп і СІАІОМО 5ігопд Сайоп
Ехспапдег виробництва компанії Зідта-ЛАіагісі) і групи на основі ортофосфату (наприклад, РІ 1 виробництва компанії М/пайтап). У найбільш переважному аспекті даного варіанту здійснення смола, яка використовується для катіонообмінної хроматографії, являє собою Егасіодеф ЕМО
ЗО», Егасіодекю ЕМО ЗЕ Нісар (МегсК), СММ Нурегсе! "м (Раї! Согрогаййоп), Саріо 5 ІтрАсі. У ще одному аспекті п'ятого варіанту здійснення параметри процесу катіонообмінної хроматографії включають, серед іншого, буфер для попереднього врівноваження (200 мМ цитратний буфер; рН 6,0:20,2Ї; врівноважувальний буфер (10 мМ цитратний буфер; полісорбат 80 (0,025 95 (в/об)); рН 6,002, витримку в середовищі з низьким рН для нейтралізації; промивний буфер А 110 мМ
БО цитратний буфер; рН 6,0:0,21; промивний буфер В (20 мМ цитратний буфер; 300-500 мМ масі;
РН 6,020,2Ї; буфер СІР (0,5М Маоні; час утримування І14,00-7,00 хвилин); колонка, що використовується |ХК2бІ.
У восьмому аспекті п'ятого варіанту здійснення елюат після вірусної інактивації піддають аніонообмінній хроматографії. У переважному аспекті даного варіанту здійснення параметри хроматографії, включаючи смолу для хроматографії та буферні умови, вибрані таким чином, що негативно заряджені домішки зв'язуються з мембраною, тоді як терапевтичний білок елююється у прямотоці. У переважному аспекті даного варіанту здійснення смола для аніонообмінної хроматографії вибрана з групи, що включає одну або білоше ДЕАЕ-целюлоз, РОКОБЗОФ РІ 20, РІ 50, НО 10, НО 20, НО 50, О 50 виробництва компанії Арріїей Віозубзіет5, ЗАКТОВІМОЮ О 60 виробництва компанії Запогіив, МопоО, Міпіо, бБоцгсе 150 і 300, О, ОЕАЕ і АМХ БЕРНАКОЗЕФ
Еавзі Ром, О 5БЕРНАКОБЕ, О ЗЕРНАКОЗЕФ Нідп Репоптапсе, ОАЕ БЕРНАОЕХФ і ГАТТ О
ЗЕРНАКОЗЕФ (СЕ Неайсаге), МУР РЕЇ, М/Р РЕАМ, М/Р ОШАТ виробництва компанії У.Т. Вакег,
Нуагтосеї! ОЕАЕ і Нуаюосеї! ОА виробництва компанії Віоспгот І арз Іпс., Ю Ов5рпеге О, МАСНВО-
РЕЕРФ ОЕАЕ і МАСВКО-РКЕРФ Ніді О виробництва компанії Віогад, Сегатіс НурегО О, сегатіс
Нуре РЕАЕ, ТВІЗБАСЕКМІ Ф М і 15 ОЕАЕ, Зрпегодех 5 ОЕАЕ, ОМА 5РНЕКОЗІ Ф І 5, ОМА
ЗРНЕКОЗБІ Є М і МОБТАМОФ СО виробництва компанії Раї! Тесппоїодіе5х, ВПОУМУЕХФО Ріпе Мезп
Зігопу Вазе Туре І і Туре ІІ Апіоп Везіп5 і ООУМЕХ? МОМО5РНЕНК Е 77, аніон слабкої основи виробництва компанії Роми І ідцід берагайоп5, мембрани ІМТЕКСЕРТФ О, Маїгех СЕ ОРІМЕФ
Аг00, АБбБО0О, 0500 ії 0800 виробництва компанії Мійроге, ЕВЕАСТОСЕ ДФ ЕМО ТМАЕ,
ЕКАСТОСЕЇ б ЕМО ОЕАЕ і ЕКАСТОСЕ Ф ЕМО ОМАЄЕ виробництва компанії ЕМО, слабкі і сильні аніонообмінні матеріали типів І і І АМВЕРІТЕФ,, слабкі і сильні аніонообмінні матеріали типів І ї І ООМ/ЕХФ), слабкі і сильні аніонообмінні матеріали типів І ії її СІДІОМФ, СВООГІТЕФ виробництва компанії бідта-Аіагісн, гель ТК О і ОЕАЕ 5РМУ і БРМ-НЕ, ТОМОРЕАКІ Ф Зирего- 6505, 650М і 650С, ОАЕ-550С і 6505, ОБАЕ-65ОМ і 650С виробництва компанії Тозоп, ОАБ2,
РЕ23, ОЕЗ32, ОЕ51, ОЕ52, ОЕ53, Ехргезв5-Їоп О і Ехрге55-Їоп СО) виробництва компанії М/Ннаїтап; більш переважно смола для аніонообмінної хроматографії вибрана з Запобіпа О (Запопив),
Езптипо О (Мегск), МОБТАМОФ О (Раї! Согрогайоп) і Рогоз Х (Тнепто). У ще одному аспекті п'ятого варіанту здійснення параметри процесу аніонообмінної хроматографії включають, серед іншого, очисний буфер (0,5М Маоні; буфер для попереднього врівноваження (200 мМ цитратний буфер; рН 6,0:0,2|; врівноважувальний буфер (20 мМ цитратний буфер; рН 6,050,2; і додатково 0,025 95 полісорбат 80); буфер для зберігання (0,1 М Маоні; лінійна швидкість потоку 110-500 см/год., зокрема 100-150 см/год.|; використовувана колонка ІХК2бІ.
Процес очищення у вказаних вище варіантах здійснення може додатково містити щонайменше одну додаткову стадію хроматографії, вибрану з групи, що включає одну або більше хроматографій, вибраних із хроматографії гідрофобної взаємодії, гідрофобної хроматографії з індукуванням заряду, хроматографії з керамічним гідроксиапатитом, мультимодальної хроматографії (Саріо ММС і Саріюо АайнНегє), мембранної хроматографії (мембрани О, включаючи Іпіегсері"м (Мійіроге), МивіапдоФ (РаїЇ Согрогайоп) і Загобіпа тм (Запогісив5)).
Зо У дев'ятому аспекті п'ятого варіанту здійснення вірусні частинки видаляють з використанням фільтра з розміром пор 20 нм. Фільтр, який використовується для видалення вірусних частинок, включає, серед іншого, фільтр, що затримує віруси, вибраний з групи Мігезоїме РВО (МегескК),
Ріапома 20М (Азапйі Казеї), Віо ЕХІ РА РЕСАЗОИЗ РЕІМЕ, РЕСАБЗИЗ МА (Раї! І їе 5сіепсеб) і мігозагі (Загіогіив5), Мігозагї СРМ виробництва компанії Запогіц5, Мігозоїме виробництва компанії
Мійіроге, Опйірог ЮМ20 або БМ50 виробництва компанії РаїЇ, Ріапома 20М їі 5ОМ або ВіоЕх виробництва компанії Азайі. Фахівцю в даній галузі техніки повинно бути дуже добре відомо, що на цій стадії можна використовувати будь-який інший фільтр, здатний затримувати віруси; переважно фільтр, який використовується для видалення вірусних частинок, вибраний з
Мігезоїме РКО (МегсК), Віо ЕХ РА РЕСАБИЗ РКІМЕ, РЕСАЗИЗ 5МА4 (Раї! І йе 5сіепсев) і
Мігозап (Запогішив).
У десятому аспекті п'ятого варіанту здійснення терапевтичний білок концентрують до необхідної концентрації і проводять заміну буфера в буферній суміші. Заміну буфера здійснюють в системі тангенціальної потокової фільтрації або системі ультрафільтрації. Інші параметри тангенціальної потокової фільтрації містять один або більше, вибраних з діафільтрації з використанням буфера для діафільтрації (25 мМ гістидинового буфера; 75 мМ аргінінового буфера; 50-150 мМ Масі; рН 6,50:0,51); очисного буфера І0,5М Маосоні; буфера для зберігання (0,1 М Маоні; урівноваження з використанням 5-10 об'ємів мембрани; концентрації і діафільтрації з використанням 10-20 об'ємів діафільтрації; промивання водою для ін'єкцій з використанням 3-5 об'ємів мембрани; очищення з використанням 0,5-1,0 М Маон; зберігання (0,1 М Маоні. В одному переважному аспекті даного варіанту здійснення тангенціальна потокова фільтрація здійснюється з використанням мембрани з номінальним відсіканням по молекулярній масі 30 кДа, вибраної з групи, що містить одну або більше з поліетерсульфонових мембран Сепігатаге серії Т (Раї! Согрогаїййоп), Нуагозагі (Запогіи5) і Реїїсоп З (МегскК).
У шостому варіанті здійснення даного винаходу зазначений терапевтичний білок використовують для одержання композиції з фармацевтичними допоміжними речовинами, причому осмоляльність композиції знаходиться в діапазоні від 300 мОсм/кг до 500 мОсм/кг, а в'язкість композиції становить менше 2,5 мПа-с.
У першому аспекті шостого варіанту здійснення композиція терапевтичного білка містить щонайменше один антигензв'язуючий білок, щонайменше один стабілізатор, щонайменше одну буферну речовину, щонайменше одну речовину, що регулює тонічність, і щонайменше одну поверхнево-активну речовину. У деяких випадках композиція містить консервант.
У другому аспекті шостого варіанту здійснення стабілізатор являє собою вуглевод.
Стабілізатор вибраний з групи, що містить одну або більше речовин, вибраних із сахарози, сорбіту, трегалози, маніту, декстрану, інозиту, глюкози, фруктози, лактози, ксилози, манози, мальтози, рафінози і їх комбінації; більш переважно стабілізатор являє собою сахарозу. У ще одному аспекті даного варіанту здійснення стабілізатор містить сахарозу в концентрації від приблизно 0,1 95 до приблизно 2,5 95 в/об, переважно «1 95 в/об сахарози.
У третьому аспекті шостого варіанту здійснення буферна речовина вибрана з групи, що містить одну або більше речовин, вибраних із гістидину, аргініну, гліцину, цитрату натрію, фосфату натрію, лимонної кислоти, ГЕПЕС, ацетату калію, цитрату калію, фосфату калію, ацетату натрію, бікарбонату натрію, трис-основи або трис-НСЇІ і їх комбінації. Переважно буферна речовина забезпечує рН від приблизно 5,5 до 7,5, від приблизно 6,0 до 7,0, від приблизно 6,3 до приблизно 6,8 або приблизно 6,5.
У четвертому аспекті шостого варіанту здійснення буферна речовина являє собою гістидин.
У переважному аспекті даного варіанту здійснення буферна речовина містить гістидин в концентрації від приблизно 5 мМ до приблизно 150 мМ, від приблизно 10 мМ до приблизно 50
ММ, від приблизно 20 мМ до приблизно 40 мМ. У найбільш переважному аспекті даного варіанту здійснення буферна речовина містить гістидин у концентрації приблизно 25 мМ.
У п'ятому аспекті шостого варіанту здійснення буферна речовина являє собою аргінін. У переважному аспекті даного варіанту здійснення буферна речовина містить аргінін у концентрації від приблизно 5 мМ до приблизно 200 мМ, від приблизно 50 мМ до приблизно 150
ММ, від приблизно 50 мМ до приблизно 100 мМ. У найбільш переважному аспекті даного варіанту здійснення буферна речовина містить аргінін у концентрації від приблизно 70 до 80
ММ.
У шостому аспекті шостого варіанту здійснення речовина, що регулює тонічність, вибрана з групи, що містить одну або більше речовин, вибраних із хлориду натрію, глюкози, гліцерину, маніту і хлориду калію. У переважному аспекті даного варіанту здійснення речовина, що регулює тонічність, містить хлорид натрію і присутня у концентрації від приблизно 10 мМ до
Зо приблизно 500 мМ, переважно у концентрації від приблизно 50 мМ до приблизно 250 мМ; найбільш переважно у концентрації приблизно 100-145 мМ.
