CN114040774A - 结合肿瘤组织用于诊断和治疗的抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了一种通过与细胞外RNA‑蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤组织结合的抗体。此类抗体用于诱导免疫反应的方法和抑制肿瘤细胞生长的方法中。另外提供了产生此类抗体的方法。

Description

结合肿瘤组织用于诊断和治疗的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,285；2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,310；2019年5月3日提交的美国临时申请号62/843,298；2019年5月6日提交的美国临时申请号62/843,751；2019年5月24日提交的美国临时申请号62/852,830；2019年10月29日提交的美国临时申请号62/927,501，所述申请各自出于所有目的以引用的方式整体并入。
癌症治疗剂领域
用于治疗各种癌症的治疗性抗体对患者的缓解和存活产生了巨大影响。然而，仍然需要替代的肿瘤治疗剂，以用于例如治疗对疗法反应不佳和/或对疗法产生抗性的患者。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种与肿瘤组织结合的分离的抗体，其中所述抗体与包含聚腺苷酸化RNA的细胞外RNA-蛋白质复合物结合。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物还包含rRNA。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含mRNA。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含一种或多种聚腺苷酸化RNA结合蛋白。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物还包含核糖体蛋白。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含mRNA结合蛋白。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚(A)+结合蛋白。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸结合蛋白家族成员。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸结合蛋白细胞质(PABPC)家族成员。在一些实施方案中，PABPC家族成员为PABPC 1(PABPC1)、PABPC 3(PABPC3)或PABPC 4(PABPC4)。在一些实施方案中，PABPC家族成员为PABPC1。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含MOV10。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含生物分子缩合物。在一些实施方案中，生物分子缩合物由应力诱导。在一些实施方案中，生物分子缩合物由缺氧和/或化学治疗药物诱导。在一些实施方案中，抗体通过与FcγR结合来诱导细胞信号传导。在一些实施方案中，抗体包含与FcγRIIa结合的Fc区。在一些实施方案中，抗体在FcγRIIa接合测定中具有500nM或更低的EC50。在一些实施方案中，FcγRIIa接合测定采用体内传代的EMT6肿瘤细胞。
在另一方面，本文提供了一种与细胞外RNA-蛋白质复合物结合的抗体，并且其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含：
(i)SEQ ID NO:1-8或169-362中的任一个的HCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；
(ii)SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的HCDR2，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；以及
(iii)SEQ ID NO:20-47、557-750或1727中的任一个的HCDR3，或其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；
(b)轻链可变区，其包含：
(i)SEQ ID NO:48-58或751-944中的任一个的LCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的变体；
(ii)SEQ ID NO:59-67或945-1138中的任一个的LCDR2，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；以及
(iii)SEQ ID NO:68-76或1139-1332中的任一个的LCDR3，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。在一些实施方案中，所述取代中的至少1或2个是保守取代；所述取代中的至少50％是保守取代；或所述取代全部都是保守取代。
在一些实施方案中，CDR中的每个中的取代提供包含符合下式的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3：
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)X9(S/T)(SEQ IDNO:1734)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；X6为A、H、K、M、N或R；并且X9为F、M或Y；
(b)HCDR2序列(F/R)I(K/Q)(A/S)X5X6X7(A/G)X9X10T(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)(SEQID NO:1735)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X7为D、E或N；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；以及
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)X5CX7(G/S)X9X10CX12X13X14(D/E)X16SX18X19X20X21X22X23X24X25(F/Y)(F/Y)X28X29(D/N)X31(SEQ ID NO:1736)，其中X3为A、P、S或T；X5为A、C或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X13为A、N或S；X14为H、Q、R或S；X16为N、Q或T；X18为F、M或Y；X19为C、S或V；X20为A、G或N；X21为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N、S或Y；X24为A、K、N、P、Q或S；X25为D、K、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列X1G(A/S)X4(S/T)(D/N)I(G/Q)(H/S)X10X11(T/V)X13(SEQ ID NO:1737)，其中X1为H、S或T；X4为E、K、P或S；X10为A、H、N、S或T；X11为A、D、S、T或Y；并且X13为A、L、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7(SEQ ID NO:1738)，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)(F/W)(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)(SEQ ID NO:1739)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q、R或W。
在一些实施方案中，抗体包含VH区，其包含含有SEQ ID NO:1-8或169-362中的任一个的序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的序列的HCDR2、含有SEQID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的序列的HCDR3；含有SEQ ID NO:48-58或751-944中的任一个的序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:59-67或945-1138中的任一个的序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:68-76或1139-1332中的任一个的序列的LCDR3，其中1或2个氨基酸被HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个取代。
在一些实施方案中，抗体包含VH区，其包含SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或VL区，其包含SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含VH区，其包含SEQ ID NO:77-122和1333-1526或1725中的任一个的VH区中列出的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和VL区，其包含SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的对应轻链的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些实施方案中，CDR中的每个中的取代提供包含符合下式的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3：
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)(F/M)(S/T)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；并且X6为A、H、K、M或N；
(b)HCDR2序列RIK(A/S)X5X6(D/N)(A/G)X9X10(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)CCX7(G/S)X9X10CX12(N/S)X14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24,X25(F/Y)YX28X29(D/N)X31，其中X3为A、P或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X14为H、Q、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或Q；X25为D、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列(S/T)G(A/S)X4(S/T)(D/N)IG(H/S)X10X11(T/V)X13，其中X4为K、P或S；X10为A、N、S或T；X11为A、S、T或Y；并且X13为A、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)W(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q或R。
在一些实施方案中，抗体包含表1A或表2A中命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3或其变体，与表1B或表2B示出的对应CDR序列相比，所述变体中的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR含有1或2个氨基酸取代。
在一些实施方案中，抗体包含表1B或表2B中命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在另一方面，本文提供了一种与细胞外RNA-蛋白质复合物结合的抗体，并且其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含：
(i)具有序列GF(T/V)(F/Y)(S/A)X6AWM(S/T)(SEQ ID NO:1728)的HCDR1，其中X6为K、A或M；
(ii)具有RIK(S/A)X5X6(D/E)(G/A)X9X10T(D/E)YAA(P/S)VKG(SEQ ID NO:1729)的序列的HCDR2，其中X5为V、N、A或T；X6为T、Q、S、D或H；X9为E、H、K或G；并且X10为T、Q或I；
(iii)具有(I/T)(S/T)SFCC(H/R)(G/S)X9X10CPSX14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24X25(F/Y)Y(F/Y)(M/V)(D/N)X31(SEQ ID NO:1730)的序列的HCDR3，其中X9为A、G、K或N；X10为N、Q、R或S；X14为H、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或S；X25为D、Q、R或S；X19为D或N；并且X31为I、P或V；
(b)轻链可变区，其包含：
(i)具有SG(S/A)X4(S/T)(N/D)IGSSX11VX13(SEQ ID NO:1731)的序列的LCDR1，其中X4为S、P或K；X11为S、Y或T；并且X13为S、Y或T；
(ii)具有(K/M)(N/D)X3X4R(P/A)X7(SEQ ID NO:1732)的序列的LCDR2，其中X3为S、N或T；X4为L、Q或A；X5为P或A；X7为Q、S、Y或L；以及
(iii)具有(S/A)(T/S)W(D/N)X5X6(L/N)X8(V/I)R(V/I)(SEQ ID NO:1733)的序列的LCDR3，其中X5为E、D或N；X6为S、A或Q；并且X8为N、S或T。在一些实施方案中，在HCDR1序列中，位置3为T；位置4为F；位置5为S；位置6为K；且/或位置10为S。在一些实施方案中，HCDR1序列包含序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)。在一些实施方案中，HCDR1包含GFTFSAAWMS(SEQID NO:4)、GFVFSKAWMS(SEQ ID NO:7)、GFTFAKAWMS(SEQ ID NO:6)、GFTYSKAWMS(SEQ IDNO:5)、GFTFSMAWMS(SEQ ID NO:3)、GFTYSAAWMS(SEQ ID NO:2)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)中的任一个的序列。在一些实施方案中，在HCDR2序列中，位置4为S；位置5为V；位置6为T；位置7为D；位置8为G；位置9为E；位置10为T；位置12为D；且/或位置16为P。在一些实施方案中，HCDR2包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，HCDR2包含序列RIKSVTDGEQTDYAAPVKG(SEQ ID NO:18)、RIKAADDGKQTDYAAPVKG(SEQ ID NO:19)、RIKSVTDGETTEYAASVKG(SEQ ID NO:9)、RIKAVHDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:10)、RIKSNTDAETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:11)、RIKSVQDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:12)、RIKSVTDGHTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:13)、RIKSVTDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:14)、RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)、RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，在HCDR3序列中，位置1为T；位置2为S；位置7为R；位置8为G；位置9为G；位置10为S；位置14为H；位置15为D；位置18为Y；位置20为G；且/或位置21为G。在一些实施方案中，HCDR3包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGYYKSYYYMDV(SEQ ID NO:33)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)或TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSFYYMDV(SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，HCDR3包含序列：
TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:29)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:27)、ISSFCCHSNNCPSSDTSYCNGYYKQYYFMDV(SEQ ID NO:26)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCGGQFKSYYFMDV(SEQ ID NO:25)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCNGYYADYYFMDV(SEQ ID NO:24)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)、TTSFCCRGASCPSSDTSYCAGSYKSYYFVNI(SEQ ID NO:22)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:20)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:42)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGSYKSYYYMDV(SEQ ID NO:41)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:37)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:40)、TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:39)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)、TTSFCCRGGRCPSRDTSFCGGQYNSYYYMDV(SEQ ID NO:38)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYNRYYYMDV(SEQ ID NO:36)和TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，在LCDR1序列中，位置3为S；位置4为S；位置5为S；位置6为N；位置11为S；且/或位置13为S。在一些实施方案中，LCDR1包含序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)。在一些实施方案中，LCDR1包含序列SGSKSNIGSSYVS(SEQ ID NO:50)、SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56)、SGSKSNIGSSSVY(SEQ ID NO:55)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO:54)、SGASSNIGSSSVS(SEQ IDNO:52)、SGSSTNIGSSTVS(SEQ ID NO:53)、SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)或SGSSTNIGSSSVT(SEQ ID NO:49)。在一些实施方案中，在LCDR2序列中，位置1为K；位置2为N；位置3为N；位置4为Q；位置6为P；且/或位置7为S。在一些实施方案中，LCDR2序列包含序列KNNQRPS(SEQ IDNO:59)。在一些实施方案中，LCDR2包含序列KNNQRPY(SEQ ID NO:66)、KDNQRPS(SEQ ID NO:62)、KNTQRPS(SEQ ID NO:65)、KNNARPY(SEQ ID NO:64)、KNTQRAS(SEQ ID NO:63)、MNNQRPY(SEQ ID NO:61)或KDNQRPL(SEQ ID NO:60)。在一些实施方案中，在LCDR3序列中，位置1为S；位置2为T；位置4为D；位置5为D；位置6为S；位置7为L；位置8为S；位置9为V；且/或位置11为V。在一些实施方案中，LCDR3序列包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)。在一些实施方案中，LCDR3序列包含序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)、SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO:71)、ATWDDQLSVRV(SEQ ID NO:69)、ATWDDSLTVRI(SEQ ID NO:76)、ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)或STWDESLSVRV(SEQ ID NO:73)。
在一些实施方案中，HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)、GFTFSAAWMS(SEQID NO:4)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)；HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)或RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)；HCDR3具有序列TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:20)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:27)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)或TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)；
LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56)、SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO:54)或SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)；LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)或KDNQRPS(SEQ ID NO:62)；并且
LCDR3具有序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)、STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)、SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO:71)或ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)
在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:92)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:77)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:80)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:86)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)和EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:95)中的任一个的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，可与前述重链可变区组合的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:138)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:136)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:132)和QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:141)中的任一个的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，抗体包含具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的HCDR1；具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的HCDR2；具有序列TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)的HCDR3；具有序列SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56)的LCDR1；具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的LCDR2；以及具有序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)的LCDR3。在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQID NO:92)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:138)的序列具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ IDNO:92)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:138)。
在一些实施方案中，HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)；HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQID NO:9)；HCDR3具有TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQID NO:20)的序列；LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)；LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)；并且LCDR3具有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)。在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:77)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:77)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)
在一些实施方案中，HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)；HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQID NO:9)；HCDR3具有序列TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)；LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)；LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)；并且LCDR3具有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)。
在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:80)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:80)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)。
在一些实施方案中，HCDR1具有序列GFTFSAAWMS(SEQ ID NO:4)；HCDR2具有序列RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)；HCDR3具有序列ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)；LCDR1具有序列SGSSTNIGSSSVS(SEQID NO:54)；LCDR2具有序列KDNQRPS(SEQ ID NO:62)；并且LCDR3具有序列SSWDDSNSVRI(SEQID NO:71)。
在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:136)的序列具有至少90％同一性的序列。`
在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:136)。
在一些实施方案中，抗体具有HCDR1序列GFTFSAAWMS(SEQ ID NO:4)；HCDR2序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)；HCDR3序列ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQID NO:27)；LCDR1序列SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)；LCDR2序列KDNQRPS(SEQ ID NO:62)；以及LCDR3序列ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:86)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:132)的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:86)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:132)。
在一些实施方案中，抗体包含HCDR1序列GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)；HCDR2序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)；HCDR3序列TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQID NO:34)；LCDR1序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)；LCDR2序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)；和LCDR3序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)。
在一些实施方案中，重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:95)的序列具有至少90％同一性的序列；并且轻链可变区具有与QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:141)的序列具有至少90％同一性的序列。
