CN112011514A - 提高抗体adcc活性的细胞培养工艺 - Google Patents

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CN112011514A CN201910467520.6A CN201910467520A CN112011514A CN 112011514 A CN112011514 A CN 112011514A CN 201910467520 A CN201910467520 A CN 201910467520A CN 112011514 A CN112011514 A CN 112011514A
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Abstract

本发明公开提供了一种有效提高抗体ADCC活性的细胞培养工艺，包括：i)向生物反应器中添加表达一种单克隆抗体或其片段的哺乳动物细胞和基础培养基，并将所述生物反应器的培养温度设置为t1；ii)在培养一段时间后，向所述生物反应器中流加补料培养基；以及iii)在培养一段时间后，将所述生物反应器的培养温度降至t2。该工艺能够在提高收获时的活率的同时显著提高抗体的ADCC活性，并且该工艺具有稳定性好、操作性强、批次间差异小等特点，容易应用于大规模CHO细胞表达单克隆抗体，特别是工业化生产单克隆抗体。

Description

提高抗体ADCC活性的细胞培养工艺
技术领域
本发明公开了一种细胞培养工艺，更具体地说涉及一种采用CHO细胞表达单克隆抗体的细胞培养工艺，其可以提高单克隆抗体的ADCC活性，属于生物制品领域。
背景技术
生物技术药物尤其是单克隆抗体药物，因其治疗的靶向性、耐受性，提高患者生存质量同时延长生命，上市后获得市场认可度高。自1986年第一个单抗药物Muromonab CD3经FDA批准上市，抗体药物在临床治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、器官移植排斥以及感染等方面取得了快速发展，引领了第二次生物医药产品浪潮。截止2018年5月，欧美共批准超过80个治疗型抗体类药物。2006-2015年全球抗体药物销售额的平均增长率高达31.65％。据预测，全球生物药在2020年在全部药品市场所占的份额将会超过35％。我国抗体类药物的研发起步晚，但近几年抗体领域受到世界越来越多的关注，抗体药物研发已被列入重点攻关项目。
抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)是单克隆抗体的重要机制之一，单抗靶向结合至肿瘤细胞表面分子后，效应细胞通过其表面上的Fc受体(FcγR)与单抗Fc片段结合，激活一系列的信号通路，从而释放一系列炎症或细胞毒性的免疫调节因子，包括细胞因子、趋化因子、蛋白酶和活性氧分子等，对肿瘤细胞产生杀伤作用，从而发挥单抗药物的抗肿瘤活性。
单抗Fc段的糖基化作为蛋白翻译后修饰的重要指标，在抗体药效(如ADCC)和药代(半衰期)中具有非常重要的作用。目前已报道或应用一些方法来改变糖基化水平或类型，提高抗体的ADCC活性，如添加甘露糖苷酶抑制剂(Kifunensine)使单抗的糖型变为高甘露糖型，或者通过基因工程的手段减少岩藻糖修饰等方法。然而，改变糖基化类型会相应影响单抗的安全性和有效性，如高甘露糖型会加快抗体在体内的清除，从而影响药代(缩短半衰期)，并可能产生免疫原性。基因工程的方法则需要重新构建细胞株，这样相当于对单抗药物进行重新开发，延长药物的开发周期和成本。
因此，在目前国内外单抗药物开发激烈竞争时代的形势下，迫切需要一种简单易行的细胞培养工艺。本发明人偶然发现，通过在细胞培养过程中降低温度可以显著改进所生产的抗体的ADCC活性而不影响其他生物学特性，从而提高产品的治疗效果。
发明内容
本发明目的在于提供一种在细胞培养过程中有效提高抗体ADCC活性的生产工艺，以解决现有细胞培养工艺中存在的缺陷。
在本发明的一个方面中，提供了一种提高抗体ADCC活性的细胞培养工艺，包括：
i)向生物反应器中添加表达一种单克隆抗体或其片段的哺乳动物细胞和基础培养基，并将所述生物反应器的培养温度设置为t1；
ii)在培养一段时间后，向所述生物反应器中流加补料培养基；以及
iii)在继续培养一段时间后，将所述生物反应器的培养温度降至t2。
优选地，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
优选地，所述单克隆抗体为OX40抗体。
优选地，所述基础培养基为Actipro培养基。
