ES2926028T3 - Métodos para potenciar la productividad de anticuerpos en cultivos de células de mamíferos y minimizar la agregación durante los procesos de formulación corriente abajo y las formulaciones de anticuerpos estables obtenidas de los mismos - Google Patents
Métodos para potenciar la productividad de anticuerpos en cultivos de células de mamíferos y minimizar la agregación durante los procesos de formulación corriente abajo y las formulaciones de anticuerpos estables obtenidas de los mismos Download PDFInfo
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Abstract
La invención describe una plataforma eficiente para la fabricación y formulación de anticuerpos, que proporciona i) un proceso de cultivo celular con una estrategia de alimentación mejorada que da como resultado un alto título de anticuerpos entre 2 g/l y 5 g/l; ii) proceso de purificación mejorado que muestra un porcentaje óptimo de recuperación, contenido de monómero de alta pureza, formación mínima de agregación/partículas, niveles mínimos de impurezas; y iii) formulación líquida estable de alta concentración con osmolalidad óptima y baja viscosidad a través de diferentes excursiones de temperatura y sin agregación. Los anticuerpos preferidos incluyen el anticuerpo monoclonal IgG1 específico para el epítopo del virus del dengue en el dominio III de la proteína E y el anticuerpo monoclonal IgG1 específico para la glicoproteína G de la superficie del virus de la rabia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para potenciar la productividad de anticuerpos en cultivos de células de mamíferos y minimizar la agregación durante los procesos de formulación corriente abajo y las formulaciones de anticuerpos estables obtenidas de los mismos
Antecedentes de la invención
El desarrollo de formulaciones corriente abajo y corriente arriba a menudo puede ser la etapa limitante en la introducción temprana de productos biofarmacéuticos en ensayos clínicos. Por ejemplo, el dengue es la enfermedad viral transmitida por mosquitos más importante que afecta a los humanos. La mitad de la población mundial vive en áreas de riesgo de dengue, lo que resulta en aproximadamente 390 millones de infecciones por año en todo el mundo. Actualmente no hay agentes antivirales aprobados para tratar el dengue y los ensayos recientes de vacunas no han cumplido las expectativas. La principal candidata a vacuna demostró recientemente una eficacia limitada, estimada entre un 30 % y un 60 %, con una protección limitada o nula contra el DENV-2. Recientemente, se ha identificado un epítopo no inmunodominante, pero funcionalmente relevante, en el dominio III de la proteína E y, posteriormente, se desarrolló un anticuerpo diseñado por ingeniería, Ab513, que exhibe una unión de alta afinidad y neutraliza ampliamente múltiples genotipos dentro de los cuatro serotipos (Refiérase Ram Sasisekharan et al Cell 162, 1-12, July 30, 2015; Samir Bhatt et al, Nature, 2013 April 25; 496 7446: 504-507).Por lo tanto, si consideramos la demanda médica mundial de un anticuerpo monoclonal contra el dengue, las estimaciones recientes indican que se producen hasta 390 millones de infecciones por dengue cada año en todo el mundo, con > 90 millones que presentan la enfermedad, lo que convierte al DENV en una importante amenaza mundial. Si asumimos que el 30 % de los 16 millones de casos de dengue diagnosticados van al hospital, entonces aproximadamente 5 millones requerirán dicho anticuerpo monoclonal contra el dengue, lo que implica que el “anticuerpo purificado” por encima de 4 gm/l se convierte en un requisito previo para satisfacer la demanda mundial de anticuerpo salvador de vida. Además, la carga de la enfermedad del dengue es alta en los países en desarrollo donde la disponibilidad de energía eléctrica y refrigeración a menudo es inadecuada y, por lo tanto, la estabilidad de los anticuerpos a través de las variaciones de temperatura asume una mayor relevancia para estas regiones.
De hecho, si fuera posible tener un proceso de plataforma que se pudiera emplear para fabricar y formular todos los candidatos a anticuerpos monoclonales (mAb), se reduciría en gran medida el tiempo y los recursos necesarios para el desarrollo del proceso. Esto puede tener un impacto significativo en la cantidad de candidatos clínicos que se pueden introducir en los ensayos clínicos. También, los procesos desarrollados para las primeras etapas de los ensayos clínicos, que incluyen aquellos desarrollados utilizando una plataforma, pueden no ser óptimos con respecto a la economía del proceso, rendimiento, volúmenes de grupo, productividad y pueden no ser adecuados para producir las cantidades requeridas para las últimas etapas o las campañas comerciales. Otra consideración importante es la velocidad del desarrollo del proceso, dado que el desarrollo del proceso debe ocurrir antes de la introducción de un candidato terapéutico en los ensayos clínicos. (Refiérase Abhinav A. Shukla et al Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39).
Normalmente, los medios de cultivo de células de mamíferos se basan en formulaciones de medios disponibles comercialmente, que incluyen, por ejemplo, DMEM o Ham's F12. A menudo, las formulaciones de medios no están lo suficientemente enriquecidas para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresión de proteínas biológicas. Sigue existiendo la necesidad de medios de cultivo celular, suplementos y métodos de cultivo celular mejorados para mejorar la producción de proteínas. Anteriormente se informaron aumentos en los títulos de anticuerpos en cultivos celulares a >2 g/l. Referirse F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393. Además, en los reactores de perfusión, las células pueden alcanzar densidades celulares mucho más altas que en los reactores por tandas o por tandas alimentadas convencionales. (Refiérase Sven Sommerfeld et al Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137). Sin embargo, los procesos basados en perfusión son complejos, costosos y también pueden dar lugar a problemas de esterilidad y heterogeneidad no deseada en el patrón de glicosilación. La adición de hidrolizados libres de componentes animales (Bacto TC Yeastolate, Phytone Peptone) a medios definidos químicamente es un enfoque común para aumentar la densidad celular, viabilidad del cultivo y productividad de manera oportuna. Los hidrolizados son digestos de proteínas compuestos por aminoácidos, péptidos pequeños, carbohidratos, vitaminas y minerales que proporcionan suplementos de nutrientes a los medios. Los hidrolizados de soja, trigo y levadura no derivados de animales se utilizan comúnmente en medios de cultivo celular y alimentos para mejorar el título de anticuerpos (refiérase al documento US9284371). Sin embargo, debido a la complejidad de su composición, las variaciones de lote a lote, el atributo indeseable de hacer que el cultivo sea viscoso, el extracto de levadura y los hidrolizados pueden ser una fuente significativa de variabilidad del medio. Debido a la complejidad de los productos de anticuerpos que incluyen isoformas y microheterogeneidades, el rendimiento del proceso de cultivo celular puede tener efectos significativos en la calidad y potencia del producto, especialmente con respecto a la glicosilación, las modificaciones postranscripcionales y los perfiles de impurezas.
A concentraciones más altas, las proteínas, particularmente los anticuerpos, a menudo presentan problemas característicos que incluyen agregación, precipitación, gelificación, menor estabilidad y/o mayor viscosidad.
Se reconoce que los anticuerpos poseen características que tienden a formar agregados y partículas en solución a medida que experimentan degradación o agregación o desnaturalización o modificaciones químicas que dan como resultado la pérdida de actividad biológica durante el proceso de fabricación y/o durante el almacenamiento con el tiempo. Se podrían formar agregados de anticuerpos durante la expresión del cultivo celular, la purificación corriente abajo, la formulación y el almacenamiento. La cosecha de cultivo celular generalmente contiene el nivel más alto de agregado en el proceso (refiérase Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75). Las rutas de degradación de las proteínas pueden implicar inestabilidad química (por ejemplo, cualquier proceso que implique la modificación de la proteína mediante la formación de enlaces o la escisión que da como resultado una nueva entidad química) o inestabilidad física (por ejemplo, cambios en la estructura de orden superior de la proteína). Las tres rutas de degradación de proteínas más comunes son la agregación, desamidación y oxidación de proteínas. Cleland et al Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10(4): 307-377 (1993). Además, las proteínas también son sensibles a, por ejemplo, el pH, fuerza iónica, estrés térmico, corte y estrés interfacial, todo lo cual puede conducir a la agregación y provocar inestabilidad. Para que una proteína permanezca biológicamente activa, una formulación debe preservar intacta la integridad conformacional de al menos una secuencia central de los aminoácidos de la proteína y al mismo tiempo proteger los múltiples grupos funcionales de la proteína de la degradación.
Un problema importante provocado por la formación de agregados es que durante la administración la formulación puede bloquear jeringas o bombas y volverla insegura para los pacientes. Dichas modificaciones de proteínas también pueden hacerlas inmunogénicas, lo que da como resultado la generación de anticuerpos antifármaco por parte del paciente, lo que puede reducir la disponibilidad del fármaco durante las inyecciones posteriores o, peor aún, inducir una reacción autoinmunitaria. Un objetivo principal en el desarrollo de formulaciones de anticuerpos es mantener la solubilidad, estabilidad y bioactividad de las proteínas.
Las primeras sugerencias sobre cómo resolver los problemas de inestabilidad de las formulaciones de proteínas terapéuticas incluían la liofilización del producto farmacéutico, seguida de la reconstitución inmediatamente o poco antes de la administración. Sin embargo, las formulaciones liofilizadas de anticuerpos tienen una serie de limitaciones, que incluyen un proceso prolongado de liofilización y el alto coste de fabricación resultante. Además, los profesionales sanitarios deben reconstituir una formulación liofilizada de forma aséptica y precisa antes de administrarla a los pacientes. La etapa de reconstitución en sí requiere ciertos procedimientos específicos, es decir, (1) se agrega un diluyente estéril (es decir, agua para administración intravenosa y dextrosa al 5 % en agua para administración intramuscular) al vial que contiene el anticuerpo liofilizado, lentamente y de forma aséptica, y el vial se debe agitar muy suavemente durante 30 segundos para evitar la formación de espuma; (2) puede ser necesario que el anticuerpo reconstituido deba permanecer a temperatura ambiente durante un mínimo de 20 minutos hasta que se aclare la solución; y (3) la preparación reconstituida debe administrarse dentro de las seis (6) horas posteriores a la reconstitución. Dicho procedimiento de reconstitución es engorroso y la limitación de tiempo después de la reconstitución puede provocar un gran inconveniente en la administración de la formulación a los pacientes, lo que lleva a un desperdicio significativo, si no se reconstituye adecuadamente, o si la dosis reconstituida no se utiliza dentro de las seis (6) horas y se debe desechar. Por lo tanto, es deseable una formulación líquida debido a factores de conveniencia clínica y para el paciente, así como a la facilidad de fabricación. Sin embargo, las formulaciones farmacéuticas líquidas de proteínas terapéuticas, es decir, los anticuerpos deben ser estables a largo plazo y contener una cantidad segura y eficaz del compuesto farmacéutico.
La eliminación de agregados es más difícil que la eliminación de impurezas relacionadas con el proceso debido a las similitudes biofísicas entre el agregado y el monómero, las múltiples fuentes y tipos de agregados y la menor comprensión del mecanismo de agregación.
Uno de los desafíos más recientes encontrados durante el desarrollo de formulaciones de formas de dosificación de anticuerpos monoclonales de alta concentración es la formación de partículas proteicas subvisibles y visibles durante la fabricación y el almacenamiento a largo plazo. El nivel de partículas proteináceas y no proteináceas en las formulaciones de IgG es una parte cada vez más importante del desarrollo de la purificación y la formulación. (Refiérase Klaus Wuchner et al Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 99, no. 8, august 2010). Además, la formulación líquida debe ser estable a diferentes temperaturas, a saber, temperaturas de 2-8 °C, 25 °C, 40 °C y 55 °C.
Muchas preparaciones de anticuerpos destinadas al uso humano requieren estabilizadores para evitar la desnaturalización, la agregación y otras alteraciones de las proteínas antes del uso de la preparación. Las formulaciones de anticuerpos líquidos de anticuerpos notificados anteriormente (Lucentis, Avastin) tenían manitol, trehalosa como estabilizadores. (Refiérase Susumu Uchiyama et al Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 2041 2052; US20160137727; WO2009120684; US8568720). Sin embargo, la trehalosa es costosa y no es factible desde la economía del proceso a gran escala.