在一些实施方案中，重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:95)；并且轻链可变区具有包含序列QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:141)的序列。
在一些实施方案中，抗体包含重链可变区，其包含：包含序列GFTFSKAWMT(SEQ IDNO:8)或GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的HCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR1；包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的HCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR2；以及包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的HCDR3，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR3；轻链可变区，其包含：包含序列SGSSDNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的LCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR1；包含序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的LCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR2；以及包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的LCDR3，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含：重链可变区，其包含FR1，所述FR1包含相对于SEQID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR1序列的1、2或3个位置处的取代；FR2，所述FR2包含相对于SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR2序列的1、2或3个位置处的取代；FR3，所述FR3包含相对于SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR3序列的1、2或3个位置处的取代；和/或FR4，所述FR4包含相对于SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR4序列的1或2个位置处的取代；以及轻链可变区，其包含FR1，所述FR1包含相对于SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR1序列的1、2或3个位置处的取代；FR2，所述FR2包含相对于SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR2序列的1、2或3个位置处的取代；FR3，所述FR3包含相对于SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR3序列的1、2或3个位置处的取代；和/或FR4，所述FR4包含相对于SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR4序列的1或2个位置处的取代。
在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:77-122或13333-1526或1725中的任一个具有至少95％同一性的VH；和与SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个具有至少95％同一性的对应VL。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1721的重链恒定区序列和SEQ ID NO:1722的轻链恒定区序列。
在另一方面，本文提供了一种与细胞外RNA-蛋白质复合物结合的抗体，其中抗体包含：重链可变区，其包含：包含序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的HCDR1，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR1；包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的HCDR2，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR2；和包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的HCDR3，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR3；以及轻链可变区，其包含：包含序列SGSSSNIGSSSVS(SEQID NO:48)的LCDR1，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR1；包含序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的LCDR2，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR2；和包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的LCDR3，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR3。
在一些实施方案中，抗体包含含有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的HCDR1、含有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的HCDR2、含有序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的HCDR3、含有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的LCDR1、含有序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的LCDR2和含有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的LCDR3。在一些实施方案中，VH包含与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且VL包含与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)；并且VL包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)。在一些实施方案中，抗体包含SEQID NO:1721的重链恒定区序列和SEQ ID NO:1722的轻链恒定区序列。在一些实施方案中，重链包含SEQ ID NO:1723的序列，并且轻链包含SEQ ID NO:1724的序列。
在另一方面，本文提供了一种诱导免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用本节前述段落所述的抗体中的任一种。在一些实施方案中，免疫反应包括ADCP反应。在一些实施方案中，抗体经静脉内施用。
在另一方面，本文提供了一种治疗患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用前述段落所述的抗体中的任一种。在一些实施方案中，抗体是如上述段落[0011]至[0034]中的任一个所述的抗体。在一些实施方案中，癌症为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，抗体经静脉内施用。在一些实施方案中，所述方法还包括施用化学疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，所述方法还包括施用靶向免疫检查点抗原的剂。在一些实施方案中，所述剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体阻断PD-1配体与PD-1结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为抗PD-1抗体。
在另一方面，本文提供了一种鉴定患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的患者的方法，所述方法包括将来自所述患者的肿瘤样品与如前述段落所述的抗体接触。
在另一方面，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码如前述段落所述的抗体的VH区的多核苷酸。另外，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码如前述段落所述的抗体的VL区的多核苷酸。在一些实施方案中，表达载体包含编码抗体的VH区和VL区的多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的表达载体包含编码前述段落中的任一个所述的抗体的VH或VL CDR3的多核苷酸。本文还提供了包含如本段落所述的表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为CHO细胞，诸如CHO K-1细胞。
另外，本文提供了一种产生抗体的方法，所述方法包括在表达编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸的条件下培养如前述段落所述的宿主细胞。
在另一方面，本文提供了一种鉴定具有抗肿瘤活性的抗体的方法，所述方法包括诱变编码如前述段落所述的抗体中的任一种的VH或VL CDR3的多核苷酸；表达包含诱变的VH或VL CDR3的抗体；以及选择在体内抑制肿瘤生长或减小肿瘤大小、肿瘤侵袭和/或转移的抗体。
在另一方面，本文提供了一种前述段落所述的抗体中的任一种在体内诱导免疫应答的方法中的用途。本文还提供了一种前述段落所述的抗体中的任一种在治疗癌症的方法中的用途。在一些实施方案中，治疗患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的受试者的癌症。在一些实施方案中，癌症为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。在一些实施方案中，癌症为非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，抗体经静脉内施用。在一些实施方案中，所述方法还包括施用化学疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，所述方法还包括靶向免疫检查点抗原的剂。在一些实施方案中，所述剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体阻断PD-1配体与PD-1结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为抗PD-1抗体。
在另一方面，本文提供了一种多肽，所述多肽包含VH序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)；和VL序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)。另外，本文提供了一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1723的重链序列和SEQ ID NO:1724的轻链区序列。
在另一方面，本文提供了一种抗肿瘤抗体，所述抗肿瘤抗体包含重链可变(VH)区和轻链可变(L)区，其中：(a)VH区包含含有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的CDR1序列，或其具有1、2或3个取代的变体；含有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)、RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)或RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)的CDR2序列，或CDR2序列的具有1、2、3、4或5个氨基酸取代的变体；和含有如参考SEQ ID NO:77-122中的任一个所编号的T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(R/S)YYYMDV的CDR3序列；并且(b)VL区包含含有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的CDR1序列，或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；含有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的CDR2，或其具有1或2个氨基酸取代的变体；和含有如参考SEQ ID NO:77-122中的任一个所编号的STWD(D/E)DSLSVRV的CDR3序列。在一些实施方案中，VH区包含CDR1变体序列GFTFSKAWM(S/T)和/或CDR2序列RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)TDYAAPVKG。在一些实施方案中，VH CDR3序列包含：
T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNSYYYMDV或T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。
在一些实施方案中，VH区包含CDR1变体序列GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)、CDR2序列RIKSVT(D/E)GETTDYAAPVKG和CDR3序列T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(R/S)YYYMDV，例如，T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV或T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。在一些实施方案中，VH包含CDR3序列TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:37)、TSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:39)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:40)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGSYKSYYYMDV(SEQ ID NO:41)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:42)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYNRYYYMDV(SEQ ID NO:36)、TSSFCCRGGRCPSRDTSFCGGQYNSYYYMDV(SEQ ID NO:1740)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)或TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:35)。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含如表1B中列出的VH CDR1、CDR2和/或CDR3。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包括包含VL区，其包含CDR1序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)，或其具有1、2、3或4个氨基酸取代的变体；CDR2序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)，或其具有1、2或3个取代的变体；和CDR3序列STWD(D/E)SLSVRV。在一些实施方案中，CDR1序列为SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)，且/或CDR2序列为KNNQRPS(SEQ ID NO:59)。
本文还提供了一种包含VH区和VL区的抗肿瘤抗体，其中：(a)VH区包含与表1B中列出的CDR1序列具有至少80％同一性；与表1B中列出的CDR2序列具有至少80％同一性；和与表1B中列出的CDR3序列具有至少80％同一性的CDR1序列；并且(b)VL区包含(i)与表1B中列出的CDR1序列具有至少80％同一性的CDR1序列；与表1B中列出的CDR2序列具有至少80％同一性的CDR2序列；和与1B中列出的CDR3序列具有至少80％同一性的CDR3序列。在一些实施方案中，抗体包含VH，其包含与SEQ ID NO:77-122中的任一个的位置1至25的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR1；与SEQ ID NO:77-122中的任一个的位置36至49的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR2；与SEQ ID NO:77-122中的任一个的位置69至98的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR3；和/或与如参考SEQID NO:77-122中的任一个确定的位置130-140的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR4。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含VL，其包含与SEQ ID NO:123-168中的一个的位置1至22的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR1；与SEQ ID NO:123-168中的任一个的位置36至50的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR2；与SEQ ID NO:123-168中的任一个的位置58至89的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR3；和/或与如参考SEQ ID NO:123-168中的任一个确定的位置101至110的氨基酸序列具有至少90％同一性的FR4。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:77-122中的任一个具有至少70％同一性的VH区；和/或与SEQ ID NO:123-168中的任一个具有至少70％同一性的VL。在一些实施方案中，VH区与SEQ ID NO:77-122中的任一个具有至少80％同一性；且/或VL区与SEQ ID NO:123-168中的任一个具有至少80％同一性。在一些实施方案中，VH区与SEQ IDNO:77-122中的任一个具有至少90％同一性；且/或VL区与SEQ ID NO:123-168中的任一个具有至少90％同一性。在其他实施方案中，VH区与SEQ ID NO:77-122中的任一个具有至少95％同一性；且/或VL区与SEQ ID NO:123-168中的任一个具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体或可用于评价具有细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤样品的抗体包含：
包含氨基酸序列SEQ ID NO:101的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:147的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:148的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:203的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:149的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:104的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:150的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:151的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:106的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:152的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:107的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:153的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:94的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:140的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:1335的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:1529的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:108的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:154的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:97的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:143的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:98的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:144的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:109的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:155的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:110的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:156的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:1136的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:1530的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:99的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:145的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:95的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:141的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:100的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:146的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:96的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:142的VL区；
包含氨基酸序列SEQ ID NO:1333的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:1527的VL区；或
包含氨基酸序列SEQ ID NO:1334的VH区和包含氨基酸序列SEQ ID NO:1528的VL区。
在一些实施方案中，如本文所述的抗体(例如具有表1A中列出的VH和对应VL的抗肿瘤抗体)包含与SEQ ID NO:1721具有至少90％同一性的IgG1重链恒定区和与SEQ ID NO:1722具有至少90％同一性的λ轻链恒定区。在一些实施方案中，IgG1重链恒定区包含SEQ IDNO:1721的序列，并且λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:1722的序列。
在另一方面，此处提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码如本文(例如，前两个段落)所述的抗体的VH区和/或VL区的多核苷酸。另外，本文提供了一种表达载体，所述表达载体包含编码如本文(例如，前两个段落)所述的抗肿瘤抗体的VH或VL CDR3的多核苷酸。本公开还提供了一种包含例如本文所述的本公开的表达载体的宿主细胞；或包含编码如本文(例如，前两个段落)所述的抗肿瘤抗体的VH区和/或VL区的多核苷酸的宿主细胞。
在另一方面，本文提供了一种鉴定具有抗肿瘤活性或肿瘤结合活性的抗体的方法，所述方法包括诱变编码如表1B或表2B中列出的VH或VL CDR3的多核苷酸；表达包含诱变的VH或VL CDR3的抗体；以及选择在体内抑制肿瘤生长、减小肿瘤大小、减少肿瘤侵袭和/或转移的抗体。
在另一方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用本公开的抗体，所述癌症诸如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。在一些实施方案中，例如在接受抗肿瘤抗体之前，还向受试者施用化学治疗剂和/或放射疗法。在一些实施方案中，向患者另外施用靶向免疫检查点抗原的治疗剂，例如，所述治疗剂为检查点抑制剂，诸如靶向PD-1/PD-L1免疫检查点的单克隆抗体，诸如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在另一方面，本文提供了一种包含重链和轻链的抗肿瘤抗体，其中所述重链包含重链可变区(VH)，其包含含有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的CDR1、含有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的CDR2和含有TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的CDR3；并且所述轻链包含轻链可变区(VL)，其包含含有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的CDR1、含有(SEQ ID NO:59)的CDR2和含有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的CDR3；并且此外，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:1721具有至少90％同一性的IgG1重链恒定区和与SEQ ID NO:1722具有至少90％同一性的λ轻链恒定区。在一些实施方案中，IgG1重链恒定区包含SEQ ID NO:1721的序列，并且λ轻链恒定区包含SEQ ID NO:1722的序列。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含具有SEQ ID NO:94的序列的VH区和具有SEQ ID NO:140的序列的VL区。在一些实施方案中，如本文所述的抗肿瘤抗体包含SEQ ID NO:1723的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:1724的轻链氨基酸序列。
在另一方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文(例如，前述段落)所述的抗肿瘤抗体和生理学上可接受的载剂。在一些实施方案中，药物组合物包含在pH 5.5下的20mM组氨酸缓冲液、8％(重量/体积)蔗糖、0.02％(重量/体积)聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，抗体以20mg/ml的浓度储存。
在另一方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用前述段落的药物组合物。在一些实施方案中，患者患有肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。在特定实施方案中，患者患有非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌或黑色素瘤。在某些实施方案中，黑色素瘤为肢端黑色素瘤。在一些实施方案中，药物组合物经静脉内施用。在特定实施方案中，药物组合物以0.1mg/kg至100mg/kg(例如，0.3mg/kg至30mg/kg)范围内的剂量经静脉内施用。在一些实施方案中，每三周一次施用药物组合物。在一些实施方案中，所述方法还可包括施用化学疗法和/或放射疗法。在一些实施方案中，所述方法还可包括施用靶向免疫检查点抗原的剂。在某些实施方案中，所述靶向免疫检查点抗原的剂可为单克隆抗体，例如，阻断PD-1配体与PD-1的结合的单克隆抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体为抗PD-1抗体。
在另一方面，本文提供了一种包含编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸。在另一方面，本文提供了一种包含所述多核苷酸的表达载体。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述多核苷酸的宿主细胞。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征在于包含编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列的多核苷酸。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述多核苷酸的表达载体。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述多核苷酸的宿主细胞。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征还在于表达载体，所述表达载体包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸和含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列的多核苷酸。在另一方面，本公开的特征还在于包含所述表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征还在于包含两个多核苷酸的宿主细胞，一个多核苷酸包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸，并且另一个多核苷酸包含编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列。
在另一方面，本公开的特征还在于包含两个表达载体的宿主细胞，一个表达载体包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸，并且另一个表达载体包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的宿主细胞为CHO细胞，例如CHO-K1细胞。
在另一方面，本公开的特征在于产生此处所述的抗体的方法。所述方法包括在表达编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸的条件下培养本文所述的宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征在于产生本文所述的抗体的方法。所述方法包括在将编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸从它们各自的宿主细胞中表达的条件下，一起培养具有包含编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸的宿主细胞和具有包含编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列的多核苷酸的宿主细胞。
