KR20140075639A - 암 치료법을 위한 e-카드헤린의 가용성 세포외 도메인의 표적화 조성물 및 관련 방법 - Google Patents

암 치료법을 위한 e-카드헤린의 가용성 세포외 도메인의 표적화 조성물 및 관련 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20140075639A
KR20140075639A KR1020137013383A KR20137013383A KR20140075639A KR 20140075639 A KR20140075639 A KR 20140075639A KR 1020137013383 A KR1020137013383 A KR 1020137013383A KR 20137013383 A KR20137013383 A KR 20137013383A KR 20140075639 A KR20140075639 A KR 20140075639A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
secad
antibody
cells
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020137013383A
Other languages
English (en)
Inventor
사빈 브룩숀
엠. 케리 오'배니언
스테파노스 키르캐나이즈
Original Assignee
더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕 filed Critical 더 리서치 파운데이션 포 더 스테이트 유니버시티 오브 뉴욕
Publication of KR20140075639A publication Critical patent/KR20140075639A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Zoology (AREA)

Abstract

본 발명은 부분적으로, 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인 내 에피토프들의 표적화가 상피-유래 종양 세포의 사멸을 일으키지만 건강한 정상 상피 세포 또는 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하는 비-상피 세포의 사멸을 일으키지 않는다는 발견에 기반한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 생물학적 활성 변이체들; 이러한 폴리펩타이드를 발현하기 위한 발현 벡터 및 세포; 및 EC2-EC5 하위도메인을 표적화하는 제제(예를 들면, 항체)를 포함한다. 본 발명의 방법은 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 생물학적 활성 변이체들을 식별하고 제조하는 방법; 이러한 폴리펩타이드를 표적화하는 항체와 같은 제제의 생성 방법; 및 상피 암을 치료하거나 그의 발생 또는 재발 위험성을 감소시키기 위해 그러한 제제를 투여하거나 이의 in vivo 생산을 야기하는 방법을 포함한다.

Description

암 치료법을 위한 E-카드헤린의 가용성 세포외 도메인의 표적화 조성물 및 관련 방법{COMPOSITIONS TARGETING THE SOLUBLE EXTRACELLULAR DOMAIN OF E-CADHERIN AND RELATED METHODS FOR CANCER THERAPY}
관련 출원에 대한 교차 참고
본 출원은 2010. 10. 27.자로 출원된 미국 가출원 번호 61/407,367을 우선일의 이익을 주장한다. 앞서 출원한 이 가출원의 내용은 본원에 그 전문이 참조 문헌으로 혼입된다.
연방 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 연구비 번호 CA133910 및 ES015832하에 국립보건원(National Institutes of Health) 의 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정 권리를 갖는다.
발명 분야
본 발명의 조성물 및 방법은 세포-세포 접착 단백질 E-카드헤린의 세포외 도메인 표적화에 관한 것이다. 조성물은 항체뿐만 아니라 암 치료의 치료적 및 예방적 방법에 사용될 수 있는 E-카드헤린 세포외 도메인의 항원성 단편과 같은 결합제를 포함한다.
E-카드헤린은 상피 세포-세포 접착의 유지를 돕는 통합 막관통 당단백질이다. E-카드헤린 기능(전장)의 소실은 피부, 폐, 위, 소장 및 유방의 암에서 세포성 탈분화, 증식 및 증가한 침습성을 야기하는는 것으로 나타났다(Brouxhon 등, Cancer Res . 67(16):7654-7664 (2007); Hirohashi, Am . J. Pathol . 153(2):333-339 (1998); Chen 등, Cancer Lett . 201:97-106 (2003)). 또한, 유방암 환자로부터의 생검 샘플에서의 E-카드헤린 염색의 소실은, 불량한 예후 및 짧은 무전이 기간을 수반한다(Pederson 등, Brit . J. Cancer 87:1281-1286 (2002)).
전장 단백질은 EC1-EC5로 명명된 5개 하위도메인으로 이루어진 세포외 도메인, 단일 막관통 영역, 및 세포질 도메인으로 이루어진다(Shiraishi 등, J. Immunol . 175(2):1014-1021 (2005) 참조). 세포막 표면에서 가장 먼 EC1 하위도메인은, 카드헤린-발현 세포(E-, N-, P-, 및 R-카드헤린-발현 세포 포함)에서 발견되는 히스티딘-알라닌-발린(HAV) 삼중자를 함유하며, 상기 하위도메인은 E-카드헤린에 의해 매개되는 세포-세포 접촉 촉진에 필수적인 것으로 여겨진다(Beavon, European J. Cancer 36:1607-1620 (2000)).
전장 E-카드헤린은 막관통 도메인 근처에 다양한 프로테아제에 대한 절단 부위를 함유하며, 상기 부위에서의 절단은 가용성 E-카드헤린(sEcad)으로 불리는 ~80-84 kDa의 가용성 N-말단 펩타이드를 생성한다. sEcad의 배출(shedding)은 자극받지 않은 정상 상피 세포에서는 항상 낮은 수준으로 일어나며, 유방, 피부, 폐, 전립선, 위 및 결직장 암과 같은 상피-유래 종양이 있는 환자에서 높은 수준으로 일어난다(Banks 등, J. Clin . Pathol . 48:179-180 (1995); Baranwal 등, Biochem . Biophys. Res . Com . 384(1):6-11 (2009); Chan 등, Gut 48:808-811 (2001); Charalabopoulos 등, Exp . Oncol . 28(1):83-85 (2006); Kuefer 등, Clin . Cancer Res. 9:6447-6452 (2003); Shirahama 등, J. Dermatol . Sci . 13:30-36 (1996); Velikova 등, Br . J. Cancer 77:1857-1863 (1998)). sEcad의 배출은 또한 비암성 정상 개 신장 세포에서 세포자멸사의 유도 후 증가하는 것으로 보고되었다(Steinhusen 등, J. Biol . Chem . 276:4972-4980 (2001).
sEcad 수준은 암 환자의 소변 또는 혈청에서 증가하고 정상 세포가 세포자멸사를 거칠 때 상승하지만, 상기 배출 단백질의 생물학적 활성은 잘 알려져 있지 않다. 여러 연구들은 sEcad가 정상 상피 세포-세포 접착을 손상시키고, 상피 세포 산란을 유도하며, 종양 세포 증식, 이동, 및 침습을 증강시킨다는 것을 나타내었다(Gil 등, Gynecol . Oncol . 108(2):361-369 (2008); Maretzky 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 102(26):9182-9187 (2005); Marambaud 등, EMBO J. 21(8):1948-1956 (2002); Najy 등, J. Biol . Chem . 283(26):18393-18401 (2008); Noe 등, J. Cell Sci . 114:111-118 (2001); Ryniers 등, Biol . Chem . 383:159-165 (2002); 및 Symowicz 등, Cancer Res . 67(5):2030-2039 (2007)). 이러한 생물학적 기능을 조절하는 신호전달 경로는 여전히 명확하지 않다. SKBr3 유방암 셀라인를 이용한 연구들은 sEcad-HER2 복합체가 정제된 세포외 융합 단백질(Fc-sEcad)의 외인성 부가에 의해 유도되어, 세포외 신호-조절된 키나아제(ERK) 활성화를 일으킴을 나타내었다(Najy 등, J. Biol . Chem . 283(26):18393-18401 (2008)). 인간 EGF 수용체는 여러 상피 종양에서 과발현된 또는 이상조절된(dysregulated) 수용체 티로신 키나아제의 ErbB 또는 HER 패밀리에 속한다(Mendelsohn and Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000); Burgess, Growth Factors 26:263-274 (2008)). 상기 수용체 패밀리는 ERK와 같은 하류-신호전달 분자를 활성화하며, 이는 다시 세포 증식, 이동, 침습 및 신행혈관형성을 포함하는 여러 암 세포 거동을 활성화한다(Hanahan 및 Weinberg, Cell 100:57-70 (2000); Shields 등, Trends Cell Biol . 10:147-154 (2000)). 따라서, 여러 항-EGF 치료법이 개발되었다. 이들은 소분자 티로신 키나아제 억제제, 모노클로날 항체, 및 암 백신이 포함한다(Fukuoka 등, Proc . Am . Soc . Clin. Oncol . 21:292a Abs 1188 (2002); Lage 등, Ann . Med . 35:327-336 (2003); Mateo 등, Immunotechnology 3:71-81 (1997); Slamon 등, N. Engl . J. Med . 344:783-792 (2001); 및 Yu 등, J. Clin . Invest . 110:289-294 (2002)). 이러한 치료 전략은 일부 종양만이 정의된 성숙 단계에서 특정 수용체/항원을 발현하며, 일정한 조직 및 단계의 모든 종양이 표적 수용체/항원을 과발현하는 것은 아니라는 점에서 제한된다(유방암의 20% 내지 50%만이 EGF 수용체를 과발현함). 따라서 이들 유형의 약물에 대한 반응율은 여전히 낮다(Mendelson and Baselga, Oncogene 19:6550-6565 (2000); Ortega 등, Cancer Control 17:7-15 (2010)). 또한, 처음에는 이들 약물에 반응한 종양도 결국 내성을 획득하게 된다(Jackman 등, Clin . Cancer Res . 12:3908-3914 (2006); Ortega 등, Cancer Control 17:7-15 (2010); 및 Riely 등, Clin . Cancer Res . 12:839-844 (2006)).
요약
본 발명은, 부분적으로, 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인 내 에피토프의 표적화가 상피-유래 종양 세포의 사멸을 일으키지만 건강한 정상 상피 세포 또는 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하는 비상피 세포를 임의의 상당한 정도로(예를 들어, 임의의 임상적으로 해로운 정도로) 사멸시키지 않는다는 본 발명자들의 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 생물학적 활성 변이체; 이러한 폴리펩타이드를 발현하기 위한 발현 벡터 및 세포; 및 EC2-EC5 하위도메인들을 표적화하는 제제(예를 들어, 항체)를 포함한다. 본 발명의 방법에는 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 생물학적 활성 변이체의 식별 및 제조 방법; 이러한 폴리펩타이드를 표적화하는 항체와 같은 제제의 생성 방법; 및 상피 암의 치료 또는 이의 발생이나 재발 위험성을 감소시키기 위한 상기 제제의 투여 또는 이의 생체 내 생산을 일으키는 방법을 포함한다. 해석의 용이성을 위해, 매번 생물학적 활성 변이체를 언급하지는 않을 것이다; 본원에 기재된 바와 같이 천연 생성 하나 이상의 E-카드헤린의 EC2, EC3, EC4, 및 EC5 하위도메인에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 제조되고 사용될 수 있는 경우에는, 상기 폴리펩타이드의 생물학적 활성 변이체도 제조되고 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
항-E 카드헤린 항체가 투여되는 방법에는 용량 특이적 치료법을 포함하며, 상기 치료법들은 유방, 폐, 결장, 전립선 및 피부 암뿐만 아니라 다른 상피 암 및 외배엽 유래 조직(예를 들어, 중추신경계, 눈의 수정체들, 뇌 및 감각 신경절 및 신경, 및 두부의 연결 조직)의 암에 대해 선택적으로 지정되고 세포독성일 수 있다. 본원에 개시된 치료 및 예방 방법은 다른 세포독성 치료법(예를 들어, 화학치료법, 호르몬 치료법, 방사선 치료법, 및 항체-기반 치료법(예를 들어, 모노클로날 항-EGF 항체 치료법))과 함께 수행될 수 있다.
따라서 하나의 측면에서, 본 발명은, 특히 sEcad의 제 1 하위도메인(EC1)이 아닌 가용성 E-카드헤린(sEcad)의 하나 이상의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인(각각 EC2, EC3, EC4 및 EC5)을 특이적으로 표적화하는 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 암 환자의 치료 방법을 특징으로 한다. 상기 제제는 EC4 및/또는 EC5를 특이적으로 표적화할 수 있다. 단일 하위도메인(예를 들어, EC4 또는 EC5)을 표적화하는 경우, 상기 제제는 해당 도메인에 국한된 아미노산 잔기에 결합할 수 있다. 상기 제제는 sEcad의 EC1 하위도메인이 아닌 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 또는 EC5 하위도메인의 아미노산 잔기를 포함하는, 항체 또는 이의 단편 또는 다른 변이체와 같은 에피토프에 특이적으로 결합하는 단백질 스캐폴드일 수 있다.
상기 제제가 항체인 경우, 상기 항체는 인간화 된, 키메라, 설치류, 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 제제 또는 항체는 또한 단일쇄 항체일 수 있으며; 상기 제제 또는 항체는 또한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체(예를 들어, IgG 또는 lgM 클래스의 면역글로불린)일 수 있다. 상기 제제의 정확한 성질과 상관 없이, 이는 검출 가능하게 표지될 수 있다(예를 들어, 형광 또는 화학발광 태그 이용).
생물학적 세포에 대한 영향에 있어서, 상기 제제는 악성 E-카드헤린-발현 세포를 죽이지만 비악성 세포는 임의의 유의미하거나 상당한 정도로 죽이지 않는 것임을 특징으로 할 수 있다. 상기 사멸은 프로그램화된 세포 사멸, 성장 정지, 아노이키스(anoikis), 괴사, 자식작용, 또는 세포 사멸을 일으키는 다른 상태를 유도하여 달성될 수 있다.
본 발명의 제제는 세포독성량의 부형제 또는 다른 "비활성" 성분이 없는 약제학적 제형 또는 제조물로 제형화될 수 있다. 보다 구체적으로, 약제학적 또는 약제학적으로 허용가능한 조성물은 경구 투여, 정맥내 투여, 비강 또는 흡입 투여(예를 들어, 흡입제), 근육내 투여, 복강내 투여, 점막관통 투여(예를 들어, 장 또는 질의 내층과 같은 점막 조직으로의 투여를 위해 제형화됨), 또는 경피 투여에 의한 환자에의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 아래에서 용량을 추가 논의하지만, 여기에서 상기 제제가 약 1㎍/mL 내지 약 400㎍/mL의 제제(예를 들어, 약 4㎍/mL 내지 약 20㎍/mL의 제제)를 함유하는 약제학적 제형 중에 전달될 수 있음이 주지된다. 상기 용량은 또한 환자에게 투여 시, 환자의 활성 약제학적 제제의 혈청 수준이 약 1-10mg/kg(예를 들어, 약 1-5mg/kg)이 되도록 하는 정도일 수 있다. 세포 배양에 사용되는 경우, 상기 용량은 배양 배지에 첨가 시, 활성 약제학적 제제가 세포 배양 배지의 약 1-500㎍/mL(예를 들어, 약 1-400㎍/mL)로 존재하는 정도일 수 있다. 당분야에서 인지되는 바와 같이, 용량은 상이한 제형마다 다를 수 있으며, 본 발명의 약제학적 제형 또는 제조물 내의 용량은 제형 중 첨가제의 존재, 부재, 또는 상대량(예를 들어, 제조업체에 의해 공급되는 대로)에 따라 변할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 (a) 환자에게 투여 시 약 1-10mg/kg(예를 들어, 약 1-5mg/kg)의 제제의 혈청 수준을 생성하거나, 또는 (b) 세포 배양에 첨가 시, 세포 배양 배지에서 약 1-500㎍/mL(1-400㎍/mL)의 제제 농도를 생성하는 제제가 약제학적 제형 중에 전달되는 것을 포함한다.
sEcad-표적화제가 투여되는 본 발명의 임의의 방법에 있어서, 상기 방법은 환자로부터의 생물학적 샘플을 제공하고(예를 들어, 표적화제의 투여 전 및/또는 표적화제의 투여 후 일정 시점에) 샘플에 상승된 수준의 sEcad 또는 다른 암에 대한 다른 예측 바이오마커를 포함하는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들면 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 또는 생검 샘플일 수 있다. 이러한 단계가 제제 투여 전에 수행되는 경우, 상승된 수준의 sEcad는 환자가 치료를 위해 우수한 후보임을 나타낼 수 있다. 이러한 단계가 제제의 투여 후 하나 이상의 시점에 수행되는 경우, 감소된 수준의 sEcad는 환자가 치료에 잘 반응하고 있음을 나타낼 수 있다.
본 발명의 임의 방법에 있어서, 제 2 암 치료를 투여할 수도 있다. 예를 들면, 화학치료제, 방사선 치료, 항체(즉, 암 치료에 유용하며 sEcad 이외의 표적에 특이적으로 결합하는 항체)를 이용한 치료, 또는 수술적 개입을 투여할 수 있다.
