JP7265477B6 - ダウンストリーム中の哺乳類細胞培養における抗体生産性の向上及び凝集の最小化のための改良された方法、製剤化方法及びそれにより得られる安定抗体製剤 - Google Patents

ダウンストリーム中の哺乳類細胞培養における抗体生産性の向上及び凝集の最小化のための改良された方法、製剤化方法及びそれにより得られる安定抗体製剤 Download PDF

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Description

アップストリーム、ダウンストリーム及び製剤開発はしばしば、臨床試験へのバイオ医薬品の早期導入における律速段階となり得る。例えば、デング熱は、ヒトに影響を与える最も重要な蚊媒介性ウィルス性疾患である。世界人口の半数がデング熱の危険な地域に住んでおり、世界中で年間３億９０００万人の感染が推定される。現在、デング熱を治療するための抗ウィルス剤は承認されておらず、そして最近のワクチン試験は予想を下回っている。主要なワクチン候補は最近、ＤＥＮＶ－２に対する有意な保護はないにもかかわらず、３０％～６０％の間であると推定される限定された有効性を示した。最近、Ｅタンパク質のドメインIIIにおける非免疫優性であるが、機能的には関連性のあるエピトープが同定されており、そしてその後、４つの全ての血清型内の複数の遺伝子型に対する親和性結合を示し、そして広く、中和する人工抗体Ａｂ５１３が開発されて来た（Ram Sasisekharan et al Cell 162, 1-12, July 30, 2015; Samir Bhatt et al, Nature, 2013 April 25; 496 7446: 504-507を参照のこと）。従って、デングモノクローナル抗体に対する世界的な医薬需要を考慮すると、最近の推定では、毎年３億９０００万人以上のデング感染が世界中で発生しており、９００万人を越える疾患がＤＥＮＶを主要な世界的脅威としている。１，６００万人のデング熱の３０％が入院すると仮定すると、約５００万人がデングモノクローナル抗体を必要として、これは、４ｇｍ／ｌ以上の「精製抗体」がそのような命を救う抗体の世界的需要を満たすための必要条件となることを意味する。さらに、しばしば、電力及び冷蔵の利用可能性が不十分であり、そして従って、温度変動に対する抗体安定性がそれらの地域にとってより重要であると仮定する発展途上国では、デング熱病の負荷が高い。
実際、すべてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）候補の製造及び製剤化のために使用され得るプラットフォームプロセスを有することができる場合、プロセス開発に必要とされる時間及び財源が大幅に削減されるであろう。これは、臨床試験に導入され得る臨床候補の数に大きな影響を与える可能性がある。また、プラットフォームを用いて開発されたそれらを含む、初期段階の臨床試験のために開発された方法は、プロセス経済性、収率、プール容量、処理量に関して最適ではなく、そして後期又は商業キャンペーンのために必要とされる量の生産には適切でないかも知れない。別の重要な検討事項は、臨床試験への治療候補の導入の前、プロセス開発を行う必要があることを考えると、プロセス開発のスピードである（Abhinav A. Shukla et al Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39を参照のこと）。
典型的には、哺乳類細胞培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ又はＨａｍ′ｓ Ｆ１２を含む市販の培地製剤に基かれている。しばしば、培地製剤は、細胞増殖及び生物学的タンパク質発現の両方における増加を支持するのに十分には富んでいない。改善されたタンパク質産生のための改善された細胞培養培地、サプリメント、及び細胞培養方法が依然として必要とされている。２ｇ／ｌ以上に細胞培養抗体価の上昇が、以前に報告されている（F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393を参照のこと）。さらに、灌流反応器において、細胞は、従来のバッチ式又は流加反応器においてよりもはるかに高い細胞密度に達することができる（Sven Sommerfeld et al Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137を参照のこと）。しかしながら、灌流に基く方法は、複雑で、費用がかかり、そしてまた、無菌性の問題及びグリコシル化パターンにおける望ましくない不均一性をもたらす可能性がある。動物成分を含まない加水分解物（Bacto TC Yeastolate, Phytone Peptone）の化学的に規定された培地への添加は、細胞密度、培養生存率及び生産性を適時に高めるための一般的なアプローチである。加水分解物は、培地に栄養サプリメントを提供する、アミノ酸、小ペプチド、炭水化物、ビタミン及びミネラルから構成されるタンパク質消化物である。大豆、小麦及び酵母由来の非動物由来加水分解物は、抗体力価を改善するために細胞培養培地及び供給物に一般的に使用されている（米国特許第９２８４３７１号を参照のこと）。しかしながら、その組成の複雑性、ロット間の変動、培養物を粘性にする所望しない属性のために、酵母抽出物及び加水分解物は、培地の多様性の有意な原因であり得る。イソフォーム及び微小不均一性を含む抗体製品の複雑性のために、細胞培養工程の性能は、特にグリコシル化、後転写修飾及び不純物プロファイルに関して、製品の品質及び効力に対して有意な効果を及ぼす可能性がある。
より高い濃度で、タンパク質、特に抗体は、凝集、沈殿、ゲル化、低められた安定性及び／又は高められた粘度を含む特有の問題をしばしば示す。
抗体は、製造工程の間及び／又は経時保存中、生物学的活性を失う、分解又は凝集、又は変性又は化学的修飾を受けるので、溶液中で凝集体及び粒子を形成する傾向がある特徴を有するものとして認識されている。抗体凝集物は、細胞培養発現、下流精製、製剤化及び保存の間に形成され得る。細胞培養収穫物は通常、その過程で最高レベルの凝集物を含む（Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75を参照のこと）。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（例えば、新しい化学的実態をもたらす、結合形成又は開裂によるタンパク質の修飾を含む任意の工程）、又は物理的不安定性（例えば、タンパク質の高次構造の変化）を含むことができる。３つの最も一般的なタンパク質分解経路は、タンパク質凝集、アミド分解、及び酸化である（Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993)）。さらに、タンパク質はまた、例えばｐＨ、イオン強度、熱応力、剪断応力及び界面応力に対して敏感であり、それらのすべては、凝集を導き、そして不安定性をもたらす。従って、タンパク質が生物学的に活性のままであるためには、製剤は、タンパク質の複数の官能基を分解から保護すると同時に、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の立体配座の完全性を損なわずに保存する必要がある。
凝集体形成により引起される主要問題は、投与中に製剤が注射器又はポンプを詰まらせ、そして患者にとって危険なものにする可能性がある。そのようなタンパク質修飾はまたそれらを免疫原性にし、その後の注射の間、薬物利用可能性を低めるか、又は自己免疫反応を悪く誘発する患者による抗薬物抗体の生成をもたらす。抗体製剤の開発における主な目的は、タンパク質の溶解性、安定性及び生物活性を維持することである。
タンパク質治療製剤の不安定性の問題をどのように解決するかについての初期提案は、医薬品の凍結乾燥、続く投与の直前の再構成を含んだ。しかしながら、抗体の凍結乾燥製剤は、凍結乾燥のための長期の工程及び製造のための高い費用を含む、多くの制限を有する。さらに、凍結乾燥製剤は、患者への投与の前、医療従事者により無菌的且つ正確に再構成されるべきである。再構成工程自体は、以下の特定の手順を必要とし、すなわち（１）滅菌希釈剤（すなわち、静脈内投与用の水及び筋肉投与用の５％デキストロース）が、凍結乾燥抗体を含むバイアルに、ゆっくり且つ無菌的に添加され、そしてバイアルが泡立ちを防ぐために３０秒間、非常にゆっくりと回され；（２）再構成された抗体は、溶液が清澄になるまで、室温で最低２０分間、静置する必要があり；そして（３）再構成製剤は、再構成の後、６時間以内に投与されるべきである。そのような再構成手順は厄介であり、そして再構成後の時間制限が、製剤の患者への投与において大きな不便性を引起し、適切に再構成されない場合、又は再構成容量が６時間以内に使用されない場合、かなりの無駄をもたらし、そして破棄されるべきである。従って、液体製剤は、臨床上及び患者の都合上の要因、及び製造の容易さのために望ましい。しかしながら、タンパク質治療薬の液体医薬製剤、すなわち抗体は、長期安定であるべきであり、安全且つ有効量の医薬化合物を含むべきである。
凝集体の除去は、凝集体とモノマーとの間の生物物理学的類似性、凝集体の複数の供給源及び種類、及び凝集機構の理解不足のために、プロセス関連の不純物の除去よりも困難である。
高濃度モノマー抗体剤形の製剤開発中に遭遇するより最近の課題の１つは、製造中及び長期保存中のタンパク質性の目に見える粒子の形成である。ＩｇＧ製剤中のタンパク質性及び非タンパク質性粒子のレベルは、精製及び製剤開発のますます重要な部分である（Klaus Wuchner et al Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 99, no. 8, august 2010を参照のこと）。さらに、液体製剤は、異なる温度にわたって、すなわち２～８℃、２５℃、４０℃及び５５℃の温度で安定すべきである。
ヒト使用に意図された多くの抗体調製物は、その調製物の使用の前、変性、凝集及び他のタンパク質への変化を防ぐために安定剤を必要とする。以前に報告された抗体液体抗体製剤（Lucentis, Avastin）は、安定剤としてマンニトール、トレハロースを有した（Susumu Uchiyama et al Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 2041-2052; 米国特許第20160137727号;国際公開第WO 2009120684号; 米国特許第8568720号を参照のこと）。しかしながら、トレハロースは高価であり、そして大規模プロセス経済学から実行可能ではない。
また、抗体のＩＶ投与は通常、ボーラス投与よりもむしろ輸液として与えられ、そして、ＩＶ投与のために適した適切な液体への賦形剤を含むｍＡｂ製剤の希釈を必要とする。得られる賦形剤、特に界面活性剤の希釈は、攪拌中の凝集の防止のために必要とされる濃度以下に低くなる可能性であり、それにより、０．９食塩水を含むＰＶＣ及びＰＯ ＩＶバッグへの希釈の後、穏やかな攪拌に続いて、凝集物及び目に見えない粒子の生成をもたらす。
疎水性相互作用クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイト及びカチオン交換樹脂は全て凝集体除去に使用されて来たが、しかしどれも理想的ではない。以前に報告された抗体精製工程の大部分は、３又は４段階工程として、プロテインＡクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーと組合して疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用に大きく依存していた（国際公開第 WO2010141039号 、国際公開第 WO2014/207763号、国際公開第WO 2013066707号、国際公開第 WO2015099165号、国際公開第 WO2014102814号、国際公開第 WO2015038888号、国際公開第 WO2004087761号を参照のこと）。しかしながら、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂は、高価であり、低い結合能力を示し、処理するのが困難であり、そして緩衝液及び生存物保持タンクの構成材料と適合できない多量の塩を必要とする。さらに、ＨＩＣ工程に使用される緩衝液間の密度差が、床安定性の問題を引起す可能性がある。セラミックヒドロキシアパタイトはまた、凝集物のモノマーから分離のためにも使用され得るが、しかしセラミック樹脂は、樹脂を損傷することなく開梱することが非常に困難である。従って、続く製造キャンペーンでの再使用のためにカラム外での樹脂の保存は、不可能である（Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78を参照のこと）。
陽イオン交換、アニオン交換フロースルー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及び混合モード陽イオン交換クロマトグラフィーの３段階の組合せが、ＣＨＯ由来のモノクローナル抗体のための宿主細胞タンパク質汚染物の適切な排除をもたらすことが見出された。しかしながら、そのような精製スキームは一般的に、精製シーケンスを各ｍＡｂについて別々に設計する必要性のために、商業的な下流操作においては得ることはできなかった。
従って、堅牢性、信頼性及びスケーラビリティを含む複数の基準を満たす、抗体製造及び製剤化のための効率的なプラットフォーム工程、特に下記を提供するプラットフォームに対する緊急の満たされていない必要性がある：ｉ）少なくとも２ｇｍ／ｌの抗体力価；ii）細胞培養、精製及び製剤化工程にわたる最小凝集／粒子形成；iii）最適回収率、高いモノマー含有量及び最小不純物レベルを示す改善された精製；及びiv）低粘度を示し、凝集及び目に見えない粒子を有さない高濃度抗体製剤（それにより、長期安定性を示す）。
出願人は、驚くべきことには、以下を見出した：
ａ）栄養素消費、副産物の蓄積、及び成長促進と容量生産性との間のバランスを考慮した供給組成物及び供給戦略、ここで特に、特定の基本培地の使用、供給溶液としての濃縮基本培地の使用、明確な供給戦略と共に異なる供給液の使用、より低い濃度の乳酸塩及びアンモニアの維持のような哺乳類細胞培養工程パラメーターが、細胞増殖、細胞寿命及びタンパク質発現を増強することが見出され；それにより高められた抗体力価をもたらす。
ｂ）凝集を最小にするプロテインＡ親和性及びカチオン交換工程中の緩衝液の一部としての特定の塩濃度；それにより、９９％以上のモノマー含有率及び８０％以上の回収率を達成する。
ｃ）スクロースを、ヒスチジン、アルギニン、ポリソルベート８０、より高い効力及び安定性を付与する塩化ナトリウムと組合して含む無粒子液体抗体製剤は、スクロースを含まない製剤と比較して、２～８℃で少なくとも９ヵ月、２５℃で少なくとも１ヵ月間、４０℃で少なくとも４２日間、５５℃で少なくとも２日間、高濃度抗体溶液の粘度を下げる。
図１は、モノクローナル抗体の精製についてのダウンストリーム処理のフローチャートを示す。
図２は、モノクローナル抗体についての製剤化工程のフローチャートを示す。