También, la administración IV de anticuerpos generalmente se proporciona como una infusión en lugar de un bolo y, por lo tanto, requiere la dilución de la formulación de mAb, que incluye los excipientes, en fluidos apropiados adecuados para la administración IV. La dilución resultante de los excipientes, especialmente los tensioactivos, que puede disminuir por debajo de la concentración requerida para prevenir la agregación durante la agitación, lo que da como resultado la generación de agregados y partículas subvisibles luego de una agitación suave después de la dilución en bolsas de PVC y PO IV que contienen solución salina al 0.9 %.
La cromatografía de interacción hidrófoba, la hidroxiapatita cerámica y las resinas de intercambio catiónico se han utilizado para la eliminación de agregados, pero ninguna es ideal. La mayoría de los procesos de purificación de anticuerpos informados anteriormente se han basado en gran medida en el uso de cromatografía de interacción hidrofóbica en combinación con cromatografía de Proteína A, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico como un proceso de tres o cuatro etapas (refiérase WO2010141039, WO 2014/207763, WO2013066707, WO2015099165, WO2014102814, WO2015038888, WO2004087761). Sin embargo, las resinas de cromatografía de interacción hidrofóbica requieren grandes cantidades de sales que son costosas, muestran una baja capacidad de unión, pueden ser difíciles de desechar y pueden no ser compatibles con los materiales de construcción de los tanques de almacenamiento de tampón y de producto. Adicionalmente, la diferencia de densidad entre los tampones utilizados para una etapa de HIC puede provocar problemas de estabilidad en el lecho. La hidroxiapatita cerámica también se puede utilizar para la separación de agregados del monómero, pero la resina cerámica puede ser muy difícil de desempacar sin dañar la resina. Por lo tanto, puede que no sea posible almacenar la resina fuera de la columna para su reutilización en una campaña de fabricación posterior (refiérase Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78).
Se encontró que las combinaciones de tres etapas de cromatografía de intercambio catiónico, flujo continuo de intercambio aniónico, cromatografía de interacción hidrofóbica y cromatografía de intercambio catiónico de modo mixto suministran una eliminación adecuada de los contaminantes de la proteína de la célula huésped para un anticuerpo monoclonal derivado de CHO. Sin embargo, dichos esquemas de purificación en general no se han popularizado en las operaciones corriente abajo comerciales debido a la necesidad de diseñar la secuencia de purificación por separado para cada mAb.
El documento WO 2015/122995 A1 divulga un anticuerpo anti-virus del dengue D88 que comprende los dominios Vh y Vl. El documento WO 2006/084006 A1 divulga el anticuerpo anti-virus de la rabia 17C7 así como la producción del mismo. El documento WO 2017/165736 A1 divulga varias formulaciones de anticuerpos anti-dengue.
Por lo tanto, subsiste la necesidad urgente no satisfecha de un proceso de plataforma eficiente para la fabricación y formulación de anticuerpos que cumpla con múltiples criterios, que incluyen la solidez, confiabilidad y escalabilidad, en particular una plataforma que proporcione i) un título de anticuerpos de al menos 2 g/l; ii) agregación /formación de partículas mínima en los procesos de cultivo celular, purificación y formulación; iii) purificación mejorada que muestra un porcentaje óptimo de recuperación, alto contenido de monómero y niveles mínimos de impurezas; y iv) formulación de anticuerpos de alta concentración que muestra baja viscosidad, desprovista de agregación y partículas subvisibles; mostrando de esta manera estabilidad a largo plazo.
Resumen
El solicitante ha encontrado sorprendentemente
a) Se encontró que composición alimenticia y una estrategia de alimentación que tenga en cuenta el consumo de nutrientes, la acumulación de subproductos y el equilibrio entre la promoción del crecimiento y la productividad volumétrica en la que, en particular, los parámetros del proceso de cultivo de células de mamíferos, como uso de un medio basal particular, uso de un medio basal concentrado como la solución de alimentación, uso de diferentes soluciones de alimentación junto con una estrategia de alimentación definida, manteniendo concentraciones más bajas de lactato y amoníaco, mejoran el crecimiento celular, la longevidad celular y la expresión de proteínas; lo que da como resultado un mayor título de anticuerpos.
b) Concentración de sal específica como parte del tampón durante las etapas de afinidad de Proteína A e intercambio catiónico que minimizan la agregación; consiguiendo de esta manera un contenido de monómero mayor del 99 % con una recuperación mayor del 80 %.
c) Formulaciones de anticuerpos líquidos libres de partículas que comprenden sacarosa en combinación con Histidina, Arginina, Polisorbato-80, Cloruro de sodio que imparten mayor potencia y estabilidad, reducen la viscosidad de soluciones de anticuerpos altamente concentrados a 2-8 °C durante al menos 9 meses, a 25 °C durante al menos 1 mes, a 40 °C durante al menos 42 días, a 55 °C durante al menos 2 días en comparación con una formulación desprovista de sacarosa.
Un primer aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para fabricar una proteína de unión a antígeno farmacéutica con alto rendimiento y mínima agregación, en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia de acuerdo con la SEQ ID 3 y SEQ ID 4, el método comprende las etapas de: a) cultivar células de mamíferos a gran escala que expresan proteína de unión a antígeno en un medio de producción de cultivo celular, en el que la etapa de cultivo mantiene efectivamente el recuento celular en el rango de 10 x 106 - 20 x 106 células/ml y da como resultado un rendimiento de al menos 2 gm/l; en el que la estirpe celular de células de mamífero es CHO-K1 SV GS-KO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue y la estirpe celular de células de mamífero es GS-CHO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo
monoclonal anti-rabia; en el que la etapa de cultivo incluye el uso de medio basal, uso de medio basal concentrado como solución de alimentación, uso de soluciones de alimentación junto con una estrategia de alimentación definida, lo que resulta en crecimiento celular potenciado, manteniendo concentraciones más bajas de lactato y amoniaco, y manteniendo efectivamente el recuento celular aumentando de esta manera la longevidad celular y el alto rendimiento; b) purificación de la proteína de unión a antígeno del sobrenadante recogido obtenido en la etapa (a), en el que la purificación da como resultado la recuperación de al menos 80% y pureza de al menos 99%; y en el que la purificación comprende cromatografía de afinidad, inactivación viral a bajo pH, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, nanofiltración, filtración/ultrafiltración de flujo tangencial; de manera secuencial; en el que la matriz de cromatografía de afinidad es la Proteína A; en el que la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 30 mM - 500 mM; y c) preparar una formulación estable que comprende la proteína de unión a antígeno, en la que la osmolalidad de la formulación está en el rango de 300 - 400 mOsm/Kg y la viscosidad de la formulación es menor de 2.5 mPa-S, en la que la formulación comprende al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un estabilizador, al menos un agente tampón, al menos un agente de tonicidad, y al menos un tensioactivo; en el que la formulación comprende 1 -100 mg/ml de la proteína de unión a antígeno; 20 - 40 mM de histidina; 50- 100 mM de arginina; Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v); NaCl 50- 150 mM; y sacarosa al 0.1 -2.5% p/v; en el que pH de la formulación es 6.5 ± 0.5; y en el que la formulación resultante es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
Un segundo aspecto de la presente divulgación se refiere a una formulación farmacéutica que comprende: 1 - 100 mg/ml de al menos una proteína de unión a antígeno, en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia de acuerdo con la s Eq ID 3 y SEQ ID 4; 20 - 40 mM de histidina; 50 - 100 mM de arginina; Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v); NaCl 50-150 mM; sacarosa al 0.1 - 2.5% p/v; en la que pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, en la que la osmolalidad de la formulación es 300 - 450 mOsmol/kg y la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S y dicha formulación es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
Un tercer aspecto de la presente divulgación se refiere a una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación para uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de virus de dengue o rabia.
Otros objetivos y características de la presente divulgación aparecerán a partir de la siguiente descripción, de los dibujos, así como de las reivindicaciones adjuntas.
Lista de Figuras:
1. Figura 1: Diagrama de flujo: procesamiento corriente abajo para la purificación de anticuerpos monoclonales
2. Figura 2: Diagrama de flujo: proceso de formulación de anticuerpos monoclonales
Descripción
Un primer aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para fabricar una proteína de unión a antígeno farmacéutica con alto rendimiento y mínima agregación, en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia de acuerdo con la SEQ ID 3 y SEQ ID 4, el método comprende las etapas de: a) cultivar células de mamíferos a gran escala que expresan proteína de unión a antígeno en un medio de producción de cultivo celular, en el que la etapa de cultivo mantiene efectivamente el recuento celular en el rango de 10 x 106 - 20 x 106 células/ml y da como resultado un rendimiento de al menos 2 gm/l; en el que la estirpe celular de células de mamífero es CHO-K1 SV GS-KO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue y la estirpe celular de células de mamífero es GS-CHO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia; en el que la etapa de cultivo incluye el uso de medio basal, uso de medio basal concentrado como solución de alimentación, uso de soluciones de alimentación junto con una estrategia de alimentación definida, lo que resulta en crecimiento celular potenciado, manteniendo concentraciones más bajas de lactato y amoniaco, y manteniendo efectivamente el recuento celular aumentando de esta manera la longevidad celular y el alto rendimiento; b) purificación de la proteína de unión a antígeno del sobrenadante recogido obtenido en la etapa (a), en el que la purificación da como resultado la recuperación de al menos 80% y pureza de al menos 99%; y en el que la purificación comprende cromatografía de afinidad, inactivación viral a bajo pH, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, nanofiltración, filtración/ultrafiltración de flujo tangencial; de manera secuencial; en el que la matriz de cromatografía de afinidad es la Proteína A; en el que la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 30 mM - 500 mM; y c) preparar una formulación estable que comprende la proteína de unión a antígeno, en la que la osmolalidad de la formulación está en el rango de 300 - 400 mOsm/Kg y la viscosidad de la formulación es menor de 2.5 mPa-S, en la que la formulación comprende al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un estabilizador, al menos un agente tampón, al menos un agente de tonicidad, y al menos un tensioactivo; en el que la formulación comprende 1 -100 mg/ml de la proteína de unión a antígeno; 20 - 40 mM de histidina; 50 - 100 mM de arginina; Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v); NaCl 50- 150 mM; y sacarosa al 0.1
- 2.5% p/v; en el que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5; y en el que la formulación resultante es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
La proteína de unión a antígeno tiene afinidad de unión hacia los epítopos presentes en el virus del dengue o el virus de la rabia.
El punto isoeléctrico (pI) de dicha proteína de unión a antígeno puede ser 7.5 - 8.5, más preferiblemente 7.8 a 8.2, aún más preferiblemente 8.12.
La estirpe celular utilizada para la expresión de la proteína de unión a antígenos son células de Ovario de Hámster Chino; más particularmente la estirpe celular de mamífero es CHOK1SV GS-KO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue y la estirpe celular de células de mamífero es GS-CHO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia.
De acuerdo con una realización, el medio de cultivo celular se complementa con uno o más de otros nutrientes, al menos una vez durante la etapa de cultivo.
De acuerdo con otra realización, el medio de producción de cultivo celular se complementa en un programa que comprende la suplementación que es continua, diaria, día por medio, cada dos días o una combinación de las mismas.
De acuerdo con una realización adicional, las células se cultivan en una tanda, tanda alimentada, modo continuo, modo de perfusión; más particularmente en un modo de tanda alimentada. Se entiende muy bien que un experto en la técnica puede modular un proceso de acuerdo con el presente documento de acuerdo con las instalaciones disponibles y las necesidades individuales. Más particularmente, el proceso de cultivo celular se puede llevar a cabo en modo de tanda alimentada proporcionando crecimiento celular potenciado, longevidad celular y una mayor expresión de proteínas, es decir, proporciona un rendimiento de cosecha de al menos 2 gm/l, preferiblemente en el rango de 3 gm/l a 6 gm/l.
El cultivo celular se puede realizar en un matraz, un biorreactor, un biorreactor de tanque, un biorreactor de bolsa o un biorreactor desechable. Preferiblemente, dicho biorreactor se selecciona del grupo de biorreactor de tanque agitado, biorreactor de columna de burbujeo, biorreactor de elevación por aire, biorreactor de lecho fluidizado o biorreactor de lecho empacado; y dicho biorreactor tiene un volumen seleccionado de 1 l, 2 l, 3 l, 5 l, 10 l, 20 l, 100 l, 200 l, 250 l, 350 l, 500 l, 1000 l, 1500 l, 3000 l, 5000 l, 10000L, 20000L y 30.000 litros.