치료에 순응적인 환자에는 상피화된 조직 내에 암을 갖는 환자가 포함된다. 상기 암은 소화관(예를 들어, 입, 목, 식도, 위, 소장, 직장 또는 항문)의 암, 중추신경계의 암, 유방암, 피부의 암(예를 들어, 편평상피 세포암종 또는 흑색종), 생식계의 암(예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 외음부 또는 음순 암, 전립선암, 고환암, 또는 남성 생식기암), 폐암, 또는 요로암일 수 있다.
상기 방법은 치료 또는 예방적인 것일 수 있다. 따라서 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암이 발생할 가능성을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 이들 방법은 (a) sEcad의 EC1 하위도메인을 제외하고 하나 이상의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항원성 폴리펩타이드, 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체 또는 (b) 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터의 치료적 유효량을 대상체에 투여함으로써 수행될 수 있다. 상기 항원성 폴리펩타이드는 EC4 내에 국한되거나, EC5 내에 국한되거나, EC4 및 EC5 둘 모두의 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항원성 폴리펩타이드는 대상체에서 sEcad에 특이적으로 결합하지만 비악성 세포에 의해 발현되는 E-카드헤린에는 결합하지 않는 항체의 생성을 야기할 수 있다. 이들 방법에 채용되는 항원성 폴리펩타이드 및 발현 벡터는 상술된 제형과 동일하거나 유사한 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들면, 이들은 경구 투여, 정맥내 투여(경구 투여에 비해 바람직할 수 있음), 비강 또는 흡입 투여(예를 들어, 흡입제), 근육내 투여, 복강내 투여, 점막관통 투여, 또는 경피 투여에 의해 전달될 수 있다. 대상체가 직면하는 위험성은 본원에 기재된 임의 유형의 암 발생 위험성일 수 있다. 위험성은 개체군에서의 일반 발생율에 근거한 평균 위험성일 수도 있고, 또는 유전적 소인 또는 조기 암 발생으로 인해 증가된 위험성일 수도 있다. 예를 들면, 항원성 폴리펩타이드 또는 이들을 인코딩하는 벡터는 대상체에 투여되어 상피화된 조직 내의 암; 소화관(예를 들어, 입, 목, 식도, 위, 소장, 직장 또는 항문)의 암, 중추신경계의 암, 유방암, 피부의 암(예를 들어, 편평상피 세포암종 또는 흑색종), 생식계의 암(예를 들어, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 외음부 또는 음순 암, 전립선암, 고환암, 또는 남성 생식기암), 폐암, 또는 요로암의 발생 또는 재발 위험성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 약제 제조의 관점에서 표현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제 제조에서 본원에 기재된 제제 및 조성물의 용도를 포함한다. 특정 구현예에서, 제제 및 조성물의 용도는 암(본원에 기재된 암 유형 포함) 치료를 위한 약제의 제조로 연장된다.
본 발명의 조성물에는 치료적 유효량의 (a) sEcad의 EC1 하위도메인이 아닌 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 또는 EC5 하위도메인의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체; (b) sEcad의 EC1 하위도메인을 제외하고 하나 이상의 EC2-EC5 하위도메인의 아미노산 서열을 포함하는 항원성 폴리펩타이드, 또는 이의 항원 활성 단편 또는 다른 변이체; 또는 (c) 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 항원 활성 단편 또는 다른 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 조성물이 포함된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 sEcad에서 에피토프의 식별 방법을 특징으로 한다. 이들 방법은 특히: (a) sEcad를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 다른 변이체를 제공하고; (b) 폴리펩타이드를 동물에게 투여하고; (c) 폴리펩타이드에 대한 반응으로 동물에 의해 제조되는 항체를 단리하고; (d) 암성 세포를 이들에서 생성된 항체 또는 모노클로날 항체에 노출시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 암성 세포의 사멸은 폴리펩타이드가 암 치료, 예방, 또는 조영에서 제제로 사용되거나 표적화될 수 있는 sEcad의 에피토프를 포함한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 다른 측면으로서, 폴리펩타이드에는 sEcad의 EC1 하위도메인에서의 아미노산 서열을 제외하고 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4, 또는 EC5 하위도메인의 아미노산 서열이 포함될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드에는 하나 이상의 EC4 및/또는 EC5에서의 아미노산 서열(예를 들어, EC4에 국한된 아미노산 서열 또는 EC5에 국한된 아미노산 서열)이 포함될 수 있다.
암 치료법의 개발에 있어서 가장 큰 어려움 중 하나는 암성 세포와 건강한 정상 조직 간을 구별할 수 있는 치료제를 찾는 데 있다. 현재 이용가능한 여러 화학치료법은 비선택적으로 세포독성을 나타내며 좁은 치료 지수를 가져서, 환자를 약화시키고 전체적인 환자 사망률을 높이는 전신성 약물 독성을 야기한다. 따라서 새로운 암 치료제를 위해 매우 바람직한 특성은 건강한 정상 세포 및 조직에 해로운 영향을 미치지 않으면서 암 세포를 선택적으로 표적화하는 능력이다. 본 발명의 조성물은 신호전달 경로에서 임의의 특정 지점에서 세포에 영향을 미치는 것으로 제한되지 않지만, 본 발명의 치료 조성물은 HER2 수용체의 상류에 작용할 것이고, HER2-표적화된 치료보다 광범위한 종류의 하류 표적을 포착할 것이라고 예측된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세 내용을 하기 첨부 도면 및 설명에 나타낸다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 설명 및 도면, 그리고 특허청구범위에서 자명할 것이다.
도 1a는 인간 E-카드헤린의 아미노산 서열(서열 목록 번호: 1)을 나타내며, 세포외 하위도메인 EC2-EC5는 교대로 밑줄쳐서 표시된다(EC2 및 EC4는 두줄로 밑줄치며, EC3 및 EC5는 한줄로 밑줄친다).
도 1b는 나타낸 바와 같이 야생형(wild type) 인간 E-카드헤린과 sEcad의 도식적 표시이다. 가용성 단편의 길이는 변할 수 있고 제 4 또는 제 5 세포외 도메인에서 종결될 수도 있고, 또는 다른 경우에서는 막관통 도메인에서 종결될 수도 있다(예를 들면, [Noe 등, J. Cell Sci . 114(1):111-118, 2000]의 연구를 참조).
도 2a는 실시예 5에 기재된 바와 같은 식염수 또는 α-sEcad의 처리 후 경시적으로 마우스에서 촉진가능한 종양의 수를 나타내는 선 그래프이다.
도 2b는 (실시예 5에 기재된 바와 같은) 식염수-처리 마우스 대 α-sEcad 처리 마우스에서 볼 수 있는 종양을 좌측에 나타내는 사진 패널이다. 수술적으로 제거된 종양을 또한 미처리(식염수) 및 처리(α-sEcad) 마우스 조직의 조직학적 제조물로 나타낸다.
도 2c는 미처리(식염수) 및 처리(α-sEcad) 마우스에서 종양 중량(g) 및 부피(cm3) 차이를 나타내는 한 쌍의 막대 그래프이다.
상세한 설명
아래에 더 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 상피 암 세포 및 비암성 세포 둘 모두의 패널에서 Espada 등(J. Cell Physiol . 219:84-93 (2009)), Fouquet 등(J. Biol . Chem . 279(41):43061-43069 (2004)) 및 Galaz 등(J. Cell Physiol . 205(1):86-96 (2005))에 의해 채용된 DECMA-1 항체를 포함하는 E-카드헤린의 세포외 도메인을 표적화하는 다양한 시판 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 유효성을 시험하였다. 이들 실험을 반복할 때, 40㎍/mL만큼 낮은 농도의 상기 항체의 적용이 놀랍게도 암 세포(즉, MCF-7, SCC12b, SCC13, CRL-1555, PAM212, SP308 및 KLN205 세포들)뿐만 아니라 대조군으로 채용된 비암성 세포(즉, 인간 유방 상피 세포 및 PHK 및 PMK 세포) 모두에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 발견하였다. 또한, 동일한 농도(40㎍/mL)의 대조군 IgG 아이소타입(isotype) 항체를 이용한 이들 암 및 비암성 세포의 처리도 또한 두 유형들의 세포둘 모두에서 동일한 수준의 세포 사멸을 유도하였다. 이러한 데이터는 항체 적용 후 세포 사멸의 비특이적 유도를 제시한다. 본 실험실에서, E-카드헤린의 세포외 도메인 EC2-EC5를 표적화하는 좀더 묽은 항체 용액(10-20㎍/mL의 저용량)의 적용은 암 세포에서만 뚜렷이 세포자멸사에 의해 세포 사멸을 유도하였다. 비암성 세포에 대한 효과들은 관찰되지 않았다. 또한, 10-20㎍/mL 농도로 비암성 세포에 대한 대조군 IgG 아이소타입의 적용은 전반적으로 세포 생활성에 검출가능한 효과를 내지 않았다. 10-20㎍/mL 사이의 이러한 농도는 Espada 등(J. Cell Physiol. 219:84-93 (2009)), Fouquet 등(J. Biol . Chem . 279(41):43061-43069 (2004)) 및 Galaz 등(J. Cell Physiol . 205(1):86-96 (2005))에 의해 사용되는 농도보다 ~20-50배 더 낮다. 따라서, 본 발명의 약제학적 제형 및 제조물은 저용량 제형(예를 들어, Espada 및 다른 선행 연구들에서 제시된 것보다 낮은 용량의)으로 제조 및 사용될 수 있다고 예측된다.
상술된 바와 같이, E-카드헤린의 EC2-EC5 하위도메인에 대한 10-20㎍/mL 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)의 외인성 적용은 인간 및 마우스 종양 셀라인의 대표적 패널을 선택적으로 사멸시켰다. 본 발명자들은 또한 상기 항체가 HT29 인간 결장 셀라인, NCI-H292 인간 폐 셀라인, 및 KLN205 설치류 폐암 셀라인에 대한 세포독성이 있다는 것을 보여주는 데이터가 있다. 또한, 정상 인간 유방 상피 세포, 정상 인간 및 마우스 케라틴 생성 세포, 마우스 3T3 섬유아세포 및 인간 내피 세포를 포함하는 비암성 세포는 저농도로 하위도메인을 표적화하는 항체를 이용하는 본 발명의 분석에서 영향받지 않고 유지됨을 나타내었다. 상피-유래 종양 세포 내 E-카드헤린의 EC2-EC5 세포외 도메인의 다양한 조합의 표적화가 세포 사멸을 유도하는 분자적 경로는 아직 규명되지 않았다. 그러나 본 발명자들은 죽어가는 암 세포에서 친-아폽토시스 마커 p53이 상향조절되었음을 나타내었다; EC2-EC5 E-카드헤린 도메인에 대한 항체의 처리 후 MCF-7 유방암, 마우스 SCC 및 마우스 KLN205 폐암 셀라인에서 이러한 상향 조절을 관찰하였다.
전술된 바와 같이, 본 발명의 조성물에는 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 및 EC5(EC1 제외)를 특이적으로 표적화하는 제제가 포함된다. 이들 제제는 종양 세포 미세환경에서, 이어서 sEcad를 억제하거나, 또는 세포 생존 수용체와 같은 다른 표적에 결합하거나, 이를 억제하거나, 격리할 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 특정 기전으로 이의 효과를 발현하는 것에 제한되지 않지만, 본 발명에서의 가설은 본 발명의 제제가 암 세포에 유리한 신호를 제공하는 sEcad의 능력을 방해한다는 것이다. 예를 들면, 암 세포는 미세환경 내로 sEcad를 분비하여 정상 세포-대-세포 접촉을 모방하는 기능적 스캐폴드를 제공한다고 가정하였다. 따라서, 종양 미세환경으로부터 sEcad의 실질적 또는 효과적 제거는 종양 세포가 접착성으로 남아 생존하는 능력을 교란한다. 다른 예들에서, 본 발명의 제제는 다른 세포성 표적(예를 들어, HER-2)과 상호작용하는 sEcad 상 에피토프에 결합하여 sEcad 활성을 억제함으로써, 세포 생존, 세포 증식, 세포 이동 및/또는 침습에 관여하는 하류 신호전달 이벤트를 변형시킬 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제제는 sEcad 신호전달에 필요한 특정 에피토프에 결합하지 않을 수 있지만 대신에 파괴를 위해 이를 격리하거나 태그화하거나 표적화하는 방식으로 sEcad에 결합하여, 종양 미세환경에서 그 농도를 낮추고 세포-세포 상호작용을 모방하지 못하게 하거나 세포성 수용체에 결합하지 못하도록 할 수 있다. 예를 들면, 제제 및 조성물은, 예를 들면 E-카드헤린에 결합하고 절단 부위를 차단하거나 또는 다른 방식으로 sEcad의 방출을 차단 또는 억제하여 sEcad 배출을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 제제는, 하나 이상의 EC2-EC5 하위도메인을 특이적으로 표적화하여, 특정 에피토프를 방해하거나 sEcad 수준을 실제로 감소시킴으로써, sEcad가 하나 이상의 신호를 달리 제공하는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.
해석의 용이성을 위해, sEcad의 제 1 하위도메인(EC1)이 아닌 하나 이상의 sEcad의 EC2-EC5 하위도메인에서의 아미노산 잔기를 특이적으로 표적화하는 제제를 더 간단히 표적화제로 언급할 수 있다. 본 발명의 표적화제는 하나 이상의 sEcad의 EC2-EC5 하위도메인(sEcad의 EC1은 아님)에서 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는, 개질된 피브로넥틴 도메인 또는 면역글로불린과 같은 단백질 스캐폴드, 또는 이의 단편 또는 다른 변이체일 수 있다. 상기 제제가 단백질이거나 이를 포함하는 경우(예를 들어, 단백질 스캐폴드 또는 항원성 폴리펩타이드), 상기 제제를 단백질-기반 치료제로 부를 수 있다. "단백질"이라는 용어를 사용하여 더 긴 아미노산 중합체를 나타내고, "폴리펩타이드"라는 용어를 사용하여 더 짧은 서열 또는 더 큰 분자 또는 복합체 내 아미노산 잔기쇄를 나타내려고 한다. 그러나 이들 두 용어는 모두 번역 후(post-translational) 개질(예를 들어, 아미드화, 인산화 또는 글리코실화)과 무관하게 둘 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩타이드 모사체의 엔터티를 나타내려는 것이다. 상기 서브유닛 아미노산 잔기는 펩타이드 결합 또는 다른 결합, 예컨대 에스테르 또는 에테르 결합에 의해 연결될 수 있다. "아미노산" 및 "아미노산 잔기"라는 용어는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 나타내며, 이들은 D- 또는 L-형 광학 이성질체일 수 있다.
항-sEcad 항체는 다양한 구성들을 상정하고 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 폴리펩타이드로 이루어진 단백질을 포함할 수 있다. 항체의 기능적, 항원 결합 영역을 포함하는 온전한 항체, 항체 다량체, 또는 항체 단편 또는 이의 다른 변이체를 포함하는 임의의 다양한 항체 구조가 사용될 수 있다. "면역글로불린"이라는 용어를 "항체"와 동의어로 사용할 수 있다. 항체는 기원 상 모노클로날(monoclonal) 또는 폴리클로날(polyclonal)일 수 있다. 항체의 출처와 무관하게, 적합한 항체는 온전한 항체, 예를 들면 2 중(H)쇄 및 2 경(L)쇄를 갖는 IgG 사량체, 단일쇄 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 상보 결정 영역(CDR)-그라프트 항체뿐만 아니라 항체 단편, 그 예로 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, 및 이러한 단편에서 유래한 재조합 항체, 그 예로 카멜바디, 마이크로항체, 디아바디 및 이중특이적 항체를 포함한다.
온전한 항체는 항원-결합 가변 영역(VH 및 VL)뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 당분야에서 널리 공지된 바와 같이, VH 및 VL 영역은 더 보존된 틀 영역들(FRs) 사이에 배치된 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 불리는 고가변성 영역으로 더 세분된다. FRs 및 CDRs의 범위는 정의되어 있다(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, 미국 Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991, 및 Chothia, 등, J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987) 참조). 항체의 CDR에는 전형적으로 천연 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화도 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열이 포함된다.
항-sEcad 항체는 임의 클래스의 면역글로불린, 예를 들면 IgA, IgG, IgE, IgD, IgM(뿐만 아니라 이의 아형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4))에서 얻을 수 있으며, 면역글로불린의 경쇄는 카파 또는 람다 유형의 것일 수 있다. 인지된 인간 면역글로불린 유전자에는 카파, 람다, 알파(IgA1, 및 lgA2), 감마(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 수많은 면역글로불린 가변 영역 유전자가 포함된다.