本発明の治療用タンパク質は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：抗原結合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多価抗体、多重特異性抗体、抗原結合タンパク質フラグメント、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ダイアボディ、ナノボディ、一価、二重特異性、ヘテロコンジュゲート、多重特異性、自己抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ） '２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（antiId）抗体、エピトープ結合フラグメント及びＣＤＲ含有フラグメント、及びそれらの組合せ。
本発明の１つの実施形態によれば、治療用タンパク質は、抗原結合タンパク質又は免疫グロブリンであり、より好ましくは、ＩｇＧであり、そして最も好ましくは、ＩｇＧ１分子である。本実施形態の第１の側面によれば、免疫グロブリン／抗体は、ＥプロテインのドメインIIIにおけるデング熱ウィルスエピトープに対して特異的なヒトκＬ鎖を有するヒトＩｇＧ１（Ｇ１ｍ３アロタイプ）である。本実施形態の第２の側面によれば、抗体は、狂犬病ウィルス表面Ｇ糖タンパク質に対して特異的な完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。本実施形態の第３の側面によれば、治療用タンパク質は、以下から成る群から選択され得る：ＣＴＰ１９、ＣＲ５７、ＣＲ４０９８、ＲＶＦａｂ８、ＭａｂＪＡ、ＭａｂＪＢ－１、Ｍａｂ ５７、１７Ｃ７、２Ｂ１０、Ａｂ２９３ / ＶＩＳ５１３、Ｎ２９７Ｑ－Ｂ３Ｂ９、Ｍａｂ２Ｅ８、２Ｄ２２、ＤＭＳｃＨｕＭａｂ、３ＣＨ５Ｌ１、ＨＭＢ ＤＶ５、ＨＭＢ ＤＶ６、ＨＭＢ、ＤＶ６、ＨＭ６、ＤＶ３２、ＤＢ３２ Ｄ８８、Ｆ３８、Ａ４８、Ｃ８８、Ｆ１０８、Ｂ４８、Ａ６８、Ａ１００、Ｃ５８、Ｃ７８、Ｃ６８、Ｄ９８、Ｄ１８８、Ｃ１２８、Ｃ９８、Ａ１１、Ｂ１１、Ｒ１７Ｄ６、Ｒ１４Ｂ３、Ｒ１６Ｃ９、Ｒ１４Ｄ６、Ｒ１８Ｇ９、Ｒ１６Ｇ７、Ｒ１７Ｇ９、Ｒ１６Ｅ５、４Ｅ１１Ａの修飾に由来する抗体、アダタセプト、アブシキシマブ、アダリムマブ、アフリベルセプト、アレフェプトマブ、トラスツズマブ、バシリキシマブ、ベバシズマブ、ベラタセプト、ベクトモマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エファリズマブ、エファリズマブ、エタネルセプト、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、ムロモナブ―ＣＤ３、オマリズマブ、パリビズマブ。 パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リロナセプト、リツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ザノリマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ｈＡ２０、 ＡＭＥ－Ｉ３３、 ＩＭＣ－３Ｇ３、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ch*)^、 ＫＳＢ－１０２、ＭＲ１－１、 ＳＣ１００、ＳＣ１０１、ＳＣ１０３、ムロモナブ－ＣＤ３、ＯＫＴ４Ａ、イブリツモマブ、ゲムツズマブ、モタビズマブ、インフリキシマブ、ペグフィルグラスチン、ＣＤＰ－５７１、エタネルセプト、ＡＢＸ－ＣＢＬ、ＡＢＸ－ＩＬ８、ＡＢＸ－ＭＡ１ペムツモマブ、Ｔｈｅｒｅｘ、ＡＳ１４０５、ナタリズマブ、ＨｕＢＣ－１、ＩＤＥＣ－１３１、ＶＬＡ－１、ＣＡＴ－１５２、Ｊ６９５、ＣＡＴ－１９２、ＣＡＴ－２１３、ＢＲ３－Ｆｃ、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ－Ｂ、ＴＲＡＩＬ－ＲＩｍＡｂ、ベバシズマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、ＭＬＮ－０２、ＨｕＭａｘ－ＩＬ １５、ＨｕＭａｘ－Ｉｎｆｌａｍ、ＨｕＭａｘ－癌、ＨｕＭａｘ－離ンパ腫、ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ、クレノリキシマブ、ルミリキシマブ、ＢＥＣ２、ＩＭＣ－ＩＣ１１、ＤＣ１０１、ラベツズマブ、アルシツモマブ、エプラツズマブ、タカツズマブ、セツキシマブ、ミエローマサイド、ＬｋｏＣｉｄｅ、ＰｒｏｓｔａＣｉｄｅ、イピリムマブ、ＭＤＸ－０６０、ＭＤＸ－０７０、ＭＤＸ－０１８、ＭＤＸ－１１０６、ＭＤＸ－１１０３、ＭＤＸ－１３３３、ＭＤＸ－２１４、ＭＤＸ－１１００、ＭＤＸ－ＣＤ４、ＭＤＸ－１３８８、ＭＤＸ － ０６６、ＭＤＸ － １３０７、ＨＧＳ － ＴＲ２Ｊ、ＦＧ － ３０１９、ＢＭＳ － ６６５１３、ＳＧＮ － ３０、ＳＧＮ － ４０、トシリズマブ、ＣＳ － １００８、ＩＤＭ － １、ゴリムマブ、ＣＮＴＯ １２７５、ＣＮＴＯ ９５、ＣＮＴＯ ３２８、メポリズマブ、ＭＯＲ１０１、ＭＯＲＩ ０２、ＭＯＲ２０１、ビジリズマブ、ＨｕＺＡＦ、ボロシキシマブ（volocixmab）、ＩＮＧ－１、ＭＬＮ２２０１、ダクリズマブ、ＨＣＤ １２２、ＣＤＰ ８６０、ＰＲＯ ５４２、Ｃ １４、オレゴボマブ、エドレコロマブ、エタラシズマブ、アテゾリズマブ、イプリムマブ、モガムリズマブ、リンツズマブ、ＨｕＩＤ１０、Ｌｙｍ－１、エファリズマブ、ＩＣＭ３、ガリキシマブ、エクリズマブ、オビヌツズマブ、ペキセリズマブ、ＬＤＰ－Ｏｌ、ｈｕＡ３３、ＷＸ－Ｇ２５０、シブロツズマブ、オフツムマブ、キメラＫＷ － ２８７１、ｈｕ３Ｓ１９３、ｈｕＬＫ２６、 ビバツズマブ、ラキシバクマブ、ｃｈｌ４．１８、３Ｆ８、ＢＣ８、ｈｕＨＭＦＧ１、ＭＯＲＡｂ － ００３、ＭＯＲＡｂ － ００４、ＭＯＲＡｂ － ００９、デノスマブ、ＰＲＯ－１４０、１Ｄ０９Ｃ３、ｈｕＭｉｋｂｅｔａ－１、ＮＩ－０４０１、ＮＩ－５０１、カンツズマブ、ＨｕＮ９０１、８Ｈ９、ｃｈＴＮＴ－１ / Ｂ、バビツキシマブ、ｈｕＪ５９１、ＨｅＦｉ－１、ペンタセア、アバゴボマブ、トシツモマブ、ウステキヌマブ、１０５ＡＤ７、ＧＭＡ１１１Ｉ、ＧＭＡ３２１。
本実施形態の他の側面によれば、治療用タンパク質は、デング熱ウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳＶ、ＭＰＶ、インフルエンザウイルス、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、チクングニアウイルス、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＭＥＲＳ、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、ＨＩＶウイルス、マールブルクウイルス、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、エボラウイルス、ＶＳＶ及びＶＥＥ上に存在するエピトープに対する結合親和性を有する抗体である。
本実施形態の別の側面によれば、前記抗原結合タンパク質の等電点（ｐＩ）は、７．５～８．５、より好ましくは約７．８～約８．２、最も好ましくは８．１２である。
特に、抗原結合タンパク質は、国際公開第WO2014025546号、国際公開第WO2015122995号、 国際公開第WO2015123362号、国際公開第WO2006084006号、国際公開第WO2017027805号 及び国際公開第 WO2017165736号に記載されるような治療用、予防用又は診断用抗体であり、その全体が参照により本明細書に組込まれる。より好ましくは、治療用タンパク質は、そのＶＩＳ５１３（配列番号１又は配列番号２）に対して８０％の類似性を有する抗体である。本実施形態の他の好ましい側面によれば、治療用タンパク質は、狂犬病モノクローナル抗体の配列（配列番号３及び配列番号４）と８０％以上の類似性を有する抗体である。
本明細書に記載される方法における治療用タンパク質の発現のために、任意の宿主が使用され得ることは非常に良く理解されている。細胞は、野生型でも良いし、又は目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする組換え核酸配列、例えば遺伝子を含む遺伝子操作されても良い。
本発明の第２の実施形態によれば、治療用タンパク質の発現のために使用される細胞系は、下記を含む群から選択されるが、但しそれらだけには限定されない：ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ、ＧＳ－ＣＨＯ、ＣＨＯ ＤＵＸ－Ｂ１１、ＣＨＯ－Ｋ１、ＢＳＣ－１、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＳＶ４０（ＣＯＳ）細胞を保有するＣＶ－１、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－７、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３、Ｃ１２７、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、Ｃｏｌｏ２５、Ｕ９３７、ＳＰ２細胞、L細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ ２９３）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ ２１）細胞、アフリカミドリザル腎臓ＶＥＲＯ－７６細胞、ＨＥＬＡ細胞、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８細胞、ＮＩＨ－３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的に免疫グロブリン鎖を産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ＰＥＲ.Ｃ６、ＳＰ２ / ０－Ａｇ１４、骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、網膜細胞、ヒト肝癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）、及びハイブリドーマ細胞。
第２の実施形態の他の側面によれば、動物又は哺乳類細胞は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えばＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＧ４４ (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; 及び Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36:10901-10909)、 ＳＨ８７ 細胞ＣＨＯ－ＤＸＢ１１ (G. Urlaub and L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 4216-4220. L. H. Graf, and L. A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96)、 ＣＨＯ － Ｋ１ Ｔｅｔ － Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＯＣ８５０５０３０２と称されるＣＨＯ(ＣＡＭＲ, Salisbury, Wiltshire, UK)、ＣＨＯ クローン１３ (ＧＥＩＭＧ, Genova, IT), ＣＨＯクローンＢ (GEIMG, Genova, IT)、ＥＣＡＣＣ ９３０６１６０７と称されるＣＨＯ－Ｋ１/ＳＦ (ＣＡＭＲ, Salisbury, Wiltshire, UK)、ＥＣＡＣＣ ９２０５２１２９ と称されるＲＲ－ＣＨＯＫ１ (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)、ＣＨＯＫ１ｓｖ (Edmonds et al., Mol. Biotech. 34:179-190 (2006))、ＣＨＯ－Ｓ (Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011))、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性ＣＨＯ細胞(ＣＨＯ/－ＤＨＦＲ, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216)、ｄｐ１２.ＣＨＯ 細胞 (米国特許第５，７２１，１２１号); ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞(ＣＯＳ 細胞, ＣＯＳ－７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１)；ヒト胎児腎臓細胞（例えば、２９３細胞、又は懸濁培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59）；ベビーハムスター腎臓細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０)；ＣＡＰ細胞、ＡＧＥ１.ＨＮ細胞、サル腎臓細胞（ＣＶ １、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７; ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251)；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ － ３４）； ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ － ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（ＨＥＰ－Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ － ５１）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４４２）；ＴＲ１細胞(Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383:44-68)；ＭＣＲ ５細胞；ＦＳ４細胞。
第２の実施形態の第１の側面によれば、治療用タンパク質の発現のために使用される細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であり：より特定には、その細胞系はＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ－ＫＯ 又は ＧＳ－ＣＨＯである。
本発明の第３の実施形態によれば、細胞は、バッチ式又は連続式で；より特定には、流加式で培養される。当業者が、利用可能な設備及びここの必要性に従って、本発明に記載される方法を調整できることは、非常に良く理解されている。より特定には、細胞培養工程は、増強された細胞増殖、細胞寿命及び高められたタンパク質発現を提供し、すなわち少なくとも２ｇｍ／ｌ、好ましくは３ｇｍ／ｌ～６ｇｍ／ｌの範囲の収穫収量を提供する流加式で実施される。