优选地，在步骤i)中，生物反应器的参数溶氧为40％，搅拌转速为90rpm，pH控制范围为6.95±0.25。
优选地，步骤i)中的t1为36℃至37℃。更优选地，t1为36.5℃。
优选地，细胞培养周期为12-16天。更优选地，细胞培养周期为14天。
优选地，在步骤ii)中，细胞培养2至4天后，每天流加补料培养基。更优选地，在细胞培养的第3天至第13天，每天流加补料培养基。
优选地，在步骤iii)中，细胞培养5至7天后，将所述生物反应器的培养温度降至t2，并将该培养温度保持至整个细胞培养周期结束。
优选地，步骤ii)中的流加培养基为Cell boost 7a和Cell boost 7b。
优选地，Cell boost 7a的每天补料体积为初始培养体积的2％，以及Cell boost7b的每天补料体积为初始培养体积的0.15％。
优选地，t2为33℃至35℃，优选为33℃。
优选地，在流加培养过程中，保持葡萄糖浓度在1g/L以上。
根据本发明的上述任一方面，本发明提供的生产工艺可以同时提高收获时的细胞活率和所得抗体的ADCC活性。另外，本发明提供的生产工艺可操作性强、稳定性好，批与批之间差异小。
附图说明
将基于以下图示对本发明的示例性实施方案进行说明，其中：
图1示出了根据本发明实施例1和比较例1的细胞密度随着培养时间的变化图。
图2示出了根据本发明实施例1和比较例1的细胞活率随着培养时间的变化图。
图3示出了根据本发明实施例1和比较例1的乳酸浓度随着培养时间的变化图。
图4示出了根据本发明实施例1和比较例1的葡萄糖浓度随着培养时间的变化图。
图5示出了根据本发明实施例1和比较例1的离线pH随着培养时间的变化图。
图6示出了根据本发明实施例1和比较例1的2pCO2随着培养时间的变化图。
图7示出了根据本发明实施例1和比较例1的NH4 +随着培养时间的变化图。
图8示出了根据本发明实施例1和比较例1的渗透压(OSM)随着培养时间的变化图。
图9示出了在FACS测试中，单克隆抗体A和B结合活细胞表达的人OX40的剂量依赖性反应曲线，其中将HuT78/OX40细胞悬浮于96-孔板，每孔5x104细胞。单克隆抗体A和B结合于细胞表面的靶蛋白，FACS检测按照本文实施例的实验讨论中的5)的叙述进行。
图10示出了单克隆抗体A和B促进IL-2上调的剂量依赖性反应曲线，其中将HuT78/OX40，每孔3x104细胞，和HEK293/OS8-FcγRI，每孔4x104细胞，以及系列稀释的单克隆抗体A和B共培养16至18小时，分泌于条件培养基中的IL-2量用IL-2 ELISA试剂盒测定，并计算出IL-2的增加倍数。
图11示出了在FACS测试中，OX40抗体(单克隆抗体A和B)结合活细胞表达的人FcγRIIIA的剂量依赖性反应曲线，其中将NK/CD16细胞悬浮于96-孔板，每孔5x104细胞。OX40抗体结合于细胞表面的FcγRIIIA(CD16a)，FACS检测按照实施例的实验讨论中的7)的叙述进行。
图12A-C示出了ADCC测试中OX40抗体的细胞毒活性的剂量依赖性反应曲线，其中在96孔U形底板中将NK/CD16细胞(每孔3×104)与BW/OX40(每孔1×105细胞)共培养5到5.5小时。检测培养上清液中LDH(lactate dehydrogenase)的释放量，以分析单克隆抗体A和B的细胞毒活性。
具体实施方式
除非另有说明，本文所使用的技术和科学术语为本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
例如，术语“生物反应器”指用于培养细胞的容器。生物反应器可以是任何大小，只要它可用于培养细胞。
术语“初始细胞培养培养基”指细胞培养周期开始时的细胞培养培养基。术语“初始培养体积”为在基础培养基中接种细胞后的培养体积。
术语“抗体”指任何免疫球蛋白或其片段，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽。该术语包括但不限于多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、嫁接的、双特异性、三特异性和体外生成的抗体。抗体片段包括Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb，其可以保留抗原结合功能。通常，此类片段包含抗原结合域。在本发明的优选实施方案中，抗体选自：单克隆和多克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。