Los métodos y medios de cultivo celular se pueden utilizar para aumentar la producción de anticuerpos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110%, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 180 %, o 200 %, lo más preferiblemente 40 % a 60 % medido en el transcurso de quince días. El período de tiempo del método de tanda de alimentación puede ser de 12 a 20 días; 15 a 20 días o 15 a 18 días.
El medio de cultivo celular se puede seleccionar del grupo que comprende uno o más de CD CHO, CD OptiCHO™, CD FortiCHO™ (Life Technologies); Ex-Celda™ CD CHO (Sigma Aldrich); ProCHO™5 (Lonza); Crecimiento A de CHO BalanCD™ (Irvine Scientific); CDM4Mabv (Hyclone); CHO-100 Cellvento™ (EMD Millipore); Cell vento 200 (Merck Millipore); Cell vento 220 (Merck Millipore); Actipro (Hyclone); y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, el medio de cultivo celular se selecciona de Cell Vento 220 (Merck), ACTIPRO (HyClone/GE) o Medio “Dynamis” Gibco™ (Thermo Fisher).
El medio de cultivo celular se puede complementar además con glucosa y otras soluciones de alimentación para aumentar el crecimiento celular, la longevidad celular, la expresión de proteínas y el rendimiento. Se entiende muy bien en la técnica que las soluciones de alimentación se pueden complementar en forma de bolo rápido o de goteo gradual.
De acuerdo con un ejemplo, la suplementación de la solución de alimentación en medio de cultivo celular se realiza con una estrategia de alimentación que comprende:
- Alimentación inicial con Solución de Alimentación A, de 0.05 % a 0.5 % del volumen del reactor, preferiblemente de 0.1 % a 0.2 % del volumen del reactor, desde el día 4;
- Alimentación con solución de Alimentación A, de 0.1 % a 0.5 % del volumen del reactor los días 6, 8, 10, 11 y 13; - Alimentar la solución B a menos del 8 % del volumen del reactor, desde el día 2 hasta el día 14, en días alternos o en forma continua;
- Alimentación con Solución de Alimentación C a menos del 8 % del volumen del reactor durante al menos 2 días consecutivos a partir del día 2 o el día 3, que tiene un espacio intermitente de 2 días consecutivos, hasta el día 12o o el día 14o o el día 15o o el día 16o o el día 18o.
- Alimentación con Solución de Alimentación D a menos del 0.5 % del volumen del reactor durante al menos 2 días consecutivos que inician desde el día 4 o el día 5, en días alternos o de forma continua o que tienen un espacio intermitente de 2 días consecutivos, hasta el día 12o o el día 14o o el día 15o o el día 16o o el día 18o. Opcionalmente
la alimentación de al menos una solución de alimentación seleccionada de EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B, EfficientFeed™ C, y Antiespumante Dow corning C.
Preferiblemente, dicha solución de Alimentación A, solución de Alimentación B, solución de Alimentación C, Solución de alimentación D se seleccionan una o más del grupo que comprende Glucosa, Suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a y 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone/GE), Cell Vento 220 (1X medio), eX-CELL® Avanced™ Alimentación CHO 1, EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B y EfficientFeed™ C, y combinación de los mismos.
Más preferiblemente, dicha solución de Alimentación A es Suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone); la solución de Alimentación B es EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), la solución de Alimentación C es suplementos Cell Boost 7a (Hyclone), la solución de Alimentación D es suplementos Cell Boost 7b (Hyclone). Además, el medio de cultivo celular se complementa con un “3X Actipro” al 10 % (Hyclone) en el 3rd día y Cell Vento 220 al 8 % (1X medio) el 7o día de cultivo celular. Se entiende muy bien que toda la adición de alimentaciones puede variar en ± 1 % y ± 1 día por un experto en la técnica.
Se pueden condiciones de cultivo celular para aumentar el crecimiento celular y la longevidad y la expresión de proteínas. Las siguientes condiciones de cultivo celular empleadas durante el proceso incluyen pero no se limitan a:
- El pH de medio de cultivo celular está en el rango de 6.5 y 7.5;
- La osmolalidad del medio de cultivo está en el rango de 250 - 500 mOsm/kg; más preferiblemente 400 - 500 mOsm/kg. - El oxígeno disuelto está en el rango de 10 - 60%; preferiblemente 20-40%; más preferiblemente 30%.
- La temperatura del cultivo celular está en el rango de 30 °C a 38 °C; primera temperatura preferiblemente 36 - 37 °C y opcionalmente segunda temperatura preferiblemente 30 - 35 °C.
- La concentración de glucosa se mantiene por debajo de 7%; preferiblemente entre 4% y 5%.
- La cosecha del cultivo celular cuando la viabilidad se reduce a 80 %;
en las que las condiciones del cultivo celular se mantienen de tal manera que los metabolitos secundarios, tales como la concentración de lactato no sea mayor de 5 g/l; y la concentración de amoniaco no sea mayor de 5 mMol/l.
De acuerdo con una realización, el medio de cultivo celular tiene una osmolalidad en el rango de 250 - 500 mOsm/Kg; pH en el rango de 6.5 - 7.5; el oxígeno disuelto se mantiene en el rango de 10 - 60%; la temperatura del cultivo celular está en el rango de 30 °C a 38 °C; primera temperatura preferiblemente 36 - 37 °C y opcionalmente segunda temperatura preferiblemente 30 - 35 °C; la concentración de glucosa se mantiene por debajo de 7%; preferiblemente entre 4% y 5%; cosecha del cultivo celular cuando la viabilidad se reduce a 80 %; en la que las condiciones del cultivo celular se mantienen de tal manera que los metabolitos secundarios, tales como la concentración de lactato no sea mayor de 5 g/l; y la concentración de amoniaco no sea mayor de 5 mMol/l. Preferiblemente, la osmolalidad del medio de fermentación es 400 - 500 mOsm/kg.
En otra realización, el oxígeno disuelto del medio de fermentación se mantiene en el rango de 20 - 40%.
La proteína de unión a antígeno obtenida de la cosecha del cultivo celular se somete a un proceso de purificación que comprende cromatografía de afinidad, inactivación viral a bajo pH, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, nanofiltración, filtración/ultrafiltración de flujo tangencial; de manera secuencial; en la que la matriz de cromatografía de afinidad es la Proteína A; en la que la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 30 mM - 500 mM.
De acuerdo con una realización específica, la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 50 mM - 300 mM.
La purificación da como resultado una recuperación de al menos el 80 % y una pureza de al menos el 99 %. Las impurezas, que incluyen el ADN celular residual, la proteína celular residual y la proteína A residual en la proteína terapéutica purificada final, son menores del 1 %.
Los problemas de agregación de la proteína de unión al antígeno durante el procesamiento corriente abajo de la proteína se pueden mitigar al utilizar i) Sal en una etapa de lavado con cromatografía de afinidad y ii) Gradiente lineal de la solución salina para elución en la etapa de cromatografía de intercambio iónico. Preferiblemente, la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 30 mM - 500 mM, más preferiblemente la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 50 mM - 300 mM.
La cromatografía de afinidad utilizada es la cromatografía de Proteína A.
La resina utilizada para la cromatografía de Proteína A se puede seleccionar del grupo que comprende uno o más de Eshmuno A, KanCapATM, MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose Fast Flow, Poros® MabCapture A, Amsphere™ Proteína A JWT203, ProSep HC, ProSep Ultra, y ProSep Ultra Plus.
Preferiblemente, la resina de cromatografía de afinidad de Proteína A es MabSelect SuRe™, Eshmuno A, Kancap A o Poros MabCapture. Más preferiblemente, la resina de cromatografía de afinidad de Proteína A es MabSelect SuRe™.
El tampón de lavado utilizado para la cromatografía de Proteína A se puede seleccionar del grupo que comprende uno o más de
- tampón de fosfato 10 - 30 mM, preferiblemente tampón de fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM, preferiblemente NaCl 150 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2;
- tampón de fosfato 10 - 30 mM, preferiblemente tampón de fosfato 20 mM; NaCl 250 mM -1 M, preferiblemente NaCl 1M; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2;
- tampón de fosfato 1-30 mM, preferiblemente tampón de fosfato 10 mM; NaCl 100- 150 mM, preferiblemente NaCl 125 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2.
El tampón de elución utilizado para la cromatografía de Proteína A puede comprender de tampón de citrato 10 - 30 mM; pH 3.0 ± 0.5; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.01 - 0.05 % (p/v); preferiblemente el tampón de elución comprende tampón de citrato 20 mM; pH 3.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v).
De acuerdo con una realización, la cromatografía de proteína A comprende: a) Tampón de equilibrio: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2; b) Carga: Cosecha Clarificada; c) Tampón de lavado I: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM, más particularmente 150 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2; d) Tampón de lavado II: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 250 mM -1 M, más particularmente 1 M; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2; e) Tampón de lavado III: tampón de fosfato 10 mM; NaCl 100 -150 mM, más particularmente 125 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2; f) Tampón de elución: tampón de citrato 20 mM; pH 3.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v); g) Tampón CIP: NaOH 0.1 M; h) tiempo de residencia: 4.00 - 8.00 minutos; i) columna utilizada: XK26; j) El caudal lineal es 10 - 500 cm/h, más particularmente 100-150 cm/h.
El eluato obtenido de la etapa de cromatografía de afinidad se somete a inactivación viral a pH bajo. Se entiende muy bien en la técnica que la inactivación viral y la reducción del eluato se pueden efectuar mediante un método seleccionado individualmente o en combinación del grupo que comprende tratamiento de pH, tratamiento con detergente, tratamiento térmico y filtración de reducción de virus.
De acuerdo con una realización, inactivación viral del eluato de la cromatografía de afinidad de la proteína A se logra al mantener el eluato a pH 3.3 - 3.5 durante 50 - 100 minutos.
Se puede neutralizar el pH del eluato al someterlo a un tampón de neutralización, es decir, tampón Tris/citrato 1 M, pH 7.0 ± 0.2. Se entiende muy bien en la técnica que cualquier otro tampón compatible se puede utilizar alternativamente para la neutralización efectiva del pH del eluato.
El eluato viral inactivado se somete a cromatografía de intercambio catiónico e intercambio aniónico. Esta cromatografía se puede llevar a cabo en modo “unir y eluir” o modo “fluir a través”. Preferiblemente, la cromatografía de intercambio catiónico y la cromatografía de intercambio aniónico se llevan a cabo en cualquier orden secuencial. La resina de cromatografía puede ser una resina multimodal como la resina Capto MMC (GE Healthcare).
De acuerdo con una realización, la cromatografía de intercambio catiónico se realiza utilizando una resina seleccionada del grupo que comprende uno o más de un grupo basado en sulfonato; un grupo basado en sulfoetilo; un grupo basado en sulfopropilo; un grupo basado en sulfobutilo; un grupo basado en sulfoxietilo, un grupo basado en carboximetilo; grupos basados en ácido sulfónico y carboxílico; un grupo basado en ácido carboxílico; un grupo basado en ácido sulfónico; y un grupo basado en ortofosfato.
Preferiblemente, los parámetros de cromatografía de cationes que incluyen la resina de cromatografía y las condiciones del tampón se seleccionan de tal manera que la proteína cargada positivamente se una a la resina de cromatografía mientras que las moléculas cargadas negativamente entran en el flujo, las proteínas adicionales se someten a elución utilizando un gradiente de sal.