第３の実施形態の第１の側面によれば、細胞培養はフラスコ、バイオリアクター、タンクバイオリアクター、バッグバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクター中で行われる。好ましくは、前記バイオリアクターは、撹拌槽バイオリアクター、気泡カラムバイオリアクター、エアリフトバイオリアクター、流動床バイオリアクター又は充填床バイオリアクターの群から選択され；そして 前記バイオリアクターは、1Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３５０Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、３０００Ｌ、５０００Ｌ、５０００Ｌ、１００００Ｌ、２００００Ｌ、及び３０，０００リットルから選択される容積を有する。
第３の実施形態の第２の側面によれば、本細胞培養培地及び方法は、２週間にわたって測定される場合、抗体収率を約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０ ％、１６０％、１８０％、又は２００％、最も好ましくは、約４０％から６０％、高めるために使用され得る。流加方法の期間は、約１２日～２０日；約１５日～２０日、又は約１５日～１８日であり得る。
本発明の第４の実施形態によれば、細胞培養培地は、１又は２以上のＣＤ ＣＨＯ、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ（登録商標）、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（登録商標）（Life Technologies）； Ｅｘ － Ｃｅｌｌ（登録商標）ＣＤ ＣＨＯ（Sigma Aldrich）； ＰｒｏＣＨＯ（登録商標）５（Ｌｏｎｚａ）；ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ（Irvine Scientific）；ＣＤＭ４Ｍａｂ（Hyclone）；Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ（登録商標）ＣＨＯ － １００（EMD ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）； Ｃｅｌｌ ｖｅｎｔｏ ２２０（Merck Millipore）； Ｃｅｌｌ ｖｅｎｔｏ２２０（Merck Millipore）；Ａｃｔｉｐｒｏ（Hyclone）; 及びそれらの組み合わせを含む群から選択される。好ましくは、細胞培養培地は、Ｃｅｌｌ ｖｅｎｔｏ２２０（Merck）、ＡＣＴＩＰＲＯ (HyClone/GE)、又はＧｉｂｃｏ（登録商標）Ｄｙｎａｍｉｓ（登録商標）培地 (Thermo Fisher)から選択される。
細胞培養培地はさらに、細胞増殖、細胞寿命、タンパク質発現及び収率を高めるためにグルコース及び他の供給溶液により補充される。供給溶液が急速ボーラス又は段階的滴下法で補充され得ることは、当業界においては非常に良く理解されている。
以下から成る供給戦略による細胞培養培地中の供給溶液の補充：
４日目から、０．０５％～０．５％の反応器容量、好ましくは０．１％～０．２％の反応器容量での供給溶液Ａによる初期供給；
６、８、１０、１１及び１３日目に０．１％～０．５％の反応器容量での供給溶液Ａによる供給；
２～１４日まで、８％以下の反応器容量での、隔日又は継続的に溶液Ｂの供給；
２日又は３日目から開始して、連続した少なくとも２日間、１２日目、又は１４日目、又は１５日目、又は１６日目、又は１８日目まで、連続した２日の断続的なギャップを有する、８％以下の反応器容量での供給溶液Ｃの供給；
４日目又は５日目から開始して、連続した少なくとも２日間、１日置に又は連続的に、又は１２日目、又は１４日目、又は１５日目、又は１６日目、又は１８日目まで、連続した２日の断続的ギャップを有する、０．５％以下の反応器容量での供給溶液Ｄの供給、任意には、EfficientFeed（登録商標）Ａ、 EfficientFeed（登録商標）Ｂ、EfficientFeed（登録商標）Ｃ及びDow corning Antifoam Ｃから選択された少なくとも１つの供給溶液の供給。
第４の実施形態の好ましい側面によれば、前記供給溶液Ａ、供給溶液Ｂ、供給溶液Ｃ、供給溶液Ｄは、グルコース、Cell Boost（登録商標）5サプリメント（Hyclone）、EX-CELL 293（Sigma Aldrich）、Cell Boost 7a及び7bサプリメント（Hyclone）、3X Actipro（Hyclone / GE）、Cell Vento 220（1X培地）、EX-CELL（登録商標）Advanced（登録商標）CHO フィード1、EfficientFeed（登録商標）A、EfficientFeed（登録商標）B、EfficientFeed（登録商標）C、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
第４の実施形態の最も好ましい側面によれば、供給溶液Ａは、Cell Boost（登録商標）5サプリメント（Hyclone）であり；供給溶液Ｂは、EX-CELL 293 (Sigma Aldrich)であり；供給溶液Ｃは、Cell Boost 7aサプリメント（Hyclone）であり；供給溶液Ｄは、Cell Boost7bサプリメント（Hyclone）である。さらに、細胞培養培地は、細胞培養の３日目、１０％の「３X Actipro」（Hyclone）及び７日目、８％のCell Vento２２０（1X培地）により補充される。すべての供給添加が±１％及び±１日、変動し得ることは、当業者により非常に良く理解されている。
第４の実施形態の別の側面は、細胞増殖及び寿命、及びタンパク質発現を高めるために使用される細胞培養条件を含む。この工程の間に使用される細胞培養条件は、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：
細胞培養培地のｐＨは６．５～７．５の範囲であり；
細胞培養培地のオスモル濃度は、２５０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇ；より好ましくは、４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり；
溶解酸素は、１０～６０％、好ましくは２０～４０％の範囲、より好ましくは３０％であり；
細胞培養温度は、３０℃～３８℃の範囲であり；第１の温度は好ましくは、３６～３７℃であり、そして任意には、第２の温度は好ましくは、３０～３５℃であり；
グルコース濃度は、７％以下、好ましくは４％～５％に維持され；
生存率が８０％まで低められる場合、細胞培養物が収穫され；ここで、細胞培養条件は、乳酸濃度などの二次代謝物が５ｇ／ｌ以下；及びアンモニア濃度が５ｍＭｏｌ／ｌ以下であるように維持される。
本発明の第５の実施形態によれば、細胞培養収穫物から得られた前記治療用タンパク質は、以下の段階から成る精製工程にゆだねられる:ｉ）親和性クロマトグラフィー、ii）ウィルス不活性化、iii）イオン交換クロマトグラフィー、及びiv）濾過；ここで全工程回収率は７０％以上であり、そして最終精製治療用タンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは９８％以上の純度／モノマー含有率を有する。最終精製治療用タンパク質における、残留細胞ＤＮＡ、残留細胞タンパク質及び残留プロテインＡを含む他の不純物は、１％以下である。
第５の実施形態の一般的側面によれば、本発明者は、ｉ）親和性クロマトグラフィー洗浄工程における塩の使用により、及びii）イオン交換クロマトグラフィー工程における溶出のための塩溶液の洗浄勾配の使用により、前記タンパク質の下流プロセッシング中の治療用タンパク質の凝集の問題に対処することに成功している。前記実施形態の好ましい側面によれば、精製に使用される緩衝液中の塩濃度は、３０ｍＭ～５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは、５０ｍＭ～３００ｍＭの範囲である。
第５の実施形態の第１の側面によれば、１又は２以上のプロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＬクロマトグラフィー、及びそれらの組み合わせを含む群から選択された親和性クロマトグラフィー、好ましくは、プロテインＡクロマトグラフィーである。
第５の実施形態の第２の側面によれば、プロテインＡクロマトグラフィーのために使用される樹脂は、１又は２以上のEshmuno A、KanCapA（登録商標）、MabSelect SuRe（登録商標）、 MabSelect SuRe LX、MabSelect Xtra、rProtein A Sepharose Fast Flow、Poros（登録商標） MabCapture A、Amsphere（登録商標）Protein A JWT203、ProSep HC、ProSep Ultra及びProSep Ultra Plusを含む群から選択され；好ましくは、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー樹脂は、MabSelect SuRe（登録商標）、 Eshmuno A、Kancap A 又は Poros MabCaptureであり；より好ましくは、プロテインＡクロマトグラフィー樹脂は、MabSelect SuRe（登録商標）である。
第５の実施形態の第３の側面によれば、プロテインＡクロマトグラフィーのために使用される洗浄緩衝液は、１又は２以上の以下を含む群から選択される：
１０～３０ｍＭのリン酸緩衝液、好ましくは２０ｍＭのリン酸緩衝液；１００～１５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２；
１０～３０ｍＭのリン酸緩衝液、好ましくは２０ｍＭのリン酸緩衝液；２５０ｍＭ～１ＭのＮａＣｌ、好ましくは１ＭのＮａＣｌ；０．０５％のポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２；
１～３０ｍＭのリン酸緩衝液、好ましくは１０ｍＭのリン酸緩衝液；１００～１５０ｍＭのＮａＣｌ、好ましくは１２５ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％のポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２。
第５の実施形態の第４の側面によれば、プロテインＡクロマトグラフィーに使用される溶出緩衝液は、１０～３０ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ３．０±０．５；及び任意には、０．０１～０．０５％（ｗ ／ ｖ）のポリソルベート８０を含み；好ましくは、溶出緩衝液は２０ｍＭクエン酸緩衝液；ｐＨ３．０±０．２；任意には、０．０２５％（ｗ ／ ｖ）のポリソルベート８０を含む。
第５の実施形態の第５の側面によれば、親和性クロマトグラフィー工程から得られる溶出液は、ウィルス不活性化及び低減にゆだねられる。溶出液のウィルス不活性化及びウィルス低減は、ｐＨ処理、界面活性剤処理、熱処理及びウィルス低減濾過から成る群から個別に又は組合せて選択される方法によりもたらされ得ることは、当業界において非常に良く理解されている。この実施形態の好ましい側面によれば、ウィルス不活性化は、溶出液を、低いｐＨ，すなわち３．３～３．５のｐＨに５００～１００分間ゆだねることによりもたらさせる。さらに、溶出液は、それを中和緩衝液、すなわち１Ｍのトリス／クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０±０．２）にゆだねることにより、ｐＨ中和される。任意の他の適合できる緩衝液が溶出液の効果的ｐＨ中和のために使用され得ることは、当業界において非常に良く理解されている。
第５の実施形態の第６の側面によれば、ウィルス不活性化された溶出液は、イオン交換クロマトグラフィーにゆだねられる。この実施形態の１つの側面によれば、イオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換クロマトグラフィー又はアニオン交換クロマトグラフィー又はそれらの組合せであり；そしてクロマトグラフィーは、「結合及び溶出」モード又は「フロースルー」モードで実施され得る。この実施形態の好ましい側面によれば、カチオン交換クロマトグラフィー及びアニオン交換クロマトグラフィーは、任意の連続的順序で実施される。第５の実施形態のさらなる側面は、前記クロマトグラフィー樹脂が任意には、Capto MMC樹脂（GE Healthcare）のようなマルチモーダル樹脂であることである。
第５の実施形態の第７の側面によれば、ウィルス不活性化された溶出液は、カチオン交換クロマトグラフィーゆだねられる。この実施形態の好ましい側面によれば、クロマトグラフィー樹脂及び緩衝液条件を含むクロマトグラフィーパラメーターは、正に荷電された治療用タンパク質がクロマトグラフィー樹脂に結合し、そして負に荷電された分子が通過し、さらに治療用タンパク質が塩勾配を用いて溶出にゆだねられるような態様で選択される。実施形態の好ましい側面によれば、カチオン交換クロマトグラフィー樹脂は、１又は２以上のスルホネート系基（例えば、GE Healthcare からのＭｏｎｏＳ、ＭｉｎｉＳ、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｓ 及び ３０Ｓ、 ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、 ＳＰ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ 、Tosoh からのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＳＰ－６５０Ｓ 及び ＳＰ－６５０Ｍ 、BioRad からのＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（登録商標） Ｈｉｇｈ Ｓ 、Pall Technologies からのＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｓ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標） Ｍ及びＬＳ ＳＰ 、及びPall Technologies からのＳｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＳＰ）；スルホエチル系基（例えば、EMD からのＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＳＥ、Applied Biosystems からのＰＯＲＯＳ（登録商標） Ｓ－１０ 及び Ｓ－２０）；スルホプロピル系基（例えば、Tosoh からのＴＳＫ Ｇｅｌ ＳＰ ５ＰＷ及びＳＰ－５ＰＷ－ ＨＲ 、Life Technologies からのＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ－２０、 ＨＳ ５０、及びＰＯＲＯＳ（登録商標） ＸＳ ）、スルホイソブチル系基（例えば、EMD からのＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＥＭＤ Ｓ０３ " ）；スルホキシエチル系基（例えば、Whatman からのＳＥ５２、ＳＥ５３ 及び Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｓ ）；カルボキシメチル系基（例えば、GE Healthcare からのＣＭ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標） Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、 Biochrom Labs Inc.からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＣＭ 、BioRad からのＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（登録商標）ＣＭ、Pall Technologies からのＣｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ ＣＭ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標） Ｍ ＣＭ、ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標）ＬＳ ＣＭ、 Millipore からのＭａｔｒｅｘ ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（登録商標） Ｃ５００及び Ｃ２００ 、Whatman からのＣＭ５２、 ＣＭ３２、 ＣＭ２３及び Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｃ 、Tosoh からのＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＣＭ－６５０Ｓ、 ＣＭ－６５０Ｍ 及びＣＭ－６５０Ｃ ）；スルホン酸及びカルボン酸系基（例えば、J.T. Baker からのＢＡＫＥＲＢＯＮＤ（登録商標）Ｃａｒｂｏｘｙ－Ｓｕｌｆｏｎ ）；カルボン酸系基（例えば、J.T Baker からのＷＰ ＣＢＸ 、 Dow Liquid Separations からのＤＯＷＥＸ（登録商標） ＭＡＣ－３ 、Sigma- Aldrich からのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標） 弱カチオン交換体、 ＤＯＷＥＸ（登録商標） 弱カチオン交換体及び ＤＩＡＩＯＮ（登録商標）弱カチオン交換体、及びEMD からのＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＥＭＤ ＣＯＯ－）；スルホ酸系基（例えば、Biochrom Labs Inc.からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＳＰ 、Dow Liquid SeparationsからのＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｆｉｎｅ Ｍｅｓｈ 強酸カチオン樹脂 、J.T. Baker からのＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ、 ＷＰ Ｓｕｌｆｏｎｉｃ 、Sartorius からのＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標） Ｓ メンブラン 、Sigma-Aldrich からのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標） 強カチオン交換体、 ＤＯＷＥＸ（登録商標） 強カチオン交換体及び ＤＩＡＩＯＮ（登録商標） 強カチオン交換体）；及びオルトリン酸系基（例えば、WhatmanからのＰＩ）を含む群から選択された樹脂から成り、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標） ＥＭＤ ＳＯ3 -、 Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標） ＥＭＤ ＳＥ Ｈｉｃａｐ (Merck)、ＣＭＭ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標） (Pall Corporation)、 Ｃａｐｔｏ Ｓ ＩｍｐＡｃｔを含む群から選択される。第５の実施形態の別の側面によれば、カチオン交換クロマトグラフィーのためのプロセスパラメーターは、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：前平衡化緩衝液［２００ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２］；平衡化緩衝液［１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ポリソルベート８０（０．０２５％（ｗ／ｖ））；ｐＨ６，０±０．２］；中和のための低ｐＨ保持；洗浄緩衝液Ａ［１０ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２］；洗浄緩衝液Ｂ［２０ｍＭのクエン酸緩衝液；３００～５００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．０±０．２］；ＣＨＰ緩衝液［０．５ＭのＮａＯＨ］；滞留時間［４．００～７，００分］；使用されるカラム［ＸＫ２６］。
第５の実施形態の第８の側面によれば、ウィルス不活性化された溶出液は、アニオン交換クロマトグラフィーにかけられる。この実施形態の好ましい側面によれば、クロマトグラフィー樹脂及び緩衝液条件を含むクロマトグラフィーパラメーターは、治療用タンパク質がフロースルーで溶出する間、すべての負に荷電された不純物が膜と結合するように選択される。この実施形態の好ましい側面によれば、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、１又は２以上のApplied Biosystems からのＤＥＡＥセルロース、ＰＯＲＯＳ（登録商標） ＰＩ ２０、 ＰＩ ５０、ＨＱ １０、ＨＱ ２０、ＨＱ ５０、 Ｄ ５０ 、Sartorius からのＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標）Ｑ 、ＭｏｎｏＱ、 ＭｉｎｉＱ、 Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑ及び ３０Ｑ、 Ｑ、 ＤＥＡＥ 及び ＡＮＸ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Q ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ）、Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標） 及び ＦＡＳＴ Ｑ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）(GE Healthcare)、J.T. Baker からのＷＰ ＰＥＩ、 ＷＰ ＤＥＡＭ、 ＷＰ ＱＵＡＴ 、Biochrom Labs Inc.からのＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＤＥＡＥ 及びＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＱＡ 、Biorad からのＵ Ｏｓｐｈｅｒｅ Ｑ、ＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（登録商標） ＤＥＡＥ 及びＭＡＣＲＯ－ＰＲＥＰ（登録商標） Ｈｉｇｈ Ｑ 、Pall Technologies からのCｅｒａｍｉｃ ＨｙｐｅｒＤ Ｑ、セラミックＨｙｐｅｒＤ ＤＥＡＥ、TRISACRYL（登録商標） Ｍ 及び ＬＳ ＤＥＡＥ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ ＬＳ ＤＥＡＥ、 ＱＭＡ ＳＰＨＥＲＯＳＩＬ（登録商標）ＬＳ、ＱＭＡ ＳＰＨＥＲＯＳＩＬ（登録商標） Ｍ 及びＭＵＳＴＡＮＧ（登録商標） Ｑ 、Dow Liquid Separations からのＤＯＷＥＸ（登録商標）ファインメッシュ強塩基タイプI及びタイプIIアニオン樹脂及びＤＯＷＥＸ（登録商標）ＭＯＮＯＳＰＨＥＲ Ｅ ７７、弱塩基アニオン、Millipore からのＩＮＴＥＲＣＥＰＴ（登録商標） Ｑメンブレン、Ｍａｔｒｅｘ ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ（登録商標） Ａ２００、 Ａ５００、 Ｑ５００、及び Ｑ８００、EMD からのＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＥＭＤ ＴＭＡＥ、 ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＥＭＤ ＤＥＡＥ 及び ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標） ＥＭＤ ＤＭＡＥ 、Sigma-Aldrich からのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）弱及び強アニオン性交換剤タイプI 及びII、ＤＯＷＥＸ（登録商標） 弱及び強アニオン性交換剤タイプI 及びII、 ＤＩＡＩＯＮ（登録商標） 弱及び強アニオン性交換剤タイプI及び II、 ＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標） 、Tosoh からのＴＳＫ ゲルＱ 及び ＤＥＡＥ ５ＰＷ 及び ５ＰＷ－ＨＲ、 ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標） ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、６５０Ｍ及び ６５０Ｃ、ＱＡＥ－５５０Ｃ 及び６５０Ｓ、 ＤＥＡＥ－６５０Ｍ 及び６５０Ｃ、Whatman からのＱＡ５２、 ＤＥ２３、 ＤＥ３２、 ＤＥ５１、 ＤＥ５２、 ＤＥ５３、 Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｉｏｎ Ｄ 及び Ｅｘｐｒｅｓｓ－ Ｉｏｎ Ｑ を含む群から選択され；より好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Sartobind Q (Sartorius)、Eshmuno Q (Merck)、 MUSTANG（登録商標） Q (Pall Corporation) 及びbPoros X (Thermo)から選択される。第５の実施形態の別の側面によれば、アニオン交換クロマトグラフィーのためのプロセスパラメーターは、以下を含むが、但しそれらだけには限定されない：洗浄緩衝液［０．５Ｍ ＮａＯＨ］；前平衡化緩衝液［２００ｍＭクエン酸緩衝液； ｐＨ６．０±０．２］； 平衡化緩衝液[２０ｍＭのクエン酸緩衝液; ｐＨ６．０±０．２；及び任意には、０．０２５％のポリソルベート８０］； 保存緩衝液［０．１ＭのＮａＯＨ］；線形流速［１０～５００ｃｍ ／時、より具体的には１００～１５０ｃｍ ／時］；使用カラム[ＸＫ２６]。
前述の実施形態の精製工程はさらに、１又は２以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー（Capto MMC and Capto Adhere）、メンブレンクロマトグラフィー（Intercept（登録商標）（Millipore）、Mustang（登録商標）（Sall Corporation）及びSartobind（登録商標）（Sartorius）を含むQメンブレン））を含む群から選択された少なくとも１つの追加のクロマトグラフィー段階から成ることができる。
第５の実施形態の第９の側面によれば、ウィルス粒子は、２０ｎｍのフィルターを用いて除去された。ウィルス粒子の除去のために使用されるフィルターは、以下の群から選択されたウィルス保持フィルターを含むが、但しそれらだけには限定されない：Viresolve PRO (Merck)、Planova 20N (Asahi Kasei)、 Bio EXL PALL PEGASUS PRIME、 PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences)及び Virosart (Sartorius)、 Sartorius からのVirosart CPVフィルター、 Millipore からのVirosolve、 Pall からのUltipor DV20 又はDV50 、 Asahi からのPlanova 20N 及び 50N 又は BioEx 。ウィルスに対する保持能力を有する他の任意のフィルターがこの工程に使用され得ることは、当業界において非常に良く理解されており；好ましくは、ウィルス粒子の除去のために使用されるフィルターは、Viresolve PRO (Merck)、Bio EXL PALL PEGASUS PRIME、PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences)及びVirosart (Sartorius)から選択される。
第５の実施形態の第１０の側面によれば、治療用タンパク質は、所望の濃度に濃縮され、そして製剤緩衝液中の緩衝液が交換される。緩衝液は、接線流濾過システム又は超流動濾過システム下で交換される。接線流濾過の他のパラメーターは、ダイアフィルトレーション緩衝液[２５ｍＭのヒスチジン緩衝液; ７５ｍＭアルギニン緩衝液； ５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．５０±０．５］；洗浄緩衝液［０．５Ｍ のＮａＯＨ］； 保存緩衝液［０．１ＭのＮａＯＨ］； ５～１０倍の膜容量で平衡化； １０～２０ダイアフィルトレーション容量を用いる濃縮及びダイアフィルトレーション；５～１０倍の膜容量を用いてのＷＦＩ洗浄；０．５～１．０ Ｍの ＮａＯＨを用いての洗浄；保存[０．１Ｍ のＮａＯＨ]を用いるダイアフィルトレーションから選択された１つ又は２以上から成る。この実施形態の好ましい側面の１つによれば、接線流濾過は、１又は２以上のCentramate Ｔ シリーズ ＰＥＳ 膜 (Pall Corporation)、 Hydrosart (Sartorius)及びPelicon 3 (Merck)を含む群から選択された３０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いて実施される。