术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体，而非下文定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。
如本文中使用的，术语“滴度(Titer)”指通过细胞培养生成的重组表达的抗体的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常表述成毫克抗体每毫升培养基的单位。可以就相对测量而言来表述或评估滴度，诸如比较在不同培养条件下获得蛋白质产品时滴度的百分比升高。
可以采用本领域技术人员通用的方式从生物反应器中获得单克隆抗体。这些通用的方式包括免疫亲和或离子交换柱上的分离。
提供以下实施例以帮助理解本发明，其真实的范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明精神的前提下对列出的规程做出修饰。
实施例
实验方法
采用NOVA对细胞培养液每天进行生化分析(Gln/Glu/Glucose/Lac/NH4+/Na+/K+)；采用血气分析仪进行pH、pCO2、pO2分析；采用冰点法测渗透压；采用Vi-cell XR计数仪进行细胞计数；采用FACS测量单克隆抗体与天然OX40的结合活性或者单克隆抗体与Fcγ受体的结合活性；采用ELISA测量IL-2分泌量；采用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测ADCC活性。
实验仪器
下文中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。
NOVA生化分析仪：购自Nova Biomedical
血气分析仪：购自Siemens
Vi-cell XR细胞计数仪：购自Beckman Coulter
FACS流式细胞分析仪：型号Guava easyCyte 6HT-2L，购自Millipore，USA
ELISA读板机型号SpectraMax Paradigm，购自Molecular Devices，USA
乳酸脱氢酶检测试剂盒：Promega，G780
实施例1
所用细胞为CHO细胞(BeiGene构建)，含表达载体，可分泌单克隆抗体。从细胞库取一支细胞(BeiGene构建)，在37℃水浴锅中快速振荡使其迅速融化，融化时间控制在3分钟以内。复苏时采用购自GE的Actipro基础培养基(含25nm MSX)，复苏密度控制在0.5±0.1*10^6cells/mL范围，置于转速为130rpm、CO2浓度5％(体积)、36.5℃摇床中培养3天，当密度达到2.5*10^6cells/mL时，开始传代扩增，接种密度为0.4±0.1*10^6cells/mL。连续进行几次传代扩增，然后将其接种至XDR10反应器(购自GE)中进行Fed-batch培养，且采用降温培养。
XDR10反应器参数设置为：从开始培养到第6天结束时(即，D0-D6)的温度为36.5℃，第7天至第14天(即，D7-D14)的温度为33.0℃，转速为90rpm，pH范围为6.95±0.25，DO为40％，接种密度为0.5±0.2*10^6cells/mL。当培养至第3天(D3)时，开始流加补料培养基Cell boost 7a(购自GE)和Cell boost 7b(购自GE)，7a按初始培养体积每天补2％(v/v)，7b按初始培养体积每天补0.15％(v/v)，过程中根据糖耗情况补糖，整个培养过程中维持葡萄糖浓度在1g/L以上。培养周期为14天。培养结束后，通过亲和层析纯化获得单克隆抗体A。
比较例1
所用细胞为CHO细胞(BeiGene构建)，含表达载体，可分泌单克隆抗体。从细胞库取一支细胞(BeiGene构建)，在37℃水浴锅中快速振荡使其迅速融化，融化时间须控制在3分钟以内。复苏时采用购自GE的Actipro基础培养基(含25um MSX)，复苏密度控制在0.5±0.1*10^6cells/mL范围，置于转速为130rpm、CO2浓度为5％(体积)、36.5℃摇床中培养3天，当密度达到2.5*10^6cells/mL时，开始传代扩增，接种密度为0.4±0.1*10^6cells/mL。连续进行几次传代扩增，然后将其接种至XDR10反应器中进行Fed-batch培养。
XDR10反应器参数设置为：整个培养周期的温度为36.5℃，转速为90rpm，pH范围为6.95±0.25，DO为40％，接种密度为0.5±0.2*10^6cells/mL。当培养至D3时，开始流加补料培养基Cell boost 7a(购自GE)和Cell boost7b(购自GE)，7a按初始培养体积每天补2％(v/v)，7b按初始培养体积每天补0.15％(v/v)，过程中根据糖耗情况补糖，整个培养过程中维持葡萄糖浓度在1g/L以上。培养周期为14天。培养结束后，通过亲和层析纯化获得单克隆抗体B。