Preferiblemente, la resina de cromatografía de intercambio catiónico se selecciona del grupo que comprende uno o más grupos basados en sulfonato (por ejemplo, MonoS, MiniS, Source 15S y 30S, SP SEPHAROSE® Fast Flow, SP SEPHAROSE® High Performance de GE Healthcare, TOYOPEARL® SP-650S y SP-650M de Tosoh, MACRO-PREP® High S de BioRad, Ceramic HyperD S, TRISACRYL® M y LS SP y Spherodex LS SP de Pall Technologies); un grupo basado en sulfoetilo (por ejemplo, FRACTOGEL® SE, de EMD, POROS® S-10 y S-20 de Applied Biosystems); un grupo basado en sulfopropilo (por ejemplo, TSK Gel SP 5PW y SP-5PW-HR de Tosoh, POROS® HS-20, HS 50 y POROS® XS de Life Technologies); un grupo basado en sulfoisobutilo (por ejemplo, FRACTOGEL® EMD S03” de EMD); un grupo basado en sulfoxietilo (por ejemplo, SE52, SE53 y Express-Ion S de Whatman), un grupo basado en carboximetilo (por ejemplo, CM SEPHAROSE® Fast Flow de GE Healthcare, Hydrocell CM de Biochrom Labs Inc., MACRO-PREP® CM de BioRad, Ceramic HyperD CM, TRISACRYL® M CM, TRISACRYL® LS CM, de Pall Technologies, Matrex CELLUFINE® C500 y c 200 de Millipore, CM52, CM32, CM23 y Express-Ion C de Whatman, TOYOPEARL® CM-650S, CM-650M y CM-650C de Tosoh); grupos a base de ácido sulfónico y carboxílico (por
ejemplo, Carboxi-sulfón BAKERBOND® de J.T. Baker); un grupo basado en ácido carboxílico (por ejemplo, WP CBX de J.T Baker, DOWEX® MAC-3 de Dow Liquid Separations, Intercambiadores Catiónicos Débiles AMBERLITE®, Intercambiador Catiónico Débil DOWEX® e Intercambiadores Catiónicos Débiles DIAION® de Sigma-Aldrich y FRACTOGEL® EMD COO-de EMD); un grupo basado en ácido sulfónico (por ejemplo, Hydrocell SP de Biochrom Labs Inc., Resina Catiónica de Ácido Fuerte de Malla Fina DOWEX® de Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic de J.T. Baker, membrana S SARTOBIND® de Sartorius, Intercambiadores Catiónicos Fuertes AMBERLITE®, Catión fuerte DOWEX® e Intercambiador Catiónico Fuerte DIAION® de Sigma-Aldrich); y un grupo basado en ortofosfato (por ejemplo, PI 1 de Whatman).
Más preferiblemente, la resina utilizada para la cromatografía de intercambio catiónico es Fractogel® EMD SO3-Fractogel® EMD SE Hicap (Merck), CMM HyperCel™ (Pall Corporation), Capto S ImpAct.
Los parámetros del proceso para la cromatografía de intercambio catiónico incluyen, pero no se limitan a, tampón de pre-equilibrio [tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2]; tampón de equilibrio [tampón de citrato 10 mM; Polisorbato 80 (0.025 % (p/v)); pH 6.0 ± 0.2]; Retención de pH bajo para neutralización; tampón de lavado A [tampón de citrato 10 mM; pH 6.0 ± 0.2]; tampón de lavado B [tampón de citrato 20 mM; NaCl 300 - 500 mM; pH 6.0 ± 0.2]; tampón CIP [NaOH 0.5 M]; Tiempo de residencia [4.00 - 7.00 minutos]; Columna utilizada [XK26].
Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la cromatografía de intercambio catiónico comprende a) Tampón de pre equilibrio: tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2; b) Tampón de equilibrio: tampón de citrato 10 mM; Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v); pH 6.0 ± 0.2; c) Tampón de lavado A: tampón de citrato 10 mM; pH 6.0 ± 0.2; d) Tampón de lavado B: tampón de citrato 20 mM; NaCl 300 - 500 mM; pH 6.0 ± 0.2; e) Tampón CIP: NaOH 0.5 M; f) Tiempo de residencia: 4.00 - 7.00 minutos; g) Columna utilizada: XK26.
El eluato viral inactivado también se somete a cromatografía de intercambio aniónico. Preferiblemente, los parámetros de cromatografía aniónica que incluyen la resina de cromatografía y las condiciones del tampón se seleccionan de tal manera que todas las impurezas cargadas negativamente se unan a la membrana mientras la proteína terapéutica se eluye en un flujo continuo.
Preferiblemente, la resina de cromatografía de intercambio aniónico se selecciona del grupo que comprende uno o más de celulosa DEAE, POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 de Applied Biosystems, SARTOBIND® Q de Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q y 30Q, Q, DEAE y ANX SEPHARo SE® Fast Flow, Q SEPHAROSE, Q SEPHAROSE® High Performance, QAE SEPHADEX® y FAST Q SEPHAROSE® (GE Healthcare),WP PEI, WP DEAM, WP QUAT de J.T. Baker, Hydrocell DEAE e Hydrocell QA de Biochrom Labs Inc., U Osphere Q, MACROPREP® DEAE y MACRO-PREP® High Q de Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, TRISACRYL® M y LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA SPHEROSIL® LS, QMA SPHEROSIL® M y MUSTANG® Q de Pall Technologies, Resinas aniónicas de malla fina de base fuerte tipo I y tipo II DOWEX® y DOWEX® MONOSPHER E 77, anión de base débil de Dow Liquid Separations, membrana INTERCe Pt ® Q, Matrex Ce LLUFINE® A200, A500, Q500 y Q800, de Millipore, FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD DEAE y FRACTOGEL® EMD DMAE de EMD, intercambiadores aniónicos fuertes débiles tipo I y II AMBERLITE®, intercambiadores aniónicos débiles y fuertes tipo I y II DOWEX®, intercambiadores aniónicos débiles y fuertes tipo I y II DIAION®, DUOLITE® de Sigma-Aldrich, gel Q TSK y DEAE 5PW y 5PW-HR, TOYOPEARL® SuperQ-650S, 650M y 650C, QAE-550C y 650S, DEAE-650M y 650C de Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D y Express-Ion Q de Whatman; más preferiblemente, la resina de cromatografía de intercambio aniónico se selecciona de Sartobind Q (Sartorius), Eshmuno Q (Merck), MUSTANG® Q (Pall Corporation) y Poros X (Thermo).
Los parámetros del proceso para la cromatografía de intercambio aniónico incluyen, pero no se limitan a, tampón de limpieza [NaOH 0.5 M]; tampón de pre-equilibrio [tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2]; tampón de equilibrio [tampón de citrato 20 mM; pH 6.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025%]; tampón de almacenamiento [NaOH 0.1 M]; Caudal lineal [10 - 500 cm/h, más particularmente 100-150 cm/h]; Columna utilizada [XK26].
Por lo tanto, de acuerdo con una realización, la cromatografía de intercambio aniónico comprende a) tampón de limpieza: NaOH 0.5 M; b) tampón de pre-equilibrio: tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2; c) tampón de equilibrio: tampón de citrato 20 mM; pH 6.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025%; d) tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M; e) El caudal lineal es 10 - 500 cm/h, más particularmente 100-150 cm/h; f) Columna utilizada: XK26.
De acuerdo con otra realización, la cromatografía de intercambio aniónico es “modo de flujo y lavado” o “modo de unión y elución”.
De acuerdo con una realización, el método de acuerdo con la presente divulgación puede comprender adicionalmente una etapa de cromatografía adicional seleccionada del grupo que comprende una o más de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, cromatografía de hidroxiapatita cerámica, cromatografía multimodal (Capto MMC y Capto Adhere), cromatografía de membrana (membranas Q que incluyen Intercept™ (Millipore), Mustang® (Pall Corporation) y Sartobind™ (Sartorius)).
En el método de acuerdo con la presente divulgación, las partículas de virus se pueden eliminar utilizando un filtro de 20 nm.
De acuerdo con una realización, la eliminación de partículas virales se logra mediante nanofiltración utilizando filtro retentivo de virus. El filtro retentivo de virus se puede seleccionar del grupo de Viresolve PRO (Merck), Planova 20N (Asahi Kasei), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences), y Virosart (Sartorius), filtro Virosart CPV de Sartorius, Virosolve de Millipore, Ultipor DV20 o DV50 de Pall, Planova 20N y 50N o BioEx de Asahi. Se entiende muy bien en la técnica que se puede utilizar cualquier otro filtro que tenga capacidad de retención de virus en esta etapa. Preferiblemente, el filtro utilizado para la eliminación de partículas virales se selecciona de Viresolve PRO (Merck), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences) y Virosart (Sartorius).
La proteína terapéutica se concentra a una concentración deseada y el tampón se intercambia en el tampón de formulación. El tampón se intercambia en un sistema de filtración de flujo tangencial o en un sistema de filtración de ultra flujo.
De acuerdo con una realización, la proteína de unión a antígeno se concentra utilizando Filtración de Flujo Tangencial (TFF).
De acuerdo con otra realización, la TFF se lleva a cabo utilizando una membrana de 30 kDa.
Los parámetros de filtración de flujo tangencial comprenden uno o más de los seleccionados de Diafiltración utilizando tampón de diafiltración [tampón de histidina 25 mM; tampón de arginina 75 mM; NaCl 50 - 150 mM; pH 6.50 ± 0.5]; tampón de limpieza [NaOH 0.5 M]; tampón de almacenamiento [NaOH 0.1 M]; Equilibrio utilizando volumen de membrana de 5 -10 X; Concentración y Diafiltración utilizando volumen de diafiltración 10-20; lavado WFI utilizando volumen de membrana de 3-5; limpieza utilizando NaOH 0.5 -1.0 M; Almacenamiento [NaOH 0.1 M].Preferiblemente, la filtración de flujo tangencial se lleva a cabo utilizando una membrana MWCO de 30 kDa seleccionada del grupo que comprende una o más membranas de PES de la serie Centramate T (Pall Corporation), Hydrosart (Sartorius), y Pelicon 3 (Merck).
De acuerdo con una realización específica, el proceso de Filtración de Flujo Tangencial comprende a) Diafiltración utilizando tampón de diafiltración: tampón de histidina 25 mM; tampón de arginina 75 mM; NaCl 50 -150 mM; pH 6.50 ± 0.5; b) tampón de limpieza: NaOH 0.5 M; c) tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M; d) Equilibrio utilizando volumen de membrana 5 -10 X; e) Concentración y diafiltración utilizando volumen de diafiltración 10 - 20; f) lavado WFI utilizando volumen de membrana 3-5; g) Limpieza utilizando 0.5 - 1.0 M. El método de la presente divulgación comprende la etapa de c) preparar una formulación estable que comprende la proteína de unión a antígeno, en la que la osmolalidad de la formulación está en el rango de 300 - 400 mOsm/Kg y la viscosidad de la formulación es menor de 2.5 mPa-S, en la que la formulación comprende al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un estabilizador, al menos un agente tampón, al menos un agente de tonicidad, y al menos un tensioactivo. La formulación comprende 1 - 100 mg/ml de la proteína de unión a antígeno; 20 - 40 mM de histidina; 50-100 mM de arginina; Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v); NaCl 50 - 150 mM; y sacarosa al 0.1 -2.5% p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5; y en la que la formulación resultante es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
De acuerdo con una realización del método de la presente divulgación, la preparación de proteína terapéutica purificada contiene no más de 2% de agregados, preferiblemente menos de 1 % de agregados.
De acuerdo con otra realización del método de la presente divulgación, la formulación de proteína de unión a antígeno estable comprende 1 mg/ml a 100 mg/ml de proteína de unión a antígeno.
De acuerdo con todavía otra realización del método de la presente divulgación, la formulación de proteína de unión a antígeno comprende no más de 3 % de agregación, cantidad mínima de partículas subvisibles y potencia mejorada.
De acuerdo con una realización adicional del método de la presente divulgación, la concentración del monómero de proteína de unión a antígeno en la formulación es mayor de 99 %; el ADN de CHO residual no es mayor de 2 pg/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 0.1 pg/mg de proteína de unión a antígeno; la proteína de CHO residual no es mayor de 100 ng/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 10 ng/mg de proteína de unión a antígeno; la Proteína A residual no es mayor de 10 ng/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 1.5 ng/mg de proteína de unión a antígeno; la Endotoxina no es mayor de 0.1 EU/mg de proteína de unión a antígeno.