本発明の第６の実施形態によれば、前記精製された治療用タンパク質は、医薬賦形剤と共に製剤化され、個々で前記製剤のオスモル濃度は、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり、そして製剤の粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第６の実施形態の第１の側面によれば、治療用タンパク質製剤は、少なくとも１つの抗原結合タンパク質、少なくとも１つの安定剤、少なくとも１つの緩衝剤、少なくとも１つの等張剤及び少なくとも１つの界面活性剤から成る。任意には、製剤は保存剤を含む。
第６の実施形態の第２の側面によれば、安定剤は炭水化物である。安定剤は、１又は２以上のスクロース、ソルビトール、トレハロース、マンニトール、デキストラン、イノシトール、グルコース、フルクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、ラフィノース及びそれらの組み合わせから成る群から選択され；より好ましくは、安定剤はスクロースである。本実施形態のさらなる別の側面によれば、安定剤は、約０．１％～約２．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは＜１％（ｗ／ｖ）の濃度でのスクロースから成る。
第６の実施形態の第３の側面によれば、緩衝剤は、１又は２以上のヒスチジン、アルギニン、グリシン、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ＨＥＰＥＳ、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ塩基、又はＴｒｉｓ－ＨＣｌ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。好ましくは、緩衝剤は、約５．５～７．５、約６．０～７．０、約６．３～約６．８、又は約６．５のｐＨを提供する。
第６の実施形態の第４の側面によれば、緩衝剤は、ヒスチジンである。本実施形態の好ましい側面によれば、緩衝剤は、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭの濃度でヒスチジンを含む。本実施形態の最も好ましい側面によれば、緩衝剤は、約２５ｍＭの濃度でヒスチジンを含む。
第６の実施形態の第５の側面によれば、緩衝剤は、アルギニンである。本実施形態の好ましい側面によれば、緩衝剤は、約５ｍＭ～約２００ｍＭ、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭの濃度でアルギニンを含む。本実施形態の最も好ましい側面によれば、緩衝剤は、約７０～８０ｍＭの濃度でアルギニンを含む。
第６の実施形態の第６の側面によれば、等張剤は、１又は２以上の塩化ナトリウム、ブドウ糖、グリセリン、マンニトール、及び塩化カリウムから成る群から選択される。本実施形態の好ましい側面によれば、等張剤は、塩化ナトリウムを含み、そして約１０ｍＭ～約５００ｍＭの濃度で；好ましくは、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度で；最も好ましくは、約１００～１４５ｍＭの濃度で存在する。
第６の実施形態の第７の側面によれば、界面活性剤は、約０．００１～約０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し；そして１又は２以上のポリソルベート（例えば、ポリソルベート－２０又はポリソルベート－８０）；ポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）；トリトン ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；ナトリウムオクチルグリコシド；ラウリル － 、ミリスチル － 、リノレイル － 、又はステアリル － スルホベタイン；ラウリル － 、ミリスチル － 、リノレイル－ 又はステアリル － サルコシン；リノレイル － 、ミリスチル － 、又はセチル － ベタイン；ラウロアミドプロピル － 、コカミドプロピル － 、リノールアミドプロピル － 、ミリスタミドプロピル － 、パルミドプロピル － 、又はイソステアルアミドプロピル － ベタイン（例えば：ラウラミドプロピル）；ミリスタミドプロピル － 、パルミドプロピル － 、又はイソステアルアミドプロピル － ジメチルアミン；メチルココイルナトリウム又はメチルオレイルタウリン酸ナトリウム；及びＭＯＮＡＱＵＡＴ（登録商標）シリーズ(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、ポリエチルグリコール、ポリプロピレングリコール、及びエチレンとプロピレングリコールのコポリマー（例えば、プルロニクス、ＰＦ６８）から成る群から選択される。本実施形態の好ましい側面によれば、界面活性剤は、ポリソルベート８０から成り、そして約０．００１％～約０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で；好ましくは約０．００２％～約０．０２％；約０．００５％～約０．０２％の濃度で；最も好ましくは、約０．０２％の濃度で存在する。
第６の実施形態の第８の側面によれば、製剤は、約１ｍｇ／ｌ～約１５０ｍｇ／ｌ、約１ｍｇ／約５０ｍｇ／ｌ、約２０ｍｇ／ｌ～約４０ｍｇ／ｌの濃度で治療用タンパク質を含む。好ましくは、製剤は、約１ｍｇ／ｌ～約５０ｍｇ／ｌの濃度で治療用タンパク質を含む。
第６の実施形態の第９の側面によれば、製剤はさらに、保存剤を含み、その保存剤は、ベンジルアルコール、ｍ－クレゾール及びフェノールを含む群から選択され得る。
本発明の第７の実施形態によれば、治療用タンパク質製剤は、少なくとも１つの治療用タンパク質、スクロース、アルギニン、ヒスチジン、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０を含む。好ましくは、治療用タンパク質製剤は、約１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌの治療用タンパク質；約２０ｍＭ～約４０ｍＭのヒスチジン；約５０ｍＭ～約１００ｍＭのアルギニン；約０．００２％～約０．０２％ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；約５０ｍＭ～約１５０ｍＭのＮａＣｌ；及び＜２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）を含む。製剤のｐＨは、６．０～約７．０の範囲であり、そして製剤のオスモル濃度は、３００ｍＯｓｍ／ｋｇ～約４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。
第７の実施形態の好ましい側面の１つによれば、医薬製剤は、２～８０ｍｇ／ｍｌのデングモノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第７の実施形態の好ましい側面の１つによれば、医薬製剤は、２５ｍｇ／ｍｌのデングモノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第７の実施形態の好ましい側面の１つによれば、医薬製剤は、５０ｍｇ／ｍｌのデングモノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第７の実施形態の好ましい側面の１つによれば、医薬製剤は、２～８０ｍｇ／ｍｌの狂犬病モノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第７の実施形態の好ましい側面の１つによれば、医薬製剤は、２５ｍｇ／ｍｌの狂犬病モノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
医薬製剤は、５０ｍｇ／ｍｌの狂犬病モノクローナル抗体；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び０．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを含み：ここで、製剤のｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ－Ｓ以下である。
第７の実施形態の別の側面によれば、前記抗体の医薬製剤は、凍結乾燥された製剤であり得る。
本発明の第８の実施形態によれば、治療用タンパク質の親和性及び効力は、１又は２以上のＥＬＩＳＡはフローサイトメトリーにより測定される。第８実施形態の好ましい側面によれば、間接的ＥＬＩＳＡに基く方法は、治療用タンパク質の特異的抗原への結合を定量化するために使用される。本実施形態の好ましい側面によれば、デングＭａｂ製剤は、デング熱ウィルスの全ての血清型に対して試験され、そしてデングｍＡｂの量が決定される。治療用タンパク質の効力は、参照標準に対する％活性として報告されている。任意の他の類似する方法が、治療用タンパク質の効力及び親和性を実証するために使用され得ることは非常に良く理解されている。
本発明の第９の実施形態によれば、フォーカスリダクション中和試験（ＰＲＮＴ／ＦＲＮＴ）又は関連試験が、治療用タンパク質によるウィルス活性の中和を評価するために実施される。本実施形態の好ましい側面によれば、デングｍＡｂ製剤が、デング熱ウィルスの全ての血清型に対して試験され、そしてＥＣ５０値がデング熱ウィルスの中和について計算される。任意の他の類似する方法が、治療用タンパク質の中和活性を実証するために使用され得ることは非常に良く理解されている。
本発明の第１０の実施形態によれば、ＨＰＬＣに基くサイズ排除クロマトグラフィーが、治療用タンパク質製剤中の凝集体の存在を評価するために使用される。本実施形態の好ましい側面によれば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｂｉｏ－Ｓｅｃ－Ｓ ３０００カラムが、デングｍａｂ製剤の凝集体及びモノマーの割合を実証するために使用される。任意の他の類似する方法が、治療用タンパク質製剤中の凝集体の存在を評価するために使用され得ることは非常に良く理解されている。
本発明の第１１の実施形態によれば、製剤は、適切な容器中で保存され得る。容器は、ボトル、バイアル、アンプル、ＩＶバッグ、ウェアラブルインジェクター、ボーラスインジェクター、シリンジ、ペン、ポンプ、マルチドーズニードルシリンジ、マルチドーズペン、インジェクター、シレット、オートインジェクター、プレ－充填注射器、又はそれらの組み合わせから選択され得る。
少なくとも１つの一次包装成分は、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリペンタフルオロスチレン（ＰＦＳ）、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリシクロペンタン（ＣＺ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリオレフィン、及びそれらの組み合わせ又はコポリマーから選択された容器クロージャーを含む。
本明細書に開示される抗デング抗体又は抗狂犬病抗体製剤は、デング又は狂犬病ウィルスを、治療し、予防し、そして／又は診断するために使用され得る（単独で、又は他の剤又は治療法と組合して）。例えば、併用療法は、１又は２以上の追加の治療剤、例えば抗ウィルス剤（他の抗デング抗体を含む）、ワクチン（デング熱ウィルスワクチン）、又は免疫応答を増強する剤と共に同時製剤化され、そして／又は同時投与される抗デング抗体分子を含むことができる。他の実施形態によれば、抗体分子は、静脈内水分補給、熱軽減剤（例えば、アセトアミノフェン）、又は輸血などの他の治療法と組合して投与される。そのような併用療法は、より低い用量の投与される治療剤を都合良く利用することができ、従って、種々の単独療法に関連する可能な毒性又は合併症を回避する。
実施例１：治療用タンパク質、すなわちデング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体の細胞培養及び発現のための上流工程：
プロトコル：
１０Ｌ規模での細胞培養を、発酵／上流工程の間、下記のパラメーターを用いて供給バッチ様式で実施した。
デングモノクローナル抗体を、Visterra Inc. USAから入手された細胞系「ＣＨＯ － Ｋ１ ＳＶ ＧＳ－ＫＯ」において発現した。
・細胞増殖及び治療用タンパク質、すなわちデングモノクローナル抗体の発現のために使用される細胞培養培地は、１Ｘ Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ（登録商標）ＣＨＯ－２２０液体培地であった。
・グルコース、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（登録商標）５サプリメント（Hyclone）、ＥＸ－ＣＥＬＬ ２９３（Sigma Aldrich）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂサプリメント（Hyclone）、３Ｘ Ａｃｔｉｐｒｏ（Hyclone）、Ｃｅｌｌ Ｖｅｎｔｏ ２２０（３Ｘ培地）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＣＨＯ供給１から成る群から選択された、供給溶液Ａ、供給溶液Ｂ、供給溶液Ｃ、供給溶液Ｄを、補充供給のために使用した。
・発酵培地のｐＨを、６．７～７．５で維持した。
・発酵培地のオスモル濃度を、＜４９０ｍＯｓｍ／ｋｇで維持した。
・発酵培地の溶存酵素を、約２０％～約４０％で維持した。
・発酵培地の温度を、３６．５±０．５で維持した。
・培養物を、細胞数が６０％に低下した時点で回収した。
供給補充を、下記表１のように徐々に滴下した：
Figure 0007265477000001
結果及び結論：
発酵工程の間に得られる生存コロニー数及び収率は以下の通りであった：
Figure 0007265477000002
出願人は、基礎培地、供給溶液としての濃縮基礎培地、明確な供給戦略と共に供給溶液の使用、増強された細胞増殖から成る細胞培養工程を用いることにより、低濃度の乳酸塩及びアンモニアが得られ、それにより、細胞数を効果的に維持し、そして細胞寿命及び収率を高めることを見出した。
実施例２：
実施例１で得られた細胞培養物を収穫し、そして後に、図１のようにデング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体の精製のためのプロトコルにかけた。
使用される詳細な工程は、以下の通りであった：
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー：
この工程においては、標的化モノクローナル抗体を、収穫された上清液における培地成分から分離した。清澄化された上清液をクロマトグラフィーカラムに通し、そして次に、適合性の溶出緩衝液を用いて溶出した。
使用される材料：
樹脂（マトリックス）：Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ／Ｅｓｈｍｕｎｏ Ａ（プロテイン－Ａ親和性）
滞留時間：４．０～８．０分
使用されるカラム：ＸＫ２６