У сьомому аспекті шостого варіанту здійснення поверхнево-активна речовина присутня в концентрації від приблизно 0,001 до приблизно 0,2 95 (в/об) і вибрана з групи, що містить одну або більше речовин, вибраних із полісорбатів (наприклад, полісорбат 20 або полісорбат 80); полоксамерів (наприклад, полоксамер 188); Тгйоп; додецилсульфату натрію (ДСН); лаурилсульфату натрію; октилглікозиду натрію; лаурил-, міристил-, лінолеїл- або стеарилсульфобетаїну; лаурил-, міристил-, лінолеїл- або стеарилсаркозину; лінолеїл-, міристил- або цетилбетаїну; лауроамідопропіл-, кокамідопропіл-, лінолеамідопропіл-, міристамідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропілбетаїну (наприклад, лауроамідопропіл); міристамідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропілдиметиламіну; метилкокоїл- або динатрійметилолеїлтаурату натрію; і серії МОМАОШОАТФ (Мопа Іпадивігієв, Іпс.,
Патерсон, Нью-Джерсі), поліетилгліколю, поліпропілтгліколю і співполімерів етилену і пропіленгліколю (наприклад, Рійигопіс5х, РЕб68 і т.д.). У переважному аспекті даного варіанту здійснення поверхнево-активна речовина містить полісорбат 80 і присутня у концентрації від приблизно 0,001 95 до приблизно 0,2 95 в/об; переважно у концентрації від приблизно 0,002 95 до приблизно 0,02 95; від приблизно 0,005 95 до приблизно 0,02 956; найбільш переважно у концентрації приблизно 0,02 9.
У восьмому аспекті шостого варіанту здійснення композиція містить терапевтичний білок у концентрації від приблизно 1 мг/л до приблизно 150 мг/л, від приблизно 1 мг/л до приблизно 50 мг/л, від приблизно 20 мг/л до приблизно 40 мг/л. Переважно композиція містить терапевтичний білок у концентрації від приблизно 1 мг/л до приблизно 50 мг/л.
У дев'ятому аспекті шостого варіанту здійснення композиція додатково містить консервант, консервант може бути вибраний з групи, що містить бензиловий спирт, м-крезол та фенол.
У сьомому варіанті здійснення даного винаходу композиція терапевтичного білка містить щонайменше один терапевтичний білок, сахарозу, аргінін, гістидин, хлорид натрію, полісорбат 80. Переважно композиція терапевтичного білка містить від приблизно 1 мг/мл до приблизно 50 мг/мл терапевтичного білка; від приблизно 20 мМ до приблизно 40 мМ гістидину; від приблизно 50 мМ до приблизно 100 мМ аргініну; від приблизно 0,002 95 до приблизно 0,02 95 полісорбату 80 (в/об); від приблизно 50 мМ до приблизно 150 мМ Масі і «2,5 95 сахарози в/об. рН композиції знаходиться в діапазоні від 6,0 до приблизно 7,0, а осмоляльність композиції знаходиться в діапазоні від 300 мОсм/кг до приблизно 450 моОсм/кг.
В одному з переважних аспектів сьомого варіанту здійснення фармацевтична композиція містить 2-80 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу Денге; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 полісорбату 80 (в/об) і 0,595 сахарози в/об; причому рН композиції становить 6,5:-0,5, осмоляльність 380 моОсм/кг, в'язкість менше 2,5 мПа-с.
В одному з переважних аспектів сьомого варіанту здійснення фармацевтична композиція містить 25 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу Денге; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101
ММ Масі; 0,02 95 полісорбату 80 (в/об) і 0,5 95 сахарози в/об; причому рН композиції становить 6,5:20,5, осмоляльність 380 мОсм/кг, в'язкість менше 2,5 мПа-с.
В одному з переважних аспектів сьомого варіанту здійснення фармацевтична композиція містить 50 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу Денге; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101
ММ Масі; 0,02 95 полісорбату 80 (в/об) і 0,5 95 сахарози; причому рН композиції становить 6,5-0,5, осмоляльність 380 моОсм/кг, в'язкість менше 2,5 мПа-с.
В одному з переважних аспектів сьомого варіанту здійснення фармацевтична композиція містить 2-80 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу сказу; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101
ММ Масі; 0,02 95 полісорбату 80 (в/об) і 0,5 95 сахарози в/об; причому рН композиції становить 6,5-0,5, осмоляльність 380 моОсм/кг, в'язкість менше 2,5 мПа-с.
Фармацевтична композиція, яка містить 50 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу сказу; 25
ММ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 полісорбату 80 (в/об) і 0,5 95 сахарози в/об; причому рН композиції становить 6,5:20,5, осмоляльність 380 мОсм/кг, в'язкість менше 2,5 мПа- б.
Згідно з ще одним аспектом сьомого варіанту здійснення зазначена фармацевтична композиція антитіл може являти собою ліофілізовану композицію.
У восьмому варіанті здійснення даного винаходу афінність і активність терапевтичного білка вимірюють з використанням одного або більше аналів, вибраних із імуноферментного аналізу (ІФА) або проточної цитометрії. У переважному аспекті восьмого варіанта здійснення для кількісного визначення зв'язування терапевтичного білка зі специфічним антигеном використовують спосіб на основі непрямого ІФА. У переважному аспекті даного варіанту здійснення композицію моноклональних антитіл до вірусу Денге досліджують по відношенню до всіх серотипів вірусів Денге і визначається кількість тАр до вірусу Денге. Активність терапевтичного білка реєструється в 95 по відношенню до активності стандартного зразка.
Зрозуміло, що для демонстрації активності і афінності терапевтичного білка можна використовувати будь-які інші аналогічні способи.
У дев'ятому варіанті здійснення даного винаходу для оцінки нейтралізації вірусної активності терапевтичним білком використовують реакцію нейтралізації за допомогою придушення фокусоутворення (РЕМТ/РКМТ) або аналогічний тест. У переважному аспекті даного варіанту здійснення композицію моноклональних антитіл до вірусу Денге досліджують по відношенню до всіх серотипів вірусів Денге і розраховують значення ЕС5О для нейтралізації вірусів Денге. Зрозуміло, що для демонстрації нейтралізуючої активності терапевтичного білка можна використовувати будь-які інші аналогічні способи.
У десятому варіанті здійснення даного винаходу для оцінки присутності агрегатів у композиції терапевтичного білка використовують ексклюзійну високоефективну рідинну хроматографію. У переважному аспекті даного варіанту здійснення для демонстрації процентного вмісту агрегатів і мономера в композиції моноклональних антитіл до вірусу Денге використовують колонку Рпепотепех Віо-бес-5 3000. Зрозуміло, що для оцінки процентного вмісту агрегатів і мономера в композиції терапевтичного білка можна використовувати будь-які інші аналогічні способи.
В одинадцятому варіанті здійснення даного винаходу композиція може зберігатися у відповідному контейнері. Контейнер може бути вибраний з флакона, ампули, мішка для внутрішньовенного вливання, натільного ін'єктора, болюсного ін'єктора, шприца, шприц-ручки, насоса, багатодозового шприца з голкою, багатодозового шприца-ручки, ін'єктора, шприца- тюбика, автоінжектора, попередньо заповненого шприца або їх комбінації.
Щонайменше один компонент первинного контейнера містить засіб закупорювання, вибраний із поліпропілену (ПП), поліетилентерефталату співполімеру (ПЕТС), поліетилену низького тиску (ПЕНТ), поліетилентерефталату (ПЕТ), поліпентафторстиролу (ПФОС), полікарбонату, полівінілхлориду (ПВХ), поліолефіну, поліциклопентану (С2.ЕТМ.), циклоолефінового співполімеру (ЦОС) і їх комбінацій або співполімерів.
Композиції антитіл до вірусу Денге або антитіл до вірусу сказу, описані в цій заявці, можна бо застосовувати (окремо або у поєднанні з іншими засобами або терапевтичними методами) для лікування, профілактики або діагностики захворювань, викликаних вірусом Денге або вірусом сказу. Так, наприклад, комбінована терапія може включати молекулу антитіл до вірус Денге, комбіновану і/або введену разом з одним або більше з додаткових лікарських засобів, наприклад, противірусних засобів (включаючи інші антитіла до вірусу Денге), вакцин (включаючи вакцини від вірусу Денге) або засобів, що підвищують імунну відповідь. В інших варіантах здійснення молекули антитіл вводять у комбінації з іншими терапевтичними діями, такими як внутрішньовенне відновлення втрати рідини, жарознижуючі засоби (такі як ацетамінофен) або переливання крові. У таких варіантах комбінованої терапії можуть переважно використовуватися знижені дозування застосовуваних лікарських засобів з метою уникнення можливої токсичності або ускладнень, пов'язаних з різними варіантами монотерапії.
Приклади:
Приклад 1: Процес нарощування біомаси для культивування клітин та експресії терапевтичного білка, тобто моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513)
Протокол:
Культивування клітин в масштабі 10 л здійснювали в періодичному режимі з підживленням з використанням зазначених нижче параметрів процесу ферментації/ нарощування біомаси.
Моноклональні антитіла до вірусу Денге експресували в клітинній лінії СНО - КІ 5М 5-КО, одержаній від компанії Мізіїеїта Іпс. О5А. - Як середовище для культивування клітин, використовуване для вирощування клітин та експресії терапевтичного білка, тобто моноклональних антитіл до вірусу Денге, використовували рідке середовище 1Х СеїЇїмепіо "м СНО-220. - Для додаткового підживлення використовували живильний розчин А, живильний розчин В, живильний розчин С, живильний розчин О, вибрані з групи, що містить один або більше компонентів, вибраних із глюкози, добавки СеїЇ Воов5і м 5 (Нусіопе), ЕХ-СЕ!Ї. 293 (бідта Айапсн), добавок Сеї! Воові 7а і 75 (Нусіопе), ЗХ Асіїрго (Нусіопе), СеїЇ Мепіо 220 (ЗХ тедішт), ЕХ-СЕ ІФ
Адмапсеа м СНО Гееа 1. - РН культурального середовища підтримували на рівні від 6,7 до 7,5. - Осмоляльність культурального середовища підтримували на рівні « 490 мОсм/кг. - Вміст розчиненого кисню у культуральному середовищі підтримували на рівні від
Зо приблизно 20 95 до приблизно 40 95. - Температуру культурального середовища підтримували на рівні 36,5:0,5. - Збір клітин здійснювали при зменшенні кількості клітин до 60 95 Підживлення вводили у вигляді поступового крапельного вливання відповідно до наведеної нижче таблиці 1:
Таблиця 1
Протокол Основне Основне стратегії | Живильний | Живильний | Живильний | Живильний | середовище | середовище 2 підживлення| розчин А розчин В розчин С розчин О | 1 (ЗХ Асіїрго"| (СейПмепо тм
Доба Нусіопе СНнО-220 (З3Х)) пи и п ПО ПОЛЯ ПОН КОНЯ КО 1 21111111 4 11171112 8 Г1Г11Г11111111111111лов 74 | беж | («| яз» | 4» 5 ЇЇ .юЮюЮБрНКюрЮКрЮю7| б» | 49 | од | г (/ 76 | беж | 495 | 49 | дж 27771116 | 1111111171111111111171111111111111711в 8 | беж | (| 495 | 04» 7798 | 49 | 49 | 405 70 | ол | 295 | 49 | 4 711111 без | 296 | 295 | бат 712 77111111 4 Ї111117111Г1111ГЕч 713. | 096 | 295 | 29 | беж 2714 Ї77711111117113ю 11111711 215. 71711117 395 ЇЇ 1111171111171Ї1111111 ол
Результати і висновок:
Кількість життєздатних колоній і вихід процесу ферментації були такими, як наведено нижче:
Таблиця 2
Кількість життєздатних колоній і вихід процесу ферментації життєздатних колоній колоній 0.1 71111108 Її 77777111 081 ЇЇ 15111111 2 128 | 111111117111111115345000 |! 3 71117143 11111115 11 74 165 ї/!Ї (щЩДЩ(Ї 74 Її 51111784 11111111 г 76 | (лом 11054 | --.-.роюИнл55б | 063 2 Щ 78 17145 щЩщЦ | 1418 | 77771971 1290 8 11111717 17711162 | 77777171111865 |771176
Заявник виявив, що при застосуванні процесу культивування клітин, що містить основне живильне середовище, концентроване основне середовище як живильний розчин, використанні живильних розчинів у поєднанні з певною стратегією підживлення, можна досягти збільшення росту клітин, зниження концентрації лактату і аміаку, тим самим ефективно підтримуючи кількість клітин, підвищуючи довговічність клітин і забезпечуючи високий вихід. В процесі ферментації був досягнутий вихід вище 4 г/л. Зібрані клітини далі піддавали процесу виділення і очищення.
