MX2013004790A - Composiciones que se dirigen al dominio extracelular soluble de e-caderina y metodos relacionados para terapia de cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el direccionamiento de epítopos dentro de uno o más sub-dominios de EC2-EC5 de E-caderina da como resultado la muerte de células tumorales derivadas epiteliales pero no la muerte de células endoteliales sanas, normales o células no epiteliales incluyendo células endoteliales y fibroblastos. Por consiguiente las composiciones de la invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido de uno o más sub-dominios de EC2-EC5 de E-caderina y sus variantes biológicamente activas; vectores de expresión y células para expresar dichos polipéptidos; y agentes (por ejemplo, anticuerpos) que dirigen los sub-dominios de EC2-EC5. Los métodos de la invención incluyen métodos para identificar y producir polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácido de uno o más de los sub-dominios de EC2-EC5 de E-caderina o su variante biológicamente activa; métodos para generar agentes, tales como antibióticos, que dirigen estos polipéptidos; y métodos para administrar dichos agentes o provocar su producción in vivo para el tratamiento de cánceres epiteliales o reducir el riegos de su ocurrencia o recurrencia.

Description

COMPOSICIONES QUE SE DIRIGEN AL DOMINIO EXTRACELULAR SOLUBLE DE E-CADERINA Y METODOS RELACIONADOS PARA TERAPIA DE CANCER Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio de la fecha de prioridad de la solicitud estadounidense provisional no. 61/407,367, la cual fue presentada el 27 de octubre de 2010. El contenido de esta solicitud provisional presentada antes es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Declaración con respecto a investigación con fondos federales Esta invención se hizo con apoyo del gobierno otorgado por los National Institutes of Health bajo los otorgamientos nos. CA133910 y ES015832. El gobierno estadounidense tiene ciertos derechos en esta invención.

Campo de la invención Las composiciones y métodos de la presente invención están relacionados con enfocar el dominio extracelular de la proteína de adhesión célula-célula de E-caderina. Las composiciones incluyen agentes ligantes, tales como anticuerpos, así como fragmentos antigénicos del dominio extracelular de E-caderina que pueden usarse en métodos terapéuticos y profilácticos para tratar cáncer.

Antecedentes La E-caderina es una glicoproteína transmembrana integral que ayuda a mantener la adhesión célula-célula epitelial. Se ha demostrado que la pérdida de función de E-caderina (longitud completa) resulta en des-diferenciación celular, proliferación e invasividad incrementada en cáncer de piel, pulmón, estómago, intestino y pecho (Brouxhon et al. , Cáncer Res. 67( 16):7654-7664 (2007) ; Hirohashi, Am. J . Pathol 153(2):333-339 (1 998); Chen et al. , Cáncer Lett. 201 :97-1 06 (2003)). Más aún, la pérdida de manchado de E-caderina en especímenes de biopsia a partir de pacientes de cáncer de pecho ha sido asociada con un pobre pronóstico y periodos cortos l ibres de metástasis (Pederson et al, Brit. J. Cáncer 87: 1 281 -1 286 (2002)).

La proteína de longitud completa está compuesta por un dominio extracelular que consiste de cinco subdominios designados EC 1 -EC5, una región transmembrana simple y un dominio citoplásmico (ver Shiraishi et al. , J . Immunol. 175(2): 1014-1021 (2005)). El subdominio EC1 , el cual es el más distante de la superficie de membrana celular, contiene una tripleta de histidina-alanina-valina (HAV) encontrada en células que expresan caderina (incluyendo las células que expresa E-, N-, P- y R-caderina) y se piensa que este subdominio es esencial para promover el contacto célula-célula mediado por E-caderina (Beavon, European J. Cáncer 36: 1607-1620 (2000)).

La E-caderina de longitud completa contiene un sitio de corte para varias proteasas cerca del dominio transmembrana, y corte en ese sitio produce un péptido N-terminal soluble de ~80-84 kDa llamado E- caderina soluble (sEcad). El derramamiento de sEcad ocurre constitutivamente a bajos niveles en células epiteliales no estimuladas, normales, y a niveles elevados en pacientes con tumores derivados epiteliales, tales como cáncer de pecho, piel, pulmón, próstata, gástrico y colorrectal (Banks et al., J. Clin. Pathol. 48:179-180 (1995); Baranwal et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 384(1):6-11 (2009; Chan et al., Gut 48:808-811 (2001); Charalbopoulos et al., Exp. Oncol. 28(1):83-85 (2006); Kuefer et al., Clin Cáncer Res. 9:6447-6452 (2003); Shirahama et al., J. Dermatol. Sci. 13:30-36 (1996); Velikova et al., Br. J. Cáncer 77:1857-1863 (1998). El derramamiento de sEcad también ha sido reportado por incrementar en células de riñon canino no canceroso después de la inducción de apoptosis (Steinhusen et al., J. Biol. Chem. 276:4972-4980 (2001)).

Al tiempo que los niveles de sEcad son incrementados en la orina o suero de pacientes con cáncer, y se elevan cuando células normales experimentan apoptosis, la actividad biológica de esta proteína derramada no es bien entendida. Una variedad de estudios han demostrado que sEcad rompe la adhesión célula-célula epitelial, induce dispersión de células epiteliales, e intensifica la proliferación, migración e invasión de células de tumor (Gil et al., Gynecol. Oncol. 108(2):361-369 (2008); Maretzky et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102/26):9182-9187 (2005); Marambaud et al., EMBO J. 21 (8): 1948-1956 (2002); Najy et al., J. Biol. Chem. 283(26): 18393-18401 (2008); Naoe et al., J. Cell Sci. 114:111-118(2001); Ryniers et al., Biol. Chem. 383:159-165 (2002); y Symowicz et al., Cáncer Res. 67(5):2030-2039 (2007)). Las rutas de señalización que modulan estas funciones biológicas todavía no están claras. Estudios usando la línea celular de cáncer de pecho SKBr3 demostraron que complejos de sEcad-H ER2 fueron inducidos mediante adición exógena de una proteína de fusión extracelular purificada (Fc-sEcad) , conduciendo a activación de cinasa regulada con señal extracelular (ERK) (Najy et al. , J. Blol. Chem. 283(26): 1 8393-1 8401 (2008)). El receptor de EGF humano pertenece a la familia ErbB o HER de tirosina cinasas de receptor, las cuales son sobre-expresadas o disreguladas en muchos tumores epiteliales (Mendelsohn y Baselga, Oncogene 1 9: 6550-6565 (2000); Burgess, Growth Factos 26:263-274 (2008)). Esta familia de receptores activa las moléculas de señalización corriente abajo, tales como ERK, lo cual a su vez activa un rango de comportamientos de células cancerosas incluyendo proliferación, migración, invasión celular y angiogénesis (Hanahan y Weinberg , Cell 100:57-70 (2000); Shields et al. , Trends Cell Biol. 10: 147-1 54 (2000)) . De acuerdo con esto, una variedad de terapias anti-EGF han sido desarrolladas. Estas incluyen inhibidores de tirosina cinasa de moléucla pequeña, anticuerpos monoclonales, y vacunas de cáncer (Fukuoka et al. , Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 21 :292a Abs1 1 88 (2002); Lage et al. , Ann. Med. 35:327-336 (2003); Mateo et al. , I mmunotechnology 3:71 -81 (1997); Slamon et al. , N . Engl. J. Med. 344:783-792 (2" 1 ) = ; y Yu et al. , J. Clin. I nvest. 1 10: 289-294 (2002)). Estas estrategias terapéuticas son limitadas porque solo algunos tumores, en una etapa de maduración definida, expresan el receptor/antígeno específico y no todos los tumores con una cierta histolog ía y etapa sobre-expresan el receptor/antígeno objetivo (solo 20% a 50% de cáncer de pecho sobre-expresa el receptor EGF). Así, las velocidades de respuesta para estos tipos de medicamentos permanece baja (Mendelson y Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000); Ortega et al , Cáncer Control 1 7( 1 ):7-1 5 (2010)). Además, los tumores que inicialmente responden a estos medicamentos eventualmente desarrollan resistencia adquirida (Jackman et al. , Clin. Cáncer Res. 1 2:3908-3914 (2006); Ortega et al. , Cáncer Control 1 7( 1 ):7-15 (201 0); y Riely et al. , Clin. Cáncer Res. 12:839-844 (2006)).

Breve desc ripción La presente invención se basa , en parte, en nuestro descubrimiento de que orientar epítopos dentro de uno o más de los subdominios EC2-EC5 de E-caderina resulta en la muerte de células de tumor derivadas epiteliales pero no mata células epiteliales saludables normales o células no epiteliales, incluyendo células endoteliales y fibroblastos, en un grado apreciable (por ejemplo, a cualquier grado cl ínicamente perjudicial). De acuerdo con esto, las composiciones de la invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios de EC2-EC5 de E-caderina y variantes biológicamente activas de los mismos; vectores de expresión y células ara expresar tales polipéptidos; y agentes (por ejemplo, anticuerpos) que se dirigen a los subdominios EC2-EC5. Los métodos de la invención incluyen método para identificar y producir polipéptidos teniendo una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2-EC5 de E-caderina o una variante biológicamente activa de la misma ; métodos para generar agentes, tales como anticuerpos, que se dirigen a estos polipéptidos; y métodos para administrar tales agentes o provocar su producción in vivo para tratar cáncer epitelial o reducir el riesgo de su ocurrencia o recurrencia. Para facilidad de lectura, no nos referiremos a variantes biológicamente activas en cada oportunidad; se entenderá que donde un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos encontrada en uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 y EC5 de una E-caderina que ocurre de manera natural puede hacerse y usarse como se describe en la presente, una variante biológicamente activa de ese polipéptido también puede hacerse y usarse.

Los métodos en los cuales los anticuerpos anti-E-caderina son administrados abarcan terapias de dosis específicas, y las terapias pueden ser dirigidas selectivamente hacia ser citotóxicas para cáncer de pecho, pulmón, colon , próstata y piel, así como otros cánceres epiteliales y cánceres de tejidos derivados de ectodermo (por ejemplo, el sistema nervioso central, los lentes del ojo, ganglios craniales y sensoriales y nervios, y tejido conectivo en la cabeza). Los métodos terapéuticos y profilácticos descritos en la presente pueden ser realizados en conexión con otras terapias citotóxicas (por ejemplo, quimioterapia, terapia de hormonas, radioterapia , y terapias basadas en anticuerpos (por ejemplo, terapia de anticuerpos anti-EGF monoclonales).

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención caracteriza métodos para tratar un paciente que tiene cáncer al, inter alia, administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que enfoca específicamente uno o más de los subdominios segundo, tercero, cuarto o quinto (EC2, EC3, EC4 y EC5, respectivamente) de E-caderina soluble (sEcad), pero no el primer subdominio (EC 1 ) de sEcad. El agente puede enfocar específicamente EC4 y/o EC5. Donde un solo subdominio (por ejemplo, EC4 o EC5) es enfocado, el agente puede ligar residuos de aminoácidos confinados a ese dominio. El agente puede ser un andamio de proteína, tal como un anticuerpo o un fragmento u otra variante del mismo que se une específicamente a un epítopo comprend iendo resi duos de a m inoá cidos en uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad, pero no en el subdominio EC 1 de sEcad.

Donde el agente es un anticuerpo, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, quimérico, murino o humano. El agente o anticuerpo también puede ser un anticuerpo de cadena simple; el agente o anticuerpo también puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal (por ejemplo, una inmunoglobulina de la clase de IgG o IgM). Sin importar la naturaleza precisa del agente, puede ser etiquetada de manera detectable (por ejemplo, con una etiqueta fluorescente o quimioluminiscente).

Con respecto al impacto sobre células biológicas, el agente puede ser caracterizado como uno que mata células que expresan E-caderina malignas pero no mata células no malignas a cualquier grado significativo o apreciable. La muerte puede ser lograda al inducir muerte celular programada, detención de crecimiento, anoikis, necrosis, autofagia, u otro estado que resulte en muerte celular.

Los agentes de la invención pueden ser formulados como formulaciones farmacéuticas o preparaciones que estén libres de cantidades citotóxicas de un excipiente u otro ingrediente "inerte". De manera más específica, las composiciones farmacéuticas o farmacéuticamente aceptables pueden ser formuladas para entrega a un paciente mediante administración oral, administración intravenosa, administración nasal o inhalación (por ejemplo, insuflación), administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración transm ucosa (por ejemplo, formuladas para administración a tejido de mucosa , de manera que recubran el recto o vagina), o administración transdérmica. Aunque discutimos las dosificaciones más adelante, notamos aqu í que el agente puede ser entregado en una formulación farmacéutica conteniendo aproximadamente 1 pg/ml hasta aproximadamente 400 pg/ml del agente (por ejemplo, aproximadamente 4 g/ml hasta aproximadamente 20 µg/ml del agente). La dosificación también puede ser tal que, sobre administración a un paciente, el nivel de suero del paciente del agente farmacéutico activo es aproximadamente 1 -10 mg(kg (por ejemplo, aproximadamente 1 -5 mg/kg). Cuando se usa en cultivo celular, la dosificación puede ser tal que, sobre adición a medio de cultivo, el agente farmacéutico activo esté presente en aproximadamente 1 -500 µg/ml de medio de cultivo celular (por ejemplo, aproximadamente 1 -400 pg/ml). Como se reconoce en la técnica, las dosificaciones pueden variar en diferentes formulaciones, y las dosificaciones dentro de las presentes formulaciones o preparaciones farmacéuticas pueden variar dependiendo de la presencia, ausencia o cantidad relativa de aditivos en la formulación (por ejemplo, como es suministrada por un fabricante). De esta manera, los métodos de la invención abarcan aquéllos en los cuales el agente es entregado en una formulación farmacéutica que: (a) producir, sobre administración a un paciente, un nivel de suero del agente de aproximadamente 1 -10 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 -5 mg/kg), o (b) producir, sobre adición a un cultivo celular, una concentración del agente de aproximadamente 1 -500 Mg/ml (1 -400 pg/ml) de medio de cultivo celular.

En cualquiera de los métodos de la invención en la cual un agente enfocador de sEcad es administrado, el método puede incluir un paso en el cual uno proporciona una muestra biológica del paciente (por ejemplo, antes de administrar el agente enfocador y/o en algún punto en el tiempo des pués de administrar el agente enfocador) y determina si la muestra incluye un nivel elevado de sEcad u otro biomarcador predictivo de cáncer. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una muestra de orina, saliva, fluido cerebrospinal, sangre o biopsia. Donde tal paso es realizado antes de administrar el agente, un nivel elevado de sEcad puede indicar que el paciente es un buen candidato para el tratamiento. Donde tal paso es realizado en una o más veces después de administrar el agente, un nivel reducido de sEcad puede indicar que el paciente está respondiendo bien al tratamiento.