在另一方面，本公开的特征在于产生本文所述的抗体的方法。所述方法包括在将编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸从它们各自的宿主细胞中表达的条件下，一起培养具有包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的重链的核酸序列的多核苷酸的表达载体的宿主细胞和具有包含含有编码本文所述的抗肿瘤抗体的轻链的核酸序列的多核苷酸的表达载体的另一个宿主细胞。
在产生本文所述的抗体的方法的任一个中，在一些实施方案中，宿主细胞为CHO细胞，例如CHO-K1细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括纯化所述抗体。
附图说明
图1示出了来自与抗PD-1抗体组合的抗体池(4种抗体，每种抗体从肺癌患者获得)的筛选和筛选中鉴定出的先导抗体的肿瘤生长数据。图A，PBS对照；图B，仅抗PD1抗体；图C，抗PD1加抗体池；图E，抗PD1抗体和AIP-192482(先导抗体)的组合。
图2A和2B提供了示出施用先导抗体和变体对EMT6小鼠肿瘤模型中的肿瘤生长的影响的数据。
图3A和3B提供了示出施用初始先导抗体和变体对EMT6小鼠肿瘤模型中的存活的影响的数据。
图4A和4B提供了EMT6小鼠肿瘤模型中先导抗体和变体的归一化曲线上面积(NAAC)肿瘤体积数据。
图5A-5D提供了示出施用先导抗体和变体对EMT6小鼠肿瘤模型中的肿瘤生长的影响的数据。
图6A和6B示出了在EMT6肿瘤模型中将先导抗体和变体与对照比较的存活数据。
图7A-7B提供了针对在EMT6小鼠肿瘤模型中测试的初始先导抗体和变体获得的NAAC数据。
图8总结了在EMT-6小鼠肿瘤模型中测试各个变体作为单一疗法和与抗PD-1抗体组合的研究设计。
图9示出了初始先导抗体和在图8中总结的研究中测试的两种变体的单一疗法存活数据。
图10提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中测试的两种变体的单一疗法肿瘤生长数据。
图11提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中测试的两种变体的单一疗法存活概率数据。
图12提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中测试的两种变体的单一疗法肿瘤体积数据。
图13提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中与抗PD1抗体组合测试的两种变体的组合疗法肿瘤生长数据。
图14提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中与抗PD1抗体组合测试的两种变体的组合疗法存活概率数据。
图15提供了初始先导抗体和在图8中总结的研究中与抗PD1抗体组合测试的两种变体的组合疗法肿瘤体积数据。
图16提供了CT26小鼠模型中初始先导抗体和两种变体的肿瘤生长数据。
图17提供了CT26小鼠模型中测试的初始先导抗体和两种变体的存活概率数据。
图18提供了CT26小鼠模型中测试的初始先导抗体和两种变体的肿瘤体积数据。
图19提供了示出变体抗体AIP-157397和AIP-165430与肿瘤和肿瘤邻近组织(TAT)的结合的免疫组织化学结合数据。
图20提供了示出变体AIP-106042与肿瘤组织的结合的免疫组织化学结合数据。
图21提供了示出变体AIP-100196与肿瘤组织的结合的免疫组织化学结合数据。
图22提供了示出先导候选物和变体(包括抗体AIP-192482、AIP-160470、AIP-133645、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-187893、AIP-142079、AIP-184490和AIP-104188)与雌激素受体阳性乳腺肿瘤组织和TAT的结合的免疫组织化学结合数据。
图23A-23C提供了示出初始先导抗体(图23A)、变体AIP-133645(图23B)和变体AIP-160470(图23C)与源自人肺A549细胞、人胰腺BXPC3细胞、人结肠癌Colo-205细胞或人前列腺癌PC3细胞；以及源自小鼠结肠癌、乳腺癌、肺癌或肾癌细胞系的肿瘤的结合的免疫组织化学数据。
图24提供了示出用抗PD-1抗体、初始先导抗体或两种抗体的组合治疗后肿瘤中免疫细胞浸润的免疫组织化学数据。
图25提供了确定与体内抗肿瘤活性的相关性的离体结合测定的示意图。
图26提供了示出变体与EMT6离体细胞的结合与体内数据相关的数据。
图27提供了示出变体与离体EMT6细胞的结合与体内结果相关的数据。C＝对照抗EGFR抗体
图28提供了用AIP-192482免疫沉淀的蛋白质的SDS-PAGE分析结果。
图29提供了用RNA酶或DNA酶处理的AIP-192482-靶标复合物免疫沉淀物的分析结果。
图30示出了使用来自与AIP-192482缀合的M-280珠一起孵育然后交联的未标记A549细胞的裂解物进行免疫沉淀的SDS PAGE分析的结果。
图31示出了AIP-192482-抗原复合物在有和没有RNA酶处理的情况下的凝胶过滤纯化和柱馏分的SDS PAGEe分析。
图32A-D示出了表明AIP-192482信号与G3BP(应激颗粒的标志物)的信号之间的广泛重叠的免疫荧光成像实验的结果。结果还表明，尽管这些G3BP阳性结构的子集(即非常小的斑点)对AIP-192482免疫反应性不呈阳性，但在结构上更具异质性的较大聚集体中，反应性共定位。
图33A-D示出了对EMT6肿瘤组织进行的共聚焦成像实验的结果。将直径为约4μm的球形物体(由虚线矩形表示)用荧光染色突出显示，从而表明其在表面与AIP-160470发生反应，并在其内腔中具有CD9反应性。CD9是四跨膜蛋白(tetraspannin)，据报道它是细胞外囊泡的标志物。图33B-D是在每种情况下从三维重建的一个平面拍摄的图33A的图像内的某些区域的更高放大倍率图像。共聚焦成像三维重建结果表明，AIP-160470反应性在本质上明显是细胞外的，从而支持图35所示的流式细胞术数据的结论。
图34示出了对人乳腺癌组织进行的共聚焦成像实验的结果。图像示出大量直径约1μm的CD9阳性囊泡块嵌入来自AIP-160470的信号(由白色箭头指示)。图34B-D是在每种情况下从三维重建的一个平面拍摄的图34A的图像内的某些区域的更高放大倍率图像。共聚焦成像三维重建结果示出，大多数CD9阳性囊泡块位于附近细胞的外部。
图35A和35B示出了在体外用化学治疗剂多柔比星(“DOX”)处理16小时后用AIP-192482和AIP-160470染色的EMT6细胞的流式细胞术分析。针对用于处理EMT6细胞的DOX浓度，绘制与通过流式细胞术检测的抗体与EMT6细胞的结合相对应的几何平均荧光的图。结果示出DOX诱导的EMT6细胞中AIP-192482和AIP-160470的随着时间推移的表面反应性。这些数据补充了图33中示出体内EMT6细胞的生长也诱导此种表面反应性的数据。
图36示出了EMT6细胞中由多柔比星(“DOX”)和顺铂(“CDDP”)两者诱导的表面反应性。
图37A和37B。AIP-160470的Kabat、Chothia和IMGT编号。
图38A和38B。图38A和38B提供了示出RNA优先被AIP-192482免疫沉淀的数据。对A549裂解物进行免疫沉淀，并用Trizol提取结合的RNA，然后使用Zymo Quick-RNAMiniprep试剂盒进行纯化。纯化后，通过Qubit对RNA进行定量，并在Agilent Bioanalyzer2100上用RNA 6000pico测定进行分析。然后加工RNA以用于使用Illumina的NEBNext UltraII RNA库制备试剂盒(NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit)进行测序，并在Illumina MiSeq上用V3 600循环(2x300 PE)测序试剂盒进行测序。使用AfterQC对读长进行质量过滤，然后使用TopHat与人基因组hg19进行比对，并使用featureCounts对映射读长进行量化。
图39示出了体外FcR接合测定中的变体活性。
图40列出了针对第1轮体内研究选择的变体。
图41列出了针对第2轮体内研究选择的变体。
图42示出了体内活性的研究设计。
图43提供了示出第2轮随机化时各队列的肿瘤体积的数据。
图44示出了第2轮中变体的抗肿瘤作用，按中值存活排序。
图45示出了在第2轮中表现出最有效反应的抗体，按NAAC效应大小排序。
图46示出了在第2轮中表现出最有效反应的抗体，按NGRM效应大小排序。
图47示出了在第2轮中引发最完全反应的抗体。
图48示出了在第2轮中表现出最持久反应的抗体
图49提供了图49中提供的具有抗肿瘤作用的变体抗体的子集的体内活性的总结。
图50A和50B示出了体外Fc-γ受体测定结果与体内活性之间的关系
图51示出了在研究过程中产生的ATRC-101序列变体以及用于ATRC-101的药理学评价的示意图。数字是指示Fv变体的AIP编号：192482＝AIP-192482、133645＝AIP-133645、160470＝AIP-160470。Fc＝可结晶片段；Fv＝可变片段；hIgG1＝人免疫球蛋白G，亚类1；IRCTM＝免疫组库捕获(Immune Repertoire
Figure GDA0003431173340000371
)；mIgG1＝小鼠免疫球蛋白G，亚类1；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mIgG3＝小鼠免疫球蛋白G，亚类3；N297A＝位置297处天冬酰胺到丙氨酸的修饰。ATRC-101是完全人免疫球蛋白G，亚类1(IgG1)/λ抗体，其包含AIP-160470的VH和VL区。
图52示出了结合在结直肠癌、三阴性乳腺癌和黑色素瘤上的ATRC-101的免疫荧光表达分析结果。嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与福尔马林固定的石蜡包埋的来自CRC、TNBC和黑色素瘤的肿瘤和肿瘤邻近组织的结合。通过标准免疫荧光法，使用10μg/mL AlexaFluor 647缀合的AIP-AIP-160470mIgG2a评估结合，并将其与Alexa Fluor 647缀合的mIgG2a同种型对照单克隆抗体进行比较。将组织用Hoechst复染。通过AIP-160470-mIgG2a或同种型检测到的信号以红色/洋红色示出，并且细胞核以蓝色标记。示出了相邻切片的H&E染色。H&E染色中的红线表示50μm。Adeno＝腺癌；CRC＝结直肠癌；H&E＝苏木精和伊红；μg＝微克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；TNBC＝三阴性乳腺癌
图53示出了核酸酶预处理对嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与人ER+乳腺癌组织的结合的影响。将新鲜冷冻组织切片用指定浓度的RNA酶A、RNA酶H或DNA酶I进行预处理。对切片进行洗涤、在多聚甲醛中固定并封闭，然后用20μg/mL Alexa Fluor 647缀合的AIP-160470-mIgG2a和抗E-钙粘蛋白或Alexa Fluor 647缀合的mIgG2a和兔IgG同种型对照抗体染色。将载玻片与Alexa Fluor 488缀合的二级抗兔抗体一起孵育。将切片洗涤并用Hoechst复染。AIP-160470-mIgG2a示出为红色/洋红色，E-钙粘蛋白示出为绿色，并且黄色表示AIP-160470-mIgG2a和E-钙粘蛋白的共定位。细胞核以蓝色标记。使用Axio Scan自动载玻片扫描仪(Zeiss)捕获图像。示出了相邻切片的H&E染色。黑色插图中的白线表示50μm。DNA酶＝脱氧核糖核酸酶；E-Cad＝E-钙粘蛋白；ER+＝雌激素受体阳性；H&E＝苏木精和伊红；μg＝微克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mL＝毫升；NSCLC＝非小细胞肺癌；RNA酶＝核糖核酸酶；U＝单位。
图54A和54B通过免疫荧光示出了嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a免疫反应性和人PABPC-1在正常组织和人癌中的分布。图像示出了嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a免疫反应性在人小肠腺癌(图39A)和来自对两个FFPE TMA(FDA808J-1和FDA808J-2；图39B)的研究的代表性正常大脑、小脑、心脏、肺、肝、肾、胰腺、胃和脾组织中的分布。将切片使用1.25μg/mLAlexa Fluor 647缀合的嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a染色。将相邻切片与兔多克隆PABPC-1抗体一起孵育，所述抗体用与Alexa Fluor 647缀合的抗兔二抗检测或H&E染色。FFPE＝福尔马林固定的石蜡包埋；H&E＝苏木精和伊红；μg＝微克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mL＝毫升；PABPC-1＝细胞质聚腺苷酸结合蛋白1；RabIgG＝兔免疫球蛋白G；TMA＝组织微阵列。
图55A和55B示出了在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中，ATRC-101和嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a的剂量依赖性肿瘤生长抑制作用。当组MTV分别达到112至113mm3和108mm3时，将BALB/c小鼠接种1×106个EMT6肿瘤细胞并每周两次IP给药指定剂量的嵌合抗体MFC-042(AIP-160470-mIgG2a；图41A)或ATRC-101(图41B)。所示为每个治疗组(15只动物/组)的平均值和平均值的标准误差。IP＝腹膜内；kg＝千克；mg＝毫克；MTV＝平均肿瘤体积。
图56示出了在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中，Fc效应功能对亲本抗体AIP-192482的嵌合变体的抗肿瘤功效的影响。将BALB/c小鼠接种1×106个EMT6肿瘤细胞，并在6天后随机分到治疗组。从EMT6接种后7天开始，在组平均肿瘤体积为94.5mm3的情况下，向小鼠每周两次IP给药10mg/kg亲本抗体AIP-192482的AIP-192482-mIgG2a、AIP-192482-mIgG1、AIP-192482-mIgG3或AIP-192482-mIgG2a-N297A嵌合变体或媒介物(磷酸盐缓冲盐水)。示出了来自每个治疗组(每组20只动物)的各个动物的肿瘤体积。对于具有CR的治疗组，示出了每组中具有CR的小鼠与总动物的比率。CR＝完全肿瘤消退；IP＝腹膜内；kg＝千克；mg＝毫克；mIgG1＝小鼠免疫球蛋白G，亚类1；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mIgG3＝小鼠免疫球蛋白G，亚类3；N297A＝位置297处天冬酰胺到丙氨酸的修饰；mm＝毫米。
图57示出了在EMT6-BALBc同基因小鼠肿瘤模型，研究EFF-016中，嵌合亲本抗体AIP-192482和序列优化的变体的抗肿瘤功效。在研究EFF-016中，将BALB/c小鼠接种1×106个EMT6肿瘤细胞，并在6天后随机分到治疗组(每组20只动物)。从EMT6接种后7天开始(组平均肿瘤体积为156mm3)，向小鼠每周两次IP给药指定剂量的嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a、嵌合序列优化的变体AIP-133645-mIgG2a、嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a或媒介物(DPBS)。所示为直至第53天每个治疗组中各个小鼠的肿瘤体积。DPBS＝达尔伯克氏(Dulbecco’s)磷酸盐缓冲盐水；IP＝腹膜内；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mm＝毫米。
图58A和58B示出了在EMT6-BALBc同基因小鼠肿瘤模型，研究EFF-020中，嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a和序列优化的变体的抗肿瘤功效。在研究EFF-020中，将BALB/c小鼠接种1×106个EMT6肿瘤细胞，并在6天后随机分到治疗组(每组20只动物)，此时组平均肿瘤体积为大约104mm3。从第7天开始，向小鼠每周两次IP给药5mg/kg或10mg/kg嵌合抗体AIP-192482-mIgG2a、2.5mg/kg或5mg/kg嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a或媒介物(DPBS)，共7次剂量。从第7天开始，还向小鼠每周两次IP给药10mg/kg抗小鼠PD-1单克隆抗体或媒介物(DPBS)，共4次剂量。在单一疗法组中，根据缺少的测试制品的给药方案施用媒介物。图44A示出了直至第35天AIP-192482-mIgG2a治疗组和对照组中各个小鼠的肿瘤体积。图44B示出了直至第35天AIP-160470-mIgG2a治疗组和对照组中各个小鼠的肿瘤体积。CR＝完全肿瘤消退；DPBS＝达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水；IP＝腹膜内；kg＝千克；mg＝毫克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mm＝毫米；PD-1＝程序性死亡受体1。
图59A和59B示出了在CT26-BALBc同基因小鼠肿瘤模型，研究EFF-039中，嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤功效。在研究EFF-039中，将BALB/c小鼠接种1×106个CT26肿瘤细胞，并在6天后随机分到治疗组。从CT26接种后7天开始(组平均肿瘤体积为大约145mm3)，向小鼠每周三次IP给药20mg/kg嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a(40只动物)或媒介物(DPBS；20只动物)。图45A示出了直至第35天每个治疗组中各个小鼠的肿瘤体积。图45B示出了直至第97天给药AIP-192482-mIgG2a的治疗组的肿瘤体积。示出了直至第97天的CR数。DPBS＝达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水；IP＝腹膜内；kg＝千克；mg＝毫克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mm＝毫米
图60示出了在E0771–C57BL/6同基因小鼠肿瘤模型，研究EFF-006中，抗体AIP-192482-mIgG2a单独或与PD-1阻断组合的抗肿瘤功效。在研究EFF-006中，将C57BL/6小鼠接种1×106个E0771肿瘤细胞，并在8天后随机分到每组20只动物的治疗组，此时组平均肿瘤体积为大约104mm3。从E0771接种后9天开始，向小鼠每周两次IP给药20mg/kg嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a或媒介物(DPBS)，直至第30天。另外，从第9天开始，向小鼠每周两次IP给药2.5mg/kg抗小鼠PD-1单克隆抗体或媒介物(DPBS)。在单一疗法组中，根据缺少的测试制品的给药计划施用媒介物。所示为直至第35天每个治疗组中各个小鼠的肿瘤体积。示出了每个治疗组中的CR数。
CR＝完全肿瘤消退；DPBS＝达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水；IP＝腹膜内；kg＝千克；mg＝毫克；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；mm＝毫米；PD-1＝程序性死亡受体1。
图61示出了在EMT6-BALBc同基因小鼠肿瘤模型，研究TMD04中，对抗肿瘤功效的T细胞需求的评估。在研究TMD04中，将BALB/c小鼠接种1×106个EMT6细胞，并从第6天开始每周三次IP给药DPBS或抗小鼠CD8α抗体克隆2.43(BioXCell)。从第7天开始，每周两次以10mg/kg IP给药嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a或媒介物(DPBS)(每组10只动物)。所示为直至第27天的各个肿瘤体积。DPBS＝磷酸盐缓冲盐水；IP＝腹膜内；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a
图62A和62B示出了在用嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a处理后，对体内EMT6肿瘤中CD8+T细胞和巨噬细胞的M1极化的评估。作为抗肿瘤研究EFF-004的一部分，在第7、10、14天向具有建立的EMT6肿瘤的BALB/c小鼠给药媒介物(DPBS)或20mg/kg嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a。在研究第15天，从代表性小鼠中收获EMT6肿瘤。通过酪胺信号传导放大免疫荧光法对样品进行切片并用抗CD8或抗iNOS抗体染色。图48A示出了由用DPBS或AIP-192482-mIgG2a处理的动物染色以确定CD8+T细胞或iNOS+巨噬细胞(绿色)的存在的代表性肿瘤切片。插图示出了相邻切片的H&E染色。黑色背景上的白线表示50μm。图48B示出了DPBS或AIP-192482-mIgG2a施用后CD8+(5只动物)和iNOS+细胞(10只动物)的比例。通过非配对t检验评估显著性，其中*＝p<0.05；**＝p<0.01。DPBS＝达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水；H&E＝苏木精和伊红；iNOS＝诱导型一氧化氮合酶；mIgG2a＝小鼠免疫球蛋白G，亚类2a；PBS＝达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水
图63示出了单剂量静脉内施用ATRC-101后食蟹猴的血清浓度(研究ATRC-101.PK.18.01)。给予雄性和雌性食蟹猴一次静脉推注注射1mg/kg、10mg/kg或30mg/kgATRC-101。在给药后5分钟和1、4、8、12、24、48、96、168、240、336、504和672小时收集血液样品。所示为通过ELISA测量的ATRC-101血清浓度。ELISA＝酶联免疫吸附测定。
图64示出了重复剂量施用ATRC-101后食蟹猴的血清浓度(研究ATRC-101.TX.18.01)。通过IV输注给与雄性和雌性食蟹猴10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg ATRC-101的每周一次施用，共4次剂量。在第一次和最后一次给药和ATRC-101后15分钟和1、4、8、12、24、48、96和168小时收集血液样品。所示为通过ELISA测量的ATRC-101血清浓度。
具体实施方式
术语
如本文所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。因此，例如，对“抗体”的引用任选地包括两个或更多个此类分子的组合等。
如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围，例如，±20％、±10％或±5％，在所述值的预期含义内。
如本文所用，术语“抗体”意指包含特异性结合抗原表位所必需的可变区序列的分离的或重组的结合剂。因此，如本文所用，“抗体”是任何类或亚类或其片段的任何形式的抗体，其表现出所需的生物活性，例如结合特定的靶抗原。因此，它以最广泛的意义使用，并具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、人抗体、嵌合抗体、纳米抗体、双抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，包括但不限于scFv、Fab等，只要它们表现出所需的生物活性。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体(例如，Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为"Fab"片段，每个均具有单个抗原结合位点，和残余的"Fc"片段，其名称反映了易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
如本文所用，“肿瘤结合抗体”是指结合肿瘤组织的抗体。在一个实施方案中，肿瘤结合抗体通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用结合肿瘤组织。“细胞外RNA-蛋白质复合物”是指在肿瘤细胞外部检测到的复合物。复合物不需要整合到细胞的外表面，但在一些实施方案中，可作为与细胞膜相互作用的RNA和蛋白质分子的团块或聚集体与肿瘤细胞的外部缔合，或以其他方式存在于肿瘤细胞的外部。虽然细胞外RNA-蛋白质复合物在肿瘤细胞外部，但它也可另外存在于细胞内部。与肿瘤邻近组织(TAT)相比，本公开的“肿瘤结合抗体”表现出与肿瘤组织的优先结合，例如，注意到噪声之上的特定信号在肿瘤组织中相对于邻近组织具有明显增强的反应性。在一些实施方案中，肿瘤结合抗体为“抗肿瘤抗体”，其通过对肿瘤细胞的直接或间接影响降低肿瘤生长速率、肿瘤大小、侵袭和/或转移。
如本文所用，“V区”是指包含框架1、CDR1、框架2、CDR2和框架3的区段的抗体可变区结构域，包括CDR3和框架4。重链V区VH为V基因(HV)、D基因(HD)和J基因(HJ)重排的结果，在B细胞分化过程中称为V(D)J重组。轻链V区VL为V基因(LV)和J基因(LJ)重排的结果。
如本文所用，“互补决定区(CDR)”是指每条链中中断由轻链和重链可变区建立的四个“框架”区的三个高变区(HVR)。CDR是与抗原表位结合的主要贡献者。每条链的CDR称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始顺序地编号，并且还通过特定CDR所定位的链来鉴定。因此，例如，VH CDR3(HCDR3)位于发现它的抗体重链的可变结构域中，而VL CDR3(LCDR3)是来自发现它的抗体轻链的可变结构域的CDR3。当提及CDR序列时，在本申请中术语“CDR”可与“HVR”互换使用。
CDR和框架区的氨基酸序列可使用本领域中各种众所周知的定义来确定，所述定义例如Kabat、Chothia、国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见例如，Chothia和Lesk,1987,Canonical structures for the hypervariable regions ofimmunoglobulins.J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia C.等人,1989,Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions.Nature 342,877-883；Chothia C.等人,1992,structural repertoire of the human VH segments J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol 1997,273(4))。抗原结合位点的定义还描述于以下中：Ruiz等人,IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic Acids Res.,28,219–221(2000)；和Lefranc,M.-P.IMGT,the international ImMunoGeneTicsdatabase.Nucleic Acids Res.1月1日；29(1):207-9(2001)；MacCallum等人,Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,J.Mol.Biol.,262(5),732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268–9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203,121–153,(1991)；Pedersen等人,Immunomethods,1,126,(1992)；和Rees等人,In Sternberg M.J.E.(编),ProteinStructure Prediction.Oxford University Press,Oxford,141–172 1996)。对如通过Kabat编号确定的CDR的引用基于例如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institute ofHealth,Bethesda,MD(1991)。Chothia CDR如由Chothia所定义确定(参见例如，Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
“Fc区”是指不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域的抗体的恒定区。因此，例如对于人免疫球蛋白，“Fc”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的柔性铰链N末端。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及在Cγ1与Cγ之间的铰链。本领域理解，Fc区的边界可变化，然而，人IgG重链Fc区通常定义为在其羧基末端包含残基C226或P230，使用根据如Kabat等人(1991,NIH Publication 91-3242,NationalTechnical Information Service,Springfield,Va.)中的EU索引的编号。术语“Fc区”可指分离的此区域或在抗体或抗体片段的上下文中的此区域。“Fc区”包括Fc区的天然存在的等位基因变体以及修饰的Fc区，例如，其经修饰以调节效应功能或其他特性，诸如抗体的药代动力学、稳定性或生产特性。Fc区还包括未表现出生物学功能改变的变体。例如，可从免疫球蛋白Fc区的N末端或C末端删除一个或多个氨基酸，而不会显著丧失生物学功能。此类变体可根据本领域已知的一般规则进行选择，以便对活性的影响最小(参见例如，Bowie等人,Science 247:306-1310,1990)。例如，对于IgG4抗体，可引入单个氨基酸取代(根据Kabat编号的S228P；命名为IgG4Pro)以消除在重组IgG4抗体中观察到的异质性(参见例如，Angal等人,Mol Immunol 30:105-108,1993)。
如本文在Fc受体接合测定的上下文中使用的“EC50”是指半最大效应浓度，其是在指定的暴露时间后诱导基线与最大值之间的中间的反应(接合测定中产生的信号)的抗体浓度。Fc受体接合测定在本文“变体结合活性”部分中进一步描述。在一些实施方案中，“相对于EC50的倍数”通过将参考抗体的EC50除以测试抗体的EC50来确定。
术语“平衡解离常数”缩写为(KD)，是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。可使用任何方法测量平衡解离常数。因此，在一些实施方案中，本公开的抗体的KD小于约50nM，通常小于约25nM或小于约10nM，例如，小于约5nM或小于约1nM，并且常常小于约10nM，如通过在37℃下进行的使用生物传感器系统(诸如
Figure GDA0003431173340000461
系统)的表面等离子体共振分析所确定的。在一些实施方案中，如作为二价抗体所测量的，本公开的抗体的KD小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10- 8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10-14M、小于5x10-15M或小于10-15M或更低。在本发明的上下文中，“改进的”KD是指较低的KD。在一些实施方案中，如作为单价抗体(诸如单价Fab)所测量的，本公开的抗体的KD小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10- 9M、小于5x10-10M、小于10-10M、小于5x10-11M、小于10-11M、小于5x10-12M、小于10-12M、小于5x10-13M、小于10-13M、小于5x10-14M、小于10-14M、小于5x10-15M或小于10-15M或更低。在一些实施方案中，当通过在37℃下进行的使用生物传感器系统(诸如
Figure GDA0003431173340000462
Figure GDA0003431173340000463
系统)的表面等离子体共振分析测量时，本公开的抗肿瘤抗体的KD小于100pM，例如，或小于75pM，例如在1至100pM的范围内。在一些实施方案中，当通过在37℃下进行的使用生物传感器系统(诸如