Приклад 2:
Клітини з культури, одержаної в прикладі 1, збирали і далі піддавали очищенню моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) за протоколом відповідно до Фіг. 1.
Нижче наведений детальний опис використаного процесу:
Афінна хроматографія на основі зв'язування з білком А:
На даній стадії цільові моноклональні антитіла відділяли від компонентів середовища в зібраній надосадовій рідині. Освітлену надосадову рідину пропускали через хроматографічну колонку, а потім елюювали з використанням придатних елюювальних буферів.
Використані матеріали:
Смола (матриця): Мар Зеїесі Зиге/Ехптипо А (афінність зв'язування з білком А)
Час утримування: 4,0-8,0 хвилин
Використана колонка: ХК 26
Урівноважувальний буфер: 20 мМ фосфатний буфер--150 мМ Масіч0,05 95 (в/об) полісорбат 80, рН 7,050,2.
Промивний буфер І: 20 мМ фосфатний буферн150 мМ Масіч0О,05 95 (в/об) полісорбат 80, рн 7,050,2.
Промивний буфер ІІ: 20 мМ фосфатний буфер-1ї М Масічн0,05 95 (в/0об) полісорбат 80, рн 7,050,2.
Промивний буфер ПП: 10 мМ фосфатний буферн125 мМ МасіІ--0,025 95 (в/об) полісорбат 80, рН 6,0-0,2.
Зо Елюювальний буфер: 20 мМ цитратний буфер-0,025 95 (в/об) полісорбат 80, рН 3,0--0,2.
Буфер СІР: 01 м Маон
Таблиця З
Використані параметри процесу о Фаженниня | оосбнюнни Гени 000106 00 дДЕлюювання.//.:/:////|Ї777777777171С1751171717171717171111111111111к3001 008000 |Зберталвня.//.:/: ЇЇ 777777777171С7л21111111111171|1111111111л«3001 1. Вірусна інактивація при низькому рН і. Елюат після афінної хроматографії на основі зв'язування з білком А піддавали впливу середовища з низьким рН, тобто 3,5:0,1, протягом 60-10 хвилин для інактивації вірусних частинок. і. Після витримки при низькому рН елюат нейтралізували з використанням нейтралізуючого буфера, тобто 1 М трис-цитратного буфера з рН 7,0:50,2. ії. Електропровідність нейтралізованого елюату регулювали з використанням води для ін'єкцій з 0,025 95 (в/об) полісорбату 80. 2. Катіонообмінна хроматографія
Позитивно заряджені молекули антитіл зв'язуються з колонкою, у той час як негативно заряджені молекули потрапляють в елюат. Зв'язані з колонкою молекули антитіл елююють з використанням сольового градієнта.
Використані матеріали:
Використана смола: Егасіоде! 503 / Егасіоде! 5Е Нісар (Мегск)
Час утримування: 4,00-7,00 хвилин
Використана колонка: ХК 26
Попереднє урівноваження: 200 мМ цитратний буфер с рН 6,0:0,2.
Урівноваження: 10 мМ цитратний буфер0,025 95 (в/об) полісорбат 80, рН 6,0:0,2.
Завантаження: Нейтралізація після витримки при низькому рн.
Промивний буфер А: 10 мм цитратний буфер з рН 6,0:0,2.
Промивний буфер В: 20 мМ цитратний буфер300 мМ масі, рН 6,002.
Буфер СІР: 0,5 М Маон
Буфер для зберігання: 0,1 М Маон
Таблиця 4
Параметри процесу ж | 00 стадяпоюу/ | ок ооусмюду 6 Моб 77777777777711111111111111111111121111111Ї11111111к3001
Таблиця 5
Збір фракцій при градієнті
Ме | ////// Назвафракцї | Критерізбору(Мад, моА./-/Г'
Аніонообмінна хроматографія:
Всі негативно заряджені домішкові частинки зв'язуються з мембраною, у той час як антитіла потрапляють в елюат.
Використані матеріали:
Використана мембрана/смола: Запобіпа О 5іпоаіє бер тіпі (Запогіив) / Еєптипо О
Об'єм завантаження: 150-1000 мг/мл
Використана колонка: ХК 26
Очисний буфер: 0,5 М Маон
Буфер для попереднього урівноваження: 200 мМ цитратний буфер з рН 6,0:0,2.
Урівноважувальний буфер: 20 мМ цитратний буфер з рН 6,0ж-0,2 і додатково 0,025 95 полісорбат 80 рН 6,050,2
Буфер для зберігання: 0,1 М маон
Таблиця 6
Параметри процесу ефренннння олнюнюннов | нене 006 Юбчищення.//////777777777777717117171111111111о1111Ї71111717171111л«3з001С 3. Нанофільтрація:
Для видалення будь-яких вірусних частинок, які могли бути присутніми у терапевтичному білку, використовували нанофільтр з розміром пор 20 нм, а саме Мігезоїме РКО (МегскК). 4. Тангенціальна потокова фільтрація/ультрафільтрація:
Антитіла концентрували до необхідної концентрації та замінювали буфер на одну з трьох буферних сумішей.
Використаний матеріал:
Буферна суміш: - Буфер 1: 25 мМ гістидинового буферан75 мМ аргінінового буферан75 мМ Масі, рн 6,5050,25; - Буфер 2: 25 мМ гістидину, 75 мМ аргініну, 101 мМ Масі; - Буфер 3: 25 мМ гістидину, 75 мМ аргініну, 75-101 мМ масі, 0,002 95 в/об полісорбат 80 - Очисний буфер: 0,5 М Маон Буфер для зберігання: 0,1 м маон
Зо Використана мембрана: РАЇЇ Сепігатайе серії Т, поліетерсульфонова мембрана з номінальним відсіканням за молекулярною масою: 30 кДа
Таблиця 7
Параметри процесу
Ме | Стадія процесу 0,5 М Маон З0-хвилинна циркуляція
Очищення водою для ін'єкцій до 2 Очищення водою для ін'єкцій | електропровідності нижче 1,3
МмкомМ/сМ 03 ЗУрівноваженняд///// | 40б0мл//////// 17777711 4 Концентрація і діафільтрація | -10-120об'ємівдіафільтрації | 003- пи Промивка водою для ін'єкцій,
Вода для ін'єкцій 1000 мл (6 о Очищення.//:/ | 0,5 М Маон 30-хвилинна циркуляція
Стерилізуюча фільтрація
У розчин антитіл додавали стабілізатор і здійснювали стерилізуючу фільтрацію через 5 фільтр з розміром пор 0,2 мкм.
Результати:
Ступінь вилучення різних стадій процесу очищення.
Таблиця 8 дини вн я 1 ЦАфінна хроматографія наосновізв'язуваннязбілюмА | 00098... | 993 чК«БЖ
Вірусна інактивація при низькому рН 2798 -
Катіонообмінна хроматографія 9011 99,52 4 |Аніонообмінна хроматографія 99,46
Нанофільтрація 00 Її - 6 |ТПФ/ультрафільтрація 7798 - 7 |Одержання композиції і стерилізуюча фільтрація во | 7 -
Встановлено, що загальна ступінь вилучення процесу становить -- 80 95, а загальна чистота - »99 95.
Таблиця 9
Данні домішок
Критерій прийнятності
Вміст мономера повинен становити »
Чистота, визначена ВЕЕХ (вміст| 90,00 95. Час утримування мономера о : 99,74 99,11 мономера, 95) повинен бути співставним з часом утримування стандартного зразка
Залишкова ДНК СНО (пг/мг тАБ) «2 пг/мг ЇДОЮ 0,005 0,004
Залишковий білок А (нг/мг тАб) « 10,00 нг/мг ІДС
Залишковий білок СНО (нг/мг тАБ) « 100,00 нг/мг ІДС
Ендотоксин (ОЄ/мг білка) х 0,1 ОЄЕ/мг білка
Таблиця 10
Постадійний вихід і чистота
Ме | Месерї | Ступінь вилучення (95) Чистота (96) 99,21 99,26
Приклад 3:
Очищені моноклональні антитіла до вірусу Денге (МІ5513) використовували для одержання композиції таким чином:
Допоміжні речовини, тобто аргінін, гістидин, Масі, сахарозу і полісорбат 80, додавали і ретельно перемішували з використанням магнітної мішалки при 50-60 об/хв до одержання суміші допоміжних речовин. Потім цю суміш поступово додавали в зібрані тАБб до вірусу Денге після ТПФ, продовжуючи перемішувати при 50-60 об/хв. Перевіряли рН (6,5) і при необхідності регулювали гістидин-аргініновим буфером. Кінцеву композицію фільтрували через фільтр з розміром пор 0,2 мкм і розфасовували в кінцеву упаковку.
Таблиця 11
Концентрація кожного компонента в кінцевій композиції
Маь до вірусу Денге (МІЗ513 101 мм 101 мм 101 мм 0,5 96 в/об 0,5 96 в/об 0,5 95 в/об
Полісорбат 80 0,02 95 в/об 0,02 95 в/об 0,02 95 в/об 6,5-0,5 6,540,5 6,5-0,5 380 мОсм/кг 380 мОсм/кг 380 мОсм/кг
Ці композиції далі аналізували на чистоту, стабільність, ефективність і активність протягом 9 місяців.
Приклад 4:
Вплив присутності сахарози у композиції антитіл до вірусу Денге МІЗ51О досліджували для аналізу активності з використанням ІФА до білка ЕС ОМ1 Дослідження композиції здійснювали при температурах 2-87С,25"С і 4076.
Результати:
Таблиця 12 1. Композиція антитіл до вірусу Денге МІ5513 без сахарози
Активність (95)порівняно зі стандартним зразком, що зберігався
Інгредієнт (кільк.) при 28 С реа Кт (25"С) 15 діб 30 діб 15 діб 30 діб
І -гістидин, 25 мМ
І -аргінін, 75 мМ
Хлорид натрію, 75 мМ 78,8 т32 79,8 53,8
Полісорбат 80, 0,02 95 в/об
Таблиця 13 2. Композиція антитіл до вірусу Денге МІ5513 з вмістом сахарози
Інгредієнт (кільк.) при28' с 90,5 86,3 94,6 81,6
Склад композиції стандартного зразка
Висновок: Додавання 0,595 в/об підвищує стабільність порівняно з відповідною точкою відбору зразків без сахарози.
Приклад 5:
Композицію антитіл МІЗ513 зберігали при 40 "С протягом 20 діб, після чого оцінювали активність МІЗ513 з використанням ІФА. Для композиції антитіл МІЗ513 досліджували вплив підвищення концентрації сахарози при 40 "С, причому оцінювали концентрацію сахарози 0,1 Фо, 0,29010,5 Фр.