En cualq uiera de los métodos de la invención , uno también puede administrar un segundo tratamiento de cáncer. Por ejemplo, uno puede administrar un agente quimioterapéutico, un tratamiento de radiación, un tratamiento con un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo que es útil en el tratamiento de cáncer y se une específicamente a un objetivo diferente de sEcad), o intervención quirúrgica.

Los pacientes susceptibles a tratamiento incluyen aquéllos que tienen un cáncer dentro de un tejido epitelializado. El cáncer puede ser un cáncer del canal alimentario (por ejemplo, la boca, garganta, esófago, estómago, intestino, recto o ano), sistema nervioso central, pecho, piel (por ejemplo, un carcinoma de células escamosas o m ela nom a) , sistema reprod uctivo (por ejem plo , cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer labial o vulvar, cáncer de de próstata, cáncer testicular, o cáncer del tracto genital masculino) ; pulmón o tracto urinario.

Los métodos pueden ser terapéuticos o profilácticos. De acuerdo con esto, en otro aspecto, la invención caracteriza métodos para reducir la probabilidad de que un sujeto desarrolle cáncer. Estos métodos pueden ser realizados al administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un polipéptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2-EC5 de sEcad pero excluye el subdominio EC1 , o un fragmento antigénicamente activo u otra variante del m iso, o (b) un vector de expresión comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico o el fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo. El polipéptido antigénico puede incluir una secuencia de aminoácidos que es confinada dentro de EC4 , confinada dentro de EC5, o que abarca la secuencia de tanto EC4 como EC5. El polipéptido antigénico puede provocar la producción de anticuerpos que unen específicamente sEcad pero no ligan E-caderina expresada por células no malignas en el sujeto. Los polipéptidos antigénicos y vectores de expresión empleados en estos métodos pueden ser formulados en formas que son iguales que o similares a las formulaciones descritas antes. Por ejemplo, pueden ser entregadas mediante administración oral, administración intravenosa (la cual puede ser de preferencia la administración oral) , administración nasal o i n halación (por ejem plo , insuflación) , adm i n i stración intramuscular, administración intraperitoneal, administración transmucosa o administración tra nsdérm ica . Los riesgos enfrentados por el sujeto puede ser un riesgo de desarrollar cualquiera de los tipos de cáncer descritos en la presente. El riesgo puede ser un riesgo promedio con base en la proporción general de ocurrencia en la población , o puede ser un riesgo intensificado debido a una predisposición genética o una ocurrencia anterior del cáncer. Por ejemplo, los polipéptidos antigénicos o vectores que los codifican pueden ser adm inistrados a un sujeto para reducir el riesgo de una ocurrencia o recurrencia de un cáncer dentro de un tejido epitelializado; un cáncer del canal alimentario (por ejemplo, la boca, garganta, esófago, estómago, intestino, recto o ano), sistema nervioso central, pecho, piel (por ejemplo, un carcinoma de células escamosas o melanoma), sistema reproductivo (por ejemplo, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer labial o vulvar, cáncer de próstata , cáncer testicular, o cáncer del tracto genital masculino), pulmón o tracto urinario.

Los métodos de la invención pueden ser expresados en términos de la preparación de un medicamento. De acuerdo con esto, la invención abarca el uso de los agentes y composiciones descritas en la presente en la preparación de un medicamento. En ciertas modalidades, el uso de los agentes y composiciones se extiende a la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer (incluyendo los tipos de cáncer descritos en la presente).

Las composiciones de la invención incluyen composiciones farmacéuticamente aceptables que incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo comprendiendo residuos de aminoácidos en uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad pero no en el subdomínio EC1 de sEcad; (b) un polipéptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2-EC5 de sEcad pero excluye el subdominio EC1 , o un fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo; o (c) un vector de expresión comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico o el fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo.

Todavía en otro aspecto, la presente invención caracteriza métodos para identificar un epítopo en un sEcad. Estos métodos pueden ser realizados al, ínter alia: (a) proporcionar un polipéptido comprendiendo sEcad o un fragmento u otra variante del mismo; (b) administrar el polipéptido a un animal; (c) aislar anticuerpos producidos por el animal en respuesta al polipéptido; y (d) exponer células cancerosas a los anticuerpos o a un anticuerpo monoclonal generado a partir de los mismos. La muerte de las células cancerosas indica que el polipéptido comprende un epítopo de sEcad que puede ser dirigido o usado como un agente en tratamiento de cáncer, profilaxis o imagenología. Como en otros aspectos de la invención, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad, pero excluyen la secuencia de aminoácidos del subdominio EC 1 de sEcad. Por ejemplo, el polipéptido puede i ncl u i r un a secuencia de a m i noácidos de uno o má s de EC4 y/o EC5 (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos confinada a EC4 o una secuencia de aminoácidos confinada a EC5).

Uno de los retos más grandes para desarrollar tratamientos de cáncer se basa en hallar agentes terapéuticos que puedan distinguir entre células cancerosas y tejidos saludables normales. Muchos de los quimioterapéuticos actualmente disponibles son no selectivamente citotóxicos y tienen un índice terapéutico estrecho, resultando en toxicidad de medicamento sistémica que está debilitando a pacientes y realza la mortalidad global de los pacientes. De esta manera, un atributo altamente deseable de nuevos terapéuticos de cáncer es la capacidad para enfocar selectivamente células cancerosas sin afectar perjudicialmente las células y tejidos saludables normales. Aunque las composiciones de la presente invención no están limitadas a aquéllas que impactan células en cualquier punto particular en una trayectoria de señalización, esperamos que las composiciones terapéuticas de la presente invención actúen corriente arriba del receptor HER2 y capturarán un arreglo más amplio de objetivos corriente abajo que los tratamientos enfocados a HER2.

Los detalles de una o más modalidades de la invención son expuestos en los dibujos acompañantes y la descripción a continuación. Otras características, objetivos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos La FIG. 1A muestra la secuencia de aminoácidos de E-caderina humana (SEQ ID NO:1) con los subdominios extracelulares EC2-EC5 indicados por subrayado alternante (EC2 y EC4 son subrayados con líneas dobles y EC3 y EC5 son subrayados con líneas sencillas).

La FIG. 1B es una representación esquemática de una E-caderina humana tipo natural con sEcad como se indica. La longitud del fragmento soluble puede variar y puede terminar en el 4o o 5o dominio extracelular o, en otros casos, en el dominio transmembrana (ver, por ejemplo, el estudio por Noe et al., J. Cell Sci. 114(1):111-118, 2000).

La FIG. 2A es una gráfica lineal que muestra el número de tumores palpables en ratones, en el tiempo, siguiendo tratamiento con solución salina o a-sEcad como se describe en el Ejemplo 5.

La FIG. 2B es un panel de fotografías que muestran, en la izquierda, los tumores visibles en un ratón tratado con solución salina contra aquéllos en un ratón tratado con a-sEcad (como se describe en el Ejemplo 5). Los tumores quirúrgicamente removidos también son mostrados, ya que son preparaciones histológicas de tejido a partir de ratones no tratados (solución salina) y tratados (ct-sEcad).

La FIG. 2C es un par de gráficas de barra que ilustran la diferencia en peso de tumor (g) y volumen (cm3) en ratones no tratados (solución salina) y tratados (a-sEcad).

Descri pción detallada Como se describe más adelante, probamos la efectividad de una variedad de anticuerpos monoclonales y policlonales comerctalmente disponibles que enfocan el dominio extracelular de E-caderina, incluyendo el anticuerpo DECMA-1 empleado por Espada et al. (J . Cell Physiol. 21 9:84-93 (2009)), Fouquet et al. (J. Biol. Chem. 279(41 ):43061 -43069 (2004)) y Galaz et al. (J . Cell Physiol . 205( 1 ):85-96 (2005)) en un panel tanto células de cáncer epitelial y células o cancerosas. Cuando repetimos estos experimentos, encontramos que la aplicación de este anticuerpo a concentraciones tan bajas como 40 pg/ml, indujo sorprendentemente la muerte celular tanto en células de cáncer (es decir, células MCF-7, SCC1 2b, SCC1 3, CRL- 1 555, PAM212, SP308 y KLN205) asi como en células no cancerosas que fueron empleadas como controles (es decir, células epiteliales de pecho humanas y células PHK y PMK). Más aún , el tratamiento de estas células de cáncer y no cancerosas con el anticuerpo de isotipo IgG de control a las mismas concentraciones (40 pg/ml) también indujo el mismo nivel de muerte celular en ambos tipos de células. Estos datos sugieren una inducción no específica de muerte celular después de la aplicación del anticuerpo. En nuestro laboratorio, aplicar una solución más diluida del anticuerpo que se dirige a los dominios extracelulares EC2-EC5 de E-caderina (una baja dosis de 10-20 pg/ml) indujo muerte celular, aparentemente por apoptosis, en células de cáncer solamente. No observamos efectos adversos sobre células no cancerosas. Más aún, la aplicación del isotipo IgG de control a células no cancerosas a una concentración de 10-20 pg/ml no tuvo efecto detectable sobre viabilidad celular en general. Estas concentraciones entre 1 0-20 pg/ml son ~20-50 veces menores que la concentración usada por Espada et al. (J. Cell Physiol . 21 9 : 84-93 (2009)) . Fo uquet et al. (J . B io l . Chem . 279(41 ) :43061 -43069 (2004)) y Galaz et al. (J. Cell Physiol. 205( 1 ):86-96 (2005)). De acue rdo con esto, esperamos que las presentes formulaciones y preparaciones farmacéuticas puedan hacerse y usarse como formulaciones de baja dosis (por ejemplo, a dosis menores que las sugeridas por Espada y otros en estudios anteriores).

Como se describe antes, la aplicación exógena de 10-20 pg/ml de anticuerpos (monoclonales o policlonales) contra los subdominios EC2-EC5 de E-caderina mató selectivamente un panel representativo de líneas de células de tumor de humano y ratón. También tenemos datos que muestran que tales anticuerpos son citotóxicos para la l ínea de células de colon humana HT29, la línea de células de pulmón humana NCI-H292 y la línea de células de cáncer de pulmón de murino KLN205. Más aún, demostramos que células no cancerosas, incluyendo células epiteliales de pecho humano normales, queratinocitos de humano y ratón normales, fibroblastos 3T3 de ratón y células endoteliales humanas permanecieron sin afectar en nuestros análisis usando que se dirigen a los subdominios a bajas concentraciones. La trayectoria molecular mediante la cual enfoca combinaciones variantes de los dominios extracelulares EC2-EC5 de E-caderina en células de tumor derivadas epiteliales induce la muerte celular, todavía no ha sido dilucidada. Sin embargo, hemos demostrado que células de cáncer moribundas sobre-regularon el marcador pro-apoptótico p53; observamos esta sobre-regulación en las líneas de células de cáncer de pecho MCF-7, SCC de ratón y de pulmón KLN205 de ratón después de tratamiento con anticuerpo contra los dominios de E-cade rina EC 2-EC5.

Como se nota antes, las composiciones de la invención incluyen agentes que enfocan específicamente uno o más de EC2, EC3, EC4 y EC5 de sEcad (pero no EC 1 ). Estos agentes pueden inhibir subsecuentemente sEcad, o pueden ligar, inhibir o secuestrar otro objetivo, tal como un receptor de supervivencia celular, en microambiente de células de tumor. Aunque las presentes composiciones no están limitadas a aquéllas que ejercen su efecto mediante cualquier mecanismo particular, nuestra hipótesis de trabajo es que los agentes de la invención interfieren con la capacidad de sEcad para proporcionar señales benéficas para células de cáncer. Por ejemplo, formulamos la hipótesis de que células de cáncer se crean sEcad en el microambiente donde proporciona un andamio funcional que imita el contacto célula-a-célula normal. De esta manera, de manera real o efectiva remover sEcad del microambiente de tumor perturba la capacidad de células de tumor a permanecer adherentes y sobrevivir. En otros casos, un agente de la invención puede inhibir la actividad sEcad al unirse a un epítopo en sEcad que interactúa con otro objetivo celular (por ejemplo, HER-2), alterando por ello eventos de señalización corriente abajo involucrados en supervivencia celular, proliferación celular, migración celular y/o invasión. De manera alternativa, o adicional, un agente puede no ligarse a epítopo específico requerido para señalización de sEcad, pero puede en su lugar ligar sEcad en cualquier manera que secuestre, etiquete o enfoque para destrucción, disminuyendo por ello su concentración en el microambiente de tumor y hacerla no disponible para imitar interacciones célula-célula o ligarse a receptores celulares. Por ejemplo, los agentes y composiciones pueden reducir derramamiento de sEcad al, por ejemplo, ligarse a E-caderina y bloquear el sitio de corte o bloquear o inhibir de otra manera la liberación de sEcad. De esta manera, una composición o agente, como se describe en la presente, puede enfocar específicamente uno o más de los subdominios EC2-EC5, previniendo de manera efectiva sEcad de proporcionar una o más de las señales que lo que haría de otra manera al interferir con un epítopo específico o al reducir realmente los niveles de sEcad.

Para facilidad de lectura, podemos referirse a un agente que enfoca de manera específica residuos de aminoácidos en uno o más de los subdominios EC2-EC5 de sEcad pero no en el primer subdominío (EC 1 ) de sEcad más simplemente como un agente enfocador. Los agentes enfocadores de la invención pueden ser una andamio de proteína, tal como un dominio de fibronectina modificado o una inmunoglobulina, o un fragmento u otra variante del mismo, que se liga específicamente a residuos de aminoácidos en uno o más de los subdominios EC2-EC5 de sEcad (pero no a EC1 de sEcad). Donde el agente es, o incluye, una proteína (por ejemplo, un andam io de proteína o polipéptido antigénico), podemos referirnos al agente como un terapéutico basado en proteína. Tendemos a usar el término "proteína" para referirnos a pol ímeros de aminoácidos más largos, y tendemos a usar el término "polipéptido" para referirse a secuencias más cortas o a una cadena de residuos de aminoácidos dentro de una molécula o complejo m ás g ra nde . S in em ba rgo, a m bos térm i nos , son pa ra describir una entidad de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos u otros péptido-imitadores, si n importar la modificación post-traducción (por ejemplo, amidación , fosforilación o glicosilación). Los residuos de subunidades de aminoácidos pueden ser enlazados por enlaces de péptido u otros enlaces tales como, por ejemplo, enlaces de éster o éter. Los términos "aminoácido" y "residuo de aminoácido" se refieren a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, los cuales pueden ser isómeros ópticos de forma D o L.

Los anticuerpos anti-sEcad pueden asumir varias configuraciones y abarcar proteínas consistiendo de uno o más polipéptidos substancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Cualquiera de una variedad de estructuras de anticuerpo puede ser usada, incluyendo un anticuerpo intacto, multímeros de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos u otras variantes de los mismos que incluyen regiones de unión a antígeno, funcionales del anticuerpo. Podemos usar el término "inmunoglobulina" de manera sinónima con "anticuerpo". Los anticuerpos pueden ser de origen monoclonal y policlonal. Si n importar la fuente del anticuerpo, anticuerpos adecuados incluyen anticuerpos intactos, por ejemplo, tetrámeros de IgG teniendo dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), anticuerpos de cadena simple, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos injertados con región determinante complementaria (CDR) asi como fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv y anticuerpos recombinantes derivados de tales fragmentos, por ejemplo, camel icuerpos , m i croa nticuerpos , d iacuerpos y a nticuerpos biespecíficos.

