BR112019011900A2 - métodos melhorados para aumentar a produtividade de anticorpos na cultura de células de mamíferos e minimizar a agregação durante os processos downs-tream, processos de formulação, e formulações de anticorpos estáveis obtidas dos mesmos - Google Patents

métodos melhorados para aumentar a produtividade de anticorpos na cultura de células de mamíferos e minimizar a agregação durante os processos downs-tream, processos de formulação, e formulações de anticorpos estáveis obtidas dos mesmos Download PDF

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Rajeev Mhalasakant Dhere
Sambhaji Shankar Pisar
Reddy Srinivas Reddy Peddi
Digamber Chahar Singh
Leena Ravindra Yeolekar
Pankaj Singh Chouhan
Nikhil Dattatray Avalaskar
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Abstract

a presente invenção refere-se a uma plataforma eficiente para formulação e produção de anticorpos que fornece: i) processo de cultura de células com estratégia melhorada de alimentação resultando em alta titulação de anticorpos entre 2 g/l e 5 g/l; ii) processo de purificação melhorado apresentando recuperação percentual ótima, teor de monômero de alta pureza, agregação/formação de particulado mínimas, níveis mínimos de impurezas; e iii) formulação líquida estável de alta concentração com osmolalidade ótima e baixa viscosidade em diferentes temperaturas e sem agregação. os anticorpos preferidos incluem o anticorpo monoclonal igg1 específico para o epítopo do vírus da dengue no domínio iii da proteína e e o anticorpo monoclonal igg1 específico para a glicoproteína g da superfície do vírus da raiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS MELHORADOS PARA AUMENTAR A PRODUTIVIDADE DE ANTICORPOS NA CULTURA DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS E MINIMIZAR A AGREGAÇÃO DURANTE OS PROCESSOS DOWNSTREAM, PROCESSOS DE FORMULAÇÃO, E FORMULAÇÕES DE ANTICORPOS ESTÁVEIS OBTIDAS DOS MESMOS.
Antecedentes da Invenção [001] O desenvolvimento de processos upstream, downstream e de formulação muitas vezes podem ser a etapa limitante na introdução precoce de produtos biofarmacêuticos em ensaios clínicos. Por exemplo, a dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquito que afeta seres humanos. Metade da população mundial vive em áreas de risco para a dengue, resultando em cerca de 390 milhões de infecções por ano no mundo. Atualmente, nenhum agente antiviral é aprovado para tratamento da dengue. Testes recentes de vacinas ficaram aquém das expectativas. A vacina candidata líder demonstrou recentemente eficácia limitada, estimada entre 30% e 60%, com proteção limitada a nenhuma proteção significativa contra o DENV-2. Recentemente, um epítopo não-imunodominante, mas funcionalmente relevante, no domínio III da proteína E foi identificado, e, subsequentemente, está sendo desenvolvido um anticorpo engenheirado, Ab513 que apresenta ligação de alta afinidade para, e neutraliza, amplamente vários genótipos dentro de todos os quatro serotipos (Referir-se a Ram Sasisekharan et al Cell 162, 1-12, 30 de julho de 2015, Samir Bhatt et al, Nature, 2013, 25 de abril ; 496-746: 504-507). Assim, se considerarmos a demanda médica global para um anticorpol monoclonal da dengue, estimativas recentes indicam que ocorrem todo ano, no mundo, até 390 milhões de infecções por dengue com > 90 milhões apresentando a doença, fazendo do DENV, uma grande ameaça global. Se assumirmos que 30% dos 16 milhões
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2/60 de casos diagnosticados de dengue vão ao hospital, então cerca de 5 milhões necessitará o referido anticorpo monoclonal da Dengue, o que implica que anticorpo purificado acima de 4 g/L se torna um prérequisito para atender a demanda global por esse anticorpo salvador de vidas. Além disso, o ônus da dengue é alto nos países em desenvolvimento onde a disponibilidade de energia elétrica e refrigeração são muitas vezes inadequadas e, portanto, estabilidade do anticorpo através de oscilações de temperatura assume maior relevância para estas regiões.
[002] De fato, se fosse possível ter um processo em plataforma que pudesse ser empregado para fabricação e formulação de todos os candidatos a anticorpos monoclonais (mAb), haveria uma grande redução de tempo e recursos necessários para desenvolvimento do processo. Isso pode ter um impacto significativo no número de candidatos clínicos que podem ser introduzidos nos ensaios clínicos. Além disso, processos desenvolvidos para ensaios clínicos em estágio inicial, incluindo aqueles desenvolvidos usando uma plataforma, podem não ser ideais em relação à economia do processo, rendimento, volumes globais, rendimento e podem não ser adequados para a produzir as quantidades necessárias para campanhas de estágio final ou comerciais. Outra consideração importante é a velocidade do desenvolvimento do processo dado que o desenvolvimento do processso precisa ocorrer antes da introdução de um candidato terapêutico em ensaios clínicos. (Referir-se a Abhinav A. Shukla e outros. Journal of Chromatography B, 848 (2007) 28-39).
[003] Tipicamente, meios de cultura de células de mamíferos são baseado em formulações de meios comercialmente disponíveis, incluindo, por exemplo, DMEM ou F12 de Ham. Muitas vezes, as formulações de meios não são suficientemente enriquecidas para suportar aumentos no crescimento celular e na expressão biológica de
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3/60 proteína. Permanece a necessidade de melhores meios de cultura de células, suplementos e métodos de cultura de células para melhorar a produção de proteína. Aumentos nos títulos de anticorpos de cultura de célulasr para> 2 g/L foram relatados anteriormente. (Consulte F. Wurm, Nat. Biotechnol. 22 (2004) 1393). Além disso, em reatores de perfusão, células podem atingir densidades celulares muito mais elevadas do que em reatores convencionais descontínuos ou de alimentação descontínua. (Consulte Sven Sommerfeld e outros Chemical Engineering and Processing 44 (2005) 1123-1137). No entanto, processos baseados em perfusão são complexos, dispendiosos e podem também resultar em problemas de esterilidade e heterogeneidade indesejada no padrão de glicosilação. A adição de hidrolisados isentos de componentes de origem animal (Bacto TC Yeastolate, Phytone Peptona) a meios quimicamente definidos é uma abordagem comum para aumentar a densidade celular, viabilidade da cultura e produtividade em tempo hábil. Hidrolisados são proteínas digeridas compostas de aminoácidos, pequenos peptídeos, carboidratos, vitaminas e minerais que fornecem suplementos nutricionais aos meios. Hidrolisados derivados de não animais oriundos de soja, trigo e levedura são usados comumente em meios de cultura de células e alimentados para melhorar o título de anticorpo (consultar US9284371). No entanto, devido à sua complexidade de composição, variações de lote a lote, atributo indesejável de tornar a cultura viscosa, extrato de levedura e hidrolisados podem ser uma fonte significativa de variabilidade do meio. Devido à complexidade dos produtos de anticorpos que incluem isoformas e micro-heterogeneidades, o desempenho do processo de cultura celular pode ter efeitos significativos na qualidade e potência do produto, especialmente com relação a glicosilação, modificações pós-transcricionais e perfis de impureza.
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4/60 [004] Em concentrações mais altas, proteínas, particularmente anticorpos, exibem frequentemente problemas característicos incluindo agregação, precipitação, gelificação, estabilidade reduzida e/ouviscosidade aumentada.
[005] Reconhece-se que anticorpos possuem características que tendem a formar agregados e partículas em solução à medida que sofrem degradação ou agregação ou desnaturação ou modificações químicas resultando na perda de atividade biológica com o tempo durante o processo de fabricação e/oudurante o armazenamento. Durante a expressão da cultura celular, purificação downstream, formulação e armazenamento podem ser formados agregados de anticorpos. Colheita de cultura de células geralmente contém o maior nível de agregados no processo (Consulte Deqiang Yu Journal of Chromatography A, 1457 (2016) 66-75). Rotas de degradação para proteínas podem envolver instabilidade química (por exemplo, qualquer processo que envolva modificação da proteína por formação ou divagem de ligação resultando em uma nova entidade química) ou instabilidade física (por exemplo, mudanças na estrutura de ordem superior da proteína). As três vias de degradação de proteína mais comuns são agregação, desamidação e oxidação de proteínas. Cleland et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems (Revisões críticas em sistemas transportadores de fármacos terapêuticos) 10 (4): 307-377 (1993). Além disso, proteínas também são sensíveis a, por exemplo, pH, força iônica, tensão térmica, tensões de cisalhamento e interfacial, que podem levar à agregação e resultar em instabilidade. Para uma proteína permanecer biologicamente ativa, uma formulação deve, portanto, preservar intata a integridade conformacional de pelo menos uma sequência nuclear dos aminoácidos da proteína enquanto, ao mesmo tempo, protege os múltiplos grupos funcionais da proteína da degradação.
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5/60 [006] Um problema importante causado pela formação de agregados é que durante a administração a formulação pode bloquear seringas ou bombas e torná-las inseguras para os pacientes. Essas modificações de proteínas também podem torná-las imunogênicas, resultando na geração de anticorpos antifármacos pelo paciente, o que pode reduzir a disponibilidade do fármaco durante as injeções subsequentes ou pior induzir uma reação autoimune. Um objetivo principal no desenvolvimento de formulações de anticorpos é manter a solubilidade, estabilidade e bioatividade da proteína.
[007] As primeiras sugestões sobre como resolver os problemas de instabilidade das formulações terapêuticas de proteínas incluíam a liofilização do fármaco, seguida de reconstituição imediatamente ou pouco antes da administração. No entanto, formulações liofilizadas de anticorpos têm várias limitações, incluindo um processo prolongado para liofilização resultando em alto custo de fabricação. Além disso, uma formulação liofilizada deve ser reconstituída assepticamente e com precisão por profissionais de saúde antes da administração a pacientes. A própria etapa de reconstituição requer certos procedimentos específicos, isto é, (1) um diluente estéril (isto é, água para administração intravenosa e dextrose a 5% em água para administração intramuscular) é adicionado ao frasco contendo o anticorpo liofilizado, lenta e assepticamente, e o frasco deve ser girado muito suavemente por 30 segundos para evitar formação de espuma; (2) o anticorpo reconstituído pode precisar permanecer à temperatura ambiente por no mínimo 20 minutos até que a solução clarifique; e (3) a preparação reconstituída deve ser administrada no prazo de seis (6) horas após a reconstituição. Este procedimento de reconstituição é complicado e a limitação de tempo após a reconstituição pode causar um grande inconveniente na administração da formulação a pacientes, levando a um desperdício significativo, se não for reconstituído adequadamente, ou se a dose
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6/60 reconstituída não for utilizada dentro de seis (6) horas e tiver de ser descartada. Portanto, uma formulação líquida é desejável devido a fatores de conveniência clínica e do paciente, bem como facilidade de fabricação. No entanto, formulações farmacêuticas líquidas de agentes terapêuticos proteicos, isto é, anticorpos devem ser estáveis a longo prazo e conter uma quantidade segura e eficaz do composto farmacêutico.
[008] Remoção de agregados é mais difícil do que remoção de impurezas relacionadas ao processo devido às semelhanças biofísicas entre agregado e monômero, às múltiplas fontes e tipos de agregados e menor compreensão do mecanismo de agregação.
[009] Um dos desafios mais recentes encontrados durante o desenvolvimento de formulações de formas de dosagem de anticorpos monoclonais de alta concentração é a formação de particulados proteicos subvisíveis e visíveis durante a fabricação e armazenamento a longo prazo. O nível de particulados proteicos e não proteicos nas formulações de IgG é uma parte cada vez mais importante do desenvolvimento da formulação e purificação. (Consulte Klaus Wuchner e outros, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 99, n. 8, agosto de 2010). Além disso, a formulação líquida deve ser estável em diferentes temperaturas, ou seja, temperaturas entre 2 e 8°C, 25°C, 40°C e 55°C. [0010] Muitas preparações de anticorpos destinadas a uso humano requerem estabilizadores para prevenir desnaturação, agregação e outras alternâncias nas proteínas antes do uso da preparação. Formulações de anticorpo líquido previamente reportadas (Lucentis, Avastin) tinham manitol, trealose como estabilizadores. (Consulte Susumu Uchiyama e outros Biochimica Biophysica Acta 1844 (2014) 20412052; US20160137727; W02009120684; US8568720). No entanto, a trealose é dispendiosa e inviável na economia de processos em larga escala.
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7/60 [0011] Além disso, a administração IV de anticorpo é geralmente administrada como uma infusão em vez de um bolus, e assim requer diluição da formulação de mAb, incluindo excipientes em fluidos apropriados adequados para administração IV. A diluição resultante de excipientes, especialmente tensoativos, que pode diminuir abaixo da concentração necessária para prevenir agregação durante a agitação, resultando assim na geração de agregados e partículas subvisíveis depois de agitação suave após diluição em sacos de PVC e PO IV contendo solução salina a 0,9%.
[0012] Cromatografia de interação hidrofóbica, cerâmica hidroxiapatita e resinas de troca catiônica têm sido usadas para remoção de agregados, mas nenhuma é ideal. A maioria dos processos de purificação de anticorpos anteriormente relatados tem sido fortemente baseada no uso de cromatografia de interação hidrofóbica em combinação com cromatografia de proteína A, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica como um processo de três ou quatro etapas (consultar WO2010141039, WO 2014/207763, W02013066707, WO2015099165, W02014102814, WO2015038888, W02004087761). No entanto, as resinas de cromatografia de interação hidrofóbica requerem grandes quantidades de sais que são dispendiosas, apresentam baixa capacidade de ligação, podem ser difíceis de eliminar e podem não ser compatíveis com os materiais de construção de tanques de tampão e produto. Além disso, a diferença de densidade entre os tampões usados para uma etapa de HIC pode causar problemas de estabilidade do leito. A cerâmica hidroxiapatita pode também ser usada para separação do agregado do monómero, mas a resina cerâmica pode ser muito difícil de desembalar sem danificar a resina. Portanto, armazenar a resina fora da coluna para reutilização em uma campanha de fabricação subsequente pode não ser possível (Consulte Suzanne Aldington Journal of Chromatography B, 848 (2007) 64-78).
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8/60 [0013] Verificou-se que combinações de três etapas de fluxo de troca catiônica, troca aniônica, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de troca catiônica de modo misto liberam adequadamente os contaminantes proteicos da célula hospedeira para um anticorpo monoclonal derivado de CHO. No entanto, esses esquemas de purificação, em geral não se enquadraram em operações downstream comerciais devido à necessidade de projetar a sequência de purificação separadamente para cada mAb.
[0014] Assim, existe uma necessidade urgente não atendida de um processo de plataforma eficiente para fabricação e formulação de anticorpos que atenda a múltiplos critérios, incluindo robustez, confiabilidade e escalabilidade, em particular uma plataforma que forneça i) título de anticorpo de pelo menos 2 g/L; ii) mínima agregação / formação de particulado através da cultura de células, processos de purificação e formulação; iii) melhoria da purificação, mostrando ótima recuperação percentual, alto teor de monômero e níveis mínimos de impureza; e iv) formulação de anticorpo de alta concentração apresentando baixa viscosidade, sem agregação e partículas subvisíveis; apresentando assim estabilidade a longo prazo.
Breve descrição da invenção [0015] O requerente surpreendentemente descobriu [0016] Uma composição de alimentação e estratégia de alimentação que leva em consideração o consumo de nutrientes, o acúmulo de subprodutos e o balanço entre promoção de crescimento versus produtividade volumétrica, em que, em particular, parâmetros de processo de cultura de células de mamíferos, como uso de meio basal particular, uso de meio basal concentrado como solução de alimentação, uso de diferentes soluções de alimentação juntamente com uma estratégia de alimentação definida, mantendo concentrações mais baixas de lactato e amônia, mostraram aumentar o crescimento celular, longevidade
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9/60 das células e expressão da proteína; resultando assim em um aumento do título de anticorpos.
[0017] Concentração salina específica como parte do tampão durante as etapas de afinidade com Proteína A e de permuta catiônica que minimizam a agregação; obtendo assim um teor de monómero superior a 99% com uma recuperação superior a 80%.
[0018] Formulações líquidas de anticorpos isentas de partículas contendo sacarose em combinação com Histidina, Arginina, Polissorbato-80, Cloreto de sódio que conferem maior potência e estabilidade, reduzem a viscosidade de soluções de anticorpo altamente concentradas a 2-8 °C por pelo menos 9 meses, a 25 °C por pelo menos 1 mês, a 40 °C por pelo menos 42 dias, a 55 °C por pelo menos 2 dias, em comparação com formulação desprovida de sacarose.
Lista de Figuras:
[0019] Figura 1: Fluxograma - Processamento downstream para purificação de anticorpo monoclonal [0020] Figura 2: Fluxograma - Processo de formulação de anticorpo monoclonal.
Descrição Detalhada da Invenção [0021] Proteínas terapêuticas da presente invenção incluem, mas não se limitam a proteína de ligação a antígeno, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo humano, anticorpo biespecífico, anticorpo multivalente, anticorpo multiespecífico, fragmentos de proteína de ligação a antígeno, policlonais, monoclonais, diacorpos e nanocorpos, monovalentes, heteroconjugados, multiespecíficos, autoanticorpos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)'2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld), fragmentos de ligação a epítopo e fragmentos contendo CDR ou suas combinações.