Результати:
Таблиця 14
І що зберігався при 2-8 "С 53 В
Таблиця 15 " що зберігався при 2-8 7С 70,8
Таблиця 16 " що зберігався при 2-8 7С 65,7
Таблиця 17 . . Активність (95) порівняно зі стандартним зразком, 81,6
Склад композиції стандартного зразка
Висновок: Максимальна стабільність спостерігалась для композиції, що містить 0,595 сахарози.
Приклад 6:
Аналітичне дослідження чистоти, стабільності, ефективності і активності композиції моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІЗ513) за умов зберігання при 2-8 7С протягом 0 місяців, З місяців, 6 місяців і 9 місяців 25 "С протягом 0 діб і 30 діб 40 "С протягом 0 діб, 7 діб, 14 діб, 28 діб, 35 діб і 42 діб. 6.1: Активність композиції антитіл МІ5513 досліджували з використанням непрямого ІФА.
Для кількісного визначення зв'язування моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) з білком ЕОР антигену ЮОМ1 застосовували спосіб на основі непрямого ІФА. Білок ЕОІЇЇ імобілізували на пластині. Незв'язаний антиген видаляли шляхом промивання. На наступній стадії додавали стандартний і досліджуваний зразки та витримували для зв'язування з антигеном. Для визначення кількості зв'язаного ЮОм-Маб використовували мишачі антилюдські антитіла Ідс БЕс-НКР, специфічні до Ом-Мабр (Ес-фрагмент імуноглобуліну людини). Для кількісного визначення використовували субстрат для визначення пероксидази ТМВ Місгоучеє ЇЇ
Регохідазе Зибрвігаїє бЗузіет, який забезпечує кількісне визначення ступеня зв'язування за інтенсивністю забарвлення при довжині хвилі 450 нм. У програмному забезпеченні для аналізу даних будували криві зв'язування для кожного зразка з використанням чотирипараметричної моделі апроксимації кривої і порівнювали криву зв'язування досліджуваного зразка зі стандартною кривою шляхом розрахунку відносної активності. Активність досліджуваного зразка реєстрували в 9о щодо активності стандартного зразка (відносна активність, помножена на 100).
Результати:
Таблиця 18
Активність моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) (95) за даними непрямого ІФА композиції, яка зберігалась при 2-87 77711111 | Одоба | Змісяці | бмісяцв | Омісяців.9///
Таблиця 19
Активність моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) (95) за даними непрямого ІФА композиції, яка зберігалась при 257 нини т виш 30 діб 74,90 79,30 74,30
Таблиця 20
Активність моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІЗ513) (95) за даними непрямого ІФА композиції, яка зберігалась при 40 "С 777777 | Одоба | 4діб 21 доба 28 діб 35 діб 42 доби 82,80 96,20 71,80 89,70 90,80
Композиція моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІЗ513) не продемонструвала наявності залежної від часу втрати афінності зв'язування. 6.2: Аналіз РЕМТ для визначення ЕС5О
Цей аналіз включає попереднє змішування послідовно розведених антитіл з вірусом для забезпечення зв'язування з антитілами, нейтралізацію і перенесення суміші на моношар клітин
Веро, покриття шаром в'язкого середовища, інкубацію (- 3-7 діб залежно від серотипу вірусу) для забезпечення обмеженої реплікації і поширення вірусу та подальше виявлення бляшок.
Нейтралізацію визначали за зниженням утворення бляшок. Стале виявлення досягалося при використанні методів імунозафарбовування із застосуванням антитіл до вірусу Денге 4с2 і
НАР-мічених козячих антимишачих антитіл з субстратом пероксидази.
Зразки композиції моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) досліджували відносно всіх чотирьох серотипів вірусів Денге, тобто ЮМ1, БМ2, ВУЗ ії ОМ4. Для нейтралізації вірусів
Денге розраховували значення ЕС5О. Значення ЕС50О являє собою 5095 ефективної концентрації, необхідної для ефективної нейтралізації вірусів Денге, значення ЕС5О0 розраховували за кількістю бляшок в контрольних комірках з вірусом і кількістю бляшок у комірках, в яких були додані інкубовані зразки таб-вірусу.
Результати:
Таблиця 21
Значення ЕС5О (нг/мл) моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) за результатами аналізу РЕМТ для композиції, що зберігалась при 2-87 - Серотипи г, с, 2, 47,15 49,74 23,88 2412 сСебія 1
Р 14,38 1471 30,29 50,75 23,96 23,35 21,03 21,01 16,12 29,41
Серія 2
Р 13,19 2414 22,46 22,44 16,61 19,56
Таблиця 22
Значення ЕС5О (нг/мл) моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) за результатами аналізу РЕМТ для композиції, що зберігалась при 257
Серотипи вірусів Денге 475 29,82 себя 1
Р 14,38 30,29 35,28 21,03 28,34
Серія 2
Р 13,19 22,46 30,69
Таблиця 23
Значення ЕС5О (нг/мл) моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) за результатами аналізу РЕМТ для композиції, що зберігалась при 40 С
Серотипи вірусів Денге ОМ2 111111 бдоба//////// 177777 666
Серія 1 26,89 3612
Композиція моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІЗ513) не продемонструвала наявності залежної від часу втрати ефективності нейтралізації вірусу при 2-8 7С і 25 "С. Навіть в разі зберігання при 40 "С композиція МІ5513 не втрачає здатність до нейтралізації вірусу Денге. 6.3: Аналіз агрегації і чистоти
Для оцінки агрегатів у нерозфасованій і кінцевій композиції моноклональних антитіл до вірусу Денге використовували ексклюзійну високоефективну рідинну хроматографію (ексклюзійну ВЕРХ). В даному способі використовували колонку Рпепотепех Віо-б5ес-5 3000 для демонстрації процентного вмісту агрегатів і мономера моноклональних антитіл до вірусу
Денге (МІЗ513) шляхом введення загальної кількості антитіл - 50 мкг ії хроматографування з витратою 1 мл/хв протягом 35 хвилин. Як рухому фазу використовували фосфатно-сольовий буфер (ФСБ) з рН 6,5.
Результати: Ексклюзійна ВЕРХ (діапазон прийнятних значень - не нижче 90 95)
Таблиця 24
Аналіз ексклюзійної ВЕРХ для композиції, що зберігалась при 2-87 77771111 | Одоба | Змісяці | бмісяцв | Омісяців./ 99,21 98,60 99,14 98,55 99,26 98,81 98,89 98,53
Таблиця 25
Аналіз ексклюзійної ВЕРХ для композиції, що зберігалась при 25 С 010771111111111одоба7///// | 77777717 Збдіб////////С 99,21 97,63 99,26 97,58
Таблиця 26
Аналіз ексклюзійної ВЕРХ для композиції, що зберігалась при 40 С 7.7. | Одоба | 7діб | Ч4діб | 2ідоба | 28діб | З5діб | 42доби
Композиція моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІЗ513) не продемонструвала наявності значної агрегації, залежної від часу, а чистота / вміст мономера становили » 98 об.
Приклад 7:
Вплив концентрацій поверхнево-активних речовин у складі композицій:
Вплив концентрації поверхнево-активної речовини оцінювали шляхом аналізу невидимих частинок. Готували композиції з різними концентраціями полісорбату 80, які досліджували з використанням аналізу невидимих частинок.
Таблиця 27 о» ломкм/// ЇЇ 77777176 Ї1711111117116 11111112 о »оабмим/// ЇЇ 7711111171Ї111111171111171Ї1111110
Висновок:
У композиції, що містить 0,005 95 в/об полісорбату 80, спостерігався мінімальний вміст невидимих частинок. Залежно від дозування, якщо потрібне розведення композиції, остаточно прийнята концентрація полісорбату 80 становить 0,02 95 в/об з 4-кратним запасом.
Приклад 8: Дослідження для визначення мінімальної концентрації використовуваних стабілізаторів
Із доступної літератури була визначена мінімально необхідна буферна сила (10-30 мМ). Для визначення мінімальної кількості аргініну (використовуваного як солюбілізувальна речовина і речовина, яка знижує в'язкість) для зразка моноклональних антитіл буфер замінювали на фізіологічний розчин і поступово додавали основний розчин аргініну (300 мМ). Агрегацію в розчині контролювали шляхом вимірювання оптичної щільності при 350 нм. Розчин з 75 мМ аргініну забезпечував найнижчу оптичну щільність, в зв'язку з чим остаточно була прийнята концентрація аргініну 75 мМ.
Приклад 8
Дослідження в'язкості композиції антитіл до вірусу Денге (МІ5513) В'язкість зразків моноклональних антитіл до вірусу Денге вимірювали на мікропроцесорному віскозиметрі моделі тісгоМІЗ5СТМ (марка Кпеозепзе, Каліфорнія, США) відповідно до процедури, зазначеної у керівництві з експлуатації приладу.
Таблиця 28 25 с1111111111111111111л1лвя1
Висновок:
Залежне від часу збільшення в'язкості не спостерігалося для композиції моноклональних антитіл, що зберігалася при 2-8 С протягом 90 діб, а також для зразка, що зберігався при 25 С протягом 1 місяця, це пов'язано перш за все з наявністю допоміжної речовини - 75 мМ аргініну.
В'язкість нашої композиції становила 1,1-1,2 мПа-с/ сПз, що нижче, ніж в'язкість інших доступних у продажу композицій, яка становить 11-50мПа-с/сП3з.
Приклад 9: Дослідження процесу очищення моноклональних антитіл до вірусу Денге (МІ5513) із додаванням вірусу
Для фактичного виробничого процесу виконували валідаційні дослідження на віруси для перевірки ефективності видалення вірусів шляхом фільтрації з метою зниження вірусного навантаження в процесі виробництва моноклональних антитіл.
Як модельні мікроорганізми використовували вірус лейкемії мишей (Ми М) і дрібний вірус мишей (МММ/ММУМ). Автори винаходу порівнювали можливості процесу очищення згідно з винаходом із розповсюдженим і загальновизнаним способом очищення моноклональних антитіл.
Розповсюджений і загальновизнаний спосіб очищення моноклональних антитіл включав афінну хроматографію на основі зв'язування з білком А (смола СЕ); обробку при низькому рі; хроматографію Загпобіпа о (одноразова аніонообмінна мембрана Загіогіи5); хроматографію з феніловою фазою Загпобіпа (одноразова хроматографічна мембрана Загіогіи5); фільтрацію через фільтр МігезоїЇме Рго (нанофільтрація, МегскК).
Таблиця 29
Результати: Процес очищення 5ІІРІ. забезпечував високу ефективність видалення вірусів з досягненням загального І КМ відповідно до вимог інструкцій ІСН (КМ стандартного процесу - 12,64, процесу даного винаходу ЗІІРІ-23,74). Було встановлено, що антитіла до вірусу Денге, очищені з використанням процесу згідно з винаходом, придатні для клінічних досліджень на людях без ризику вірусного зараження.
Приклад 10: Процес нарощування біомаси для культивування клітин та експресії терапевтичного білка, тобто моноклональних антитіл до вірусу сказу
Протокол:
Культивування клітин в масштабі 2 л здійснювали в періодичному режимі з підживленням з використанням зазначених нижче параметрів процесу ферментації / нарощування біомаси. - Моноклональні антитіла до вірусу сказу експресували в клітинній лінії (35 - СНО. - Як середовище для культивування клітин, використовуване для вирощування клітин та експресії терапевтичного білка, тобто моноклональних антитіл до вірусу сказу, використовували
Зо рідке середовище 1Х СейЙмепіо "м СНО-220 І їдцід Меаічт або Асіїрго їх (Нусіопе). - Для додаткового підживлення використовували живильний розчин А, живильний розчин В, живильний розчин С, живильний розчин О, вибрані з групи, що містить один або більше компонентів, вибраних із глюкози, добавки СеїЇ Воов5і м 5 (Нусіопе), ЕХ-СЕЇ!Ї. 293 (бідта Айапсн), добавок Сеї| Воові 7а і 75 (Нусіопе), ЗХ Асіїрго (Нусіопе), СеїЇ Мепіо 220 (1Х тедішт), ЕХ-СЕГ (Ф
Адмапсей м СНО Гееа. - РН культурального середовища підтримували на рівні від 6,7 до 7,5. - Осмоляльність культурального середовища підтримували на рівні 270-450 мОсм/кг. - Вміст розчиненого кисню у культуральному середовищі підтримували на рівні від приблизно 20 95 до приблизно 60 95. - Температуру культурального середовища підтримували на рівні 36,5:-1.