De acuerdo con todavía otra realización del método de la presente divulgación, la formulación comprende <1 % (p/v), aún más preferiblemente 0.5% (p/v), sacarosa; 25 mM, histidina; 75 mM, arginina; 100 - 145 mM, cloruro de sodio; 0.02 %(p/v), Polisorbato 80; y 1 mg/ml a 50 mg/ml, proteína de unión a antígeno.
En un segundo aspecto, la presente divulgación se refiere a una formulación farmacéutica que comprende a) 1 -100 mg/ml de al menos una proteína de unión a antígeno, en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo
monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia de acuerdo con la SEQ ID 3 y SEQ ID 4; b) 20 - 40 mM de histidina; c) 50 - 100 mM de arginina; d) Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v); e) NaCl 50 - 150 mM; f) sacarosa al 0.1 - 2.5% p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, en la que la osmolalidad de la formulación es 300 - 450 mOsmol/kg y la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S y dicha formulación es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica comprende 2 - 80 mg/ml de al menos una proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5% (p/v); en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5.
A la osmolalidad de la formulación es 380 mOsmol/kg.
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica comprende 2 - 80 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica comprende 25 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con una realización, la formulación farmacéutica comprende 50 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con otra realización, la formulación es una formulación líquida.
La proteína de unión a antígeno purificada se puede formular con excipientes farmacéuticos.
Por lo tanto, la formulación de proteína de unión a antígeno comprende al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un estabilizador (sacarosa), al menos un agente tampón (histidina y arginina), al menos un agente de tonicidad (cloruro de sodio, NaCl), y al menos un tensioactivo (Polisorbato 80). Opcionalmente, la formulación comprende un conservante.
La formulación puede comprender un estabilizador adicional seleccionado del grupo que comprende uno o más de sorbitol, trehalosa, manitol, dextrano, inositol, glucosa, fructosa, lactosa, xilosa, manosa, maltosa, rafinosa y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, la formulación comprende <1 % de sacarosa p/v.
La formulación puede comprender un agente tampón adicional seleccionado del grupo que comprende uno o más de glicina, citrato de sodio, fosfato de sodio, ácido cítrico, HEPES, acetato de potasio, citrato de potasio, fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, base Tris o Tris-HCl, y combinación de los mismos. Los agentes tamponadores proporcionan un pH de 6.0 a 7.0. Los agentes tamponadores proporcionan un pH de 6.0 a 7.0, preferiblemente de 6.3 a 6.8 o 6.5.
Preferiblemente, la formulación comprende Histidina a una concentración de 25 mM.
Preferiblemente, la formulación comprende Arginina a una concentración de 70 a 80 mM.
La formulación puede comprender un agente de tonicidad adicional seleccionado del grupo que comprende uno o más de dextrosa, glicerina, manitol y cloruro de potasio. Preferiblemente, la formulación comprende NaCl a una concentración de 100 - 145 mM.
La formulación puede comprender un tensioactivo adicional seleccionado del grupo que comprende uno o más polisorbatos (por ejemplo, polisorbato-20); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecilsulfato desodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octilglucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil de sodio o metil oleil taurato de disodio; y la serie MONAQUAT® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilenglicol, polipropilglicol y copolímeros de etilenglicol y propilenglicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc.). Preferiblemente, la formulación comprende Polisorbato 80 a una concentración de 0.02 % (p/v).
Preferiblemente, la formulación comprende la proteína de unión a antígeno a una concentración de 1mg/l a 50 mg/l, 20 mg/l a 40 mg/l. Aún más preferiblemente la formulación comprende la proteína de unión a antígeno a una concentración de 1 mg/l a 50 mg/l.
La formulación puede comprender además un conservante. El conservante se puede seleccionar del grupo que comprende alcohol bencílico, m-cresol y fenol.
De acuerdo con un ejemplo, la formulación farmacéutica comprende 2 - 80 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti dengue; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con otro ejemplo, la formulación farmacéutica comprende 25 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-dengue; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con todavía otro ejemplo, la formulación farmacéutica comprende 50 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-dengue; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 %; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con un ejemplo adicional, la formulación farmacéutica comprende 2 - 80 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-rabia; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con todavía un ejemplo adicional, la formulación farmacéutica comprende 25 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-rabia; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
De acuerdo con un ejemplo, la formulación farmacéutica comprende 50 mg/ml de anticuerpo monoclonal contra la rabia; 25 mM de Histidina; 75 mM de Arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la Osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
La formulación farmacéutica puede ser una formulación liofilizada.
La afinidad y la potencia de la proteína de unión al antígeno se pueden medir mediante uno o más de ELISA o citometría de flujo. Preferiblemente, se utiliza un método basado en ELISA indirecto para cuantificar la unión de la proteína de unión al antígeno al antígeno específico. Preferiblemente, la formulación de Dengue Mab se prueba contra todos los serotipos de los virus del dengue y se determina la cantidad de Dengue mAb. La potencia de la proteína de unión al antígeno se informa como % de actividad en relación con el estándar de referencia. Se entiende muy bien que se puede utilizar cualquier otro método similar para demostrar la potencia y afinidad de la proteína terapéutica.
Se puede llevar a cabo una prueba de neutralización por reducción de foco (PRNT/FRNT) o una prueba relacionada para evaluar la neutralización de la actividad viral por la proteína de unión al antígeno. Preferiblemente, la formulación de Dengue mAb se prueba contra todos los serotipos de los virus del dengue y se calculan los valores EC50 para la neutralización de los virus del dengue. Se entiende muy bien que se puede utilizar cualquier otro método similar para demostrar la actividad de neutralización de la proteína terapéutica. La cromatografía de exclusión por tamaño basada en HPLC se puede utilizar para evaluar la presencia de agregados en la formulación de proteína terapéutica. Preferiblemente, se utiliza la columna Phenomenex Bio-Sec-S 3000 para demostrar el porcentaje de agregado y monómero de la formulación de Dengue mab. Se entiende muy bien que se puede utilizar cualquier otro método similar para evaluar la presencia de agregados en la formulación de proteínas terapéuticas.
La formulación se puede almacenar en un recipiente adecuado. El recipiente se puede seleccionar entre un frasco, un vial, una bolsa IV, un inyector portátil, un inyector de bolo, una jeringa, una pluma, una bomba, una jeringa con aguja multidosis, una pluma multidosis, un inyector, una jeringa, un autoinyector, una jeringa precargada o una combinación de los mismos.
Al menos un componente de empaque primario puede comprender un cierre de recipiente seleccionado de polipropileno (PP), tereftalato de polietileno (PETG), polietileno de alta densidad (HDPE), tereftalato de polietileno (PET), polipentafluoroestireno (PFS), policarbonato, cloruro de polivinilo (PVC), poliolefina, policiclopentano (CZ.RTM.), copolímero de olefina cíclica (COC), y combinaciones o copolímeros de los mismos.
Las formulaciones de anticuerpos anti-dengue o anti-rabia divulgadas en el presente documento se pueden utilizar (solas o en combinación con otros agentes o modalidades terapéuticas) para tratar, prevenir y/o diagnosticar el virus del dengue o la rabia. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una molécula de anticuerpo anti-dengue coformulada y/o coadministrada con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, agentes antivirales (que incluyen otros anticuerpos anti-dengue), vacunas (que incluyen vacunas contra el virus del dengue), o agentes
que mejoran una respuesta inmunitaria. En otras realizaciones, las moléculas de anticuerpo se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéutico, tal como hidratación intravenosa, agentes antifebriles (tal como acetaminofén) o transfusión de sangre. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
En un tercer aspecto, la presente divulgación se relaciona con una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente divulgación para uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico del virus del dengue o de la rabia.
De acuerdo con una realización, la formulación está comprendida en un recipiente seleccionado de una botella, un vial, una ampolla, una bolsa IV, un inyector portátil, un inyector de bolo, una jeringa, una pluma, una bomba, una jeringa de aguja multidosis, una pluma multidosis, un inyector, una jeringa, un autoinyector, una jeringa precargada o una combinación de los mismos.
De acuerdo con otra realización, al menos un componente de empaque primario comprende un cierre de recipiente seleccionado de polipropileno (PP), tereftalato de polietileno (PETG), polietileno de alta densidad (HDPE), tereftalato de polietileno (PET), polipentafluoroestireno (PFS), policarbonato, cloruro de polivinilo (PVC), policiclopentano (CZ.RTM.), copolímero de olefina cíclica (COC), poliolefina, y combinaciones o copolímeros de los mismos.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Proceso anterior para el cultivo de células y la expresión de la proteína terapéutica, es decir, el anticuerpo monoclonal contra el dengue (VIS513)
Protocolo:
El cultivo de células a una escala de 10 l se llevó a cabo en forma de tanda Alimentada utilizando los parámetros mencionados a continuación durante el proceso de fermentación/anterior.
El anticuerpo monoclonal contra el dengue se expresó en la estirpe celular “CHO - K1 SV GS-KO” obtenida de Visterra Inc. USA.
• El medio de cultivo celular utilizado para el crecimiento celular y la expresión de la proteína terapéutica, es decir, el anticuerpo monoclonal contra el dengue, fue Medio Líquido CHO-2201X Cellvento™.
• Solución de alimentación A, Solución de alimentación B, Solución de alimentación C, Solución de alimentación D seleccionada del grupo que comprende Glucosa, suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a y 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (3X medio), el Alimento 1 CHO EX-CELL® Avanced™ se utilizó como alimento de suplementación.
• El pH del medio de fermentación se mantuvo entre 6.7 y 7.5.
• La osmolalidad del medio de fermentación se mantuvo a <490 mOsm/Kg.
• El oxígeno disuelto del medio de fermentación se mantuvo a aproximadamente 20 % y 40 %.
• La temperatura del medio de fermentación se mantuvo a 36.5 ± 0.5.
• El cultivo se cosechó al caer el recuento de células al 60 %
La suplementación alimenticia se realizó en forma de goteo gradual según la siguiente Tabla 1:
Tabla 1
Resultados y conclusión:
El recuento de colonias viables y el rendimiento obtenido durante el proceso de fermentación fue el siguiente:
T l 2: R n l ni vi l r n imi n ni r n l r f rm n i n
El solicitante ha encontrado que al utilizar un proceso de cultivo celular que comprende medio basal, medio basal concentrado como solución de alimentación, uso de soluciones de alimentación junto con una estrategia de alimentación definida, se puede obtener un crecimiento celular mejorado, concentraciones más bajas de lactato y amoníaco, manteniendo de esta manera efectivamente el recuento de células y el aumento de la longevidad celular y alto rendimiento. Se obtuvo un rendimiento de más de 4 gm/l en el proceso de fermentación. La cosecha obtenida se sometió adicionalmente a procesamiento de purificación/ corriente abajo.
Ejemplo 2:
El cultivo celular obtenido en el ejemplo 1 se cosechó y luego se sometió al protocolo de purificación del anticuerpo monoclonal contra el dengue (VIS513) de acuerdo con la Figura 1
El proceso detallado utilizado fue el siguiente:
Cromatografía de afinidad de Proteína A:
En esta etapa, el anticuerpo monoclonal dirigido se separó de los componentes del medio en el sobrenadante recolectado. El sobrenadante clarificado se pasó a través de la columna de cromatografía y luego se eluyó utilizando tampones de elución compatibles.
Materiales utilizados:
Resina (Matriz): Mab Select Sure/Eshmuno A (Afinidad de Proteína-A)
Tiempo de residencia: 4.0 - 8.0 minutos
Columna utilizada: XK 26
Tampón de equilibrio: tampón de fosfato 20 mM NaCl 150 mM Polisorbato al 0.05 %(p/v) 80, pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado I: tampón de fosfato 20 mM NaCl 150 mM Polisorbato 80 al 0.05% (p/v), pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado II: tampón de fosfato 20 mM NaCl 1M Polisorbato 80 al 0.05% (p/v), pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado III: tampón de fosfato 10 mM NaCl 125 mM Polisorbato 80 al 0.025% (p/v), pH 6.0 ± 0.2. Tampón de elución: tampón de citrato 20 mM Polisorbato 80 al 0.025% (p/v), pH 3.0 ± 0.2.