Un anticuerpo intacto es u n o que comprende una región variable de unión a antígeno (VH y VL) así como un dominio constante de cadena ligera (CL) y dominios constantes de cadena pesada, CHi , CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencias naturales (por ejemplo, dominios constantes de secuencias naturales humanas) o variantes de secuencias de aminoácidos de los mismos. Como es bien conocido en la técnica , las regiones VH y VL son subdivididas adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas "regiones determinantes de complementariedad" (CDRs), intercaladas con las regiones de marco de trabajo más conservadas (FRs). El grado de las FRs y CDRs ha sido definido (ver, Kabat et al. Sequences of Proteins of I mmunological Interest (Secuencias de proteínas de interés inmunológico), quinta edición, U. S. Department of Health and Human Services, N I H Publication No. 91 -3242 , 1 991 , y Chothia, et al . , J. Mol. Biol. 196:901 -917 (1 987)). El CDR de un anticuerpo normalmente incluye secuencias de aminoácidos que definen juntos la afinidad de unión y especificidad de la región Fv natural de un sitio de unión de inmunoglobulina natural.

Un anticuerpo anti-sEcad puede ser de cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de los mismos (por ejemplo, IgGi , lgG2, lgG3 e lgG4)) y las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa ( I gAi e lgA2), gamma (IgGL lgG2, lgG3, lgG4), delta , épsilon y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina.

El término "porción de unión a antígeno" de una inmunoglobulina o anticuerpo se refiere de manera general a una poción de una inmunoglobulina que liga específicamente a un objetivo, en este caso, un epítopo comprendiendo residuos de aminoácidos dentro o entre uno o más de los subdominios segundo a quinto de sEcad (por ejemplo, dentro de o entre los subdominios cuarto y quinto). Una porción de unión a antígeno de una inmunoglobulina es por lo tanto una molécula en la cual una o más cadenas de inmunoglobulina no son de longitud completa, pero la cual se liga específicamente a un objetivo celular. Ejemplos de porciones de unión a antígeno o fragmentos incluyen : (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistiendo de los dominios VLC, VHC, CL y CH 1 ; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente comprendiendo dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fv consistiendo de los dominios VLC y HVC de un brazo simple de un anticuerpo, y (v) un CDR aislado teniendo marco de trabajo suficiente para ligar específicamente, por ejemplo, una porción de unión a antígeno de una región variable. Una porción de unión a antígeno de una región variable de cadena ligera y una porción de unión a antígeno de una región variable de cadena pesada, por ejemplo, los dos dominios del fragmento Fv, VLC y VHC, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena de prote ína simple, en la cual las regiones de VLC y VH C se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv), ver, por ejemplo, Bird et al. , Science 242:423-426 (1 988); y H uston et al. , Proc. Nati. Acad. Scie. USA 85:5879-5883 (1 988)) . Tales scFvs pueden ser un agente objetivo de la presente invención y son abarcados por el término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo.

Un fragmento "Fv" es el fragmento de anticuerpo m ínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y sitio de unión. Esta región consiste de un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación co-covalente, estrecha. Es en esta configuración que tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. al tiempo que seis regiones hipervariables confieren especificidad de unión a antígeno, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv comprendiendo solo tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque a una menor afinidad que el sitio de unión completo. Para mejorar la estabilidad, los dominios VH-VL pueden estar conectados por un enlazador de péptido flexible, tal como (Gly4Ser)3 para formar un fragmento de anticuerpo Fv o scFV de cadena simple o puede diseñarse para formar un enlace disulfuro al introducir dos residuos de cisteína en las regiones de marco de trabajo para producir un Fv estabilizado con disulfuro (dsFv).

Como se nota, otros formatos de anticuerpo útiles incluyen diacuerpos, minicuerpos y anticuerpos biespecíficos. Un diacuerpo es un homodímero de scFvs que están enlazados covalentemente por un enlazador de péptido corto (aproximadamente aminoácidos o menos). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir formación de pares entre dos dominios en la misma cadena, los dominios pueden ser forzados para emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, EP 404,097 y WO 93/11161 para información adicional con respecto a los diacuerpos). Una variante de diacuerpo, (dsFv)2 o un anticuerpo lineal útil en las presentes composiciones y métodos incluye un par de segmentos Fd en tándem (VH-Ch1-VH-Ch1) que forman un par de regiones de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Zapata et al., Port, Eg. 8:1057 (1995)). Minicuerpos útiles son homodímeros de proteínas de fusión scFv-CH3- En la variante de minicuerpo, el minicuerpo Flex, el scFv es fusionado a la región de gozne de IgG 1 , la cual a su vez, es enlazada a la región CH3 por un enlazador de 10 aminoácidos.

Un anticuerpo biespecífico, el cual reconoce dos diferentes epítopos, también puede usarse siempre y cuando un brazo se una específicamente a sEcad como se describe en la presente. Una variedad de diferentes formatos anticuerpo biespecíficos ha sido desarrollada. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos útiles pueden ser cuadromas, es decir, un anticuerpo intacto en el cual cada par H-L es derivado de un anticuerpo diferente. Normalmente, cuadromas son producidos mediante fusión de dos diferentes hibridomas de células B, seguido por clasificación de las células fusionadas para seleccionar aquéllas que han mantenido la expresión de ambos conjuntos de genes de inmunoglobulina de clonotipo. De manera alternativa, un anticuerpo biespecífico puede ser un anticuerpo recombinante. Formatos ejemplares para anticuerpos biespecíficos incluyen, pero no están limitados a scFvs en tándem , en las cuales dos cadenas simples de diferente especificidad son conectadas vía un enlazador de péptido; diacuerpos y diacuerpos de cadena simple.

Los fragmentos de anticuerpos son adecuados para usarse en los métodos provistos siempre y cuando retengan la especificad deseada del anticuerpo de longitud completa y/o especificidad suficiente para inhibir la supervivencia, proliferación o metástasis de células de cáncer. Así, un fragmento de un anticuerpo anti-sEcad , como se describe en la presente, puede retener la capacidad del anticuerpo intacto para unirse a los subdominios declarados. Estas porciones anticuerpo pueden obtenerse usando técnicas convencionales conocidas por alguien de habilidad ordinaria en la técnica, y las porciones pueden ser clasificadas para utilidad en la m isma manera como anticuerpos intactos son clasificados como agentes anti-cáncer.

Los métodos para preparar fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica y abarcan tanto métodos bioquímicos (por ejemplo, digestión proteolítica de anticuerpos intactos, los cuales pueden ser seguidos por reticulación química) y métodos basados en DNA recombinante, en los cuales las secuencias de inmunoglobulina son diseñadas genéticamente para dirigir la síntesis de los fragmentos deseados. Métodos bioquímicos ejemplares son descritos en las patentes estadounidenses nos. 5,855, 866; 5,877, 289; 5,965, 132; 6,093,399; 6,261 ,535; y 6,004,555. Los ácidos nucleicos que codifican una cadena quimérica o humanizada pueden ser expresados para producir un polipéptido contiguo. Ver, por ejemplo, Cabilly et al. , patente estadounidense no. 4,816,567; Cabilly et al . , patente europea no. 0, 125,023 B1 ; Boss et al. , patente estadounidense no. 4,816,397; Boss et al. , patente europea no. 0, 1 94,276 B 1 , Winter, patente estadounidense no. 5,225,539; y Winter, patente europea no. 0,239,400 B1 . Ver también, Newman et al. , BioTechnology 1 0: 1455-1460 (1 992), con respecto a anticuerpos injertados con CDR y Ladner et al. (patente estadounidense no. 4,946,778) y Bird et al. , Science 242:423-426 (1988)) con respecto a los anticuerpos de cadena simple.

Los fragmentos de anticuerpos pueden ser obtenidos mediante proteólisis de la inmunoglobulina entera mediante la tioproteasa no específica, papaína. La digestión de papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados "fragmentos Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno simple, y un "fragmento Fe" residual. Las diversas fracciones pueden ser separadas mediante cromatografía de intercambio iónico o proteína A-Sepharose. El procedimiento usual para la preparación de fragmentos F(ab')2 de IgG de origen de conejo y humano es limitada por proteólisis por la enzima pepsina. El tratamiento con pepsina de anticuerpos intactos produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y todavía es capaz de reticular antígeno. Un fragmento Fab contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab mediante la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteína(s) de la región de gozne de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 fueron producidos de manera original como pares de fragmentos Fab' que tienen cisternas de gozne entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son conocidos.

También están dentro del alcance de la presente invención métodos para hacer un agente enfocador (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno u otra variante del mismo) que enfoca sEcad al, por ejemplo, ligar específicamente al subdominio segundo, tercero, cuarto o quinto de sEcad (o a un epítopo incluyendo residuos de aminoácidos en dos o más de estos subdominios). Por ejemplo, regiones variables pueden ser construidas usando métodos de mutagénesis de PCR para alterar secuencias de DNA que codifican una cadena de inmunoglobulina (por ejemplo, usando métodos empleados para generar inmunoglobulinas humanizadas; ver, por ejemplo, Kanunan et al. , Nucí. Acids Res. 1 7:5404 (1 989); Sato et al. , Cáncer Research 53:856 (1 993) ; Daugherty et al. , Nucleic Acids Res. 1 9(9) :2471 -2476 (1991 ); y Lewis and Crowe, Gene 1 01 :297-302 ( 1 991 )). Usando estos u otros métodos adecuados, también pueden producirse fácilmente las variantes. Por ejemplo, en una modalidad, las regiones variables clonadas pueden ser mutagenizadas, y las secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas (por ejemplo, a partir de una genoteca de fagos; ver, por ejemplo, Krebber et al. , patente estadounidense no. 5,514,548; y Hoogenboom et al. , WO 93/06213).

Otros métodos adecuados para producir o aislar inmunoglobulinas que reconocen específicamente un objetivo celular como se describe en la presente incluyen, por ejemplo, métodos que se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos (ver, por ejemplo, Jakobovits et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2551 -2555 (1 993); Jakobovits et al. , Nature 362:255-258 ( 1993); Lonberg et al. , patente estadounidense no. 5,545,806; y Surani et al. , patente estadounidense no. 5,545,807).

Como es bien sabido en la técnica, los anticuerpos monoclonales son anticuerpos homogéneos de especificidad antigénica idéntica producida por un clon simple de células productoras de anticuerpos, y anticuerpos policlonales generalmente reconocen diferentes epítopos en el mismo antígeno y son producidos por más de un clon de células productoras de anticuerpos. Cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante simple en el antígeno. El modificador, monoclonal, indica el carácter del anticuerpo como que es obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no va a ser interpretado como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden hacerse mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler et al. , (Nature 256:495 (1 975)) o mediante métodos de DNA recombinante (ver, por ejemplo, patente estadounidense no. 4,816,567). Los anticuerpos monoclonales también pueden ser aislados de genotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas en Clakson et al. (Nature 352:624-628( 1 991 )) y Marks et al. (J . Mol. Biol. 222:581 -597 ( 1 991 )), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales en la presente pueden incluir anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que normalmente tienen una porción de la cadena pesada y/o ligera idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o perteneciente a otra clase o subclase de a nticuerpo, asi como fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (patente estadounidense no. 4,816,567; y Morrison et al. , Proc. Nati. Acad. Sci USA 81 :6851 -6855 (1 984)). Los anticuerpos quiméricos de interés incluyen anticuerpos primatizados comprendiendo secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivados de secuencias de región constante humanas y primate no humano (por ejemplo, sim ios, monos del Viejo Mundo, monos del Nuevo Mundo, prosimios) .

Varios métodos para generar anticuerpos monoclonales (mAbs) son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, los métodos descritos en la patente estadounidense no. 4, 1 96,265, incorporados en la presente por referencia. La mayoría de técnicas de generación de anticuerpos monoclonales estándares generalmente comienzan junto con las mismas líneas como aquéllas para preparar anticuerpos policlonales (Antibod ies : A Laboratory M anua l (Anticuerpos : U n m a n ua l de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ( 1988)). Normalmente, un animal adecuado puede ser inmunizado con un inmunogeno seleccionado para estimular células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como ratones y ratas son animales ejemplares, aunque conejos, borregos, ranas y pollos pueden usarse también. Los ratones pueden ser particularmente útiles (por ejemplo, ratones BALB/c son usados rutinariamente y generalmente dan un mayor porcentaje de fusiones estables).

Siguiendo la inmunización, células somáticas con el potencial de producir los anticuerpos deseados, específicamente linfocitos B (células B), pueden seleccionarse para usarse en generación de MAb y fusión con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que fue inmunizado. Las líneas de células de mieloma adecuadas para usarse en procedimientos de fusión productores de hibridoma normalmente son no productoras de anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias de enzimas que las hacen incapaces entonces de crecer en ciertos medios selectivos, los cuales soportan el crecimiento de solo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Cualquiera de una variedad de células de mieloma puede ser usada, como son conocidas por aquéllos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, donde el animal inmunizado es un ratón, uno puede usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS 1 /1 .Ag 4 1 , Sp21 0-Ag 14, FO, NSO/U , MPC-1 1 , MPC 1 1 -X45-GTG 1 .7 y S 1 94/5XX0 Bul; para ratas, uno puede usar R210. RCY3, Y3-Ag 1 .2.3. , I R983F, 4B21 0 o una de las líneas de células de ratón listadas antes. U-266, GM 500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6, todas pueden ser útiles en conexión con fusiones de células humanas.

Este cultivo puede proporcionar una población de hibridomas a partir de los cuales pueden seleccionarse hibridomas específicos, seguido por dilución serial y clonación en líneas productoras de anticuerpos individuales, las cuales pueden ser propagadas indefinidamente para producción de anticuerpo.

Los métodos para producir anticuerpos monoclonales pueden incluir pasos de purificación , Por ejemplo, en general los anticuerpos pueden ser purificados adicionalmente, por ejemplo, usando filtración, centrifugación y varios métodos cromatog ráficos, tales como HPLC o cromatografía por afinidad, todas esas técnicas bien conocidas para alguien de habilidad ordinaria en la técnica. Estas técnicas de purificación involucran cada una el fraccionamiento para separar el anticuerpo deseado de otros componentes de una mezcla. Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de anticuerpos incluyen, por ejemplo, cromatografía de proteina A-Sepharose y/o proteína G-Sepharose.

Los anticuerpos anti-sEcad de la invención pueden incluir CDRs de una fuente humana o no humana. Anticuerpos "humanizado" son generalmente anticuerpos monoclonales quiméricos o mutantes de ratón, rata, hámster, conejo u otras especies, que portan dominios de región constante y/o variable humanos o cambios específicos. Las técnicas para generar un así llamado anticuerpo "humanizado" son bien conocidas para aquéllos de habilidad e n la técn i ca .