Figure GDA0003431173340000464
系统)的表面等离子体共振分析测量时，本公开的抗肿瘤抗体的KD大于100pM，例如在100-1000pM或500-1000pM的范围内。
如本文所用，术语“单价分子”是指具有一个抗原结合位点的分子，例如，Fab或scFv。
如本文所用，术语“二价分子”是指具有两个抗原结合位点的分子。在一些实施方案中，本发明的二价分子为二价抗体或其二价片段。在一些实施方案中，本发明的二价分子为二价抗体。在一些实施方案中，本发明的二价分子为IgG。通常，单克隆抗体具有二价基本结构。IgG和IgE仅具有一个二价单元，而IgA和IgM由多个二价单元(分别为2个和5个)组成，并因此具有更高的价态。此二价性增加了抗体对抗原的亲合力。
如本文所用，术语“单价结合”或“与...单价结合”是指一个抗原结合位点与其抗原的结合。
如本文所用，术语“二价结合”或“与...二价结合”是指二价分子的两个抗原结合位点与其抗原的结合。在一些实施方案中，二价分子的两个抗原结合位点共享相同的抗原特异性。
如本文所用，术语“价态”是指抗体对抗原的不同结合位点的数量。单价抗体包含对抗原的一个结合位点。二价抗体包含对同一抗原的两个结合位点。
如本文在抗体与抗原结合的上下文中使用的术语“亲合力”是指抗体的多个结合位点的组合结合强度。因此，“二价亲合力”是指两个结合位点的组合强度。
在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，在指定区域(例如，两个序列的长度)上相同的或具有指定百分比的相同(例如，至少70％、至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)同一性的氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。出于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可通过多种方法进行，包括使用可公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件的方法。适用于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例为BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。因此，出于本发明的目的，BLAST 2.0可与默认参数一起使用，以确定序列同一性百分比。
当在鉴定多肽序列中的给定氨基酸残基的上下文中使用时，术语“对应于”、“参考...确定”或“参考...编号”是指，当对给定氨基酸序列进行最大比对并将其与参考序列相比时，指定参考序列的残基的位置。因此，例如，当残基与SEQ ID NO:1中的氨基酸比对时，当与SEQ ID NO:1最佳比对时，VH区多肽中的氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO:1的VH区中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不需要与参考序列的长度相同。
如本文所用，“保守”取代是指使得侧基链的电荷、极性、亲水性(疏水性、中性或亲水性)和/或大小得以保持的氨基酸的取代。可相互取代的说明性氨基酸组包括(i)带正电荷的氨基酸Lys和Arg；以及His，pH为约6；(ii)带负电荷的氨基酸Glu和Asp；(iii)芳香族氨基酸Phe、Tyr和Trp；(iv)氮环氨基酸His和Trp；(v)脂肪族疏水性氨基酸Ala、Val、Leu和Ile；(vi)疏水性含硫氨基酸Met和Cys，其疏水性不如Val、Leu和Ile；(vii)小的极性不带电荷的氨基酸Ser、Thr、Asp和Asn；(viii)小的疏水性或中性氨基酸Gly、Ala和Pro；(ix)包含酰胺的氨基酸Asn和Gln；和(xi)β-分支氨基酸Thr、Val和Ile。本段中对氨基酸的电荷的引用是指在pH 6-7下的电荷。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且如本文所用，是指RNA、cDNA、基因组DNA的正义链和反义链以及上述的合成形式和混合聚合物。在特定实施方案中，核苷酸是指核糖核苷酸、脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式及其组合。所述术语还包括但不限于单链和双链形式的DNA。另外，多核苷酸(例如，cDNA或mRNA)可包括通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸键联连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的一者或两者。核酸分子可经化学或生物化学修饰，或可含有非天然或衍生的核苷酸碱基，如本领域技术人员将容易理解的。此类修饰包括例如标记，甲基化，用类似物取代天然存在的核苷酸中的一个或多个，核苷酸间修饰诸如不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬垂部分(例如，多肽)、插层剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键联(例如，α异头核酸等)。上述术语还旨在包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链、三链、发夹、环状和挂锁(padlocked)构象。除非另有说明，否则对核酸序列的引用涵盖其互补序列。因此，对具有特定序列的核酸分子的引用应理解为涵盖其互补链及其互补序列。所述术语还包括编码相同多肽序列的密码子优化的核酸。
如本文所用，术语“载体”是指能够使与其连接的另一个核酸增殖的核酸分子。所述术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及并入所述载体已引入的宿主细胞的基因组内的载体。如此处所用，“载体”是指重组构建体，其中将感兴趣的核酸序列插入到载体中。某些载体能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，“取代”表示分别用不同的氨基酸或核苷酸替代一个或多个氨基酸或核苷酸。
“分离的”核酸是指已经从其天然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色体位置的染色体位置。
“分离的编码抗体或其片段的核酸”是指编码抗体重链或轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或分开的载体上的此类核酸分子以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用并且是指其中已经引入了外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。因此，宿主细胞是重组宿主细胞，并且包括初始转化细胞以及由其衍生的后代，而不考虑传代的次数。
如本文所用的术语，多肽“变体”是通常在一个或多个取代、缺失、添加和/或插入方面与本文具体公开的一个或多个多肽序列不同的多肽。
如本文所用，术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指赘生性细胞。所述术语包括来自良性以及恶性肿瘤的细胞。赘生性转化与肿瘤细胞相对于其来源的细胞类型的表型变化相关联。所述变化可包括失去接触抑制、形态变化和不受调控的细胞生长。
如本文所用，“抑制肿瘤生长”和“抑制癌症生长”可互换，并且是指减缓癌症患者的生长和/或减少癌细胞负担。因此，“抑制癌症生长”包括通过对肿瘤细胞的直接或间接影响来杀伤癌细胞以及降低肿瘤生长速率、肿瘤大小、侵袭和/或转移。
如本文所用，“治疗剂”是指当以治疗有效剂量施用于罹患疾病的患者时，将治愈或至少部分地阻止疾病的症状和与疾病相关联的并发症的剂。
与肿瘤结合的抗体
在一个方面，本文提供了通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤组织结合的抗体。细胞外-RNA蛋白质复合物在下文标题为“抗体结合靶标”的部分中进一步描述。
本公开的说明性肿瘤结合抗体的重链和轻链可变区序列在表1A和2A中提供。
重链可变区中残基的位置在本文中参考表1A和2A的VH区序列(SEQ ID NO:77-122、1333-1526和1725)中的任一个来指定，所有这些序列的长度均为140个氨基酸。
轻链可变区中残基的位置在本文中参考表1A和2A所示的110个氨基酸的VL区序列(SEQ ID NO:123-168、1527-1720和1726)中的任一个来指定。
根据EU索引编号，如相对于表1A和2A所示的VH区序列编号的位置140以及表1A和2A所示的VL区序列的位置110分别被视为VH和VL区的最后的氨基酸。在人IgG形式(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)中，随后的残基被称为“连接密码子”，并通过可变区基因(HJ或LJ)的最后3'碱基与恒定区基因(重链或轻链)的前两个5'碱基的连接进行天然编码，并且由于HJ和LJ的最后3'碱基的变异而呈现出氨基酸变异。人重链连接密码子可天然地为Ala、Ser、Pro或Thr，并且通常为Ala。人κ链连接密码子可天然地为Arg或Gly，并且通常为Arg。人λ链连接密码子可天然地为Gly、Ser、Arg或Cys，并且通常为Ser或Gly。
如表1B和表2B所示的CDR由IMGT和Kabat定义。重链CDR涵盖来自氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-68(HCDR2)和99-129(HCDR3)的氨基酸残基。轻链CDR涵盖来自氨基酸残基23-35(LCDR1)、51-57(LCDR2)和90-100(LCDR3)的氨基酸残基。残基的编号对应于表1A和2A中VH和VL序列中的位置。如表1B和表2B中列出的VH CDR定义如下：HCDR1通过组合Kabat和IMGT定义；HCDR2由Kabat定义；并且HCDR3由IMGT定义。如表1B和表2B中列出的VL CDR由Kabat定义。如本领域中已知的，CDR的编号和放置可根据所采用的编号系统而不同。应当理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开包括相关CDR的公开，无论采用哪种编号系统。
使用AIP-160470作为参考序列，图37示出了使用IMGT、Kabat和Chothia编号系统对AIP-160470VH和VL序列中的残基的编号。
如使用IMGT编号系统定义的CDR为：
HCDR1:27-38(不包括位置31-34)
HCDR2:56-65
HCDR3:105-117(包括111与112之间的18个插入)
LCDR1:27-38(不包括位置31-34)
LCDR2:56-65(不包括位置58-64)和
LCDR3:105-117(不包括位置111-112)。
因此，AIP-160470的对应IMGT CDR为：
HCDR1:GFTFSKAW
HCDR2:IKSVTDGETT
HCDR3:TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV
LCDR1:SSNIGSSS
LCDR2:KNN
LCDR3:STWDDSLSVRV。
如使用Kabat编号系统定义的CDR为：
HCDR1:31-35
HCDR2:50-65(包括52a、52b和52c的插入)
HCDR3:95-102(包括100a-100u的插入)
LCDR1:24-34(包括27a和27b的插入)
LCDR2:50-56
LCDR3:89-97(包括95a和95b的插入)。
因此，AIP-160470的对应KABAT CDR为：
HCDR1:KAWMS
HCDR2:RIKSVTDGETTDYAAPVKG
HCDR3:SFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV
LCDR1:SGSSSNIGSSSVS
LCDR2:KNNQRPS
LCDR3:STWDDSLSVRV
使用Chothia编号系统定义的CDR为：
HCDR1:26-32；
HCDR2:52-56(包括52a、52b和52c的插入)
HCDR3:95-102(包括100a-100u的插入)
LCDR1:24-34(包括30a和30b的插入)
LCDR2:50-56
LCDR3:89-97(包括95a和95b的插入。
因此，AIP-160470的对应Chothia CDR为：
HCDR1:GFTFSKA
HCDR2:KSVTDGET
HCDR3:SFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV
LCDR1:SGSSSNIGSSSVS
LCDR2:KNNQRPS
LCDR3:STWDDSLSVRV
VH区
在一些实施方案中，与例如在FcγRIIa接合测定中具有活性的细胞外RNA-蛋白质复合物结合的本发明的肿瘤结合抗体具有如表1A或表2A所示的VH序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个中列出的VH序列相比，肿瘤结合抗体在VH氨基酸序列中具有至少一个突变且不超过10、20、30、40或50个突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个中列出的VH序列相比，VH氨基酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或缺失。在一些实施方案中，相对于表1B或表2B所示的CDR序列，VH氨基酸序列可包含插入或缺失，例如，1、2、3、4或5个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于表1B或表2B所示的CDR序列，VH氨基酸序列可包含1个氨基酸或2个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:1-8或169-362中的任一个的CDR1序列，VH区包含具有1或2个取代的CDR1。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1-8或169-362中的任一个的CDR1序列，HCDR1具有3或4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的CDR2序列，VH区包含具有1、2、3或4个取代的CDR2。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的CDR2序列，VH区具有5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的CDR3序列，VH区包含具有1、2、3或4个取代的CDR3。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的CDR3序列，VH区具有5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的CDR3，VH区具有9、10、11、12、13或14个取代。在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与如表1B或2B所示的CDR1、CDR2和CDR3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与如表1B或表2B所示的CDR1、CDR2和CDR3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含如表1B或表2B所示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含表1中命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些实施方案中，基于说明性抗体的Fab晶体结构，本发明的肿瘤结合抗体的VH区具有以平方埃计的每个CDR侧链的溶剂暴露，如本段中所述。埋藏、居中或暴露的分类分别基于如下的截止值：小于约10Ang2、约10-50Ang2或大于约50Ang2。参考表1A或表2A中提供的VH区序列中的任一个确定位置。因此，在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1，其中位置26、27、28、29、30和31为暴露的；位置32为埋藏的；位置33为暴露的；并且位置34和35为居中的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR2，其中位置50为居中的；位置51为暴露的；位置53为埋藏的；位置54、55、56、57、58、59和60为暴露的；位置61为居中的；并且位置62、63、64、65、66、67和68为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR3，其中位置99为暴露的；位置100为埋藏的；位置101为居中的；位置102、103和104为埋藏的；位置105、106、107和108为暴露的；位置109和110为埋藏的；位置111为居中的；位置112和113为暴露的；位置114为居中的；位置115和116为暴露的；位置117为居中的；位置118为暴露的；位置119为居中的；位置120为暴露的；位置121为居中的；位置122和123为暴露的；位置124为居中的；并且位置125、126、127、128和129为暴露的。在一些实施方案中，相对于表1B或表2B的CDR中列出的CDR，分类为“埋藏”的残基包含取代，即保持电荷和近似大小以保持抗体构象的保守取代。在一些实施方案中，分类为“暴露”的残基被取代，例如，被保守取代，或被与如表1A或表2A所示的亲本序列相比提供改进的与癌细胞的结合的残基取代。
在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤结合抗体的HCDR3与表1B或表2B所示的HCDR3序列中的任一个具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少85％、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的HCDR3序列中的半胱氨酸残基中的至少两个、三个或全部四个在变体中为保守的。在其他实施方案中，HCDR3的长度为至少27、28、29或30个氨基酸。在典型实施方案中，HCDR3的长度为31个氨基酸。
在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤结合抗体的VH区的FR1区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置1至25的FR1序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR1区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置1至25的FR1序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR1包含SEQ IDNO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置1至25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的肿瘤结合抗体的VH区的FR2区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置36至49的FR2序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR2区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置36至49的FR2序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR2包含SEQID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置36至49的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体的VH区的FR3区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置69至98的FR3序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR3区与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置69至98的FR3序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR3包含SEQ IDNO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置69至98的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH区的FR4区包含SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的位置130至140的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应序列，FR4区包含位置130至140中的一个或两个处的取代。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含重链CDR1序列GFTFSKAWM(S/T)。在一些实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)。在替代的实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，相对于序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR1包含位置30处的N、位置31处的N；和/或位置33处的Y。在一些实施方案中，CDR1与序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)具有至少60％同一性、或至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含重链HCDR2序列RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)T(D/E)YAAPVKG。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)TDYAAPVKG。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代；或相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR2包含具有以下位置中的一个或多个的取代的序列：位置51为V；位置54为K或T；位置55为S；位置56为S；位置58为G；位置59为I；位置60为K；或位置61为E。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR2包含取代的序列，其中位置51为V；位置54为V、K或T；位置55为T；位置58为E；位置59为T；位置60为K；且/或位置61为E。在一些实施方案中，如果HCDR2包含其中位置56为S的序列，则HCDR1包含位置33处的W。在一些实施方案中，HCDR2与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)具有至少60％同一性或至少70％同一性；或与序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少60％同一性或至少70％同一性。在一些实施方案中，CDR2序列与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，肿瘤结合抗体包含VH CDR3序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(S/R)YYYMDV。在一些实施方案中，HCDR3包含表1B或表2B所示的HCDR3序列中的任一个。在一些实施方案中，HCDR3包含如表1B或表2B所示的序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸相对于CDR3序列被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR3包含位置99处的V、位置100处的T、位置108处的R、位置111处的D、位置112处的R、位置116处的Y和/或位置120处的S。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNSYYYMDV或T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV或T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含重链CDR1序列GFTFSKAWM(S/T)。在一些实施方案中，HCDR1包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)。在替代的实施方案中，HCDR1包含GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，相对于序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR1包含位置30处的N、位置31处的N；和/或位置33处的Y。在一些实施方案中，HCDR1与序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)具有至少60％同一性、或至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含重链CDR2序列RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)T(D/E)YAAPVKG。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)TDYAAPVKG。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，HCDR2包含RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代；或相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR2包含具有以下位置中的一个或多个的取代的序列：位置51为V；位置54为K或T；位置55为S；位置56为S；位置58为G；位置59为I；位置60为K；或位置61为E。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，HCDR2包含取代的序列，其中位置51为V；位置54为V、K或T；位置55为T；位置58为E；位置59为T；位置60为K；且/或位置61为E。在一些实施方案中，如果HCDR2包含其中位置56为S的序列，则HCDR1包含位置33处的W。在一些实施方案中，HCDR2与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)具有至少60％同一性或至少70％同一性；或与序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少60％同一性或至少70％同一性。在一些实施方案中，CDR2序列与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含VH CDR3序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(S/R)YYYMDV。在一些实施方案中，CDR3包含表1或表2所示的CDR3序列中的任一个。在一些实施方案中，CDR3包含如表1或表2所示的CDR3序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸相对于CDR3序列被取代。例如，在一些实施方案中，CDR3包含位置99处的V、位置100处的T、位置108处的R、位置111处的D、位置112处的R、位置116处的Y和/或位置120处的S。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNSYYYMDV或T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV或T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。
VL区