[0022] Em uma modalidade da presente invenção, a proteína tera
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10/60 pêutica é uma proteína de ligação a antígeno ou imunoglobulina; mais preferivelmente é uma molécula de IgG e no máximo da preferência é uma molécula de lgG1. Em um primeiro aspecto da presente modalidade, imunoglobulina / anticorpo é um lgG1 humano (alotipo G1m3) com uma cadeia leve kappa humana específica para o epítopo do vírus da Dengue no domínio III da proteína E. Em um segundo aspecto da presente modalidade, o anticorpo é um anticorpo monoclonal lgG1 totalmente humano específico para a glicoproteína G da superfície do vírus da raiva. Em um terceiro aspecto da presente modalidade, a proteína terapêutica pode ser selecionada no grupo compreendendo CTP19, CR57, CR4098, RVFab8, MabJA, MabJB-1, Mab 57, 17C7, 2B10, Ab513/VIS513, N297Q-B3B9, Mab2E8, 2D22. , DMScHuMab, 3CH5L1, HMB DV5, HMB DV6, HMB DV8, DB32-6, D88, F38, A48, C88, F108, B48, A68, A100, C58, C78, C68, D98, D188, C128, C98, A11, B11, R17D6, R14B3, R16C9, R14D6, R18G9, R16F7, R17G9, R16E5, anticorpos derivados da modificação de 4E11A, adatacept, abciximabe, adalimumabe, aflibercepte, alefacepte, alentuzumabe. trastuzumabe, basiliximabe, bevacizumabe, belatacepte, bectumomabe, certolizumabe, cetuximabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, entanercepte, gentuzumabe, ibritumomabe, infliximabe, muromonabe-CD3, omalizumabe, palivizumabe, panitumumabe, pertuzumabe, ranibizumabe, rilonacepte, rituximabe, tositumomabe, trastuzumabe, zanolimabe, nivolumabe, pembrolizumabe, hA20, AME-I33, IMC-3G3, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, ch*)A, KSB-102, MR1-1 , SC100, SC101, SC103, muromonabe-CD3, OKT4A, ibritumomabe, gentuzumabe, motavizumabe, infliximabe, pegfilgrastim, CDP-571, etanercepte, ABX-CBL, ABX-IL8, ABX-MAI, panitumumabe, Therex, AS1405, natalizumabe, HuBC- I, IDEC-131, VLA-I; CAT-152; J695, CAT-192, CAT-213, BR3-Fc, LymphoStat-B, TRAIL-RImAb, bevacizumabe, omalizumabe, efalizumabe, MLN-02, HuMax-IL 15, HuMaxPetição 870190053787, de 12/06/2019, pág. 121/197
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Inflam, Hu Max-Cancer, HuMax-Lymphoma, HuMax -TAC, clenoliximabe, *lumiliximabe, BEC2, IMC-ICI1, DCIOI, labetuzumabe, arcitumomabe, epratuzumabe, tacatuzumabe, cetuximabe, MyelomaCide, LkoCide, ProstaCide, ipilimumabe, MDX-060, MDX-070, MDX-018, MDX-1106, MDX-1103, MDX-1333, MDX-214, MDX-1100, MDX-CD4, MDX-1388, MDX-066, MDX-1307, HGS-TR2J, FG-3019, BMS-66513, SGN-30, SGN- 40, tocilizumabe, CS-1008, IDM-I, golimumabe, CNTO 1275, CNTO 95, CNTO 328, mepolizumabe, MORIOI, MORI 02, MOR201, visilizumabe, HuZAF, volocixmabe, ING-I, MLN2201, daclizumabe, HCD 122, CDP860 , PR0542, C 14, oregovomabe, edrecolomabe, etaracizumabe, atezolizumabe, jplimumabe, mogamulizumabe, lintuzumabe, HulDIO, Lym-1, efalizumabe, ICM3, galiximabe, eculizumabe, obinutuzumabe, pexelizumabe, LDP-ΟΙ, huA33, WX-G250, sibrotuzumabe, ofatumumabe. Chimeric KW-2871, hu3S193, huLK26; bivatuzumabe. raxibacumabe, CI4.18, 3F8, BC8, huHMFGI, MORAb003, MORAb-004, MORAb-009, denosumabe, PRO-140, 1D09C3, huMikbeta-1, NI-0401, NI-501, cantuzumabe, HuN901 , 8H9, chTNT1/B, bavituximabe, huJ591, HeFi-l, Pentacea, abagovomabe, tositumomabe, ustequinumabe, 105AD7, GMAI 61, GMA321.
[0023] Em outro aspecto desta modalidade, a proteína terapêutica é um anticorpo possuindo afinidade de ligação a epítopos presentes no vírus da Dengue, vírus da raiva, RSV, MPV, vírus da gripe (influenza), vírus da zika, vírus Oeste do Nilo, Vírus da febre amarela, vírus da chikungunya. HSV, CMV, MERS, vírus Ebola, vírus Epstein-Barr, vírus Varicella-Zoaster, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da poliomielite, vírus Rhino, adenovirus, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus Norwalk, Togavirus, vírus alfa, vírus da rubéola, vírus HIV, vírus Marburg, vírus Ebola, vírus do papiloma humano, poliomavírus, metapneumovirus, coronavirus, VSV e VEE.
[0024] Em outro aspecto desta modalidade, o ponto isoelétrico (pl)
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12/60 da referida proteína de ligação a antígeno é de 7,0 a 8,5, mais preferivelmente, de cerca de 7,4 a cerca de 8,2.
[0025] Em particular, a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo terapêutico, profilático ou de diagnóstico como descrito em WO2014025546, WO2015122995, WO2015123362, W02006084006, WO2017027805 e WO2017165736, cujos conteúdos estão aqui incorporados por referência em sua totalidade. Mais preferivelmente, a proteína terapêutica é um anticorpo tendo 80% de similaridade com o VIS513 (Seq ID 1 ou Seq ID 2). Em outro aspecto preferido da presente modalidade, a proteína terapêutica é um anticorpo tendo mais de 80% de similaridade com o anticorpo monoclonal da raiva (Seq ID 3 e Seq ID 4).
[0026] Está muito bem entendido que qualquer hospedeiro pode ser usado para a expressão de proteína terapêutica nos métodos aqui descritos. As células podem ser selvagens ou geneticamente modificadas para conter uma sequência de ácido nucleico recombinante, por exemplo, um gene, que codifica um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um anticorpo).
[0027] Em uma segunda forma de realização da invenção Presente, linhagem celular utilizada para a expressão de proteínas terapêuticas é selecionado a partir do grupo incluindo, mas não limitados a CHO, CHOK1SV GS-KO, GSCHO, CHO DUX-B11, CHO-K1, BSC-1, NS0 células de mieloma, CV-1 em Origem portadora de células SV40 (COS), COS-1, COS-7, P3X3Ag8.653, C127, 293 EBNA, MSR 293, COIo25, U937, células SP2, célula L, células de rim embrionário humano (HEK 293), células de rim de hamster bebê (BHK 21), células renais de macaco verde Africano VERO-76, células HELA, VERO, BHK, MDCK, células WI38, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (uma linhagem celular de mieloma murino que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina),
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CRL7O3O, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Ag14, uma linha celular de mieloma, uma linha celular de híbrido, células pulmonares humanas (W138), retina células, linha de hepatoma humano (Hep G2) e células de hibridoma.
[0028] Em outro aspecto da segunda modalidade, células hospedeiras de animais ou de mamíferos incluem mas não se limitam a células de ovário de hamster chinês (CHO), como CHO-K1 (ATCC CCL61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12: 555-556; e Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36: 10901-10909), SH87 celICHODXB11 (G. Urlaub e LA Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei., 77: 42164220, L.H. Grafe L.A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93-96), linhagem de células CHO-K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire , UK), CHO clone 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clone B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF designado ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), RR- CHOK1 designado ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), CHOKIsv (Edmonds et al., Mol. Biotech. 34: 179-190 (2006)), CHO-S (Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108: 38694 (2011)), células CHO negativas para di-hidrofolato redutase (CHO/DHFR, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216) e células dp12.CHO (U.S. Pat. No. 5 721 121); células CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL1651); células de rim embrionário humano (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células renais de bebê de hamster (BHK, ATCC CCL-10); Célula CAP, célula AGE1.HN, células de rim de macaco (CV 1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de Sertoli de camundongo (ΤΜ4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); céulas de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC
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CCL-2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL-34); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células tumorais mamárias de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL-51); células de fígado de rato Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TR1 (Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383: 44-68); células MCR 5; e células FS4.
[0029] Em um primeiro aspecto da segunda modalidade, a linhagem de células utilizada para a expressão de proteínas terapêuticas é células de ovário de hamster chinês; mais particularmente, a linhagem de células é CHOK1SV GS-KO ou GS-CHO.
[0030] Em uma terceira modalidade da presente invenção, as células são cultivadas em modo de batelada, batelada alimentada ou modo contínuo; mais particularmente em um modo de alimentação em batelada. É muito bem compreendido, que uma pessoa perita na arte pode modular um processo descrito nesta invenção de acordo com instalações disponíveis e necessidades individuais. Mais particularmente, o processo de cultura de células é realizado em modo de alimentação em batelada proporcionando crescimento celular melhorado, longevidade das células e aumento da expressão de proteína isto é, provendo um rendimento de colheita de pelo menos 2 g/L, preferivelmente na faixa de 3 g/L a cerca de 6 g/L.
[0031] Em um primeiro aspecto da terceira modalidade, a cultura de células é realizada em um frasco, em um biorreator, um biorreator de tanque, um biorreator de saco ou um biorreator descartável. Preferivelmente, o referido biorreator é selecionado no grupo de biorreator de tanque agitado, biorreator de coluna de bolhas, biorreator agitado pneumaticamente “Airlift”, biorreator de leito fluidizado ou biorreator de leito fixo; e o referido biorreator tem um volume selecionado entre 1L, 2L, 3L, 5L, 10L, 20L, 100L, 200L, 250L, 350L, 500L, 1000L, 1500L, 3000L, 5000L, 10000L, 20000L e 30.000 litros.
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15/60 [0032] Em um segundo aspecto da terceira modalidade, os presentes meios e métodos de cultura de células podem ser utilizados para aumentar o rendimento de anticorpos em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 180% ou 200%, mais preferivelmente, cerca de 40% a 60%, conforme medido ao longo de uma quinzena. O período de tempo do método de alimentação em batelada pode ser de cerca de 12 a 20 dias; cerca de 15 a 20 dias ou cerca de 15 a 18 dias.
[0033] Em uma quarta modalidade da presente invenção, o meio de cultura de células é selecionado no grupo compreendendo um ou mais entre CD CHO, CD OptiCHO™, CD FortiCHO™ (Life Technologies); Ex-Cell™ CD CHO (Sigma Aldrich); ProCHO™5 (Lonza); BalanCD™ CHO Growth A (Irvine Scientific); CDM4Mab (Hyclone); Cellvento™ CHO-100 (EMD Millipore); Cell vento 200 (Merck Millipore); Cell vento 220 (Merck Millipore); Actipro (Hyclone); e combinação dos mesmos. Preferivelmente, o meio de cultura de células é selecionado entre Cell Vento 220 (Merck), ACTIPRO (HyClone/ GE) ou Gibco™Dynamis™ Medium (Thermo Fisher).
[0034] O meio de cultura de células é ainda suplementado com glicose e outras soluções de alimentação, de modo a aumentar o crescimento celular, longevidade das células, e expressão e rendimento das proteínas. É muito bem compreendido na técnica que as soluções de alimentação podem ser suplementadas em bolus rápido ou em gotejamento gradual.
[0035] A suplementação de solução de alimentação em meio de cultura de células com uma estratégia de alimentação compreende a: [0036] Alimentação inicial com solução de alimentação A, a 0,05% a 0,5% do volume do reator, de preferência a 0,1% a 0,2% do volume do reator, a partir do dia 4;
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16/60 [0037] Alimentação com a solução de alimentação A, a 0,1% a 0,5% do volume do reator no dia 6, 8, 10, 11 e 13;
[0038] Solução de alimentação B com menos de 8% do volume do reator, do dia 2 ao dia 14, em dias alternados ou de maneira contínua;
[0039] Alimentação com solução de alimentação C com menos de 8% do volume do reator por pelo menos 2 dias consecutivos a partir do dia 2 ou dia 3, com um intervalo intermitente de 2 dias consecutivos até o 12- dia ou 14- dia ou 15- dia ou 16- dia ou 18- dia.
[0040] Alimentação com solução de alimento D a menos de 0,5% do volume do reator por pelo menos 2 dias consecutivos a partir do dia 4 ou dia 5, em dias alternados ou de forma contínua ou com um intervalo intermitente de 2 dias consecutivos até o 122 dia ou 142 dia ou 152 dia ou 16- dia ou 18- dia. Opcionalmente, alimentação com pelo menos uma solução de alimentação selecionada entre EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B, EfficientFeed™ C e Dow Corning Antifoam C.
[0041] Em um aspecto preferido da quarta modalidade, a referida solução de alimentação A, solução de alimentação B, solução de alimentação C, solução de alimentação D, é selecionada, uma ou mais, do grupo que compreende Glicose, suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a e 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone/GE), Cell Vento 220 (1X medium), EXCELL® Advanced™ CHO Feed 1, EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B e EfficientFeed™ C, e suas combinações.
[0042] Em um aspecto mais preferido da quarta modalidade, a referida solução de alimentação A é o suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone); a solução de alimentação B é EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), a solução de alimentação C é o suplemento Cell Boost 7a (Hyclone), a solução de alimentação D é o suplemento Cell Boost 7b (Hyclone). Além disso, o meio de cultura de células é suplementado com 10% 3X Actipro (Hyclone) no 32 dia e Cell Vento 220 8% (meio
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1X) no 72 dia de cultura de células. É muito bem entendido que toda a adição de alimentação pode variar em ± 1% e ± 1 dia por um perito na arte.
[0043] Outro aspecto da quarta modalidade inclui condições de cultura de células empregadas para aumentar o crescimento celular e a longevidade e expressão de proteínas. As seguintes condições de cultura de células empregadas durante o processo incluem, mas não se limitam a:
[0044] O pH do meio de cultura das células fica na faixa de 6,5 a 7,5;
[0045] A osmolalidade do meio de cultura fica na faixa de 250 500 mOsm/kg; mais preferivelmente 400 - 500 mOsm/kg.
[0046] O oxigênio dissolvido fica na faixa de 10 a 60%; preferivelmente 20-40%; mais preferivelmente 30%.
[0047] A temperatura da cultura de células fica na faixa de 30°C a 38°C; a primeira temperatura, preferivelmente, de 36-37°C e, opcionalmente, a segunda temperatura, preferivelmente, de 30-35°C.
[0048] A concentração de glicose é mantida abaixo de 7%; preferivelmente entre 4% e 5%.
[0049] Colher a cultura de células quando a viabilidade for reduzida para 80%;
[0050] Em que as condições da cultura de células são mantidas de maneira que os metabólitos secundários, como a concentração de lactato não seja superior a 5 g/L; e a concentração de amônia não seja superior a 5 mMol/L [0051] Na quinta modalidade da presente invenção, a referida proteína terapêutica obtida da colheita de cultura celular é submetida a um processo de purificação compreendendo as seguintes etapas: i) cromatografia por afinidade, ii) inativação viral, iii) cromatografia por troca iônica e iv) filtração; em que a recuperação global do processo é
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18/60 superior a 70% e a proteína terapêutica purificada final tem um teor de pureza/monômero de pelo menos 90%, preferivelmente superior a 98%. Outras impurezas, incluindo o DNA residual da célula I, proteína residual da célula e proteína A residual na proteína terapêutica final purificada são inferiores a 1%.
[0052] No aspecto geral da quinta modalidade, os inventores desta invenção conseguiram lidar com o problema da agregação de proteína terapêutica durante o processamento downstream da referida proteína, utilizando i) sal em uma etapa de lavagem por cromatografia por afinidade e ii) gradiente linear de solução de sal para eluição em etapa de cromatografia de troca iônica. Em um aspecto preferido da referida modalidade, a concentração de sal dos tampões utilizados na purificação fica na faixa de 30 mM - 500 mM, mais preferivelmente a concentração de sal dos tampões usados na purificação fica na faixa de 50 mM - 300 mM.
[0053] Em um primeiro aspecto da quinta modalidade, cromatografia por afinidade selecionada no grupo compreendendo uma ou mais entre cromatografia de proteína A, cromatografia de proteína G, cromatografia de proteína L e combinação das mesmas; preferivelmente, a cromatografia por afinidade utilizada é a cromatografia de Proteína A.
[0054] Em um segundo aspecto da quinta modalidade, a resina utilizada para cromatografia de Proteína A é selecionada no grupo compreendendo um ou mais entre Eshmuno A, KanCapATM, MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose Fast Flow, Poros® MabCapture A, Protein A JWT203 Amsphere™, ProSep HC, ProSep Ultra e ProSep Ultra Plus. Preferivelmente, a resina de cromatografia por afinidade de Proteína A é MabSelect SuRe™, Eshmuno A, Kancap A ou Poros MabCapture; mais preferivelmente, a resina de cromatografia por afinidade de Proteína A é MabPetição 870190053787, de 12/06/2019, pág. 129/197
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Select SuRe™.
[0055] Em um terceiro aspecto da quinta modalidade, o tampão de lavagem utilizado para cromatografia de Proteína A é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre:
tampão fosfato 10-30 mM, de preferência tampão fosfato 20 mM; NaCl 100 - 150 mM, preferivelmente NaCl 150 mM; polissorbato 80 0,05%; pH 7,0 ± 0,2.
tampão fosfato 10-30 mM, de preferência tampão fosfato 20 mM; NaCl 250 mM - 1M, preferivelmente NaCl 1M; polissorbato 80 0,05%; pH 7,0 ± 0,2.
tampão fosfato 1-30 mM, de preferência tampão fosfato 10 mM; NaCl 100 mM - 150 mM, preferivelmente NaCl 125 mM; polissorbato 80 0,05%; pH 7,0 ± 0,2.