采用上述实验方法，对实施例1和实施例2进行测试，实验结果(如细胞生长、细胞代谢、表达量、质量、ADCC活性等)如图1-12和表1-10所示。
1)细胞生长的评价结果
图1和2示出了实施例1和比较例1的细胞生长的结果，其中从图1中可以看出，实施例1的VCD略低，为29.74*106cells/mL，而比较例1的VCD相对较高，为34.07*106cells/mL；以及从图2中可以看出，实施例1中的后期细胞活率维持较好，活率为85％以上；而比较例1中的后期细胞活率下降较快，活率下降至64.5％。
2)细胞代谢的评价结果
图3至8示出了实施例1和比较例1的细胞代谢的结果。图2至8表明：降温与否，对细胞培养过程中葡萄糖浓度、NH4+浓度、PCO2、OSM变化趋势基本没有显著影响，但对乳酸代谢、pH代谢具有一定影响。采用比较例1的不降温工艺，培养后期乳酸会回升，pH会下降至6.80以下，而实施例1中的降温工艺则培养后期乳酸不会回升，pH维持在7.0左右。
3)细胞表达量的评价结果
表1：实施例1和比较例1的滴度结果
Figure BSA0000183946720000071
注：D11、D12、D13和D14分别表示第11天、第12天、第13天和第14天。以下同。
4)单克隆抗体的质量的评价结果
表2：实施例1和比较例1的SEC结果
Figure BSA0000183946720000072
Figure BSA0000183946720000081
表3：实施例1和比较例1的CE-SDS(NR)结果
Figure BSA0000183946720000082
表4：实施例1和比较例1的IEC结果
Figure BSA0000183946720000083
表5：实施例1和比较例1的糖型分布结果
Figure BSA0000183946720000084
5)单克隆抗体A和B结合抗原的活性的评价
单克隆抗体结合抗原OX40是行使所有功能的第一步，使用常规FACS比较了单克隆抗体A和B与天然OX40的结合活性。在FACS分析中所使用的稳定细胞系HuT78/OX40是用人白血病T细胞系HuT78(ATCC)作为宿主细胞表达全长人OX40。将HuT78/OX40细胞接种至96孔板，与单克隆抗体A和B共同孵育1小时。使用荧光标记的抗人Fab抗体检测单克隆抗体A和B在细胞表面的抗原结合活性。若将单克隆抗体B作为参照品，单克隆抗体A作为待测样品，峰值的相对差异RV％计算为：(待测抗体的峰值/参照样品的峰值)x 100％；EC50的相对差异RV％计算为：(参照抗体的EC50/待测样品的EC50)x 100％。在该检测方法中设定，当EC50的相对差异RV％在70％-130％之间时，不同批次的抗体具有可比性。实验结果如图9和表6所示。结果表明：单克隆抗体A和B与OX40的结合呈剂量依赖性，EC50均达到纳摩尔级浓度。也即，EC50(单克隆抗体B)＝411ng/mL(2.74nM)，EC50(单克隆抗体A)＝402ng/mL(2.68nM)，RV的差异仅为2％.在峰值极其相近(RV相差1％)的情况下，说明单克隆抗体A和B的结合抗原的活性具有可比性。
表6：单克隆抗体A和B结合细胞表面OX40的活性分析结果
抗体 峰值(MFI*) RV％，峰值 EC<sub>50</sub>(μg/mL) RV％，EC<sub>50</sub>
单克隆抗体B 1103 100％ 0A11 100％
单克隆抗体A 1096 99％ 0.402 102％
*，MFI：平均荧光强度
6)抗OX40抗体DS促进功能活性的比较(IL-2检测)
抗OX40抗体(单克隆抗体A和B)能特异性地结合人OX40，激活下游OX40的信号传递，启动免疫细胞的免疫活性(Aspeslagh et al.，2016；Voo et al.，2013)。此基于细胞的功能分析方法是用测定IL-2分泌量的增加作为刺激免疫反应强度的指标。在此方法中，采用一种T细胞衔接器，即膜锚定嵌合抗体OS8(参见US Patent 8735553)和Fc gammareceptor I(FcγRI)共转染HEK293细胞(ATCC)，建立了稳转细胞系HEK293/OS8-FcγRI，将其与前述表达OX40的人T细胞系(HuT78/OX40)以及单克隆抗体A和B共培养16至18小时，取其上清液用IL-2ELISA试剂盒(Invitrogen，货号88-7025)测定IL-2含量。该检测用IL-2增加的倍数多少，定量地比较不同OX40抗体在促进免疫反应，导致TCR信号上调的活性大小。若将单克隆抗体B作为参照品，单克隆抗体A作为待测样品，IL-2增加倍数的相对差异RV％计算为：(待测抗体的峰值/参照样品的峰值)x 100％；EC50的相对差异RV％计算为：(参照抗体的EC50/待测样品的EC50)x 100％。在该检测方法中设定，当EC50的相对差异RV％在70％-130％之间时，不同批次的抗体具有可比性。实验结果如图10和表7所示。