Підживлення вводили у вигляді поступового крапельного вливання відповідно до наведеної нижче таблиці:
Таблиця 30
Основне Основне
Доба Живильний | Живильний | Живильний | Живильний | середовище |середовище 2 розчин А розчин В розчин С розчин О | 1 (ЗХ Асіїрго"| (СейПмепо тм
Нусіопе СснОо-220 1Х пи и п ПО ПООЯ КОНЯ КОНЯ КО и: п я ПО ПОЛЯ ПОЛЯ КОНЯ КО 21111114 11111711 95 | беж | (Її 71 7111171Ї11111111171ї1 77477711 аз | 0496 | лов | 89 2 | юЮБ..ЙМ | б» | 495 | 04» 6 | без | 496 | 495 | 04» 27 Ї71111111711бж 11111711 8 | бат | (| 495 | 04» 7798... | 4» | 495 | 409 70 | ол | 26 | 4956 | 0495 711171 баб | 2 | 296 | беж 712 71111111 аж 11171111 713 | обл | 26 | 296 | беж 27147 17711111111711з3ж 11111111 215 71111111 11111111 ол
Примітка: Для всіх живильних розчинів можливі зміни в межах! 95 об'єму ії-1 доба.
Збір клітин проводили при зниженні оптичної щільності до 60 95
Результати і висновок: 5 Вихід процесу ферментації становив 3-5 г/л. Зібрані клітини далі піддавали процесу виділення і очищення.
Приклад 11:
Клітини з культури, одержаної в прикладі 9, збирали і далі піддавали очищенню моноклональних антитіл до вірусу сказу за протоколом відповідно до фіг. 1.
Нижче наведений детальний опис використаного процесу:
Афінна хроматографія на основі зв'язування з білком А:
На даній стадії цільові моноклональні антитіла відділяли від компонентів середовища в зібраній надосадовій рідині. Освітлену надосадову рідину пропускали через хроматографічну колонку, а потім елюювали з використанням придатних елюювальних буферів.
Використані матеріали:
Смола (матриця): Мар Зеїесі Зиге/Ехптипо А (афінність зв'язування з білком А)
Час утримування: 4,0-8,0 хвилин
Використана колонка: ХК 26
Урівноважувальний буфер: 20 мМ фосфатний буфер--150 мМ Масіч0,05 95 (в/об) полісорбат 80, рН 7,050,2.
Промивний буфер І: 20 мМ фосфатний буферн150 мМ Масіч0О,05 95 (в/об) полісорбат 80, рн 7,050,2.
Промивний буфер ІІ: 20 мМ фосфатний буфер-1ї М Масічн0,05 95 (в/0об) полісорбат 80, рн 7,050,2.
Промивний буфер ПП: 10 мМ фосфатний буферн125 мМ Масін0,025 95 (в/об) полісорбат 80, рН 6,0-0,2.
Елюювальний буфер: 20 мМ цитратний буфер--0,025 95 (в/об) полісорбат 80, рН 3,0:0,2.
Буфер СІР: 01 м Маон
Використані параметри процесу:
Зо
Таблиця 31 жо | сталяпроцеу | Оссиютни ЛЮД 11101016 дЕплюювання/:// |. 77777775 Ї111111111300С1С 1110108 |Збергтання///// | 77777172 Ї711111111«3001С 1. Вірусна інактивація при низькому рН і. Елюат після афінної хроматографії на основі зв'язування з білком А піддавали впливу середовища з низьким рН, тобто 3,5:0,1, протягом 60-10 хвилин для інактивації вірусних частинок. і. Після витримки при низькому рН елюат нейтралізували з використанням нейтралізуючого буфера, тобто 1 М трис-цитратного буфера з рН 7,0:20,2. Потім нейтралізований розчин фільтрували з використанням фільтрів з розміром пор 0,8/0,45 мкм або 0,8/0,2 мкм. ії. Електропровідність нейтралізованого елюату регулювали з використанням води для ін'єкцій з 0,025 95 (в/об) полісорбату 80. 2. Катіонообмінна хроматографія
Позитивно заряджені молекули антитіл зв'язуються з колонкою, у той час як негативно заряджені молекули потрапляють в елюат. Зв'язані з колонкою молекули антитіл елююють з використанням сольового градієнта.
Використані матеріали:
Використана смола: Егасіоде! 503 / Егасіодеї! ЗЕ Нісар (Мегск)
Час утримування: 4,00-7,00 хвилин
Використана колонка: ХК 26
Попереднє урівноваження: 200 мМ цитратний буфер с рН 6,0:0,2.
Урівноваження: 10 мМ цитратний буфер-О,025 95 (в/0б) полісорбат 80, рН 6,002.
Завантаження: Нейтралізація після витримки при низькому рн.
Промивний буфер А: 10 мм цитратний буфер з рН 6,0:0,2.
Промивний буфер В: 20 мМ цитратний буфер300 мМ масі, рН 6,0:0,2.
Буфер СІР: 0,5 М Маон
Буфер для зберігання: 20 95 етанолун150 мМ Масі
Таблиця 32
Параметри процесу . Лінійна швидкість ж |00стлялюеу | ок у смюду 1176 лоб 777777771111111111111Ї1111111211111111111111111к300С1С
Таблиця 33
Збір фракцій при градієнті
Ме | 0 Назвафракцї | Критерізбору(ЮМад моА/-/З
Аніонообмінна хроматографія:
Всі негативно заряджені домішкові частинки зв'язуються з мембраною, у той час як антитіла потрапляють в елюат.
Використані матеріали:
Використана мембрана/смола: Запобіпа О 5іпоаіє бер тіпі (Запогіив) / Еєптипо О
Об'єм завантаження: 150-1000 мг/мл
Використана колонка: ХК 26
Очисний буфер: 0,5 М Маон
Буфер для попереднього урівноваження: 200 мМ цитратний буфер з рН 6,0-0,2.
Урівноважувальний буфер: 20 мМ цитратний буфер з рН 6,0ж-0,2 і додатково 0,025 95 полісорбат 80 рН 6,0-0,2
Буфер для зберігання: 20 95 етанолуд150 мМ Масі або 0,1 м маон
Таблиця 34
Параметри процесу . ' Лінійна швидкість потоку мо | 000 стдяпроцеу Обсмюлониою Леди 006 0 Очищення.//////7777777777777717171711111111о11Ї7111171111111л«30011С 3. Нанофільтрація:
Для видалення будь-яких вірусних частинок, які могли бути присутніми у терапевтичному білку, використовували нанофільтр з розміром пор 20 нм, а саме Мігезоїме РКО (МегскК). 4. Тангенціальна потокова фільтрація/ультрафільтрація:
Антитіла концентрували до необхідної концентрації та замінювали буфер на одну з трьох буферних сумішей.
Використаний матеріал:
Буферна суміш: - Буфер 1: 25 мМ гістидинового буферан75 мМ аргінінового буферан75 мМ Масі, рн 6,5050,25; - Буфер 2: 25 мМ гістидину, 75 мМ аргініну, 101 мм масі;
Зо - Буфер 3: 25 мМ гістидину, 75 мМ аргініну, 75-101 мМ Масі, 0,002 95 в/об полісорбату 80 - Очисний буфер: 0,5 М Маон
Буфер для зберігання: 20 95 етанолуд150 мМ Масі або 0,1 м маон
Використана мембрана: РАЇЇ Сепігатайе серії Т, поліеєтерсульфонова мембрана з номінальним відсіканням за молекулярною масою: 30 кДа
Таблиця 35
Параметри процесу
Ме | Стадія процесу 0,5 М Маон З0-хвилинна циркуляція
Очищення водою для ін'єкцій до 2 |Очищення водою для ін'єкцій електропровідності нижче 1,3
МмкомМ/сМ
ОЗ ЗУрівноваження.д//-/://./// | 7 4б0бмл////// | 77777777 -11СсС1С
Концентрація і діафільтрація -10-120об'ємівдіафільтрації ся Промивка водою для ін'єкцій, |Вода для ін'єкцій 1000 мл 6 |Очищення.//-/:/К/://40/С/С | 0,5 М Маон 30-хвилинна циркуляція
Стерилізуюча фільтрація
У розчин антитіл додавали стабілізатор і здійснювали стерилізуючу фільтрацію через 5 фільтр з розміром пор 0,2 мкм.
Результати:
Таблиця 36
Ступінь вилучення різних стадій процесу очищення
Ме | 77717171 Стадія | Ступіньвилучення (90)" 0001000 Афінна хроматографія на основі зв'язування з білком А 2 |Вірусна інактивація при низькому рН 12198
З |Катіонообмінна хроматографія 4 |Аніонообмінна хроматографія 5 |Нанофільтрація 6 |ТПФ/ультрафільтрація 202198 0007 Одержання композиції і стерилізуюча фільтрація
Встановлено, що загальна ступінь вилучення процесу становить » 80 95.
Таблиця 37
Данні домішок
Критерій прийнятності
Концентрація, визначена ОМ280 (мг/мл) 12619 24,39
Вміст мономера повинен становити » 90,00 95. Час
Чистота, визначена ексклюзійною ВЕРХ (вмісті утримування мономера 100 100 мономера, 95) повинен бути співставним з часом утримування стандартного зразка
ДСН-ПААГурзневідновлювальнихумовах(юДа)| /00001101156,0 156,0
ДСН-ПААГувідновлювальнихумовах(юДа) | 00000011 150,4/27,7 | 50,7/27,9
Залишкова ДНК СНО (пг/мг тАб) « 2 пг/мг ЇД9О
Залишковий білок А (нг/мг тАб) « 10,00 нг/мг Ї9О
Залишковий білок СНО (нг/мг тАб) « 100,00 нг/мг ІДС
Бактеріальний ендотоксин (ОЄЕ/мг білка) х 0,1 ОЕ/мг білка
Таблиця 38
Постадійний вихід і чистота
Ме | о Месерї | Ступіньвилучення(9)0| Чистота (95) 721 Ї7771717171717171717111беря2,///// |1777771717117807111711171111111996 2
Встановлено, що загальна чистота моноклональних антитіл до вірусу сказу становить » 99 95, а загальна ступінь вилучення - »80 95.
Приклад 12:
Очищені моноклональні антитіла до вірусу сказу використовували для одержання композиції відповідно до блок-схеми, наведеної на фіг. 2.
Допоміжні речовини, тобто аргінін, гістидин, Масі, сахарозу і полісорбат 80, додавали і ретельно перемішували з використанням магнітної мішалки при 50-60 об/хв до одержання суміші допоміжних речовин. Потім цю суміш поступово додавали в зібрані тАБб до вірусу Денге після ТПФ, продовжуючи перемішувати при 50-60 об/хв. Перевіряли рН (6,5) і при необхідності регулювали гістидин-аргініновим буфером. Кінцеву композицію фільтрували через фільтр з розміром пор 0,2 мкм і розфасовували в кінцеву упаковку.