平衡化緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１５０ｍＭのＮａｃｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄Ｉ緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄II緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１ＭのＮａＣｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄III緩衝液：１０ｍＭのリン酸緩衝液＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
溶出緩衝液：２０ｍＭのクエン酸緩衝液＋０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ３．０±０．２
ＣＩＰ緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ
使用されるプロセスパラメーター：
Figure 0007265477000003
１．低ｐＨウィルス不活性
ｉ．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの溶出液を、低ｐＨ、すなわち３．５±０．１に、６０±１０分間、ゆだね、ウィルス粒子を不活性化した。
ii. 低ｐＨを保持した後、溶出液を、中和緩衝液、すなわちｐＨ７．０±０．２を有する、１Ｍのトリス／クエン酸緩衝液を用いて中和した。
iii. 中和された溶出液の導電率を、０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含むＷＦＩを用いて調整した。
２．カチオン交換クロマトグラフィー
正に荷電された抗体分子はカラムと結合し、一方では、負に荷電された分子はフロースルーオする。カラム結合抗体分子を、塩勾配を用いて溶出する。
使用される材料：
使用される樹脂：Fractogel SO3-/ Fractogel SE Hicap (Merck)
滞留時間：４．００～７．００分
使用されるカラム：ＸＫ２６
前平衡化：２００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０±０．２
平衡化：１０ｍＭのクエン酸緩衝液＋ ０．０２５％（ｗ ／ ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．０±０．２
充填：中和のための低ｐＨ保持
洗浄緩衝液Ａ：１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０±０．２
洗浄緩衝液Ｂ：２０ｍＭのクエン酸緩衝液＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０±０．２
ＣＩＰ緩衝液：０．５ ＭのＮａＯＨ
保存緩衝液：０．１ ＭのＮａＯＨ
プロセスパラメーター：
Figure 0007265477000004
勾配中の画分収集
Figure 0007265477000005
アニオン交換クロマトグラフィー：
すべての負に荷電された不純物は膜と結合し、一方では、抗体はフロースルーする。
使用される材料：
使用される膜/樹脂: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q
充填容積: １５０mg/ｍＬ～１０００ mg/ｍＬ
使用されるカラム: ＸＫ ２６
洗浄緩衝液: ０．５ Ｍの ＮａＯＨ
前平衡化緩衝液: ２００ ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０ ±０．２
平衡化緩衝液: ２０ ｍＭの クエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０±０．２ ; 及び任意には、０．０２５％の ＰＳ－８０、ｐＨ ６．０±０．２
保存緩衝液: ０．１ Ｍ のＮａＯＨ
プロセスパラメーター：
Figure 0007265477000006
３．ナノ濾過：
２０ｎｍのナノフィルター、すなわちＶｉｒｅｓｏｌｖｅ ＰＲＯ（Merck）を用いて、治療用タンパク質に利用可能な任意のウィルス粒子を除去した。
４．接線流濾過／ウィルトラフロー濾過：
抗体を所望する濃度に濃縮し、そして緩衝液を３つの製剤緩衝液のうち１つにおいて交換した。
使用される材料：
製剤緩衝液：
・緩衝液１：２５ｍＭのヒスチジン緩衝液＋ ７５ｍＭのアルギニン緩衝液＋ ７５ｍＭ のＮａＣｌ、ｐＨ６．５０±０．２５；
・緩衝液２：２５ｍのＭヒスチジン、７５ｍＭのアルギニン、１０１ｍＭ のＮａＣｌ；
・緩衝液３：２５ｍＭのヒスチジン、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭ～１０１ｍＭ のＮａＣｌ、ポリソルベート－８０ ０．００２％w / v；
・洗浄緩衝液：０．５ Ｍ のＮａＯＨ；
・保存緩衝液：０．１ Ｍ のＮａＯＨ；
・使用される膜：ＰＡＬＬ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｔシリーズ、ＰＥＳ膜ＭＷＣＯ：３０ ｋＤａ。
プロセスパラメーター：
Figure 0007265477000007
減菌濾過：
安定剤を抗体溶液に添加し、そして０．２μのフィルターを通して減菌濾過した。
結果：
精製工程に使用される種々の段階の段階的な回収。
Figure 0007265477000008
全体のプロセス回収率は、約８０％であることがわかり、そして全体の純度は＞９９％であることがわかった。
Figure 0007265477000009
Figure 0007265477000010
実施例３：
精製されたデング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体を以下のようにして処方した：
賦形剤、すなわちアルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、スクロース及びポリソルベートに８０を添加し、そして５０～６０ＲＰＭで磁気攪拌機を用いて十分に混合し、賦形剤の混合物を形成した。次に、この混合物を、５０～６０ＲＰＭの攪拌速度で徐々に、デングｍＡｂ ＴＦＦ収穫物中に添加した。ｐＨを調べ（ｐＨ６．５）、そして必要なら、ヒスチジン－アルギニン緩衝液により調節した。最終製剤を、０．２μＭのフィルターを通して濾過し、そして最終容器中に満たした。
最終製剤中の各成分の濃度は、次の通りであった：
Figure 0007265477000011
さらに、それらの製剤を、９ヵ月間、純度、安定性、効能及び効力について試験した。
実施例４：
ＶＩＳ５１３デング抗体製剤中のスクロースの存在の効果を、ＤＶ１のＥＤIIIタンパク質に対する効力のＥＫＩＳＡアッセイによる試験効について研究した。製剤研究を、２～８℃、２５℃及び４０℃の温度に対して行った。
結果：
スクロースを含まないＶＩＳ５１３デング抗体製剤
Figure 0007265477000012
スクロースを含むＶＩＳ５１３デング抗体製剤
Figure 0007265477000013
Figure 0007265477000014
結論：０．０５％（ｗ／ｖ）のスクロースの添加が、スクロースを含まないその対応するサンプリング点に比較して、安定性を改善する。
実施例５：
ＶＩＳ５１３抗体製剤を４０℃で２０日間、貯蔵し、そしてその後、ＶＩＳ５１３の効力をＥＬＩＳＡ試験により評価した。増加するスクロース強度の効果を、４０℃でＶＩＳ５１３抗体製剤について研究し、ここで０．１、０．２及び０．５％のスクロース濃度を評価した。
結果：
Figure 0007265477000015
Figure 0007265477000016
Figure 0007265477000017
Figure 0007265477000018
Figure 0007265477000019
結論：最高の安定性が、０．５％のスクロースを含む製剤で観察された。
実施例６：
下記条件下で保存されたデング（ＶＩＳ５１３）Ｍａｂ製剤の純度、安定性、効能及び効力についての分析試験：
・２～８℃で０ヵ月、３ヵ月、６ヶ月及び９ヵ月の期間；
・２５℃で０日及び３０日の期間；
・４０℃で０日、７日、１４日、２８日、３５日及び４２日の期間。
６．１：ＶＩＳ５１３抗体製剤の効力を、間接的ＥＬＩＳＡにより試験した。
間接的ＥＬＩＳＡに基く方法を用いて、ＤＶ１抗原のＥＤIIIタンパク質へのデングＭａｂ（ＶＩＳ５１３）の結合を定量化した。ＥＤIIIタンパク質をプレートに固定化した。末結合を洗浄により除去した。次に、段階標準及び試験サンプルを添加し、抗原への結合を可能にした。結合したＤｖ－Ｍａｂの量を決定するために、Ｄｖ－Ｍａｂに対して特異的なマウス抗－ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ（ヒト免疫グロブリンＦｃフラグメント）を用いて、Ｄｖ－Ｍａｂの存在を認識した。アッセイを、４５０ｎｍで形成される色の量により結合の程度を定量化するＴＭＢマイクロウェル ペルオキシダーゼ基質により開発した。データ分析ソフトウェアは、４種のパラメーター曲線フィッティングモデルを用いて各サンプルについての結合曲線を生成し、そして相対効力を計算することにより、試験サンプルの結合曲線を標準曲線に比較した。試験サンプルの効力を、参照標準に対する％活性（相対効力×１００）として報告する。
結果：
Figure 0007265477000020
Figure 0007265477000021
Figure 0007265477000022
デング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体製剤は、結合親和性の時間依存性喪失を全く示さなかった。
６．２：ＥＣ５０を決定するためのＰＲＮＴアッセイ
このアッセイは、抗体の結合を可能にするためにウィルスと、段階的に希釈された抗体とを予備混合し、中和し、次にその混合物を、Ｖｅｒｏ細胞単層に移し、粘性媒体により重層し、インキュベートし（ウィルス血清型に依存して、約３～７日）、ウィルス複製及び広がりを制限し、続いてプラークを検出した。中和は、プラーク形成の減少により捕獲された。強い検出は、ペルオキシダーゼ基質と共に、４Ｇ２抗－デング抗体及びＨＲＰ標識ヤギ抗－マウス抗体を用いる免疫染色法により達成された。
デング（ＶＩＳ５１３）Ｍａｂ製剤サンプルを、４種の全ての血清型のデング熱ウィルス、すなわちＤＶ１、ＤＶ２、ＤＶ３及びＤＶ４に対して試験した。ＥＣ５０値を、デング熱ウィルスの中和のために計算した。ＥＣ５０値は、デング熱ウィルスの効果的中和に必要とされる５０％有効濃度、及びウィルス対照ウェルに存在するプラークの数及びインキュベートされたｍａｂ－ウィルスサンプルが添加されているウェルにおけるプラークの数から計算されたＥＣ５０値を表す。
結果：
Figure 0007265477000023
Figure 0007265477000024
Figure 0007265477000025
デング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体製剤は、２～８℃及び２５℃でウィルス中和効力の時間依存性の喪失を全く示さなかった。たとえ４０℃で保持されても、ＶＩＳ５１３製剤は、デング熱ウィルスを中和するその能力を失うことはない。
６．３：凝集及び純度分析
ＨＰＬＣに基くサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を用いて、ＤＶ Ｍａｂのバルク製剤及び最終製剤中の凝集体を評価した。この方法によれば、フェノメネックスＢｉｏ－Ｓｅｃ－Ｓ ３０００カラムを用いて、約５０μｇの全抗体を注入し、そして１ｍｌ／分の流速で３５分間流すことにより、デング（ＶＩＳ５１３）Ｍａｂの凝集体及びモノマー％を実証した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）を、移動相として使用した。
結果：ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（許容範囲はＮＬＴ９０％である）
Figure 0007265477000026
Figure 0007265477000027
Figure 0007265477000028
デング（ＶＩＳ５１３）モノクローナル抗体製剤は、何れの有意な時間依存性凝集も示さず；そして純度／モノマー含有率は、＜９８％であることが見出された。
実施例７：製剤中の界面活性剤濃度の効果：
界面活性剤濃度の効果を、目に見えない粒子分析により評価した。ポリソルベート８０強度を変えた製剤を調製し、そして目に見えない粒子分析のために分析した。
Figure 0007265477000029
結論：
０．００５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含む製剤において、最小の見えない粒子が観察された。用量に依存して、製剤が希釈を必要とする場合、ポリソルベート８０強度は、４倍のマージンを伴って０．０２％であることが確立された。
実施例８：使用される安定剤の最小濃度の決定の研究
必要とされる最小緩衝液強度（１０～３０ｍＭ）は、入手できる文献から参照された。最小アルギニン（可溶化剤及び粘度低減剤として使用される）を見出すために、Ｍａｂサンプルを、通常の生理食塩水中に緩衝液交換し、そしてアルギニンストック溶液（３００ｍＭ）を徐々に添加した。その溶液の凝集を、ＯＤ＠３５０ｎｍを測定することによりモニターした。７５ｍＭのアルギニンを含む生理食塩水は最低のＯＤを付与し、従って、７５ｍＭのアルギニンを確定した。
実施例８：デング（ＶＩＳ５１３）抗体製剤の粘度研究
機器マニュアルに記載される手順に従って、マイクロチップに基く粘度計、モデル：microVISCTM (Make: RheoSense, CA USA)上で、ＤＶ ｍａｂサンプルの粘度を測定した。
Figure 0007265477000030
結論：
粘度の時間依存性上昇は、２～８℃で９日間、保存されたｍａｂ製剤、及び２５℃で１ヵ月間、保存されたサンプルにおいては、観察されず、これは主に、賦形剤－アルギニン７５ｍＭによるものである。我々の製剤の粘度は、１．１～１．２ｍＰａ・Ｓ／ｃＰであることが見出され、これは、１１～５０ｍＰａ・Ｓ／ｃＰの粘度を有する他の市販の製剤よりも低い。
実施例９：デング（ＶＩＳ５１３）ｍＡｂ精製工程に対するウィルススパイキング研究
モノクローナル抗体の製造工程におけるウィルス濾過による除去の有効性を試験するために、実際の製造工程についてウィルス検証を実施した。
マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）及びマウスの微小ウィルス（ＭＭＶ／ＭＶＭ）を、モデル生物として使用した。本発明の発明者は、彼らの独創的な精製方法の能力と、モノクローナル抗体精製の一般的且つ十分に確立された方法の能力とを比較した。
モノクローナル抗体精製の前記一般的且つ十分に確立された方法は、プロテインA親和性クロマトグラフィー(GE Resin);低pH処理; Sartobind Q クロマトグラフィー (アニオン交換膜、ザルトリウス、使い捨て); サルトバインドフェニルクロマトグラフィー(メンブレンクロマトグラフィー、ザルトリウス、使い捨て); Viresolve Pro濾過 (ナノ濾過、 Merck)を含む。
