CN109576212B - 高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用 - Google Patents

高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药中哺乳动物细胞培养技术领域，具体而言，涉及高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用。本发明在N‑1种子细胞培养和后续(可选的)扩大培养中，通过流加补料培养增加活细胞密度。便于放大至生产规模，操作简单，成本低廉；还可以在更短的周期获得相同或更高产量和质量的蛋白，并在相同的生产周期可以获得更高的蛋白产量，可提高＞20％的产量。

Description

高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药中哺乳动物细胞培养技术领域，具体而言，涉及高密度接种培养中种子细胞的培养方法及其应用。
背景技术
生物医药是生物技术产业与医药产业相结合，共同组成的新型产业。随着生物技术的不断突破和创新，及在医药领域的成熟应用，大批医药生物技术产品(包括基因工程药物，疫苗，生物诊断试剂等)大量涌出。
尤其进入21世纪后，生物医药的发展日新月异，到目前为止，已有上百种单克隆抗体药物上市和处于研发阶段，人们对生物制药的兴趣也越发浓厚。其较低的毒副作用、高特异性治疗功效、较长的半衰期和平台化的生产工艺技术等特点，使单抗在治疗生物制品领域处于领导地位，是最成功的一类生物制品。迄今，大部分的单抗都是由哺乳动物细胞表达，其研发和商业性生产均是在生物反应器中进行的，其常见工作体积规模从几升至数千升不等。
抗体药物研发工艺包括细胞株构建及单克隆筛选、细胞培养、纯化和制剂四个方面，生产工艺则为上游细胞培养、下游纯化、制剂灌装三个方面。其中又以上游工艺最为关键。
由于哺乳动物细胞的生长及表达特性，决定了其培养周期长，从而使得抗体药物研发周期长，投资高，商业化生产成本高；这也是目前单抗药物价格高昂的主要原因。
为了降低生物医药价格，惠及全人类，人们不断探索，从高表达细胞株的构建和筛选到培养工艺及方式的优化等等。得益于基因工程技术的发展，细胞株的表达量获得极大的提高，传统的细胞培养工艺也得到优化，从低密度接种培养到高密度接种培养，从批次培养模式、补料流加到连续流培养模式。如何在高密度接种培养时缩短培养周期、提高目标蛋白的产量，进而降低整体的培养成本，是提高整体培养效率的关键问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种在N-1种子扩增时通过流加补料培养基后获得高活细胞密度的培养方法。
本发明的目的之二是提供一种高活细胞密度接种的细胞培养方式。
本发明的目的之三是通过上述方法在哺乳动物细胞中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，包括：
在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种高密度接种细胞培养的方法，包括：
1)应用如上所述的方法培养得到种子细胞；
2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养。
根据本发明的一方面，本发明还涉及上述方法在哺乳动物细胞中的应用。
缩短上游培养工艺周期或者相同的生产周期提高产量，从而降低成本。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)便于放大至生产规模，操作简单，成本低廉。
(2)可以在更短的周期获得相同或更高产量和质量的蛋白。
(3)在相同的生产周期可以获得更高的蛋白产量，可提高＞20％的产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的N-1细胞扩增生长图谱；
图2为本发明实施例1提供的N Production阶段细胞生长对比图谱；
图3为本发明实施例1提供的N Production阶段细胞生产对比图谱；
图4为本发明实施例1提供的N Production阶段蛋白产量对比图谱；
图5为本发明实施例2提供的N-1细胞扩增生长图谱；
图6为本发明实施例2提供的N Production阶段细胞生长对比图谱；
图7为本发明实施例2提供的N Production阶段细胞生产对比图谱；
图8为本发明实施例2提供的N Production阶段蛋白产量对比图谱。
具体实施方式
本发明涉及一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，包括：
在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度。
在一些实施方式中，所述流加补料的补料形式为补加基础培养基、补料培养基或氨基酸营养源。
此处所用的术语“流加补料培养”为一种在培养过程起始后，持续或半持续地向培养物中供以额外成分的细胞培养方法，且整个培养过程中没有培养基流出。所提供的成分一般包括在培养过程中消耗的细胞营养添加剂。
“培养物”、“细胞培养物”，和“哺乳动物细胞培养物”：此处所用的这些术语是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下，悬浮于培养基(见下文“培养基”定义)内的哺乳动物细胞群。对本领域普通技术人员显而易见的是，此处所用的这些术语也指包含哺乳动物细胞群和细胞群悬浮于其中的培养基的组合。
“培养基”、“细胞培养基”：此处所用的这些术语是指含有滋养哺乳动物细胞生长的营养素的溶液。一般而言，这些溶液提供细胞基本生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素。溶液中也可含有促进最低速率以上生长和/或存活的成分，包括激素和生长因子。所述溶液优选配制为适于细胞存活和增殖的pH和盐浓度。培养基也可为“限定培养基”——不含蛋白质、水解产物或未知组合物成分的无血清培养基。限定培养基中不含有动物来源的成分，并且其所有成分均具有已知的化学结构。