Таблиця 39
Концентрація кожного компонента в кінцевій композиції
Маб до вірусу сказу
Хлорид натрію 101 мм 101 мм 101 мм 0,5 965 в/об 0,5 95 в/об 0,5 95 в/об
Полісорбат 80 0,02 95 в/об 0,02 95 в/об 0,02 95 в/об 6,5-0,5 6,5-0,5 6,5-0,5 386 мОсм/кг 386 мОсм/кг 386 мОсм/кг
Ці композиції далі аналізували на чистоту, стабільність, ефективність і активність протягом 9 місяців.
Приклад 13: Аналітичні дослідження на чистоту і стабільність композиції моноклональних антитіл до вірусу сказу в умовах зберігання при 2-8, 25 і 40 "С протягом 0 місяців, 1 місяця, З місяців і 6 місяців. 13.1 Аналіз агрегації і чистоти
Для оцінки агрегатів у нерозфасованій і кінцевій композиції моноклональних антитіл до вірусу Денге використовували ексклюзійну високоефективну рідинну хроматографію (ексклюзійну ВЕРХ). В даному способі використовували колонку Рпепотепех Віо-5ес-5 3000 для демонстрації процентного вмісту агрегатів і мономера моноклональних антитіл до вірусу сказу шляхом введення загальної кількості антитіл - 50 мкг і хроматографування з витратою 1 мл/хв протягом 35 хвилин. Як рухому фазу використовували фосфатно-сольовий буфер (ФСБ) з рн 6,5.
Результати:
Таблиця 40
Результати ексклюзійної ВЕРХ (95) 99,70 99,40 99,60 99,60 5 з92о(діб) | (- | -
Композиція моноклональних антитіл до вірусу сказу не продемонструвала наявності агрегації, залежної від часу, а чистота / вміст мономера становили » 99 95.
Таблиця 41 13.2 Аналіз ДСН-ПААГ, серія 1 -досліджуваний зразок при 2-87 100100 одоса | оду, моні емоцію
ДСН-ПААГ у Важкий відновлювальних умовах | Досліджуваний ланцюг 50,8 49,8 49,3 49,2 (кДа) Молекулярна маса |зразок при 2-8 С| Легкий важких і легких ланцюгів ланцюг 25,6 257 25,6 264 повинна бути в межах Важкий стандартного зразка. Станда .
Загальний вміст важких і т пово л - легких ланцюгів повинен разок егкии 25 25 25 25 становити 295 95. панцюг
Загальний вміст, 95: 100 невідновлювальних с 151,0 156,7 157,2 157,6 умовах (кДа) С3З - стандартний зразок
Молекулярна маса основної смуги повинна Стандартний зразок 150 150 150 150 бути в межах 510 95 молекулярної маси стандартного зразка (С3).
Досліджуваний зразок при 2570 11111111 одоба.// | 30 діб
ДСН-ПААГ у Важкий відновлювальних Досліджуваний ланцюг 50,8 47,5 умовах (кДа) зразок при 25"7С Легкий
Молекулярна маса ланцюг 25,6 295,5 важких і легких Важкий 0 0 ланцюгів повинна бути в ланцюг 95 95 межах х-10 95 молекулярної маси стандартного зразка. Стандартний
Загальний вміст важких зразок Легкий 25 25 і легких ланцюгів ланцюг повинен становити »95 95. Загальний вміст,
Ус: 100
ДСН-ПААГ у не Досліджуваний зразок при 15130 151 6 відновлювальних 2576 " " умовах (кДа) С3З - стандартний зразок
Молекулярна маса основної смуги повинна - бути в межах 210 95 Стандартний зразок 150 150 молекулярної маси стандартного зразка (С3).
Висновок: Композиція моноклональних антитіл до вірусу сказу не показала наявності суттєвих змін агрегації і молекулярної маси, залежних від часу. Таким чином, встановлено, що композиція зберігає стабільність при 2-8 "С, 25 С і 40 "С. зеч 10 1: ХЖН амінокислотна послідовність 13513 (мовоклональне антибіпе Ддевге)
ОУОСУСНОАЕУККРОАВУКУВСКАВЕМІКИЧУМОМУВОДРЕОСТЕКМОВІЮРЕМСЮТКХР: 0
РКБОСВУТМТАОТЕРНТАХМЕКВІКООИТАТУУСАНОМХКЕОКАТИСОсСТОУТУвВАЕТИ БО
РЕУКРІВРЕВКБІВОЗТААБОСІУКОХЕРЕРУТУВИНІОВЬТВСУВТЕРАУрОВОСЬТЯЬ 180
ЗБУУТУРЕВБІОТОБКЖТСМУМНКРВНТКУРКВУКЕРЕВСОКТНТСРРСРАРЕБОССРЕМЕЬ ВО
ЕРЕКРЕОТЬМІСЕТРЕУТСОМУУВУБНЕОРЕМКЕНИУУПСУЕХНМАКТКРНЕВОХМЕТУВУ 500
БИТВИ МОКВУКСКУВМКАРВРІЕКТІВКАКООРВЕРОСЖУТЕРРОВЕЕМТКМО ЗБ
УКОТСГУКОКХРІОІАХЕЧЕВМОСРЕМКУКТТВРУБрВООВЕВІХКеТУрКИВКООСсММ 42 тБОБУМНЕВТНКНУТОКОоВЬОВОК 845 хе(ї Ж й: ЗІ амінокисногна послпіудовність ЗГБЗЕЗ імевокланальне антитілб денте)
ПЕЧМТОЗЕАВТЛУВІОКВАТІВСВАБЕМУрКУОМЕКМНЕ У ОКРООРРКЕТУВАБЕРОЮ БО
ПУВОКЕВОВОДОТОЕТТІЗВБОАЕрУАУХУСОНВМЕУ РТС БЕТКАТУААРОУК 190
ІЕРБАЗПЕОЬКОСТАБУМСЬСКМЕХВЕВЕАКУОНКУрМАТОВОМООВЕУТЕОООоКОЕТУєЬВ 180
ЗТЕТЕЗКАСУЕЕНКУХАСЕУТНОСІВВРУТКВЕМАОВО 218 цей Ї0 З: бт1 род о (ВАВ11 11727) дмінокислотвна послідовність важкого павцека
ОУСТУКВОПОУЧОрОВЕМВІОСААОЕТЕВТУАМНИУВОдРОоКОТ ККУ роВтТКоУ БО
АПБУКОВЕТІВВОМОКМТИХСОМИБЬВІВОТАУЖЕСАВЕВРЕСАХКОХШООСТЬУТМвяА 120
ЗТКОСРЧУКРЬАРЗЕКОТООТААрОСЬУКОУЕРЕРУТУВИМООВБТБОУНТЕРАМТОВВЕ. 180
ГУБІ ТУРЕВОСТОТХІСМУМНЕРОМІКУОКЕУЮРКЗСВЕТНТОВЕСВАВБІОЯР 949
ЗУКБЕРРЕРЕОСТІМІЗНІРЕУТСУУУВУВНЕОВВУКиМИУУроУВУНМНАКТКРНИЕЕОТМВ 300
ТЕВуУВУТУрвОрМЬМсКЕТКСКУЗВКАНРАРІВКТІЕКАКООРВЕРОУХТТУВЕНЕЕМ 360
ТЕНОУБОТСБУКаТУКНО АВМ КБОРЕННУКТТРРУТГОВООВККЬУВКИТУВКОВНО 520
ОСМУКВСЕУМНЕАЛЬНИНУТОКВОЗраРОК 449 зе Її о 4: БІ ВМАБ (ВАБІБІЇСТ)у бмінокислетвна нослідсвнесть петкслво ланцюка
ЕТУБТОЗРАТЬБОРОЕВАТІВСВАВОВУВИХУБАМООКРООАРЕСЬІУОДЯМВАТСТВА 50
ВЕБОЕОВСТрЕТІ ТТБ ЕРЕОКАУХВОСООВММИКРІЖОбОСТКУКІВВТИАВРяУМКІК 150
ТРОПЕОСКЕОТАВУЄСІІММКУРНЕАКУИНКУЮМАБОВОМООВЗУТКОрЯКОВТУчвОоВТ 189
ІТББКАБУВКНЕУУАСЕУТНОСЬВБЕУТЕВЕМВоОВОС о

Claims (34)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб одержання фармацевтичного антигензв'язуючого білка з високим виходом і мінімальною агрегацією, в якому антигензв'язуючий білок являє собою моноклональне антитіло до вірусу денге з БЕО ІЮ МО: 1 і ЗЕО ІЮ МО: 2 або моноклональне антитіло до вірусу сказу з ЗЕО ІЮ МО: З і 5ЕО ІЮ МО: 4, що включає: а) культивування у великих масштабах клітин ссавців, які експресують антигензв'язуючий білок, у середовищі для культивування клітин, при цьому в процесі культивування клітин ефективно підтримують кількість клітин у діапазоні 10х106-20х105 клітин/мл і забезпечують вихід щонайменше 2 г/л, при цьому, коли антигензв'язуючий білок являє собою моноклональне антитіло до вірусу денге, клітинна лінія являє собою СНО-КІ 5М (05-КО, а коли антигензв'язуючий білок являє собою моноклональне антитіло до вірусу сказу, клітинна лінія являє собою 55-СНО, при цьому процес культивування клітин включає використання основного живильного середовища, використання концентрованого основного середовища як живильного розчину, використання різних живильних розчинів у поєднанні з певною стратегією підживлення, що забезпечує підвищений ріст клітин, підтримання зниженої концентрації лактату і аміаку, ефективне підтримання кількості клітин, тим самим підвищення довговічності клітин і забезпечення їх високого виходу, р) очищення антигензв'язуючого білка із зібраної надосадової рідини, одержаної на стадії (а), в якому процес забезпечує ступінь вилучення щонайменше 80 95, чистоту щонайменше 99 95, при цьому процес очищення включає афінну хроматографію, вірусну інактивацію при низькому рн, аніонообмінну хроматографію, катіонообмінну хроматографію, нанофільтрацію, тангенціальну потокову фільтрацію/ультрафільтрацію в послідовному порядку, причому матрицею для афінної хроматографії є білок А, а концентрація солей в буферах, використовуваних для очищення, знаходиться в діапазоні 30-500 мМ, і с) приготування стабільної композиції, в якій осмоляльність знаходиться в діапазоні 300-400 мОсм/кг, а в'язкість становить менше 2,5 мПа-с, причому композиція містить щонайменше один антигензв'язуючий білок, щонайменше один стабілізатор, щонайменше один буфер, щонайменше одну речовину, що регулює тонічність, і щонайменше одну поверхнево-активну Зо речовину, при цьому композиція містить: а) 1-100 мг/мл щонайменше одного антигензв'язуючого білка; р) 20-40 мМ гістидину; с) 50-100 мМ аргініну; а) 0,002-0,02 95 (в/о6.) полісорбату-80; е) 50-150 мМ масі; У 0,1-2,5 95 (в/о0б.) сахарози; в якій рН композиції становить 6,520,5 і композиція зберігає стабільність при 2-8 "С протягом щонайменше 9 місяців, при 25 "С протягом щонайменше 1 місяця, при 40 "С протягом щонайменше 40 діб, при 50 "С протягом щонайменше 2 діб.
2. Спосіб за п. 1, в якому у середовище для культивування клітин додають одну або більше інших живильних речовин щонайменше один раз в ході процесу.
3. Спосіб за п. 1, в якому у середовище для культивування клітин вводять добавки за графіком, який включає додавання у безперервному режимі, щодня, через добу, через дві доби і їх комбінації.
4. Спосіб за п. 1, в якому середовище для культивування клітин має осмоляльність у діапазоні 250-500 мОсм/кг; рН - у діапазоні 6,5-7,5; вміст розчиненого кисню підтримується в діапазоні 10- 60 95; температура культури клітин знаходиться в діапазоні від ЗО до 38 "С; перша температура переважно становить 36-37 "С і в деяких випадках друга температура переважно становить 30- 35 "С; концентрація глюкози підтримується на рівні нижче 7 90; переважно від 4 до 5 95; збір клітин здійснюється при зниженні життєздатності до 80 90; умови культивування клітин підтримуються таким чином, що концентрація вторинних метаболітів, таких як лактат, не перевищує 5 г/л, а концентрація аміаку не перевищує 5 ммоль/л.