结果表明：单克隆抗体A和B与IL-2产量呈剂量依赖性，EC50均达到亚纳摩尔级浓度。也即，EC50(单克隆抗体B)＝50.26ng/mL(0.335nM)，EC50(单克隆抗体A)＝52.76ng/mL(0.352nM)，RV的差异仅为5％。在IL-2增加倍数相近(RV％差异＝6％)的情况下，说明这两个不同批次的DS的结合活性具有可比性。
表7：单克隆抗体A和B促进IL-2上调的功能分析结果
Figure BSA0000183946720000101
7)抗OX40抗体(即，单克隆抗体A和B)Fcγ受体的结合活性的比较
抗体结合了细胞表面靶蛋白，随即又交联到效应细胞表达的Fcγ受体(FcγRs)，是诸如ADCC等一些重要细胞功能的基础。单克隆抗体A和B为IgG1野生型，对FcγR具有明显较高的结合亲和力，尤其是对FcγRI和FcγRIIIA的结合。典型的ADCC是由结合到FcγRIIIA(又名CD16a)的抗体激活自然杀伤(natural killer，NK)细胞而启动。使用常规FACS比较了单克隆抗体A和B与NK细胞表面天然CD16a的结合活性。在此方法中，将含有CD16a(V158等位基因)和FcRγ基因的表达质粒共转导NK92MI细胞(ATCC)，由此产生NK92MI/CD16aV(NK/CD16)细胞系。将NK/CD16细胞接种至96孔板，与单克隆抗体A和B共同孵育1小、时。使用荧光标记的抗人Fab抗体检测OX40抗体在细胞表面与CD16的结合活性。若将单克隆抗体B作为参照品，单克隆抗体A作为待测样品，峰值的相对差异RV％计算为：(待测抗体的峰值/参照样品的峰值)x 100％；EC50的相对差异RV％计算为：(参照抗体的EC50/待测样品的EC50)x 100％。结果如图11和表8所示。
结果表明：单克隆抗体A和B与FcγRIIIA的结合呈剂量依赖性。也即，EC50(单克隆抗体B)＝9.8μg/mL(65nM)，EC50(单克隆抗体A)＝5.844μg/mL(39nM)，RV的差异为68％，显然，这个差异是显著的。在峰值相近(RV相差4％)的情况下，单克隆抗体A结合FcγRIIIA的活性比单克隆抗体B的活性显著高。
表8：单克隆抗体A和B结合细胞表面FcγRIIIA的活性分析结果
抗体 峰值*(MFI) RV％，峰值 EC<sub>50</sub>(μg/mL) RV％，EC<sub>50</sub>
单克隆抗体B 2225 100％ 9.8 100％
单克隆抗体A 2311 104％ 5.844 168％
*，取自Prism软件四参数拟合曲线的峰值
8)抗OX40抗体(即，单克隆抗体A和B)ADCC活性的比较
如前所述，当抗体结合了细胞表面靶蛋白，随即又交联到效应细胞表达的Fcγ受体(FcγRs)时，ADCC(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)启动。典型的ADCC是由结合到FcγRIIIA(又名CD16a)的抗体激活NK细胞而启动，导致细胞释放LDH(lactate dehydrogenase)。在此方法中，将前述NK92MI/CD16aV(NK/CD16)细胞用作效应细胞，而将稳转了人OX40的鼠T细胞株BW5143.7(ATCC)(简称为BW/OX40)用作靶细胞。在96孔U形底板中将NK/CD16细胞(每孔3×104)与BW/OX40细胞(每孔1×105)共培养5到5.5小时。采用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit试剂盒(Promega，G780)，检测培养上清液中LDH(lactate dehydrogenase)的释放量，以分析抗OX40抗体的细胞毒性，并以百分比表示。若将单克隆抗体B作为参照品，单克隆抗体A作为待测样品，ADCC活性峰值的相对差异RV％计算为：(待测抗体的ADCC峰值％/参照样品的峰值％)x 100％；EC50的相对差异RV％计算为：(参照抗体的EC50/待测样品的EC50)x 100％。