Figure 0007265477000031
結果：ＳＩＩＰＬ精製方法は、ウィルス除去においては非常に効率的であり、達成された全ＬＲＶはＩＣＨガイドラインの通りである（標準方法ＬＲＶ１２．６４に対するＳＩＩＰＬ進歩性方法２３．７４）。本発明の方法を用いて精製されたデング抗体は、何れのウィルスリスクも伴わないでヒト臨床試験に適していることが見出された。
実施例１０：治療用タンパク質、すなわち狂犬病モノクローナル抗体の細胞培養及び発現のための上流工程
プロトコル：
２Ｌ規模での細胞培養を、発酵／上流工程の間、下記パラメーターを用いて供給バッチ様式で実施した。
・狂犬病モノクローナル抗体を、細胞系「ＧＳ－ＣＨＯ」において発現した。
・細胞増殖及び治療用タンパク質、すなわち狂犬病モノクローナル抗体の発現のために使用される細胞培養培地は、１Ｘ Ｃｅｌｌｖｅｎｔｏ（登録商標）ＣＨＯ－２２０液体培地、又は「Ａｃｔｉｐｒｏ 1ｘ (Hyclone)」であった。
・グルコース、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（登録商標）５サプリメント（Hyclone）、ＥＸ－ＣＥＬＬ ２９３（Sigma Aldrich）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び７ｂサプリメント（Hyclone）、３Ｘ Ａｃｔｉｐｒｏ（Hyclone）、Ｃｅｌｌ Ｖｅｎｔｏ ２２０（３Ｘ培地）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）ＣＨＯ供給１から成る群から選択された、供給溶液Ａ、供給溶液Ｂ、供給溶液Ｃ、供給溶液Ｄを、補充供給のために使用した。
・発酵培地のｐＨを、６．５～７．５で維持した。
・発酵培地のオスモル濃度を、２７０～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇで維持した。
・発酵培地の溶存酵素を、約２０％～約６０％で維持した。
・発酵培地の温度を、３６．５±０．１で維持した。
供給補充を、下記表３０のように徐々に滴下した：
Figure 0007265477000032
注：全ての供給溶液は、±１％及び±１日変動する可能性がある。
細胞培養物を、ＯＤが６０％まで低下した場合に回収した。
結果及び結論：
発酵工程の収量は、３～５ｇｍ／lであった。得られる収穫物をさらに、精製／下流処理にゆだねた。
実施例１１：
実施例９で得られた細胞培養物を収穫し、そして後に、図１のように狂犬病モノクローナル抗体の精製のためのプロトコルにゆだねた。
使用される詳細な工程は、以下の通りであった：
プロテインＡ親和性クロマトグラフィー：
この工程においては、標的化モノクローナル抗体を、収穫された上清液における培地成分から分離した。清澄化された上清液をクロマトグラフィーカラムに通し、そして次に、適合性の溶出緩衝液を用いて溶出した。
使用される材料：
樹脂（マトリックス）：Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ／Ｅｓｈｍｕｎｏ Ａ（プロテイン－Ａ親和性）
滞留時間：４．０～８．０分
使用されるカラム：ＸＫ２６
平衡化緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１５０ｍＭのＮａｃｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄Ｉ緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄II緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液＋１ＭのＮａＣｌ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ７．０±０．２
洗浄III緩衝液：１０ｍＭのリン酸緩衝液＋１２５ｍＭのＮａＣｌ＋０．００２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ６．０±０．２
溶出緩衝液：２０ｍＭのクエン酸緩衝液＋０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ｐＨ３．０±０．２
ＣＩＰ緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ
使用されるプロセスパラメーター：
Figure 0007265477000033
１．低ｐＨウィルス不活性
ｉ．プロテインＡ親和性クロマトグラフィーからの溶出液を、低ｐＨ、すなわち３．５±０．１に、６０±１０分間、ゆだね、ウィルス粒子を不活性化した。
ii. 低ｐＨを保持した後、溶出液を、中和緩衝液、すなわちｐＨ７．０±０．２を有する、１Ｍのトリス／クエン酸緩衝液を用いて中和した。続いて、中和された溶液を、０．８ ／ ０．４５μ又は０．８ ／ ０．２μを用いて濾過した。
iii. 中和された溶出液の導電率を、０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含むＷＦＩを用いて調整した。
２．カチオン交換クロマトグラフィー
正に荷電された抗体分子はカラムと結合し、一方では、負に荷電された分子はフロースルーオする。カラム結合抗体分子を、塩勾配を用いて溶出する。
使用される材料：
使用される樹脂：Fractogel SO3-/ Fractogel SE Hicap (Merck)
滞留時間：４．００～７．００分
使用されるカラム：ＸＫ２６
前平衡化：２００ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０±０．２
平衡化：１０ｍＭのクエン酸緩衝液＋ ０．０２５％（ｗ ／ ｖ）ポリソルベート８０、ｐＨ６．０±０．２
充填：中和のための低ｐＨ保持
洗浄緩衝液Ａ：１０ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ６．０±０．２
洗浄緩衝液Ｂ：２０ｍＭのクエン酸緩衝液＋ ３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０±０．２
ＣＩＰ緩衝液：０．５ ＭのＮａＯＨ
保存緩衝液：２０％エタノール＋１５０ｍＭのＮａＣｌ
Figure 0007265477000034
Figure 0007265477000035
アニオン交換クロマトグラフィー：
すべての負に荷電された不純物は膜と結合し、一方では、抗体はフロースルーする。
使用される材料：
使用される膜/樹脂: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q
充填容積: １５０mg/ｍＬ～１０００ mg/ｍＬ
使用されるカラム: ＸＫ ２６
洗浄緩衝液: ０．５ Ｍの ＮａＯＨ
前平衡化緩衝液: ２００ ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０ ±０．２
平衡化緩衝液: ２０ ｍＭの クエン酸緩衝液、ｐＨ ６．０±０．２ ; 及び任意には、０．０２５％の ＰＳ－８０、ｐＨ ６．０±０．２
保存緩衝液: ２０％エタノール＋１５０ｍＭのＮａＣｌ又は０．１ＭのＮａＯＨ
Figure 0007265477000036
３．ナノ濾過：
２０ｎｍのナノフィルター、すなわちＶｉｒｅｓｏｌｖｅ ＰＲＯ（Merck）を用いて、治療用タンパク質に利用可能な任意のウィルス粒子を除去した。
４．接線流濾過／ウィルトラフロー濾過：
抗体を所望する濃度に濃縮し、そして緩衝液を３つの製剤緩衝液のうち１つにおいて交換した。
使用される材料：
製剤緩衝液：
・緩衝液１：２５ｍＭのヒスチジン緩衝液＋ ７５ｍＭのアルギニン緩衝液＋ ７５ｍＭ のＮａＣｌ、ｐＨ６．５０±０．２５；
・緩衝液２：２５ｍのＭヒスチジン、７５ｍＭのアルギニン、１０１ｍＭ のＮａＣｌ；
・緩衝液３：２５ｍＭのヒスチジン、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭ～１０１ｍＭ のＮａＣｌ、ポリソルベート－８０ ０．００２％w / v；
・洗浄緩衝液：０．５ Ｍ のＮａＯＨ；
・保存緩衝液：２０％エタノール＋１５０ｍＭのＮａＣｌ又は０．１ＭのＮａＯＨ；
・使用される膜：ＰＡＬＬ Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ Ｔシリーズ、ＰＥＳ膜ＭＷＣＯ：３０ ｋＤａ。
Figure 0007265477000037
減菌濾過：
安定剤を抗体溶液に添加し、そして０．２μのフィルターを通して減菌濾過した。
結果：
Figure 0007265477000038
全体のプロセス回収率は、約８０％以上であることがわかった。
Figure 0007265477000039
Figure 0007265477000040
精製後の狂犬病モノクローナル抗体の全体の純度は＞ ９９％であることが分かり、全体の回収率は＞ ８０％であることがわかった。
実施例１２：
精製狂犬病モノクローナル抗体を図２に示すフローチャートに従って調製した。
賦形剤、すなわちアルギニン、ヒスチジン、ＮａＣｌ、スクロース及びポリソルベートに８０を添加し、そして５０～６０ＲＰＭで磁気攪拌機を用いて十分に混合し、賦形剤の混合物を形成した。次に、この混合物を、５０～６０ＲＰＭの攪拌速度で徐々に、狂犬病ｍＡｂ ＴＦＦ収穫物中に添加した。ｐＨを調べ（ｐＨ６．５）、そして必要なら、ヒスチジン－アルギニン緩衝液により調節した。最終製剤を、０．２μＭのフィルターを通して濾過し、そして最終容器中に満たした。
最終製剤中の各成分の濃度は、次の通りであった：
Figure 0007265477000041
さらに、それらの製剤を、９ヵ月間、純度、安定性、効能及び効力について試験した。
実施例１３：０カ月、１カ月、３カ月、及び６カ月の期間にわたって２～８、２５及び４０℃で保存した狂犬病Ｍａｂ製剤の純度及び安定性についての分析試験
１３．１：凝集及び純度分析
ＨＰＬＣに基くサイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ－ＳＥＣ）を用いて、ＤＶ Ｍａｂのバルク製剤及び最終製剤中の凝集体を評価した。この方法によれば、フェノメネックスＢｉｏ－Ｓｅｃ－Ｓ ３０００カラムを用いて、約５０μｇの全抗体を注入し、そして１ｍｌ／分の流速で３５分間流すことにより、狂犬病Ｍａｂの凝集体及びモノマー％を実証した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）を、移動相として使用した。
結果：
Figure 0007265477000042
狂犬病モノクローナル抗体製剤は時間依存性凝集を全く示さず、純度／モノマー含有量は＞ ９９％以上であることが判明した。
１３．２：ＳＤＳ Ｐａｇｅ分析バッチ１ － ２～８℃での試験サンプル
Figure 0007265477000043
Figure 0007265477000044
結論：狂犬病ｍＡｂ製剤は、凝集における有意な時間依存的変化及び分子量の変化を示さなかった。 従って、製剤は２～８℃、２５℃、及び４０℃で安定であることがわかった。

Claims (33)

  1. 高収率及び最小凝集で医薬抗原結合タンパク質製剤を製造する方法であって、前記医薬抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗デングモノクローナル抗体であり、又は前記医薬抗原結合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗狂犬病モノクローナル抗体であり、当該方法が、以下の工程：
    ａ）細胞培養産生培地中で抗原結合タンパク質を発現する哺乳類細胞を大規模に培養する工程、ここで前記培養工程は、細胞数を１０ｘ１０６～２０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの範囲内に効果的に維持し、そして少なくとも２ｇ／ｌの収率をもたらし、ここで前記哺乳類細胞の細胞株は、前記医薬抗原結合タンパク質が抗デングモノクローナル抗体である場合ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳ－ＫＯであり、又は前記医薬抗原結合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗狂犬病モノクローナル抗体である場合ＧＳ－ＣＨＯであり、ここで前記培養工程は、基本培地の使用、供給溶液として濃縮基本培地の使用、明確な供給戦略と共に供給溶液の使用を含み、増強された細胞増殖をもたらし、細胞数を効果的に維持し、それにより、細胞寿命及び収率を高める；
    ｂ）工程（ａ）で得られた回収上清液からの抗原結合タンパク質を精製する工程、ここで前記精製工程は少なくとも８０％の回収率、少なくとも９９％の純度をもたらし、ここで前記精製工程は、順に、親和性クロマトグラフィー、低ｐＨウイルス不活性化、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、ナノ濾過、接線流濾過／限外濾過を含み、前記親和性クロマトグラフィーのマトリックスがプロテインＡであり、そして精製において使用される緩衝剤の塩濃度は、３０ｍＭ～５００ｍＭである；及び
    ｃ）前記医薬抗原結合タンパク質を含有する安定製剤を調製する工程、ここで前記製剤のオスモル濃度が３００～４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、そして前記製剤の粘度が２．５ｍＰａ・Ｓ未満であり、
    ここで前記製剤が、１つ以上の抗原結合タンパク質、１つ以上の安定化剤、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の等張化剤、及び１つ以上の界面活性剤を含む；
    を含み、ここで前記製剤が、以下：
    ｉ）１～１００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１つの抗原結合タンパク質；
    ｉｉ）２０～４０ｍＭのヒスチジン；
    ｉｉｉ）５０～１００ｍＭのアルギニン；
    ｉｖ）０．００２～０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；
    ｖ）５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ；及び
    ｖｉ）０．１～２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）；
    を含み、ここでｐＨは、６．５±０．５であり；そして得られる製剤は２～８℃で少なくとも９ヵ月間、２５℃で少なくとも１ヵ月間、４０℃で少なくとも４０日間、５０℃で少なくとも２日間安定である；
    方法。