[0056] Em um quarto aspecto da quinta modalidade, o tampão de eluição usado para cromatografia de proteína A compreende tampão citrato de 10 - 30 mM; pH 3,0 ± 0,5; e opcionalmente 0,01 - 0,05% (p/v) de polissorbato 80; preferivelmente o tampão de eluição consiste em tampão citrato 20 mM; pH 3,0 ± 0,2; e opcionalmente 0,025% (p/v) de polissorbato 80.
[0057] Em um quinto aspecto da quinta modalidade, o eluato obtido a partir da etapa de cromatografia por afinidade é submetido à redução e inativação viral. É muito bem compreendido na técnica que a redução e inativação viral do eluato podem ser efetuadas por um método selecionado individualmente ou em combinação no grupo compreendendo tratamento de pH, tratamento com detergente, tratamento térmico e filtração para redução de vírus. Em um aspecto preferido desta modalidade, a inativação viral é efetuada submetendo o eluato a pH baixo, isto é 3,3-3,5 por 50 a 100 minutos. Além disso, o eluato foi neutralizado por pH submetendo-o a tampão de neutralização, isto é, tampão Tris / Citrato 1M, pH 7,0 ± 0,2. É muito bem compreendido na
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20/60 arte que qualquer outro tampão compatível pode ser utilizado alternativamente para uma neutralização efetiva do eluato por pH.
[0058] No sexto aspecto da quinta modalidade, o eluato viral inativado é submetido à cromatografia de troca iônica. De acordo com um dos aspectos desta modalidade, a cromatografia de iônica é cromatografia de troca catiônica ou cromatografia de troca aniônica ou sua combinação; e a cromatografia pode ser realizada no modo ligar e eluir ou no modo fluir. No aspecto preferido desta modalidade, cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica são realizadas em qualquer ordem sequencial. Um outro aspecto da quinta modalidade é que a referida resina de cromatografia é opcionalmente uma resina multimodal como a resina Capto MMC (GE Healthcare).
[0059] No sétimo aspecto da quinta modalidade, o eluato viral inativado é submetido a cromatografia de troca catiônica. Em um aspecto preferido desta modalidade, os parâmetros cromatográficos incluindo resina cromatográfica e condições de tamponamento são selecionados de maneira que a proteína terapêutica carregada positivamente se liga à resina de cromatografia enquanto as moléculas carregadas negativamente entram no fluxo, outras proteínas terapêuticas são submetidas à eluição usando um gradiente de sal. Em um aspecto preferido desta modalidade, a resina de cromatografia de troca catiônica é selecionada no grupo compreendendo um ou mais de : grupo baseado em sulfonato (por exemplo, MonoS, MiniS, Source 15S e 30S, SP SEPHAROSE® Fast Flow, SP SEPHAROSE® High Performance da GE Healthcare, TOYOPEARL® SP-650S e SP-650M da Tosoh, MACRO-PREP® High S da BioRad, Ceramic HyperD S, TRISACRYL® M e LS SP e Spherodex LS SP da Pall Technologies); um grupo baseado em sulfoetila (por exemplo, FRACTOGEL® SE, da EMD, POROS® ΒΙΟ e S-20 da Applied Biosystems); um grupo baseado em sulfopropila (por exemplo, TSK Gel SP 5PW e SP-5PW-HR da Tosoh, POROS®
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HS-20, HS 50 e POROS® XS da Life Technologies); um grupo baseado em sulfoisobutila (por exemplo, FRACTOGEL® EMD SOs' da EMD); um grupo baseado em sulfoxietila (por exemplo, SE52, SE53 e Express-Ion S da Whatman), um grupo baseado em carboximetila (por exemplo, CM SEPHAROSE® Fast Flow da GE Healthcare, Hydrocell CM da Biochrom Labs Inc., MACRO-PREP® CM da BioRad, Ceramic HyperD CM, TRISACRYL® M CM, TRISACRYL® LS CM, da Pall Technologies, Matrex CELLUFINE® C500 e C200 da Millipore, CM52, CM32, CM23 e Express-Ion C da Whatman, TOYOPEARL® CM-650S, CM-650M e CM-650C da Tosoh), grupos baseados em ácido sulfônico e carboxílico (por exemplo, BAKERBOND® Carboxy-Sulfon da JT Baker), um grupo baseado em ácido carboxílico ( por exemplo, WP CBX da JT Baker, DOWEX® MAC-3 da Dow Liquid Separations, resinas trocadoras de cátions fracas AMBERLITE®, trocadora de cátions fracas DOWEX®, e trocadoras de cátions fracas DIAION® da SigmaAldrich e FRACTOGEL® EMD COO’ da EMD); um grupo baseado em ácido sulfônico (por exemplo, Hydrocell SP da Biochrom Labs Inc., resina catiônica de ácido forte de malha fina (Fine Mesh Strong Acid Cation Resin) DOWEX® da Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic da J.T. Baker, membrana SARTOBIND® S da Sartorius, resinas trocadoras de cátions fortes AMBERLITE®, resina trocadora de cátions fortes DOWEX® e resina trocadora de cátions fortes DIAION® da Sigma-Aldrich); e um grupo baseado em ortofosfato (por exemplo, PI 1 da Whatman). No aspect mais preferido desta modalidade, a resina usada para cromatografia de troca catiônica é Fractogel® EMD SO3·, Fractogel® EMD SE Hicap (Merck), CMM HyperCel™ (Pall Corporation), Capto S ImpAct. Em outro aspecto da quinta modalidade, parâmetros de processo para cromatografia de troca catiônica incluem, mas não se limitam a, tampão de pré-equilíbrio [tampão citrato 200 mM; pH 6,0 ± 0,2]; tampão de equilíbrio [tampão citrato 10 mM; Polis
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22/60 sorbato 80 (0,025% (p/v)); pH 6,0 ± 0,2]; baixo pH para neutralização; tampão de lavagem A [tampão citrato 10 mM; pH 6,0 ± 0,2]; tampão de lavagem B [tampão citrato 20 mM; NaCI 300 - 500 mM; pH 6,0 ± 0,2]; tampão CIP [NaOH 0,5 MJ; tempo de residência [4,00 - 7,00 minutos]; coluna utilizada [XK26], [0060] No oitavo aspecto da quinta modalidade, o eluato viral inativado é submetido a cromatografia de troca aniônica. Em um aspecto preferido desta modalidade, os parâmetros cromatográficos incluindo resina cromatográfica e condições de tamponamento são selecionados de tal modo que todas as impurezas carregadas negativamente se ligam à membrana enquanto a proteína terapêutica elui em um fluxo através da membrana. Em um aspecto preferido desta modalidade, a resina de cromatografia de troca aniônica é selecionada no grupo que compreende um ou mais de: DEAE-celulose, POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 da Applied Biosystems, SARTOBIND® Q da Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q e 30Q, Q, DEAE e ANX SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE, Q SEPHAROSE® High Performance, QAE SEPHADEX® e FAST Q SEPHAROSE® (GE Healthcare),WP PEI, WP DEAM, WP QUAT da J.T. Baker, Hydrocell DEAE e Hydrocell QA da Biochrom Labs Inc., U Osphere Q, MACRO-PREP® DEAE e MACRO-PREP® High Q da Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, TRISACRYL® M e LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA SPHEROSIL® LS, QMA SPHEROSIL® M e MUSTANG® Q da Pall Technologies, resinas aniônicas tipo I e tipo II de base forte com malha fina DOWEX® e DOWEX® MONOSPHER E 77, resina aniônica de base fraca da Dow Liquid Separations, membrana INTERCEPT® Q, Matrex CELLUFINE® A200, A500, Q500, e Q800, da Millipore, FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD DEAE e FRACTOGEL® EMD DMAE da EMD, resinas trocadoras de anions fracos e fortes AMBERLITE® tipo I e II, resinas trocadoras de anions
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23/60 fracos e fortes DOWEX® tipo I e II, resinas trocadoras de ânions fracos e fortes DIAION® tipo I e II, DUOLITE® da Sigma-Aldrich, TSK gel Q e DEAE 5PW e 5PW-HR, TOYOPEARL® SuperQ-650S, 650M e 650C, QAE-550C e 650S, DEAE-650M e 650C da Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51 , DE52, DE53, Express-Ion D e Express-Ion Q da Whatman; mais preferivelmente a resina de cromatografia de troca aniônica é selecionada entre Sartobind Q (Sartorius), Eshmuno Q (Merck), MUSTANG® Q (Pall Corporation) e Poros X (Thermo). Em outro aspecto da quinta modalidade, parâmetros do processo para cromatografia de troca aniônica incluem, mas não se limitam a, tampão de limpeza [NaOH 0,5 M]; tampão de pré-equilíbrio [tampão citrato 200 mM; pH 6,0 ± 0,2]; tampão de equilíbrio [tampão citrato 20 mM; pH 6,0 ± 0,2; e opcionalmente Polissorbato 80 0,025%]; tampão de armazenamento [NaOH 0,1 M]; vazão Linear [10 - 500 cm/h, mais particularmente 100-150 cm/h]; coluna usada [XK26], [0061] O processo de purificação das modalidades acima mencionadas pode ainda compreender pelo menos uma etapa adicional de cromatografia selecionada no grupo compreendendo uma ou mais entre cromatografia de interação hidrofílica, cromatografia de indução de carga hidrofóbica, cromatografia de cerâmica hidroxiapatita, cromatografia multimodal (Capto MMC e Capto Adhere), cromatografia de membrana (Membranas Q incluindo Intercept™ (Millipore), Mustang® (Pall Corporation) e Sartobind ™ (Sartorius)).
[0062] No nono aspecto da quinta modalidade, partículas de virus foram removidas usando um filtro de 20 nm. O filtro usado para remoção de partículas virais inclui, mas não se limita a, filtro retentor de vírus selecionado no grupo de Viresolve PRO (Merck), Planova 20N (Asahi Kasei), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences) e Virosart (Sartorius), filtro Virosart CPV da Sartorius, Virosolve da Millipore, Ultipor DV20 ou DV50 da Pall, Planova 20N e
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50N ou BioEx da Asahi. É muito bem entendido na técnica que qualquer outro filtro com capacidade de retenção para vírus pode ser utilizado nesta etapa; preferivelmente, o filtro usado para a remoção de partículas virais é selecionado entre Viresolve PRO (Merck), BioEx PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences), e Virosart (Sartorius).
[0063] No décimo aspecto da quinta modalidade, a proteína terapêutica é concentrada até uma concentração desejada e o tampão é trocado na formulação de tampão. O tampão é trocado em um sistema de filtragem de fluxo tangencial ou em um sistema de ultrafiltração. Os outros parâmetros de filtração de fluxo tangencial compreendem um ou mais selecionados de diafiltração utilizando tampão de diafiltração [tampão de histidina 25 mM; tampão de arginina 75 mM; NaCI 50 - 150 mM; pH 6,50 ± 0,5]; tampão de limpeza [NaOH 0,5 M]; tampão de armazenamento [NaOH 0,1 M]; equilíbrio usando 5 - 10 X volumes de membrana; concentração e diafiltração usando 10-20 volumes de diafiltração; lavagem WFI usando 3 - 5 volumes de membrana; limpeza usando NaOH 0,5 - 1,0 M; armazenamento [NaOH 0,1 M], Em um dos aspectos preferidos desta modalidade, filtração de fluxo tangencial é realizada usando membrana MWCO de 30 kDa selecionada no grupo que compreende uma ou mais membranas PES da série Centramate T (Pall Corporation), Hydrosart (Sartorius) e Pelicon 3 (Merck).
[0064] Na sexta modalidade da presente invenção, a referida proteína terapêutica purificada é formulada com excipientes farmacêuticos, em que a osmolalidade da formulação fica na faixa de 300 mOsm/Kg a 500 mOsm/Kg e a viscosidade da formulação é inferior a 2,5 mPa-S.
[0065] Em um primeiro aspecto da sexta modalidade, a formulação de proteína terapêutica compreende pelo menos uma proteína de ligação a antígeno, pelo menos um estabilizante, pelo menos um agente
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25/60 de tamponamento, pelo menos um agente de tonicidade, e pelo menos um tensoativo. Opcionalmente, a formulação inclui um conservante. [0066] Em um segundo aspecto da sexta modalidade, o estabilizante é um carboidrato. O estabilizante é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre sacarose, sorbitol, trealose, manitol, dextrano, inositol, glicose, frutose, lactose, xilose, manose, maltose, rafinose e combinação dos mesmos; mais preferivelmente o estabilizante é sacarose. Em ainda outro aspecto desta modalidade, o estabilizante inclui sacarose em uma concentração de cerca de 0,1% a cerca de 2,5% p/v, de preferência <1% de sacarose p/v.
[0067] Em um terceiro aspecto da sexta modalidade, o agente tamponante é selecionado no grupo consistindo de um ou mais entre histidina, arginina, glicina, citrato de sódio, fosfato de sódio, ácido cítrico, HEPES, acetato de potássio, citrato de potássio, fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, Tris base ou Tris-HCI, e suas combinações. Preferivelmente, o agente tamponante proporciona um pH de cerca de 5,5 a 7,5, cerca de 6,0 a 7,0, cerca de 6,3 a cerca de 6,8 ou cerca de 6,5.
[0068] Em um quarto aspecto da sexta modalidade, o agente tamponante é histidina. Em um aspecto preferido desta modalidade, o agente tamponante compreende histidina em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM, cerca de 10 mM a cerca de 50 mM, cerca de 20 mM a cerca de 40 mM. No aspecto mais preferido desta modalidade, o agente tampão inclui histidina a uma concentração de cerca de 25 mM.
[0069] Em um quinto aspecto da sexta modalidade, o agente tamponante é arginina. Em um aspecto preferido desta modalidade, o agente tamponante compreende arginina em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM, cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. No aspecto mais preferido
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26/60 desta modalidade, o agente tampão inclui arginina em uma concentração de cerca de 70 a 80 mM.
[0070] Em um sexto aspecto da sexta modalidade, o agente de tonicidade é selecionado no grupo consistindo de um ou mais entre cloreto de sódio, dextrose, glicerina, manitol e cloreto de potássio. Em um aspecto preferido desta modalidade, o agente de tonicidade consiste em cloreto de Sódio e está presente em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 500 mM; preferivelmente em uma concentração de cerca de 50 mM a cerca de 250 mM; mais preferivelmente em uma concentração de cerca de 100 - 145 mM. No sétimo aspecto da sexta modalidade, o tensoativo está presente em uma concentração de cerca de 0,001 a cerca de 0,2% (p/v); e é selecionado no grupo que consiste em um ou mais polissorbatos (por exemplo polissorbato20 ou polissorbato-80); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton; dodecil sulfato de sódio (SDS); laurilsulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearil-sulfobetaína; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearil-sarcosina; linoleila-, miristila- ou cetil-betaína; lauroamidopropila-, cocamidopropila-, linoleamidopropila-, miristamidopropila-, palmidopropila- ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropila-, palmidopropilaou isoestearamidopropil-dimetilamina; metil-cocoil de sódio, ou metiloleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Pluronics, PF68, etc.). Em um aspecto preferido desta modalidade, o tensoativo consiste em Polissorbato 80 e está presente em uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 0,2% p/v; preferivelmente a uma concentração de cerca de 0,002% a cerca de 0,02%; cerca de 0,005% a cerca de 0,02%, no máximo da preferência a uma concentração de cerca de 0,02%.
[0071] No oitavo aspecto da sexta modalidade, a formulação con
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27/60 siste em uma proteína terapêutica a uma concentração de cerca de 1 mg/L a cerca de 150 mg/L, cerca de 1 mg/L a cerca de 50 mg/L, cerca de 20 mg/L a cerca de 40 mg/L. Preferivelmente, a formulação consiste em uma proteína terapêutica a uma concentração de cerca de 1 mg/L a cerca de 50 mg/L.
[0072] No nono aspecto da sexta modalidade, a formulação inclui, ainda, conservante, o conservante podendo ser selecionado no grupo composto de álcool benzílico, m-cresol e fenol.
[0073] Na sétima modalidade da presente invenção, a formulação de proteína terapêutica compreende pelo menos uma proteína terapêutica, sacarose, arginina, histidina, cloreto de sódio, polissorbato 80. Preferivelmente a formulação de proteína terapêutica compreende de cerca de 1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml de proteína terapêutica; cerca de 20 mM a cerca de 25mM de histidina; de cerca de 50 mM a cerca de 100 mM de arginina; de cerca de 0,002% a cerca de 0,02% de polissorbato 80 (p/v); de cerca de 50 mM a cerca de 150 mM de NaCI; e <2,5% de sacarose p/v. O pH da formulação está na faixa de 6,0 a cerca de 7,0 e a osmolalidade da formulação está na faixa de 300 mOsm/Kg a cerca de 450 mOsm/Kg.
[0074] Em um dos aspectos preferidos da sétima modalidade, uma formulação farmacêutica compreende de 2-80 mg/ml de anticorpo monoclonal de Dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5 osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
[0075] Em um dos aspectos preferidos da sétima modalidade, uma formulação farmacêutica compreende 25 mg/ml de anticorpo monoclonal de Dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosida
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28/60 de inferior a 2,5 mPa-S.
[0076] Em um dos aspectos preferidos da sétima modalidade, uma formulação farmacêutica compreende 50 mg/ml de anticorpo monoclonal de Dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
[0077] Em um dos aspectos preferidos da sétima modalidade, uma formulação farmacêutica compreende de 2-80 mg/ml de anticorpo monoclonal de Raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
[0078] Em um dos aspectos preferidos da sétima modalidade, uma formulação farmacêutica compreende 25 mg/ml de anticorpo monoclonal de Raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
[0079] Uma formulação farmacêutica compreende 50 mg/ml de anticorpo monoclonal de Raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; NaCI 101 mM; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
[0080] De acordo com outro aspecto da sétima modalidade, a referida formulação farmacêutica de anticorpo pode ser uma formulação liofilizada.