三次检测的结果如图12A-C所示，单克隆抗体A和B均与ADCC活性呈剂量依赖性。各个ADCC峰值和EC50结果列于表9，三次检测的平均数分析见表10。结果显示，在三次检测中单克隆抗体A和B的EC50的RV平均差异高达107％。也即，单克隆抗体A比单克隆抗体B的ADCC活性高一倍。一般认为，在ADCC分析中，当ADCC峰值极其接近(差异为±2％)时，这个差异是显著的。
已有报道显示，抗OX40抗体促进对抗肿瘤的免疫反应依赖于它们的效应子功能，经ADCC/ADC作用有效地清除肿瘤内OX40+Treg细胞，导致肿瘤消退，病人的存活率提高(Aspeslagh等人，2016；Bulliard等人，2014；Jacquemin等人，2015；Marabelle等人，2013)。在基于细胞的测试中显示ADCC活性高的抗体显然更可能具有较高的抗肿瘤潜能。
表9：三次检测中单克隆抗体A和B的ADCC活性的结果
Figure BSA0000183946720000121
表10：三次检测中单克隆抗体A和B的ADCC相对活性平均值比较
Figure BSA0000183946720000122
上文中已经用一般性说明、具体实施方式和试验对本发明做了详尽的描述，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。本公开所引用的任何文献均通过引用并入本文中。

Claims (14)

1.一种表达单克隆抗体或其片段的细胞培养工艺，包括：
i)向生物反应器中添加表达一种单克隆抗体或其片段的哺乳动物细胞和基础培养基，并将所述生物反应器的培养温度设置为t1；
ii)在培养一段时间后，向所述生物反应器中流加补料培养基；以及
iii)在继续培养一段时间后，将所述生物反应器的培养温度降至t2。
2.根据权利要求1所述的细胞培养工艺，其中所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、NS0细胞和SP2/0细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养工艺，其中所述单克隆抗体为OX40抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细胞培养工艺，其中所述基础培养基为Actipro培养基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细胞培养工艺，其中在步骤i)中，生物反应器的参数溶氧为40％，搅拌转速为90rpm，pH控制范围为6.95±0.25。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞培养工艺，其中步骤i)中的t1为36℃至37℃，优选为36.5℃。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞培养工艺，其中细胞培养周期为12-16天，优选为14天。
8.根据权利要求7所述的细胞培养工艺，其中在步骤ii)中，细胞培养2至4天后，每天流加补料培养基，优选地，细胞培养的第3天至第13天，每天流加补料培养基。
9.根据权利要求7所述的细胞培养工艺，其中在步骤iii)中，细胞培养5至7天后，将所述生物反应器的培养温度降至t2，并将该培养温度保持至整个细胞培养周期结束。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞培养工艺，其中步骤ii)中流加的补料培养基选自Cell boost 7a和Cell boost 7b。
11.根据权利要求10所述的细胞培养工艺，其中Cell boost 7a的每天补料体积为初始培养体积的2％，以及Cell boost 7b的每天补料体积为初始培养体积的0.15％。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的细胞培养工艺，其中步骤iii)中的t2为33℃至35℃，优选地为33℃。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的细胞培养工艺，其中在流加培养过程中，保持葡萄糖浓度在1g/L以上。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的细胞培养工艺，其中所述单克隆抗体或其片段具有提高的ADCC活性。
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