5. Спосіб за п. 4, в якому осмоляльність культурального середовища становить 400-500 МО см/кг.
6. Спосіб за п. 1, в якому вміст розчиненого кисню у культуральному середовищі підтримують у діапазоні 20-40 95.
7. Спосіб за п. 1, в якому клітини культивують у періодичному, періодичному з підживленням, безперервному режимі, перфузійному режимі, більш конкретно у періодичному режимі з підживленням.
8. Спосіб за п. 1, в якому концентрація солей в буферах, використовуваних для очищення, знаходиться в діапазоні 50-300 мМ.
9. Спосіб за п. 1, який включає додаткову стадію хроматографії, вибрану з групи, що містить одну або більше хроматографій, вибраних із хроматографії гідрофобної взаємодії, гідрофобної хроматографії з індукуванням заряду, хроматографії з керамічним гідроксіапатитом, мультимодальної хроматографії, мембранної хроматографії.
10. Спосіб за п. 1, в якому хроматографія білка А включає: а) урівноважувальний буфер: 20 мМ фосфатний буфер; 100-150 мМ Масі; 0,05 95 полісорбат-80; рН 7,050,2; р) завантаження: очищені зібрані клітини; с) промивний буфер І: 20 мМ фосфатний буфер; 100-150 мМ Масі, більш конкретно 150 мМ; 0,05 95 полісорбат-80; рН 7,0:50,2; а) промивний буфер ІІ: 20 мМ фосфатний буфер; 250 мМ-1 М Масі, більш конкретно 1 М; 0,05 95 полісорбат-80; рН 7,050,2; е) промивний буфер І: 10 мМ фосфатний буфер; 100-150 мМ Масі, більш конкретно 125 мМ; 0,05 95 полісорбат-80; рН 7,0:50,2; І елюювальний буфер: 20 мМ цитратний буфер; рН 3,0:20,2 і додатково 0,025 95 (в/об.) полісорбат-80; 9) буфер СІР: 0,1 М Маон; І) час утримування: 4,00-8,00 хвилин; ї) використана колонка: ХК26; Ї) лінійна швидкість потоку становить 10-500 см/год, більш конкретно 100-150 см/год.
11. Спосіб за п. 1, в якому вірусну інактивацію елюату після афінної хроматографії з білком А досягають шляхом витримки елюату при рН 3,3-3,5 протягом 50-100 хвилин.
12. Спосіб за п. 1, в якому катіонообмінну хроматографію здійснюють з використанням смоли, вибраної з групи, що включає одну або більше груп на основі сульфонату, групи на основі сульфоетилу, групи на основі сульфопропілу, групи на основі сульфоізобутилу, групи на основі сульфоксієтилу, групи на основі карбоксиметилу, групи на основі сульфонової і карбонової кислот, групи на основі карбонової кислоти, групи на основі сульфонової кислоти і групи на Зо основі ортофосфату.
13. Спосіб за п. 1, в якому катіонообмінна хроматографія включає: а) буфер для попереднього урівноваження: 200 мМ цитратний буфер; рН 6,0:50,2; Б) урівноважувальний буфер: 10 мМ цитратний буфер; 0,025 95 (в/об.) полісорбат-80;. рн 6,0-0,2; с) промивний буфер А: 10 мМ цитратний буфер; рН 6,050,2; а) промивний буфер В: 20 мМ цитратний буфер; 300-500 мМ Масі; рН 6,0-0,2; е) буфер СІР: 0,5 М Ман; І) час утримування: 4,00-7,00 хвилин; 9) використана колонка: ХК26.
14. Спосіб за п. 1, в якому аніонообмінна хроматографія включає: а) очисний буфер: 0,5 М Маон; р) буфер для попереднього урівноваження: 200 мМ цитратний буфер; рН 6,050,2; с) урівноважувальний буфер: 20 мМ цитратний буфер; рН 6,0-0,2 і додатково 0,025 95 полісорбат-80; а) буфер для зберігання: 0,1 М Маон; е) лінійна швидкість потоку становить 10-500 см/год, більш конкретно 100-150 см/год; У використана колонка: ХК26;
15. Спосіб за п. 1, в якому аніонообмінну хроматографію здійснюють в проточному режимі з промивкою або в режимі зв'язування і елюювання.
16. Спосіб за п. 1, в якому видалення вірусних частинок досягається шляхом нанофільтрації з використанням фільтра, що затримує віруси.
17. Спосіб за п. 1, в якому антигензв'язуючий білок концентрують з використанням тангенціальної проточної фільтрації (ТПФ).
18. Спосіб за п. 17, в якому ТПФ здійснюють з використанням мембрани з відсіканням по молекулярній масі 30 кДа.
19. Спосіб за п. 17, в якому процес тангенціальної проточної фільтрації включає: а) діафільтрацію з використанням буфера для діафільтрації: 25 мм гістидинового буфера; 75 ММ аргінінового буфера; 50-150 мМ Масі; рН 6,50:0,5; р) очисний буфер: 0,5 М Ммаон; 60 с) буфер для зберігання: 0,1 М Ммаон;
а) урівноваження з використанням 5-10 об'ємів мембрани; е) концентрацію і діафільтрацію з використанням 10-20 об'ємів діафільтрації; І) промивку водою для ін'єкцій з використанням 3-5 об'ємів мембрани; 9) очищення з використанням 0,5-1,0 М Ммаон; І) зберігання з використанням 0,1 М Маон.
20. Спосіб за п. 1, в якому очищений препарат терапевтичного білка містить не більше 2 95 агрегатів, переважно менше 1 95 агрегатів.
21. Спосіб за п. 1, в якому композиція стабільного антигензв'язуючого білка містить від 1 до 50 мг/мл антигензв'язуючого білка.
22. Спосіб за будь-яким із попередніх пунктів, в якому композиція антигензв'язуючого білка містить не більше 3 95 агрегатів, мінімальну кількість невидимих частинок і проявляє покращену активність.
23. Спосіб за п. 1, в якому концентрація мономера антигензв'язуючого білка становить понад 99 Фо; концентрація залишкової ДНК СНО становить не більше 2 пг/мг антигензв'язуючого білка, більш конкретно не більше 0,1 пг/мг антигензв'язуючого білка; концентрація залишкового білка СНО становить не більше 100 нг/мг антигензв'язуючого білка, більш конкретно не більше 10 нг/мг антигензв'язуючого білка; концентрація залишкового білка А становить не більше 10 нг/мг антигензв'язуючого білка, більш конкретно не більше 1,5 нг/мг антигензв'язуючого білка, а вміст ендотоксину становить не більше 0,1 ОЄ/мг білка.
24. Спосіб за п. 1, в якому композиція містить: а) «1 95 (в/об.) сахарози, переважно 0,5 95 (в/об.) сахарози; Б) 25 мМ гістидину; с) 75 мМ аргініну; а) 100-145 мМ хлориду натрію; е) 0,02 95 (в/об.) полісорбату-80; У) 1-50 мг/мл антигензв'язуючого білка.
25. Фармацевтична композиція, що містить: а) 1-100 мг/мл щонайменше одного антигензв'язуючого білка, яким є моноклональне антитіло до вірусу денге з БЕО ІЮ МО: 1 або ЗЕО ІЮ МО: 2 або моноклональне антитіло до вірусу сказу з ЗЕО ІЮ МО: З і ЗЕО ІЮ МО: 4, р) 20-40 мМ гістидину; с) 50-100 мМ аргініну; а) 0,002-0,02 95 (в/о6.) полісорбату-80; е) 50-150 мМ масі; У) 1-2,5 95 (в/об.) сахарози; причому рН композиції становить 6,5-40,5, а осмоляльність композиції становить 300-450 мОсмоль/кг, а в'язкість менше 2,5 мПа-с, і композиція зберігає стабільність при 2-8 "С протягом щонайменше 9 місяців, при 25 "С протягом щонайменше 1 місяць, при 40 "С протягом щонайменше 40 діб, при 50 "С протягом щонайменше 2 діб.
26. Фармацевтична композиція за п. 25, що містить 2-80 мг/мл щонайменше одного антигензв'язуючого білка; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 (в/об.) полісорбату-80 і 0,5 95 (в/об.) сахарози, причому рН композиції становить 6,5:0,5.
27. Фармацевтична композиція за п. 25 або 26, в якій осмоляльність композиції становить 380 МмОсмоль/кг.
28. Фармацевтична композиція за будь-яким 3 пп. 25-27, що містить 2-80 мг/мл антигензв'язуючого білка; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 (в/об.) полісорбату-80 і 0,5 95 (в/об.) сахарози; причому рН композиції становить 6,5:20,5, осмоляльність - 380 мОсм/кг, в'язкість - менше 2,5 мПа-с.
29. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 25-28, що містить 25 мг/мл моноклональних антитіл до вірусу денге; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 (в/об.) полісорбату-80 і 0,5 95 (в/об.) сахарози; причому рН композиції становить 6,5:20,5, осмоляльність - 380 мОсм/кг, в'язкість - менше 2,5 мПа-с.
30. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 25-28, що містить 50 мг/мл антигензв'язуючого білка; 25 мМ гістидину; 75 мМ аргініну; 101 мМ Масі; 0,02 95 (в/об.) полісорбату-80 і 0,5 95 (в/об.) сахарози; причому рН композиції становить 6,520,5, осмоляльність - 380 мОсм/кг, в'язкість - менше 2,5 мПа-с.
31. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 25-30, яка являє собою рідку композицію.
32. Фармацевтична композиція за будь-яким 3 пп. 25-31, яка призначена для лікування, профілактики або діагностики захворювань, викликаних вірусом денге або вірусом сказу.
33. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 25-32, яка міститься у контейнері, вибраному з флакона, пробірки, ампули, мішка для внутрішньовенного вливання, натільного ін'єктора, болюсного ін'єкгора, шприца, шприца-ручки, насоса, багатодозового шприца з голкою, багатодозового шприца-ручки, ін'єккгора, шприца-тюбика, автоіїнжектора, попередньо заповненого шприца або їх комбінацій.