[0081] Na oitava modalidade da presente invenção, a afinidade e potência da proteína terapêutica é medida por um ou mais de: ELISA ou citometria de fluxo. Em um aspecto preferido da oitava modalidade,
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29/60 o método baseado em ELISA indireto é utilizado para quantificar a ligação da proteína terapêutica ao antígeno específico. Em um aspecto preferido desta modalidade, a formulação de mAb da Dengue é testada contra todos os serotipos dos vírus da dengue e a quantidade de mAb da Dengue é determinada. A potência da proteína terapêutica é reportada como % de atividade relativa ao padrão de referência. É muito bem entendido que qualquer outro método semelhante pode ser utilizado para demonstrar a potência e afinidade da proteína terapêutica.
[0082] Na nona modalidade da presente invenção, o teste de neutralização por redução de focos (PRNT / FRNT) ou um teste relacionado é realizado para avaliar a neutralização da atividade viral por proteína terapêutica. Em um aspecto preferido desta modalidade, a formulação de mAb da Dengue é testada contra todos os serotipos dos vírus da dengue e valores de EC50 são calculados para neutralização dos vírus da dengue. É muito bem entendido que qualquer outro método semelhante pode ser utilizado para demonstrar a atividade de neutralização da proteína terapêutica.
[0083] Na décima modalidade da presente invenção, cromatografia por exclusão de tamanho baseada em HPLC é utilizada para avaliar a presença de agregados na formulação de proteína terapêutica. Em um aspecto preferido desta modalidade, a coluna Phenomenex BioSec-S 3000 é utilizada para demonstrar a percentagem de agregado e monômero da formulação de Dengue mAb. É muito bem entendido que qualquer outro método semelhante pode ser utilizado para avaliar a presença de agregados na formulação de proteína terapêutica.
[0084] Na décima primeira modalidade da presente invenção, a formulação pode ser armazenada em um recipiente adequado. O recipiente pode ser selecionado entre: uma garrafa, um frasco, um frasco de vidro, um saco IV, uma forma/recipiente com sopro-enchimento
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30/60 selagem, um injetor reutilizável, um injetor de bolus, uma seringa, uma caneta, uma bomba, uma seringa com agulha multidose, uma caneta multidose, um injetor, umsyrette, um autoinjetor, uma seringa pré-cheia ou uma combinação destes.
[0085] Pelo menos um componente de embalagem primário compreende um sistema de fechamento de recipiente (container closure) selecionado entre: polipropileno (PP), polietileno tereftalato (PETG), polietileno de alta densidade (HDPE), polietileno tereftalato (PET), polipentafluoroestireno (PFS), policarbonato, poli(cloreto de vinila) (PVC), poliolefina, policiclopentano (CZ.RTM), copolímero olefínico cíclico (COC), e combinações ou copolímeros dos mesmos.
[0086] As formulações de anticorpo antidengue ou anticorpo antirrábica aqui divulgadas podem ser usadas (isoladamente ou em combinação com outros agentes ou modalidades terapêuticas) para tratar, prevenir e ou diagnosticar vírus da dengue ou da raiva. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir uma molécula de anticorpo antidengue coformulada com, e/oucoadministrada com, um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, agentes antivirais (incluindo outros anticorpos antidengue), vacinas (incluindo vacinas contra vírus da dengue), ou agentes que melhoram uma resposta imune. Em outras modalidades, as moléculas de anticorpo são administradas em combinação com outras modalidades de tratamento terapêutico, como hidratação intravenosa, agentes redutores de febre (como acetaminofeno) ou transfusão de sangue. Tais terapias de combinação podem vantajosamente utilizar dosagens mais baixas dos agentes terapêuticos administrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas com as diversas monoterapias.
Exemplos:
[0087] Exemplo 1: Processo upstream para cultura de células e expressão de proteína terapêutica, isto é, anticorpo monoclonal da
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Dengue (VIS513)
Protocolo:
• Cultivo de células em uma escala de 10 L foi realizado em um modo de alimentação em batelada usando os parâmetros mencionados abaixo durante o processo upstream / fermentação.
• O anticorpo monoclonal da Dengue foi expresso em linhagem de células CHO-K1 SV GS-KO obtida da Visterra Inc. USA.
• O meio de cultura de células utilizado para crescimento celular e expressão de proteína terapêutica, isto é, anticorpo monoclonal de dengue foi ΊΧ Cellvento™ CHO-220 Liquid Medium”.
• Solução de alimentação A, solução de alimentação B, solução de alimentação C, solução de alimentação D selecionadas no grupo que compreende glicose, suplemento Cell Boost ™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a e 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (3 X medium), “EX-CELL® Advanced™ CHO Feed 1” foram usadas como alimentação suplementar.
• pH do meio de fermentação foi mantido em 6,7 a 7,5.
• A osmolalidade do meio de fermentação foi mantida a <490 mOsm / Kg.
• O oxigênio dissolvido do meio de fermentação foi mantido em cerca de 20% a cerca de 40%.
• A temperatura do meio de fermentação foi mantida em 36,5 ± 0,5°C.
• A cultura foi colhida após queda na contagem de células para 60%.
[0088] Suplementação da alimentação foi feita por gotejamento gradual, conforme Tabela 1:
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Tabela 1
Protocolo de estratégia de alimentação Dia Alimentação A Alimentação B Alimentação C Alimentação D Meio basal 1 (3X Actipro (Hyclone)) Meio basal 2 (Cellvento™ CHO-220 (3X))
0
1
2 4%
3 10%
4 0,2% 4% 0,4%
5 6% 4% 0,4%
6 0,2% 4% 4% 0,4%
7 6% 8%
8 0,2% 4% 0,4%
9 4% 4% 4,0%
10 0,1% 2% 4% 0,4%
11 0,2% 2% 2% 0,2%
12 4%
13 0,1% 2% 2% 0,2%
14 3%
15 3%
16
Resultados e conclusão:
[0089] A contagem viável de colônias e o rendimento obtido durante o processo de fermentação foram os seguintes:
Tabela 2: Contagem de colônias viáveis e rendimento obtido durante o processo de fermentação
Dia Batelada 1 Batelada 2
Contagem de colônia viável Título g/l Contagem de colônia viável Título g/l
0 0,8 0,81
1 1,5 1,7
2 2,8 3,45
3 4,3 5,9
4 6,5 7,4
5 8,4 11,8
6 10,1 0,54 15,5 0,63
7 12,7 0,77 18,5 0,91
8 14,5 1,18 19 1,29
9 17 1,62 18,5 1,76
10 17,25 2,15 18,8 2,42
11 17,25 2,64 18 2,85
12 16,8 3,05 18 3,39
13 15,3 3,6 17,2 4,0
14 15 3,99 17 4,32
15 14,7 4,43 14,9 4,68
16 14,5 4,56 13,5 4,86
[0090] O Requerente descobriu que usando o processo de cultura celular compreendendo meio basal, meio basal concentrado como solução de alimentação, uso de soluções de alimentação juntamente com uma estratégia de alimentação definida, podem ser obtidos um crescimento celular aumentado, concentrações mais baixas de lactato e amônia, mantendo efetivamente a contagem de células e aumentan
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33/60 do a longevidade das células e alto rendimento. Rendimento superior a 4 g L foi obtido no processo de fermentação. A colheita obtida foi submetida ainda à purificação / processamento downstream.
Exemplo 2:
[0091] A cultura celular obtida no exemplo 1 foi colhida e depois submetida a protocolo para purificação do anticorpo monoclonal da dengue (VIS513) conforme Figura 1.
O processo detalhado utilizado foi o seguinte:
Cromatografia de Afinidade com Proteína-A:
[0092] Nesta etapa, o anticorpo monoclonal alvo foi separado dos componentes do meio no sobrenadante coletado. O sobrenadante clarificado foi passado através da coluna de cromatografia e depois eluído usando tampões de eluição compatíveis.
Materiais utilizados:
Resina (Matriz): Mab Select Sure / Eshmuno A (Afinidade com Proteína-A)
Tempo de Residência: 4,0-8,0 minutos
Coluna utilizada: XK 26
Tampão de Equilíbrio: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 150 mM + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem I: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 150 mM + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem II: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 1 M + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem III: Tampão Fosfato 10 mM + NaCI 125 mM + polissorbato 80 0,025% (p/v), pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de eluição: tampão citrato 20 mM + 0,025% (p/v) de polissorbato 80, pH 3,0±0,2.
Tampão CIP: NaOH 0,1 M [0093] Parâmetros de processo utilizados:
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34/60
Tabela 3:
Etapa No. Etapa do processo Volume de coluna Vazão linear (cm/h)
1 Equilíbrio 5 <300
2 Carga (ml) Real (como atual) <300
3 Lavagem I 2 <300
4 Lavagem II 4 <300
5 Lavagem III 4 <300
6 Eluição 5 <300
7 Limpeza 3 <300
8 Armazenamento 2 <300
1. Inativação viral por pH baixo
i. Eluato de cromatografia de afinidade com proteína A foi submetido a pH baixo, isto é, 3,5 ±0,1 por 60 ± 10 minutos para inativar as partículas virais.
ii. Após manutenção do pH baixo, o eluato foi neutralizado utilizando tampão de neutralização, isto é, tampão Tris / Citrato 1 M com pH 7,0 ± 0,2.
iii. A condutividade do eluato neutralizado foi ajustada usando WFI com polissorbato 80 0,025% (p/v)
2. Cromatografia de troca catiônica [0094] Moléculas carregadas positivamente ligadas à coluna enquanto moléculas carregadas negativamente entram no fluxo. Moléculas de anticorpo ligadas à coluna são eluídas usando gradiente salino.
Materiais usados:
Resina usada: Fractogel SOs' / Fractogel SE Hicap (Merck)
Tempo de permanência: 4,00 a 7,00 minutos
Coluna utilizada: XK 26
Pré Equilíbrio: tampão citrato 200 mM pH 6,0 ± 0,2.
Equilíbrio: tampão citrato 10 mM + polissorbato 80 0,025% (p / v), pH 6,0 ±0,2.
Carga: mantida em baixo pH; neutralizada (low pH hold neutralized). Tampão de lavagem A: tampão citrato 10 mM, pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem B: tampão citrato 20 mM + NaCI 300 mM, pH 6,0
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35/60 ±0,2.
Tampão CIP: NaOH 0,5 M
Tampão de Armazenamento: NaOH 0,1 M
Parâmetros de Processo:
Tabela 4:
Etapa No. Etapa do Processo CV Vazão linear (cm/h)
1 Pré-equilíbrio 2 <300
2 Equilíbrio 5 <300
3 Carga Real (como atual) <300
4 Lavaqem 5 <300
5 Eluição 0-60%B (Gradiente) 15 <300
6 100% B 2 <300
7 CIP 3 <300
[0095] Coleta de fração durante o gradiente
Tabela 5:
Etapa Nome da fração Critérios de coleta (UV 280) mAU
1 Fração 01 Até 300
2 Fração 02 300 - 700
3 Fração 03 700 até a linha de base
4 Fração 04 (100%B) Linha de base até a linha de base
Cromatografia de Troca Aniônica:
[0096] Todas as impurezas carregadas negativamente estão ligadas com a membrana enquanto o anticorpo entra no fluxo. Materiais usados:
Membrana/Resina usada: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius) / Eshmuno Q
Volume de carga: 150mg / ml_-1000 mg / ml
Coluna utilizada: XK 26
Tampão de Limpeza: NaOH 0,5 M
Tampão de pré-equilíbrio: tampão citrato 200 mM, pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de Equilíbrio: tampão citrato 20 mM, pH 6,0 ± 0,2; e opcionalmente de PS-80 0,025% p/v pH 6,0±0,2
Tampão de Armazenamento: NaOH 0,1 M
Parâmetros do Processo:
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36/60
Tabela 6:
Etapa No. Etapa do Processo Volume de coluna (column volume - CV) Vazão linear (cm/h)
1 Limpeza 10 <300
2 Pré-equilíbrio 10 <300
3 Equilíbrio 20 <300
4 Carga Real (como atual) <300
5 Lavaqem pós carqa 20 <300
6 Limpeza 10 <300
3. Nano-filtração:
[0097] Nanofiltro de 20 nm, isto é, Viresolve PRO (Merck) foi usado para remover quaisquer partículas de vírus da proteína terapêutica.
4. Filtração de fluxo tangencial/filtração de ultrafluxo [0098] O anticorpo foi concentrado até a concentração desejada e submetido a troca de tampão em um dos três tampões da formulação. Material usado:
Tampão de Formulação:
Tampão 1: tampão de histidina 25 mM + tampão de arginina 75 mM + NaCl 75 mM, pH 6,50 ±0,25;
Tampão 2: histidina 25 mM, arginina 75 mM, NaCl 101 mM;
Bufffer 3: Histidina 25mM, arginina 75mM, NaCI75mM - 101mM, polissorbato-80 0,002% p/v
Tampão de Limpeza: NaOH 0,5 M
Tampão de Armazenamento: NaOH 0,1 M
Membrana utilizada: PALL Série Centramate T, membrana PES MWCO: 30 kDa
Parâmetros do Processo:
Tabela 7
Etapa No. Etapa do processo Descrição Observação
1 Limpeza NaOH 0,5 M 30 min de recirculação
2 Limpeza WFI WFI até a condutividade ficar abaixo de 1,3 pS/cm -
3 Equilíbrio 400 ml
4 Concentração e diafiltração -10-12 DV pass
5 WFI Lavagem com WFI 1000 ml
6 Limpeza NaOH 0,5 M 30 min de recirculação
Filtração estéril
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37/60 [0099] Estabilizante foi adicionado à solução de anticorpo e filtrado de maneira estéril através de filtro de 0,2 μ.
Resultados:
[00100] Recuperação em etapas dos vários estágios usados no processo de purificação.
Tabela 8:
Etapa No Estágio Recuperação (%) Pureza (%)
1 Cromatografia por afinidade com Proteína A 98 99,3
2 Inativação viral por baixo pH 98 -
3 Cromatografia de troca catiônica 90 99,52
4 Cromatografia de troca aniônica 95 99,46
5 Nanofiltração 100 -
6 TFF/UFF 98 -
7 Formulação e filtração estéril 100 -
[00101] Verificou-se que o processo global de recuperação foi de ~ 80% e a pureza total foi de > 99%.
Tabela 9: Dados de impureza
Ensaio Critério aceito Batelada 1 Batelada 2
Pureza por HP-SEC (% monômero) Monômero deve ser >90,0% Tempo de retenção do monômero deve ser comparável ao padrão de referência 99,74 99,11
DNA CHO residual (pg/mg de mAb) <2 pg/mg IgG 0,005 0,004
Proteína A residual (ng/mg de mAb) <10,00 ng/mg IgG 1,05 0,82
Proteína CHO residual (ng/mg de mAb) <100,00 ng/mg IgG 1,74 3,80
Endotoxina (EU/mg de proteína) <0,1 EU/mg de proteína < 0,05 < 0,05
Tabela 10: Recuperação em modo de batelada & Pureza
Etapa No Batelada No. Recuperação (%) Pureza (%)
1 Batelada 1 85 99,21
2 Batelada 2 87 99,26
Exemplo 3:
[00102] O anticorpo monoclonal da Dengue purificado (VIS513) foi formulado como se segue:
[00103] Excipientes isto é, arginina, histidina, NaCI, sacarose e polissorbato-80 foram adicionados e misturados cuidadosamente utilizando um agitador magnético a 50-60 rpm para formar uma mistura de
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38/60 excipientes. Esta mistura foi então adicionada à colheita da TFF de mAb da Dengue gradualmente com taxa de agitação de 50-60 RPM. O pH foi verificado (pH 6,5) e, se necessário, ajustado por tampão histidina-arginina. A formulação final foi filtrada através de um filtro de 0,2 μΜ enchendo o recipiente final.
[00104] A concentração de cada componente na formulação final foi a seguinte:
Tabela 11
Ingrediente Formulação 1 Formulação 2 Formulação 3
mAb da Dengue (VIS 513) 10 mg/ml 25 mg/ml 50 mg/ml
Histidina 25 mM 25 mM 25 mM
Arginina 75 mM 75 mM 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM 101 mM 101 mM
Sacarose 0,5 % p/v 0,5 % p/v 0,5 % p/v
Polissorbato-80 0,02 % p/v 0,02 % p/v 0,02 % p/v
PH 6,5 ±0,5 6,5 ±0,5 6,5 ±0,5
Osmolalidade 380 mOsm/kg 380 mOsm/kg 380 mOsm/kg
[00105] Estas formulações foram testadas quanto a pureza, estabilidade, eficácia e potência durante 9 meses.
Exemplo 4:
[00106] O efeito da presença de sacarose em formulação de anticorpo da Dengue VIS513 foi estudado para testar a potência através de ensaio ELISA em proteína EDIII de DV1. Os estudos de formulação foram realizados para temperaturas de 2 - 8°C, 25°C e 40°C.