在一些实施方案中，与例如在FcγRIIa接合测定中具有活性的细胞外RNA-蛋白质复合物结合的本发明的肿瘤结合抗体具有如表1A或表2A所示的VL序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL序列相比，肿瘤结合抗体在VL氨基酸序列中具有至少一个突变且不超过10、20、30、40或50个突变。在一些实施方案中，与SEQID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL序列相比，VL氨基酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或缺失。在一些实施方案中，相对于表1所示的CDR序列，VL氨基酸序列可包含缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于表1B或表2B所示的CDR序列，VL氨基酸序列可包含1个氨基酸或2个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:48-58或751-944中的任一个的CDR1序列，VL区包含具有1或2个取代的CDR1。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:48-58或751-944中的任一个的CDR1序列，CDR1具有3、4或5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:59-67或945-1138中的任一个的CDR2序列，VL区包含具有1或2个或者1、2或3个取代的CDR2。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:68-76或1139-1332中的任一个的CDR3序列，VL区包含具有1、2或3个或者1、2、3或4个取代的CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与如表1或表2所示的CDR1、CDR2和CDR3具有至少70％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与如表1B或表2B所示的CDR1、CDR2和CDR3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含如表1B或表2B所示的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含表1A中命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体的VL区具有以平方埃计的每个CDR侧链的溶剂暴露，如本段中所述，这基于说明性抗体的Fab晶体结构。埋藏、居中或暴露的分类分别基于如下的截止值：小于约10Ang2、约10-50Ang2或大于约50Ang2。参考表1A中提供的VL区序列中的任一个确定位置。因此，在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL包含CDR1，其中位置23为暴露的；位置24为居中的；位置25和26为暴露的；位置27和28为居中的；位置29、30和31为暴露的；位置32、33和34为居中的；并且位置35为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL包含CDR2，其中位置51、52、53、54、55、56和57为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL包含CDR3，其中位置90为暴露的；位置91为埋藏的；位置92为暴露的；位置93为埋藏的；位置94、95、96和97为暴露的；位置99为居中的；并且位置100为暴露的。在一些实施方案中，相对于表1B或表2B的CDR，分类为“埋藏”的残基包含取代，即保持电荷和近似大小以保持抗体构象的保守取代。在一些实施方案中，分类为“暴露”的残基被取代，例如，被保守取代，或被与如表1A或表2所示的序列相比提供改进的与癌细胞的结合的残基取代。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含轻链CDR1序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)。在一些实施方案中，相对于序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)，1、2、3、4或5个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置28为Y或H。在一些实施方案中，位置30为E。在一些实施方案中，位置32为N。在一些实施方案中，位置33为Y或F。在一些实施方案中，位置35为D或E。在一些实施方案中，CDR1与序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含轻链CDR2序列(K/R)(N/D)(N/D)QRPS。在一些实施方案中，CDR2包含如表1或表2所示的CDR2序列。在一些实施方案中，CDR2包含CDR2序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，相对于序列KNNQRPS(SEQ IDNO:59)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置51为R，位置52为D，且/或位置53为D。在一些实施方案中，CDR2序列与序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)具有至少60％或至少70％同一性。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含VL CDR3序列STWD(D/E)SLSV(R/W)V。在一些实施方案中，CDR3序列包含STWD(D/E)SLSVRV。在一些实施方案中，CDR3包含如表1或表2所示的CDR3序列。在一些实施方案中，CDR3序列包含STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)或STWDESLSVRV(SEQ ID NO:73)。在一些实施方案中，相对于序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)或STWDESLSVRV(SEQ ID NO:73)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置90为A，位置91为I，且/或位置97为G。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体的VL区的FR1区与表1的VL区序列的位置1至22的FR1序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR1区与表1的VL区序列的位置1至22的FR1序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR1包含表1的VL区序列的位置1至22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体的VL区的FR2区与表1的VL区序列的位置36至50的FR2序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR2区与表1的VL区序列的位置36至50的FR2序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR2包含表1的VL区序列的位置36至50的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体的VL区的FR3区与表1的VL区序列的位置58至89的FR3序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR3区与表1的VL区序列的位置58至89的FR3序列具有至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，FR3包含表1的VL区序列的位置58至89的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH区的FR4区包含表1的VL区序列的位置101至110的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于表1的VL区序列的对应序列，FR4区包含位置101至110中的一个或两个处的取代。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含如此部分中前述段落所述的VL区CDR1、CDR2和/或CDR3。在一些实施方案中，VL CDR序列中的一个或两个包含如表1所示的CDR序列。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含如此部分中前述段落所述的VL区CDR1、CDR2和/或CDR3，并且与如表1所示的VL序列中的任一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含如表1所示的CDR1、CDR2和CDR3，并且与如表1所示的VL序列中的任一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。
在一些实施方案中，肿瘤结合抗体包含命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且包含与表1所示的对应VL序列的至少80％或至少90％同一性，或包含表1中对应VL序列的VL序列。
说明性抗体
在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤结合的抗体，其中所述抗体包含表1或表2所示的重链和轻链CDR。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1-8或169-362中的任一个的HCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的HCDR2，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；SEQ ID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的HCDR3，或其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；SEQ ID NO:48-58或751-944中的任一个的LCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的变体；SEQ ID NO:59-67或945-1138中的任一个的LCDR2，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；和SEQ IDNO:68-76或1139-1332中的任一个的LCDR3，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。在一些实施方案中，所述取代中的至少1或2个为保守取代。在一些实施方案中，相对于表1或表2中的参考CDR序列，所述取代中的至少50％、或至少60％、至少70％、至少80％或至少90％为保守取代。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1-8或169-362中的任一个的HCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；SEQ ID NO:9-19或363-556中的任一个的HCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；SEQ ID NO:20-47或557-750或1727中的任一个的HCDR3，或其中1、2或3个或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；SEQ ID NO:48-58或751-944中的任一个的LCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的变体；SEQ ID NO:59-67或945-1138中的任一个的LCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；和SEQ ID NO:68-76或1139-1332中的任一个的LCDR3，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。在一些实施方案中，所述取代中的至少1或2个为保守取代。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤结合的抗体，其中抗体包含表1A或表2A中命名的抗体或所述抗体的变体的六个CDR，与表1A或2A所示的抗体的对应CDR相比，所述变体中的至少一个CDR、至少两个CDR、至少三个CDR、至少四个CDR、至少五个CDR或全部六个CDR具有1至2个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文提供了一种与细胞外RNA-蛋白质复合物结合的肿瘤结合抗体，其中所述抗体包含根据下式的CDR。对于每个CDR，“X”残基按其在CDR中的位置编号，例如，X3在CDR的第三个位置。
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)X9(S/T)(SEQ ID NO:1734)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；X6为A、H、K、M、N或R；并且X9为F、M或Y；
(b)HCDR2序列(F/R)I(K/Q)(A/S)X5X6X7(A/G)X9X10T(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)(SEQID NO:1735)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X7为D、E或N；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)X5CX7(G/S)X9X10CX12X13X14(D/E)X16SX18X19X20X21X22X23X24X25(F/Y)(F/Y)X28X29(D/N)X31(SEQ ID NO:1736)，其中X3为A、P、S或T；X5为A、C或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X13为A、N或S；X14为H、Q、R或S；X16为N、Q或T；X18为F、M或Y；X19为C、S或V；X20为A、G或N；X21为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N、S或Y；X24为A、K、N、P、Q或S；X25为D、K、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列X1G(A/S)X4(S/T)(D/N)I(G/Q)(H/S)X10X11(T/V)X13(SEQ ID NO:1737)，其中X1为H、S或T；X4为E、K、P或S；X10为A、H、N、S或T；X11为A、D、S、T或Y；并且X13为A、L、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7(SEQ ID NO:1738)，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)(F/W)(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)(SEQ ID NO:1739)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q、R或W。在一些实施方案中，抗体的每个重链或轻链CDR与表1A或表2A中的对应重链或轻链CDR的差异不超过两个氨基酸或不超过一个氨基酸。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤结合的抗体，其中所述抗体包含表1A或表2A所示的抗体的六个CDR或其变体，相对于表1B或表2B中的对应CDR序列，所述变体中的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR包含1或2个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤结合的抗体，其中所述抗体包含表1A或表2A所示的抗体的六个CDR或其变体，相对于表1B或表2B中的对应CDR序列，所述变体中的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部六个CDR包含1或2个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗体包含命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的抗体的六个CDR或其变体，相对于表2B中的对应CDR序列，所述变体中的至少一个、两个、三个、四个、五个或所有六个CDR包含1或2个氨基酸取代。
在一些实施方案中，本文提供了一种与细胞外RNA-蛋白质复合物结合的肿瘤结合抗体，其中所述抗体包含根据下式的CDR。对于每个CDR，“X”残基按其在CDR中的位置编号，例如，X3在CDR的第三个位置。
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)(F/M)(S/T)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；并且X6为A、H、K、M或N；
(b)HCDR2序列RIK(A/S)X5X6(D/N)(A/G)X9X10(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)CCX7(G/S)X9X10CX12(N/S)X14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24,X25(F/Y)YX28X29(D/N)X31，其中X3为A、P或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X14为H、Q、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或Q；X25为D、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列(S/T)G(A/S)X4(S/T)(D/N)IG(H/S)X10X11(T/V)X13，其中X4为K、P或S；X10为A、N、S或T；X11为A、S、T或Y；并且X13为A、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)W(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q或R。
在一些实施方案中，本文提供了肿瘤结合抗体，其包含与SEQ ID NO:77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的氨基酸序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的VH。在一些实施方案中，本文提供了抗肿瘤抗体，其包含与SEQ ID NO:123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的氨基酸序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的VL。
在一些实施方案中，肿瘤结合抗体包含含有SEQ ID NO:77-122或1333-1526中的任一个的氨基酸序列的VH；或含有SEQ ID NO:123-168或1527-1720中的任一个的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含表1A或表2A中由AIP编号命名的抗体(“AIP抗体”)中的任一个的VH和VL。在一些实施方案中，肿瘤结合抗体为抗体的变体，其中VH与如表1A或表2A所示的AIP抗体的VH序列具有至少85％同一性、或至少90％同一性或至少95％同一性；并且VL与其具有至少85％同一性、或至少90％同一性或至少95％同一性；并且VL与如表1A或表2A所示的AIP抗体的VL序列具有至少85％同一性、或至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，与AIP抗体的CDR序列相比，变体抗体在重链和轻链CDR序列中总共具有不超过十个突变、或不超过九个突变、不超过八个突变或不超过七个突变。在一些实施方案中，与AIP抗体的CDR序列相比，抗体在重链和轻链CDR序列中总共具有六个、五个、四个、三个、两个或一个突变。在一些实施方案中，所有突变均为相对于如表1所示的AIP抗体的序列的取代。
在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体具有命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的CDR。在一些实施方案中，抗体另外与表1所示的对应VH和VL序列具有至少80％或至少90％同一性。
表现出抗肿瘤活性的抗体
在一个方面，本文提供了对肿瘤表现出抑制作用(包括减小肿瘤生长速率、大小、肿瘤侵袭和/或转移)的抗体。例如当施用于患有具有细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的受试者时，此类抗体在体内表现出抗肿瘤作用。在一些实施方案中，相对于如本文所述的说明性抗体序列，此种抗体的VH区或VL区具有至少两个、三个、四个、五个或六个或更多个修饰，例如取代。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含如本文所述的如表1A所示的抗体(AIP名称AIP-101235、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-125258、AIP-150199、AIP-115388、AIP-143369、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125、AIP-160470、AIP-192482、AIP-171142、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-104188、AIP-106042、AIP-100196、AIP-180675、AIP-170105、AIP-126080、AIP-161571、AIP-181246、AIP-192216、AIP-168605、AIP-172872、AIP-190051、AIP-167533、AIP-112580、AIP-136060)或其变体。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含如本文所述的如表1B所示的抗体(AIP名称AIP-101235、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-125258、AIP-150199、AIP-115388、AIP-143369、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125、AIP-160470、AIP-192482、AIP-171142、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-104188、AIP-106042、AIP-100196、AIP-180675、AIP-170105、AIP-126080、AIP-161571、AIP-181246、AIP-192216、AIP-168605、AIP-172872、AIP-190051、AIP-167533、AIP-112580、AIP-136060)的六个CDR或其变体。
VH区
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体具有如表1所示的VH序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH序列相比，抗肿瘤抗体在VH氨基酸序列中具有至少一个突变且不超过10、20、30、40或50个突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH序列相比，VH氨基酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或缺失。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的CDR序列，VH氨基酸序列可包含插入缺失或插入，例如，1、2、3、4或5个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的CDR序列，VH氨基酸序列可包含1个氨基酸或2个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1-8中的任一个的HCDR1序列，VH区包含具有1或2个取代的HCDR1。在一些实施方案中，相对于SEQID NO:1-8中的任一个的HCDR1序列，HCDR1具有3或4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQID NO:9-19中的任一个的HCDR2序列，VH区包含具有1、2、3或4个取代的HCDR2。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:9-19中的任一个的HCDR2序列，VH区具有5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47中的任一个的HCDR3序列，VH区包含具有1、2、3或4个取代的HCDR3。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47中的任一个的HCDR3序列，VH区具有5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:20-47中的任一个的HCDR3序列，VH区具有9、10、11、12、13或14个取代。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含VH区CDR1、CDR2和CDR3，每个与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的对应CDR1、CDR2和CDR3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的对应CDR1、CDR2和CDR3具有至少90％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本发明的肿瘤结合抗体包含表1A中命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，基于说明性抗体的Fab晶体结构，本发明的抗肿瘤抗体的VH区具有以平方埃计的每个CDR侧链的溶剂暴露，如本段中所述。埋藏、居中或暴露的分类分别基于如下的截止值：小于约10Ang2、约10-50Ang2或大于约50Ang2。参考表1A的SEQ ID NO:77-122的VH区序列中的任一个确定位置。因此，在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1，其中位置26、27、28、29、30和31为暴露的；位置32为埋藏的；位置33为暴露的；并且位置34和35为居中的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR2，其中位置50为居中的；位置51为暴露的；位置53为埋藏的；位置54、55、56、57、58、59和60为暴露的；位置61为居中的；并且位置62、63、64、65、66、67和68为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR3，其中位置99为暴露的；位置100为埋藏的；位置101为居中的；位置102、103和104为埋藏的；位置105、106、107和108为暴露的；位置109和110为埋藏的；位置111为居中的；位置112和113为暴露的；位置114为居中的；位置115和116为暴露的；位置117为居中的；位置118为暴露的；位置119为居中的；位置120为暴露的；位置121为居中的；位置122和123为暴露的；位置124为居中的；并且位置125、126、127、128和129为暴露的。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的CDR，分类为“埋藏”的残基包含取代，即保持电荷和近似大小以保持抗体构象的保守取代。在一些实施方案中，分类为“暴露”的残基被取代，例如，被保守取代，或被与表1A的亲本抗体相比提供改进的与癌细胞的结合的残基取代。
在一些实施方案中，如本文所述的抗肿瘤抗体的HCDR3与HCDR3序列SEQ ID NO:20-47中的任一个具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少85％、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，如本文所述的HCDR3序列中的半胱氨酸残基中的至少两个、三个或全部四个在变体中为保守的。在其他实施方案中，HCDR3的长度为至少27、28、29或30个氨基酸。在典型实施方案中，HCDR3的长度为31个氨基酸。
在一些实施方案中，如本文所述的抗肿瘤抗体的VH区的FR1区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置1至25的FR1序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR1区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置1至25的FR1序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置1至25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，如本文所述的抗肿瘤抗体的VH区的FR2区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置36至49的FR2序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR2区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置36至49的FR2序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR2包含SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置36至49的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的VH区的FR3区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置69至98的FR3序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR3区与SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置69至98的FR3序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR3包含SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置69至98的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH区的FR4区包含SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的位置130至140的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:77-122中的任一个的VH区的对应序列，FR4区包含位置130至140中的一个或两个处的取代。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含重链CDR1序列GFTFSKAWM(S/T)。在一些实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)。在替代的实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，相对于序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR1包含位置30处的N、位置31处的N；和/或位置33处的Y。在一些实施方案中，CDR1与序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)具有至少60％同一性、或至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含重链CDR2序列RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)T(D/E)YAAPVKG。在一些实施方案中，CDR2包含RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)TDYAAPVKG。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代；或相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR2包含具有以下位置中的一个或多个的取代的序列：位置51为V；位置54为K或T；位置55为S；位置56为S；位置58为G；位置59为I；位置60为K；或位置61为E。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR2包含取代的序列，其中位置51为V；位置54为V、K或T；位置55为T；位置58为E；位置59为T；位置60为K；且/或位置61为E。在一些实施方案中，如果CDR2包含其中位置56为S的序列，则CDR1包含位置33处的W。在一些实施方案中，CDR2与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)具有至少60％同一性或至少70％同一性；或与序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少60％同一性或至少70％同一性。在一些实施方案中，CDR2序列与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含VH CDR3序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(S/R)YYYMDV。在一些实施方案中，CDR3包含表2所示的CDR3序列中的任一个。在一些实施方案中，CDR3包含如表2所示的CDR3序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸相对于表2CDR3序列被取代。例如，在一些实施方案中，CDR3包含位置99处的V、位置100处的T、位置108处的R、位置111处的D、位置112处的R、位置116处的Y和/或位置120处的S。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNSYYYMDV或T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV或T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含重链CDR1序列GFTFSKAWM(S/T)。在一些实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)。在替代的实施方案中，CDR1包含GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)。在一些实施方案中，相对于序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR1包含位置30处的N、位置31处的N；和/或位置33处的Y。在一些实施方案中，CDR1与序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)具有至少60％同一性、或至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含重链CDR2序列RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)T(D/E)YAAPVKG。在一些实施方案中，CDR2包含RIKS(V/T)(T/S)(D/E)G(E/G)(I/T)TDYAAPVKG。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，CDR2包含RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代；或相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR2包含具有以下位置中的一个或多个的取代的序列：位置51为V；位置54为K或T；位置55为S；位置56为S；位置58为G；位置59为I；位置60为K；或位置61为E。在一些实施方案中，相对于序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)，1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，CDR2包含取代的序列，其中位置51为V；位置54为V、K或T；位置55为T；位置58为E；位置59为T；位置60为K；且/或位置61为E。在一些实施方案中，如果CDR2包含其中位置56为S的序列，则CDR1包含位置33处的W。在一些实施方案中，CDR2与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)具有至少60％同一性或至少70％同一性；或与序列RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少60％同一性或至少70％同一性。在一些实施方案中，CDR2序列与序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)具有至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含VH CDR3序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)(Y/D)(K/N/S)(S/R)YYYMDV。在一些实施方案中，CDR3包含表2所示的CDR3序列中的任一个。在一些实施方案中，CDR3包含如表2所示的CDR3序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸相对于表2CDR3序列被取代。例如，在一些实施方案中，CDR3包含位置99处的V、位置100处的T、位置108处的R、位置111处的D、位置112处的R、位置116处的Y和/或位置120处的S。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)YNSYYYMDV或T(S/T)SFCCRGG(R/S)CPS(H/R)DTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。在一些实施方案中，VH CDR3包含序列T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YKSYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DSRYYYMDV、T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)YNRYYYMDV或T(S/T)SFCCRGGSCPSHDTS(Y/F)CGG(Q/S)DKRYYYMDV。