면역글로불린 또는 항체의 "항원-결합부"라는 용어는 일반적으로 표적에 특이적으로 결합하는 면역글로불린의 일부, 이 경우에는 하나 이상의 sEcad의 제 2 내지 제 5 하위도메인 내 또는 이들 사이(예를 들어, 제 4 및 제 5 하위도메인 내 또는 이들 사이)의 아미노산 잔기들을 포함하는 에피토프를 나타낸다. 따라서 면역글로불린의 항원-결합부는 하나 이상의 면역글로불린쇄가 전장이 아니지만 세포성 표적에 특이적으로 결합하는 분자이다. 항원-결합부 또는 단편의 예에는 하기가 포함된다: (i) Fab 단편, VLC, VHC, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디설파이드드 가교로 연결된 두 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) 항체의 단일 팔의 VLC 및 VHC 도메인으로 이루어진 Fv 단편, 및 (v) 특이적으로 결합하는 충분한 틀을 갖는 단리된 CDR, 그 예로 가변 영역의 항원 결합부. 경쇄 가변 영역의 항원-결합부 및 중쇄 가변 영역의 항원-결합부, 그 예로 Fv 단편의 두 도메인, VLC 및 VHC는 VLC 및 VHC 영역이 짝을 이뤄 1가 분자들을 형성하는 단일 단백질쇄(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 그 예로 Bird 등, Science 242:423-426 (1988); 및 Huston 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:5879-5883 (1988) 참조)로 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 연결될 수 있다. 이러한 scFv는 본 발명의 표적화제일 수 있고, 항체의 "항원-결합부"라는 용어에 포함된다.
"Fv" 단편은 전체 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단히 공유 결합된 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인 이량체로 이루어진다. 이 구성에서는, 각각의 가변 도메인의 세 고가변 영역이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원-결합 부위를 정의한다. 6개의 고가변 영역이 항원-결합 특이성을 부여하지만, 단일 가변 도메인(또는 항원에 대해 특이적인 3 고가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)이라도, 전체 결합 부위에 비해 더 낮은 친화도일지라도 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다. 안정성을 개선하기 위해, VH-VL 도메인은 가요성 펩타이드 링커, 예컨대 (Gly4Ser)3에 의해 연결되어 단일쇄 Fv 또는 scFV 항체 단편을 형성하거나 틀 영역들에 두 시스테인 잔기를 도입함으로써 디설파이드 결합을 형성하도록 조작되어 디설파이드드로 안정화된 Fv(dsFv)를 생성할 수 있다.
주지되는 바와 같이, 다른 유용한 항체 형식에는 디아바디, 미니바디 및 이중특이적 항체가 포함된다. 디아바디는 짧은 펩타이드 링커(약 5 아미노산 이하)로 공유 연결된 scFvs들의 동종이량체이다. 동일한 쇄에서 두 도메인 간 짝 형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인들은 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 이루어 두 항원 결합 부위를 생성하도록 유도된다(그 예로, 디아바디에 관한 추가 정보에 대해서는 EP 404,097 및 WO 93/11161 참조). 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 디아바디 변이체, (dsFv)2 또는 선형 항체에는, 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 일렬 Fd 절편(VH-CH1-VH-CH1)이 포함된다(예를 들어, Zapata 등, Prot . Eng . 8:1057 (1995) 참조). 유용한 미니바디로는 scFv-CH3 융합 단백질의 동종이량체가 있다. 미니바디 변이체인 Flex 미니바디에서, scFv는 IgG1의 힌지 영역으로 융합되고, 이는 다시 10-아미노산 링커에 의해 CH3 영역으로 연결된다.
상이한 두 에피토프를 인지하는 이중특이적 항체도 한 팔이 본원에 기재된 sEcad에 특이적으로 결합하는 한 사용될 수 있다. 여러 상이한 이중특이적 항체 형식이 개발되었다. 예를 들면, 유용한 이중특이적 항체는 퀘드로마(quadroma), 즉 각각의 H-L 쌍이 상이한 항체에서 유래된 온전한 항체일 수 있다. 전형적으로, 퀘드로마는 상이한 두 B 세포 하이브리도마의 융합 후, 융합된 세포를 스크리닝하여 두 세트의 클론형 면역글로불린 유전자 발현을 유지하는 것을 선택하여 제조된다. 대안적으로, 이중특이적 항체는 재조합 항체일 수 있다. 이중특이적 항체의 예시적 형식에는 비제한적으로 상이한 특이성의 두 단일쇄가 펩타이드 링커를 통해 연결되는 일렬 scFvs; 디아바디 및 단일쇄 디아바디가 포함된다.
항체 단편은 이들이 원하는 전장 항체의 특이성 및/또는 암 세포 생존, 증식, 또는 전이를 억제하기 충분한 특이성을 보유하는 한, 제공되는 방법에 사용하기 적합하다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 항-sEcad 항체의 단편은 언급된 하위도메인에 결합하는 온전한 항체의 능력을 보유할 수 있다. 이들 항체부는 당업자에게 공지된 통상적 기법을 이용하여 수득될 수 있으며, 그 부는 온전한 항체가 항암제로서 스크리닝되는 것과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
항체 단편의 제조를 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며 생화학적 방법(예를 들어, 온전한 항체의 단백분해 소화에 이어 화학적 가교가 뒤따를 수 있음) 및 면역글로불린 서열이 원하는 단편을 합성하도록 유전적으로 조작되는 재조합 DNA-기반 방법 둘 다가 포함된다. 예시적 생화학적 방법은 미국 특허 번호 5,855,866; 5,877,289; 5,965,132; 6,093,399; 6,261,535; 및 6,004,555에 기재되어 있다. 키메라 또는 인간화 사슬을 인코딩하는 핵산은 인접한 폴리펩타이드를 생성하도록 발현될 수 있다. [Cabilly 등, 미국 특허 번호 4,816,567; Cabilly 등, 유럽 특허 번호 0,125,023 B1; Boss 등, 미국 특허 번호 4,816,397; Boss 등, 유럽 특허 번호 0,120,694 B1; Neuberger 등, WO 86/01533; Neuberger 등, 유럽 특허 번호 0,194,276 B1; Winter, 미국 특허 번호 5,225,539; 및 Winter, 유럽 특허 번호 0,239,400 B1]을 참조하라. 또한 CDR-그라프트 항체에 대해서는 [Newman 등, BioTechnology 10:1455-1460 (1992)]을, 그리고 단일쇄 항체에 대해서는 [Ladner 등 (미국 특허 번호 4,946,778) 및 Bird 등, Science 242:423-426 (1988))]를 참조하라.
항체 단편은 비특이적 티올프로테아제인 파파인에 의한 전체 면역글로불린의 단백분해에 의해 수득될 수 있다. 파파인 소화는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 "Fab 단편"으로 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 및 잔여 "Fc 단편"을 생성한다. 다양한 분획은 단백질 A-세파로오스 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 토끼 및 인간 기원 IgG로부터 F(ab')2 단편의 제조를 위한 일반적 절차는 효소 펩신에 의한 단백분해로 제한된다. 온전한 항체의 펩신 처리는 두 항원 조합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성한다. Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 첫번째 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역에서 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에서 몇몇 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 다르다. F(ab')2 항체 단편은 원래 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 제조되었다. 다른 항체 단편의 화학적 커플링이 공지되어 있다.
예를 들면 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에(또는 둘 이상의 이들 하위도메인의 아미노산 잔기를 포함하는 에피토프에) 특이적으로 결합함으로써 sEcad를 표적화하는 표적화제(예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 이의 다른 변이체)의 제조 방법이 또한 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들면, 가변 영역은 면역글로불린쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 변형하는 PCR 돌연변이화 방법을 이용하여(예를 들어, 인간화 면역글로불린들을 생성하는데 채용되는 방법을 이용하여; 예로 Kanunan 등, Nucl . Acids Res . 17:5404 (1989); Sato 등, Cancer Research 53:851-856 (1993); Daugherty 등, Nucleic Acids Res. 19(9):2471-2476 (1991); 및 Lewis 및 Crowe, Gene 101:297-302 (1991) 참조) 구축될 수 있다. 이들 또는 다른 적합한 방법을 이용하여, 변이체도 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들면 하나의 구현예에서, 클로닝된 가변 영역이 돌연변이화될 수 있고, 원하는 특이성을 갖는 변이체를 인코딩하는 서열이 선택될 수 있다(예를 들어, 파지 라이브러리로부터; 예로 Krebber 등, 미국 특허 번호 5,514,548; 및 Hoogenboom 등, WO 93/06213 참조).
본원에 기재된 바와 같은 세포성 표적을 특이적으로 인지하는 면역글로불린의 제조 또는 단리의 다른 적합한 방법에는, 예를 들면 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자삽입 동물들(예를 들어, 마우스)의 면역화에 의존하는 방법이 포함된다(예를 들어, Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:2551-2555 (1993); Jakobovits 등, Nature 362:255-258 (1993); Lonberg 등, 미국 특허 번호 5,545,806; 및 Surani 등, 미국 특허 번호 5,545,807 참조).
당분야에서 널리 공지된 바와 같이, 모노클로날 항체는 단일 클론의 항체-생성 세포에 의해 제조되는 동일한 항원 특이성의 균질한 항체이며, 폴리클로날 항체는 일반적으로 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인지하고 하나 이상의 클론의 항체 생성 세포에 의해 생성된다. 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지정된다. 수식어(modifier)인 모노클로날이란 항체의 특징이 실질적으로 균질한 항체군에서 수득되는 것임을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 간주되지 않는다. 예를 들면, 모노클로날 항체는 Kohler 등이 최초로 설명한 하이브리도마 방법(Nature 256:495 (1975)) 또는 재조합 DNA방법(예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한, 예를 들면 Clackson 등(Nature 352:624-628 (1991)) 및 Marks 등(J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991))에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.
본원의 모노클로날 항체에는 키메라 항체, 즉 전형적으로 특정종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응 서열과 동일하거나 상동성을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄 일부를 가지고, 나머지 쇄(들)은 이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체뿐만 아니라 이들 항체의 단편들의 대응 서열과 동일하거나 상동성을 갖는 항체가 포함될 수 있다(미국 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). 관심 키메라 항체에는 비인간 영장류(예를 들어, 유인원, 광비류, 원원류) 유래의 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 영장류화 항체가 포함된다.
모노클로날 항체(mAbs)들을 생성하기 위한 다양한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예로, 본원에 참조로 혼입되는 미국 특허 번호 4,196,265에 기재된 방법을 참조하라. 가장 표준인 모노클로날 항체 생성 기법은 일반적으로 폴리클로날 항체의 제조를 위한 것과 동일한 셀라인와 함께 시작된다(Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988)). 전형적으로, 적합한 동물은 선택된 면역원으로 면역화되어 항체-생성 세포를 자극할 수 있다. 마우스 및 래트와 같은 설치류들이 예시적 동물이지만, 토끼, 양, 개구리, 및 닭도 이용될 수 있다. 마우스가 특히 유용할 수 있다(예를 들어, BALB/c 마우스가 일상적으로 사용되며, 일반적으로 더 높은 비율의 안정한 융합체를 제공한다).
면역화 후, 원하는 항체, 특히 B 림프구(B 세포)를 생성할 가능성이 있는 체세포가 MAb 생성 및 불멸 골수종 세포, 일반적으로 면역화된 동물과 동일한 종의 세포와의 융합에 사용하기 위해 선택될 수 있다. 하이브리도마-생성 융합 절차에 사용하기 적합한 골수종 셀라인는 전형적으로 항체를 생성하지 않으며, 높은 융합 효율과 원하는 융합 세포(하이브리도마)만의 성장을 지지하는 특정한 선택적 배지에서는 자랄 수 없도록 하는 효소 결핍증을 갖는다. 당분야의 숙련자에게 공지된 바와 같은 여러 골수종 세포 중 임의 하나가 사용될 수 있다. 예를 들면, 면역화된 동물이 마우스인 경우, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XX0 Bu1을 사용할 수 있다; 래트에 대해서는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 또는 상술된 마우스 셀라인 중 하나를 사용할 수 있다. U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6은 모두 인간 세포 융합체에 관해 유용할 수 있다.
상기 배양은 하이브리도마의 개체군을 제공할 수 있으며, 이로부터 특정 하이브리도마가 선택된 후 연속 희석 및 항체 제조를 위해 무한 증식될 수 있는 개별 항체 생성주로 클로닝될 수 있다.
모노클로날 항체를 제조하기 위한 방법에는 정제 단계가 포함될 수 있다. 예를 들면, 항체는 일반적으로, 예를 들면 그 전체가 당업자에게 널리 공지된 기법인 여과, 원심분리 및 HPLC 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 다양한 크로마토그래피적 방법을 이용하여 추가 정제될 수 있다. 이들 정제 기법에는 각각 혼합물의 다른 성분으로부터 원하는 항체를 분리하기 위한 분획화가 관여된다. 항체 제조에 특히 적합한 분석적 방법에는, 예를 들면 단백질 A-세파로오스 및/또는 단백질 G-세파로오스 크로마토그래피가 포함된다.
본 발명의 항-sEcad 항체에는 인간 또는 비인간 출처의 CDR들이 포함될 수 있다. "인간화" 항체는 일반적으로 인간 불변 및/또는 가변 영역 도메인 또는 특정 변경을 보유한 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 다른 종으로부터의 키메라 또는 변이체 모노클로날 항체이다. 소위 "인간화" 항체를 생성하기 위한 기법은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있다.
면역글로불린의 틀은 인간의, 인간화 된, 또는 비인간(예를 들어, 인간에서의 항원성을 감소시키도록 개질된 설치류 틀)의, 또는 합성 틀(예를 들어, 공통 서열)일 수 있다. 인간화 면역글로불린은 틀 잔기가 인간 생식계열 서열에 해당하고 상기 CDR들은 V(D)J 재조합 및 체세포 돌연변이에 의해 얻어진 것들이다. 그러나, 인간화 면역글로불린은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 핵산 서열에서 코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, ex vivo 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이화에 의해 도입된 돌연변이)도 포함할 수 있다. 인간 가변 유전자의 in vivo 체세포 돌연변이는 틀 잔기의 돌연변이를 일으키는 것으로 나타났다(Nature Immunol . 2:537 (2001) 참조). 이러한 항체는 틀 돌연변이에도 불구하고 그 출처가 "인간"인 것으로 명명될 것이다. 마우스 항체 가변 도메인은 또한 틀 잔기에 체세포 돌연변이를 함유할 수 있다(Sem . Immunol . 8:159 (1996) 참조). 결과적으로, 인간 Ig 유전자위를 함유하는 유전자삽입 마우스는 이들이 평균 4.5개의 틀 돌연변이를 보유할지라도 "완전 인간"인 것으로 통용되는 면역글로불린을 생성한다( Nature Genet . 15:146-56 (1997)). 따라서 허용되는 사용은 생식계열 서열에 근거하지만, 예를 들면 in vivo 체세포 돌연변이화 절차에 의해 도입된 틀 돌연변이를 보유하는 항체 가변 도메인 유전자가 "인간"으로 명명됨을 나타낸다.
인간화 항체는, 예를 들면 (1) 인간 틀 및 불변 영역 상으로의 비인간 상보성 결정 영역들(CDRs)의 그라프팅(인간화로 당분야에서 불리는 절차), 또는 대안적으로 (2) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하지만 이들에게 표면 잔기의 대체에 의해 인간 유사 표면을 제공(베니어링으로 당분야에서 불리는 절차)을 포함하는 당분야에 공지된 다양한 방법들로 조작될 수 있다. 인간화 항체에는 인간화 및 베니어화 항체가 모두 포함될 수 있다. 유사하게, 인간 항체는 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 유전자삽입 동물, 그 예로 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자위를 도입하여 제조될 수 있다. 유발접종 시, 인간 항체 제조가 관찰되며, 이는 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 측면에서 인간에서 보이는 것과 매우 유사하다. 상기 접근법은, 예를 들면 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 및 하기 과학 문헌들: Marks 등, Bio / Technology 10:779-783 (1992); Lonberg 등, Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild 등, Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg 및 Huszar, Intern . Rev . Immunol . 13:65-93 (1995); Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci , USA , 81:6851-6855 (1984); Morrison 및 Oi, Adv . Immunol ., 44:65-92 (1988); Verhoeyer 등, Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun . 28:489-498 (1991); Padlan, Molec . Immunol . 31(3):169-217 (1994); 및 Kettleborough, C. A. 등, Protein Eng . 4:(7):773-83 (1991))에 기재되어 있다.