Resultados:
1. Formulação de anticorpo VIS513 da Dengue sem sacarose
Tabela 12:
Ingrediente (QTD) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
2 a 8°C RT (25°C) 40°C
15 dias 30 dias 15 dias 30 dias
L-histidina 25 mM 78,8 73,2 79,8 53,8
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 75 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
2. Formulação de anticorpo VIS513 da Dengue com sacarose
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39/60
Tabela 13:
Ingrediente (QTD.) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
2 a 8°C RT (25°C) 40°C
15 dias 30 dias 15 dias 30 dias
L-histidina 25 mM 90,5 86,3 94,6 81,6
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,5% p/v
Composição da formulação padrão de referência
Ingrediente (QTD)
L-histidina 25 mM
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,5 % p/v
Conclusão: A adição de 0,5% p / v melhora a estabilidade em comparação com o ponto de amostragem correspondente sem sacarose.
Exemplo 5:
[00107] A formulação do anticorpo VIS513 foi armazenada a 40 ° C por 20 dias e a potência posterior do VIS513 foi avaliada pelo teste de ELISA. O efeito do aumento do teor d sacarose foi estudado na formulação de anticorpo VIS513 a 40 ° C, em que a concentração de sacarose de 0,1,0,2 e 0,5% foi avaliada.
Resultados:
Tabela 14:
Ingrediente (QTD) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
L-histidina 25 mM 53,8
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Tabela 15:
Ingrediente (QTD) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
L-histidina 25 mM 70,8
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,1 % p/v
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Tabela 16:
Ingrediente (QTD) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
L-histidina 25 mM 65,7
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,2 % p/v
Tabela 17:
Ingrediente (QTD) Potência (%) em comparação com padrão de referência armazenado a 2-8°C
L-histidina 25 mM 81,6
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,5 % p/v
Composição da formulação padrão de referência:
Ingrediente (QTD)
L-histidina 25 mM
L-arginina 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM
Polissorbato 80 0,02 % p/v
Sacarose 0,5 % p/v
Conclusão: A maior estabilidade foi observada na formulação contendo 0,5% de sacarose.
Exemplo 6:
[00108] Teste analítico para pureza, estabilidade, eficácia e potência da formulação de mAb da Dengue (VIS513) com armazenamento em • 2-8 °C por um período de 0 meses, 3 meses, 6 meses, meses, 12 meses e 18 meses;
• 25 ° C por um período de 0 dias e 30 dias;
• 40 ° C por um período de 0 dias, 7 dias, 14 dias, 28 dias, 35 dias e 42 dias.
6.1: A potência da formulação de anticorpo VIS513 foi testada por ELISA indireto.
[00109] O método baseado em ELISA indireto foi usado para quan
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41/60 tificar a ligação do mAb da Dengue (VIS513) à proteína EDIII do antigeno DV1. Proteína EDIII foi imobilizada na placa. O antígeno não ligado foi removido por lavagem. Na etapa seguinte, foram adicionadas amostras padrão e teste, que se ligaram ao antígeno. Para determinar a quantidade de Dv-mAb ligado, IgG Fc-HRP anti-humano de camundongo, específico de Dv-Mab (fragmento Fc de imunoglobulina humana), foi utilizado para reconhecer a presença de Dv-Mab. O ensaio foi desenvolvido com Sistema de Substrato de Peroxidase TMB Microwell, que quantifica a extensão de ligação pela quantidade de cor formada a 450 nm. O programa de análise de dados gerou uma curva de ligação para cada amostra usando um modelo de ajuste de curva com 4 parâmetros e comparou a curva de ligação da amostra de teste à curva padrão calculando a potência relativa. A potência de uma amostra de teste é relatada como % de atividade em relação a um padrão de referência (potência relativa x 100).
Resultados:
Tabela 18: Potência de mAb da dengue (VIS513) (%) por ELISA indireto para formulação armazenada a 2 - 8°C.
0 dia 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses
Batelada 1 74,90 79,30 89,30 84,9 88,5 93,90
Batelada 2 74,30 80,05 82,20 86,7 79,00 94,70
Batelada 3 91 98,30 125 99,70 88,80 118,40
Batelada 4 97,5 102,2 92,6 84 83,80 96,70
Tabela 19: Potência de mAb da Dengue (VIS513) (%) por ELISA indireto para formulação armazenada a 25 °C.
0 dia 30 dias
Batelada 1 74,90 79,30
Batelada 2 74,30 87,8
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Tabela 20: Potência de mAb da Dengue (VIS513) (%) por ELISA indireto para formulação armazenada a 40 °C.
0 dia 14 dias 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias
Batelada 1 70,3 82,80 96,20 71,90 89,70 90,80
[00110] A formulação de mAb da dengue (VIS513) não apresentou qualquer perda de afinidade de ligação dependente do tempo.
6.2: Ensaio PRNT para determinar EC50 [00111] O ensaio significa a pré-mistura de anticorpos diluídos em série com vírus para permitir a ligação de anticorpo, neutralização e, então transferência da mistura para uma monocamada de células Vero, sobreposição com um meio viscoso, incubação (~3-7 dias, dependendo do serotipo do vírus) para permitir replicação e espalhamento limitados do vírus, seguido pela detecção de placas. A neutralização foi capturada pela redução da formação de placa. Detecção robusta foi obtida com métodos de imunocoloração, usando anticorpo antidengue 4G2 de camundongo e anticorpo de cabra anticamundongo marcado com HRP com substrato de peroxidase.
[00112] As amostras de formulação de mAb da dengue (VIS513) foram testadas contra todos os quatro serotipos de vírus da dengue, ou seja, DV1, DV2, DV3 e DV4. Foi calculado o valor de EC50 para a neutralização dos vírus da Dengue. O valor EC50 representa a concentração eficaz para 50% de neutralização efetiva dos vírus da dengue, sendo o valor EC50 calculado a partir do número de placas presentes nos poços de controle do vírus e número de placas nos poços nos quais amostras de mAb-vírus incubadas foram adicionadas. Resultados:
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Tabela 21: Valor EC50 de mAb da Dengue (VIS513) (ng/ml) por en saio PRNT para formulação armazenada a 2 - 8°C.
Batelada # Serotipos do vírus da dengue 0 dia 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses
Batelada 1 DV1 47,15 49,74 23,88 24,12 42,58
DV2 5,9 8,03 3,58 3,31 13,03
DV3 14,38 14,7111 5,58 4,57 18,14
DV4 30,29 50,75 23,96 23,35 117597
Batelada 2 DV1 21,03 21,01 16,12 29,41 62,94
DV2 3,26 5,69 4,15 2,87 8,59
DV3 13,19 24,14 6,53 7,05 27,83
DV4 22,46 22,44 16,61 19,56 155207
Batelada 3 DV1 32,77 13,74 27,76 34,22 60,48
DV2 4,34 7,37 2,94 4,26 16,80
DV3 15,43 4,96 6,76 7,74 14,21
DV4 30,49 16,36 39,71 31,75 141205
Batelada 4 DV1 22,81 24,67 23,34 46,72 23,48
DV2 3,16 3,25 1,25 6,35 23,49
DV3 11,42 7,35 4,65 5,34 128,6
DV4 21,39 24,58 19,56 22,31 15814
Tabela 22: Valor EC50 de mAb da Dengue (VIS513) (ng/ml) por en saio PRNT para formulação armazenada a 25 °C.
Batelada # Serotipos do vírus da dengue 0 dia 30 dias
Batelada 1 DV1 47,15 29,82
DV2 5,9 5,6
DV3 14,38 9,63
DV4 30,29 35,28
Batelada 2 DV1 21,03 28,34
DV2 3,26 5,51
DV3 13,19 9,25
DV4 22,46 30,69
Tabela 23: Valor EC50 de mAb da Dengue (VIS513) (ng/ml) por en saio PRNT para formulação armazenada 40 °C.
Batelada # Serotipo DV2 do vírus da dengue Controle Teste
Batelada 1 0 dia 6,66 -
7 dias 6,37 26,89
14 dias 6,18 36,12
[00113] A formulação de mAb da dengue (VIS513) não apresentou qualquer perda de eficácia de neutralização de vírus dependente do tempo a 2-8°C & 25°C. Formulação de VIS513 até quando mantida a 40°C, não perde sua capacidade de neutralizar o vírus da dengue.
6.3: Análise de agregação e pureza [00114] Uma cromatografia de exclusão de tamanho baseada em
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HPLC (HPLC-SEC) foi usada para avaliar os agregados na formulação bruta e final de DV mAb. Neste método, uma coluna phenomenex BioSec-S 3000 foi usada para demonstrar os agregados e a porcentagem de monômero de mAb da Dengue (VIS513) pela injeção de50 pg de anticorpo total e funcionamento a uma vazão de 1 ml/minuto por 35 minutos. Solução salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered Saline - PBS), pH 6,5 foi usada como fase móvel.
[00115] Resultados: SEC-HPLC (faixa de aceitação é de não menos que (not less than -NLT) 90%)
Tabela 24: Análise SEC-HPLC de formulação armazenada a 2 - 8°C
0 dia 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses
Batelada 1 % Monômeros 99,21 98,60 99,14 98,55 98,25 98,14
% Agregados 0,78 1,39 0,85 1,44 1,74 1,85
Batelada 2 % Monômeros 99,26 98,81 98,89 98,53 98,36 98,18
% Agregados 0,73 1,18 0,86 1,45 1,63 1,81
Batelada 3 % Monômeros 99,25 99,35 98,99 98,81 98,78 98,22
% Agregados 0,74 0,64 1,00 1,18 1,18 1,77
Batelada 4 % Monômeros 99,25 99,12 98,69 98,93 98,42 93,48
% Agregados 0,74 0,82 1,30 1,06 1,42 1,95
Análise de Concentração de Proteínas
Tabela 24A: Concentração de Proteína (mg/mL) Análise através da medição UV da formulação armazenada a 2 - 8°C
0 dia 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses 18 meses
Batelada 1 25,94 25,24 25,13 24,71 25,37 22,71
Batelada 2 25,80 25,20 25,75 24,59 26,63 23,72
Batelada 3 24,72 24,39 24,75 25,67 24,02 24,79
Batelada 4 26,04 26,23 26,27 26,92 26,63 25,40
Análise de Partículas Subvisíveis de formulação armazenada a 2 - 8°C [00116] O material particulado nas injeções consiste em partículas móveis não dissolvidas, que não sejam bolhas de gás, presentes involuntariamente nas soluções. O material particulado em mAb da Dengue (VI513) formulado a granel foi analisado ao longo do tempo. Para parenterais com volume inferior a 100 mL, o teste é aprovado quando por recipiente, são observadas menos de 6000 partículas de tamanho igual ou superior a 10μ, ou menos de 600 partículas de tamanho igual ou superior a 25 μ.
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Tabela 24B:
Tamanho de partícula Ponto de Amostragem (N° de partículas/mL)
Inicial 3 meses 6 meses 12 meses
>10 μ 1 3 5 9
>25 μ 0 0 3 1
[00117] O formulado a granel apresenta estabilidade, uma vez que foi observado apenas um aumento marginal na matéria particulada. Tabela 25: Análise SEC-HPLC de formulação armazenada a 25°C
0 dia 30 dias
Batelada 1 99,21 97,63
Batelada 2 99,26 97,58
Tabela 26: Análise SEC-HPLC de formulação armazenada a 40 °C
0 dia 7 dias 14 dias 21 dias 29 dias 35 dias 42 dias
Batelada 1 99,21 99,30 99,50 97,74 97,30 98,70 95,30
[00118] Formulação de mAb da Dengue (VIS513) não apresentou qualquer agregação significativa dependente do tempo; e verificou-se que a pureza/ teor de monômero foi >98%.
Análise de Concentração de Proteínas
Tabela 26A: Concentração de Proteína (mg/mL) Análise através da medição UV da formulação armazenada a 40°C
0 dia 3 dias 7 dias 15 dias
Batelada 1 27,53 26,09 25,46 26,58
[00119] A variação na medição da concentração de proteínas foi encontrada dentro da variabilidade da análise de teste por medição UV.
[00120] Estudos de pH e focalização isoelétrica (separação de proteínas baseada em seu ponto isoelétrico) sobre a formulação de mAb da Dengue (VIS513) armazenada a 40 °C.
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Tabela 26B: Medição de pH de mAb da Dengue (VIS513) armazenada a 40 °C.
0 dia 3 dias 7 dias 15 dias
Batelada 1 6,4 6,38 6,38 6,33
Tabela 26C: Identificação por SDS PAGE (Redutora/Não Redutora) & Focalização Isoelétrica de mAb da Dengue (VIS513) armazenada a
40°C.
Teste 0 dia 3 dias 7 dias 15 dias
SDS PAGE (Redutora) Banda única difundida correspondente em posição e intensidade com padrão de referência NA NA Banda única difundida correspondente em posição e intensidade com padrão de referência
SDS PAGE (Nâo -Redutora) Banda única difundida correspondente em posição e intensidade com padrão de referência NA NA Banda única difundida correspondente em posição e intensidade com padrão de referência
Focalização Isoelétrica Std. PI = 7.8±0,3 Compatível com o padrão de referência interno (SR) NA NA Compatível com o padrão de referência interno (SR)
Exemplo 7:
Efeito das concentrações de tensoativo nas Formulações:
[00121] O efeito da concentração de tensoativo foi avaliado por análise de partículas subvisíveis. Formulações variando as concentrações de Polissorbato-80 foram preparadas e analisadas quanto a partículas subvisíveis.
Tabela 27
Formulação com polissorbato 80 cone. (%p/v)
0,0016 % 0,002% 0,005%
Tamanho de partícula
>2μ 916 211 20
> 5 μ 55 48 5
> 10 μ 6 16 2
>25 μ 1 1 0
Conclusão:
[00122] Na formulação contendo 0,005% p/v de polissorbato-80 foram observadas partículas mínimas subvisíveis. Dependendo da dose, se a formulação requer diluição a concentração do polissorbato 80 foi
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47/60 finalizada em 0,02% p/v com margem de 4 vezes.
Exemplo 8: Estudo de determinação da concentração mínima dos estabilizantes usados [00123] A força tampão mínima requerida (10-30mM) foi referida à literatura disponível. Para descobrir a arginina mínima (usada como um agente solubilizante e agente redutor de viscosidade), foi trocado o tampão da amostra de mAb para solução salina normal e foi adicionada, gradualmente, solução de estoque de arginina (300 mM). A agregação da solução foi monitorada por OD @ 350 nm. A solução salina com 75 mM de Arginina forneceu a OD mais baixa, resultando na finalização de arginina a 75 mM.
Exemplo 8
Estudos de viscosidade da formulação de anticorpo da dengue (VIS513) [00124] A viscosidade das amostras de mAb DV foi medida em um viscosímetro baseado em microchip, Modelo: microVISCTM (Fabricação: RheoSense, CA EUA) conforme procedimento mencionado no manual do instrumento.
Tabela 28
Amostra Temperatura de medição Viscosidade MPa.s
Dia 0 5°C 2,04
25°C 1,164
Dia 90 armazenado a 2 - 8°C 25°C 1,173
Dia 180 armazenado a 2 - 8°C 25°C 1,167
Dia 180 armazenado a 2 - 8°C 25°C 1,166
Dia 180 armazenado a 2 - 8°C 25°C 1,174
Dia 365 armazenado a 2 - 8°C 25°C 1,175
Dia 30 armazenado a 25°C 25°C 1,137
Dia 60 armazenado a 25°C 25°C 1,127
Dia 90 armazenado a 25°C 25°C 1,122
Conclusão:
[00125] Nenhum aumento na viscosidade dependente do tempo foi observado na formulação de mAb armazenada a 2-8°C por 90 dias, bem como em uma amostra mantida a 25°C por 1 mês; isto é princi
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48/60 palmente devido ao excipiente- Arginina 75m M. Foi verificado que a viscosidade de nossa formulação era de 1,1 a 1,2 mPa-S/cP, que é mais baixa do que a de outras formulações comercializadas que têm viscosidade entre 11-50 mPa-S/cP A viscosidade da amostra global não aumenta mesmo após armazenagem durante 1 ano a 2-8 °C ou durante 3 meses a 25 °C.
Exemplo 9: Estudos de Spiking Viral no processo de purificação do mAb da Dengue (VIS513) [00126] A validação do vírus foi realizada para o processo real de fabricação, para testar a eficácia da remoção do vírus por filtração de virus no processo de fabricação do anticorpo monoclonal.
[00127] Virus de Leucemia Murina (MuLV) e virus Minute de camundongos (MMV / MVM) foram utilizados como organismos modelo. Os inventores desta invenção compararam a capacidade do seu processo de purificação da invenção com o do método geral e bem estabelecido de purificação de anticorpos monoclonais.
[00128] O método geral e bem estabelecido de purificação de anticorpos monoclonais composto de Cromatografia de Afinidade com Proteína A (Resina GE); Tratamento com pH baixo; Cromatografia Sartobind Q (Membrana de Troca Aniônica, Sartorius, uso único); Cromatografia de Fenila Sartobind (Cromatografia de Membrana, Sartorius, uso único); Viresolve Pro filtration (Nanofiltração, Merck).
Tabela 29:
Tabela 29 Logw fator de redução viral (LRV)
MuLV MMV
A Método geral/padrão >12,64 ±0,60 7,02 ± 0,69
B Método da Invenção (SIIPL) >18,3 ±0,60 14,72 ±0,70
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Tabela 29A: Detalhes dos Métodos utilizados na linha A da tabela 29.
Método geral/padraõ do Processo de Purificação de Anticorpos Monoclonais da Dengue
Etapa Logio Fator de redução viral
MuLV MMv
Cromatografia de Afinidade Proteína A (Resina GE) 2,75±0,10 1,52 ±0,46
Cromatografia Q Sartobind (Membrana de troca de ânions, Sartorius, uso único) 1,15 ±0,43 2,19 ±0,44
Cromatografia fenil de Sartobind (Cromatografia de membrana, Sartorius, uso único) 2,09 ±0,17 Não testado
Filtração Viresolve Pro (Nanofiltração, Merck) >3,76 ±0,25 3,31 ±0,26
Fator cumulativo de redução de Logio >12,64 ±0,60 7,02 ± 0,69
Tabela 29B: Detalhes dos Métodos utilizados na linha B da tabela 29.