34. Фармацевтична композиція за п. 33, яка міститься у контейнері, що має щонайменше один засіб закупорювання, виконаний із поліпропілену (ПП), поліетилентерефталату співполімеру (ПЕТО), поліетилену низького тиску (ПЕНТ), поліетилентерефталату (ПЕТ), поліпентафторстиролу (ПФС), полікарбонату, полівінілхлориду (ПВХ), поліциклопентану
(С2.ЕТМ.), циклоолефінового співполімеру (ЦОС) поліолефіну і їх комбінацій або співполімерів. і А-Біпов афінна хроматографія і інактивація вірусу низьким он і Катонобмінна хроматографіяАнівнсобмінна хроматографіяНанефільтрація ! Тантенціальнае потокова днльторацівлньтоввіпьтрація Е і Формулювання і стерильна фільтрація
Фіг. 1 шо. Вержання готових розчинівдД ' Фільтрація готового розчину : Одержання сумні стабінізатора Додавання сумані стабінізатора до продукту після ТГФ р о ит : 0 Мільтрація кінцевої композиції. Ше
Фіг. 2
UAA201908477A 2016-12-23 2017-12-20 Удосконалені способи підвищення продуктивності антитіл у культурах клітин ссавців і зведення до мінімуму агрегації у процесах виділення і очищення, одержання композицій та стабільні композиції антитіл, одержані цими способами UA128200C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN201621044139 2016-12-23
PCT/IB2017/058194 WO2018116198A1 (en) 2016-12-23 2017-12-20 Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA128200C2 true UA128200C2 (uk) 2024-05-08

Family

ID=61054429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201908477A UA128200C2 (uk) 2016-12-23 2017-12-20 Удосконалені способи підвищення продуктивності антитіл у культурах клітин ссавців і зведення до мінімуму агрегації у процесах виділення і очищення, одержання композицій та стабільні композиції антитіл, одержані цими способами

Country Status (28)

Country Link
US (2) US20200131251A1 (uk)
EP (1) EP3559027B1 (uk)
JP (1) JP7265477B6 (uk)
KR (1) KR102595080B1 (uk)
CN (1) CN110337445B (uk)
AR (1) AR110584A1 (uk)
AU (1) AU2017380842A1 (uk)
BR (1) BR112019011900A2 (uk)
CA (1) CA3047530A1 (uk)
CO (1) CO2019006289A2 (uk)
CR (1) CR20190291A (uk)
DK (1) DK3559027T3 (uk)
EA (1) EA201900326A1 (uk)
ES (1) ES2926028T3 (uk)
GE (1) GEP20237513B (uk)
HR (1) HRP20221071T1 (uk)
MX (1) MX2019007564A (uk)
MY (1) MY197200A (uk)
PE (1) PE20191436A1 (uk)
PH (1) PH12019501472A1 (uk)
PT (1) PT3559027T (uk)
RS (1) RS63533B1 (uk)
SA (1) SA519402010B1 (uk)
TW (2) TW202413401A (uk)
UA (1) UA128200C2 (uk)
UY (1) UY37547A (uk)
WO (1) WO2018116198A1 (uk)
ZA (1) ZA201904046B (uk)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MA52570A (fr) 2018-05-10 2021-03-17 Regeneron Pharma Formulations contenant des protéines de fusion du récepteur vegf à haute concentration
US11773155B2 (en) 2018-08-09 2023-10-03 Beijing Wisdomab Biotechnology Co., Ltd Bispecific antibody against rabies virus, and application thereof
KR102270048B1 (ko) * 2020-07-10 2021-06-28 주식회사 녹십자 바리셀라 조스터 바이러스 표면 단백질 항원의 생산 방법
WO2020071876A1 (ko) * 2018-10-04 2020-04-09 삼성바이오에피스 주식회사 점도가 감소된 고농도 트라스투주맙 또는 이의 항원 결합 단편 안정화 제제
JP7467438B2 (ja) * 2018-10-18 2024-04-15 メルク・シャープ・アンド・ドーム・エルエルシー 抗ｒｓｖ抗体の製剤及びその使用方法
JP2022506413A (ja) * 2018-11-02 2022-01-17 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 連続的採取を行い細胞流出を行わない強化灌流による細胞培養法
CN109576212B (zh) * 2018-12-14 2021-06-22 杭州奕安济世生物药业有限公司 高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用
CN111349142B (zh) * 2018-12-20 2024-09-13 上海百迈博制药有限公司 一种蛋白质的纯化方法
BR112021015034A2 (pt) 2019-02-18 2021-10-05 Eli Lilly And Company Formulação de anticorpo terapêutico
CN112011514A (zh) * 2019-05-31 2020-12-01 百济神州(苏州)生物科技有限公司 提高抗体adcc活性的细胞培养工艺
KR102286892B1 (ko) * 2019-07-08 2021-08-06 삼천당제약주식회사 안과용 단백질 제제의 정제방법
CN114615993A (zh) * 2019-07-29 2022-06-10 康姆普根有限公司 抗pvrig抗体制剂及其用途
BR112022001812A2 (pt) * 2019-08-01 2022-03-29 Gennova Biopharmaceuticals Ltd Composição oftálmica de bevacizumabe
WO2021064079A1 (en) * 2019-10-04 2021-04-08 Merck Patent Gmbh Purification of proteins and viral inactivation
JP2023500651A (ja) * 2019-11-04 2023-01-10 コンピュジェン リミテッド 抗ｐｖｒｉｇ抗体製剤および抗ｐｄ－１抗体による併用療法
CN112876567A (zh) * 2019-11-29 2021-06-01 广东菲鹏制药股份有限公司 Fc融合蛋白及其纯化方法
WO2021112927A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
CN111588850A (zh) * 2020-02-19 2020-08-28 中国科学技术大学 Il-6受体抗体的新用途
CN113563469A (zh) * 2020-04-28 2021-10-29 江苏中新医药有限公司 高回收率纯化阿达木单抗的方法
WO2021226444A2 (en) 2020-05-08 2021-11-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
KR20230035355A (ko) * 2020-07-03 2023-03-13 씨에스엘 이노베이션 피티와이 엘티디 인자 xii 항원 결합 단백질의 고농도 제형
CN113274494B (zh) * 2021-06-07 2022-09-20 武汉生物制品研究所有限责任公司 一种抗SARS-CoV-2的重组全人源单克隆抗体的液体制剂
JP2024535132A (ja) * 2021-09-14 2024-09-26 カエルム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 多発性骨髄腫を治療する方法
KR102682066B1 (ko) * 2021-10-12 2024-07-05 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 집단의 제조 방법
WO2023194837A1 (en) * 2022-04-04 2023-10-12 Intas Pharmaceuticals Ltd. Multi-component buffer system for purification of antibodies

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
EP1614693A4 (en) 2003-03-31 2006-07-19 Kirin Brewery PURIFICATION OF A HUMAN MONOCLONAL ANTIBODY AND A HUMAN POLYCLONAL ANTIBODY
PL1851315T3 (pl) * 2005-02-02 2014-06-30 Univ Massachusetts Ludzkie przeciwciała przeciwko wściekliźnie i ich zastosowania
SG174804A1 (uk) 2006-09-13 2011-10-28 Abbott Lab
PE20091174A1 (es) 2007-12-27 2009-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo
WO2009120684A1 (en) 2008-03-25 2009-10-01 Medimmune, Llc Antibody formulation
AU2009347206C1 (en) 2008-10-20 2016-12-08 Abbvie Inc. Isolation and purification of antibodies using Protein A affinity chromatography
WO2011028962A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Xoma Technology Ltd. Antibody coformulations
JO3417B1 (ar) * 2010-01-08 2019-10-20 Regeneron Pharma الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r
CN107693791B (zh) 2010-02-26 2022-06-07 诺沃—诺迪斯克有限公司 包含稳定抗体的组合物
WO2012125735A1 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 Abott Laboratories An integrated approach to the isolation and purification of antibodies
TWI723339B (zh) 2011-05-02 2021-04-01 美商千禧製藥公司 抗-α4β7抗體之調配物
EP2773439A4 (en) 2011-10-31 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme CHROMATOGRAPHY METHOD FOR DECOMPOSING HETEROGENEOUS ANTIBODY AGGREGATES
ES2859574T3 (es) 2012-08-07 2021-10-04 Massachusetts Inst Technology Anticuerpos de antivirus del dengue y usos de los mismos
US8613919B1 (en) * 2012-08-31 2013-12-24 Bayer Healthcare, Llc High concentration antibody and protein formulations
US9592297B2 (en) 2012-08-31 2017-03-14 Bayer Healthcare Llc Antibody and protein formulations
WO2014102814A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Intas Biopharmaceuticals Limited Process for the purification of fc fusion proteins
TWI596107B (zh) 2013-06-25 2017-08-21 卡地拉保健有限公司 單株抗體之新穎純化方法
NZ756750A (en) 2013-09-13 2022-05-27 Genentech Inc Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides
BR112016014824A2 (pt) 2013-12-27 2017-09-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método para purificar anticorpo que tem ponto isoelétrico baixo
SG11201606624WA (en) 2014-02-11 2016-09-29 Visterra Inc Antibody moleules to dengue virus and uses thereof
BR112016017764A2 (pt) 2014-02-11 2017-10-10 Massachusetts Inst Technology anticorpo antidengue de amplo espectro
EP3109252B1 (en) * 2014-02-18 2020-12-30 Savid Therapeutics Inc. Modified biotin, streptavidin mutant, and usage of them
WO2016044334A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 Genentech, Inc. Antibody formulations
WO2017027805A1 (en) 2015-08-13 2017-02-16 University Of Massachusetts Human antibodies against rabies and uses thereof
ZA201604024B (en) * 2015-09-26 2017-08-30 Serum Institute Of India Pvt Ltd Improved feeding strategies and purification processes for monoclonal antibody production
WO2017165736A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Visterra, Inc. Formulation of antibody molecules to dengue virus

Also Published As

Publication number Publication date
UY37547A (es) 2018-06-29
JP7265477B2 (ja) 2023-04-26
TWI830692B (zh) 2024-02-01
ZA201904046B (en) 2022-02-23
EP3559027A1 (en) 2019-10-30
EP3559027B1 (en) 2022-06-01
US20240309073A1 (en) 2024-09-19
TW201829777A (zh) 2018-08-16
WO2018116198A1 (en) 2018-06-28
RS63533B1 (sr) 2022-09-30
AR110584A1 (es) 2019-04-10
EA201900326A1 (ru) 2019-11-29
BR112019011900A2 (pt) 2019-11-26
CO2019006289A2 (es) 2019-06-28
MX2019007564A (es) 2019-09-06
PE20191436A1 (es) 2019-10-14
JP2020501592A (ja) 2020-01-23
GEP20237513B (en) 2023-06-12
KR102595080B1 (ko) 2023-10-30
ES2926028T3 (es) 2022-10-21
JP7265477B6 (ja) 2023-05-12
MY197200A (en) 2023-05-31
PH12019501472A1 (en) 2020-03-09
CA3047530A1 (en) 2018-06-28
PT3559027T (pt) 2022-09-06
KR20190099269A (ko) 2019-08-26
HRP20221071T1 (hr) 2022-11-11
TW202413401A (zh) 2024-04-01
US20200131251A1 (en) 2020-04-30
DK3559027T3 (da) 2022-09-05
SA519402010B1 (ar) 2022-09-20
CN110337445A (zh) 2019-10-15
AU2017380842A1 (en) 2019-07-11
CN110337445B (zh) 2023-05-23
CR20190291A (es) 2019-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA128200C2 (uk) Удосконалені способи підвищення продуктивності антитіл у культурах клітин ссавців і зведення до мінімуму агрегації у процесах виділення і очищення, одержання композицій та стабільні композиції антитіл, одержані цими способами
JP7467538B2 (ja) ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する患者を処置するための方法
CN105722501B (zh) 包含粘度降低剂的液体蛋白质制剂
US20200255544A1 (en) Methods for treating high cardiovascular risk patients with hypercholesterolemia
WO2014130064A1 (en) Ultrafiltration and diafiltration formulation methods for protein processing
US20130195888A1 (en) Ultrafiltration and diafiltration formulation methods for protein processing
ZA200506159B (en) Immunoglobulin formulation and method of preparation thereof
EA027325B1 (ru) Составы этанерцепта, стабилизированные ксилитом
CA2996716A1 (en) Insulin immunoglobulin fusion proteins
TW202102518A (zh) 用於病毒滅活之替代性清潔劑
US20220395573A1 (en) High Concentration Bispecific Antibody Formulations
JP2022028075A (ja) 免疫寛容を誘導する抗体、誘導されたリンパ球、また誘導されたリンパ球を用いる細胞治療剤治療法
KR20150084836A (ko) 벤조나아제 부재 하의 시나지스 분리 방법
US20240034813A1 (en) High Concentration Bispecific Antibody Formulations
EP3254691A1 (en) Polyclonal antibodies for use in the prevention and/or treatment of ebola virus disease
OA19248A (en) Improved methods for enhancing antibody productivity in mammalian cell culture and minimizing aggregation during downstream, formulation processes and stable antibody formulations obtained thereof.
JP2023543167A (ja) ペプチドマッピング分析のための試料を処理する方法