키메라 및 인간화 항체에 부가하여, 완전 인간 항체는 인간 면역글로불린 유전자를 갖는 유전자삽입 마우스에서(예를 들어, 미국 특허 번호 6,075,181; 6,091,001; 및 6,114,598 참조), 또는 인간 면역글로불린 유전자의 파지 디스플레이 라이브러리에서(예를 들어, McCafferty 등, Nature 348:552-554 (1990); Clackson 등, Nature 352:624-628 (1991), 및 Marks 등, J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991) 참조) 유래될 수 있다, 일부 구현예에서, 항체는 당분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 scFv-파지 디스플레이 라이브러리에 의해 제조되고 식별될 수 있다.
항-sEcad 항체는 이의 항원 결합 친화도, 이의 효과기 기능, 또는 이의 약동학을 조절하도록 개질될 수 있다. 특히, 무작위 돌연변이는 더 높은 친화도 및/또는 더 높은 특이성을 갖는 항체를 식별하도록 스크리닝된 CDR들 및 산물에서 수행될 수 있다. 이러한 돌연변이화 및 선택은 항체 분야에서 일상적으로 실시된다. 이러한 치환 변이체를 생성하기 위한 편리한 방식은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다.
예를 들면, CDR 셔플링 및 이식 기술이 본원에 제공된 항체에 이용될 수 있다. CDR 셔플링은 CDR 서열을 특정 틀 영역 내로 삽입한다(Jirholt 등, Gene 215:471 (1988)). CDR 이식 기법으로는 무작위 CDR 서열의 조합을 단일 마스터 틀 내로 넣을 수 있게 한다(Soderlind 등, Immunotechnol . 4:279 (1999); 및 Soderlind 등, Nature Biotechnol . 18:852 (2000)). 이러한 기법을 이용하여, 예를 들면 항-sEcad 항체의 CDR 서열을 돌연변이화시켜 복수의 상이한 서열을 생성할 수 있고, 이들은 원하는 특징, 그 예로 더 높은 친화도에 대해 스크리닝되는 스캐폴드 서열 및 생성 항체 변이체 내로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-sEcad 항체의 서열은 당분야에 공지된 바와 같이 T 세포 에피토프의 존재에 대해 조사될 수 있다. 이어서 내재 서열이 변경되어 T 세포 에피토프를 제거, 즉 항체를 "탈면역화"할 수 있다.
예를 들면 파지미드 기술을 이용한 재조합 기술은 여러 항체를 인코딩하는 재조합 유전자로부터 원하는 특이성을 갖는 항체를 제조할 수 있도록 한다. 특정 재조합 기법에는 면역화된 동물의 비장에서 단리된 RNA에서 제조되는 조합 면역글로불린 파지 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝에 의한 항체 유전자의 단리가 관여된다(Morrison 등, Mt . Sinai J. Med . 53:175 (1986); Winter and Milstein, Nature 349:293 (1991); Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:4457 (1992)). 이러한 방법을 위해, 조합 면역글로불린 파지미드 라이브러리는 면역화된 동물의 비장에서 단리된 RNA에서 제조될 수 있고, 적절한 항체를 발현하는 파지미드는 항원 발현 세포 및 대조군 세포를 이용한 패닝에 의해 선택될 수 있다. 통상적 하이브리도마 기법에 비해 이러한 접근법의 이점에는 단일회로 대략 104 배 많은 항체를 제조하고 스크리닝할 수 있으며, H 및 L 쇄 조합에 의해 새로운 특이성이 생성될 수 있고, 생성되는 적절한 항체의 백분율을 더 증가시킬 수 있다는 것이 포함된다.
박테리아에서 다양한 항체 분자의 대형 레퍼토리를 생성하는 한 방법은 벡터로서 박테리오파지 람다를 이용한다(Huse 등, Science 246:1275 (1989)). 람다 벡터를 이용한 항체의 제조에는 DNA 서열의 중쇄 및 경쇄 개체군을 별도의 출발 벡터로 클로닝하는 것이 관여된다. 이어서 벡터는 무작위 조합되어 중쇄 및 경쇄를 공발현시키는 단일 벡터를 형성하여 항체 단편이 형성될 수 있다. 필라멘트성 파지 디스플레이에 대한 일반적 기법은 설명되어 있다(미국 특허 번호 5,658,727). 가장 일반적인 관점에서, 상기 방법에서는 단일 벡터계를 이용해 항체 유전자 레퍼토리로부터 미리 선택된 리간드 결합 특이성의 동시적 클로닝 및 스크리닝을 위한 시스템을 제공한다. 라이브러리의 단리된 멤버의 미리 선택된 리간드 결합능에 대한 스크리닝은 발현된 항체 분자의 결합능과 라이브러리에서 멤버를 인코딩하는 유전자를 단리하기 위한 편리한 수단의 조합을 가능케 한다. 파지미드 라이브러리를 스크리닝하기 위한 추가 방법이 설명되어 있다(미국 특허 번호 5,580,717; 5,427,908; 5,403,484; 및 5,223,409).
결합부 전체 또는 부분 합성 항체 결합부 또는 파라토프의 거대 라이브러리의 생성 및 스크리닝을 위한 한 방법은, 필라멘트성 파지, 예컨대 M13, fl 또는 fd 유래의 디스플레이 벡터를 이용한다(미국 특허 번호 5,698,426, 본원에 참조로 혼입됨). "파지미드"들로 불리는 필라멘트성 파지 디스플레이 벡터들은, 다양하고 신규한 면역특이성을 갖는 모노클로날 항체의 거대 라이브러리를 생성한다. 상기 기술에서는 필라멘트성 파지 복제의 조립 단계 동안 유전자 산물 및 유전자를 연관시키기 위한 수단으로서 필라멘트성 파지 코팅 단백질 막 부착 도메인을 이용하며, 조합 라이브러리로부터 항체의 클로닝 및 발현을 위해 사용되었다(Kang 등, Proc . Natl . Acad. Sci . USA 88:4363 (1991); 및 Barbas 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88:7978 (1991)). 표면 발현 라이브러리는 표준 친화도 단리 절차에 의해 뉴라미니다아제 분자에 결합하는 특이적 Fab 단편에 대해 스크리닝된다. 선택된 Fab 단편은 파지 개체군의 증폭 후 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산의 서열분석에 의해 특징분석될 수 있다.
다양한 항체 라이브러리의 생성 및 원하는 결합 특이성에 대한 스크리닝을 위한 한 방법이 설명되어 있다(미국 특허 번호 5,667,988 및 5,759,817). 상기 방법에는 변성 올리고뉴클레오타이드 및 프라이머 연장 반응을 이용한 파지미드 라이브러리의 형태의 이종이량체성 면역글로불린 분자의 라이브러리를 제조하여 면역글로불린 가변 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 CDR 영역에 방종성을 그리고 파지미드의 표면에 돌연변이된 폴리펩타이드의 디스플레이를 도입하는 것이 관여된다. 이후 디스플레이 단백질은 미리 선택된 항원에 결합하는 능력에 대해 스크리닝된다. 다양한 항체 라이브러리의 생성 및 원하는 결합 특이성에 대한 스크리닝을 위한 이 방법의 추가 변형이 미국 특허 번호 5,702,892에 기재된다(본원에 참조로 혼입됨). 이 방법에서, 중쇄 서열만 채용되며, 중쇄 서열은 CDRI 또는 CDRIII 고가변 영역을 인코딩하는 모든 뉴클레오타이드 위치에서 무작위화되고, CDR들에서의 유전적 변이성은 임의의 생물학적 절차와 무관하게 생성될 수 있다.
상술된 조합 면역글로불린 파지 발현 라이브러리에 추가하여, 하나의 분자적 클로닝 접근법은 인간 항체 라이브러리를 함유하는 유전자삽입 마우스에서 항체를 제조하는 것이다. 이러한 기법은 다음에 설명되어 있다(미국 특허 번호 5,545,807, 본원에 참조로 혼입됨). 이러한 유전자삽입 동물은 단일 아이소타입, 보다 구체적으로는 IgM 및 가능하게는 IgD와 같은 B 세포 성숙에 필수적인 아이소타입의 인간 항체를 제조하는데 채용될 수 있다. 인간 항체를 제조하기 위한 다른 방법은 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661;016; 및 5,770,429에 기재되어 있으며, B 세포 발달에 필요한 아이소타입으로부터 다른 아이소타입으로 스위칭할 수 있는 유전자삽입 동물이 기재된다.
항-sEcad 면역글로불린은 글리코실화를 감소시키거나 없애도록 개질될 수 있다. 글리코실화가 없는 면역글로불린이란 전혀 글리코실화되지 않은 면역글로불린일 수 있거나; 완전히 글리코실화되지 않은 것일 수 있거나; 또는 비전형적으로 글리코실화된 것(즉, 돌연변이체에 대한 글리코실화 패턴이 해당 야생형 면역글로불린의 글리코실화 패턴과 다름)일 수 있다. IgG 폴리펩타이드에는 글리코실화를 약화시키는 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 또는 3 이상) 돌연변이, 즉 글리코실화가 없거나, 완전히 글리코실화되지 않거나 또는 비전형적으로 글리코실화된 IgG CH2 도메인을 만드는 돌연변이가 포함된다. 인간 IgG1에서 아미노산 297의 아스파라긴 잔기의 돌연변이가 이러한 돌연변이의 예이다. 올리고당 구조도, 예를 들면 N-연결 글리칸으로부터 푸코오스 부분을 제거하여 개질될 수 있다.
항체도 비단백질 중합체, 그 예로 폴리에틸렌 글리콜에 대한 콘쥬게이션(conjugation)에 의해 이의 in vivo 안정성 및 또는 용해도를 증가시키도록 개질될 수 있다. 항-sEcad 항체가 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 선택적으로 결합하는 능력을 보유하는 한, 임의의 PEG화 방법이 이용될 수 있다.
생성 폴리펩타이드에 표적, 즉 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 특이적인 적어도 하나의 결합 영역이 포함되는 한, 다양한 항체/면역글로불린 틀 또는 스캐폴드가 채용될 수 있다. 그와 같은 틀 또는 스캐폴드에는 인간 면역글로불린의 5가지 주요 인자형 또는 이의 단편(예컨대 본원에서 다른 곳에 개시된 것들)이 포함되며, 바람직하게는 인간화된 측면을 갖는 다른 동물 종의 면역글로불린이 포함된다. 단일 중쇄 항체, 예컨대 카멜리드에서 식별된 것들이 이에 관해 특히 관심의 대상이 된다.
sEcad 항체의 CDR이 이식될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드를 이용하여 비-면역글로불린 기반 항체를 생성할 수 있다. 틀 또는 스캐폴드에 표적에 특이적인 결합 영역이 포함되는 한, 당분야에 공지된 임의의 비-면역글로불린 틀 및 스캐폴드가 사용될 수 있다. 면역글로불린-유사 분자에는 면역글로불린에 특징적인 특정 구조, 예를 들면, β-시트 2차 구조를 공유하는 단백질이 포함된다. 비-면역글로불린 틀 또는 스캐폴드의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다; 아드넥틴(파이브로넥틴), 안키린, 도메인 항체 및 Ablynx nv, 리포칼린, 작은 모듈형 면역-약제(Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), 맥시바디(Avidia, Inc., MountainView, CA), 단백질 A 및 애필린(감마-결정형 또는 유비퀴틴) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany).
본 발명의 항-sEcad 항체는 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인 상 에피토프에(EC1의 에피토프가 아님) 특이적으로 결합한다. 에피토프는 파라토프, 즉 항체의 결합 부위에 특이적으로 결합된 표적 상의 항원 결정기를 나타낸다. 에피토프 결정기는 통상 분자의 화학적 활성 표면기, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 전형적으로 특정한 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 일반적으로 약 4 내지 약 10 근접 아미노산(연속 에피토프)을 갖거나, 또는 대안적으로 특정 구조(예를 들면 입체형태 에피토프)를 정의하는 비근접 아미노산의 세트일 수도 있다. 따라서, 에피토프는 적어도 4, 적어도 6, 적어도 8, 적어도 10, 및 적어도 12개의 이러한 아미노산으로 구성될 수 있다. 아미노산의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명이 포함된다.
항체가 결합할 수 있는 다른 잠재 에피토프를 예측하는 방법은 당분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 비제한적으로 하기가 포함된다: Kyte-Doolittle 분석(Kyte 및 Dolittle, J. Mol . Biol . 157:105-132 (1982)), Hopp 및 Woods 분석(Hopp 및 Woods, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:3824-3828 (1981); Hopp and Woods, Mol . Immunol . 20:483-489 (1983); Hopp, J. Immunol . Methods 88:1-18 (1986)), Jameson-Wolf 분석(Jameson 및 Wolf. Comput . Appl . Biosci . 4 :181-186 (1988)), 및 Emini 분석(Emini 등, Virology 140:13-20 (1985)). 일부 구현예에서, 잠재 에피토프는 이론적 세포외 도메인을 결정하여 식별된다. 분석 알고리즘, 예컨대 TMpred(Hofmann 및 Stoffel, Biol . Chem . 374:166 (1993) 참고) 또는 TMHMM(Krogh 등, J. Mol . Biol ., 305(3):567-580 (2001))이 이러한 예측을 하는데 이용될 수 있다. 다른 알고리즘, 예컨대 SignalP 3.0(Bednsten 등, J. Mol . Biol . 340(4):783-795 (2004))은 신호 펩타이드의 존재를 예측하고, 전장 단백질에서 이들 펩타이드가 절단될 위치를 예측하는데 이용될 수 있다. 세포 외부의 단백질 부분은 항체 상호작용을 위한 표적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 (1) 역치 수준의 결합 활성을 나타내고/나타내거나 (2) 공지된 관련 폴리펩타이드 분자와 유의미하게 교차반응하지 않는 항체가 포함된다. 항체의 결합 친화도는 당업자에 의해, 예를 들면 Scatchard 분석(Scatchard, Ann . NY Acad , Sci . 51:660-672 (1949))에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-sEcad 항체는 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 일부 상동성을 갖는 것으로 예측되는 다른 단백질에 비해 표적 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 대한 이의 표적 에피토프 또는 모방체 데코이에 적어도 1.5-배, 2-배, 5-배, 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 106-배 이상 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항-sEcad 항체는 10-4M 이하, 10-7M 이하, 10-9M 이하의 높은 친화도나 또는 나노몰 이하 친화도로(0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 nM 이하로) 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 대한 항체의 결합 친화도는 적어도 1 x 106 Ka이다. 일부 구현예에서, sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 대한 항체의 결합 친화도는 적어도 5x106 Ka, 적어도 1x107 Ka, 적어도 2x107 Ka, 적어도 1x108 Ka 이상이다. 항체는 또한 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 대한 그 결합 친화도의 관점으로 설명되거나 특정될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 친화도에는 5x10-2M, 10-2M, 5x10-3M, 10-3M, 5x10-3M, 10-4M, 5x10-5M, 10-5M, 5x10-6M, 10-6M, 5x10-7M, 10-7M, 5x10-8M, 10-8M, 5x10-9M, 5x10-10M, 10-10M, 5x10-11M, 10-11M, 5x10-12M, 10-12M, 5x10-13M, 10-13M, 5x10-14M, 10-14M, 5x10-15M, 또는 10-15M, 또는 그 미만의 Kd를 갖는 것들이 포함된다.
일부 구현예에서, 항체는 공지된 관련 폴리펩타이드 분자에 결합하지 않는다; 예를 들면, 이들은 sEcad 폴리펩타이드의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 결합하지만 공지된 관련 폴리펩타이드에는 결합하지 않는다. 항체는 sEcad 폴리펩타이드의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 특이적으로 결합하는 항체 개체군을 단리하기 위해 공지된 관련 폴리펩타이드에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들면, sEcad 폴리펩타이드의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인에 특이적인 항체는 적절한 완충액 조건 하에 불용성 매트릭스에 부착된 sEcad 폴리펩타이드의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인-관련 단백질(sEcad 폴리펩타이드의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인 제외)을 포함하는 칼럼을 통해 흐를 것이다. 그와 같은 스크리닝으로 밀접하게 관련된 폴리펩타이드에 대해 비교차반응성을 갖는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 단리할 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current so Protocols in Immunology, Cooligan 등(eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). 특이적 항체의 스크리닝 및 단리는 당분야에 널리 공지되어 있다(Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff 등, Adv . in Immunol . 43:1-98 (1988); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin 등, Ann . Rev . Immunol . 2:67-101, 1984 참고). 그와 같은 분석의 대표예에는 동시적 면역전기영동, 방사선 면역분석(RIA), 방사선 면역침전, 효소-연관 면역흡수 분석(ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석, 억제 또는 경쟁 분석, 및 샌드위치 분석이 포함된다.