Método Inventivo SIIPL’s do Processo de Purificação de Anticorpos Monoclonais da Dengue
Etapa Logio Fator de redução viral
MuLV MMv
Cromatografia de Afinidade Proteína A (Merck) 2,27±0,17 2,35 ± 0,45
Tratamento a pH baixo 4,14 ±0,26 Não se aplica
Cromatografia de troca catiônica (Merck) 2,31 ±0,31 2,73± 0,44
Cromatografia de troca aniônica (Merck) 4,38 ± 0,36 2,96 ± 0,44
Filtração Viresolve Pro (Nanofiltração, Merck) >5,20 ±0,28 6,68 ± 0,90
Fator cumulativo de redução de Logio 18,3 ±0,60 14,72 ±0,70
NOTA: *MMV é um vírus não envelopado e altamente resistente ao pH ácido. Portanto, o estágio de tratamento de pH baixo não é avaliado.
No cálculo de partículas de retrovirus por dose de acordo com o método geral e o método SIIPL. De acordo com a ICH Q5A, menos de uma partícula por milhão de doses é esperada.
Tabela 29C: Comparação dos Métodos utilizados nas linhas A e B da tabela 29.
Descrição Método geral/padrão Método da Invenção (SIIPL)
Carga máxima de RVLPs/mL em massa não processada determinada por microscopia eletrônica (Visterra Data) 8,5x106 (A) 8,5x106 (A)$
Volume total de granéis não processados que entram na Processo de Purificação (L) 770,85 (B) 300 (B)
Rendimento do produto para lote (g) 720,32 (C) 625 (C)
Dose única máxima proposta 75mg/kg (Visterra), 25 mg/kg (SIIPL) paciente médio 80 KG 6(D) 2* (D)
Volume de granel não transformado necessário para fabricar uma dose única de produto (L) 6,42089 (D) HC/B} 0,960 (D) ^{C/B}
Volume de granel não processado necessário para fazer uma dose única de produto JmL) 6420,89 (E) 960,0 (E)
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Fator de redução do vírus determinado pelo estudo de spiking >12,64log10 18,3 Iog10
Antilog do fator de redução >4,37X1012 (F) 1,99X1018 (F)
Estimativa de partículas de vírus por dose ΑΧ E 8,5X10® Χ6420,89 4,37X1012 8,5X10® Χ961.5 1,99X1018
F =1,25X10-2 (G) =4,1X10-9 (G)
Portanto, espera-se 1 vírus como partícula para cada dose máxima (1/G) 8,0X101 doses 2,4X108
Conclusão 1 partícula viral estaria presente em 80 doses do produto. 1 partícula viral estaria presente em 240 milhões de doses do produto.
Resultados:
- O processo de purificação inventivo SIIPL é altamente eficiente na depuração viral, o LRV total (MuLV) alcançado foi 18,3 ou seja, pelo menos 18 log™,fator de redução, enquanto que com o método Geral /Padrão foi 12,64; o LRV total (MMV) alcançado foi pelo menos 14 log 10,fator de redução, enquanto com o método Geral /Padrão foi 7,02;
- Uma partícula viral estaria presente em 240 milhões de doses do produto utilizando o processo de purificação inventivo SIIPL (dose de 2,0 gramas);
- Uma partícula viral estaria presente em 80 doses do produto utilizando o processo de purificação do método geral/padrão. [00130] O anticorpo monoclonal de dengue purificado pelo processo de purificação inventivo SIIPL pode ser utilizado em ensaios clínicos em seres humanos sem qualquer risco viral.
[00131] O processo de purificação de SIIPL foi altamente eficiente na depuração viral, o LRV total alcançado está de acordo com as diretrizes da ICH. (processo padrão - LRV 12,64 enquanto processo inventivo (SIIPL) - LRV 23,74). O anticorpo da dengue purificado utilizando o nosso processo inventivo mostrou ser adequado para ensaios clínicos humanos sem qualquer risco viral.
Exemplo 10: Processo upstream para cultura de células e expressão de proteína terapêutica, ou seja anticorpo monoclonal da raiva (Rabies).
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Protocolo:
[00132] Cultivo de células em uma escala de 2 L foi realizado em um modo de alimentação em batelada usando os parâmetros mencionados abaixo durante o processo upstream / fermentação.
• O anticorpo monoclonal da Raiva foi expresso em linhagem de células GS-CHO”.
• O meio de cultura de células utilizado para crescimento celular e expressão de proteína terapêutica, isto é, anticorpo monoclonal de Raiva foi ΊΧ Cellvento™ CHO-220 Liquid Medium” ou “Actipro1X (Hyclone)”.
• Solução de alimentação A, solução de alimentação B, solução de alimentação C, solução de alimentação D selecionadas no grupo que compreende glicose, suplemento Cell Boost ™ 5 (Hyclone), EX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a e 7b (Hyclone), 3X Actipro (Hyclone), Cell Vento 220 (1 X medium), EX-CELL® Advanced ™ CHO Feed foram usadas como alimentação suplementar.
• O pH do meio de fermentação foi mantido em 6,5 a 7,5.
• A osmolalidade do meio de fermentação foi mantida a entre 270 e 450 mOsm/Kg.
• O oxigênio dissolvido do meio de fermentação foi mantido em cerca de 20% a cerca de 60%.
• A temperatura do meio de fermentação foi mantida em 36,5 ± 1°C.
[00133] Suplementação da alimentação foi feita por gotejamento gradual, conforme a tabela a seguir:
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Tabela 30:
Dia Alimentação A Alimentação B Alimentação C Alimentação D Meio Basal 1 (3 X Actipro (Hyclone)) Meio Basal 2 (Cellvento™ CHO-220 (1X))
0
1
2 4%
3 0,2%
4 4% 0,4% 10% 8%
5 6% 4% 0,4%
6 0,2% 4% 4% 0,4%
7 6%
8 0,2 % 4% 0,4%
9 4 % 4 % 4,0 %
10 0,1 % 2% 4% 0,4%
11 0,2 % 2% 2% 0,2%
12 4%
13 0,1 % 2% 2% 0,2%
14 3%
15 3%
16
Nota: Todas as soluções de alimentação podem variar em ± 1% e em ± 1 dia.
[00134] A cultura de células foi colhida após queda na OD até 60% Resultados e conclusão:
[00135] O rendimento de 3 - 5 g/L foi obtido do processo de fermentação. A colheita obtida foi ainda submetida a purificação / processamento downstream.
Exemplo 11:
[00136] A cultura celular obtida de acordo com o exemplo 9 foi colhida e depois submetida a protocolo para purificação do anticorpo monoclonal da raiva conforme Figura 1.
[00137] O processo detalhado utilizado foi o seguinte:
[00138] Cromatografia de Afinidade com Proteína-A:
[00139] Nesta etapa, o anticorpo monoclonal alvo foi separado dos componentes do meio no sobrenadante coletado. O sobrenadante clarificado foi passado através da coluna de cromatografia e depois eluído usando tampões de eluição compatíveis.
Materiais utilizados:
Resina (Matriz): Mab Select Sure / Eshmuno A (Afinidade com Proteína-A)
Tempo de Residência: 4,0-8,0 minutos
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Coluna utilizada: XK 26
Tampão de Equilíbrio: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 150 mM + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem I: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 150 mM + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem II: Tampão Fosfato 20 mM + NaCI 1 M + polissorbato 80 0,05% (p/v), pH 7,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem III: Tampão Fosfato 10 mM + NaCI 125 mM + polissorbato 80 0,025% (p/v), pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de eluição: tampão citrato 20 mM + 0,025% (p/v) de polissorbato 80, pH 3,0±0,2.
Tampão CIP: NaOH 0,1 M
Parâmetros de processo utilizados:
Tabela 31
Etapa No. Etapa do Processo Volume de coluna Vazão linear (cm/h)
1 Equilíbrio 5 <300
2 Carga (ml) Real (como atual) <300
3 Lavagem I 2 <300
4 Lavagem II 4 <300
5 Lavagem III 4 <300
6 Eluição 5 <300
7 Limpeza 3 <300
8 Armazenamento 2 <300
1. Inativação viral por pH baixo
i. Eluato de cromatografia de afinidade com proteína A foi submetido a pH baixo, isto é, 3,5 ± 0,1 por 60 ± 10 minutos para inativar as partículas virais.
ii. Após manutenção do pH baixo, o eluato foi neutralizado utilizando tampão de neutralização, isto é, tampão Tris / Citrato 1 M com pH 7,0 ± 0,2. Subsequentemente solução neutralizada foi filtrada usando 0,8/0,45 μ ou 0,8/0,2μ.
iii. A condutividade do eluato neutralizado foi ajustada usando WFI com polissorbato 80 0,025% (p/v)
2. Cromatografia de troca catiônica
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54/60 [00140] Moléculas carregadas positivamente ligadas à coluna enquanto moléculas carregadas negativamente entram no fluxo. Moléculas de anticorpo ligadas à coluna são eluídas usando gradiente salino. Materiais usados:
Resina usada: Fractogel SOs' / Fractogel SE Hicap (Merck)
Tempo de permanência: 4,00 a 7,00 minutos
Coluna utilizada: XK 26
Pré Equilíbrio: tampão citrato 200 mM pH 6,0 ± 0,2.
Equilíbrio: tampão citrato 10 mM + polissorbato 80 0,025% (p / v), pH 6,0 ±0,2.
Carga: Manutenção de pH baixo seguido de neutralização Tampão de lavagem A: tampão citrato 10 mM, pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de lavagem B: tampão citrato 20 mM + NaCI 300 mM, pH 6,0 ±0,2.
Tampão CIP: NaOH 0,5 M
Tampão de Armazenamento: 20% etanol + 150mM NaCI
Tabela 32: Parâmetros de Processo:
Etapa No Etapa do processo CV Vazão linear cm/h
1 Pré-equilíbrio 2 <300
2 Equilíbrio 5 <300
3 Carga Real (como atual) <300
4 Lavagem 5 <300
5 Eluição 0 - 60%B (gradiente) 15 <300
6 100%B 2 <300
7 CIP 3 <300
Tabela 33: Coleta de fração durante 0 gradiente
Etapa No Nome da fração Critérios de coleta (UV280) mAU
1 Fração 01 Até 300
2 Fração 02 300-700
3 Fração 03 700 até linha de base
4 Fração 04 (100%B) Linha de base até a linha de base
Cromatografia de Troca Aniõnica:
[00141] Todas as impurezas carregadas negativamente estão ligadas com a membrana enquanto 0 anticorpo entra no fluxo.
Materiais usados:
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55/QO
Membrana I Resina usada: Sartobind Q single Sep mini (Sartorius) I Eshmuno Q
Volume de carga: 150mg / ml-1000 mg / ml
Coluna utilizada: XK 26
Tampão de Limpeza: NaOH 0,5 Μ
Tampão de pré-equilíbrio: tampão citrato 200 mM, pH 6,0 ± 0,2.
Tampão de Equilíbrio: tampão citrato 20 mM, pH 6,0 ± 0,2; e opcionalmente PS-80 0,025% p/v pH 6,0±0,2
Tampão de Armazenamento: 20% etanol + 150mM NaCI ou NaOH 0,1 M
Tabela 34: Parâmetros do Processo:
Etapa No Etapa do processo CV Vazão linear cm/h
1 Limpeza 10 <300
2 Pré-Equilíbrio 10 <300
3 Equilíbrio 20 <300
4 Carga Real <300
5 Lavagem pós carga 20 <300
6 Limpeza 10 <300
Filtração:
[00142] Nanofiltro de 20 nm, isto é, Viresolve PRO (Merck) foi usado para remover quaisquer partículas de vírus da proteína terapêutica. 4. Filtração de fluxo tanqencial/ultrafiltração [00143] O anticorpo foi concentrado até a concentração desejada e submetido a troca de tampão em um dos três tampões da formulação. Material usado:
Tampão de Formulação:
Tampão 1: tampão de histidina 25 mM + tampão de arginina 75 mM + NaCI 75 mM, pH 6,50 ±0,25;
Tampão 2: histidina 25 mM, arginina 75 mM, NaCI 101 mM;
Bufffer 3: Histidina 25mM, arginina 75mM, NaCI 75mM - 101mM, polissorbato-80 0,002% p/v
Tampão de Limpeza: NaOH 0,5 M
Tampão de Armazenamento: 20% etanol + NaCI 150mM ou NaOH
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0,1 Μ
Membrana utilizada: PALL Série Centramate T, membrana PES
MWCO: 30 kDa
Tabela 35: Parâmetros de Processo:
Etapa No. Etapa do processo Descrição Observação
1 Limpeza NaOH 0,5 M 30 min de recirculação
2 Limpeza WFI WFI até a condutividade ficar abaixo de 1,3 pS/cm -
3 Equilíbrio 400 ml -
4 Concentração e diafiltração Passagem de ~10-12 DV -
5 WFI Lavagem com WFI 1000 ml -
6 Limpeza NaOH 0,5 M 30 In de re- circulação
Filtração estéril [00144] Estabilizante foi adicionado à solução de anticorpo e filtrado de maneira estéril através de filtro de 0,2 μ.
Resultados:
Tabela 36: Recuperação em etapas dos vários estágios usados no processo de purificação.
Etapa No Estágio Recuperação (%) *
1 Cromatografia por afinidade com Proteína A 94
2 Inativação viral por baixo pH 98
3 Cromatografia de troca catiônica 94
4 Cromatografia de troca aniônica 95
5 Nanofiltração 100
6 TFF/UFF 98
7 Formulação e filtração estéril 100
[00145] Verificou-se que o processo global de recuperação foi de >
80%
Tabela 37: Dados de impureza
Ensaio Critério aceito Batelada 1 Batelada 2
Concentração por UV280 (mg/ml) - 26,19 24,39
Pureza porSEC-HPLC (% monômero) Monômero deve ser >90,0% Tempo de retenção do monôMero deve ser comparável ao padrão de referência 100 100
SDS PAGE NR (kD) - 156,0 156,0
SDS PAGE R (kD) - 50,4/27,7 50,7/27,9
DNA CHO residual (pg/mg de mAb) <2 pg/mg IgG 0,34 0,17
Proteína A residual (ng/mg de mAb) <10,00 ng/mg IgG <10 0,82
Proteína CHO residual (ng/mg de mAb) <100,00 ng/mg IgG 5,50 7,94
Endotoxina bacteriana (EU/mg de proteína) <0,1 EU/mg de proteína < 0,35 < 0,5
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Tabela 38: Recuperação em modo de batelada & Pureza
Etapa No Batelada No Recuperação % Pureza (%)
1 Batelada 1 82 99,4
2 Batelada 2 80 99,6
[00146] Verificou-se que a pureza global do mAb da raiva após purificação foi de >99% e a recuperação global de >80%.
Exemplo 12:
[00147] O anticorpo monoclonal da raiva foi formulado como no fluxograma da Figura 2.
[00148] Excipientes isto é, arginina, histidina, NaCI, sacarose e polissorbato-80 foram adicionados e misturados cuidadosamente utilizando um agitador magnético a 50-60 rpm para formar uma mistura de excipientes. Esta mistura foi então adicionada à colheita da TFF de mAb da Dengue gradualmente com taxa de agitação de 50-60 rpm. O pH foi verificado (pH 6,5) e, se necessário, ajustado por tampão histidina-arginina. A formulação final foi filtrada através de um filtro de 0,2 μΜ enchendo o recipiente final.
[00149] A concentração de cada componente na formulação final foi a seguinte:
Tabela 39:
Ingrediente Formulação 1 Formulação 2 Formulação 3
Rabies mAb 10 mg/ml 25 mg/ml 50 mg/ml
Histidina 25 mM 25 mM 25 mM
Arginina 75 mM 75 mM 75 mM
Cloreto de sódio 101 mM 101 mM 101 mM
Sacarose 0,5 % p/v 0,5 % p/v 0,5 % p/v
Polissorbato-80 0,02 % p/v 0,02 % p/v 0,02 % p/v
PH 6,5 + 0,5 6,5 + 0,5 6,5 + 0,5
Osmolalidade 386 mOsm/kg 386 mOsm/kg 386 mOsm/kg
[00150] Estas formulações foram testadas quanto a pureza, estabilidade, eficácia e potência durante 9 meses.
Exemplo 13: Teste analítico para pureza e estabilidade de formulação de mAb da Raiva com armazenamento em 2-8, 25 e 40°C por um período de 0 meses, 1 mês, 3 meses & 6 meses.
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13.1 Análise de agregação e pureza [00151] Uma cromatografia de exclusão de tamanho baseada em HPLC (HPLC-SEC) foi usada para avaliar os agregados na formulação bruta e final de DV mAb. Neste método, uma coluna phenomenex BioSec-S 3000 foi usada para demonstrar os agregados e a porcentagem de monômero de mAb da Raiva pela injeção de ~ 50 pg de anticorpo total e funcionamento a uma vazão de 1 ml/minuto por 35 minutos. Solução salina tamponada com fosfato (Phosphate buffered Saline PBS), pH 6,5 foi usada como fase móvel.
Resultados:
Tabela 40: Resultados de SE- HPLC (%)
Temp. 0 dia 1 mês 3 meses 6 meses
2 - 8°C 100 99,70 99,40 99,60
25°C 100 99,60 - -
40°C 100 99,20 (7 dias) - -
[00152] Formulação de mAb da Raiva não apresentou qualquer agregação dependente do tempo; e verificou-se que a pureza/ teor de monômero foi >99%.