Tampón CIP: NaOH 0.1 M
Parámetros de proceso utilizados:
Tabla 3:
1. Inactivación viral de pH bajo
1. El eluato de la cromatografía de afinidad de Proteína A se sometió a un pH bajo, es decir, 3.5 ± 0.1 durante 60 ± 10 minutos para inactivar las partículas virales.
ii. Después de mantener el pH bajo, el eluato se neutralizó utilizando un tampón de neutralización, es decir, un tampón Tris/citrato 1 M con un pH de 7.0 ± 0.2.
iii. La conductividad del eluato neutralizado se ajustó utilizando WFI con polisorbato 80 al 0.025 % (p/v).
2. Cromatografía de intercambio catiónico
Las moléculas de anticuerpos con carga positiva se unen a la columna, mientras que las moléculas con carga negativa entran en el flujo. Las moléculas de anticuerpo unidas a la columna se eluyen utilizando un gradiente de sal.
Materiales utilizados:
Resina utilizada: Fractogel SO3-/ Fractogel SE Hicap (Merck)
Tiempo de residencia: 4.00-7.00 minutos
Columna utilizada: XK 26
Pre Equilibrio: Tampón de citrato 200 mM pH 6.0 ± 0.2.
Equilibrio: Tampón de citrato 10 mM Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v), pH 6.0 ± 0.2.
Carga: Mantenimiento de pH bajo neutralizado.
Tampón de lavado A: Tampón de citrato 10 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón de lavado B: Tampón de citrato 20 mM NaCl 300 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón CIP: NaOH 0.5 M
Tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M
Parámetros de proceso:
Tabla 4:
Colección de fracciones durante el gradiente
Tabla 5:
Todas las impurezas cargadas negativamente se unen a la membrana mientras el anticuerpo pasa por el flujo. Materiales utilizados:
Membrana/Resina utilizada: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q
Volumen de carga: 150 mg/ml-1000 mg/ml
Columna utilizada: XK 26
Tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
Tampón de preequilibrio: Tampón de citrato 200 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón de equilibrio: tampón de citrato 20 mM pH 6.0 ± 0.2; y opcionalmente PS-80 al 0.025 % pH 6.0 ± 0.2 Tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M
Parámetros de proceso:
Tabla 6:
3. Nanofiltración:
Se utilizó un nanofiltro de 20 nm, es decir, Viresolve PRO (Merck), para eliminar cualquier partícula de virus disponible en la proteína terapéutica.
4. Filtración de flujo tangencial/Filtración de ultra flujo:
El anticuerpo se concentró a la concentración deseada y el tampón se intercambió en uno de los tres tampones de formulación.
Material utilizado:
Tampón de formulación:
• Tampón 1: tampón de Histidina 25 mM tampón de Arginina 75 mM NaCl 75 mM, pH 6.50 ± 0.25;
• Tampón 2: Histidina 25 mM, Arginina 75 mM, NaCl 101 mM;
• Tampón 3: Histidina 25 mM, Arginina 75 mM, NaCl de 75 mM a 101 mM, polisorbato-800.002 % p/v Tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
Tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M
Membrana utilizada: Serie PALL Centramate T, membrana de PES MWCO: 30kDa
Parámetros de proceso:
Tabla 7
Filtración estéril
Se agregó estabilizador a la solución de anticuerpo y se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 0.2 p. Resultados:
Recuperación por estadios de las distintas etapas utilizadas en el proceso de purificación.
Tabla 8:
Se encontró que la recuperación general del proceso era ~80 % y que la pureza general era > 99 %.
Tabla 9: Datos de impurezas
T l 1 : R r i n r z r n
Ejemplo 3:
El anticuerpo monoclonal purificado contra el dengue (VIS513) se formuló de la siguiente manera:
Se agregaron excipientes, es decir, arginina, histidina, NaCl, sacarosa y polisorbato-80, y se mezclaron completamente utilizando un agitador magnético a 50-60 RPM para formar una mezcla de excipientes. Luego, esta mezcla se agregó a la cosecha de Dengue mAb TFF gradualmente con una tasa de agitación de 50-60 RPM. Se comprobó el pH (pH 6.5) y, si fue necesario, se ajustó mediante tampón de histidina-arginina. La formulación final se filtró a través de un filtro de 0.2 pM y se introdujo en el recipiente final.
La concentración de cada componente en la formulación final fue la siguiente:
Tabla 11:
Estas formulaciones se sometieron a más pruebas de pureza, estabilidad, eficacia y potencia durante 9 meses. Ejemplo 4:
Se estudió el efecto de la presencia de sacarosa en la formulación de anticuerpos contra el dengue VIS513 para probar la potencia mediante ensayo ELISA sobre la proteína EDIIII de DV1. Los estudios de formulación se realizaron para la temp. 2 - 8 °C, 25 °C y 40 °C.
Resultados:
1. Formulación de anticuerpos contra el dengue VIS513 sin sacarosa
Tabla 12:
2. Formulación de anticuerpos contra el dengue VIS513 con sacarosa
Tabla 13:
Com osición de la formulación estándar de referencia:
Conclusión: La adición de 0.5 % p/v mejora la estabilidad en comparación con el punto de muestreo correspondiente sin sacarosa.
Ejemplo 5:
La formulación del anticuerpo VIS513 se almacenó a 40 °C durante 20 días y luego se evaluó la potencia de VIS513 mediante la prueba ELISA. Se estudió el efecto del aumento de la fuerza de la sacarosa en la formulación del anticuerpo VIS513 a 40 °C, en la que se evaluó la concentración de sacarosa de 0.1, 0.2 y 0.5 %.
Resultados:
Tabla 14:
Tabla 15:
Tabla 16:
Tabla 17
Com osición de la formulación estándar de referencia:
Conclusión: Se observó la mayor estabilidad en la formulación que comprende sacarosa al 0.5 % de.
Ejemplo 6:
Prueba analítica de pureza, estabilidad, eficacia y potencia de la formulación de Dengue (VIS513) Mab con almacenamiento a
• 2-8 °C durante un período de 0 meses, 3 meses, 6 meses y 9 meses.
• 25 °C durante un período de 0 días y 30 días
• 40 °C durante un período de 0 días, 7 días, 14 días, 28 días, 35 días y 42 días.
6.1: La potencia de la formulación del anticuerpo VIS513 se analizó mediante ELISA indirecto.
Se utilizó el método basado en ELISA indirecto para cuantificar la unión de Dengue Mab (VIS513) a la proteína EDIIII del antígeno DV1. La proteína EDIIII se inmovilizó en la placa. El antígeno no unido se eliminó mediante lavado. En la etapa siguiente, se agregaron muestras estándar y de prueba y se permitió que se unieran al antígeno. Para determinar la cantidad de Dv-Mab unido, se utilizó Fc-HRP de IgG anti-humana de ratón, específica de Dv-Mab (fragmento Fc de inmunoglobulina humana), para reconocer la presencia de Dv-Mab. El ensayo se desarrolló con el Sistema de Sustrato de Peroxidasa de Micropozo TMB, que cuantifica el grado de unión por la cantidad de color formado a 450 nm. El software de análisis de datos generó una curva de unión para cada muestra utilizando un modelo de ajuste de curva de cuatro parámetros y se comparó la curva de unión de la muestra de prueba con la curva estándar al calcular la potencia relativa. La potencia de una muestra de prueba se informa como el % de actividad en relación con el estándar de referencia (potencia relativa multiplicada por 100).
Tabla 18: Potencia del Mab (%) contra el dengue (VIS513) mediante ELISA indirecto para la formulación almacenada a 2-8 °C.
Tabla 19: Potencia del Mab (%) contra el dengue (VIS513) mediante ELISA indirecto para la formulación almacenada a 25 °C.
Tabla 20: Potencia del Mab (%) contra el dengue (VIS513) mediante ELISA indirecto para la formulación almacenada a 40 °C.
La formulación del mab contra el dengue (VIS513) no mostró ninguna pérdida de afinidad de unión dependiente del tiempo.
6.2: Ensayo PRNT para determinar EC50
El ensayo implica la mezcla previa de anticuerpos diluidos en serie con el virus para permitir la unión del anticuerpo, la neutralización y luego la transferencia de la mezcla a una monocapa de células Vero, la superposición con un medio viscoso, la incubación (~3-7 días, dependiendo del serotipo del virus) para permitir la replicación limitada del virus y la propagación, seguida de la detección de placas. La neutralización se capturó por la reducción de la formación de placas. Se logró una detección robusta con métodos de inmunotinción, utilizando anticuerpo anti-dengue 4G2 de ratón y anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con HRP con sustrato de peroxidasa.
Las muestras de la formulación Mab (VIS513) contra el dengue se probaron contra los cuatro serotipos de los virus del dengue, es decir, DV1, DV2, DV3 y DV4. Se calculó el valor EC50 para la neutralización de los virus del dengue. El valor EC50 representa el 50 % de la concentración efectiva requerida para la neutralización efectiva de los virus del dengue y el valor EC50 se calcula a partir del número de placas presentes en los pozos de control de virus y el número de placas en los pozos en los que se agregaron las muestras incubadas con virus mab.
Resultados:
Tabla 21: Valor del mAb EC50 (ng/ml) contra el dengue (VIS513) mediante ensayo PRNT para la formulación almacenada a 2-8 °C.
Tabla 22: Valor del mAb EC50 (ng/ml) contra el dengue (VIS513) mediante ensayo PRNT para la formulación almacenada a 25 °C.
Tabla 23: Valor del mAb EC50 (ng/ml) contra el dengue (VIS513) mediante ensayo PRNT para la formulación almacenada a 40 °C.
La formulación del mab contra el dengue (VIS513) no mostró ninguna pérdida dependiente del tiempo de la eficacia de neutralización del virus a 2-8 °C y 25 °C. La formulación de VIS513, incluso si se mantiene a 40 °C, no pierde su capacidad de neutralizar el virus del dengue.
6.3: Análisis de agregación y pureza
Se utilizó una cromatografía de exclusión por tamaño basada en HPLC (HPLC-SEC) para evaluar los agregados en la formulación a granel y final de DV Mab. En este método, se utilizó una columna Phenomenex Bio-Sec-S 3000 para demostrar los agregados y el porcentaje de monómero de Mab contra el dengue (VIS513) al inyectar -50 |jg de anticuerpo total y ejecutar a un caudal de 1 ml/minuto durante 35 minutos. Como fase móvil se utilizó solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 6.5.
Resultados: SEC-HPLC (rango de aceptación es NLT 90 %)
Tabla 24: Análisis SEC-HPLC de la formulación almacenada a 2-8 °C
Tabla 25: Análisis SEC-HPLC de la formulación almacenada a 25 °C
Tabla 26: Análisis SEC-HPLC de la formulación almacenada a 40 °C
La formulación del mab contra el dengue (VIS513) no mostró ninguna agregación significativa dependiente del tiempo; y se encontró que la pureza/contenido de monómero era >98 %.
Ejemplo 7:
Efecto de las concentraciones de tensioactivo de las formulaciones:
El efecto de la concentración de tensioactivo se evaluó mediante análisis de partículas subvisibles. Se prepararon formulaciones de fuerzas de polisorbato-80 variables y se analizaron para el análisis de partículas subvisibles.
Tabla 27
Conclusión:
En la formulación que contenía polisorbato-80 al 0.005 % p/v se observaron partículas subvisibles mínimas. Dependiendo de la dosis, si la formulación requiere dilución, la fuerza de polisorbato 80 se finalizó al 0.02 % p/V con un margen de 4 veces.
Ejemplo 8: Estudio de determinación de concentración mínima de estabilizadores utilizados
La fuerza de tampón mínima requerida (10-30 mM) se refirió a la literatura disponible. Para encontrar la arginina mínima (utilizada como agente solubilizante y agente reductor de viscosidad), la muestra de Mab se intercambió en tampón por solución salina normal y se agregó gradualmente la solución madre de arginina (300 mM). La agregación de la solución se monitorizó al medir OD@350nm. La solución salina con arginina 75 mM dio la OD más baja, por lo que se finalizó con arginina 75 mM.
Ejemplo 8
Estudios de viscosidad de la formulación de anticuerpos contra el dengue (VIS513)
La viscosidad de las muestras de DV mab se midió en un Viscosímetro basado en microchip, Modelo: microVISCTM (Marca: RheoSense, CA USA) según el procedimiento mencionado en el manual del instrumento.