El marco de trabajo de la inmunoglobulina puede ser un marco de trabajo humano, humanizado o no humano (por ejemplo, un marco de trabajo de murino modificado para disminuir la antigenicidad en humanos), o un marco de trabajo sintético (por ejemplo, una secuencia de consenso). Las inmunoglobulinas humanizadas son aquéllas en las cuales los residuos de marco de trabajo corresponden a secuencias de línea germinal humana y las CDRs resultan de recombínación V(D)J y mutaciones somáticas. Sin embargo, las inmunoglobulinas humanizadas también pueden comprender residuos de aminoácidos no codificados en secuencias de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico ex vivo) . Se ha demostrado que mutación somática in vivo de genes variables humanos resulta en mutación de residuos de marco de trabajo (ver Nature Immunol. 2: 537 (2001 )). Tal anticuerpo sería llamado "humano" dada su fuente, a pesar de las mutaciones de marco de trabajo. Los dominios variables de anticuerpo de ratón también contienen mutaciones somáticas en residuos de marco de trabajo (Ver Sem . Immunool. 8: 1 59 (1 996)). En consecuencia, los ratones transgénicos conteniendo el sitio de Ig humana producen inmunoglobulinas que son comúnmente referidas como "completamente humanas", aún cuando poseen un promedio de 4.5 mutaciones de marco de trabajo (Nature Genet. 1 5: 146-56(1997)). Por lo tanto, el uso aceptado indica que un gene de dominio variable de anticuerpo basado en secuencia de línea germinal pero poseyendo mutaciones de marco de trabajo introducidas media nte , por ejemplo, un proceso de mutación somática in vivo, es llamado "humano".

Los anticuerpos humanizados pueden ser diseñados mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo, por ejemplo: (1 ) injertar las regiones determinantes de complementariedad no humanas (CDRs) sobre un marco de trabajo humano y región constante (un proceso referido en la técnica como humanizado), o de manera alternativa, (2) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero proporcionándolos con una superficie similar a humano mediante reemplazo de residuos de superficie (un proceso referido en la técnica como chapado). Los anticuerpos humanizados pueden incluir tanto anticuerpos humanizados como chapados. De manera similar, los anticuerpos humanos pueden hacerse al introducir sitios de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratone, en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena han sido ¡nactivados parcial o completamente. Sobre el reto, se observa la producción de anticuerpos humanos, lo cual asemeja estrechamente lo visto en humanos en todos los aspectos, incluyendo rearreglo de genes, montaje y repertorio de anticuerpos. Esta aproximación es descrita, por ejemplo, en las patentes estadounidenses nos. 5,545,807; 5,545,806, 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995); Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Scie, USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31 (3): 169-217 (194); y Kettleborough, C.A. et al., Protein Eng.4(7):773-83 (1991)).

Además de anticuerpos quiméricos y humanizados, los anticuerpos completamente humanos pueden ser derivados de ratones transgénicos teniendo genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, patentes estadounidenses nos. 6,075,181; 6,091,001; y 6,114,598), o a partir de genotecas de exhibición de fagos de genes de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991), y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). En algunas modalidades, los anticuerpos pueden ser producidos e identificados por genotecas de exhibición de fagos scFv usando métodos estándares conocidos en la técnica.

Los anticuerpos anti-sEcad pueden ser modificados para modular su afinidad de unión a antígeno, sus funciones efectoras o su farmacocinética . En particular, mutaciones aleatorias pueden hacerse en las CDRs y productos clasificados para identificar anticuerpos con mayores afinidades y/o mayores especificidades. Tal mutagénesis y selección es practicada rutinariamente en las técnicas de anticuerpos. Una manera conveniente para generar tales variantes substitucionales es la maduración por afinidad usando exhibición de fagos.

Las tecnolog ías de arrastramiento e implantación de CDR pueden usarse con los anticuerpos provistos en la presente, por ejemplo. El arrastramiento de CDR inserta secuencias de CDR en una región de marco de trabajo específica (Jirholt et al. , Gene 21 5:471 (1 988)). Las técnicas de implantación de CDR permiten combinación aleatoria de secuencias de CDR en un solo marco de trabajo maestro (Soderlind et al. , Immunotech nol. 4:279 (1999); y Soderlind et al. , Nature Biotechnol. 18:852 (2000)). Usando tales técnicas, las secuencias de CDR del anticuerpo anti-sEcad, por ejemplo, pueden ser mutagenizadas para crear una pluralidad de diferentes secuencias, las cuales pueden ser incorporadas en una secuencia de andamio y las variantes de anticuerpos resultantes clasificadas para características deseadas, por ejemplo, mayor afinidad. En algunas modalidades, las secuencias del anticuerpo anti-sEcad pueden examinarse por la presencia de epítopos de células T, como es conocido en la técnica. La secuencia subyacente puede ser cambiada entonces para remover epítopos de células T, es decir, para "desinmunizar" el anticuerpo.

La tecnología recombinante que usa, por ejemplo, tecnolog ía de fagomidos, permite la preparación de anticuerpos teniendo una especificidad deseada a partir de genes recombinantes que codifican un rango de anticuerpos. Ciertas técnicas recombinantes involucran el aislam iento de genes de anticuerpos mediante clasificación inmunológica de genotecas de expresión de fagos de ¡nmunoglobulina de combinación preparadas a partir de RNA aislado a partir de bazo de un animal inmunizado (Morrison et al. , Mt. Sinai J. Med 53: 1 75 ( 1 986); Winter y Milstein , Nature 349:293 (191 ); Barbas et al. , Proc. Nati. Acad. Scie. USA 89:4457 ( 1 992)) . Para tales métodos, las genotecas de fagomidos de ¡nmunoglobulina de combinación pueden prepararse a partir de RNA aislado a partir de bazo de un animal inmunizado, y fagomidos que expresan anticuerpos apropiados pueden ser seleccionados mediante paneo usando células que expresen antígeno y células de control. La ventaja de esta aproximación sobre las técnicas de hibridoma convencionales incluyen aproximadamente 104 veces tantos anticuerpos que pueden ser producidos y clasificados en una sola ronda, y que nuevas especificidades pueden ser generadas por la combinación de cadena H y L, la cual puede incrementar adicionalmente el porcentaje de anticuerpos apropiados generados.

Un método para la generación de n gran repertorio de moléculas de anticuerpo diversas en bacterias utiliza el bacteriófago lambda como el vector (Huse et al. , Science 246: 1 275 ( 1 989)) . La producción de anticuerpos usando el vector lambda involucra la clonación de poblaciones de cadena pesada y ligera de secuencias de DNA en vectores de inicio separados. Los vectores subsecuentemente pueden ser combinados aleatoriamente para formar un solo vector que dirige la co-expresión de cadenas pesadas y ligeras para formar fragmentos de anticuerpos. La técnica general para exhibición de fatos filamentosos es descrita (patente estadounidense no 5,658,727). En un sentido más general, el método proporciona un sistema para la clonación y clasificación simultánea de especificidades de unión a ligando pre-seleccionadas a partir de repertorios de genes de anticuerpos usando un sistema de vector simple. La clasificación de miembros aislados de la genoteca para una capacidad de unión a ligando pre-seleccionado permite la correlación de la capacidad de unión de una molécula de anticuerpo expresada con un medio conveniente para aislar un gene que codifica el miembro de la genoteca. Métodos adicionales para clasificar genotecas de fagomidos son descritos (patentes estadounidenses nos. 5,580,717; 5,427,908; 5,403,484; y 5,223,409).

Un método para la generación y clasificación de genotecas grandes de sitios de combinación de anticuerpos completa o parcialmente sintéticos, o paratopes, utiliza vectores de exhibición derivados de fago filamentoso, tal como M 1 3, fl o fd (patente estadounidense no. 5,698,426, incorporado en la presente por referencia). Los vectores de exhibición de fago filamentoso, referidos como "fagomidos" , producen grandes genotecas de anticuerpos monoclonales ten iendo diversas y novedosas inmunoespecificidades. La tecnolog ía usa un dominio de ancla de membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso como un medio para enlazar gene-producto y gene durante la etapa de montaje de replicación de fago filamentoso, y ha sido usada para la clonación y expresión de anticuerpos a partir de genotecas de combinación (Kang et al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363 (191 ); y Barbas et al. , Proc Nati. Acad. Sci. USA 88:7978 (1991 )). La genoteca de expresión de superficie es clasificada por fragmentos Fab específicos que se unen a moléculas de neuraminidasa mediante procedimientos de aislamiento por afinidad estándares. Los fragmentos Fab seleccionados pueden ser caracterizados al secuenciar los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos después de la amplificación de la población de fagos.

Un método para producir diversas genotecas de anticuerpos y clasificar por especificidades de unión deseables es descrito (patentes estadounidenses nos. 5,667,988 y 5,759,817). El método involucra la preparación de genotecas de moléculas de inmunoglobulina heterodiméricas en la forma de genotecas de fagomidos usando oligonucleótidos y reacciones de extensión de cebadores para incorporar degeneraciones en regiones de CDR de dom inios variables de cadena ligera y pesada variables de inmunoglobulina, y exhiben polipéptidos mutagenizados en la superficie del fagomido. Posteriormente, la proteína de exhibición es clasificada por la capacidad para unirse a un antígeno preseleccionado. Una variación adicional de este método para producir diversas genotecas de anticuerpos y clasificación para especificidades de unión deseables es descrito en la patente estadounidense no. 5,702,892 (incorporada en la presente por referencia). En este método, sol se emplean secuencias de cadena pesada, las secuencias de cadena pesadas son aleatorizadas en todas las posiciones de nucleótidos ya sea la región hipervariable CDRI o CDRI I I , y la variabilidad genética en las CDRs puede ser generada independiente de cualquier proceso biológico.

Además de las genotecas de expresión de fago de inmunoglobina de combinación descritas antes, una aproximación de clonación molecular es preparar anticuerpos a partir de ratones transgénlcos conteniendo genotecas de anticuerpos humanos. Tales técnicas son descritas (patente estadounidense no. 5,545, 807, incorporada en la presente por referencia) . Tales anim ales transgén icos pueden ser empleados para producir anticuerpos humanos de un solo isotipo, de manera más específica un isotipo que es esencial para maduración de células B, tal como Ig M y posiblemente IgD. Otro método para producir anticuerpos humanos se describe en las patentes estadounidenses nos. 5,545,806; 5, 569,825; 5,625, 1 26; 5,633,425; 5,661 ,016; y 5, 770,429, en donde los animales transgénicos son descritos que son capaces de cambiar de un isotipo necesario para desarrollo de células B a otros isotipos.

Las inmunoglobulinas anti-sEcad pueden ser modificadas para reducir o abolir la glicosilación. Una inmunoglobulina que carece de glicosilación puede ser una inmunoglobulina que no sea glicosilada en absoluto; que sea no completamente glicosilada; o que sea atípicamente glicosilada (es decir, el patrón de glicosilación para el muíante difiere del patrón de glicosilación de la inmunoglobulina tipo natural correspondiente) . Los polipéptidos de IgG incluyen una o más mutaciones (por ejemplo, 1 , 2 o 3 o más) que aten úan la glicosilación, es decir, mutaciones que resultan en un dominio CH2 de IgG que carece de glicosilación, no es completamente glicosilada o es atípicamente glicosilada. Las mutaciones del residuo de asparagina en el aminoácido 297 en IgG 1 humana es un ejemplo de tal mutación. La estructura de oligosacárido también puede ser modificada, por ejemplo, al eliminar la porción de fusosa a partir del glicano N-enlazado.

Los anticuerpos también pueden ser modificados para incrementar su estabilidad y/o solubilidad in vivo mediante conjugación a polímeros no de proteína, por ejemplo, polietilenglicol. Cualquier método de PEGilación puede ser usado siempre y cuando el anticuerpo anti-sEcad retenga la capacidad para unirse selectivamente al segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad.

Una amplia variedad de marcos de trabajo o andamios de anticuerpo/inmunoglobulina pueden emplearse, siempre y cuando el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que sea específica para el objetivo, es decir, el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad. Tales marcos de trabajo o andamios incluyen los cinco idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de los mismos (tales como aquéllos descritos en otra parte en la presente), e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, de preferencia teniendo aspectos humanizados. Los anticuerpos de cadena pesada simple, tales como aquéllos identificados en camélidos son de particular interés en este aspecto.

Uno puede generar anticuerpos no basados en inmunoglobulina usando andamios no de inmunoglobulina sobre los cuales las CDRs del anticuerpo de sEcad puede ser injertadas. Cualquier marco de trabajo o andamio no de inmunoglobulina conocido por aquéllos en la técnica puede ser usado, siempre y cuando el marco de trabajo o andamio incluya una región de unión específica para el objetivo. Las moléculas similares a inmunoglobulina incluyen proteínas que comparten ciertas características estructurales con inmunoglobulinas, por ejemplo, una estructura secundaria de lámina ß. Ejemplos de marcos de trabajo o andamios no de inmunoglobulina incluyen, pero no están limitados a, adnectinas (fibronectina) , anquirina, anticuerpos de dominio y Ablynx nv, lipocalina, inmuno-farmacéuticos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc. , Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc. , Moutanin iew, CA), Proteína A y afilina (gamma-cristalina o ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).

Los anticuerpos anti-sEcad de la invención se unen específicamente a un epítopo en el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad (pero no a un epítopo de EC 1 ). Un epítopo se refiere a un determinante antigénico sobre un objetivo que es unido específicamente por el paratope, es decir, el sitio de unión de un anticuerpo. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos generalmente tienen entre aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 aminoácidos contiguos (un epítopo continuo), o alternativamente puede ser un conjunto de aminoácidos no contiguos que definen una estructura particular (por ejemplo, un epítopo conformacional). Así, un epítopo puede consistir de al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 1 0, y al menos 1 2 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar la conformación espacial de aminoácidos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, cristalografía de rayos x y resonancia magnética nuclear bidimensional.

Los métodos para predecir otros epítopos potenciales a los cuales un anticuerpo puede un irse son bien conocidos para aquéllos de habilidad en la técnica e incluyen sin limitación, Análisis de Kyte-Doolittle (Kyte y Dolittle, J. Mol. Biol. 1 57: 1 05-1 32 (1982)). Análisis de Hopp y Woods (Hpp y Woods, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:3824-3828 (1981 ); Hopp y Woods, Mol. Immunol. 20:483-489 ( 1983) ; Hopp, J. Immunol. Methods 88: 1 -18 (1986)), Análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf, Comput. Appl. Biosci. 4: 1 81 -186 ( 1988)) , y Análisis de Emini (Emini et al. , Virology 140: 1 3-20 (1985)). En algunas modalidades, los epítopos potenciales son identificados al determinar dominios extracelulares teóricos. Los algoritmos de análisis, tal como TMpred (ver Hofmann y Stoffel, Biol. Che. 374: 166 (1 993)) o TMHMM (Krogh et al. , J. Mol. Biol. 305(3): 567-580 (2001 )) pueden usarse para hacer tales predicciones. Otros algoritmos, tal como SignalP 3.0 (Bednesten et al. , J. Mol. Biol. 340(4):783-795 (2004)) pueden usarse para predecir la presencia de péptidos de señal y para predecir donde se cortarían esos péptidos de la protema de longitud completa. Las porciones de las proteínas en el exterior de la célula pueden servir como objetivos para interacción de anticuerpo.