在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度至少为0.25×106cells/ml；
在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度为0.25～0.50×106cells/ml；
在一些实施方式中，N-1种子扩增培养的细胞起始密度为0.3±0.05×106cells/ml。
在本申请中，所用的术语“细胞密度”是指在指定体积培养基中存在的细胞数目，通常以活细胞数计。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种高密度接种细胞培养的方法，包括：
1)应用如上所述的方法培养得到种子细胞；
2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养。
此处所用的术语“生物反应器”是指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。只要能用于培养哺乳动物细胞，生物反应器可为任意大小。一般而言，生物反应器为至少1升，也可为10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、120000升或更大，或其间任意容积。一般在培养期间调控生物反应器的内部条件，包括但不仅限于pH和温度。生物反应器可以由适于容纳在本发明培养条件下悬浮于培养基内的哺乳动物细胞培养物的任何材料构成，包括玻璃、塑料或金属。此处所用的术语“生产生物反应器”是指用于生产目的多肽或蛋白质的终末生物反应器。
大规模细胞培养物生产生物反应器的容积一般至少为50升，也可为100、150、200、500、1000、2500、5000、8000、10000、120000升或更大，或其间任意容积。本领域普通技术人员应当了解并能够选择合适的生物反应器用于实施本发明。
此处所用的术语“接种”是指将细胞培养物供予生物反应器或另一容器的方法。之前细胞可在另一生物反应器或容器中增殖。或者细胞为冰冻并于供予生物反应器或容器之前解冻。该术语用于指任意数目细胞，包括单个细胞。
在一些实施方式中，在步骤1)中，当种子活细胞密度≥15×106cells/ml时终止培养。
在一些实施方式中，在步骤2)中，所述种子细胞接种的密度≥2×106cells/ml；
在一些实施方式中，所述种子细胞接种的密度为2～5×106cells/ml；
在一些实施方式中，所述种子细胞接种的密度为3.0±0.5×106cells/ml。
在一些实施方式中，步骤2)采用流加补料培养基的培养方式进行细胞培养。
根据本发明的一方面，本发明还涉及上述方法在哺乳动物细胞中的应用。
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞选自多能干细胞、胚胎干细胞、骨髓基质细胞、造血祖细胞、淋巴干细胞、骨髓干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、肝细胞、胰腺细胞、癌瘤细胞以及细胞系中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述细胞系是由以下各者所构成的群组中选出：
CHO(优选CHO-S和/或CHO-K1)、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC5、FS4、T细胞系、B细胞系、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U20S、HT1080、L929、融合瘤以及癌细胞系。
在一些实施方式中，所述CHO细胞为CHO-K1细胞，且在培养时，维持葡萄糖浓度不低于3.0g/L，维持谷氨酰胺浓度不低于3mM；
优选的，在步骤1)中，培养周期为5天，在第2天和第4天进行补料，补料比率为5％/0.5％Hyclone CellBoost 7a/Hyclone CellBoost 7b；更优选的，此阶段所用培养基为Hyclone Actipro Medium；更优选的，此阶段培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。
优选的，在步骤2)中，培养周期为14天，补料策略为5％/0.5％(HycloneCellBoost 7a/Hyclone CellBoost 7b)on day 1,3,5,7,9,11,13；更优选的，此阶段所用培养基为Hyclone Actipro Medium；更优选的，此阶段初始培养温度37℃±0.5，2L反应器的搅拌转速为200rpm，pH控制在6.5-7.5，DO控制范围为50％，当细胞密度＝17±2×106cells/ml，温度降为32℃。
目前主流的补料流加培养模式，以活细胞密度0.3～0.5×106cells/ml进行接种，培养5～6天、活细胞密度达到15～30×106cells/ml后，降温到31～33℃。降温1～2天后细胞进入大量蛋白表达生产阶段。细胞于后期约培养11～12天细胞活率开始下降。因此总培养时间一般为14～16天，生长期5～6天，大量蛋白表达生产阶段8～9天，活率稳定生产阶段仅4～6天。
若能提高最初的接种活细胞密度，则能提前达到降温之细胞密度、增加大量蛋白表达生产总时间，进而增加总体蛋白产量。但是目前的高密度接种的实现是在N-1种子大体积培养后离心、换液后浓缩或者N-1灌流培养，这两种方式在商业化生产时不仅会额外增加的生产成本，而且还会增加操作难度，从而提升生产难度和风险。