  2. 前記細胞培養産生培地が、前記細胞培養工程の間、少なくとも１度、１又は２以上の他の栄養物により補充される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞培養培地が、連続的、毎日、１日置き、２日置き又はそれらの組合せである補充を含むスケジュールで補充される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞培養産生培地が２５０～５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有し；溶存濃度が１０～６０％の範囲で維持され；細胞培養温度が３０℃～３８℃の範囲であり；第１の温度が３６～３７℃であり、そして、第２の温度が３０～３５℃であり；グルコース濃度が７％以下、又は４％及び５％で維持され；生存率が８０％に低められる場合、細胞培養物を収穫し；ここで細胞培養条件が、乳酸濃度などの二次代謝物が５ｇ／ｌ以下、そしてアンモニア濃度が５ｍモル／ｌ以下となるように維持される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞培養産生培地のオスモル濃度が４００～５００ｍＯｓｍ／ｋｇである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記細胞培養産生培地の溶存酸素が、２０～４０％の範囲で維持される、請求項４に記載の方法。
  7. 前記細胞が、バッチ式、流加式、連続式、濯流式、又は流加式で培養される、請求項１に記載の方法。
  8. 精製に使用される緩衝液中の塩濃度は、５０ｍＭ～３００ｍＭの範囲である、請求項１に記載の方法。
  9. 疎水性相互作用クロマトグラフィー、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、マルチモーダルクロマトグラフィー、及びメンブレンクロマトグラフィーの１又は２以上を含む群から選択された追加のクロマトグラフィー工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記プロテインＡクロマトグラフィーが、
    ａ）平衡化緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液；１００～１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％ポリソルベート８０；ｐＨ７．０±２；
    ｂ）ローディング：明澄化された収穫物；
    ｃ）洗浄Ｉ緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液；１００～１５０ｍＭのＮａＣｌ、又は１５０ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％ポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２；
    ｄ）洗浄ＩＩ緩衝液：２０ｍＭのリン酸緩衝液；２５０ｍＭ～１ＭのＮａＣｌ、又は１ＭのＮａＣｌ；０．０５％ポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２；
    ｅ）洗浄ＩＩＩ緩衝液：１０ｍＭのリン酸緩衝液；１００～１５０ｍＭのＮａＣｌ、又は１２５ｍＭのＮａＣｌ；０．０５％ポリソルベート８０；ｐＨ７．０±０．２；
    ｆ）溶出緩衝液：２０ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ３．０±０．２；及び、０．０２５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０；
    ｇ）ＣＩＰ緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ；
    ｈ）滞留時間：４．００～８．００分；
    ｉ）使用カラム：内径２６ｍｍのホウケイ酸カラム；及び
    ｊ）線形流速：１０～５００ｃｍ／時、又は１００～１５０ｃｍ／時；
    を含む、請求項１に記載の方法。
  11. プロテインＡクロマトグラフィーからの溶出液のウィルス不活性化が、ｐＨ３．３～３．５に５０～１００分間、溶出液を保持することにより達成される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記カチオン交換クロマトグラフィーが、１又は２以上のスルホネート系基；スルホエチル系基；スルホプロピル系基、スルホイソブチル系基；スルホキシエチル系基；カルボキシメチル系基；スルホン酸及びカルボン酸系基；カルボン酸系基；スルホン酸系基；及びオルトリン酸系基からなる群から選択される樹脂を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記陽イオン交換クロマトグラフィーか、
    ａ）前平衡化緩衝液；２００ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２、
    ｂ）平衡化緩衝液；１０ｍＭのクエン酸緩衝液；０．０２５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；ｐＨ６．０±０．２、
    ｃ）洗浄緩衝液Ａ：１０ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２、
    ｄ）洗浄緩衝液Ｂ：２０ｍＭのクエン酸緩衝液；３００～５００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ６．０±０．２、
    ｅ）ＣＩＰ緩衝液：０．５ＭのＮａＯＨ、
    ｆ）滞留時間：４．００～７．００分、及び
    ｇ）使用されるカラム：内径２６ｍｍのホウケイ酸カラム、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  14. 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、
    ａ）洗浄緩衝液：０．５ＭのＮａＯＨ、
    ｂ）前平衡化緩衝液：２００ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２、
    ｃ）平衡化緩衝液：２０ｍＭのクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０±０．２；及び０．０２５％ポリソルベート８０、
    ｄ）保存緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ、
    ｅ）線形流速：１０～５００ｃｍ／時、又は１００～１５０ｃｍ／時、及び
    ｆ）使用されるカラム：内径２６ｍｍのホウケイ酸カラム、
    を含む、請求項１に記載の方法。
  15. 前記アニオン交換クロマトグラフィーが、フロースルー及び洗浄モード、又は結合及び溶出モードである、請求項１に記載の方法。
  16. ウィルス粒子の除去が、ウィルス保持フィルターを用いるナノ濾過により達成される、請求項１に記載の方法。
  17. 前記抗原結合タンパク質が、接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて濃縮される、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ＴＦＦが、３０ｋＤａメンブレンを用いて実施される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記接線流濾過工程が、
    ａ）ダイアフィルトレーション緩衝液を用いてのダイアフィルトレーション：２５ｍＭのヒスチジン緩衝液；７５ｍＭのアルギニン緩衝液；５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ：ｐＨ６．５０±０．５；
    ｂ）洗浄緩衝液：０．５ＭのＮａＯＨ；
    ｃ）保存緩衝液：０．１ＭのＮａＯＨ；
    ｄ）５～１０倍の膜容量を用いての平衡化；
    ｅ）１０～２０ダイアフィルトレーション容量を用いての濃縮及びダイアフィルトレーション；
    ｆ）３～５膜容量を用いてのＷＦＩ洗浄；
    ｇ）０．５～１．０ＭのＮａＯＨを用いての洗浄；及び
    ｈ）０．１ＭのＮａＯＨを用いての保存；
    を含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 精製治療用タンパク質調製物が、２％以下の凝集物、又は１％未満の凝集物を含む、請求項１に記載の方法。
  21. 前記安定抗原結合タンパク質製剤が、１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質から成る、請求項１に記載の方法。
  22. 前記安定抗原結合タンパク質製剤が、３％以下の凝集、最小量の目に見えない粒子、及び改善された効力から成る、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記製剤中の抗原結合タンパク質モノマーの濃度が９９％以上であり；残留ＣＨＯ ＤＮＡが抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり２ｐｇ以下、又は、抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり０．１ｐｇ以下であり；残留ＣＨＯタンパク質が、抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり１００ｎｇ以下、又は抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ以下であり；残留プロテインＡが、抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり１０ｎｇ以下、又は抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり１．５ｎｇ以下であり；そしてエンドトキシンは、抗原結合タンパク質１ｍｇ当たり０．１ＥＵ以下である、請求項１に記載の方法。
  24. 前記製剤が、以下：
    ａ）０．５％（ｗ／ｖ）のスクロース；
    ｂ）２５ｍＭのヒスチジン；
    ｃ）７５ｍＭのアルギニン；
    ｄ）１００～１４５ｍＭの塩化ナトリウム；
    ｅ）０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０；及び
    ｆ）１ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質；
    を含有する、請求項１に記載の方法。
  25. ａ）１～１００ｍｇ／ｍｌの少なくとも１つの抗原結合タンパク質、ここで前記抗原結合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗デングモノクローナル抗体であり、又は前記抗原結合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖を有する抗狂犬病モノクローナル抗体である；
    ｂ）２０～４０ｍＭのヒスチジン；
    ｃ）５０～１００ｍＭのアルギニン；
    ｄ）０．００２～０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；
    ｅ）５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ；
    ｆ）０．１～２．５％のスクロース（ｗ／ｖ）；
    から成る医薬製剤であり、ここでｐＨは、６．５±０．５であり、オスモル濃度は３００～４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、粘度は２．５ｍＰａ・Ｓ以下であり、そして２～８℃で少なくとも９ヵ月間、２５℃で少なくとも１ヵ月間、４０℃で少なくとも４０日間、５０℃で少なくとも２日間安定である、医薬製剤。
  26. ２～８０ｍｇ／ｍｌの少なくとも１つの抗原結合タンパク質；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；及び０．５％のスクロース（ｗ／ｖ）から成り、ｐＨが６．５±０．５である、請求項２５に記載の医薬製剤。
  27. 前記製剤のオスモル濃度が３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである、請求項２５又は２６のいずれかに記載の医薬製剤。
  28. ２～８０ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；及び０．５％のスクロース（ｗ／ｖ）を含み、ｐＨが６．５±０．５であり、オスモル濃度が３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、そして粘度が２．５ｍＰａ・Ｓ以下である、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
  29. ２５ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；及び０．５％のスクロース（ｗ／ｖ）から成り、ｐＨが６．５±０．５であり、オスモル濃度が３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、そして粘度が２．５ｍＰａ・Ｓ以下である、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
  30. ５０ｍｇ／ｍｌの抗原結合タンパク質；２５ｍＭのヒスチジン；７５ｍＭのアルギニン；１０１ｍＭのＮａＣｌ；０．０２％のポリソルベート８０（ｗ／ｖ）；及び０．５％のスクロース（ｗ／ｖ）から成り、ｐＨが６．５±０．５であり、オスモル濃度が３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、そして粘度が２．５ｍＰａ・Ｓ以下である、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
  31. デング熱又は狂犬病ウイルスの治療、予防又は診断に使用される、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
  32. 請求項３１に記載の医薬製剤であって、ボトル、バイアル、アンプル、ＩＶバッグ、ウェアラブルインジェクター、ボーラスインジェクター、シリンジ、ペン、ポンプ、マルチドーズニードルシリンジ、マルチドーズペン、インジェクター、シレット、オートインジェクター、プレ－充填注射器、又はそれらの組み合わせから選択される容器に収納される、医薬製剤。
  33. 少なくとも１つの一次包装成分が、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴＧ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリペンタフルオロスチレン（ＰＦＳ）、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリシクロペンタン（ＣＺ）、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリオレフィン、及びそれらの組み合わせ又はコポリマーから選択された容器クロージャーを含む、請求項３２に記載の医薬製剤。
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