Las composiciones de la presente invención incluyen anticuerpos que (1 ) exhiben un nivel de umbral de actividad de unión; y/o (2) no reaccionan cruzado significativamente con moléculas de polipéptido relacionadas conocidas. La afinidad de unión de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica, por ejemplo, mediante análisis de Scatchard. (Scatchard , Ann. NY Acad. Sci. 51 :660-672 ( 1949)).

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-sEcad pueden unirse a sus epitopes objetivo o señuelos imitadores al menos 1 .5-veces, 2-veces, 5-veces, 10-veces, 100-veces, 103-veces, 104-veces, 105-veces, 106-veces o más para el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio objetivo de sEcad diferente a otras proteínas que se predijo tienen alguna homolog ía con el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad.

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-sEcad se unen con alta afinidad de 1 0'4M o menos, 10"7M o menos, 1 0"9M o menos o con afinidad subnanomolar (0.9, 0.8, 0.7 , 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM o incluso menos). En algunas modalidades, la afinidad de unión de los anticuerpos para el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad es al menos 1 x 1 06 Ka. En algunas modalidades, la afinidad de unión de los anticuerpos para el segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad es al menos 5x1 06 Ka, al menos 1 x107 Ka, al menos 2x107 Ka, al menos 1x108 Ka o mayor. Los anticuerpos también pueden ser descritos o especificados en términos de su afinidad de unión al segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de sEcad. En algunas modalidades, las afinidades de unión incluyen aquéllas con una Kd menor que 5x10"2 M, 10~2 M, 5x10"3 M, 10"3 M, 5x10"3 M, 10" M, 5x10" 5 M, 10-5 M, 5x10. -6 M, 10"6 M, 5x10"7 M, 10.7 M, 5x10.8 M, 10'8 M, 5x10. "9 M, 5x10. -10 M, 10"10 M, 5x10"11 M, 10"11 M, 5x10"12 M, 10"12 M, 5x10"13 , 10"13 M, 5x10"14 M, 10"14 M, 5x10"15 M, 10"15 M, o menos.

En algunas modalidades, los anticuerpos no se unen a moléculas de polipéptido relacionadas conocidas; por ejemplo, se unen al segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de un polipéptido de sEcad pero no a polipéptidos relacionados conocidos. Los anticuerpos pueden ser clasificados contra polipéptidos relacionados conocidos para aislar una población de anticuerpo que se une específicamente al segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de un polipéptido de sEcad. Por ejemplo, los anticuerpos específicos a segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de un polipéptido de sEcad fluirán a través de una columna comprendiendo segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de proteínas relacionadas con polipéptido de sEcad (con la excepción de segundo, tercero, cuarto o quinto subdominio de un polipéptido de sEcad) adheridas a matriz insoluble bajo condiciones amortiguadoras apropiadas. Tal clasificación permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales no de reacción cruzada con polipéptidos estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: Un manual de laboratorio, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current so Protocole in Immunology (Protocolos actuales en inmunología), Cooligan et al., (Eds.); National Institutes of Health, John Wiley and Sons, INc, 1995). La clasificación y aislamiento de anticuerpos específicos es bien conocida en la técnica (ver, Fundamental Immunology (Inmunología fundamental), Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. In Immunol.43:1-98 (1988); Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (Principios y práctica), Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamín et al., Ann. Rev. Immunol. 2:67-101, 1984). Ejemplos representativos de tales ensayos incluye: ¡nmunoelectroforesis simultánea, radioinmunoensayo (RIA), radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA), ensayo de dot blot o Western blot, ensayo de inhibición o competencia, y ensayo intercalado.

La capacidad de un anticuerpo particular para matar selectivamente células que expresan e-caderina malignas puede ser evaluada usando, por ejemplo, los métodos descritos en los Ejemplos en la presente.

Los anticuerpos anti-sEcad puede incluir una etiqueta, la cual también puede ser referida como un reportero o marcador (por ejemplo, un marcador detectable). Un marcador detectable puede ser cualquier molécula que esté enlazada covalentemente a anticuerpo anti-sEcad o un fragmento biológicamente activo del mismo que permita valoración cualitativa y/o cuantitativa de la expresión o actividad del péptido etiquetado. La actividad puede incluir una actividad biológica, una actividad físico-química, o una combinación de las mismas. Tanto la forma y posioción del marcador detectable puede variar, siempre y cuando el anticuerpo etiquetado retenga la actividad biológica. Muchos marcadores diferentes pueden ser usados, y la elección de un marcador particular dependerá de la aplicación deseada . Los anticuerpos anti-sEcad etiquetados pueden ser usados, por ejemplo, para valorar los niveles de sEcad en una muestra biológica, por ejemplo, orina, saliva, fluido cerebroespinal , sangre o una muestra de biopsia o para evaluación de la respuesta clínica a terapéuticos de péptido de sEcad.

Marcadores adecuados incluyen, por ejemplo, ligandos de foto-afinidad, radioisótopos, y compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes. Los métodos para introducir marcadores detectables en péptidos son bien conocidos en la técnica. los marcadores pueden ser adicionados durante la síntesis o post-sintéticamente. Los anticuerpos anti-sEcad recombinantes o variantes biológicamente activas de los mismos también pueden ser etiquetados por la adición de precursores etiquetados (por ejemplo, aminoácidos radioetiquetados) al medio de cultivo, en el cual las células transformadas son cultivadas. En algunas modalidades, pueden usarse análogos o variantes de péptidos con el fin de facilitar la incorporación de marcadores detectables. Por ejemplo, cualquier residuo de fenilalanina N-terminal puede ser reemplazado con un aminoácido aromático estrechamente relacionado, tal como tirosina, que puede ser etiquetada fácilmente con 1 25l . En algunas modalidades, los grupos funcionales adicionales que soportan etiquetado efectivo pueden ser adicionados a los fragmentos de un anticuerpo anti-sEcad o variantes biológicamente activas del mismo. Por ejemplo, un grupo 3-tributilestañobenzoilo puede adicionarse al extremo N de la estructura natural; desplazamiento subsecuente del grupo tributilestaño con 125l generará un grupo yodobenzoilo radioetiquetado.

En lugar de adm inistrar un terapéutico de anticuerpo o similar a anticuerpo per se, los presentes métodos también pueden ser realizados al administrar una proteína que provoca la producción de anticuerpos anti-sEcad in vivo. De acuerdo con esto, las composiciones de la invención incluyen fragmentos antigénicos del dominio extracelular de E-caderina en los subdominios EC2-EC5 (ver FIG 1 a y FIG. 1 B). Estos pol ipéptidos pueden se r fus ionad os a u n po l i pépt id o hete rólog o para generar una proteína de fusión inmunogénica. Por ejemplo, un polipéptido de sEcad puede ser fusionado a un fragmento de la proteína de hemaglutinina HA2 de virus de influenza como se describe en la patente estadounidense no. 7,262,270.

También están dentro del alcance de la invención los ácidos nucleicos que pueden ser usados para inhibir la expresión de E-caderina (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o un oligonucleótido que media la interferencia de RNA). Las construcciones de ácido nucleico también pueden ser usadas para expresar fragmentos antigénicos de sEcad in vivo o ex vivo (por ejemplo, en cultivo celular o de tejido).

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" pueden ser usados de manera intercambiable en la presente, y se refieren tanto a RNA como DNA, incluyendo cDNA, DNA genómico, DNA sintético y DNA (o RNA) conteniendo análogos de ácido nucleico. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional. Un ácido nucleico puede ser de doble filamento o filamento simple (es decir, un filamento de sentido o un filamento antisentido). Ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen genes, fragmentos de gene, exones, intrones, RNA mensajero (mRNA) y porciones de los mismos, RNA de transferencia, RNA ribosomal, siRNA, micro-RNA, ribozimas, cDNA, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, DNA aislado de cualquier secuencia, RNA aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico, y cebadores, así como análogos de ácido nucleico. En el contexto de la presente invención, los ácidos nucleicos pu eden cod ifi ca r, por ejem plo , u n anticuerpo , un a nticuerpo muíante o fragmento del mismo o un sEcad o fragmento del mismo.

Un ácido nucleico "aislado" puede ser, por ejemplo, una molécula de DNA que ocurre de manera natural o un fragmento de la misma, siempre que al menos una de las secuencias de ácido' nucleico encontrada normalmente justo flanqueando la molécula de DNA en un genoma que ocurre de manera natural sea removida o esté ausente. Así, un ácido nucleico aislado incluye, sin limitación, una molécula de DNA que existe como una molécula separada, independiente de otras secuencias (por ejemplo, un ácido nucleico químicamente sintetizado, o un cDNA o fragmento de DNA genómico producido mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o tratamiento de endonucleasa de restricción). Un ácido nucleico aislado también se refiere a una molécula de DNA que es incorporada en un vector, un plásmido autónomamente replicante, un virus, o en el DNA genómico de un procariote o eucariote. Además, un ácido nucleico aislado puede incluir un ácido nucleico diseñado, tal como una molécula de DNA que es parte de un ácido nucleico de fusión o híbrido. Un ácido nucleico que existe entre muchos (por ejemplo, docenas, o cientos a millones) de otros ácidos nucleicos dentro de, por ejemplo, genotecas de cDNA o genotecas genómicas, o rebanadas de gel conteniendo una digestión de restricción de DNA genómico, no es un ácido nucleico aislado.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden ser producidas mediante técnicas estándares. Por ejemplo, las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) pueden ser usadas para obtener un ácido nucleico aislado conteniendo una secuencia de nucleótidos descrita en la presente, incluyendo secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido descrito en la presente (es decir, una proteína diseñada). La PCR puede ser usada para amplificar secuencias específicas de DNA así como RNA, incluyendo secuencias del DNA genómico total o RNA celular total. Varios métodos de PCR son descritos en, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cebador de PCR: Un manual de laboratorio), Dieffenbach y Dveksler, eds. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 995. En general, información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá es empleada para diseñar cebadores de oligonucleótidos que sean idénticos o similares en secuencia a filamentos opuestos de la plantilla a ser amplificada. Varias estrategias de PCR también están disponibles, mediante las cuales las modificaciones de secuencias de nucleótidos específicas de sitio pueden ser introducidas en un ácido nucleico de plantilla (como uno puede desear hacer, por ejemplo, cuando se elabora una proteína diseñada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o fragmento del mismo, o una proteína de fusión o fragmento del mismo. Los ácidos nucleicos aislados también pueden ser sintetizados qu ímicamente, ya sea como una molécula de ácido nucleico simple (por ejem plo, usando síntesis de DNA automatizada en la dirección 3' a 5' usando tecnología de fosforamidita) o como una serie de oligonucleótidos. Por ejemplo, uno o más pares de oligonucleótidos (por ejemplo, >50-100 nucleotidos) pueden ser sintetizados que contienen la secuencia deseada, conteniendo cada par un segmento corto de complementariedad (por ejemplo, aproximadamente 1 5 nucleotidos) de m a ne ra q ue se forma una dupla cuando el par de oligonucleótidos es templado. La DNA polimerasa es usada para extender los oligonucleótidos, resultando en una molécula de ácido nucleico de doble filamento, simple, por par de oligonucleótidos, la cual puede ligarse entonces en un vector. Los ácidos nucleicos aislados de la invención también pueden ser obtenidos mediante mutagénesis de, por ejemplo, una porción que ocurre de manera natural de un DNA que codifica proteína diseñada.

Los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, fragmentos antigénicos de sEcad) pueden ser referidos como "exógenos". El término "exógeno" indica que el ácido nucleico o polipéptído es parte de, o codificado por, una construcción de ácido nucleico recombinante, o no está en su ambiente natural. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede ser una secuencia de una especie introducida en otra especie, es decir, un ácido nucleico heterólogo.

Normalmente, tal ácido nucleico exógeno es introducido en la otra especie vía una construcción de ácido nucleico recombinante. Un ácido nucleico exógeno también puede ser una secuencia que es natural para un organismo y que ha sido reintroducida en células de ese organismo. Un ácido nucleico exógeno que incluye una secuencia natural puede ser distinguido frecuentemente de la secuencia que ocurre de manera natural mediante la presencia de secuencias no naturales enlazadas al ácido nucleico exógeno, por ejemplo, secuencias reguladoras no naturales que flanquean una secuencia natural en una construcción de ácido nucleico recombinante. Además, los ácidos nucleicos exógenos establemente transformados normalmente son integrados en posiciones diferentes de la posición donde la secuencia natural es encontrada.

Las construcciones recombinantes también so provistas en la presente y pueden ser usas para transformar células con el fin de expresar un polipéptido, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo muíante o fragmento del mismo, o un sEcad o fragmento de la misma. Una construcción de ácido nucleico recombinante comprende un ácido nucleico que codifica, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o fragmento del mismo, o un sEcad o fragmento del mismo como se describe en la presente, enlazado operablemente a una región reguladora adecuada para expresar la proteína diseñada, por ejemplo, un anticuerpo, un anticuerpo mutante o fragmento del mismo o un sEcad o fragmento del mismo. En algunos casos, una construcción de ácido nucleico recombinante puede incluir un ácido nucleico comprendiendo una secuencia de codificación, un gene, o un fragmento de una secuencia de codificación o gene en una orientación antisentido, de manera que el filamento antisentido de RNA es transcrito. Se apreciará que una variedad de ácidos nucleicos pueden codificar un polipéptido teniendo una secuencia de aminoácidos particular. La degeneración del código genético es bien conocida en la técnica . Para muchos aminoácidos, existe más de una tripleta de nucleótidos que sirve como el codón para el aminoácido. Por ejemplo, los codones en la secuencia de codificación para un fragmento dado de un anticuerpo, un anticuerpo mutante o fragmento del mismo, o una proteína de fusión o fragmento del mismo, puede ser modificado de manera que la expresión óptima en un organismo particular es obtenida, usa ndo tablas de derivación de codón apropiadas para ese organismo.