특정 항체가 악성 e-카드헤린 발현 세포를 선택적으로 죽이는 능력은, 예를 들면 본원의 실시예에 개시된 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
항-sEcad 항체에는 태그가 포함될 수 있으며, 이것은 리포터 또는 마커로도 불릴 수 있다(예를 들면, 검출가능 마커). 검출가능 마커는 태그화된 펩타이드의 발현 또는 활성의 정성적 및/또는 정량적 평가를 허용하는 항-sEcad 항체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 공유 연결된 임의 분자일 수 있다. 활성에는 생물학적 활성, 물리화학적 활성, 또는 이의 조합이 포함될 수 있다. 검출 가능한 마커의 형태 및 위치는 모두 표지된 항체가 생물학적 활성을 보유하는 한 변할 수 있다. 많은 상이한 마커가 사용될 수 있으며, 특정 마커의 선택은 원하는 적용에 따를 것이다. 표지된 항-sEcad 항체는, 예를 들면 생물학적 샘플, 예를 들면 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액 또는 생검 샘플 중 sEcad의 수준을 평가하거나 sEcad 펩타이드 치료제에 대한 임상 반응을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
적당한 마커에는, 예를 들면 효소, 광친화도 리간드, 방사선 동위원소, 및 형광 또는 화학발광 화합물이 포함된다. 펩타이드 내로의 검출 가능한 마커의 도입 방법은 당분야에 공지되어 있다. 마커는 합성 동안 또는 합성 후에 첨가될 수 있다. 재조합 항-sEcad 항체 또는 이의 생물학적 활성 변이체는 또한 형질전환된 세포가 배양되는 배양 배지로의 표지된 전구체(예를 들면, 방사표지된 아미노산)의 첨가에 의해 표지될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 유사체 또는 변이체가 검출 가능한 마커의 도입을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 임의 N-말단 페닐알라닌 잔기는 125I로 쉽게 표지될 수 있는 밀접하게 관련된 방향족 아미노산, 예컨대 티로신으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 효과적인 표지를 지원하는 추가 작용기가 항-sEcad 항체의 단편 또는 이의 생물학적 활성 변이체에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 3-트리부틸주석벤조일기가 천연 구조의 N-말단에 첨가될 수 있다; 그 후 트리부틸주석기의 125I를 이용한 변위는 방사표지된 아이오도벤조일기를 생성할 것이다.
항체 또는 항체-유사 치료제 자체의 투여의 관점에서, 본 방법은 또한 생체 내 항-sEcad 항체의 생산을 일으키는 단백질 투여에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물에는 EC2-EC5 하위도메인 중 E-카드헤린의 세포외 도메인의 항원성 단편이 포함된다(도 1a 및 도 1b 참고). 이들 폴리펩타이드는 이종성 폴리펩타이드에 융합되어 면역원성 융합 단백질을 생성할 수 있다. 예를 들면, sEcad 폴리펩타이드는 미국 특허 번호 7,262,270에 기재된 바와 같이 인플루엔자 바이러스 HA2 헤마글루티닌 단백질의 단편에 융합될 수 있다.
또한 E-카드헤린의 발현을 억제하는데 사용될 수 있는 핵산(예를 들면, RNA 간섭을 매개하는 올리고뉴클레오타이드 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드)이 발명의 범위 내에 속한다. 핵산 구조물은 또한 생체 내 또는 생체 외(예를 들면, 세포 또는 조직 배양 중) sEcad의 항원성 단편을 발현하는데 사용될 수 있다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA, 및 핵산 유사체 함유 DNA(또는 RNA)를 포함하는 RNA 및 DNA 모두를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 임의 3차원 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중쇄 또는 단일쇄(즉, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥)일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적 예에는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA) 및 이의 일부, tRNA, 리보솜 RNA, siRNA, 마이크로-RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머뿐만 아니라 핵산 유사체가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 핵산은, 예를 들면 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편 또는 sEcad 또는 이의 단편을 인코딩할 수 있다.
"단리된" 핵산은, 예를 들면 천연 생성 DNA 분자 또는 그의 단편일 수 있고, 단 보통 천연 생성 게놈 중 해당 DNA 분자에 바로 인접하여 발견되는 핵산 서열의 적어도 하나가 제거되거나 부재한다. 따라서, 단리된 핵산에는 비제한적으로 다른 서열과 무관하게 별개 분자로 존재하는 DNA 분자(예를 들면, 화학적으로 합성된 핵산, 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)가 포함된다. 단리된 핵산이란 또한 벡터, 자체 복제 플라스미드, 바이러스 내로 도입된, 또는 원핵생물이나 진핵생물의 게놈 DNA 내로 도입된 DNA 분자를 나타낸다. 또한, 단리된 핵산에는 조작된 핵산, 예컨대 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자가 포함될 수 있다. 예를 들면, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리, 또는 게놈 DNA 제한 소화물을 함유하는 겔 슬라이스 내의 다른 여러(예를 들면 수십 또는 수백 내지 수백만개) 핵산 중에 존재하는 핵산은 단리된 핵산이 아니다.
단리된 핵산 분자는 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술은 본원에 기재된 폴리펩타이드(즉 조작된 단백질)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 단리된 핵산을 수득하는데 사용될 수 있다. PCR은 총 게놈 DNA 또는 총 세포 RNA 유래 서열을 포함하는 DNA뿐만 아니라 RNA 유래의 특정 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다. 다양한 PCR 방법은 예를 들면 [PCR Primer : A Laboratory Manual , Dieffenbach 및 Dveksler, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 기재되어 있다. 일반적으로 관심 영역 말단이나 그 밖의 서열 정보가 증폭될 템플레이트의 반대 가닥 서열과 동일하거나 유사한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계하는데 채용된다. 부위 특이적 뉴클레오타이드 서열 개질이 템플레이트 핵산 내로 도입될 수 있는(예를 들면, 조작된 단백질, 예를 들면 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질 또는 이의 단편을 제조할 때 원할 수 있는 바와 같이) 다양한 PCR 전략도 이용가능하다. 단리된 핵산도 단일 핵산 분자(예를 들면, 포스포르아미다이트 기술을 이용하여 3'에서 5' 방향으로의 자동화 DNA 합성을 이용) 또는 일련의 올리고뉴클레오타이드로서 화학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 각각의 쌍이 짧은 상보성 절편(예를 들어, 약 15 뉴클레오타이드)을 함유하는, 원하는 서열을 함유하여 올리고뉴클레오타이드쌍이 어닐링될 때 이중체가 형성되도록 하는 한 쌍 이상의 긴 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, > 50~100 뉴클레오타이드)가 합성될 수 있다. DNA 폴리머라제는 올리고뉴클레오타이드를 연장하는데 사용되어, 올리고뉴클레오타이드 한쌍 당 단일한 이중쇄 핵산 분자를 생성한 뒤 벡터 내로 결찰될 수 있다. 본 발명의 단리된 핵산은 또한, 예를 들면 조작된 단백질을 인코딩하는 DNA의 천연 생성 부분의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
본원에 기재된 핵산 및 폴리펩타이드(예를 들면, sEcad의 항원 단편)는 "외인성"으로 불릴 수 있다. 용어 "외인성"이란 핵산 또는 폴리펩타이드가 재조합 핵산 구조물의 일부 또는 이에 의해 인코딩되거나 그 천연 환경에 있지 않음을 나타낸다. 예를 들면, 외인성 핵산은 또 하나의 종 내로 도입된 한 종의 서열, 즉 이종성 핵산일 수 있다. 전형적으로 그와 같은 외인성 핵산은 재조합 핵산 구조물을 통해 다른 종 내로 도입된다. 외인성 핵산은 또한 유기체에 천연으로 존재하며 해당 유기체의 세포 내로 재도입된 서열일 수 있다. 천연 서열을 포함하는 외인성 핵산은 종종 외인성 핵산에 연결된 비천연 서열, 예를 들면 재조합 핵산 구조물 중 천연 서열에 인접한 비천연 조절 서열의 존재에 의해 천연 생성 서열로부터 구별될 수 있다. 또한, 안정하게 형질전환된 외인성 핵산은 전형적으로 천연 서열이 발견되는 위치 이외의 위치에 도입된다.
재조합 구조물도 본원에서 제공되며, 폴리펩타이드, 예를 들면 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편, 또는 sEcad 또는 이의 단편을 발현하기 위해 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다. 재조합 핵산 구조물은 조작된 단백질, 예를 들면 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편 또는 sEcad 또는 이의 단편을 발현하기 적당한 조절 영역에 작동 가능하게 연결된, 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편 또는 sEcad 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 경우에서, 재조합 핵산 구조물에는 RNA의 안티센스 가닥이 전사되도록 안티센스 배향인 코딩 서열, 유전자, 또는 코딩 서열이나 유전자의 단편을 포함하는 핵산이 포함된다. 여러 핵산이 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다는 것이 인지될 것이다. 유전 부호의 퇴화는 당분야에 널리 공지되어 있다. 많은 아미노산에 있어서, 아미노산에 대한 코돈으로 작용하는 하나 초과의 뉴클레오타이드 삼중자가 존재한다. 예를 들면, 항체, 돌연변이체 항체 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질 또는 이의 단편의 주어진 단편에 대한 코딩 서열 내 코돈은 해당 유기체에 대한 적절한 코돈 편향 표를 이용하여 특정 유기체 내 최적 발현이 수득될 수 있도록 개질될 수 있다.
핵산, 예컨대 본원에서 기재된 것을 함유하는 벡터도 제공된다. "벡터"는 또 다른 DNA 절편이 내부로 삽입되어 삽입된 절편의 복제를 일으킬 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 또는 코스미드이다. 발현 벡터에는 미국 출원 공보 번호 2006/0239970(본원에 참조로 혼입됨)에 기재된 바와 같은 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 및 HSV 앰플리콘 입자가 포함된다. 일반적으로 벡터는 적절한 조절 요소와 연관될 때 복제할 수 있다. 적당한 벡터 골격에는, 예를 들면 당분야에서 일상적으로 사용되는 것들, 예컨대 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BACs, YACs, 또는 PACs이 포함된다. "벡터"라는 용어에는 클로닝 및 발현 벡터뿐만 아니라 바이러스 벡터 및 삽입 벡터가 포함된다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 적당한 발현 벡터에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 플라스미드 및 예를 들면 박테리오파지, 배큘로바이러스, 및 레트로바이러스 유래의 바이러스 벡터. 수많은 벡터 및 발현 시스템은 Novagen(Madison, WI), Clontech(Palo Alto, CA), Stratagene(La Jolla, CA), 및 Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad, CA) 같은 회사에서 상업적으로 이용가능하다.
본원에서 제공되는 벡터에는 또한, 예를 들면 복제 기원, 스캐폴드 부착 영역들(SARs), 및/또는 마커가 포함될 수 있다. 마커 유전자는 숙주 세포에 선택가능한 표현형을 부여할 수 있다. 예를 들면, 마커는 살생물제 내성, 예컨대 항생제(예를 들면, 카나마이신, G418, 블레오마이신, 또는 하이그로마이신)에 대한 내성을 부여할 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 발현 벡터에는 발현된 폴리펩타이드의 조작 또는 검출(예를 들면, 정제 또는 편재)을 촉진하도록 설계된 태그 서열이 포함될 수 있다. 태그 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP), 글루타티온 S-트랜스페라제(GST), 폴리히스티딘, c-myc, 헤마글루티닌, 또는 Flag™ 태그(Kodak, New Haven, CT) 서열은 전형적으로 인코딩된 폴리펩타이드와의 융합물로 발현된다. 그와 같은 태그는 카르복실 또는 아미노 말단을 포함하여, 폴리펩타이드 내 어느 부위에든 삽입될 수 있다.
벡터에는 또한 조절 영역이 포함될 수 있다. "조절 영역"이라는 용어는 전사 또는 번역 개시 및 속도, 및 전사 또는 번역 산물의 안정성 및/또는 이동성에 영향을 미치는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 조절 영역들에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 프로모터 서열들, 인핸서 서열들, 반응 요소들, 단백질 인지 부위들, 유도가능한 요소들, 단백질 결합 서열들, 5' 및 3' 미번역 영역들(UTRs), 전사 개시 부위들, 종결 서열들, 폴리아데닐화 서열들, 및 인트론들.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 핵산 중 전사될 서열 및 조절 영역의 위치가 그러한 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 것을 나타낸다. 예를 들면 코딩 서열을 프로모터의 조절 하에 두기 위해, 폴리펩타이드의 번역 판독틀의 번역 개시 부위는 전형적으로 프로모터의 1 내지 약 50 뉴클레오타이드 하류에 배치된다. 그러나 프로모터는 번역 개시 부위의 약 5,000 뉴클레오타이드 상류 또는 전사 개시 부위의 약 2,000 뉴클레오타이드 상류만큼에 배치될 수 있다. 프로모터 전형적으로 적어도 코어(기본) 프로모터를 포함한다. 프로모터에는 또한 적어도 하나의 조절 요소, 예컨대 인핸서 서열, 상류 요소 또는 상류 활성화 영역(UAR)이 포함될 수 있다. 포함될 프로모터의 선택은 비제한적으로 효율, 선택 능력, 유도 가능성, 목적 발현 수준 및 세포- 또는 조직-선호 발현을 포함하는 여러 인자에 의존한다. 당분야의 숙련자가 코딩 서열에 대한 프로모터 및 다른 조절 영역을 적절히 선택하고 배치함으로써 코딩 서열의 발현을 조정하는 것은 일상적인 것이다.
또한 본원에는 숙주 세포가 제공된다. 숙주 세포는, 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드를 발현하는 원핵생물, 예를 들면 대장균과 같은 박테리아, 또는 진핵생물, 예를 들면 효모, 곤충 또는 포유류 세포일 수 있다.
sEcad를 억제하는 본원에 기재된 제제는 생리적으로 허용가능한(즉, 본원에 기재된 치료 및 예방 방법에 사용되기에 충분히 비-독성인) 약제학적 조성물 중에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 sEcad 억제제의 경피 전달을 위한 국소 크림(자외선 차단제에 통합된) 및 지효성 패치를 포함하는 다양한 제형을 특징으로 한다. 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 경구 린스, 겔, 또는 에멀젼으로, 또는 직장 용액, 서스펜션, 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 당분야의 숙련자에게 자명할 바와 같이, 특정 제형이 치료받는 암의 유형에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면, 경구 린스, 겔, 또는 에멀젼은 입, 목, 식도, 또는 위 내의 암을 치료하는데 사용될 수 있고, 직장 용액, 현탁액, 또는 에멀젼은 직장 또는 결장 내 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 치료제(예를 들면, 항-sEcad 항체 및 sEcad를 억제하는 다른 단백질- 또는 핵산-기반 제제)는 그 안정성을 개선하고/하거나 in vivo 조절 또는 지속 방출을 제공하는 물질과 함께 환자에게 투여하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 본 발명은 sEcad-특이적 제제가 마이크로입자(예를 들면, 폴리머 마이크로입자, 예컨대 폴리락타이드-코-글라이콜라이드 마이크로입자) 또는 나노입자(예를 들면, 리포솜, 폴리머 탄수화물 나노입자, 덴드리머, 및 탄소-기반 나노입자)와 함께 제형화된 전달 시스템을 포함한다.
다른 제형에는 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 또는 폐 투여를 위한 것들이 포함된다. 주지되는 바와 같이, 지속 방출 이식물도 제조 및 사용될 수 있다.