Tabla 28
Conclusión:
No se observó un aumento de la viscosidad dependiente del tiempo en la formulación de mab almacenada a 2-8 °C durante 90 días ni en una muestra mantenida a 25 °C durante 1 mes, esto se debe principalmente al excipiente de Arginina 75 mM. Se encontró que la viscosidad de nuestra formulación fue de 1.1 a 1.2 mPa-S/cP, que es inferior a otras formulaciones comercializadas que tienen una viscosidad entre 11 y 50 mPa-S/cP.
Ejemplo 9: Estudios de picos virales en el proceso de purificación de mAb contra el dengue (VIS513)
La validación de virus se realizó para el proceso de fabricación real, para probar la eficacia de la eliminación de virus mediante filtración de virus en el proceso de fabricación de anticuerpos monoclonales.
Se utilizaron el virus de la leucemia murina (MuLV) y el virus Minute de ratones (MMV/MVM) como organismos modelo. Los inventores de esta invención compararon la capacidad de su proceso de purificación inventivo con la del método general y bien establecido de purificación de anticuerpos monoclonales.
El método general y bien establecido de purificación de anticuerpos monoclonales comprende cromatografía de afinidad con Proteína A (resina GE); tratamiento de pH bajo; cromatografía Sartobind Q (Membrana de Intercambio Aniónico, Sartorius, de un solo uso); Cromatografía de Fenilo Sartobind (Cromatografía de membrana, Sartorius, de un solo uso); Filtración Viresolve Pro (Nanofiltración, Merck).
Tabla 29:
Resultados:
El proceso de purificación de SIIPL fue altamente eficiente en la eliminación viral, el LRV total alcanzado es según las pautas de ICH. (Proceso Estándar LRV 12.64 mientras que el proceso inventivo SIIPL 23.74) Se encontró que el anticuerpo contra el dengue purificado utilizando nuestro proceso inventivo es adecuado para ensayos clínicos en humanos sin ningún riesgo viral.
Ejemplo 10: Proceso anterior para el cultivo de células y la expresión de proteínas terapéuticas, es decir, anticuerpos monoclonales contra la rabia
Protocolo:
El cultivo de células a escala de 2 l se llevó a cabo en una tanda alimentada utilizando los parámetros mencionados a continuación durante el proceso de fermentación/anterior.
• El anticuerpo monoclonal contra la rabia se expresó en la estirpe celular “GS-CHO”.
• El medio de cultivo celular utilizado para el crecimiento celular y la expresión de la proteína terapéutica, es decir, el anticuerpo monoclonal contra la rabia fue el “Medio líquido CHO-220 1X Cellvento™” o “Actipro 1x (Hyclone)”
• Solución de alimentación A, Solución de alimentación B, Solución de alimentación C, Solución de alimentación D seleccionada del grupo que comprende Glucosa, Suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a y 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (1X medio), el alimento CHO EX-CELL® Avanced™ se utilizó como alimento de suplementación.
• El pH del medio de fermentación se mantuvo entre 6.5 y 7.5.
• La osmolalidad del medio de fermentación se mantuvo entre 270-450 mOsm/Kg.
• El oxígeno disuelto del medio de fermentación se mantuvo a aproximadamente 20 % y a aproximadamente 60 %.
• La temperatura del medio de fermentación se mantuvo a 36.5 ± 1.
La suplementación alimenticia se realizó en forma de goteo gradual según la siguiente tabla:
Tabla 30:
El cultivo celular se cosechó al caer en OD hasta 60 %
Resultados y conclusión:
Se obtuvo un rendimiento de 3-5 gm/l del proceso de fermentación. La cosecha obtenida se sometió adicionalmente a procesamiento de purificación/ posterior.
Ejemplo 11:
El cultivo celular obtenido de acuerdo con el ejemplo 9 se cosechó y luego se sometió al protocolo de purificación del anticuerpo monoclonal contra la rabia de acuerdo con la Figura 1.
El proceso detallado utilizado fue el siguiente:
Cromatografía de afinidad de proteína A:
En esta etapa, el anticuerpo monoclonal dirigido se separó de los componentes del medio en el sobrenadante cosechado. El sobrenadante clarificado se pasó a través de la columna de cromatografía y luego se eluyó utilizando tampones de elución compatibles.
Materiales utilizados:
Resina (Matriz): Mab Select Sure/Eshmuno A (Afinidad de Proteína-A)
Tiempo de residencia: 4.0-8.0 minutos
Columna utilizada: XK 26
Tampón de equilibrio: tampón de fosfato 20 mM NaCl 150 mM Polisorbato al 0.05 %(p/v) 80, pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado I: tampón de fosfato 20 mM NaCl 150 mM Polisorbato 80 al 0.05% (p/v), pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado II: tampón de fosfato 20 mM NaCl 1M Polisorbato 80 al 0.05% (p/v), pH 7.0 ± 0.2.
Tampón de lavado III: tampón de fosfato 10 mM NaCl 125 mM Polisorbato 80 al 0.025% (p/v), pH 6.0 ± 0.2. Tampón de elución: tampón de citrato 20 mM Polisorbato 80 al 0.025% (p/v), pH 3.0 ± 0.2.
Tampón CIP: NaOH 0.1 M
Parámetros de proceso utilizados:
Tabla 31
1. Inactivación viral de pH bajo
1. El eluato de la cromatografía de afinidad de Proteína A se sometió a un pH bajo, es decir, 3.5 ± 0.1 durante 60 ± 10 minutos para inactivar las partículas virales.
ii. Después de mantener el pH bajo, el eluato se neutralizó utilizando un tampón de neutralización, es decir, un tampón Tris/citrato 1 M con un pH de 7.0 ±0.2. Posteriormente, la solución neutralizada se filtró utilizando 0.8/0.45 p o 0.8/0.2 p.
iii. La conductividad del eluato neutralizado se ajustó utilizando WFI con polisorbato 80 al 0.025 % (p/v).
2. Cromatografía de intercambio catiónico
Las moléculas de anticuerpos con carga positiva se unen a la columna, mientras que las moléculas con carga negativa entran en el flujo. Las moléculas de anticuerpo unidas a la columna se eluyen utilizando un gradiente de sal.
Materiales utilizados:
Resina utilizada: Fractogel SO3-/ Fractogel SE Hicap (Merck)
Tiempo de residencia: 4.00-7.00 minutos
Columna utilizada: XK 26
Preequilibrio: Tampón de citrato 200 mM pH 6.0 ± 0.2.
Equilibrio: Tampón de citrato 10 mM Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v), pH 6.0 ± 0.2.
Carga: Mantenimiento de pH bajo neutralizado.
Tampón de lavado A: Tampón de citrato 10 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón de lavado B: Tampón de citrato 20 mM NaCl 300 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón CIP: NaOH 0.5 M
Tampón de almacenamiento: Etanol al 20 % NaCl 150 mM
Tabla 32: Parámetros de proceso:
Tabla 33: Recolección de fracciones durante el gradiente
Cromatografía de intercambio aniónico:
Todas las impurezas cargadas negativamente se unen a la membrana mientras el anticuerpo pasa por el flujo. Materiales utilizados:
Membrana/Resina utilizada: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius)/Eshmuno Q
Volumen de carga: 150 mg/ml-1000 mg/ml
Columna utilizada: XK 26
Tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
Tampón de preequilibrio: Tampón de citrato 200 mM, pH 6.0 ± 0.2.
Tampón de equilibrio: tampón de citrato 20 mM pH 6.0 ± 0.2; y opcionalmente PS-80 al 0.025 % pH 6.0 ± 0.2 Tampón de almacenamiento: Etanol al 20 % NaCl 150 mM o NaOH 0.1 M
T l 4: P r m r r :
Nanofiltración
Se utilizó un nanofiltro de 20 nm, es decir, Viresolve PRO (Merck), para eliminar cualquier partícula de virus disponible en la proteína terapéutica.
4. Filtración de flujo tangencial/Filtración de ultra flujo:
El anticuerpo se concentró a la concentración deseada y el tampón se intercambió en uno de los tres tampones de formulación.
Material utilizado:
Tampón de formulación:
• Tampón 1: tampón de histidina 25 mM tampón de arginina 75 mM NaCl 75 mM, pH 6.50 ± 0.25;
• Tampón 2: Histidina 25 mM, Arginina 75 mM, NaCl 101 mM;
• Tampón 3: Histidina 25 mM, Arginina 75 mM, NaCl 75 mM a 101 mM, Polisorbato-80 al 0.002 % p/v
• Tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
Tampón de almacenamiento: etanol al 20 % NaCl 150 mM o NaOH 0.1 M
Membrana utilizada: PALL Centramate T Series, membrana PES MWCO: 30 kDa
T l : P r m r r :
Filtración estéril
Se agregó un estabilizador a la solución de anticuerpo y se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 0.2 p. Resultados:
T l : R r i n r i l i in iliz n l r rifi i n.
Se encontró que la recuperación general del proceso era > 80 %.
Tabla 37: Datos de im urezas
T l : R r i n r z r n
Se encontró que la pureza general del mab contra la rabia después de la purificación era >99 % y la recuperación general era >80 %.
Ejemplo 12:
El anticuerpo monoclonal contra la rabia purificado se formuló según el diagrama de flujo que se muestra en la figura 2.
Se agregaron excipientes, es decir, arginina, histidina, NaCl, sacarosa y polisorbato-80, y se mezclaron completamente utilizando un agitador magnético a 50-60 RPM para formar una mezcla de excipientes. Luego, esta mezcla se agregó a la cosecha de TFF de mAb contra el dengue gradualmente con una tasa de agitación de 50-60 RPM. Se comprobó el pH (pH 6.5) y, si fue necesario, se ajustó mediante tampón de histidina-arginina. La formulación final se filtró a través de un filtro de 0.2 pM y se introdujo en el recipiente final.
La concentración de cada componente en la formulación final fue la siguiente:
Tabla 39:
Estas formulaciones se sometieron a más pruebas de pureza, estabilidad, eficacia y potencia durante 9 meses.
Ejemplo 13: Prueba analítica de pureza y estabilidad de la formulación de Mab contra la rabia con almacenamiento a 2-8, 25 y 40 °C durante un período de 0 meses, 1 mes, 3 meses y 6 meses.
13.1 Análisis de agregación y pureza
Se utilizó una cromatografía de exclusión por tamaño basada en HPLC (HPLC-SEC) para evaluar los agregados en la formulación a granel y final de DV Mab. En este método, se utilizó una columna Phenomenex Bio-Sec-S 3000 para demostrar los agregados y el porcentaje de monómero del Mab contra la rabia al inyectar -50 ug de anticuerpo total y al ejecutar un caudal de 1 ml/minuto durante 35 minutos. Como fase móvil se utilizó solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 6.5.
Resultados:
Tabla 40: Resultados SE-HPLC %
La formulación del mab contra la rabia no mostró ninguna agregación dependiente del tiempo y se encontró que el contenido de pureza/monómero era >99 %.