Vectores conteniendo ácidos nucleicos tales como aquéllos descritos en la presente también son provistos. Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, en el cual otro segmento de DNA puede ser insertado con el fin de originar la replicación del segmento insertado. Los vectores de expresión incluyen vectores de plásmido, vectores virales, y las partículas de amplicón de HSV como se describe en la publicación de solicitud estadounidense no. 2006/0239970 (la cual es incorporada en la presente por referencia). En general, un vector es capaz de replicación cuando se asocia con los elementos de control apropiados. Los esqueletos de vector adecuados incluyen, por ejemplo, aquéllos usados de manera rutinaria en la técnica, tales como plásmidos, virus, cromosomas artificiales, BACs, YACs o PACs. El término "vector" incluye vectores de expresión y clonación, así como vectores virales y vectores de integración . Un "vector de expresión" es un vector que incluye una región reguladora. Vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación , plásmidos y vectores virales derivados de, por ejemplo, bacteriófagos, baculoviruses y retroviruses. Numerosos vectores y sistemas de expresión están comercialmente disponibles de tales corporaciones como Novagen (Madison, Wl), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA).

Los vectores provistos en la presente también pueden incluir, por ejemplo, orígenes de replicación, regiones de unión de andamio (SARs) y/o marcadores. U n g ene m a rcador pued e conferi r u n fenotipo seleccionable en una célula huésped. Por ejemplo, un marcador puede conferir resistencia a biocida, tal como resistencia a un antibiótico (por ejemplo, canamicina, G418, bleomicina o higromicina). Como se nota antes, un vector de expresión puede incluir una secuencia de marbete diseñada para facilitar la manipulación o detección (por ejemplo, purificación o localización) del polipéptido expresado. Las secuencias de marbete, tal como secuencias de proteína fluorescente verde (GFP), glutationa S-transferasa (GST), polihistidina, c-myc, hemaglutinina o marbete FlagMR (Kodak, New Haven , CT) normalmente son expresadas como una fusión con el polipéptido codificado. Tales marbetes pueden ser insertados en cualquier parte dentro del polipéptido, incluyendo en ya sea el extremo carboxilo o amino.

El vector también puede incluir una región reguladora. El término "región reguladora" se refiere a secuencias de nucleótidos que influencian la iniciación y proporción de transcripción y traducción, y estabilidad y/o movilidad de un producto de transcripción o traducción. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitación , secuencias promotoras, secuencias mejoradoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de proteína, elementos inducibles, secuencias de unión a proteína, regiones no traducidas 5' y 3' (UTRs), sitios de inicio de transcripción, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación e intrones.

Como se usa en la presente, el término "enlazado operablemente" se refiere a posicionamiento de una región reguladora y una secuencia a ser transcrita en un ácido nucleico para influenciar la transcripción o traducción de tal secuencia. Por ejemplo, para llevar una secuencia de codificación bajo el control de un promotor, el sitio de iniciación de traducción del marco de lectura de traducción del polipéptido es normalmente posicionado entre uno y aproximadamente cincuenta nucleótidos corriente abajo del promotor. Sin embargo, un promotor puede ser posicionado tanto como aproximadamente 5 , 000 nucleótidos corriente arriba del sitio de iniciación de traducción o aproximadamente 2, 000 nucleótidos corriente arriba del sitio de inicio de transcripción. Un promotor normalmente comprende al menos un promotor de núcleo (basal). Un promotor también puede incluir al menos un elemento de control, tal como una secuencia mejoradora , un elemento corriente arriba o una región de activación corriente arria (UAR). La elección de promotores a ser incluida depende de varios factores, incluyendo pero no limitando a, eficiencia, capacidad de selección, capacidad de inducción, nivel de expresión deseado y expresión preferencial de célula o tejido. Es una cuestión de rutina para alguien de habilidad en la técnica modular la expresión de una secuencia de codificación al seleccionar y posicionar apropiadamente promotores y otras regiones reguladoras en relación a la secuencia de codificación.

También se proporcionan en la presente células huésped. Una célula huésped puede ser, por ejemplo, un procariote, por ejemplo, una bacteria tal como E. coli, o un eucariote, por ejemplo, célula de mamífero, insecto o levadura, que exprese un polipéptido de la presente invención.

Los agentes descritos en la presente que inhiben sEcad pueden ser incluidos en composiciones farmacéuticas que son fisiológicamente aceptables (es decir, suficientemente no tóxicos a ser usados en los métodos terapéuticos y profilácticos descritos en la presente). De acuerdo con esto, la invención caracteriza una variedad de formulaciones, incluyendo cremas tópicas (integradas en pantallas solares) y parces de liberación sostenida para inhibidores de sEcad de entrega transdérmica. En otras modalidades, la composición farmacéutica puede ser formulada como un enjuague oral, gel o emulsión, o como una solución rectal, suspensión o emulsión. Como será evidente para alguien de habilidad ordinaria en la técnica, las formulaciones específicas pueden ser seleccionadas con base en el tipo de cáncer siendo tratado. Por ejemplo, el enjuague oral, gel o emulsión puede ser usado para tratar cáncer en la boca, garganta, esófago o estómago, y la solución, suspensión o emulsión rectal puede usarse para tratar cánceres en el recto o colon.

Los agentes terapéuticos de la invención (por ejemplo, anticuerpos anti-sEcad y otros agentes basados en ácido nucleico o proteína que inhiben sEcad) pueden ser formulados para administración a un paciente con materiales que mejoran su estabilidad y/o proporcionan una liberación controlada o sostenida in vivo. De acuerdo con esto, la invención abarca sistemas de entrega en los cuales un agente específico de sEcad es formulado con micropartículas (por ejemplo, micropartículas poliméricas, tales como micropartículas de poliláctido-co-glicólido) o nanopartículas (por ejemplo, liposomas, nanopartículas de carbohidratos poliméricos, dendrimeros y nanopartículas basadas en carbono).

Otras formulaciones incluyen aquéllas para administración subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial o pulmonar. Como se nota, implantes de liberación sostenida también pueden hacerse y usarse.

Cualquiera de los métodos terapéuticos o profilácticos de la invención pueden incluir un paso para valorar un paciente antes del tratamiento o conforme el tratamiento progresa. Como se nota antes, está bien documentado que sEcad es elevado en la orina y/o suero de pacientes con cáncer de pecho, piel, pulmón, próstata, gástrico y colorrectal, así como otras malignidades epiteliales. Consistente con estudios anteriores sobre los niveles de sEcad, nuestros datos demuestran que sEcad es derramada a bajos niveles de la superficie de células epiteliales normales y a niveles mucho mayores de células de cáncer de piel humanas, células de cáncer de pecho humanas y células de cáncer de pulmón de ratón. Así, los presentes métodos pueden incluir un paso en el cual los niveles de sEcad son determinados de una muestra (por ejemplo, una muestra de orina o sangre) obtenida de un sujeto. Los niveles elevados son una indicación de que un sujeto es un buen candidato para el tratamiento como se describe en la presente, un monitorear sEcad conforme el tratamiento progresa puede ayudar a optimizar la dosificación y programación así como a predecir el resultado. Por ejemplo, el monitoreo puede ser usado para detectar el inicio de resistencia y para distinguir rápidamente los pacientes que responden de los pacientes que no responden. Donde existen signos de resistencia o sin respuesta, un médico puede elegir un agente alternativo o adyuvante antes de que el tumor desarrolle mecanismos de escape adicionales.

Las composiciones comprendiendo dos o más agentes que enfocan específicamente uno o más de los segundo, tercero, cuarto o quinto subdominios de sEcad pueden ser administradas a personas o mamíferos que sufren de, o predispuestos a sufrir de, cáncer. Los anticuerpos anti-sEcad también pueden ser administrados con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico, o quimioterapéutico de cáncer. La administración concurrente de dos o más agentes terapéuticos no requiere que los agentes sean administrados al mismo tiempo o por la misma ruta, siempre y cuando exista un traslape en el periodo de tiempo durante el cual los agentes están ejerciendo su efecto terapéutico. Administración simultánea o secuencias es contemplada, como es la administración en diferentes días o semanas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir, además de un agente enfocador de sEcad, otro anticuerpo terapéutico (o anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos que reconocen un objetivo celular (u objetivos) diferentes de sEcad)). Inmunoglobulinas ejemplares son listadas a continuación. Cada inmunoglobulina es identificada por su nombre apropiado y su nombre comercial. Los números en paréntesis que empiezan con " DB" se refieren a los identificadores para cada anticuerpo en la base de datos DrugBank disponible en la University of Alberta. La base de datos DrugBank se describe en Wishart et al. , Nucí. Acids Res. 36: D901 -906 (2008)) en la red mundial en www.drugbank.ca. I nmunoglobulinas útiles incluyen: Abciximab (ReoPro R) (DB00054), el fragmento Fab del anticuerpo monoclonal de humano-murino quimérico 7E3, la síntesis del cual se describe en EP0418316 (A1 ) y WO 89/1 1 538 (A1 ); Adalimumab (Humira R) (DB00051 ), un anticuerpo monoclonal completamente humano que se une al Factor de necrosis de tumor alfa (TNF-alfa) y bloquea la unión de TNF-alfa uniéndose a su receptor cognado; alemtuzumab (CampathM R) (DB00087), un anticuerpo monoclonal que enfoca CD52, una proteína presente en la superficie de linfocitos maduros, usando en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica (CLL), linfoma de células T cutáneas (CTCL) y linfoma de células T; basiliximab (SimulectMR) (DB00074), un anticuerpo monoclonal de ratón-humano quimérico para la cadena alfa (CD25) del receptor I L-2; bevacizumab (AvastinM R) (DB001 2) un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce y bloquea el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la señal química que estimula la angiogénesis, cuya síntesis es descrita en Presta et al., Cáncer Res., 57:4593-4599 (1997); certuximab (ErbituxMR) (DB00002), un anticuerpo monoclonal quimérico (ratón/humano) que se une a e inhibe el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), cuya síntesis es descrita en la patente estadounidense no. 6,217,866; certolizumab pegol (CimziaMR), un fragmento de Fab' PEGilado de un anticuerpo monoclonal inhibidor de TNF humanizado; daclizumab (ZenapaxMR) (DB00111), un anticuerpo monoclonal humanizado para la subunidad alfa del receptor IL-2; eculizumab (SolirisMR), un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a la proteína complemento de C5 humana; efalizumab (Raptiva R) (DB00095), un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a CD11a; gemtuzumab (MylotargMR)(DB00056) un anticuerpo monoclonal para CD#3 enlazado a un agente citotóxico, cuya secuencia de aminoácidos es descrita en J. Immunol. 148:1149 (1991), y Carón et al., Cáncer.73(3 Suppl):1049-1056 (1994)); ibritumomab tiuxetan (ZevalinMR)(DB00078), un anticuerpo de IgG 1 de ratón monoclonal ibritumomab en conjunción con el quelante tiuxetan y un isótopo radioactivo (itrio90 o indio111); Infliximab (RemicadeMR) (DB00065), un anticuerpo monoclonal de ratón-humano quimérico que se une a factor de necrosis de tumor alfa (TNF-alfa), cuya síntesis es descrita en la patente estadounidense no. 6,015,557; muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3MR), un anticuerpo de lgG2a monoclonal de ratón que se une al complejo CD3-receptor de células T; natalizumab (Tysabri R)(DB00108), un anticuerpo monoclonal humanizado contra la molécula de adhesión celular a4-integrina, cuya secuencia es descrita en Leger et al. , Hum. Antibodies 8(1 ):3- 6 ( 1 997); omalizumab (XolairM R)(DB00043), un anticuerpo monoclonal de IgG 1 k humanizado que se une selectivamente a ¡nmunoglobulina E humana (Ig E); palivizumab (SynagisMR)(DB001 1 0), un anticuerpo monoclonal humanizado (IgG) dirigido contra un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F del Virus sincitial respiratorio (RSV) , cuya secuencia de aminoácidos es descrita en Johnson et al. , J. Infect. Dis. 176(5): 121 5-1224 (1997); panitumumab (VectibixM R), un anticuerpo monoclonal completamente humano para el rector de factor de crecimiento epidérm ico (ta mbién conocid o com o receptor EG F , EG FR , ErbB-1 y HER1 en humanos); ranibizumab (LucentisMR), un fragmento de anticuerpo monoclonal anti-VEG F-A madurado por afinidad derivado del mismo anticuerpo de murino padre como bevacizumab (AvastinMR); rituximab (RituxanMR, MabtheraMR)(DB00073), un anticuerpo monoclonal quimérico contra la proteína CD20, la cual es encontrada principalmente en la superficie de células B; tositumomab (BexxarM R)(DB00081 ), un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD20 covalentemente unido a 1 31 l ; o trastuzumab (Herceptín R)(DB00072) , un anticuerpo monoclonal humanizado que se une selectivamente a la proteína H ER2.

Los anticuerpos pueden incluir bioequivalentes de los anticuerpos aprobados o comercializados (biosímilares) . Un biosimilar puede ser, por ejemplo, un anticuerpo actualmente conocido que tiene la misma secuencia de aminoácidos primarios como es un anticuerpo comercializado, pero uno que puede hacerse en un tipo de célula diferente o mediante un método de producción, purificación o formulación diferentes que el anticuerpo comercializado. En general, cualquier material depositado puede ser usado.

Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir o ser administradas junto con un agente citotóxico, por ejemplo, una substancia que inhibe o previene la función de células y/o causa destrucción de células. Agentes citotóxicos ejemplares incluyen isótopos radioactivos (por ejemplo, 131 l , 125l , 90Y y 1 86Re), agentes quimioterapéuticos y toxinas, tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o toxinas s intéticas , o frag mentos de las mismas. U n age nte no citotóxico se refiere a una substancia que no inhibe o previene la función de células y/o no causa destrucción de células. Un agente no citotóxico puede incluir un agente que puede ser activado para ser citotóxico. Un agente no citotóxico puede incluir una perla, liposoma, matriz o partícula (ver, por ejemplo, publicaciones de patentes estadounidenses 2003/0028071 y 2003/0032995, las cuales son incorporadas por referencia en la presente). Tales agentes pueden ser conjugadas, acopladas, enlazadas o asociadas con un anticuerpo u otro agente enfocador descrito en la presente.

Medicamentos de cáncer convencionales pueden ser administrados con las composiciones descritas en la presente. Medicamentos útiles incluyen agentes anti-angiogénicos, es decir, agentes bloquean la capacidad de tumores para estimular crecimiento de vasos sanguíneos nuevos necesarios para su supervivencia. Cualquier agente anti-angiogénico conocido para aquéllos en la técnica pueden ser usados, incluyendo agentes tales como Bevacizumab (Avastin®, Genentech , Inc.) que bloquean la función de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Otros ejemplos incluyen, sin limitación, Dalteparin (Fragmin®), Suramin ABT-51 0, fosfato de Combretastatin A4, Lenalidomide, LY31 761 5 (Enzastaurin), isoflavona de soya (Genistein; aislado de proteína de soya) AMG-706, anticuerpo anti-VEGF, AZD2171 , Bay 43-9006 (tosilato de sorafenib) , PI-88, PTK787/ZK 222584 (Vatalanib), SU 1 1248 (malato de sunitinib), VEGF-Trap, XL1 84, ZD6474, Talidomina, ATN-161 , EMD 121 974 (Cilenigtide) y Celecoxib (Cele brex®) .