VL区
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体具有如表1A所示的SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL序列的一个、两个或三个CDR。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL序列相比，抗肿瘤抗体在VL氨基酸序列中具有至少一个突变且不超过10、20、30、40或50个突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL序列相比，VL氨基酸序列可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸插入或缺失。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的CDR序列，VL氨基酸序列可包含缺失或插入，例如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的CDR序列，VL氨基酸序列可包含1个氨基酸或2个氨基酸缺失或插入。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:48-58中的任一个的LCDR1序列，VL区包含具有1或2个取代的LCDR1。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:48-58中的任一个的CDR1序列，LCDR1具有3、4或5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:59-67中的任一个的LCDR2序列，VL区包含具有1或2个或者1、2或3个取代的CDR2。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:68-76中的任一个的LCDR3序列，VL区包含具有1、2或3个或者1、2、3或4个取代的CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的对应CDR的CDR1、CDR2和CDR3具有至少70％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含CDR1、CDR2和CDR3，每个与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的对应CDR1、CDR2和CDR3具有至少80％同一性。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含表1A中命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的VL区具有以平方埃计的每个CDR侧链的溶剂暴露，如本段中所述，这基于说明性抗体的Fab晶体结构。埋藏、居中或暴露的分类分别基于如下的截止值：小于约10Ang2、约10-50Ang2或大于约50Ang2。参考表1A中提供的SEQID NO:123-168的VL区序列中的任一个确定位置。因此，在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL区包含CDR1，其中位置23为暴露的；位置24为居中的；位置25和26为暴露的；位置27和28为居中的；位置29、30和31为暴露的；位置32、33和34为居中的；并且位置35为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL包含CDR2，其中位置51、52、53、54、55、56和57为暴露的。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体VL包含CDR3，其中位置90为暴露的；位置91为埋藏的；位置92为暴露的；位置93为埋藏的；位置94、95、96和97为暴露的；位置99为居中的；并且位置100为暴露的。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的CDR，分类为“埋藏”的残基包含取代，即保持电荷和近似大小以保持抗体构象的保守取代。在一些实施方案中，分类为“暴露”的残基被取代，例如，被保守取代，或被与表1A的亲本抗体相比提供改进的与癌细胞的结合的残基取代。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含轻链CDR1序列SGSSSNIGSSSVS(SEQID NO:48)。在一些实施方案中，相对于序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)，1、2、3、4或5个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置28为Y或H。在一些实施方案中，位置30为E。在一些实施方案中，位置32为N。在一些实施方案中，位置33为Y或F。在一些实施方案中，位置35为D或E。在一些实施方案中，CDR1与序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)具有至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含轻链CDR2序列(K/R)(N/D)(N/D)QRPS。在一些实施方案中，CDR2包含如表1B所示的CDR2序列。在一些实施方案中，CDR2包含CDR2序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)。在一些实施方案中，相对于序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置51为R，位置52为D，且/或位置53为D。在一些实施方案中，CDR2序列与序列KNNQRPS(SEQ ID NO:59)具有至少60％或至少70％同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含VL CDR3序列STWD(D/E)SLSV(R/W)V。在一些实施方案中，CDR3序列包含STWD(D/E)SLSVRV。在一些实施方案中，CDR3包含如表1所示的CDR3序列。在一些实施方案中，CDR3序列包含STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)或STWDESLSVRV(SEQ ID NO:73)。在一些实施方案中，相对于序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)或STWDESLSVRV(SEQ ID NO:73)，1、2或3个氨基酸被取代。例如，在一些实施方案中，位置90为A，位置91为I，且/或位置97为G。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的VL区的FR1区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置1至22的FR1序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR1区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置1至22的FR1序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置1至22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的VL区的FR2区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置36至50的FR2序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR2区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置36至50的FR2序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，FR2包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置36至50的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的VL区的FR3区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置58至89的FR3序列具有至少80％或至少90％同一性。在一些实施方案中，FR3区与SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置58至89的FR3序列具有至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，FR3包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的位置58至89的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH区的FR4区包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区的位置101至110的氨基酸序列。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的VL区序列的对应序列，FR4区包含位置101至110中的一个或两个处的取代。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含如此部分中前述段落所述的VL区CDR1、CDR2和/或CDR3。在一些实施方案中，VL CDR序列中的一个或两个包含如SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列所示的CDR序列。在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体包含如此部分中前述段落所述的VL区CDR1、CDR2和/或CDR3，并且与SEQ ID NO:123-168的VL序列中的任一个具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含SEQ ID NO:123-168中的任一个的VL区序列的CDR1、CDR2和CDR3，并且与如表1A所示的对应VL区序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、或至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体包含表1中命名为AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-104188、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-192482、AIP-122563或AIP-171142的抗体的CDR1、CDR2和CDR3，并且包含与表1A所示的对应VL序列的至少80％或至少90％同一性。
说明性抗体
在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤组织结合的抗肿瘤抗体，其中所述抗体包含如本文所述的具有AIP名称AIP-101235、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-125258、AIP-150199、AIP-115388、AIP-143369、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125、AIP-160470、AIP-192482、AIP-171142、AIP-157397、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-104188、AIP-106042、AIP-100196、AIP-180675、AIP-170105、AIP-126080、AIP-161571、AIP-181246、AIP-192216、AIP-168605、AIP-172872、AIP-190051、AIP-167533、AIP-112580、AIP-136060的表1的抗体的重链和轻链CDR或其变体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1-8中的任一个的HCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；SEQ ID NO:9-19中的任一个的HCDR2，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；SEQ ID NO:20-47中的任一个的HCDR3，或其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；SEQ ID NO:48-58’中的任一个的LCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的抗体；SEQ ID NO:59-67中的任一个的LCDR2，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；和SEQ ID NO:68-76中的任一个的LCDR3，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。在一些实施方案中，所述取代中的至少1或2个为保守取代。在一些实施方案中，相对于参考CDR序列，所述取代中的至少50％、或至少60％、至少70％、至少80％或至少90％为保守取代。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1-8中的任一个的HCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；SEQ ID NO:9-19中的任一个的HCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；SEQ ID NO:20-47中的任一个的HCDR3，或其中1、2或3个或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；SEQID NO:48-58中的任一个的LCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的变体；SEQ ID NO:59-67’中的任一个的LCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；和SEQ ID NO:68-76中的任一个的LCDR3，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。在一些实施方案中，所述取代中的至少1或2个为保守取代。
在一些实施方案中，本文提供了一种通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤组织结合的抗体，其中所述抗体包含：(a)重链可变区，其包含：(i)具有GF(T/V)(F/Y)(S/A)X6AWM(S/T)(SEQ ID NO:1728)的序列的HCDR1，其中X6为K、A或M；(ii)具有RIK(S/A)X5X6(D/E)(G/A)X9X10T(D/E)YAA(P/S)VKG(SEQ ID NO:1729)的序列的HCDR2，其中X5为V、N、A或T；X6为T、Q、S、D或H；X9为E、H、K或G；并且X10为T、Q或I；和(iii)具有(I/T)(S/T)SFCC(H/R)(G/S)X9X10CPSX14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24X25(F/Y)Y(F/Y)(M/V)(D/N)X31(SEQID NO:1730)的序列的HCDR3，其中X9为A、G、K或N；X10为N、Q、R或S；X14为H、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或S；X25为D、Q、R或S；X31为I、P或V；以及(b)轻链可变区，其包含(i)具有SG(S/A)X4(S/T)(D/N)IGSSX11VX13(SEQ ID NO:1731)的序列的CDRL1，其中X4为S、P或K；X11为S、Y或T；并且X13为S、Y或T；(ii)具有(K/M)(D/N)X3X4R(A/P)X7(SEQID NO:1732)的序列的CDR L2，其中X3为S、N或T；X4为L、Q或A；并且X7为Q、S、Y或L；和(iii)具有(A/S)(S/T)W(D/N)X5X6(L/N)X8(I/V)R(I/V)(SEQ ID NO:1733)的序列的CDR L3，其中X5为E、D或N；X6为S、A或Q；并且X8为N、S或T。
在一些实施方案中，在抗体的HCDR1序列中，HCDR1的位置3为T；位置4为F；位置5为S；位置6为K；且/或位置10为S。在特定实施方案中，抗体的HCDR1具有GFTFSKAWMS(SEQ IDNO:1)的序列。在其他实施方案中，抗体的HCDR1具有GFTFSAAWMS(SEQ ID NO:4)、GFVFSKAWMS(SEQ ID NO:7)、GFTFAKAWMS(SEQ ID NO:6)、GFTYSKAWMS(SEQ ID NO:5)、GFTFSMAWMS(SEQ ID NO:3)、GFTYSAAWMS(SEQ ID NO:2)和GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，在抗体的HCDR2序列中，HCDR2的位置4为S；位置5为V；位置6为T；位置7为D；位置8为G；位置9为E；位置10为T；位置12为D；且/或位置16为P。在特定实施方案中，抗体的HCDR2具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列。在其他实施方案中，抗体的HCDR2具有RIKSVTDGEQTDYAAPVKG(SEQ ID NO:18)、RIKAADDGKQTDYAAPVKG(SEQ IDNO:19)、RIKSVTDGETTEYAASVKG(SEQ ID NO:9)、RIKAVHDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:10)、RIKSNTDAETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:11)、RIKSVQDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:12)、RIKSVTDGHTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:13)、RIKSVTDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:14)、RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)、RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO:16)或和RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:17)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，在抗体的HCDR3序列中，HCDR3的位置1为T；位置2为S；位置7为R；位置8为G；位置9为G；位置10为S；位置14为H；位置15为D；位置18为Y；位置20为G；且/或位置21为G。在特定实施方案中，抗体的HCDR3具有TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGYYKSYYYMDV(SEQID NO:33)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)和TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSFYYMDV(SEQ ID NO:28)中的任一个的序列。在其他实施方案中，抗体的HCDR3具有TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:29)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:27)、ISSFCCHSNNCPSSDTSYCNGYYKQYYFMDV(SEQ ID NO:26)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCGGQFKSYYFMDV(SEQ ID NO:25)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCNGYYADYYFMDV(SEQ ID NO:24)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)、TTSFCCRGASCPSSDTSYCAGSYKSYYFVNI(SEQ ID NO:22)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:20)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:42)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGSYKSYYYMDV(SEQ ID NO:41)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:37)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO:40)、TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:39)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)、TTSFCCRGGRCPSRDTSFCGGQYNSYYYMDV(SEQ ID NO:38)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYNRYYYMDV(SEQ ID NO:36)和TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:35)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，在抗体的LCDR1序列中，位置3为S；位置4为S；位置5为S；位置6为N；位置11为S；且/或位置13为S。在特定实施方案中，抗体的LCDR1具有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的序列。在其他实施方案中，LCDR1具有SGSKSNIGSSYVS(SEQ ID NO:50)、SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56)、SGSKSNIGSSSVY(SEQ ID NO:55)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ IDNO:54)、SGASSNIGSSSVS(SEQ ID NO:52)、SGSSTNIGSSTVS(SEQ ID NO:53)、SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)和SGSSTNIGSSSVT(SEQ ID NO:49)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，在抗体的LCDR2序列中，位置1为K；位置2为N；位置3为N；位置4为Q；位置6为P；且/或位置7为S。在特定实施方案中，LCDR2具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列。在其他实施方案中，LCDR2具有KNNQRPY(SEQ ID NO:66)、KDNQRPS(SEQ ID NO:62)、KNTQRPS(SEQ ID NO:65)、KNNARPY(SEQ ID NO:64)、KNTQRAS(SEQ ID NO:63)、MNNQRPY(SEQID NO:61)和KDNQRPL(SEQ ID NO:60)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，在抗体的LCDR3序列中，LCDR3的位置1为S；位置2为T；位置4为D；位置5为D；位置6为S；位置7为L；位置8为S；位置9为V；且/或位置11为V。在特定实施方案中，抗体的LCDR3具有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的序列。在其他实施方案中，LCDR3具有STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)、SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO:71)、ATWDDQLSVRV(SEQ ID NO:69)、ATWDDSLTVRI(SEQ ID NO:76)、ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)和STWDESLSVRV(SEQ IDNO:73)中的任一个的序列。