본 발명의 임의의 치료 또는 예방 방법에는 치료 전에 또는 치료가 진행됨에 따라 환자를 평가하는 단계가 포함될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, sEcad가 유방, 피부, 폐, 전립선, 위 및 결직장 암뿐만 아니라 다른 상피 악성종양을 갖는 환자의 소변 및/또는 혈청에서 상승됨이 널리 알려져 있다. sEcad 수준에 대한 이전 연구와 일치하게, 본 발명의 데이타는 sEcad가 정상 상피 세포의 표면에서 낮은 수준으로 그리고 인간 피부암 세포, 인간 유방암 세포, 및 마우스 폐암 세포에서 훨씬 더 높은 수준으로 흘려짐을 나타낸다. 따라서, 본 방법에는 sEcad 수준을 대상체에서 수득한 샘플(예를 들면, 소변 또는 혈액 샘플)에서 결정하는 단계가 포함될 수 있다. 상승된 수준은 대상체가 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료를 위해 우수한 후보라는 지표이며, 치료가 진행됨에 따른 sEcad의 모니터링은 투여 및 스케줄링을 최적화할만 아니라 결과를 예측하는 것을 도울 수 있다. 예를 들면, 모니터링은 내성 개시를 검출하고 반응성 환자를 비반응성 환자로부터 빠르게 구분하는데 사용될 수 있다. 내성 또는 비반응성의 징후가 존재하는 경우, 의사는 종양이 추가 회피 기전을 개발하기 전에 대안적 또는 보조적 제제를 선택할 수 있다.
하나 이상의 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인을 특이적으로 표적화하는 2개 이상 제제를 포함하는 조성물은 암에 걸리거나 또는 이에 걸리기 쉬운 개인 또는 포유류에 투여될 수 있다. 항-sEcad 항체는 또한 또 하나의 치료제, 예컨대 세포독성제, 또는 암 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 2개 이상 치료제의 동시 투여는 제제가 그 치료 효과를 발휘하는 시기가 겹치는 한, 제제가 동시에 또는 동일한 경로로 투여될 것을 필요로 하지 않는다. 상이한 날이나 주의 투여와 같은 동시 또는 순차적 투여가 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 또한 sEcad 표적화제에 부가하여 또 하나의 치료 항체(또는 항체(예를 들면, sEcad 이외의 세포 표적(또는 표적들)을 인지하는 항체))가 포함될 수 있다. 예시적인 면역글로불린이 아래에 열거된다. 각각의 면역글로불린은 그 적절한 이름 및 그 상표명으로 확인된다. "DB"로 시작하는 괄호 안의 번호는 앨버타 대학교에서 이용가능한 의약품 뱅크(The Drug Bank) 데이터베이스 상 각 항체에 대한 식별자를 나타낸다. 의약품 뱅크 데이타베이스는 월드 와이드 웹 www.drugbank.ca.의 [Wishart 등, Nucl . Acid Res . 36:D901-906 (2008)]에 기재되어 있다. 유용한 면역글로불린에는 하기가 포함된다: 아브식지맙(ReoPro™)(DB00054), 키메라 인간-설치류 모노클로날 항체 7E3의 Fab 단편으로 그 합성은 EP0418316(A1) 및 WO 89/11538(A1)에 기재됨; 아달리무맙(Humira™)(DB00051), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 결합하고 그 동족 수용체에 대한 TNF-알파 결합을 차단하는 완전 인간 모노클로날 항체; 알렘투주맙(Campath™)(DB00087), 성숙 림프구 표면에 존재하는 단백질인 CD52를 표적으로 하며, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 피부 T 세포 림프종(CTCL) 및 T-세포 림프종의 치료에 사용되는 인간화 모노클로날 항체; 바실릭지맙(Simulect™)(DB00074), IL-2 수용체의 알파 사슬(CD25)에 대한 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체; 베바시주맙(Avastin™)(DB00112), 신생혈관형성을 자극하는 화학적 신호인 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 인지하고 차단하는 인간화 모노클로날 항체로, 그 합성은 [Presta 등, Cancer Res ., 57:4593-4599 (1997)]에 기재됨; 세르툭시맙(Erbitux™)(DB00002), 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하고 억제하는 키메라(마우스/인간) 모노클로날 항체로, 그 합성은 미국 특허 번호 6,217,866에 기재됨; 세르톨리주맙 페골(Cimzia™), 인간화 TNF 억제제 모노클로날 항체의 PEG화 Fab' 단편; 다클리주맙(Zenapax™)(DB00111), IL-2 수용체의 알파 서브유닛에 대한 인간화 모노클로날 항체; 에쿨리주맙(Soliris™), 인간 C5 보체 단백질에 결합하는 인간화 모노클로날 항체; 에팔리주맙(Raptiva™)(DB00095), CD11에 결합하는 인간화 모노클로날 항체; 젬투주맙(Mylotarg™)(DB00056), 세포독성제에 연관된 CD33에 대한 모노클로날 항체로, 그 아미노산 서열은 [J. Immunol . 148:1149 (1991), 및 Caron 등, Cancer . 73(3 Suppl):1049-1056 (1994))]에 기재됨; 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin™)(DB00078), 킬레이터 티욱세탄 및 방사선 동위원소(이트륨90 또는 인듐111)에 접합된 모노클로날 마우스 IgG1 항체 이브리투모맙; 인플릭시맙(Remicade™)(DB00065), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)에 결합하는 키메라 마우스-인간 모노클로날 항체로, 그 합성은 미국 특허 번호 6,015,557에 기재됨; 무로모납-CD3(Orthoclone OKT3™), T 세포 수용체-CD3-복합체에 결합하는 마우스 모노클로날 IgG2a 항체; 나탈리주맙(Tysabri™)(DB00108), 세포 부착 분자 α4-인테그린에 대한 인간화 모노클로날 항체로, 그 서열은 [Leger 등, Hum . Antibodies 8(1):3-16 (1997)]에 기재됨; 오말리주맙(Xolair™)(DB00043), 인간 면역글로불린 E(IgE)에 선택적으로 결합하는 인간화 IgG1k 모노클로날 항체; 팔리비주맙(Synagis™)(DB00110), 호흡기 신시티움 바이러스(RSV)의 F 단백질의 A 항원 부위 내 에피토프에 대해 만들어진 인간화 모노클로날 항체(IgG)로, 그 아미노산 서열은 [Johnson 등, J. Infect . Dis . 176(5):1215-1224 (1997)]에 기재됨; 파니투무맙(Vectibix™), 표피 성장 인자 수용체(인간에서 EGF 수용체, EGFR, ErbB-1 및 HER1로도 알려져 있음)에 특이적인 완전 인간 모노클로날 항체; 라니비주맙(Lucentis™), 베바시주맙(Avastin™)과 동일한 부모 설치류 항체 유래의 친화도 성숙된 항-VEGF-A 모노클로날 항체 단편; 리툭시맙(Rituxan™, Mabthera™)(DB00073), 주로 B 세포 표면에서 발견되는 단백질 CD20에 대한 키메라 모노클로날 항체; 토시투모맙(Bexxar™)(DB00081),131I에 공유 결합된 항-CD20 마우스 모노클로날 항체; 또는 트라스투주맙(Herceptin™)(DB00072), HER2 단백질에 선택적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체.
항체에는 승인되거나 시판된 항체의 생물학적 동등품(바이오시밀러 제품)이 포함될 수 있다. 바이오시밀러는, 예를 들면 시판 항체와 동일한 일차 아미노산 서열을 갖는 것으로 현재 공지되어 있는 항체이지만 시판 항체와 상이한 세포 유형 중에서 또는 상이한 생산, 정제 또는 제형화 방법에 의해 제조될 수 있는 것일 수 있다. 일반적으로, 모든 수탁 물질이 사용될 수 있다.
약제학적 조성물에는 또한 세포독성제, 예를 들면 세포의 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포의 파괴를 일으키는 물질이 포함되거나 이와 함께 투여될 수 있다. 예시적인 세포독성제에는 방사선 동위원소(예를 들면, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학치료제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 합성 독소, 또는 이의 단편이 포함된다. 비-세포독성제란 세포의 기능을 억제하거나 방지하지 않고/않거나 세포의 파괴를 일으키지 않는 물질을 나타낸다. 비-세포독성제에는 세포독성으로 활성화될 수 있는 제제가 포함될 수 있다. 비-세포독성제에는 비드, 리포솜, 매트릭스 또는 입자가 포함될 수 있다(예를 들면, 본원에 참조로 혼입된 미국 특허 공보 2003/0028071 및 2003/0032995 참조). 이러한 제제는 본원에 개시된 항체 또는 다른 표적화제와 콘주게이션, 커플링, 연결 또는 연합될 수 있다.
종래의 암 치료제가 본원에 개시된 조성물과 함께 투여될 수 있다. 유용한 치료제에는 항-신생혈관형성제, 즉 종양이 그 생존을 위해 필요한 새로운 혈관 성장을 자극하는 능력을 차단하는 제제가 포함된다. 당분야에 공지된 임의의 항신생혈관형성제, 예컨대 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 기능을 차단하는 베바시주맙(Avastin®, Genentech, Inc.)을 포함하는 제제가 사용될 수 있다. 다른 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 달테파린(Fragmin®), 수라민 ABT-510, 콤브레타스타틴 A4 포스페이트, 레날리도미드, LY317615(엔자스타우린), 콩 이소플라본(게니스테인; 콩 단백질 단리물) AMG-706, 항-VEGF 항체, AZD2171, Bay 43-9006(소라페닙 토실레이트), PI-88, PTK787/ZK 222584(바탈라닙), SU11248(수니티닙 말레이트), VEGF-트랩, XL184, ZD6474, 탈리도마이드, ATN-161, EMD 121974(실레니그티드) 및 셀레콕십(Celebrex®).
다른 유용한 치료제에는 암 세포에서 DNA-손상, 예를 들면 세포 DNA의 이중가닥 절단을 촉진하는 제제가 포함된다. 당분야의 숙련자에게 공지된 임의 형태의 DNA 손상제가 사용될 수 있다. DNA 손상은 전형적으로 방사선 치료 및/또는 화학치료에 의해 생성될 수 있다. 방사선 치료의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 외부 방사선 치료 및 내부 방사선 치료(또한 소위 근접치료)가 포함된다. 외부 방사선 치료를 위한 에너지 공급원에는 x-선, 감마선 및 입자 빔이 포함되며; 내부 방사선에 사용되는 에너지 공급원에는 방사성 요오드(요오드125 또는 요오드131), 및 스트론튬8 9, 또는 인, 팔라듐, 세슘, 이리듐, 포스페이트, 또는 코발트의 방사선 동위원소가 포함된다. 방사선 치료의 투여 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
DNA-손상 화학치료제의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 부설판(밀레란), 카보플라틴(파라플라틴), 카르무스틴(BCNU), 클로르암부실(류케란), 시스플라틴(플라티놀), 사이클로포스파마이드(사이톡산, 네오사르), 다카르바진(DTIC-돔), 이포스파마이드(이펙스), 로무스틴(CCNU), 메클로레타민(질소 머스타드, 무스타르겐), 멜팔란(알케란), 및 프로카르바진(마툴란).
다른 표준 암 화학치료제에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 알킬화제, 예컨대 카보플라틴 및 시스플라틴; 질소 머스타드 알킬화제; 니트로소우레아 알킬화제, 예컨대 카르머스틴(BCNU); 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트; 폴린산; 퓨린 유사체 항대사물, 머캅토퓨린; 피리미딘 유사체 항대사물, 예컨대 플루오로우라실(5-FU) 및 젬시타빈(Gemzar®); 호르몬 항종양제, 예컨대 고세렐린, 류프롤라이드, 및 타목시펜; 천연 항종양제, 예컨대 알데스류킨, 인터루킨-2, 도세탁셀, 에토포사이드(VP-16), 인터페론 알파, 파클리탁셀(Taxol®), 및 트레티노인(ATRA); 항생제 천연 항종양제, 예컨대 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 다우노마이신 및 미토마이신 C를 포함하는 미토마이신; 및 빈카 알카로이드 천연 항종양제, 예컨대 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신; 하이드록시우레아; 아세갈락톤, 아드리아마이신, 이포스파마이드, 에녹시타빈, 에피티오스탄올, 아클라루비신, 안시타빈, 니뮤스틴, 프로카르바진 하이드로클로라이드, 카르보쿠온, 카보플라틴, 카르모푸르, 크로모마이신 A3, 항종양 다당류, 항종양 혈소판 인자, 사이클로포스파마이드(Cytoxin®), 스키조필란, 사이타라빈(시토신 아라바이노사이드), 다카르바진, 티오이노신, 티오테파, 테가푸르, 돌라스타틴, 돌라스타틴 유사체, 예컨대 아우리스타틴, CPT-11(이리노테칸), 미토잔트론, 비노렐빈, 테니포사이드, 아미노프테린, 카르미노마이신, 에스페르아미신(예를 들면, 미국 특허 번호 4,675,187 참조), 네오카르조노스타틴, OK-432, 블레오마이신, 푸르툴론, 브록스우리딘, 부설판, 혼반, 페플로마이신, 베스타틴(Ubenimex®), 인터페론-β, 메피티오스탄, 미토브로니톨, 멜팔란, 라미닌 펩타이드, 렌티난, 코리올루스 베르시칼라 추출물, 테가푸르/우라실, 에스트라무스틴(에스트로겐/메클로레타민).
암 환자를 위한 치료법으로 사용될 수 있는 추가 제제에는 EPO, G-CSF, 간시클로비르; 항생제, 류프롤라이드; 메페리딘; 지도부딘(AZT); 돌연변이체 및 유사체를 포함하는 인터루킨 1 내지 18; 인터페론 또는 시토카인, 예컨대 인터페론 α, β, 및 γ 호르몬, 예컨대 황체형성 호르몬 분비 호르몬(LHRH) 및 유사체, 그리고 생식선 분비 호르몬(GnRH); 성장 인자, 예컨대 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 신경 성장 인자(NGF), 성장 호르몬 분비 인자(GHRF), 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자 동족 인자(FGFHF), 간세포 성장 인자(HGF), 및 인슐린 성장 인자(IGF); 종양 괴사 인자-α & β(TNF-α & β); 침입 억제 인자-2(IIF-2); 골형성 단백질 1-7(BMP 1-7); 소마토스타틴; 티모신-α-1; γ-글로불린; 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD); 보체 인자; 및 항-신생혈관형성 인자가 포함된다.
유용한 치료제에는 전구약물, 예를 들면 ah약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 더 적거나 비-세포독성이며, 활성이 있거나 또는 보다 활성이 높은 모 형태로 효소적으로 활성화 또는 전환될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태가 포함된다. 예를 들면 [Wilman, Biochemical Society Transaction, 14:375-382 (1986) 및 Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등(ed.), 페이지 247-267, Humana Press (1985)]을 참조하라. 전구약물에는 비제한적으로 하기가 포함된다; 보다 활성이 높은 세포독성이 없는 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-개질 전구약물, 글라이코실화 전구약물, b-락탐-함유 전구약물, 임의 치환된 페녹시아세트아마이드-함유 전구약물 또는 임의 치환된 페닐아세트아마이드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로우리딘 전구약물. 본원에서 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예에는 상술된 화학치료제가 비제한적으로 포함된다.
당분야에 공지된 임의 방법을 사용하여 특정 반응이 유도되는지를 결정할 수 있다. 특정 질환 상태의 정도를 평가하는 임상 방법을 사용하여 반응이 유도되는지를 확인할 수 있다. 반응을 평가하는데 이용되는 특정 방법은 환자의 장애의 성격, 환자의 연령 및 성별, 투여 중인 다른 의약품 및 담당 임상의의 판단에 의존할 것이다.
실시예
실시예 1: sEcad 의 격리는 in vitro 에서 악성 유방 상피 세포에서 세포자멸 사를 유도하나, 정상 인간 유방 상피 세포에서는 그렇지 않다.
E-카드헤린 엑토도메인(ectodomain) 배출은 MCF-7 유방암 세포의 배지에서 가용성 80kDa 단편을 검출한 Wheelock 등에 의해 최초로 설명되었다(J. Cell Biochem . 34:187-202 (1987)). 그 이후, 이러한 sEcad 단편의 절단이 악성 유방, 피부, 난소, 전립선, 식도, 결장, 폐 및 뇌 세포를 포함하여 in vitro에서 몇몇 상이한 악성 세포 유형에서 설명되었다(Davies 등, Clin . Cancer Res . 7(10):3289-3297 (2001); Gil 등, Gynecol . Oncol . 108(2):361-369 (2008); Ito 등, Oncogene 18(50):7080-7090 (1999); Kantak 및 Kramer, 1998; Noe 등, J. Cell Sci . 114:111-118 (2001); Ryniers 등, Biol . Chem . 383:159-165 (2002); Symowicz 등, Cancer Res . 67(5):2030-2039 (2007)).