Otros terapéuticos útiles incluyen aquéllos agentes que promueven el daño a DNA, por ejemplo, rupturas de doble filamento en DNA celular, en células de cáncer. Cualquier forma de agente que daña el DNA conocida para aquéllos de habilidad en la técnica puede ser usada. El daño de DNA puede ser producido normalmente mediante terapia de radiación y/o quimioterapia. Ejemplos de terapia de radiación incluyen, sin limitación , terapia de radiación externa y terapia de radiación interna (también llamada braquiterapia) . Fuentes de energía para terapia de radiación externa incluyen rayos x, rayos gamma y haces de partículas; fuentes de energ ía usadas en radiación interna incluyen yodo radioactivo (yodo125 o yodo131) , y de estroncio89, o radioisótopos de fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato o cobalto. Métodos para administrar terapia de radiación son bien conocidos para aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica.

Ejemplos de agentes quimioterapéuticos que dañan el DNA incluyen, sin limitación, Busulfan (Myleran) , Carboplatin (paraplatin), Carmustine (BCNU); clorambucil (Leukeran), cisplatin (PLatinol), Ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar), Dacarbazine (DTIC-Dome) , Ifosfamida (I Fex), Lomuestine (CCNU), Mecloretamina (mostaza de nitrógeno, Mustargen), Melfalan (alkeran) y Procarbazine (Matulane).

Otros agentes quimioterapéuticos de cáncer estándares incluyen, sin limitación, agentes alquilantes, tales como carboplatina y cisplatina; agentes alquilantes de ostaza de nitrógeno; agentes alquilantes de nitrosourea , tal como carmustine (BCNU); antimetabolitos, tal como metotrexato ; ácido fol ín ico ; a nti meta bol itos a n á logos de purina, mercaptopurina; antimetabolitos análogos de pirimidina, tal como fluorouracilo (5-FU) y gemcitabina (Gemzar®); antineoplásticos hormonales, tales como goserelin , leuprolide y tamoxifen; antineoplásticos naturales, tal como aldesleucina, interleucina-2, docetaxel, etopósito (VP-16), interferón alfa, paclitaxel (Taxol®), y tretinoína (ATRA); antineoplásticos naturales antibióticos, tales como bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, daunomicina y mitomicinas incluyendo mitomicina C; y antineoplásticos naturales alcaloides de vinca, tales como vinblastina, vincristina, vindesina; hidroxiurea; aceglatona, adriamicina, ifosfamida, enocitabina, epitiostanol, aclarubicina, ancitabina , nimustina, hidrocloruro de procarbazina, carbocuona, carboplatina, carmofur, cromomicina A3, polisacáridos antitumor, factores de plaquetas antitumor, ciclofosfamida (Cytoxin®), Schizophyllan , citarabina (arabinósido de citosina),dacarbazina, tioinosina, tiotepa , tegafur, dolastatinas, análogos de dolastatina tal como aur¡statina,CPT-1 1 (irinotecan), mitozantrona, vinorelbina, tenipósido, aminopterina, carminomicina, esperamicinas (ver, por ejemplo, patente estadounidense no. 4,675, 1 87), neocarzinostatina, OK-432, Blemoicina, furtulon, broxuridina, busulfan, honvan, peplomicina, bestatina (Ubenimex®), interferón-ß, mepitiostano, mitobronitol, melfalan, péptidos de laminina, lentinan, extracto de Coriolus versicolor, tegafur/uracilo, estramustina (estrógeno/mecloretamina).

Agentes adicionales, los cuales pueden ser usados como terapia para pacientes de cán cer incluye n E PO , G-CS F, g a nciclovi r; antibióticos, leuprolida; meperidina; zidovudina (AZT); interleucinas 1 a 18, incluyendo mutantes y análogos; interferones o citocinas, tales como interferones a, ß y ?, tal como hormona liberadora de hormona luteinizante (LH RH) y análogos y, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH); factores de crecimiento, tales como factgor de crecimiento de transformación ß (TGF-ß), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de nervios (NGF); factor liberador de hormonas de crecimiento (GHRF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor homólogo a factor de crecimiento de fibroblasto (GFGHF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), y factor de crecimiento de insulina (IGF); factor de necrosis de tumor a y ß (TNF-a & ß); factor inhibidor de invasión 2 (I I F-2); proteínas morfogenéticas de hueso 1 -7 (BMP 1 -7); somatostatina; timosina-a-1 ; ?-globulina ; dismutasa de superóxido (SOD); factores de complemento; y factores anti-angiogénesis.

Agentes terapéuticos útiles incluyen, promedicamentos, por ejemplo, precursores o formas derivadas de una substancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica o no citotóxica a células de tumor comparadas con el medicamento padre y es capaz de ser enzimáticamente activada o convertida en un activo o la forma padre más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, Biochemical Society Transactions, 14:375-382 ( 1 986) y Stella et al. , "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery" (Promedicamentos: Una aproximación química a entrega de medicamentos enfocada) , Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed), pp. 247-267 , Humana Press ( 1 985): Los promedicamentos incluyen, pero o están limitados a, promedicamentos conteniendo fosfato, promedicamentos conteniendo tiofosfato, promedicamentos conteniendo sulfato, promedicamentos conteniendo péptido, promedicamentos modificados con aminoácido D, promedicamentos glicosilados, promedicamentos conteniendo b-lactama, promedicamentos conteniendo fenoxiacetamida opcionalmente substituidos o promedicamentos conteniendo fenilacetamida opcionalmente substituidos, 5-fluorocitosina y otros promedicamentos de 5-fluorouridina, los cuales pueden ser convertidos en el medicamento libre citotóxico más activo. Ejemplos de medicamentos citotóxicos que pueden ser derivados en una forma de promedicamento para uso en la presente incluyen, pero no están limitadas a, esos agentes quimioterapéuticos descritos antes.

Cualquier método conocido para aquéllos en la técnica puede ser usado para determinar si una respuesta particular es inducida. Métodos cl ínicos que valoran el grado de un estado de enfermedad particular puede ser usado para determinar si una respuesta es inducida. Los métodos particulares usados para evaluar una respuesta dependerán de la naturaleza del trastorno del paciente, la edad y sexo del paciente, otros medicamentos siendo administrados y el juicio del médico encargado.

Ejemplos Ejemplo 1 : Secuestro de sEcad induce apoptosis en células epiteliales de pecho malignas in vitro, pero no en células epiteliales de pecho humanas normales.

El derramamiento de ectodominio de E-caderina se describió primero por Wheelock et al. (J . Cell Biochem. 34: 187-202 (1987)); quien detectó un fragmento de 80 kDa soluble en los medios de células de cáncer de pecho MCF-7. Desde entonces, el corte de este fragmento de sEcad ha sido descrito en varios tipos de células malignas diferentes in vitro incluyendo células malignas de pecho, piel, ovario, próstata, esófago, colon, pulmón y cerebro (Davies et al. , Clin. Cáncer Res. 7(10): 3289-3297 (2001 ); Gil et al. , Gynecol. Oncol. 1 08(2): 361 -369 (2008); Ito et al. , ONcogene 18(50): 7080-7090 ( 1999); Kantak y Kramer, 1998; Noe et al., J. Cell Scie. 1 14: 1 1 1 -1 18 (2001 ); Ryniers et al. , Biol.

Chem. 383: 1 59-1 65 (2002) ; Symowicz et al. , Cáncer Res. 67(5):2030- 2039 (2007)).

Para determinar si existen diferencias en la localización y derramamiento constitutivo de E-caderina entre células benignas y malignas, manchamos células epiteliales de pecho MCF-1 0A normales y células de cáncer de pecho MCF-7 para visualización de E-caderina mediante microscopía inmunofluorescente. Ambos tipos de células fueron cultivados en portaobjetos de cámara de 4 cavidades (Nunc) en DMEM complementado con 1 0% FBS hasta confluencia. Las células fueron fijadas en 1 00% metanol, se inmunomancharon por E-caderina y se examinaron mediante m icroscopía inmunofluorescencia (aumento x20). Histona H 1 (rojo) (Santa Cruz) se usó para etiquetar núcleos. También analizamos los sobrenadantes para el ectodominio E-caderina mediante ELISA. Medios acondicionados de células MCF-1 0A y MCF-7 confluentes fueron recolectadas y ana lizadas para niveles de sEcad mediante ELISA (R&D Systems), según las instrucciones del fabricante.

Siguiendo la exposición a un anticuerpo monoclonal específico para el su bdominio de E-caderina humano EC1 (SHE78-7, Zymed), se observó E-caderina inmunomanchando en sitos de contacto célula-célula, muy notablemente a lo largo de los l im ites intercelulares dentro de agrupamientos de células en ambas líneas celulares. En contraste, mientras que el ectodominio de E-caderina soluble derramado fue detectado en el medio acondicionado tanto de células MCF-10A y células de cáncer MCF-7 normales, se incrementó notablemente en la linea de células de cáncer MCF-7. Los niveles de sEcad fueron significativamente diferentes para células MCF-1 0A vs MCF-7.

A continuación , células MCF-10A y MCF-7 confluentes se cultivaron en la presencia o ausencia de un anticuerpo dirigido contra el ectodominio de E-caderina (DECMA; 20 pg/ml) o suero pre-inmune (IgG; 20 Mg/ml) durante 48 horas y analizado para apoptosis usando el kit de etiquetado final de mella de biotina-dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. No hubo diferencia apreciable en apoptosis entre células MCF-10A normales que fueron expuestas al anticuerpo anti-sEcad y células de control de isotipo o sin tratar. En contraste, las celias de cáncer MCF-7 tratadas anti-sEcad exhibieron un aumento comercializado en apoptosis celular que no fue evidente en células sin tratar. Para confirmar adicionalmente estos hallazgos, usamos un ensayo ELISA específico de apoptosis que mide fragmentos de DNA asociados a h istona citoplásmicos (mononucleosomas y oligonucleosomas). Los lisados celulares de células MCF-10A y MCF-7 cultivadas en la presencia o ausencia de 20 pg/ml de Ab o Ig anti-sEcad durante 48 horas, fueron analizados por apoptosis usando un ELISA específico de apoptosis para fragmentos de DNA asociados con histona citoplásmicos (Cell Death Detection ELISAP LUS, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados revelaron que el tratamiento anti-sEcad indujo dramáticamente la apoptosis en células MCF-7 pero no tuvo efecto apreciable en células de MCF-1 0A. Los niveles de necrosis no fueron afectadas mediante tratamiento anti-sEcad en cualquier l íneas celular. De manera colectiva, estos resultados muestran que inhibir o secuestrar el ectodom inio de E-caderina derramado del ambiente celular induce selectivamente la apoptosis en células de cáncer de pecho al tiempo que rocía células epiteliales de pecho saludables normales.

Debido a que la activación de p53 conduce a la regulación de transcripción de genes importante para suprimir la tumorigénesis y su acción específica es ejercida principalmente a través del activación de apoptosis (Fuster et al., Trends Mol. Med. 13(5): 92-199 (2007)), a continuación deseamos determinar si p53 juega un papel en esta apoptosis inducida por anti-sEcad. Usando western blotting y un anticuerpo dirigido contra p53, examinamos el efecto de anti-sEcad sobre la expresión de esta proteína pro-apotótica en células MCF-7. Brevemente, 50 g de Usados fueron sometidos a electroforesis sobre geles de gradiente de 4-15% (BioRad), se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) y se inmunomancharon con anti-p53 (Santa Cruz; 1:400) seguido por anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:3,000= y detección de quimioluminiscencia intensificada (ECL). La carga igual de proteína fue verificada mediante manchado con G3PDH. Sobre 20 pg/ml de tratamiento con anti-sEcad, p53 comenzó a incrementarse desde 24 horas y alcanzó un nivel máximo por 48 horas. En contraste, las células no tratadas o células tratadas con el control de isotipo fueron desprovistas de expresión de p53. Debido a que la presencia de p53 en un tumor se correlaciona con una respuesta favorable a quimioterapia, y bajos niveles de p53 confieren resistencia a medicamento en células de cáncer, creemos que inhibir sEcad en el ambiente de tumor puede intensificar la citotoxicidad y disminuir la resistencia que desarrolla con estrategias quimioterapéuticas actuales.

Ejemplo 2: Células de carcinomas de células escamosas de piel humana experimentan apoptosis después de tratamiento de anticuerpo anti-sEcad mientras que se salvan queratinocitos humanos adultos normales.

Para determinar directamente si el derramamiento constitutivo de sEcad difiere en cultivos de queratinocitos epiteliales normales versus carcinomas de células escamosas humanas (SCCs), evaluamos niveles de sEcad en queratinocitos de piel humana primarios normales (PHK) y en dos l íneas de células SCC humanas diferentes (SCC1 2b y SCC 1 3). Células PHK, SCC12b y SCC13 fueron cultivadas a -80% de confluencia, y niveles de sEcad en los sobrenadantes de cultivo fueron examinados mediante ¡nmunomanchado western. Brevemente, 60 µ? de medios acond icionados de cada línea celular fueron sometidos a electoforesis en geles de gradiente 4-1 5% (BioRad), transferidos a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) e ¡nmunomanchado con anti-E-caderina (Santa Cruz; 1 :600) seguido por anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa ( 1 :3000) y detección de quimioluminiscencia intensificada (ECL). Medios acondicionados de células de PHK, SCC 1 2b y SCC 1 3 también fueron recolectadas y analizadas para niveles de sEcad mediante ELISA, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Observamos una expresión incrementada de sEcad en ambas líneas de células SCC mediante western blotting. Esto correspondió a un aumento mayor a 3 veces en los niveles de sEcad en las líneas de células SSC 1 2b y SCC13 sobre las células PHK no cancerosas mediante ELISA.

Para determinar si los anticuerpos anti-sEcad podrían inducir apoptosis en células de cáncer epiteliales diferentes de las células de cáncer de pecho MCF-7 descritas antes, cultivamos células PHK (D033), SCC12b y SCC13 para confluencia en la presencia o ausencia de anti-sEcad (20 pg/ml; DECMA; Sigma) o suero pre-inmune (IgG; "control isotipo") durante 48 horas y se analizaron las células para apoptosis usando el ensayo TUNEL de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Células SCC12b y SCC13 exhibieron un aumento notable en apoptosis cuando se exponen a anti-sEcad, mientras que el tratamiento de PHK normales con este bloqueo, el anticuerpo no exhibió efectos pro-apoptóticos detectables. Usar el ensayo ELISA específico de apoptosis, validamos adicionalmente que el tratamiento de PHK con esta dosis de anti-sEcad no tuvo efectos sobre la apoptosis. Colectivamente, estos datos muestran que el tratamiento anti-sEcad induce selectivamente la apoptosis en dos líneas de células de cáncer de piel humanas diferentes, pero no en cultivos de piel de queratinocitos humanos primarios normales.

Ejemplo 3: SCCs de ratón son susceptibles a apoptosis inducida por anti-sEcad.