13.2 Análise por SDS Page da Batelada 1 - Amostra de teste a 28°C
Tabela 41:
0 dia 1 M 3 M 6M
SDS PAGE redutora (kD) Peso molecular de cadeias pesadas e leves deve ficar dentro de ±10% do peso molecular do padrão de referência. % total de cadeia leve e pesada deve ser >95%. Total % :100 Amostra de teste a 2 - 8°C Cadeia pesada 50,8 49,8 49,3 49,2
Cadeia Leve 25,6 25,7 25,6 26,4
Padrão de referência Cadeia pesada 50 50 50 50
Cadeia leve 25 25 25 25
SDS PAGE não redutora (kD) RS (reference standard)- padrão de referência Peso molecular da banda maior deve ficar dentro de ±10% do peso molecular do padrão de referência. (RS) Amostra de teste a 2-8°C 151,0 156,7 157,2 157,6
Padrão de referência 150 150 150 150
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Amostra de teste a 25°C
0 dia 30 dias
SDS PAGE redutora (kD) Peso molecular de cadeias pesadas e leves deve ficar dentro de ±10% do peso molecular do padrão de referência. % total de cadeia pesada e leve deve ser >95%. Total % : 100 Amostra de teste a 25°C Cadeia pesada 50,8 47,5
Cadeia leve 25,6 25,5
Padrão de referência Cadeia pesada 50 50
Cadeia leve 25 25
SDS PAGE não redutora (kD) RS = padrão de referência (reference standard) Peso molecular da banda maior deve ficar dentro de ±10% do peso molecular do padrão de referência (RS) Amostra de teste a 25°C 151,0 151,6
Padrão de referência 150 150
[00153] Conclusão: A formulação de mAb da raiva não apresentou quaisquer alterações significativas dependentes do tempo na agregação e mudança no peso molecular. Assim, a formulação é considerada estável a 2 - 8°C, 25°C e 40°C.
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Sequence_ST25. Txt
Seq ID 1: Sequência variável de cadeia pesada (VH) de aminoácidos de VIS513 (anticorpo monoclonal da dengue) QVQLVQSGAEVKKP GASVKVSCKAGFNIKDVYMSWVRQAPEQGLEWMGRIDPENGDTKYD 60
PKLQGRVTMTADTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGWEGFAYW GQGTLVTVSSASTKG
120
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSL
180
SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFL
240
FPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRV
300
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQ
360
VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNV
420
FSCSVMHEALHNHYTQKS LS PGK
445
Seq ID 2: Sequência variável de cadeia leve (VL) de aminoácidos de VIS513 (anticorpo monoclonal da dengue)
DIVMTQSPASLAVSLGERATISCRASENVDKYGNSFMHWYQQKPGQ PPKLLIYRASELQW
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GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQRSNEVPWTFGQGT KLEIKRTVAAPSVF
120
IFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV
TEQDSKDSTYSLS
180
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
218 seq ID 3: Sequência de aminoácidos de cadeia pesada de Sil RmAb (RABI) (17c7)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYAMHWVRQAPGKGL EWVAWSYDGRTKDY
ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRTEDTAVYFCARERFSGAYFD YWGQGTLVTVSSA
120
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQSSG
180
LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHT
CPPCPAPELLGGP
240
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH
NAKTKPREEQYNS
300
TYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQ
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420
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LS LS PGK
449
Seq ID 4: Sequência de aminoácidos de cadeia leve de Sil RMAb (RAB1) (17C7)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRL
LIYDASNRATGIPA
RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYSCQQRNNWPPTFGGGTKVE
IKRTVAAPSVSVFIF
120
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSST
180
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKS FNRGEC
219
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Claims (89)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de fabricação de proteína de ligação a antígeno farmacêutica com alto rendimento e agregação mínima, caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) cultura em larga escala de células de mamífero que expressam proteína de ligação a antígeno em um meio de produção de cultura de células, em que o processo efetivamente mantém a contagem de células e resulta em um rendimento de pelo menos 2 g/L;
    b) purificação da proteína de ligação a antígeno do sobrenadante coletado obtido na etapa (a), em que o processo resulta na recuperação de pelo menos 80% e pureza de pelo menos 99%;
    c) formulação estável, em que a osmolalidade fica na faixa de 300 - 400 mOsm/kg e a viscosidade é inferior a 2,5 mPa-S.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, consistindo na cultura em larga escala de células de mamíferos que expressam anticorpos em um meio de produção de cultura de células; caracterizado pelo fato de que o processo de cultura celular inclui o uso de meio basal, uso de meio basal concentrado como solução de alimentação, uso de soluções de alimentação juntamente com uma estratégia de alimentação definida, resulta em crescimento celular melhorado, mantendo concentrações mais baixas de lactato e amônia, mantendo efetivamente a contagem de células, aumentando assim a longevidade das células e obtendo alto rendimento.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células inclui pelo menos um meio selecionado no grupo consistindo de Cell Vento 220 (Merck), ACTIPRO (HyClone/GE), Gibco™ Dynamis™ Medium (Thermo Fisher).
  4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células é
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    2/22 suplementado com um ou mais outros nutrientes, pelo menos uma vez durante o processo.
  5. 5. Método de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado pelo fato de que o meio de produção de cultura de células é suplementado em um esquema compreendendo suplementação que é contínua, diária, em dias alternados, a cada dois dias e combinação das mesmas.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o meio de produção de cultura de células é suplementado com solução de alimentação compreendendo pelo menos um meio selecionado no grupo compreendendo Glicose, suplemento Cell Boost™ 5 (Hyclone), EEX-CELL 293 (Sigma Aldrich), suplementos Cell Boost 7a e 7b (Hyclone), 3X Actipro medium, Cell Vento 220 (3X medium), EX-CELL® Advanced™ CHO Feed 1, EfficientFeed™ A, EfficientFeed™ B, e EfficientFeed™ C, e combinações dos mesmos.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1; caracterizado pelo fato de que a contagem de células fica na faixa de 10 x 106 a 20 x 106 células/ml.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células tem osmolalidade na faixa de 250 - 500 mOsm/Kg; pH na faixa de 6,5 - 7,5; o oxigênio dissolvido é mantido na faixa de 10 a 60%; a temperatura da cultura de células fica na faixa de 30°C a 38°C; a primeira temperatura sendo, preferivelmente de 36-37°C e, opcionalmente, a segunda temperatura sendo, preferivelmente, de 30-35°C; a concentração de glicose é mantida abaixo de 7%; preferivelmente entre 4% e 5%; a colheita da cultura celular é feita quando a viabilidade é reduzida para 80%; sendo que as condições de cultura das células são mantidas de maneira que os metabolites secundários, como a concentração de lactato, não seja superior a 5 g/L; e a concentração de amônia não seja superior a 5 mMol/L.
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  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a osmolalidade do meio de fermentação é de 400 500 mOsm/kg.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o oxigênio dissolvido do meio de fermentação é mantido na faixa de 20 - 40%.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é selecionada no grupo composto de anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo humano, anticorpo biespecífico, anticorpo multivalente, anticorpo multiespecífico, fragmentos de proteína de ligação a antígeno, policlonais, monoclonais, diacorpos, nanocorpos, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, autoanticorpos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)'2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos antiidiotípicos (anti-ld), fragmentos de ligação a epítopo e fragmentos contendo CDR e suas combinações.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células é selecionada no grupo que consiste em células de ovário de hamster chinês (CHO), GS - CHO, CHOK1SV GS-KO, CHO DUX-B11, CHO-K1, BSC-1, células de mieloma NS0, CV-1 de Origem portando células SV40 (COS), COS-1, COS-7, P3X3Ag8.653, células SP2, células embriônicas de rim humano (HEK 293), células de rim de bebê de hamster (BHK 21), células de rim de macaco verde africano VERO-76, células HELA, células de pulmão humano (W138), células de retina, e linhagem de células de hepatoma humano (Hep G2). Células VERO, BHK, MDCK, WI38, NIH3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (uma linhagem de células de mieloma murino que não produz endogenamente quaisquer cadeias de imunoglobulina), células CRL7030, HsS78Bst,
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    4/22
    PER.C6, SP2/0-Ag14, uma linhagem de células de mieloma, uma linhagem de células de hibridoma, células pulmonares humanas (W138), células de retina, linhagem de células de hepatoma humano (Hep G2), CHO— K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; e Kolkekar et al., 1997, Biochem., 36:10901-10909), SH87 cellCHO-DXB11 (G. Urlaub e L. A. Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sei., 77: 4216-4220. L. H. Graf, e L A. Chasin 1982, Molec. Cell. Biol., 2: 93- 96), linhagem de células CHO— K1 Tet-On (Clontech), CHO designada ECACC 85050302 (CA R, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO clone 13 (GEIMG, Genova, IT), CHO clone B (GEIMG, Genova, IT), CHO— K1/SF designada ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), RR— CHOK1 designada ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHOKIsv (Edmonds et al., Mol. Biotech. 34:179-190 (2006)), CHO— S (Pichler et al., Biotechnol. Bioeng. 108:386-94 (2011)), células CHO negativas para di-hidrofolato redutase (CHO/-DHFR, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216), e células dp12.CHO (Patente U.S. No. 5 721 121); células CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (células COS, COS-7, ATCC CRL-1651); células embrionárias de rim humano (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células renais de bebê de hamster (BHK, ATCC CCL-10); célula CAP, célula AGE1.HN, células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL-34); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células tumorais mamárias de camundongo (MMT 060562, ATCC
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    5/22
    CCL-51); células de fígado de rato Buffalo (buffalo rat liver cells) (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TR1 (Mather, 1982, Ann. NY Acad. Sci., 383: 44-68); células MCR 5; e células FS4, e células de hibridoma.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células é CHO-K1 SV GS-KO.
  14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a linhagem de células é GS - CHO.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas em batelada, com alimentação em batelada, em modo contínuo, em modo de perfusão; mais particularmente em modo de alimentação em batelada.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração de sal dos tampões usados na purificação fica na faixa de 30 mM - 500 mM.
  17. 17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a concentração de sal dos tampões usados na purificação fica na faixa de 50 mM - 300 mM.
  18. 18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas de purificação consistem de cromatografia por afinidade com proteína A, cromatografia de troca catiônica e cromatografia de troca aniônica.
  19. 19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas de purificação consistem de cromatografia por afinidade, inativação viral por baixo pH, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica, nanofiltração, filtração de fluxo tangencial/ultrafiltração; de maneira sequencial.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas de purificação consistem de cromatografia por afinidade, inativação viral por baixo pH, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, nanofiltração, filtração de
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    6/22 fluxo tangencial/ultrafiltração; de maneira sequencial.
  21. 21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz da cromatografia por afinidade é selecionada entre Proteína A, Proteína G e Proteína L, preferivelmente Proteína A.
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de incluir uma etapa de cromatografia adicional selecionada no grupo que compreende uma ou mais entre cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por indução de carga hidrofóbica, cromatografia por cerâmica hidroxiapatita, cromatografia multimodal (Capto MMC e Capto Adhere), cromatografia de membrana (membranas Q incluindo Intercept™ (Millipore), Mustang® (Pall Corporation) e Sartobind™ (Sartorius)).
  23. 23. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a cromatografia por proteína A consiste em uma ou mais resinas selecionadas no grupo consistindo de Eshmuno A, KanCapA™, MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe LX, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose Fast Flow, Poros® MabCapture A, Amsphere™ Protein A JWT203, ProSep HC, ProSep Ultra, e ProSep Ultra Plus; preferivelmente a resina de cromatografia por afinidade com proteína A é MabSelect SuRe™. Eshmuno A, Kancap A ou Poros MabCapture.
  24. 24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a cromatografia por proteína A consiste em
    a) Tampão de equilíbrio: tampão fosfato 20 mM; NaCI 100 - 150 mM; 0,05% de polissorbato 80; pH 7,0 ± 0,2.
    b) Carga: colheita clarificada
    c) Tampão de lavagem I: tampão fosfato 20 mM; NaCI 100 - 150 mM, mais particularmente 150 mM; 0,05% de polissorbato 80; pH 7,0 ±0,2.
    d) Tampão de lavagem II: tampão fosfato 20 mM; NaCI 250 mM - 1M, mais particularmente 1M; 0,05% de polissorbato 80; pH
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    7/22
    7,0 ±0,2.
    e) Tampão de lavagem III: tampão fosfato 10 mM; NaCI 100 - 150 mM, mais particularmente 125 mM; 0,05% de polissorbato 80; pH 7,0 ±0,2.
    f) Tampão de eluição: tampão citrato 20 mM; pH 3,0 ± 0,2; e opcionalmente 0,025% (p/v) de polissorbato 80;
    g) Tampão CIP: NaOH 0,1 M.
    h) Tempo de residência: 4,00 - 8,00 minutos
    i) Coluna usada: XK26
    j) Vazão linear é 10 - 500 cm/h, mais particularmente 100-150 cm/h.
  25. 25. Método de acordo com a reivindicação 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a inativação viral do eluato com cromatografia de proteína A é realizada mantendo o eluato em pH 3,3 - 3,5 por um período de 50 - 100 minutos.
  26. 26. Método de acordo com a reivindicação 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca catiônica consiste em resina selecionada no grupo que compreende um ou mais entre grupo baseado em sulfonato (por exemplo, MonoS, Minis, Source 15S e 30S, SP SEPHAROSE® Fast Flow, SP SEPHAROSE® High Performance da GE Healthcare, TOYOPEARL® SP-650S e SP-650M da Tosoh, MACRO-PREP® High S da BioRad, Ceramic HyperD S, TRISACRYL® M e LS SP e Spherodex LS SP da Pall Technologies); um grupo baseado em sulfoetila (por exemplo, FRACTOGEL® SE, da EMD, POROS® S-10 e S-20 da Applied Biosystems); um grupo baseado em sulfopropila (por exemplo, TSK Gel SP 5PW e SP-5PW- HR da Tosoh, POROS® HS-20, HS 50, e POROS® XS da Life Technologies); urn grupo baseado em sulfoisobutila (por exemplo, FRACTOGEL® EMD SO3· da EMD); um grupo baseado em sulfoxietila (por exemplo, SE52, SE53 e Express-Ion S da Whatman), um grupo baseado em carboxi
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    8/22 metila (por exemplo, CM SEPHAROSE® Fast Flow da GE Healthcare, Hydrocell CM da Biochrom Labs Inc., MACRO-PREP® CM da BioRad, Ceramic HyperD CM, TRISACRYL® M CM, TRISACRYL® LS CM, da Pall Technologies, Matrex CELLUFINE® C500 e C200 da Millipore, CM52, CM32, CM23 e Express-Ion C da Whatman, TOYOPEARL® CM-650S, CM-650M e CM-650C da Tosoh); grupos baseados em ácido sulfônico e carboxílico (por exemplo, BAKERBOIMD® CarboxySulfon da J.T. Baker); um grupo baseado em ácido carboxílico (por exemplo, WP CBX da J.T Baker, DOWEX® MAC-3 da Dow Liquid Separations, resinas trocadoras de cátions fracos AMBERLITE®, resina trocadora de cátions fracos DOWEX®, e resinas trocadoras de cátions fracos DIAION® da Sigma- Aldrich e FRACTOGEL® EMD COO- da EMD); um grupo baseado em ácido sulfônico (por exemplo, Hydrocell SP da Biochrom Labs Inc., resina catiônica de ácido forte de malha fina DOWEX® da Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic da J.T. Baker, membrana SARTOBIND® S da Sartorius, resinas trocadoras de cátions fortes AMBERLITE®, resinas trocadoras de cátions fortes DOWEX® e resina trocadora de cátions fortes DIAION® da Sigma-Aldrich); e um grupo baseado em ortofosfato (por exemplo, PI 1 da Whatman). Resinas de cromatografia de troca catiônica preferidas para esta invenção são Fractogel® EMD SOs', Fractogel® EMD SE Hicap (Merck), CMM HyperCel™ (Pall Corporation), Capto S ImpAct(GE).
  27. 27. Método de acordo com a reivindicação 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca catiônica compreende
    a) Tampão de pré-equilíbrio: tampão citrato 200 mM; pH 6,0 ±0,2
    b) Tampão de Equilíbrio: tampão citrato 10 mM; 0,025% (p / v) de polissorbato 80; pH 6,0 ± 0,2
    c) Tampão de Lavagem A: tampão citrato 10 mM; pH 6,0
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    9/22 ± 0,2
    d) tampão de lavagem B: tampão citrato 20 mM; NaCI 300 500 mM; pH 6,0 ± 0,2
    e) tampão CIP: NaOH 0,5 M
    f) Tempo de residência: 4,00 - 7,00 minutos
    g) Coluna utilizada: XK26
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica consiste em resina selecionada no grupo que compreende um ou mais entre DEAE-celulose, POROS® PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 da Applied Biosystems, SARTOBIND® Q da Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q e 30Q, Q, DEAE e ANX SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE, Q SEPHAROSE® High Performance, QAE SEPHADEX® e FAST Q SEPHAROSE® (GE Healthcare),WP PEI, WP DEAM, WP QUAT da J.T. Baker, Hydrocell DEAE e Hydrocell QA da Biochrom Labs Inc., U Osphere Q, MACRO-PREP® DEAE e MACROPREP® High Q da Biorad, Ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, TRISACRYL® M e LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA SPHEROSIL® LS, QMA SPHEROSIL® M e MUSTANG® Q da Pall Technologies, resinas aniônicas tipo I e tipo II de base forte com malha fina DOWEX® e DOWEX® MONOSPHER E 77, resina aniônica de base fraca da Dow Liquid Separations, membrana INTERCEPT® Q, Matrex CELLUFINE® A200, A500, Q500, e Q800, da Millipore, FRACTOGEL® EMD TMAE, FRACTOGEL® EMD DEAE e FRACTOGEL® EMD DMAE da EMD, resinas trocadoras de ânions fracos e fortes AMBERLITE® tipo I e II, resinas trocadoras de ânions fracos e fortes DOWEX® tipo I e II, resinas trocadoras de ânions fracos e fortes DIAION® tipo I e II, DUOLITE® da Sigma-Aldrich, TSK gel Q e DEAE 5PW e 5PW-HR, TOYOPEARL® SuperQ-650S, 650M e 650C, QAE550C e 650S, DEAE-650M e 650C da Tosoh, QA52, DE23, DE32,
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    DE51 , DE52, DE53, Express-Ion D e Express-Ion Q da Whatman; mais preferivelmente a resina de cromatografia de troca aniônica é Sartobind Q (Sartorius).