양성 및 악성 세포 간 E-카드헤린의 편재 및 기본 배출에 차이가 있는지를 결정하기 위해, 면역형광 현미경으로 E-카드헤린 가시화를 위해 정상 MCF-10A 유방 상피 세포 및 MCF-7 유방암 세포를 염색하였다. 두 세포 유형을 융합성이 될 때까지 10% FBS로 보충 된 DMEM 중에 4-웰 챔버 슬라이드(Nunc) 상에서 배양하였다. 세포를 100% 메탄올 중에 고정하고, E-카드헤린에 대해 면역염색하고 면역형광 현미경으로 검사하였다(x20 확대). 히스톤 H1(빨간색)(Santa Cruz)을 사용하여 핵을 라벨링하였다. 또한 ELISA에 의해 배출된 E-카드헤린 엑토도메인에 대해 상청액을 분석하였다. 융합성 MCF-10A 및 MCF-7 세포의 조정 배지(conditioned media)를 수집하고, 제조자 설명서에 따라 ELISA(R&D Systems)로 sEcad 수준에 대해 분석하였다.
인간 E-카드헤린 하위도메인 EC1에 특이적인 모노클로날 항체(SHE78-7, Zymed)에 대한 노출 후, 세포-세포 접촉 부위에서, 가장 현저하게는 두 셀라인에서 세포 응집부 내 세포간 경계를 따라 E-카드헤린 면역염색을 관찰한 반면, 배출된 가용성 E-카드헤린 엑토도메인은 두 정상 MCF-10A 세포 및 MCF-7 암 세포 모두의 조정 배지에서 검출되었고, MCF-7 암 셀라인에서 현저하게 증가하였다. sEcad 수준은 MCF-10A 대 MCF-7 세포에 있어 유의미하게 상이하였다.
다음으로 융합성 MCF-10A 및 MCF-7 세포를 E-카드헤린의 엑토도메인에 대해 만들어진 항체(DECMA; 20㎍/mL) 또는 전-면역화(pre-immune) 혈청(IgG; 20㎍/mL)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 배양하고 제조자의 설명서에 따라 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라제 바이오틴-dUTP 닉 말단 표지(TUNEL) 키트(Promega)를 이용하여 세포자멸사에 대해 분석하였다. 항-sEcad 항체에 노출된 정상 MCF-10A 세포 및 미처리 또는 아이소타입 대조군 세포 간 세포자멸사에는 큰 차이가 없었다. 반대로, 항-sEcad 처리 MCF-7 암 세포는 미처리 세포에서는 자명하지 않던 세포자멸사의 뚜렷한 증가를 나타내었다. 이들 발견을 추가 확인하기 위해, 세포질 히스톤-연관 DNA 단편(모노뉴클레오좀 및 올리고뉴클레오좀)을 측정하는 세포자멸사-특이적 ELISA 분석을 이용하였다. 20㎍/mL의 항-sEcad Ab 또는 IgG의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 배양된 MCF-10A 및 MCF-7 세포의 세포 용해물을, 제조자의 설명서에 따라 세포질 히스톤-연관 DNA 단편에 대한 세포자멸사-특이적 ELISA(세포 사멸 검출(Cell Death Detection) ELISAPLUS, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)를 이용하여 세포자멸사를 분석하였다. 결과로부터 항-sEcad 처리가 MCF-7 세포에서는 세포자멸사를 극적으로 유도하였으나 MCF-10A 세포에서는 큰 효과를 갖지 않는 것으로 드러났다. 괴사 수준은 두 셀라인에서 모두 항-sEcad 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 종합적으로, 이들 결과는 세포 환경에서의 배출된 E-카드헤린 엑토도메인의 억제 또는 격리가 유방암 세포에서 선택적으로 세포자멸사를 유도하지만 정상의 건강한 유방 상피 세포는 보존함을 나타낸다.
p53의 활성화가 종양화를 억제하는데 중요한 유전자의 전사 조절을 일으키고, 그 특이적 작용이 주로 세포자멸사의 유발을 통해 발휘되므로(Fuster 등, Trends Mol . Med . 13(5):192-199 (2007)), 다음으로 p53이 이러한 항-sEcad-유도 세포자멸사에서 역할을 담당하는지 여부를 결정하고자 했다. p53에 대해 만든 항체 및 웨스턴 블로팅을 이용하여, MCF-7 세포에서 이러한 친-세포자멸성 단백질의 발현에 대한 항-sEcad의 효과를 조사하였다. 간단히 말해서, 50㎍의 용해물을 4-15% 구배 겔(BioRad) 상에서 전기영동하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고 항-p53(Santa Cruz; 1:400), 그 다음 페록시다아제-콘주게이트화 2차 항체(1:3,000)로 면역블로팅하여 화학발광(ECL) 검출을 증강시켰다. 동량 단백질 로딩을 G3PDH 염색으로 확인하였다. 20㎍/mL의 항-sEcad 처리 시, p53은 24시간부터 증가하기 시작해서 48시간에 최대 수준에 도달했다. 반대로, 미처리 세포 또는 아이소타입 대조군으로 처리한 세포에서는 p53 발현이 없었다. 종양 내 p53의 존재가 화학치료에 대한 유리한 반응과 연관되며 낮은 수준의 p53이 암 세포에서 약물 내성을 부여하므로, 종양 환경에서 sEcad의 억제가 세포독성을 증강시키고 현재의 화학치료 전략으로 발생하는 내성을 낮출 수 있을 것으로 믿는다.
실시예 2: 인간 피부 편평상피 세포암종 세포는 항- sEcad 항체 처리 후 세포자멸사를 겪지만, 정상 성인 인간 케라틴 생성 세포는 보존된다.
sEcad의 기본 배출이 정상 상피 케라틴 생성 세포 배양물 대 인간 편평상피 세포 암종들(SCCs) 간에 차이가 있는지를 직접 결정하기 위해, 정상 일차 인간 피부 케라틴 생성 세포(PHK) 및 2개의 상이한 인간 SCC 셀라인(SCC12b 및 SCC13)에서 sEcad 수준을 평가하였다. PHK, SCC12b 및 SCC13 세포를 ~80% 융합까지 배양하고, 배양 상청액 중 sEcad 수준을 웨스턴 면역블로팅으로 조사하였다. 간단히 말해서, 각 셀라인로부터 60㎕의 조정 배지를 4-15% 구배 겔(BioRad) 상에서 전기영동하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고 항-E-카드헤린(Santa Cruz; 1:600), 그 다음 페록시다아제-콘주게이트화 2차 항체(1:3,000)로 면역블로팅하여 화학발광(ECL) 검출을 증강시켰다. 또한 PHK, SCC12b 및 SCC13 세포로부터 조정 배지를 수집하고, 제조자의 설명서에 따라 ELISA에 의해 sEcad의 수준에 대해 분석하였다. 웨스턴 블로팅에 의해 두 SCC 셀라인 모두에서 sEcad의 증가된 발현을 관찰하였다. 이는 ELISA에 의한 비암성 PHK 세포 대비 SCC12b 및 SCC13 셀라인에서 sEcad 수준의 3배 초과 증가에 대응하였다.
항-sEcad 항체가 상술된 MCF-7 유방암 세포 이외 상피 암 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 항-sEcad(20㎍/mL; DECMA; Sigma) 또는 전-면역화 혈청(IgG; "아이소타입 대조군")의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 PHK(D033), SCC12b 및 SCC13 세포를 융합할 때까지 배양하고 제조자의 설명서에 따라 TUNEL 분석을 이용하여 세포자멸사에 대해 세포를 분석하였다.
SCC12b 및 SCC13 세포는 항-sEcad에 노출되었을 때 세포자멸사의 현저한 증가를 나타낸 반면, 상기 차단 항체를 이용한 정상 PHK의 처리는 검출 가능한 친-세포자멸성 효과를 나타내지 않았다. 세포자멸사-특이적 ELISA 분석을 이용하여, 상기 용량의 항-sEcad를 이용한 PHK의 처리가 세포자멸사에 효과가 없음을 추가 검증하였다. 종합적으로, 본 데이터는 항-sEcad 처리가 2개의 상이한 인간 피부암 셀라인에서 선택적으로 세포자멸사를 유도하지만, 정상 일차 인간 케라틴 생성 세포 피부 배양물에서는 그렇지 않음을 보여준다.
실시예 3: 마우스 SCCs 는 항- sEcad -유도 세포자멸사에 민감하다.
질환 절차, 예컨대 편평상피 세포암을 효과적으로 연구하기 위해, 인간 및 동물 모델 접근법 모두를 이용하는 것이 신중하다. 따라서 항-sEcad 처리가 SCC 마우스 셀라인에서 세포자멸사를 선택적으로 유도할 것인지 여부를 결정하고자 하였다. 그런 경우, 설치류 모델 시스템을 이용하여 in vivo에서 항-sEcad의 효능 및 독성을 추가 시험할 수 있을 것이다.
먼저 ELISA로 융합성 일차 마우스 케라틴 생성 세포(PMK) 및 마우스 SCC 셀라인(PAM212)의 조정 배지 중 sEcad 수준을 결정하였다. 예측된 바와 같이, PAM212 셀라인 중 sEcad 수준은 대조군 PMK 배양물에서에 비해 거의 2배 더 높았다. 이들 수준은 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다; sEcad의 상대 수준은 PAM212 셀라인에서에 비해 2 내지 3배 더 높았다. 따라서, 유방 및 인간 피부암 세포에서와 마찬가지로, E-카드헤린 엑토도메인의 기본 배출이 건강한 비암성 상피 세포에 비해 마우스 SCCs에서 통계적으로 더 높다는 것이 명확하다.
항-sEcad 처리가 마우스 SCCs에 대해 선택적으로 세포독성을 나타내는지를 검증하기 위해, PMK 및 PAM212 세포를 E-카드헤린의 엑토도메인에 대해 만들어진 항체(20㎍/mL DECMA; Sigma) 또는 전-면역화 혈청(IgG)의 존재 또는 부재 하에 48시간 동안 융합하도록 배양하고, TUNEL 분석을 이용하여 세포자멸사에 대해 분석하였다. 차단 항체와의 인큐베이션 후 SCC 셀라인에서 TUNEL-양성 세포의 현저한 증가를 관찰하였으나 PMK 배양에서는 현저한 차이가 없었다.
이들 결과는 세포자멸사-특이적 ELISA 분석(세포 사멸 검출 ELISAPLUS (Boehringer Mannheim))에 의해 확인되는데, 항-sEcad 처리 PAM212 셀라인에서 세포자멸사의 2배 초과 증가를 보이고 PMK 배양물에서의 현저하지 않은 세포 사멸을 나타낸 . 반대로, 괴사 수준은 세포 유형과 무관하게 모든 조건에서 변화하지 않았다.
20㎍/mL의 항-sEcad 항체에 노출된 MCF-7 세포 중 p53 수준의 증가를 이전에 나타냈으므로, 다음으로 상기 차단 항체 또는 전-면역화 혈청(IgG)의 존재 또는 부재 하에 24 및 48 시간 동안 배양된 PAM212 세포에서도 p53의 유사한 증가가 존재할지 여부를 결정하였다. 간단히 말해서, 50㎍의 용해물을 4-15% 구배 겔(BioRad) 상에서 전기영동하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고, 항-p53(Santa Cruz; 1:400) 그 다음 페록시다아제-콘주게이트화 2차 항체(1:3,000)로 면역블로팅하여 화학발광(ECL) 검출을 증강시켰다. 동량 단백질 로딩을 G3PDH 염색으로 확인하였다. 웨스턴 블로팅은 항-sEcad 처리 24 및 48시간 후 p53 수준의 뚜렷한 증가를 나타내었으나, 미처리 또는 아이소타입 IgG 대조군에서는 밴드가 나타나지 않았다. 이 시점의 항-sEcad 유도 p53 발현은 전술된 MCF-7 셀라인에서 확인된 것과 동일하다. 따라서, 상기 항-sEcad-유도 암 세포 사멸은 p53-의존성 경로를 통할 가능성이 있으나, 정확한 하류 관련 인자는 아직 규명되지 않았다.
실시예 4: sEcad 차단은 다른 비암성 세포에서는 세포자멸사를 유도하지 않는다.
3T3 마우스 섬유아세포 및 인간 내피 세포(HUVEC)를 항-sEcad Ab 또는 전-면역화 혈청(IgG)의 존재 또는 부재 하에 24-48 시간 동안 배양하고 전술된 TUNEL 및 세포자멸사-특이적 ELISA 분석에 의해 세포자멸사에 대해 분석하였다. 차단 항체의 존재 하에, 3T3 세포는 TUNEL 분석을 이용하여 세포자멸성 핵을 거의 또는 전혀 나타내지 않았고 세포자멸사-특이적 ELISA 분석에 의해서도 세포자멸사에 변화를 나타내지 않았다. 마찬가지로, 항-sEcad로 처리한 HUVEC 세포는 두 전략 모두를 이용하였을 때 세포자멸사에 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 또한, 3T3 및 HUVEC 세포는 E-카드헤린 차단 항체에서 이들 세포를 나타내지 않았다.
실시예 5: 항- sEcad mAb 치료법은 종양 개시를 지연하고, 종양 부담을 방지하고, in vivo 에서 종양 등급을 약화시킨다 .
공격적 선암종이 폐로 전이하며 진행되는 촉진 가능한 유방암 종양의 신속한 발생을 특징으로 하는, 여성 처녀 MMTV-PyMT 유전자삽입 마우스를 본 연구에 이용하였다(Guy 등, 1992; Bugge 등, 1998). 48일령부터 시작하여, 상기 마우스를 sEcad의 EC-5 도메인을 표적으로 하는 모노클로날 항체(α-sEcad; DECMA-1, Sigma Aldrich, 마우스 당 20㎍/200㎕ 식염수) 또는 일반 식염수로 i.p. 주사에 의해 주 2회 처리하였다. 마우스를 90일령에 희생시켰다. 모든 식염수 처리(대조군) MMTV-PyMT 마우스에서는 56-60일에 촉진 가능한 종양이 발생한 반면, 처리 마우스에서는 종양 개시에 있어 통계적으로 유의미한 지연이 관찰되었다(81-85일; 도 2a 참고). 90-일령의 EC5 mAb-처리 마우스는 조직병리학적으로 중등 분화된 것으로 확인된 더 적은 수의 전체 종양을 나타내었다(구조 등급 II 및 핵 등급 I; 도 2b 참고). 반대로, 90일 식염수 처리 마우스에서의 모든 종양은 불량하게 분화되었다(구조 등급 III 및 핵 등급 III; 도 2c 참고). mAb-처리 마우스는 또한 감소된 전체 종양 중량 및 용적 부담을 나타내었다.
결론적으로, 본 발명의 결과는 항-sEcad 항체 처리가 다양한 상피 암 셀라인(유방, 피부 및 폐)에서 세포 사멸을 유도하는 반면, 건강한 인접 정상 상피 세포, 섬유아세포 및 내피 세포는 보존함을 분명히 나타낸다. 암 세포가 정상 세포-세포 접촉을 인공적으로 모방하기 위해 미세환경 중에 sEcad를 분비하며, 인접 부근 세포와의 기능성 스캐폴드를 제공한다고 제시한다. 따라서, 종양 미세환경에서 sEcad를 포획함으로써, 이러한 종양 세포 환경의 보육 역량을 교란시키고 프로그램된 세포 사멸에 관여하는 p53-의존성 분자 경로를 활성화시킨다.