Para investigar de manera efectiva un proceso de enfermedad, tal como cáncer de células escamosas, es prudente usar ambas aproximaciones de modelo humano y animal. Por lo tanto, deseamos determinar si tratamiento anti-sEcad induciría selectivamente apoptosis en una línea de células SCC de ratón. Si es así, esto permitiría pruebas adicionales de la eficacia y toxicidad de agentes anti-sEcad in vivo usando un sistema modelo de murino.

Primero determinamos, mediante ELISA, los niveles de sEcad en el medio acondicionado de queratinocitos de ratón primarios (PMK) y una línea de células SCC de ratón (PA 212). Como se espera, el nivel de sEcad en la l ínea de células PAM21 2 fue casi dos veces mayor que cultivos PMK de control. Estos niveles fueron confirmados mediante western blotting; niveles relativos de sEcad fueron dos a tres veces mayores en la línea de células PAM21 2. Así, está claro que, como con las células de cáncer de pecho y piel humanas, el derramamiento constitutivo del ectodominio de E-caderina es estadísticamente mayor en SCC de ratón que en células epiteliales saludables no cancerosas.

Para validar que el tratamiento anti-sEcad es selectivamente citotóxico para SCC de ratón, células PM K y PAM212 fueron cultivadas a confluencia en la presencia o ausencia de un anticuerpo dirigido contra el ectodominio de E-caderina (20 pg/ml DECMA; Sig ma) o suero pre-inmune (IgG) durante 48 horas y se analizaron por apoptosis usando el ensayo TUNEL. Observamos un aumento notable en las células TUNEL-posítivas en la línea de células SCC después de incubación con el anticuerpo de bloqueo, pero sin diferencia apreciabie en los cultivos de PM K.

Estos resultados fueron confirmados mediante un ensayo ELISA específico de apoptosis (el Cell Death Detection ELISAPLU S (Boehringer Mannheim)) que mostró alrededor de un aumento de 2 veces en apoptosis en la línea de células PAM21 2 tratadas con anti-sEcad y sin muerte celular apreciabie en cultivos de PMK. En contraste, los niveles de necrosis no fueron cambiados en todas las condiciones probadas sin importar el tipo celular.

Debido a que demostramos previamente un aumento en los niveles de p53 en células MCF-7 expuestas a 20 pg/ml de anticuerpo anti-sEcad, a continuación determinamos si un aumento similar en p53 estaría presente en células PAM212 cultivadas en la presencia o ausencia de este anticuerpo de bloqueo o suero pre-inmune (IgG) durante 24 y 48 horas. Brevemente, 50 pg de lisados fueron sometidos a electroforesis en geles de gradiente 4-15% (BioRad), transferidos a membranas de difluoruro de poli vinilideno (PVDF) y se inmunomancharon con anti-p53 (Santa Cruz; 1:400) seguido por anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:3,000) y detección de quimioluminiscencia intensificada (ECL). Carga igual de proteína fue verificada mediante manchado con G3PDH. El western blotting demostró un notable aumento en los niveles de p53 por 24 y 48 horas después del tratamiento anti-sEcad, pero sin bandas en controles de IgG de isotipo o sin tratar. Este tiempo de expresión de p53 inducido por anti-sEcad es igual que el encontrado en la línea de células MCF-7, previamente descrito. Por lo tanto, es probable que esta muerte de células de cáncer inducida por anti-sEcad sea vía una trayectoria dependiente de p53, aunque los jugadores corriente abajo exactos todavía no han sido dilucidados.

Ejemplo 4: sEcad de bloque no induce apoptosis en otras células no cancerosas.

Fibroblastos 3T3 de ratón y células endoteliales humanas (HUVEC) fueron cultivados en la presencia o ausencia de Ab anti-sEcad o suero pre-inmune (IgG) durante 24-48 horas y se analizó por apoptosis mediante TUNEL y mediante el ensayo ELISA específico para apoptosis descrito antes. En la presencia del anticuerpo de bloqueo, las células 3T3 exhibieron pocos o nada de núcleos apoptóticos usando el ensayo TUNEL y sin cambio en apoptosis por el ensayo ELISA específico de apoptosis. De manera similar, células HUVEC tratadas con anti-sEcad no exhibieron diferencia apreciable en apoptosis al usar ambas estrategias. Más aún, las células 3T3 y HUVEC no exhibieron estas células en el anticuerpo de bloque de E-caderina.

Ejemplo 5: Terapia mAb anti-sEcad retrasa el inicio de tumor, previene la carga tumoral, y disminuye el grado de tumor in vivo.

Ratones transgénicos MMTV-PyMT vírgenes femeninos, caracterizados por rápido desarrollo de tumores de cáncer de pecho palpable que progresan a adenocarcinomas agresivos con metástasis a los pulmones, fueron usados en este estudio (Guy et al., 1992; Bugge et al., 1998). Iniciando a 48 días de edad, los ratones fueron tratados dos veces a la semana con un anticuerpo monoclonal enfocando el dominio EC-5 de sEcad (a-sEcad; DECMA-1, Sigma Aldrich, 20 pg/200 µ? de solución salina por ratón) o solución salina normal mediante inyecciones i.p. Los ratones fueron sacrificados a 90 días de edad. Todos los ratones MMTV-PyMT tratados con solución salina (control) desarrollaron tumores palpables por 56-60 días, mientras que un retraso estadísticamente significativo en el inicio de tumor fue observado en los ratones tratados (81 -85 días; ver FIG. 2A). Ratones tratados con mAb de EC5 de 90 días de edad, exhibieron menos tumores totales que histopatológicamente fueron determinados como ser moderadamente diferenciados (grado arquitectónico de I I y grado nuclear de I; ver FIG. 2B). En contraste, todos los tumores en ratones tratados con solución salina por 90 días fueron pobremente diferenciados (grado arquitectónico de I II y grado nuclear de I I I , ver FIG . 2C). Los ratones tratados con mAb también exhibieron carga tumoral de peso y volumen total reducida.

En co ncl usió n , nuestros resultados dem uestra n claramente que el tratamiento de anticuerpo anti-sEcad induce la muerte celular en una variedad de líneas celulares cancerosas epiteliales (pecho, piel y pulmón), al tiempo que salvan células epiteliales, fibroblastos y células endoteliales saludables normales adyacentes. Proponemos que las células de cáncer secretan sEcad en el microambiente para imitar artificialmente los contactos célula-célula normales y para proporcionar un andamio funcional con células vecinas adyacentes. Así, al depurar sEcad del microambiente de tumor, alteramos esta capacidad de nutrición del ambiente de células de tumor y activamos las trayectorias moleculares dependientes de p53 involucradas en la muerte celular programada.

Una variedad de modalidades de la invención han sido descritas. No obstante, se entenderá que varias modificaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. De acuerdo con esto, otras modalidades están dentro del alcance de las siguientes reivind icaciones.

Claims (45)

REIVI NDICACION ES

1. Un método para tratar u n paciente que tiene cáncer, comprendiendo el método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que se dirige específicamente a uno o más de los subdom inios segundo, tercero, cuarto o quinto (EC2, EC3, EC4 y EC5, respectivamente) de E-caderina soluble (sEcad) pero no el primer subdominio (EC 1 ) de sEcad.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente enfoca específicamente EC4 y/o EC5.

3. El método de la re ivi nd icación 2 , e n donde e l agente enfoca específicamente EC4.

4. El método de la reivindicación 2 , en donde el agente enfoca específicamente EC5.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es un andamio de proteína.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el andamio de proteína es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a un epítopo comprendiendo residuos de a minoácidos en uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad, pero no en el subdominio EC 1 de sEcad.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, quimérico o humano.

8. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena simple.

9. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o policlonal.

10. El método de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo es la inmunoglobulina clase G (IgG) o inmunoglobulina clase M (IgM).

1 1 . El método de la reivindicación 1 , en donde el agente está etiquetado de manera detectable.

12. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente mata células malignas que expresan E-caderina pero no mata células no malignas.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el agente mata cél ulas m a l ig nas q ue expresan E-caderi n a med ia nte m uerte cel u la r programada, detención de crecimiento, anoikis, necrosis o autofagia.

14. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es administrado en una formulación farmacéutica que está libre de cantidades citotóxicas de cualquier excipiente.

15. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es entregado en una formulación farmacéutica que: (a) produce, sobre administración a un paciente, un nivel de suero del agente de aproximadamente 1 -10 mg/kg , o (b) produce, sobre adición a un cultivo celular, una concentración del agente de aproximadamente 1 -500 pg/ml de medio de cultivo celular.

16. El método de la reivindicación 1 5, en donde el agente farmacéutico produce un nivel de suero de aproximadamente 1 -5 mg/kg en el paciente o una concentración en el medio de cultivo celular de aproximadamente 1 -400 pg/ml.

17. El método de la reivindicación 1 , en donde el agente es entregado en una formulación farmacéutica mediante administración oral, administración intravenosa, administración nasal o inhalación, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración transmucosa o administración transdérmica.

18. El método de la reivindicación 1 , que comprende además el paso de proporcionar una muestra biológica del paciente y que determinar si la muestra incluye un nivel elevado de sEcad u otro biomarcador predictivo para cáncer.

19. El método de la reivindicación 18, en donde la muestra biológica es una muestra de orina, saliva, fluido cerebrospinal, sangre o muestra de biopsia.

20. El método de la reivindicación 18, en donde el paso es realizado antes de administrar el agente y un nivel elevado de sEcad indica que el paciente es un buen candidato para el tratamiento.

21 . El método de la reivindicación 18, en donde el paso es realizado en una o más veces después de adm inistrar el agente y un nivel reducido de sEcad indica que el paciente está respondiendo bien al tratamiento.

22. El método de la reivindicación 1 , que comprende además el paso de administrar un segundo tratamiento de cáncer.

23. El método de la reivindicación 22, en donde el seg undo tratamiento de cáncer comprende administración de un agente quimioterapéutico, un tratamiento de radiación , tratamiento con un anticuerpo o intervención quirúrgica.

24. El método de la reivindicación 1 , en donde el cáncer está dentro de un tejido epitelializado.

25. El método de la reivindicación 1 , en donde el cáncer es un cáncer del canal alimentario, sistema nervioso central, pecho, piel, sistema reproductivo, pulmón o tracto urinario.

26. El método de la reivindicación 25, en donde el cáncer del anal alimentario es un cáncer de la boca, garganta, esófago, estómago, intestino, recto o ano.

27. El método de la reivindicación 25, en donde el cáncer de la piel es carcinoma de células escamosas o melanoma.

28. El método de la reivind icación 25, en donde el cáncer del sistema reproductivo es cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer labial o vulva r, cáncer de próstata , cáncer testicular, o cáncer del tracto genital masculino.

29. Un método para reducir la probabilidad de que un sujeto desarrollará cáncer, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un polipéptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2-EC% de sEcad pero excluye el subdominio de EC1 , o un fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo, o (b) un vector de expresión comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico o el fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo.

30. El método de la reivindicación 29, en donde el polipéptido antigénico comprende una secuencia de aminoácidos de EC4 y/o EC5.

31 . El método de la reivindicación 29, en donde el polipéptido antigénico comprende una secuencia de aminoácidos de EC4.

32. El método de la reivindicación 29, en donde el polipéptido antigénico comprende una secuencia de aminoácidos de EC5.

33. El método de la reivindicación 29, en donde el polipéptido antigénico provoca la producción de anticuerpos que unen específicamente sEcad pero o unen E-caderina expresada por células no malignas en el sujeto.

34. El método de la reivindicación 29, en donde el polipéptido antigénico o el vector de expresión es entregado en una formulación farma céutica med i ante ad m i n istración oral , ad m i ni stración i ntrave nosa , administración nasal o inhalación, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración transm ucosa o administración transdérmica.

35. El método de la reivindicación 29, en donde el cáncer está dentro de un tejido epitelializado.

36. El método de la reivindicación 29, en donde el cáncer es un cáncer del canal alimentario, sistema nervioso central, pecho, piel, sistema reproductivo, pulmón o tracto urinario.

37. El método de la reivindicación 36, en donde el cáncer del canal alimentario es un cáncer de la boca, garganta, esófago, estómago, intestino, recto o ano.

38. El método de la reivindicación 36, en donde el cáncer de la piel es carcinoma de células escamosas o melanoma.

39. El método de la reivindicación 36, en donde el cáncer del sistema reproductivo es cáncer cervical, cáncer uterino, cánc er ovárico, cáncer labial o vulvar, cáncer de próstata, cáncer testicular, o cáncer del tracto genital masculino.

40. Una composición farmacéuticamente aceptable comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de (a) un anticuerpo que liga específicamente un epítopo comprendiendo residuos de aminoácidos en uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad pero no en el subdominio EC1 de sEcad; (b) un polipéptido antigénico que comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2-EC5 de sEcad pero excluye el subdomnio EC 1 , o un frag mento a ntigéni camente activo u otra va ria nte del m ismo ; o (c) un vector de expresión comprendiendo una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido antigénico o el fragmento antigénicamente activo u otra variante del mismo.

41 . Un método para identificar un epítopo en un sEcad, comprendiendo el método: (a) proporcionar un polipéptido comprendiendo sEcad o un fragmento u otra variante del mismo; (b) administrar el polipéptido a un animal; (c) aislar anticuerpos producidos por el animal en respuesta al polipéptido; y (d) exponer células cancerosas a los anticuerpos o a un anticuerpo monoclonal generado a partir de los mismos, en donde la muerte de las células cancerosas indica que el polipéptido comprende un epítopo de sEcad que puede enfocarse o usarse como un agente en el tratamiento de cáncer, profilaxis o imagenolog ía.

42. El método de la reivindicación 41 , en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de los subdominios EC2, EC3, EC4 o EC5 de sEcad pero excluye la secuencia de aminoácidos del subdominio EC1 de sEcad.

43. El método de la reivindicación 42, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos de uno o más de EC4 o EC5.

44. El método de la reivindicación 43, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos confinada a EC4.

45. El método de la reivindicación 43, en donde el polipéptido comprende una secuencia de am inoácidos confinada a EC4. R ES U M E N La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que el direccionamiento de epítopos dentro de uno o más sub-dominios de EC2-EC5 de E-caderina da como resultado la muerte de células tumorales derivadas epiteliales pero no la muerte de células endoteliales sanas, normales o células no epiteliales incluyendo células endoteliales y fibroblastos. Por consiguiente las composiciones de la invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de uno o más sub-dominios de EC2-EC5 de E-caderina y sus variantes biológicamente activas; vectores de expresi ón y cél u la s para expresa r dichos polipéptidos; y agentes (por ejemplo, anticuerpos) que se dirigen a los sub-dominios de EC2-EC5. Los métodos de la invención incluyen métodos para identificar y producir polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos de uno o más de los sub-dom inios de EC2-EC5 de E-caderina o su variante biológicamente activa; métodos para generar agentes, tales como antibióticos, que se dirigen a estos polipéptidos; y métodos para administrar dichos agentes o provocar su producción in vivo para el tratamiento de cánceres epiteliales o reducir los riesgos de su ocurrencia o recurrencia.