  29. 29. Método de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica inclui
    a) Tampão de limpeza: 0.5M NaOH
    b) Tampão de pré-equilíbrio: tampão citrato 200 mM; pH 6,0 ±0,2
    c) tampão de equilíbrio: tampão citrato 20 mM; pH 6,0 ± 0,2; e opcionalmente 0,025% de polissorbato 80
    d) Tampão de armazenamento: NaOH 0,1 M
    e) A taxa de fluxo linear é 10 - 500 cm/h, mais particularmente 100-150 cm / h
    f) Coluna utilizada: XK26
  30. 30. Método de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a cromatografia de troca aniônica é realizada no “modo fluir e lavar” ou no “modo ligar e eluir.
  31. 31. Método de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a remoção de partículas virais é realizada por nanofiltração usando filtro retentor de vírus selecionado no grupo que inclui um ou mais entre Viresolve PRO (Merck), Planova 20N (Asahi Kasei), Bio EXL PALL PEGASUS PRIME, PEGASUS SV4 (Pall Life Sciences) e Virosart (Sartorius), filtro Virosart CPV da Sartorius, Virosolve da Millipore, Ultipor DV20 ou DV50 da Pall, Planova 20N e 50N ou BioEx da Asahi.
  32. 32. Método de acordo com as reivindicações 19 e 20, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é concentrada usando filtração de fluxo tangencial (Tangential Flow Filtration (TFF)).
  33. 33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracteriza
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    11/22 do pelo fato de que a TFF é realizada usando membrana de 30 kDa, selecionada no grupo que compreende uma ou mais entre membrana PES série Centramate T (Pall Corporation), Hydrosart (Sartorius), e Pelicon 3 (Merck), preferivelmente usando membrana PES série Centramate T (Pall Corporation).
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o processo de filtração por fluxo tangencial consiste em:
    a) Diafiltração usando tampão de diafiltração: tampão de histidina 25 mM; tampão de arginina 75 mM; NaCI 50-150 mM; pH 6,50 ±0,5.
    b) Tampão de limpeza: NaOH 0,5 M
    c) Tampão de armazenamento: NaOH 0,1 M
    d) Equilíbrio usando 5 -10 X volume de membrana
    e) Concentração e diafiltração usando 10-20 volumes de diafiltração
    f) lavagem WFI usando 3 - 5 volumes de membrana
    g) limpeza usando NaOH 0,5 - 1,0 M
    h) Armazenamento NaOH 0,1 M.
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado pelo fato de que a preparação de proteína terapêutica purificada contém não mais que 2% de agregados, preferivelmente menos de 1% de agregados.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno inclui pelo menos uma proteína de ligação a antígeno, pelo menos um estabilizante, pelo menos um tampão, pelo menos um agente de tonicidade e pelo menos um tensoativo.
  37. 37. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o estabilizante é um carboidrato selecionado no
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    12/22 grupo composto de um ou mais entre sacarose, sorbitol, trealose, manitol, dextrana, inositol, glicose, frutose, lactose, xilose, manose, maltose, ou rafinose; mais preferivelmente o estabilizante é sacarose.
  38. 38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno estável inclui <2,5% de sacarose, mais preferivelmente <1% de sacarose, e no máximo da preferência 0,5% de sacarose.
  39. 39. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre Histidina, Glicina, citrato de sódio, fosfato de sódio, arginina, ácido cítrico, HEPES, acetato de potássio, citrato de potássio, fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonate de sódio, Tris Base, e Tris-HCI.
  40. 40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento é histidina ou arginina ou combinação dos mesmos.
  41. 41. Método de acordo com a reivindicação 36 e 39, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento é histidina.
  42. 42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a concentração de histidina fica na faixa de 10 - 50 mM; preferivelmente 25 mM.
  43. 43. Método de acordo com a reivindicação 36 e 39, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento é arginina.
  44. 44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a concentração de arginina fica na faixa de 10 150 mM; preferivelmente 75 mM.
  45. 45. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o agente de tonicidade é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre cloreto de sódio, dextrose, glicerina, manitol, e cloreto de potássio.
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  46. 46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o agente de tonicidade é cloreto de sódio.
  47. 47. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a concentração de cloreto de sódio fica na faixa de 50 - 250 mM; preferivelmente 100- 145 mM.
  48. 48. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre polissorbatos (por exemplo polissorbato-20 ou polissorbato-80); poloxâmeros (por exemplo poloxâmero 188); Triton; dodecil sulfato de sódio (SDS); laurilsulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearil-sulfobetaína; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearil-sarcosina; linoleila-, miristila- ou cetilbetaína; lauroamidopropila-, cocamidopropila-, linoleamidopropila-, miristamidopropila-, palmidopropila- ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropila-, palmidopropila- ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metil-cocoil de sódio, ou metil-oleiltaurato dissódico; e a série MONAQUAT® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Pluronics, PF68, etc.); preferivelmente o tensoativo é polissorbato 80.
  49. 49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que a concentração de polissorbato 80 fica na faixa de 0,002 - 0,2% (p/v) ; preferivelmente 0,02%(p/v).
  50. 50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 36 a 48, caracterizado pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno estável inclui de cerca de 1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml de proteína de ligação a antígeno.
  51. 51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno estável inclui de cerca de 1 mg/ml a cerca de 50 mg/ml de proteína de
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    14/22 ligação a antígeno
  52. 52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno inclui não mais que 3% de agregação, quantidade mínima de partículas subvisíveis e potência melhorada.
  53. 53. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração do monômero da proteína de ligação a antígeno é superior a 99%; CHO DNA residual não é maior que 2 pg/mg de proteína de ligação a antígeno, mais particularmente não superior a 0,1 pg/mg de proteína de ligação a antígeno; proteína CHO residual não é superior a 100 ng/mg de proteína de ligação a antígeno, mais particularmente não superior a10 ng/mg de proteína de ligação a antígeno; proteína A residual não é superior a10 ng/mg de proteína de ligação a antígeno, mais particularmente não superior a 1,5 ng/mg de proteína de ligação a antígeno; Endotoxina não é superior a 0,1 EU/mg de proteína, depuração viral LRV para MuLV é de pelo menos fator de redução 15 Log™, e para MMV é de pelo menos fator de redução 12 Logw .
  54. 54. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de ser preparada como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
  55. 55. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em proteína de ligação a antígeno, um agente de tamponamento, um agente de tonicidade, um tensoativo e um agente estabilizante.
  56. 56. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o estabilizante é um carboidrato selecionado no grupo que compreende um ou mais entre sacarose, sorbitol, trealose, manitol, dextrana, inositol, glicose, frutose, lactose, xilose, manose, maltose, ou rafinose; mais preferivelmente o estabili
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    15/22 zante é sacarose.
  57. 57. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 56, caracterizada pelo fato de que a formulação de proteína de ligação a antígeno estável inclui <2,5% de sacarose p/v, mais preferivelmente <1% de sacarose p/v.
  58. 58. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre histidina, glicina, citrato de sódio, fosfato de sódio, arginina, ácido cítrico, HEPES, acetato de potássio, citrato de potássio, fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonate de sódio, Tris base e Tris-HCI.
  59. 59. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 58, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento é histidina ou arginina ou combinação das mesmas.
  60. 60. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento é histidina.
  61. 61. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pelo fato de que a concentração de histidina fica na faixa de 10-50 mM; preferivelmente 25 mM.
  62. 62. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento é arginina.
  63. 63. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 62, caracterizada pelo fato de que a concentração de arginina fica na faixa de 10-150 mM; preferivelmente 75 mM.
  64. 64. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o agente de tonicidade é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre cloreto de sódio, dextrose, glicerina, manitol, e cloreto de potássio.
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  65. 65. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 64, caracterizada pelo fato de que o agente de tonicidade é cloreto de sódio.
  66. 66. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a concentração de cloreto de sódio fica na faixa de 50 - 250 mM; preferivelmente 100 - 145 mM.
  67. 67. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado no grupo que compreende um ou mais entre polissorbatos (por exemplo polissorbato-20 ou polissorbato-80); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton; dodecil sulfato de sódio (SDS); laurilsulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearilsulfobetaína; laurila-, miristila-, linoleila- ou estearil-sarcosina; linoleila-, miristila- ou cetil-betaína; lauroamidopropila-, cocamidopropila-, linoleamidopropila-, miristamidopropila-, palmidopropila- ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristamidopropila-, palmidopropila- ou isoestearamidopropil-dimetilamina; metil-cocoil de sódio, ou metil-oleil-taurato dissódico; e a série MONAQUAT® (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilglicol, polipropilglicol e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Pluronics, PF68, etc.); preferivelmente o tensoativo é polissorbato 80.
  68. 68. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 67, caracterizada pelo fato de que a concentração de polissorbato 80 fica na faixa de 0,002 - 0.2% (p/v); preferivelmente 0,02% (p/v).
  69. 69. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em
    a) 1-100 mg/ml de pelo menos uma proteína de ligação a antígeno;
    b) 20 - 40 mM de histidina;
    c) 50 - 100 mM de arginina;
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    d) 0,002 - 0,02% de polissorbato 80 (p/v);
    e) 50- 150 mM NaCI;
    f) não mais que 2,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, em que a osmolalidade da formulação é de 300 - 450 mOsmol/kg e a viscosidade é inferior a 2,5 mPa-S e a referida formulação é estável em 2-8°C por pelo menos 9 meses, em 25°C por pelo menos 1 mês, em 40°C por pelo menos 40 dias, em 50°C por pelo menos 2 dias.
  70. 70. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 2 - 80 mg/ml de pelo menos uma proteína de ligação a antígeno; 25 mM de histidina;75 mM de arginina; 101 mM NaCI; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5.
  71. 71. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o ponto isoelétrico (pl) da referida proteína de ligação a antígeno é 7,0 - 8,5.
  72. 72. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a osmolalidade da formulação é de cerca de 380 mOsmol/kg.
  73. 73. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo humano, anticorpo biespecífico, anticorpo multivalente, anticorpo multiespecífico, fragmentos de proteína de ligação a antígeno, anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal, diméricos (diacorpos), nanocorpos, monovalentes, heteroconjugados, multiespecíficos, autoanticorpos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab)'2, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-ld), fragmentos de li
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    18/22 gação a epítopo e fragmentos contendo CDR ou suas combinações.
  74. 74. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo monoclonal.
  75. 75. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal se liga a um vírus da dengue.
  76. 76. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal se liga a um vírus da raiva.
  77. 77. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 2 - 80 mg/ml de anticorpo monoclonal da dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM NaCI; 0,02% Polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  78. 78. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 25 mg/ml de anticorpo monoclonal da dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM de NaCI; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  79. 79. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 50 mg/ml de anticorpo monoclonal da dengue; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM de NaCI; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  80. 80. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 2 - 80 mg/ml de anticorpo monoclonal da raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM de NaCI; 0,02% de polis
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    19/22 sorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  81. 81. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 25 mg/ml de anticorpo monoclonal da raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM de NaCI; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  82. 82. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que consiste em 50 mg/ml de anticorpo monoclonal da raiva; 25 mM de histidina; 75 mM de arginina; 101 mM de NaCI; 0,02% de polissorbato 80 (p/v); e 0,5% de sacarose p/v; em que o pH da formulação é de 6,5 ± 0,5, osmolalidade de 380 mOsm/Kg, viscosidade inferior a 2,5 mPa-S.
  83. 83. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação líquida.
  84. 84. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação liofilizada.
  85. 85. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação a antígeno é um anticorpo tendo afinidade de ligação a epítopos presentes no vírus da Dengue, vírus da raiva, RSV, MPV, vírus da gripe (influenza), vírus da zika, vírus Oeste do Nilo, vírus da febre amarela, vírus da chikungunya, HSV, CMV, MERS, vírus Epstein-Barr, vírus VaricellaZoaster, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus da poliomielite, vírus Rhino, adenovirus, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus Norwalk, Togavirus, vírus alfa, vírus da rubéola,
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    20/22 vírus HIV, vírus Marburg, vírus Ebola, vírus do papiloma humano, poliomavírus, metapneumovírus, coronavirus, VSV e VEE.
  86. 86. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato a proteína de ligação a antígeno é selecionada no grupo que compreende uma ou mais entre CTP19, CR57, CR4098, RVFab8, MabJA, MabJB-1, Mab 57, 17C7, 2B10, Ab513/VIS513, N297Q-B3B9, Mab2E8, 2D22, DMScHuMab, 3CH5L1, HMB DV5, HMB DV6, HMB DV8, DB32-6, D88, F38, A48, C88, F108, B48, A68, A100, C58, C78, C68, D98, D188, C128, C98, A11, B11, R17D6, R14B3, R16C9, R14D6, R18G9, R16F7, R17G9, R16E5, anticorpos derivados da modificação de 4E11A, adatacept, abciximabe, adalimumabe, aflibercepte, alefacepte, alentuzumabe, trastuzumabe, basiliximabe, bevacizumabe, belatacepte, bectumomabe, certolizumabe, cetuximabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, entanercepte, gentuzumabe, ibritumomabe, infliximabe, muromonabe-CD3, omalizumabe, palivizumabe, panitumumabe, pertuzumabe, ranibizumabe, rilonacepte, rituximabe, tositumomabe, trastuzumabe, zanolimabe, nivolumabe, pembrolizumabe, hA20, AME-I33, IMC-3G3, zalutumumabe, nimotuzumabe, matuzumabe, ch*)A> KSB-102, MR1-1 , SC100, SC101, SC103, muromonabe-CD3, OKT4A, ibritumomabe, gentuzumabe, motavizumabe, infliximabe, pegfilgrastim, CDP-571, etanercepte, ABX-CBL, ABX-IL8, ABX-MAI, pemtumomab, Therex, AS1405, natalizumabe, HuBC- I, IDEC-131, VLA-I; CAT-152; J695, CAT-192, CAT-213, BR3-Fc, LymphoStat-B, TRAIL-RImAb, bevacizumabe, omalizumabe, efalizumabe, MLN-02, HuMax-IL 15, HuMax-Inflam, HuMaxCancer, HuMax-Lymphoma, HuMax -TAC, clenoliximabe, lumiliximabe, BEC2, IMC-ICI 1, DCIOI, labetuzumabe, arcitumomabe, epratuzumabe, tacatuzumabe, cetuximabe, MyelomaCide, LkoCide, ProstaCide, ipilimumabe, MDX-060, MDX-070, MDX-018, MDX-1106, MDX-1103, MDX-1333, MDX-214, MDX-1100, MDX-CD4, MDX-1388, MDX-066,
    Petição 870190053787, de 12/06/2019, pág. 194/197
    21/22
    MDX-1307, HGS-TR2J, FG-3019, BMS-66513, SGN-30, SGN- 40, tocilizumabe, CS-1008, IDM-I, golimumabe, CNTO 1275, CNTO 95, CNTO 328, mepolizumabe, MORIOI, MORI 02, MOR201, visilizumabe, HuZAF, volocixmabe, ING-I, MLN2201, daclizumabe, HCD 122, CDP860, PR0542, C 14, oregovomabe, edrecolomabe, etaracizumabe, atezolizumabe, jplimumabe, mogamulizumabe, lintuzumabe, HulDIO, Lym-1, efalizumabe, ICM3, galiximabe, eculizumabe, obinutuzumabe, pexelizumabe, LDP-ΟΙ, huA33, WX-G250, sibrotuzumabe, ofatumumabe. Chimeric KW-2871, hu3S193, huLK26; bivatuzumabe, raxibacumabe, cl4.18, 3F8, BC8, huHMFGI, MORAb-003, MORAb-004, MORAb-009, denosumabe, PRO-140, 1D09C3, huMikbeta-1, NI-0401, Nl501, cantuzumabe, HuN901 , 8H9, chTNT-1/B, bavituximabe, huJ591, HeFi-l, Pentacea, abagovomabe, tositumomabe, ustequinumabe, 105AD7, GMAI 61, GMA321.
  87. 87. Formulação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a referida proteína de ligação a antígeno é um anticorpo antidengue ou anticorpo antirraiva que pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros agentes, outras modalidades profiláticas ou terapêuticas.
  88. 88. Recipiente contendo a formulação como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o recipiente é selecionado dentre uma garrafa, um frasco, um frasco de vidro, uma ampola, um saco IV, uma forma/recipiente com sopro-enchimento-selagem, um injetor vestível, um injetor de bolus, uma seringa, uma caneta, uma bomba, uma seringa com agulha multidose, uma caneta multidose, um injetor, um syrette, um autoinjetor, uma seringa pré-cheia ou uma combinação dos mesmos.
  89. 89. Recipiente contendo a formulação de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que pelo menos um componente de embalagem primário compreende um sistema de fechamento
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