在本文所述的抗体中，HCDR1可具有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)、GFTFSAAWMS(SEQID NO:4)和GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)中的任一个的序列；HCDR2可具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)和RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)中的任一个的序列；HCDR3可具有TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:20)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:27)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)和TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)中的任一个的序列；LCDR1可具有SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56),SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO:54)和SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)中的任一个的序列；LCDR2可具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)和KDNQRPS(SEQ ID NO:62)中的任一个的序列；LCDR3可具有STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)、STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)、SSWDDSNSVRI(SEQ IDNO:71)和ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)中的任一个的序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体的重链可变区可具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:92)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:77)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:80)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:86)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)和EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:95)中的任一个的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一些实施方案中，本文所述的抗体的轻链可变区可具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:138)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ IDNO:140)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:136)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:132)和QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ IDNO:141)中的任一个的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可包含具有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:32)的序列的HCDR3；具有SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO:56)的序列的LCDR1；具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列的LCDR2；以及具有STWDDALSVRV(SEQ ID NO:72)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:92)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:138)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:20)的序列的HCDR3；具有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的序列的LCDR1；具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列的LCDR2；以及具有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:77)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有sequence ofTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO:23)的序列的HCDR3；具有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的序列的LCDR1；具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列的LCDR2；以及具有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:80)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSAAWMS(SEQ ID NO:4)的序列的HCDR1；具有RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:15)的序列的HCDR2；具有ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO:30)的序列的HCDR3；具有SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO:54)的序列的LCDR1；具有KDNQRPS(SEQ ID NO:62)的序列的LCDR2；以及具有SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO:71)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:90)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:136)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSAAWMS(SEQ ID NO:4)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:27)的序列的HCDR3；具有SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO:51)的序列的LCDR1；具有KDNQRPS(SEQ ID NO:62)的序列的LCDR2；具有ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO:70)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:86)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:132)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的序列的HCDR3；具有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的序列的LCDR1；具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列的LCDR2；以及具有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:94)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:140)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在某些实施方案中，本文所述的抗体可含有具有GFTFSKAWMT(SEQ ID NO:8)的序列的HCDR1；具有RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的序列的HCDR2；具有TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO:34)的序列的HCDR3；具有SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的序列的LCDR1；具有KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的序列的LCDR2；以及具有STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的序列的LCDR3。在一些实施方案中，抗体的重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:95)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列；并且抗体的轻链可变区具有与QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:141)的序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。
在一个方面，本文提供了一种包含如本文所述的VH和VL区的抗体(例如，具有如表1中列出的VH和VL区的抗体)或其变体，其还包含人IgG1恒定区和/或人λ恒定区。在一些实施方案中，抗体包含重链序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:1721)，或其与SEQ IDNO:1721具有至少90％同一性的变体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1721的氨基酸序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸发生突变，以例如调节FcR结合、效应功能、糖基化和/或稳定性。在一些实施方案中，抗体包含轻链序列GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:1722)。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:1722具有至少90％同一性或至少95％同一性或更高的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体的VH区具有包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的CDR1、包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的CDR2和包含TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的CDR3；并且VL区具有包含SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的CDR1、包含KNNQRPS(SEQ ID NO:59)的CDR2和包含STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的CDR3。在一些实施方案中，此种抗体包含人IgG1和/或人λ恒定区。在一些实施方案中，VH区包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列，并且VL区包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含重链序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:1721)，或其与SEQ ID NO:1721具有至少90％同一性的变体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1721的氨基酸序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸发生突变，以例如调节FcR结合、效应功能、糖基化和/或稳定性。在一些实施方案中，抗体包含轻链序列GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:1722)。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:1722具有至少90％同一性或至少95％同一性或更高的序列。在一些实施方案中，本发明的抗体包含重链序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:1723)和轻链序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:1724)。
在一个方面，本文提供了一种包含如本文所述的VH和VL区的抗体(例如，具有如表1A中列出的VH和VL区的抗体)或其变体，其还包含人IgG1恒定区和/或人λ恒定区。在一些实施方案中，抗体包含重链序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:1721)，或其与SEQID NO:1721具有至少90％同一性的变体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1721的氨基酸序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸发生突变，以例如调节FcR结合、效应功能、糖基化和/或稳定性。在一些实施方案中，抗体包含轻链序列GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:1722)。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ ID NO:1722具有至少90％同一性或至少95％同一性或更高的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体的VH区具有包含GFTFSKAWMS(SEQ ID NO:1)的CDR1、包含RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO:9)的CDR2和包含TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO:21)的CDR3；并且VL区具有包含SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO:48)的CDR1、包含KNNQRPS(SEQID NO:59)的CDR2和包含STWDDSLSVRV(SEQ ID NO:68)的CDR3。在一些实施方案中，此种抗体包含人IgG1和/或人λ恒定区。在一些实施方案中，VH区包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，并且VL区包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含重链序列ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQID NO:1721)，或其与SEQ ID NO:43具有至少90％同一性的变体。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸发生突变，以例如调节FcR结合、效应功能、糖基化和/或稳定性。在一些实施方案中，抗体包含轻链序列GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS(SEQ ID NO:1722)。在一些实施方案中，抗体包含与SEQ IDNO:1722具有至少90％同一性或至少95％同一性或更高的序列。
变体结合活性
活性
可用于通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤组织结合和/或用于诱导免疫反应(包括抗肿瘤免疫反应)的抗体的变体可使用多种测定来鉴定。在一个优选的实施方案中，如本文所述的肿瘤结合抗体的结合靶标由肿瘤细胞在体内生长时存在于细胞外，但对于在体外标准培养条件下生长的肿瘤细胞不存在于细胞外。因此，对离体肿瘤组织或肿瘤细胞(例如，在同基因(免疫匹配)小鼠中作为肿瘤移植物在体内生长，然后在24-48小时内收获并加工的肿瘤细胞)进行结合测定以评估变体活性。结合可通过包括流式细胞术在内的任何数量的手段来评估。然而，在本申请中，当以包含与FcγRIIa结合的Fc区的形式提供时，肿瘤结合抗体也具有接合FcγRIIa的能力。在一项测定中，在Fc受体接合测定中评价变体结合活性。出于测试变体的目的，当变体抗体通过其Fv区与靶肿瘤细胞结合并且通过抗体Fc区与存在于免疫细胞上的FcγR结合，从而以此种方式转导信号时，发生Fc受体的“接合”。如果Fc区在Fv区不同的变体之间保持恒定，则所述测定允许在通过结合特定Fc受体的特定Fc区的潜在信号转导的背景下评价此类变体之间的肿瘤结合活性。在一些实施方案中，抗体Fc区的结合可导致FcR的聚集和/或内化，从而导致在携带NFAT-RE-荧光素酶报告基因构建体的细胞中的发光信号。
在优选的测定中，如上所述，在FcγRIIa接合测定中使用离体肿瘤细胞评估变体抗体的结合活性。在某些实施方案中，抗体与其靶标和FcγR两者的结合导致信号产生。在此种测定中，确定EC50值，并且在一些实施方案中，也确定Δ活性值，如下所述。在说明性测定中，可在FcγRIIa-H Promega报告基因测定中测试变体。其他测定也是可用的，例如，BPSBioscience提供了使用CD32a报告细胞系的类似测定。替代测定包括使用CD16a报告细胞系，并且可购自Promega或Invivogen。
以下测定优选用于测量与肿瘤表达的靶标特异性结合并激活FcγRIIa的抗体的结合活性。此测定(FcγRIIa-H ADCP测定)可购自Promega，并采用稳定表达人FcγRIIa-H(高亲和力H131变体)的Jurkat细胞和NFAT诱导的荧光素酶。在与靶细胞结合的测试抗体的Fc区与Jurkat效应细胞上的FcγR接合后，Jurkat细胞中产生细胞内信号，从而产生可量化的NFAT-RE介导的荧光素酶活性。下面的“详细方法”部分中详细描述了用于分析变体的测定。可如下文进一步详述的那样进行测定。
结合活性通过确定EC50值来评估，并且在一些实施方案中，另外确定Δ活性(即激活曲线的下平台与上平台之间的比活性的差异)表示为具有已知体外活性的所选抗体的活性百分比(也参见实施例8)。在典型实施方案中，将EC50值与参考抗体进行比较。出于本公开的目的，当使用小鼠肿瘤模型测试离体结合时，包含AIP-160470的VH和VL区以及小鼠IgG2aFc区的抗体用作参考抗体，并包括在测定中以相对于所述参考抗体评估变体活性。相对于EC50的倍数通过将参考抗体的EC50除以测试抗体的EC50来计算。基于所得值，将抗体被分配到组中，并给出0-4的排序如下：0＝(>500nM)；1＝<0.5；2＝0.5至2；3＝2至4；4＝>4。
下面提供了每个步骤的方案。
EMT6肿瘤在Balb/c小鼠体内的接种和生长
1.将EMT6细胞悬浮于不含FBS的Waymouth培养基中，以达到5x106个细胞/ml
a.1个T225细胞培养烧瓶将产生约18-24x106个活细胞
2.在剩余的程序中将细胞保持在冰上
3.使用异氟烷吸入麻醉8周龄雌性BALB/c小鼠
使用带有25G针头的1ml注射器，将200μl细胞悬浮液(共1x106个细胞)皮下注射到小鼠剃光的左侧，从而确保细胞不会在注射期间因回流回注射器或从注射部位泄漏而丢失。
5.接种完成后检查细胞计数和活力
a.应在10％窗口内
6.使用卡尺监测肿瘤生长
收获EMT6肿瘤和离体细胞库的制备
1.如用卡尺测量的，一旦肿瘤达到500–800mm3，就收获肿瘤
2.去除所有周围的皮肤和肌肉
3.将肿瘤转移到冰上的RPMI培养基中，所述培养基中含有1/500稀释度(100μg/mL)的Primocin 4.(可合并肿瘤并将体积按比例扩大)
5.制备肿瘤消化混合物(每1个肿瘤)
a.含有Ca2+Mg2+的3.3ml HBSS
b.33μl胶原酶A(最终浓度：0.2mg/ml)
c.33μl分散酶II(最终浓度：0.8mg/ml)
d.17μl DNA酶(最终浓度：0.02mg/ml)
e.6.6μl Primocin
f.混合并通过0.22微米醋酸纤维素过滤器过滤以灭菌
6.从RPMI中恢复肿瘤。将肿瘤切成小块，并向每个肿瘤添加1ml消化混合物7.在37℃下在带盖的FACS管、15或50ml螺旋盖管中孵育，连续旋转
15分钟
8.使细胞静置30秒
9.用1ml移液管小心地去除上清液，并添加至3ml冰上的纯FBS中，所述FBS中含有
浓度100μg/mL的Primocin
10.再添加1ml消化混合物并重复2次，总共3次
11.(您可以从1ml移液管尖端上切下顶部，并在消化步骤之间使用其
进行机械解离)
12.最后一次消化后，细胞悬浮液应通过1ml微量移液管尖端
13.通过100微米细胞过滤器将FBS中收集的细胞过滤到新的50ml管中
14.旋转，300xg，4℃，10分钟
15.去除上清液并将细胞重悬于1ml纯FBS(含有100μg/mL的Primocin)中
16.计数并将细胞用FBS(含有100μg/mL的Primocin)调节至6x106个细胞/ml
a.由于碎片的原因，用Countess II或血细胞计数器的细胞计数可能不准确i.推荐用1:1000Draq5(5mM储备液浓度)对有核细胞进行染色，并
在APC通道中的流式细胞仪上计数
ii.以1:1000添加DAPI允许有核群体的活细胞门控
(需要紫激光)
1.通过添加1μl Draq5(5mM储备液)和1μl
DAPI至1ml PBS中来制备染色溶液
2.向圆底96孔中添加40μl染色溶液3.添加10μl细胞悬浮液并充分混合
4.在室温下在黑暗中孵育5分钟
5.通过流式分析样品
a.首先对Draq5(APC通道)阳性细胞进行门控
b.确定Draq5阳性群体内的DAPI(BV421通道)
阴性细胞
6.如果流式细胞仪可测量事件/μl，则您可以直接计算
细胞数(Cytflex可做到这一点)
7.如果流式细胞仪不能测量事件/μl(像大多数BD仪器一样)，则您需要添加计数珠以获得细胞计数
b.活力应高于75％
17.用FBS(含有100μg/mL的Primocin)将细胞以4x106个细胞/ml重悬
18.添加等量的含有20％DMSO和100μg/mL Primocin的FBS
19.通过上下吸移充分混合
20.将1ml(2x106个细胞)细胞悬浮液等分到冷冻管中，并在-80℃下冷冻
a.预期细胞数为约10x106个细胞/肿瘤
21.第二天转移至长期液态N2储存
a.取1个样品小瓶并根据“离体细胞解冻”方案进行解冻b.控制细胞计数
使用离体EMT6细胞进行接合测定
离体细胞解冻
1.将小瓶在37℃水浴中解冻
2.将小瓶中的内容物转移到50ml锥形管中
3.将19mL RPMI+2％FBS逐滴添加到细胞中，同时旋转悬浮液
4.旋转，300xg，4℃，5分钟
5.重悬于1mL PBS+2％FBS+2mM EDTA中
6.旋转，300xg，4℃，5分钟
7.重悬于2mL测定缓冲液(RPMI1640+4％低IgG血清)中
8.重悬于1ml测定缓冲液中
9.计数并将细胞在测定缓冲液中调节至0.5x106个细胞/ml
a.如部分C；16a
FcγRIIa接合测定(Promega试剂盒#G9991)中所述进行细胞计数
1.在测定缓冲液中以1.5倍过量制备抗体系列稀释液。
a.75μl总测定体积
b.10-6M起始浓度
c.6点剂量反应曲线中的对数稀释，一式三份
2.将25μl抗体稀释液添加到白色平底96孔板中。
a.仅使用内部60孔
b.将未使用的孔用75μl测定缓冲液填充
3.向含有抗体稀释液的每个孔中添加25ul离体细胞
a.轻轻敲击板，以将细胞与抗体混合
4.在37℃、5％CO2下孵育15分钟。
5.将一小瓶FcγRIIa-H效应细胞(0.62mL)(Promega试剂盒3G991)在37℃水浴中解冻
a.解冻后立即将小瓶从37℃取出
6.将小瓶的内容物转移到含有5.3mL测定缓冲液的锥形管中
7.将管倒置4-5次进行混合
8.计数并将细胞调节至0.5x106个细胞/ml
a.可使用常规细胞计数器或血细胞计数器进行细胞计数9.将25μl FcγRIIa-H效应细胞添加到经调理的靶细胞中
a.E:T比率为1:1
10.轻轻地来回摇动板以混合内容物(75μl总体积)
11.在37℃、5％CO2下孵育5小时
12.5小时后，通过将整瓶Bio-GloTM
测定缓冲液添加到Bio-Glo荧光素酶测定底物(每个试剂盒总共10mL)中来制备Bio-Glo荧光素酶溶液。
13.从孵育箱中取出板
14.向每个反应孔中添加75ul Bio-GloTM混合物
15.在室温下在黑暗中孵育15分钟
16.在合适的酶标仪中测量发光
17.绘制曲线并计算EC50值
试剂和缓冲液
EMT6完全培养基(正常生长培养基，NGM)
Waymouth MB 752/1培养基+2mM L-谷氨酰胺+15％胎牛血清(FBS)+1％青霉素-链霉素
测定缓冲液
RPMI1640+4％低IgG胎牛血清(FBS)
胶原酶A(Sigma-Aldrich，#10103586001)
1.添加含有Ca2+Mg2+的HBSS，以创建50mg/ml的储备溶液
2.多次倒置管
3.在室温下孵育5分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖(snap-cap)管中
5.在-20℃下储存长达一个月
6.避免重复冻/融循环
分散酶II(Sigma-Aldrich，#D4693-1G)
1.用10mM钠将1g分散酶II在10mL分子生物学级水中复原醋酸盐(pH 7.5)和5mM醋酸钙
2.多次倒置管
3.在室温下孵育60分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖管中
5.在4℃下储存长达一个月
DNA酶(Sigma-Aldrich，#4536282001)
1.添加含有Ca2+Mg2+的HBSS，以创建2mg/ml的储备溶液
2.多次倒置管
3.在室温下孵育5分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖管中
5.在-20℃下储存长达7天
6.避免重复冻/融循环
也可使用如实施例部分中所述的体内测定在体内测试抗体的抗肿瘤功能。当在相同测定条件下评价以测量体内抗肿瘤活性时，如本文所述的抗的体变体通常具有如表1所示的参考抗体的至少50％、或至少60％、或70％或更高的抗肿瘤活性。在一些实施方案中，与参考抗体相比，抗肿瘤抗体表现出改进的活性，即大于100％的活性。
抗体结合靶标
在一个方面，本文提供了一种与肿瘤组织结合的抗肿瘤抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体靶向包含mRNA并且还包含mRNA结合蛋白的细胞外RNA-蛋白质复合物。在典型实施方案中，肿瘤结合抗体通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而结合。在一些实施方案中，RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸化RNA。在一些实施方案中，RNA-蛋白质复合物包含mRNA。此种复合物还可包含其他类型的RNA，诸如核糖体RNA和/或微小RNA和/或长链非编码RNA。在一些实施方案中，RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸化RNA和/或前mRNA。在一些实施方案中，抗体直接与存在于RNA蛋白质复合物中的RNA结合蛋白结合。在其他实施方案中，抗体可结合与RNA结合蛋白相互作用的蛋白质。在其他实施方案中，抗体与蛋白质的结合取决于RNA。在一些实施方案中，抗体可同时与RNA和蛋白质结合。在一些实施方案中，抗体可与RNA结合。在其他实施方案中，抗体与RNA的结合可取决于与RNA结合的一种或多种RNA结合蛋白或取决于蛋白质复合物中结合RNA的多种蛋白质。
在一些实施方案中，本文提供的抗肿瘤抗体与包含表3中列出的一种、两种、三种或更多种蛋白质的细胞外RNA-蛋白质复合物结合。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸结合蛋白家族成员，如下文进一步所述。在一些实施方案中，细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸结合蛋白家族成员和另外的蛋白质，例如表3中列出的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，抗体与表3中列出的蛋白质结合。在一些实施方案中，蛋白质为RNA结合蛋白，诸如聚腺苷酸结合蛋白家族成员，如下文进一步所述。在一些实施方案中，本文提供的肿瘤结合抗体与包含选自以下的一种或多种蛋白质的细胞外RNA-蛋白质复合物结合：
ABCF1、ACIN1、ACLY、ADAR、AGO1、AGO2、AGO3、AHNAK、ATP2A2、ATXN2、BAG2、BOP1、BUB3、CAD、CASC3、CDC5L、CELF1、CLTA、CNBP、COPA、CRNKL1、DARS、DDX17、DDX18、DDX21、DDX5、DDX54、DDX6、DHX15、DHX30、DHX36、DHX57、DHX9、DICER1、DKC1、DNTTIP2、EDC4、EEF1D、EEF2、EFTUD2、EIF2AK2、EIF2S1、EIF3D、EIF3E、EIF3I、EIF4A3、EIF4G1、EIF6、ELAVL1、EPRS、FAM120A、FBL、FMR1、FTSJ3、FUBP3、FUS、FXR1、FXR2、GAR1、GEMIN4、GNL3、GRSF1、GTPBP4、HEATR1、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H3A、HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPA3、HNRNPAB、HNRNPC、HNRNPD、HNRNPDL、HNRNPF、HNRNPH1、HNRNPH3、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPR、HNRNPUL1、HNRNPUL2、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF2、ILF3、KARS、KHDRBS1、L1RE1、LARP1、MAGOHB、MAK16、MAP1B、MATR3、MBNL1、MOV10、MRTO4、MVP、MYBBP1A、MYO1B、NAT10、NCL、NHP2、NIFK、NKRF、NOL11、NOL6、NOP2、NOP56、NOP58、PABPC1、PABPC4、PCBP2、PDCD11、PES1、PGD、PLEC、PPP1CB、PRKDC、PRKRA、PRPF19、PRPF4B、PRPF8、PRRC2C、PTBP1、PTBP3、PUM1、PURA、PURB、PWP1、PWP2、RAB14、RAB2A、RACK1、RALY、RAN、RBM14、RBM34、RBM4、RBM45、RBM8A、RBMX、RCC2、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL29、RPL3、RPL30、RPL32、RPL34、RPL35A、RPL36、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPS11、RPS13、RPS17、RPS23、RPS24、RPS26、RPS27A、RPS3、RPS3A、RPS5、RPS6、RPS8、RPS9、RPSA、RRBP1、RRP1、RRP9、RRS1、RSL1D1、RTCB、RUVBL2、RYDEN、SART3、SF3B3、SKIV2L2、SLC3A2、SND1、SNRNP200、SNRNP70、SNRPB、SNRPD1、SNRPD2、SNRPD3、SON、SRP68、SRP72、SRPK1、SRPK2、SRRM2、SRSF1、SRSF10、SRSF2、SRSF3、SRSF6、SRSF7、SRSF9、SSB、STAU1、STAU2、STRAP、SYNCRIP、TARBP2、TARDBP、TCOF1、TCP1、THOC2、THOC6、TNRC6A、TOP1、TRA2A、TRA2B、TRIM25、TRIM56、TTN、U2AF2、UGDH、UPF1、UTP15、UTP18、UTP4、UTP6、WDR12、WDR36、WDR43、WDR46、WDR74、WDR75、XAB2、XRCC5、XRN2、YBX1、YBX3、YTHDC2、ZC3H7A、ZC3HAV1、ZCCHC3和ZNF326。
在一些实施方案中，聚腺苷酸结合蛋白家族成员为“聚腺苷酸结合蛋白1”，也称为“聚(A)结合蛋白1”(PABP-1)以及RNA，例如含聚(A)的RNA。PABP-1与mRNA的3'聚(A)尾缔合，并且在真核生物中高度保守。PABP-1由聚(A)结合蛋白细胞质1(PABPC1)基因编码(参见例如，根据NCBI参考序列NM_002568.4可获得的人PABPC1基因序列)。出于本发明的目的，“PABPC1”与“PABP-1”在指代多肽时可互换使用。人PABPC1多肽序列信息可感觉UniProtKB登录号P11940获得。已经描述了通过可变剪接产生的两种同工型。同工型1被认为是标准序列，并且长度为636个氨基酸(参见例如，NCBI参考序列NP_002559.2)。同工型2与标准序列的不同之处在于氨基酸447-553缺失。如本文所用，“人PABPC1多肽”包括由定位于人染色体8q22.2-q23的人PABPC1基因编码的任何PABPC1多肽。
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA、PABPC1和/或另外的RNA结合蛋白的复合物以引发免疫反应和/或抗肿瘤反应。可包含在此类复合物中的另外的RNA结合蛋白的说明性实例包括PABP家族成员，诸如PABP-4(也称为PABPC4)。在一些实施方案中，复合物可包含选自由表3所列的蛋白质组成的组的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质为RNA结合蛋白。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC1或RNA和PABPC1和/或另外的RNA结合蛋白的复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分，所述缩合物是大的、无序的变性RNP构型，它们与彼此及RNA形成非特异性缔合以形成大的集合体，其相分离以形成可区分的液滴(参见例如，Hyman等人,Annu Rev.Cell Dev.Biol.30:39-58,2014)。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC1或RNA和PABPC1和/或另外的RNA结合蛋白的复合物为生物分子缩合物的组分。生物分子缩合物为二维和三维隔室，其在没有封装膜的情况下缩合不同分子的特定集合(Ditlev等人,J.Mol.Biol.430:4666–4684,2018；Mullard,Nature Reviews 18:325,2019)。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC1复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC1或RNA和PABPC1和/或另外的RNA结合蛋白的复合物为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。如本文所用，“应激颗粒”是指通常在细胞质中形成的非膜结合的组装体或颗粒，其在应激后增加。在一些情况下，当细胞例如通过抑制翻译及将mRNA从分解的多核糖体中释放到离散的细胞质病灶中对应激作出反应而关闭一般蛋白质合成时，应激颗粒形成。应激颗粒可包含信使核糖核蛋白(mRNP)，包括mRNA、小40S核糖体亚基、mRNA相关翻译抑制复合物和RNA结合蛋白。这些应激颗粒蛋白可决定进出应激颗粒的特定转录物的命运，并且还调节应激细胞中的各种信号传导级联。PABPC1是已在应激颗粒中鉴定出的蛋白质之一(Aulas等人,J.of Cell Science,130:927-937,2017)。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC1复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表3的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表3中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPC1或RNA和PABPC1和/或另外的RNA结合蛋白的复合物，例如，含有靶RNA-PABPC1复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-PABPC1复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