본 발명의 여러 구현예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 수행될 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 다른 구현예는 하기 특허청구범위의 범위 내에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> THE RESEARCH FOUNDATION OF STATE UNIVERSITY OF NEW YORK THE UNIVERSITY OF ROCHESTER <120> COMPOSITIONS TARGETING THE SOLUBLE EXTRACELLULAR DOMAIN OF E-CADHERIN AND RELATED METHODS FOR CANCER THERAPY <130> U2146-02036 <140> <141> <150> PCT/US2011/058076 <151> 2011-10-27 <150> 61/407,367 <151> 2010-10-27 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 882 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Pro Trp Ser Arg Ser Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln 1 5 10 15 Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Pro Glu Pro Cys His Pro Gly Phe 20 25 30 Asp Ala Glu Ser Tyr Thr Phe Thr Val Pro Arg Arg His Leu Glu Arg 35 40 45 Gly Arg Val Leu Gly Arg Val Asn Phe Glu Asp Cys Thr Gly Arg Gln 50 55 60 Arg Thr Ala Tyr Phe Ser Leu Asp Thr Arg Phe Lys Val Gly Thr Asp 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Val Lys Arg Pro Leu Arg Phe His Asn Pro Gln Ile 85 90 95 His Phe Leu Val Tyr Ala Trp Asp Ser Thr Tyr Arg Lys Phe Ser Thr 100 105 110 Lys Val Thr Leu Asn Thr Val Gly His His His Arg Pro Pro Pro His 115 120 125 Gln Ala Ser Val Ser Gly Ile Gln Ala Glu Leu Leu Thr Phe Pro Asn 130 135 140 Ser Ser Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro 145 150 155 160 Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val 165 170 175 Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile 180 185 190 Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val Gly Val Phe Ile Ile Glu 195 200 205 Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg 210 215 220 Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn 225 230 235 240 Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn 245 250 255 Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu Val Phe Lys Gly Ser Val Met 260 265 270 Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Glu Val Thr Ala Thr Asp 275 280 285 Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile 290 295 300 Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn 305 310 315 320 Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu 325 330 335 Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly 340 345 350 Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala Val Ile Thr Val Thr Asp Thr 355 360 365 Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val 370 375 380 Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp 385 390 395 400 Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu 405 410 415 Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn 420 425 430 Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln 435 440 445 Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr Asn Val Val Pro Phe Glu Val 450 455 460 Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Leu Asp Val 465 470 475 480 Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro Glu Lys Arg Val Glu Val Ser 485 490 495 Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu 500 505 510 Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp 515 520 525 Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr 530 535 540 Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe Glu His Val Lys Asn Ser Thr 545 550 555 560 Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr 565 570 575 Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala 580 585 590 Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys 595 600 605 Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser 610 615 620 Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile 625 630 635 640 Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met 645 650 655 Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn 660 665 670 Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu Val Ser Val Cys Asp Cys 675 680 685 Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly 690 695 700 Leu Gln Ile Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu Ala Leu 705 710 715 720 Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg Ala Val 725 730 735 Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val 740 745 750 Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Phe Asp 755 760 765 Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val Thr Arg 770 775 780 Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Arg Tyr Leu Pro Arg 785 790 795 800 Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn Leu Lys 805 810 815 Ala Ala Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val 820 825 830 Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu 835 840 845 Asn Ser Ser Glu Ser Asp Lys Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu 850 855 860 Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu 865 870 875 880 Asp Asp <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (45)

  1. 암 환자의 치료 방법에 있어서, 상기 방법이 가용성 E-카드헤린(sEcad)의 제 1 하위도메인(EC1)이 아닌 하나 이상의 sEcad의 제 2, 제 3, 제 4 또는 제 5 하위도메인들(각각 EC2, EC3, EC4 및 EC5)을 특이적으로 표적화하는 제제의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 EC4 및/또는 EC5를 특이적으로 표적화하는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 제제가 EC4를 특이적으로 표적화하는, 방법.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 제제가 EC5를 특이적으로 표적화하는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 단백질 스캐폴드인, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 단백질 스캐폴드가, sEcad의 EC1 하위도메인이 아닌 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 또는 EC5 하위도메인들 내의 아미노산 잔기들을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 인간화, 키메라, 또는 인간 항체인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 단일쇄 항체인, 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인, 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 항체가 면역글로불린 G(IgG) 클래스 또는 면역글로불린 M(IgM) 클래스에 속하는, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 검출 가능하게 표지된, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 악성 E-카드헤린-발현 세포를 사멸시키지만 비-악성 세포는 사멸시키지 않는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 제제가 프로그램된 세포 사멸, 성장 정지, 아노이키스(anoikis), 괴사, 또는 자식작용에 의해 악성 E-카드헤린-발현 세포를 사멸시키는, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 세포독성량의 임의 부형제가 없는 약제학적 제형 중에 투여되는, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 약제학적 제형 중에 전달되어,
    (a) 환자에게 투여 시 약 1-10mg/kg의 제제 혈청 수준을 생성하거나,
    (b) 세포 배양에 첨가 시, 세포 배양 배지에서 약 1-500㎍/mL의 제제 농도를 생성하는, 방법
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 약제학적 제제가 상기 환자에서 약 1-5mg/kg의 혈청 수준을 생성하거나 세포 배양 배지에서 약 1-400㎍/mL의 농도를 생성하는, 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 제제가 경구 투여, 정맥내 투여, 비강 또는 흡입 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 점막관통 투여, 또는 경피 투여에 의해 약제학적 제형으로 전달되는, 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 환자로부터 생물학적 샘플을 제공하는 단계 및 샘플에 상승된 수준의 sEcad 또는 암에 대한 또 다른 예측 바이오마커가 포함되는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 생물학적 샘플이 소변, 타액, 뇌척수액, 혈액, 또는 생검 샘플인, 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 단계가 제제 투여 전에 수행되며, 상승된 수준의 sEcad는 환자가 치료에 대해 우수한 후보임을 나타내는, 방법.
  21. 청구항 18에 있어서, 상기 단계가 제제 투여 후 1회 이상 수행되며, 감소된 수준의 sEcad는 환자가 치료에 잘 반응하고 있음을 나타내는, 방법.
  22. 청구항 1에 있어서, 제 2 암 치료를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 제 2 암 치료가 화학치료제의 투여, 방사선 치료, 항체 치료, 또는 수술적 개입을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 1에 있어서, 상기 암이 상피화된 조직 내에 있는, 방법.
  25. 청구항 1에 있어서, 상기 암이 소화관, 중추신경계, 유방, 피부, 생식계, 폐, 또는 요로의 암인, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 소화관 암이 입, 목, 식도, 위, 소장, 직장 또는 항문의 암인, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 피부 암이 편평상피 세포암종 또는 흑색종인, 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, 상기 생식계 암이 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 외음부 또는 음순 암, 전립선암, 고환암, 또는 남성 생식기암인, 방법.
  29. 대상체에게 암이 발생할 가능성을 감소시키는 방법에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에게 치료적 유효량의 (a) EC1 하위도메인을 제외한 하나 이상의 sEcad의 EC2-EC5 하위도메인들의 아미노산 서열을 포함하는 항원성 폴리펩타이드, 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체 또는 (b) 상기 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드가 EC4 및/또는 EC5의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  31. 청구항 29에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드가 EC4의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  32. 청구항 29에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드가 EC5의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 29에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드가 sEcad에 특이적으로 결합하지만 대상체에서 비악성 세포에 의해 발현되는 E-카드헤린에는 결합하지 않는 항체 생산을 일으키는, 방법.
  34. 청구항 29에 있어서, 상기 항원성 폴리펩타이드 또는 상기 발현 벡터가 경구 투여, 정맥내 투여, 비강 또는 흡입 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 점막관통 투여, 또는 경피 투여에 의해 약제학적 제형으로 전달되는, 방법.
  35. 청구항 29에 있어서, 상기 암이 상피화된 조직 내에 있는, 방법.
  36. 청구항 29에 있어서, 상기 암이 소화관, 중추신경계, 유방, 피부, 생식계, 폐, 또는 요로의 암인, 방법.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 소화관 암이 입, 목, 식도, 위, 소장, 직장 또는 항문의 암인, 방법.
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 피부 암이 편평상피 세포암종 또는 흑색종인, 방법.
  39. 청구항 36에 있어서, 상기 생식계 암이 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 외음부 또는 음순 암, 전립선암, 고환암, 또는 남성 생식기암인, 방법.
  40. 치료적 유효량의 (a) sEcad의 EC1 하위도메인이 아닌 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 또는 EC5 하위도메인들 내의 아미노산 잔기들을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체; (b) EC1 하위도메인을 제외한 하나 이상의 sEcad의 EC2-EC5 하위도메인들의 아미노산 서열을 포함하는 항원성 폴리펩타이드, 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체; 또는 (c) 상기 항원성 폴리펩타이드 또는 이의 항원 활성 단편 또는 이의 다른 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 약제학적으로 허용가능한 조성물.
  41. sEcad의 에피토프를 식별하는 방법에 있어서, 상기 방법이
    (a) sEcad를 포함하는 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 이의 다른 변이체를 제공하는 단계;
    (b) 상기 폴리펩타이드를 동물에게 투여하는 단계;
    (c) 상기 폴리펩타이드에 대한 반응으로 동물에 의해 제조되는 항체를 단리하는 단계;
    (d) 암성 세포들을 이들에서 생성된 상기 항체들 또는 모노클로날 항체에 노출시키는 단계를 포함하며,
    여기서 암성 세포들의 사멸은 상기 폴리펩타이드가 암 치료, 예방 또는 조영에서 제제로서 표적화되거나 사용될 수 있는 sEcad의 에피토프를 포함한다는 것을 나타내는 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 sEcad의 EC1 하위도메인 유래 아미노산 서열을 제외한 하나 이상의 sEcad의 EC2, EC3, EC4 또는 EC5 하위도메인들의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 EC4 또는 EC5의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 EC4에 국한된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  45. 청구항 43에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 EC5에 국한된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
KR1020137013383A 2010-10-27 2011-10-27 암 치료법을 위한 e-카드헤린의 가용성 세포외 도메인의 표적화 조성물 및 관련 방법 KR20140075639A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40736710P 2010-10-27 2010-10-27
US61/407,367 2010-10-27
PCT/US2011/058076 WO2012058418A2 (en) 2010-10-27 2011-10-27 Compositions targeting the soluble extracellular domain of e-cadherin and related methods for cancer therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140075639A true KR20140075639A (ko) 2014-06-19

Family

ID=45994754

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137013383A KR20140075639A (ko) 2010-10-27 2011-10-27 암 치료법을 위한 e-카드헤린의 가용성 세포외 도메인의 표적화 조성물 및 관련 방법

Country Status (13)

Country Link
US (4) US20130287784A1 (ko)
EP (1) EP2632489B1 (ko)
JP (1) JP6243737B2 (ko)
KR (1) KR20140075639A (ko)
CN (1) CN103582494A (ko)
AU (1) AU2011319777B2 (ko)
BR (1) BR112013010535A2 (ko)
CA (1) CA2816358A1 (ko)
ES (1) ES2784385T3 (ko)
MX (2) MX357167B (ko)
RU (1) RU2013123792A (ko)
SG (3) SG10202100921YA (ko)
WO (1) WO2012058418A2 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9534058B2 (en) 2012-02-08 2017-01-03 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-CD324 monoclonal antibodies and uses thereof
CA2867456A1 (en) * 2012-03-15 2013-09-19 The Research Foundation For The State University Of New York Combination therapies including inhibitors of the extracellular domain of e-cadherin
US9411750B2 (en) 2012-07-30 2016-08-09 International Business Machines Corporation Efficient calibration of a low power parallel data communications channel
US9474034B1 (en) 2015-11-30 2016-10-18 International Business Machines Corporation Power reduction in a parallel data communications interface using clock resynchronization
US10321351B2 (en) 2017-03-02 2019-06-11 Cable Television Laboratories, Inc. System and method for grant assignment
US10492104B2 (en) 2016-03-10 2019-11-26 Cable Television Laboratories, Inc. Latency reduction in wireless service
EP3427514B1 (en) 2016-03-10 2022-01-19 Cable Television Laboratories, Inc. Methods for latency reduction
US10738127B2 (en) 2016-06-10 2020-08-11 Veritas Biotecnologia Ltda Monoclonal antibodies prevent cell surface protein shedding and block tumor growth
US10420085B2 (en) 2016-10-07 2019-09-17 Cable Television Laboratories, Inc. System and method for grant assignment
EP3791570A4 (en) 2018-05-11 2022-01-26 Axon Enterprise, Inc. SYSTEMS AND METHODS OF CROSS-EDITING

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4196265A (en) 1977-06-15 1980-04-01 The Wistar Institute Method of producing antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
KR940009084B1 (ko) 1988-05-18 1994-09-29 체크 포인트 시스템스, 인코오퍼레이티드 자기 및 공명회로 검출용 안테나 시스템
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
DK1471142T3 (da) 1991-04-10 2009-03-09 Scripps Research Inst Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Technology Ltd., Melbourn Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
DE69332948T2 (de) 1992-03-05 2003-11-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Verwendung von Immunokonjugate zur Diagnose und/oder Therapie der vaskularisierten Tumoren
US5877289A (en) 1992-03-05 1999-03-02 The Scripps Research Institute Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US5965132A (en) 1992-03-05 1999-10-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for targeting the vasculature of solid tumors
US6004555A (en) 1992-03-05 1999-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for the specific coagulation of vasculature
US6093399A (en) 1992-03-05 2000-07-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
WO1994011401A1 (en) * 1992-11-17 1994-05-26 Yale University Human homolog of the e-cadherin gene and methods based thereon
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US5702892A (en) 1995-05-09 1997-12-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Phage-display of immunoglobulin heavy chain libraries
US6723320B2 (en) * 1996-07-24 2004-04-20 Gsf Forschungszentrum Fur Umwelt Und Geshundheit Gmbh Mutations of E cadherin as a basis for the diagnosis and therapy of human malignant tumors
US6015557A (en) 1999-02-24 2000-01-18 Tobinick; Edward L. Tumor necrosis factor antagonists for the treatment of neurological disorders
WO2002034880A2 (en) * 2000-10-23 2002-05-02 University Of Kansas Cadherin peptides for drug delivery and inhibition of tumor metastasis/invasion
CA2441626A1 (en) 2001-03-28 2002-10-17 Children's Medical Center Corporation Fusion protein construct and method for inducing hiv-specific serum igg and secretory iga antibodies in-vivo
US7074175B2 (en) 2001-07-25 2006-07-11 Erik Schroeder Handy Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
EP1592455A4 (en) 2003-01-23 2006-06-28 Univ Rochester AMPLICON PARTICLES OF THE HERPES VIRUS
EP2426149A4 (en) * 2009-05-01 2013-01-23 Univ Tokyo ANTI-CADHERIN ANTIBODY

Also Published As

Publication number Publication date
JP2014500862A (ja) 2014-01-16
US20190352380A1 (en) 2019-11-21
US20160046701A1 (en) 2016-02-18
AU2011319777A1 (en) 2013-05-23
AU2011319777B2 (en) 2016-12-08
CA2816358A1 (en) 2012-05-03
BR112013010535A2 (pt) 2017-11-07
RU2013123792A (ru) 2014-12-10
WO2012058418A3 (en) 2012-07-19
CN103582494A (zh) 2014-02-12
EP2632489B1 (en) 2020-01-15
ES2784385T3 (es) 2020-09-24
EP2632489A4 (en) 2014-06-18
MX357167B (es) 2018-06-28
JP6243737B2 (ja) 2017-12-06
US20130287784A1 (en) 2013-10-31
EP2632489A2 (en) 2013-09-04
MX2018007983A (es) 2023-02-23
WO2012058418A2 (en) 2012-05-03
MX2013004790A (es) 2014-01-17
SG10201604467PA (en) 2016-07-28
SG189547A1 (en) 2013-05-31
SG10202100921YA (en) 2021-03-30
US20210380671A1 (en) 2021-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210380671A1 (en) Compositions targeting the soluble extracellular domain of e-cadherin and related methods for cancer therapy
US20210403553A1 (en) Combination therapy for treatment of disease
RU2765410C2 (ru) Способы лечения рака, включающие связывающие tigit агенты
US20190008957A1 (en) Combination therapies including inhibitors of the extracellular domain of e-cadherin
EP2287194B1 (en) Antibodies binding to EphB4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
SG186000A1 (en) Axl antibodies
CA2661669A1 (en) A pharmaceutical composition for treating cholangiocarcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of cholangiocarcinoma and a method for treating cholangniocarcinoma
JP6181088B2 (ja) 癌の治療
KR20090039748A (ko) 암의 치료, 진단 또는 검출을 위한 ａｍｉｇｏ-2 억제제
JP4865868B2 (ja) 悪性中皮種の治療方法
KR20100014405A (ko) 암치료용 모노클로날 항체
WO2016133059A1 (ja) Ｆｓｔｌ１を利用した抗がん剤・転移抑制剤およびその併用剤
CN114040774A (zh) 结合肿瘤组织用于诊断和治疗的抗体
KR20120123619A (ko) 혈관형성 및 종양 성장을 억제하기 위한 폴리펩티드 화합물
CN117897402A (zh) 使用抗cd300c抗体的组合疗法
AU2013231846A1 (en) Combination therapies including inhibitors of the extracellular domain of E-cadherin
CN117751141A (zh) 用于预防或治疗癌症的抗cd300c单克隆抗体及其生物标志物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application