本发明所提供的上述方法能够缩短上游培养工艺周期或者相同的生产周期提高产量，从而降低成本。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种用于治疗癌症的单克隆抗体1，以基因工程技术人工构建表达细胞株，hostcell为CHO-K1，谷氨酰胺合成酶基因表达系统，采用单克隆筛选技术，筛选出稳定的表达细胞株。此抗体生产的上游工艺过程为细胞解冻复苏、种子扩增培养、反应器中放大生产(NProduction)、细胞液收获4个步骤。以在2L生物反应器生产工艺为例：
Step 1-细胞解冻复苏：
从细胞库中拿出一只冻管，在37℃水浴中解冻3-5分钟。在生物安全柜中无菌转移至装有49ml基础培养基1(Gibco CD CHO Medium)的125ml摇瓶。iVCD为0.3±0.05×106cells/ml，在infors CO2摇床培养箱进行培养，温度37℃±0.5，转速110rpm，湿度80％±10％。培养2～3天，活细胞密度达到1.1～2.0×106cells cells/ml，转到下一级培养。
Step 2-种子扩增培养：
N-X种子扩增：iVCD为0.15±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(HycloneActiPro Medium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养时间3天，最终活细胞密度为2.5-4.0×106cells/ml.
N-1种子扩增：
原工艺为iVCD为0.30±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(Hyclone ActiProMedium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养时间3天，最终活细胞密度为3.0～6.0×106cells/ml.
本发明工艺为N-1_Fed-batch,接种密度(iVCD)为0.3±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(Hyclone ActiPro Medium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养周期为5天，在第2天和第4天，feeding 2％补料培养基1(HycloneCellBoost 7a),0.2％补料培养基2(Hyclone CellBoost 7b)，最终活细胞密度为16-20×106cells/ml.
Step 3-反应器上生产(N Production)：
原工艺接种密度(iVCD)为0.4±0.1×106cells/ml，初始培养温度37℃±0.5，2L反应器的搅拌转速为195rpm，pH控制在6.6-7.2，DO控制范围为40％，当活细胞密度达到20±3×106cells/ml，温度降为31℃，补料策略为补料比率5％/0.5％(Hyclone CellBoost7a/CellBoost 7b)on day 3,6,8,10.维持葡萄糖浓度不低于4.5g/L。
本发明优化后的工艺，接种密度(iVCD)为3.0±0.5x 106cells/ml，初始培养温度37℃±0.5，2L反应器的搅拌转速为195rpm，pH控制在6.6-7.2，DO控制范围为40％，当活细胞密度达到20±3×106cells/ml，温度降为31℃，补料策略为补料比率5％/0.5％(HycloneCellBoost 7a/CellBoost7b)on day 1,4,6,8,12(如果培养周期不变，第12天需要补料)，维持葡萄糖浓度不低于4.5g/L。
Step 4-细胞液收获：
在第14天或者细胞活率低于70％，进行收获。细胞液用深层过滤的方法分离收集上清液，然后0.2um过滤，移交给下游纯化。
上游生产结果如下：
表1 2L反应器细胞培养生产结果汇总
Figure BDA0001905669990000091
表2蛋白质量检测结果
Figure BDA0001905669990000092
Figure BDA0001905669990000101
从表1和表2中可知，与原工艺相比：1.在相同的培养周期(14天)，用本发明优化后的培养工艺可获得更高的蛋白表达量，同比增加20.9％的蛋白表达量；而在培养的第12天即获得了与原工艺相同蛋白的表达量，比原工艺缩短2天的培养周期；优化后的工艺表达的蛋白质量并未发生明显变化，依旧在原蛋白质量标准中。
实施例2
一种用于治疗癌症的单克隆抗体2，以基因工程技术人工构建表达细胞株，hostcell为CHO-K1，谷氨酰胺合成酶基因表达系统。采用单克隆筛选技术，筛选出稳定的表达细胞株。此抗体生产的上游工艺过程为细胞解冻复苏、种子扩增培养、反应器中放大生产(NProduction)、细胞液收获4个步骤。以在2L生物反应器生产工艺为例：
Step 1-细胞解冻复苏：
从细胞库中拿出一只冻管，在37℃水浴中解冻3-5分钟。在生物安全柜中无菌转移至装有49ml基础培养基2(Hyclone ActiPro Medium)的125ml摇瓶。接种密度(iVCD)为0.3±0.05×106cells/ml，在infors CO2摇床培养箱进行培养，温度37℃±0.5，转速110rpm，湿度80％±10％。培养3-4天，活细胞密度达到1.5-2.0×106cells/ml，转到下一级培养。
Step 2-种子扩增培养：
N-X种子扩增：接种密度(iVCD)为0.30±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(Hyclone ActiPro Medium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养时间3天，最终活细胞密度为2.0-3.5×106cells/ml.