13.2 Análisis de SDS Page Tanda 1 - Muestra de prueba a 2-8 °C
Tabla 41:
Muestra de prueba a 25 °C
Conclusión: La formulación de mAb contra la rabia no mostró cambios significativos dependientes del tiempo en la agregación ni en el peso molecular. Por lo tanto, se encuentra que la formulación es estable a 2-8 °C, 25 °C y 40 °C. ID de secuencia 1: Secuencia de aminoácidos VH de VIS513 (anticuerpo monoclonal contra el dengue)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAGFNIKDVYMSWVRQAPEQGLEWMGRIDPENGDTKYD 60
PKLQGRVTMTADTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGWEGFAYWGQGTLVTVSSASTKG 120
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL 180
SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL 240
FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV 300
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ 360
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV 420
FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 445
ID de secuencia 2: Secuencia de aminoácidos VL de VIS513 (anticuerpo monoclonal contra el dengue)
DIVMTQSPASLAVSLGERATISCRASENVDKYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASELQW 60
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQRSNEVPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVF 120
IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS 180
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 218
ID de secuencia 3: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SII RmAb (RAB1)(17C7)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYAMHWVRQAPGKGLEWVAVVSYDGRTKDY 60
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVYFCARERFSGAYFDYWGQGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG 180
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP 240
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS 300
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM 360
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 420
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 449
ID de secuencia 4: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera SII RMAb (RAB1)(17C7)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA 60
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYSCQQRNNWPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVSVFIF 120
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST 180
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 219
Claims (33)
1. Un método para fabricar una proteína de unión a antígeno farmacéutica con alto rendimiento y mínima agregación, en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en el que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia de acuerdo con la SEQ ID 3 y SEQ ID 4, el método comprende las etapas de:
a) cultivar células de mamíferos a gran escala que expresan proteína de unión a antígeno en un medio de producción de cultivo celular, en el que la etapa de cultivo mantiene efectivamente el recuento celular en el rango de 10 x 106 - 20 x 106 células/ml y da como resultado un rendimiento de al menos 2 g/l en el que la estirpe celular de células de mamífero es CHO-K1 SV GS-KO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue y la estirpe celular de células de mamífero es GS-CHO cuando la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-rabia; en el que la etapa de cultivo incluye el uso de medio basal, uso de medio basal concentrado como solución de alimentación, uso de soluciones de alimentación junto con una estrategia de alimentación definida, lo que resulta en crecimiento celular potenciado, manteniendo concentraciones más bajas de lactato y amoniaco, y manteniendo efectivamente el recuento celular aumentando de esta manera la longevidad celular y el alto rendimiento; b) purificación de la proteína de unión a antígeno del sobrenadante recogido obtenido en la etapa (a), en la que la purificación da como resultado la recuperación de al menos 80% y una pureza de al menos 99%; y en la que la purificación comprende cromatografía de afinidad, inactivación viral a bajo pH, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de intercambio aniónico, nanofiltración, filtración/ultrafiltración de flujo tangencial; de manera secuencial; en la que la matriz de cromatografía de afinidad es la Proteína A; en la que la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 30 mM - 500 mM; y
c) preparar una formulación estable que comprende la proteína de unión a antígeno, en la que la osmolalidad de la formulación está en el rango de 300 - 400 mOsm/Kg y la viscosidad de la formulación es menor de 2.5 mPa-S, en la que la formulación comprende al menos una proteína de unión a antígeno, al menos un estabilizador, al menos un agente tampón, al menos un agente de tonicidad, y al menos un tensioactivo;
en el que la formulación comprende:
(i) 1 -100 mg/ml de la proteína de unión a antígeno;
(ii) 20 - 40 mM de histidina;
(iii) 50 - 100 mM de arginina;
(iv) Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v);
(v) NaCl 50 - 150 mM; y
(vi) sacarosa al 0.1 - 2.5% p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5;
y en el que la formulación resultante es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo celular se complementa con uno o más de otros nutrientes, al menos una vez durante la etapa de cultivo.
3. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de producción de cultivo celular se complementa en un programa que comprende la suplementación que es continua, diaria, día por medio, cada dos días o una combinación de las mismas.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo celular tiene una osmolalidad en el rango de 250 -500 mOsm/Kg; el pH en el rango de 6.5 - 7.5; el oxígeno disuelto se mantiene en el rango de 10 - 60%; la temperatura del cultivo celular está en el rango de 30 °C a 38 °C; primera temperatura preferiblemente 36 - 37 °C y opcionalmente segunda temperatura preferiblemente 30 - 35 °C; la concentración de glucosa se mantiene por debajo de 7%; preferiblemente entre 4% y 5%; cosecha del cultivo celular cuando la viabilidad se reduce a 80 %; en el que las condiciones del cultivo celular se mantienen de tal manera que los metabolitos secundarios, tales como la concentración de lactato no sea mayor de 5 g/l; y la concentración de amoniaco no sea mayor de 5 mMol/l.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la osmolalidad del medio de fermentación es 400 - 500 mOsm/kg.
6. El método de la reivindicación 1, en el que el oxígeno disuelto del medio de fermentación se mantiene en el rango de 20 - 40%.
7. El método de la reivindicación 1, las células se cultivan en una tanda, tanda alimentada, modo continuo, modo de perfusión; más particularmente en un modo de tanda alimentada.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración de sal de los tampones utilizados en la purificación está en el rango de 50 mM - 300 mM.
9. El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una etapa de cromatografía adicional seleccionada del grupo que comprende una o más de cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de inducción de carga hidrofóbica, cromatografía de hidroxiapatita cerámica, cromatografía multimodal, cromatografía de membrana.
10. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatografía de proteína A comprende:
a) tampón de equilibrio: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2 b) Carga: Cosecha Clarificada
c) tampón de lavado I: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM, más particularmente 150 mM; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2
d) tampón de lavado II: tampón de fosfato 20 mM; NaCl 250 mM - 1 M, más particularmente 1 M; Polisorbato 80 al 0.05 %; pH 7.0 ± 0.2
e) tampón de lavado III: tampón de fosfato 10 mM; NaCl 100 - 150 mM, más particularmente 125 mM; Polisorbato 80 al 0.05%; pH 7.0 ± 0.2
f) tampón de elución: tampón de citrato 20 mM; pH 3.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v) g) tampón CIP: NaOH 0.1 M
h) Tiempo de residencia: 4.00 - 8.00 minutos
i) Columna utilizada: XK26
j) El caudal lineal es 10 - 500 cm/h, más particularmente 100-150 cm/h.
11. El método de la reivindicación 1, en el que la inactivación viral del eluato de la cromatografía de afinidad de la proteína A se logra al mantener el eluato a pH 3.3 - 3.5 durante un periodo de 50 - 100 minutos.
12. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio catiónico se realiza utilizando una resina seleccionada del grupo que comprende uno o más de un grupo basado en sulfonato; un grupo basado en sulfoetilo; un grupo basado en sulfopropilo; un grupo basado en sulfobutilo; un grupo basado en sulfoxietilo, un grupo basado en carboximetilo; grupos basados en ácido sulfónico y carboxílico; un grupo basado en ácido carboxílico; un grupo basado en ácido sulfónico; y un grupo basado en ortofosfato.
13. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio catiónico comprende:
a) tampón de pre-equilibrio: tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2
b) tampón de equilibrio: tampón de citrato 10 mM; Polisorbato 80 al 0.025 % (p/v); pH 6.0 ± 0.2
c) tampón de lavado A: tampón de citrato 10 mM; pH 6.0 ± 0.2
d) tampón de lavado B: tampón de citrato 20 mM; NaCl 300 - 500 mM; pH 6.0 ± 0.2
e) tampón CIP: NaOH 0.5 M
f) Tiempo de residencia: 4.00 - 7.00 minutos
g) Columna utilizada: XK26.
14. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio aniónico comprende:
a) tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
b) tampón de pre-equilibrio: tampón de citrato 200 mM; pH 6.0 ± 0.2
c) tampón de equilibrio: tampón de citrato 20 mM; pH 6.0 ± 0.2; y opcionalmente Polisorbato 80 al 0.025% d) tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M
e) El caudal lineal es 10 - 500 cm/h, más particularmente 100-150 cm/h
f) Columna utilizada: XK26.
15. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatografía de intercambio aniónico es “modo de flujo y lavado” o “modo de unión y elución”.
16. El método de la reivindicación 1, en el que la eliminación de partículas virales se logra mediante nanofiltración utilizando filtro retentivo de virus.
17. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína de unión a antígeno se concentra utilizando Filtración de Flujo Tangencial (TFF).
18. El método de la reivindicación 17, en el que la TFF se lleva a cabo utilizando una membrana de 30 kDa.
19. El método de la reivindicación 17, en el que el proceso de Filtración de Flujo Tangencial comprende:
a) Diafiltración utilizando tampón de diafiltración: tampón de histidina 25 mM; tampón de arginina 75 mM; NaCl 50 -150 mM; pH 6.50 ± 0.5
b) tampón de limpieza: NaOH 0.5 M
c) tampón de almacenamiento: NaOH 0.1 M
d) Equilibrio utilizando volumen de membrana de 5 - 10 X
e) Concentración y diafiltración utilizando volumen de diafiltración 10-20
f) Lavado WFI utilizando volumen de membrana de 3 - 5
g) Limpieza utilizando NaOH 0.5 -1.0 M
h) Almacenamiento NaOH 0.1 M.
20. El método de la reivindicación 1, en el que la preparación de proteína terapéutica purificada contiene no más de 2 % de agregados, preferiblemente menos de 1 % de agregados.
21. El método de la reivindicación 1, en el que la formulación de proteína de unión a antígeno estable comprende 1 mg/ml a 100 mg/ml de proteína de unión a antígeno.
22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la formulación de proteína de unión a antígeno comprende no más de 3 % de agregación, cantidad mínima de partículas subvisibles y potencia mejorada.
23. El método de la reivindicación 1, en el que la concentración del monómero de proteína de unión a antígeno en la formulación es mayor de 99%; El ADN de CHO residual no es mayor de 2 pg/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 0.1 pg/mg de proteína de unión a antígeno; la proteína de CHO residual no es mayor de 100 ng/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 10 ng/mg de proteína de unión a antígeno; la Proteína A residual no es mayor de 10 ng/mg de proteína de unión a antígeno, más particularmente no mayor de 1.5 ng/mg de proteína de unión a antígeno; la Endotoxina no es mayor de 0.1 EU/mg de proteína de unión a antígeno.
24. El método de la reivindicación 1, en el que la formulación comprende:
- <1 % (p/v), aún más preferiblemente 0.5% (p/v), sacarosa;
- 25 mM, histidina;
- 75 mM, arginina;
- 100 - 145 mM, cloruro de sodio;
- 0.02%(p/v), Polisorbato 80; y
-1 mg/ml a 50 mg/ml, proteína de unión a antígeno.
25. Una formulación farmacéutica que comprende:
a) 1 - 100 mg/ml de al menos una proteína de unión a antígeno, en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti-dengue de acuerdo con la SEQ ID 1 y SEQ ID 2 o en la que la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal anti/rabia de acuerdo con la SEQ ID 3 y SEQ ID 4;
b) 20 - 40 mM de histidina;
c) 50 - 100 mM de arginina;
d) Polisorbato 80 al 0.002 - 0.02% (p/v);
e) NaCl 50 - 150 mM;
f) sacarosa al 0.1 - 2.5% p/v; en la que pH de la formulación es 6.5 ± 0.5,
en la que la osmolalidad de la formulación es 300 - 450 mOsmol/kg y la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S y dicha formulación es estable a 2-8 grados C durante al menos 9 meses, a 25 grados C durante al menos 1 mes, a 40 grados C durante al menos 40 días, a 50 grados C durante al menos 2 días.
26. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende de 2 - 80 mg/ml de al menos una proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5% (p/v); en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5.
27. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 25 o 26, en la que la osmolalidad de la formulación es 380 mOsmol/kg.
28. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, que comprende 2 -80 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
29. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que comprende 25 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02% (p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
30. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, que comprende 50 mg/ml de proteína de unión a antígeno; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCl 101 mM; Polisorbato 80 al 0.02%
(p/v); y sacarosa al 0.5 % p/v; en la que el pH de la formulación es 6.5 ± 0.5, la osmolalidad es 380 mOsm/Kg, la viscosidad es menor de 2.5 mPa-S.
31. Una formulación farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30 para uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de virus de dengue o rabia.
32. Una formulación farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 31 en la que la formulación está comprendida en un recipiente seleccionado de una botella, un vial, una ampolla, una bolsa intravenosa, un inyector portátil, un inyector de bolo, una jeringa, una pluma, una bomba, una jeringa con aguja multidosis, una pluma multidosis, un inyector, una jeringa, un autoinyector, una jeringa precargada o una combinación de los mismos.
33. Una formulación farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 32 en la que al menos un componente de empaque primario comprende un cierre de recipiente seleccionado de polipropileno (PP), tereftalato de polietileno (PETG), polietileno de alta densidad (HDPE), tereftalato de polietileno (PET), polipentafluoroestireno (PFS), policarbonato, cloruro de polivinilo (PVC), policiclopentano (CZ.RTM.), copolímero de olefina cíclica (COC), poliolefina, y combinaciones o copolímeros de los mismos.
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