N-1种子扩增：
原工艺为接种密度(iVCD)为0.30±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(HycloneActiPro Medium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养时间3天，最终活细胞密度为2.5-4.5×106cells/ml.
本发明工艺为N-1_Fed-batch,接种密度(iVCD)为0.3±0.05×106cells/ml，在基础培养基2(Hyclone ActiPro Medium)中培养，培养温度37℃±0.5，摇床转速110±10rpm，湿度80％±10％。培养周期为6天，在第2天和第4天，feeding 3％补料培养基1(HycloneCellBoost 7a),0.3％补料培养基2(Hyclone CellBoost 7b)，Target VCD为15-20×106cells/ml.
Step 3-反应器上生产(N Production)：
原工艺接种密度(iVCD)为0.5±0.1×106cells/ml，初始培养温度37℃±0.5，2L反应器的搅拌转速为200rpm，pH控制在6.5-7.5，DO控制范围为50％，当活细胞密度达到17±2×106cells/ml，温度降为32℃，补料策略为补料比率3％/0.3％(Hyclone CellBoost7a/CellBoost 7b)on day3,5,7,9,11,13.维持葡萄糖浓度不低于3.0g/L，维持Glutamine浓度不低于3mM。
本发明优化后的工艺，接种密度(iVCD)为3.0±0.5×106cells/ml，初始培养温度37℃±0.5，2L反应器的搅拌转速为200rpm，pH控制在6.5-7.5，DO控制范围为50％，当VCD＝17±2×106cells/ml，温度降为32℃，补料策略为补料比率5％/0.5％(Hyclone CellBoost7a/CellBoost 7b)on day1,3,5,7,9,11,13(如果培养周期不变，第13天需要补料)，维持葡萄糖浓度不低于3.0g/L，维持谷氨酰胺浓度不低于3mM。
Step 4-细胞液收获：
在第14天或者细胞活率低于80％，进行收获。细胞液用深层过滤的方法分离收集上清液，然后0.2um过滤，移交给下游纯化。
上游生产结果如下：
表3 2L反应器细胞培养生产结果汇总
Figure BDA0001905669990000121
表4蛋白质量检测结果
Figure BDA0001905669990000122
从表3和表4中可知，与原工艺相比：1.在相同的培养周期(14天)，用本发明优化后的培养工艺可获得更高的蛋白表达量，同比增加24.4％的蛋白表达量；在培养的第12天即获得与原工艺相同蛋白的表达量，比原工艺缩短了2天的培养周期；优化后的工艺表达的蛋白质量并未发生明显变化，依旧在本产品的质量标准中。
通过以上两组实例均可实现本发明的目的即在获得相同蛋白产量的情况下有效缩短生物反应器上细胞培养周期或者在相同的培养周期可提高至少20％以上的蛋白产量。而且本发明运用在商业化生产上，可明显提高生产效率，降低生产成本，进而可以降低药物的生产成本，降低药物价格，惠及广大病人。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种用于高密度接种培养中种子细胞的培养方法，其特征在于，包括：
在N-1种子扩增培养时通过流加补料培养增加种子活细胞密度；所述流加补料的补料形式为补加补料培养基；培养周期为5天，在第2天和第4天进行补料，补料比率为2％/0.2％Hyclone CellBoost 7a/Hyclone CellBoost 7b；
当种子活细胞密度≥15×106cells/ml时终止培养；
所述种子细胞为CHO-K1细胞。
2.一种高密度接种细胞培养的方法，其特征在于，包括：
1)应用权利要求1所述的方法培养得到种子细胞；
2)将所述种子细胞接种于生物反应器中进行放大培养；
步骤2)采用流加补料培养方式进行细胞培养；在步骤2)中，所述种子细胞接种的密度为3.0±0.5×106cells/ml。
3.权利要求1所述的方法或权利要求2所述的方法在哺乳动物细胞的培养中的应用；所述哺乳动物细胞为CHO-K1。
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A novel high density N-1 batch seed strategy development for CHO cell culture manufacturing;Andrew Yongky;《ABSTRACTS OF PAPERS OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIET》;20180318;第255卷;487 *
Case Study: An Accelerated 8-Day Monoclonal Antibody Production Process Based on High Seeding Densities;Ishai Padawer等;《Biotechnol. Prog.》;20130418;第29卷(第3期);829-832 *

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