在另一方面，本文提供了一种例如具有抗肿瘤活性的抗体，所述抗体靶向包含与PABPC1密切相关的聚(A+)结合蛋白(PABP)的RNA-蛋白质复合物。此类RNA结合蛋白描述于例如Eliseeva等人,Biochemistry 78:1377-1391,2013中。这些包括六种人聚(A+)结合蛋白，其可分组如下：细胞质(PABPC3、PABPC4、PABPC4L(和PABPC1))、胚胎(ePABP，也称为PABPC1L)、核(PABPN1)和X染色体编码的蛋白PABPC5。编码ePABP(也称为PABPC1L)的基因位于人20号染色体上。PABPC1L蛋白与PABPC1具有约98％的同源性。编码PABPC3的基因定位于13q12-q13。PABC3蛋白(631个氨基酸)与PABPC1蛋白(636个氨基酸)具有约100％的同源性。编码PABPC4(存在三种已知的同工型)的基因定位于1p34.2。所有三种PABPC4同工型与PABPC1具有约99％的同源性。编码PABC4L的基因定位于4q28.3。PABC4L蛋白与PABPC1具有约63％的同源性。编码PABPN1的基因定位于14q11.2。PABPN1蛋白与PABPC1具有约30％的同源性。编码PABPC5的基因定位于Xq21.3。PABPC5蛋白与PABPC1具有约61％的同源性。这些蛋白质的结构域结构包含一个或多个RNA识别基序。细胞质PABP具有四个此类结构域，通常位于N末端区。PABPC1、PABPC1L、PABPC3和PABC4的C末端区含有由五个α螺旋组成的螺旋结构域。核蛋白PABPN1仅具有一个RNA识别基序。
RNA-PABPC4复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和PABPC4的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC4的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC4的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPC4的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-PABPC4复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-PABPC4复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-PABPC3复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和PABPC3的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC3的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC3复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC3的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC3的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC3复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC3的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC3的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC3复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC3复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC3复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC3复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPC3的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-PABPC3复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC3的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-PABPC3复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-PABPC4L复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和PABPC4L的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4L的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4L复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC4L的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4L的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4L复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC4L的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4L的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC4L复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4L复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4L复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC4L复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPC4L的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-PABPC4L复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC4L的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-PABPC4L复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-ePABP复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和ePABP的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含ePABP的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-ePABP复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和ePABP的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含ePABP的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-ePABP复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和ePABP的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含ePABP的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-ePABP复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-ePABP复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-ePABP复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-ePABP复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和ePABP的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-ePABP复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含ePABP的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-ePABP复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-PABPN1复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和PABPN1的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPN1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPN1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPN1的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPN1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPN1复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPN1的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPN1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPN1复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPN1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPN1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPN1复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPN1的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-PABPN1复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPN1的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-ePABP复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-PABPC5复合物
在一些实施方案中，本文提供了一种抗体，所述抗体靶向包含RNA和PABPC5的复合物以引发抗肿瘤反应。在一些实施方案中，所述复合物包含另外的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，所述复合物为核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC5的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC5复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC5的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为生物分子缩合物的组分。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC5的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC5复合物的生物分子缩合物。
在一些实施方案中，包含RNA和PABPC5的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)为应激颗粒的组分或以其他方式与应激颗粒复合。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC5的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤含有包含靶RNA-PABPC5复合物的应激颗粒。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC5复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物包含选自表5的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，应激颗粒包含选自表5中组1、2、3或4中的蛋白质的一种或多种应激颗粒蛋白质。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC5复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含一种或多种癌胚蛋白。癌胚蛋白的非限制性实例包括IGF2BP1和IGF2BP3。
在一些实施方案中，包含靶RNA-PABPC5复合物的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、应激颗粒和/或生物分子缩合物还包含癌症抗原，例如癌症-睾丸抗原。一种示例性癌症-睾丸抗原为IGF2BP2。
在一些实施方案中，在细胞外发现包含RNA和PABPC5的复合物(其还可包含另外的RNA结合蛋白)，例如，含有靶RNA-PABPC5复合物或与其结合的核糖核蛋白(RNP)-RNA缩合物液滴、颗粒和/或生物分子缩合物(如上所述)在细胞外。因此，在一些实施方案中，将靶向包含PABPC5的复合物的抗体施用于患有肿瘤的患者，所述肿瘤具有包含靶RNA-PABPC5复合物的细胞外复合物。在一些实施方案中，患者为哺乳动物，例如人。
RNA-PABP疫苗
在一些实施方案中，将包含RNA和一种或多种RNA结合蛋白(例如PABP，例如PABC1、PABPC3、PABPC4、PABC4L、ePABP、PABPN1和/或PABPC5中的一个或多个)的复合物作为癌症疫苗的组分施用。在一些实施方案中，此种复合物与免疫调节剂(例如佐剂)共同施用。调节剂的实例包括但不限于细胞因子、生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白细胞介素(例如，白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15Rα，例如，sushi结构域、复合物、IL-18和IL-21)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(例如，干扰素-α、-β或-γ)、促红细胞生成素和促血小板生成素或其组合。在一些实施方案中，复合物可与佐剂共同施用，所述佐剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂、C型凝集素受体(CLR)激动剂、视黄酸诱导基因I样受体(RLR)激动剂、皂苷、多糖诸如甲壳素、壳聚糖、β-葡聚糖、ISCOM、QS-21、干扰素基因刺激剂(STING)激动剂或另一种免疫增强剂。
抗体形式
在本发明的另一方面，根据本公开的抗肿瘤抗体可为抗体片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、双抗体或F(ab')2片段。在另一个实施方案中，抗体为基本上全长的抗体，例如，如本文所定义的IgG抗体或其他抗体类型或同种型。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。抗体片段可通过各种技术来制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞产生。
在一些实施方案中，施用于患者的根据本发明的抗肿瘤抗体为IgG1亚类的IgG。在一些实施方案中，此种抗体具有λ轻链恒定区。
在一些实施方案中，根据本公开的抗肿瘤抗体呈单价形式。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体呈片段形式，例如，Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab')2片段。
在一些实施方案中，本公开的抗体包含具有效应功能的Fc区，例如表现出抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一些实施方案中，Fc区可为经工程化以改变抗体的一种或多种功能特性的Fc区，所述功能特性诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或ADCC。因此，Fc区可包含另外的突变以增加或减少效应功能，即在与免疫细胞上表达的Fc受体结合后诱导某些生物学功能的能力。免疫细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞(Langerhans’cell)、自然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞。
效应功能的实例包括但不限于C1q结合和CDC、Fc受体结合(例如，FcγR结合)、ADCC、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、细胞表面受体的下调(例如，B细胞受体)和B细胞激活。效应功能可因抗体类别而异。例如，天然人IgG1和IgG3抗体可在与免疫系统细胞上存在的适当Fc受体结合后引发ADCC和CDC活性；并且天然人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4可在与免疫细胞上存在的适当Fc受体结合后引发ADCP功能。
在一些实施方案中，本文所述的Fc区可包括另外的调节效应功能的修饰。调节效应功能的Fc区氨基酸突变的实例包括但不限于Fc区的位置228、233、234、235、236、237、238、239、243、265、269、270、297、298、318、326、327、329、330、331、332、333和334(EU编号方案)处的一个或多个取代。
减少效应功能的示例性取代包括以下：位置329可具有突变，其中脯氨酸被甘氨酸或精氨酸或足够大的氨基酸残基取代以破坏Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp87和Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面。另外的减少效应功能的说明性取代包括S228P、E233P、L235E、N297A、N297D和P331S。也可存在多个取代，例如，人IgG1 Fc区的L234A和L235A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和P329G；人IgG4 Fc区的S228P和L235E；人IgG1 Fc区的L234A和G237A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A和G237A；人IgG2 Fc区的V234A和G237A；人IgG4Fc区的L235A、G237A和E318A；以及人IgG4 Fc区的S228P和L236E，以减少效应功能。增加效应功能的取代的实例包括例如，E333A、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、S239D/A330L/I332E、F243L、G236A和S298A/E333A/K334A。Fc区中可增加或减少效应功能的氨基酸突变的描述可发现于例如Wang等人,Protein Cell.9(1):63–73,2018；Saunders,FrontImmunol.6月7日,eCollection,2019；Kellner等人,Transfus Med Hemother.44(5):327–336,2017；和Lo等人,J Biol Chem.292(9):3900-3908,2017中。
在一些实施方案中，Fc区可具有调节ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如，根据EU编号方案在Fc区的位置298、333和/或334处的取代。具体地，可将S298A、E333A和K334A引入Fc区以增加Fc区对FcγRIIIa的亲和力并降低Fc区对FcγRIIa和FcγRIIb的亲和力。
Fc区还可包含另外的突变以增加血清半衰期。通过增强与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，Fc区的此类突变可改进抗体的药代动力学。Fc区中增加抗体血清半衰期的取代的实例包括例如，M252Y/S254T/T256E、T250Q/M428L、N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M428L/N434S、M252Y/M428L、D259I/V308F、N434S、V308W、V308Y和V308F。Fc区中可增加抗体血清半衰期的氨基酸突变的描述可发现于例如Dumet等人,MAbs.26:1-10,2019；Booth等人,MAbs.10(7):1098–1110,2018；和Dall'Acqua等人,J Biol Chem.281(33):23514-24,2006中。
此外，在一些实施方案中，本公开的抗体可经化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分连接到抗体)或被修饰，例如在细胞系中和/或在细胞培养条件下产生以改变其糖基化(例如，低岩藻糖基化、无岩藻糖基化或增加的唾液酸化)，以改变抗体的一种或多种功能特性。例如，抗体可连接到多种聚合物中的一种，例如聚乙二醇。在一些实施方案中，抗体可包含突变以促进与化学部分的连接和/或改变经受翻译后修饰(例如，糖基化)的残基。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体以双特异性或多特异性形式(例如，三特异性形式)使用。例如，在一些实施方案中，可将抗体并入包含与相同或不同抗原结合的另一结合结构域的双特异性或多特异性抗体中。
可被包含本发明的重链和/或轻链可变结构域的双特异性或多特异性抗体中的另一结合结构域靶向的说明性抗原包括但不限于T细胞上的抗原，以增强T细胞接合和/或激活T细胞。此种抗原的说明性实例包括但不限于CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L、CD44、IL-15Rα、CD122、CD132或CD25。在一些实施方案中，抗原为CD3。在一些实施方案中，抗原在T细胞激活途径中，诸如4-1BB/CD137、CD137L、OX40、OX40L、GITRL、GITR、CD27、CD70、CD28、ICOS、HVEM或LIGHT抗原。
在一些实施方案中，包含本发明的重链和/或轻链可变区的双特异性或多特异性抗体还包含与检查点剂PD1、PDL1、CTLA-4、ICOS、PDL2、IDO1、IDO2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、GITR、HAVCR2、LAG3、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO、OX-40、SLAM、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137、CD160、CD39、VISTA、TIGIT、CGEN-15049、2B4、CHK 1、CHK2、A2aR或B-7家族配体或其受体结合的结合结构域。
在一些实施方案中，包含本发明的重链和/或轻链可变区的双特异性或多特异性抗体还包含靶向肿瘤相关抗原的结合结构域。说明性肿瘤相关抗原包括但不限于EpCAM、HER2/neu、HER3/neu、G250、CEA、MAGE、蛋白聚糖、VEGF、VEGFREGFR、ErbB2、ErbB3、MET、IGF-1R、PSA、PSMA、EphA2、EphA3、EphA4、叶酸结合蛋白αVβ3-整合素、整合素α5βl HLA、HLA-DR、ASC、CD1、CD2、CD4、CD6、CD7、CD8、CD1 1、CD1 3、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD37、CD40、CD41、CD47、CD52、c-erb-2、CALLA、MHCII、CD44v3、CD44v6、p97、神经节苷脂GM1、GM2、GM3、GD1 a、GD1 b、GD2、GD3、GT1 b、GT3、GQ1、NY-ESO-1、NFX2、SSX2、SSX4Trp2、gp100、酪氨酸酶、Muc-1、端粒酶、生存素、SLAMF7 EphG250、p53、CA125 MUC、Wue抗原、Lewis Y抗原、HSP-27、HSP-70、HSP-72、HSP-90、Pgp、PMEL17、MCSP和细胞表面靶标GC182、GT468或GT512。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体的重链和轻链可变区可并入嵌合抗原受体构建体中，以产生含有CAR的免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞。例如，在一些实施方案中，第一代CAR通过铰链结构域和跨膜结构域将来自抗体的单链可变区连接到CD3 T细胞受体的CD3zeta(ζ)细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR可含有共刺激结构域，例如，第二代或第三代CAR可包含另外的一个或两个共刺激结构域，诸如4-1BB、CD28或OX-40)。在另外的实施方案中，含有CAR的细胞(例如CAR-T细胞)可另外经工程化成具有诱导型表达组分(诸如细胞因子，例如IL-12或IL-15)，以增加CAR-T细胞的激活，并且还激活先天免疫细胞。
抗体的产生
如本文所公开的抗肿瘤抗体通常使用本领域众所周知的载体和重组方法产生(参见例如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology)。用于基因操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可购自商业供应商。因此，在本发明的另一方面，本文提供了编码如本文所述的抗肿瘤抗体中的任一个的VH和/或VL区或其片段的分离的核酸；包含此类核酸的载体和其中引入了用于复制编码抗体的核酸和/或表达抗体的核酸的宿主细胞。此类核酸可编码含有抗肿瘤抗体的VL的氨基酸序列和/或含有抗肿瘤抗体的VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，宿主细胞含有(1)含有编码VL氨基酸序列的多核苷酸和编码VH氨基酸序列的多核苷酸的载体，或(2)含有编码VL氨基酸序列的多核苷酸的第一载体和含有编码VH氨基酸序列的多核苷酸的第二载体。
在另一方面，本发明提供了一种制备如本文所述的抗肿瘤抗体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在适合用于表达抗体的条件下培养如前述段落中所述的宿主细胞。在一些实施方案中，随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗体。
含有编码本公开的抗体或其片段的多核苷酸的合适载体包括克隆载体和表达载体。虽然所选克隆载体可根据旨在使用的宿主细胞而变化，但可用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性核酸内切酶的单一靶标，且/或可携带可用于选择含有所述载体的克隆的标志物的基因。实例包括质粒和细菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1质粒、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体。这些和许多其他克隆载体可购自商业供应商。
表达载体通常为含有本公开的核酸的可复制多核苷酸构建体。表达载体可作为附加体(episome)或作为染色体DNA的组成部分在宿主细胞中复制。合适的表达载体包括但不限于质粒和病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和任何其他载体。
用于表达如本文所述的抗肿瘤抗体的合适宿主细胞包括原核或真核细胞。例如，可在细菌中产生抗肿瘤抗体，特别是在不需要糖基化和Fc效应功能时。表达后，抗体可在可溶性馏分中从细菌细胞团糊中分离，并可进一步纯化。可替代地，宿主细胞可为真核宿主细胞(包括真核微生物，诸如丝状真菌或酵母，包括其糖基化途径已经“人源化”而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株)、脊椎动物、无脊椎动物和植物细胞。无脊椎动物细胞的实例包括昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用。也可利用植物细胞培养物作为宿主细胞。
在一些实施方案中，脊椎动物宿主细胞用于产生本公开的抗肿瘤抗体。例如，哺乳动物细胞系诸如由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚胎肾系(如例如Graham等人,J.GenVirol.36:59,1977中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(sertolicell)(如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251,1980中所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68,1982中所述的TRI细胞；MRC 5细胞；和FS4细胞，可用于表达抗肿瘤抗体。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216,1980)；和骨髓瘤细胞系诸如Y0、NS0和Sp2/0。本公开的宿主细胞还包括但不限于分离的细胞、体外培养的细胞和离体培养的细胞。关于适合用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编，Humana Press,Totowa,NJ),第255-268页,2003。
在一些实施方案中，本发明的抗体由CHO细胞系例如CHO-K1细胞系产生。可引入编码重链和轻链序列的一种或多种表达质粒。例如，在一个实施方案中，使用试剂诸如Freestyle Max试剂将编码重链(例如SEQ ID NO:1723)的表达质粒和编码轻链(例如SEQID NO:1724)的表达质粒在CHO-K1宿主细胞系中以1:1的比率作为线性化质粒转染到宿主细胞中。荧光激活细胞分选(FACS)耦联单细胞成像可用作获得生产细胞系的克隆方法。
可在适当的条件下培养用编码本公开的抗肿瘤抗体或其片段的表达载体转染的宿主细胞，以允许发生多肽的表达。多肽可从含有多肽的细胞和培养基的混合物中分泌和分离。可替代地，可将多肽保留在细胞质或膜馏分中，并且收获细胞、裂解细胞，并使用所需方法分离多肽。
在一些实施方案中，本公开的抗肿瘤抗体可通过体外合成产生(参见例如，SutroBiopharma生化蛋白质合成平台)。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生如本文所公开的抗肿瘤抗体的变体的方法。因此，例如，可修饰编码如本文所述的VH CDR3变体的构建体，并且可在如本文所述的与如本文所述的VL区或变体区配对的VH区的上下文中，测试由修饰的构建体编码的VH区对EMT-6细胞的结合活性和/或体内抗肿瘤活性。类似地，可修饰编码如本文所述的VL CDR3变体的构建体，并且可测试由修饰的构建体编码的VL区与EMT-6细胞或其他肿瘤细胞的结合和/或体内抗肿瘤活性功效。此种分析也可用其他CDR或框架区进行，然后可选择具有所需活性的抗体。
抗肿瘤抗体缀合物/共刺激剂
在另一方面，本发明的抗肿瘤抗体可缀合或连接至治疗性部分和/或成像/可检测部分。例如，抗肿瘤抗体可缀合至可检测标志物、细胞毒性剂、免疫调节剂、成像剂、治疗剂或寡核苷酸。用于将抗体缀合或连接至所需分子的方法是本领域众所周知的。所述部分可共价或通过非共价键联与抗体连接。
在一些实施方案中，抗体缀合至细胞毒性部分或抑制细胞增殖的其他部分。在一些实施方案中，抗体缀合至细胞毒性剂，包括但不限于例如，蓖麻毒素A链、多柔比星、柔红霉素、美登木素生物碱、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、甲氨蝶呤(methotrexact)、放线菌素、白喉毒素、来自假单胞菌(Pseudomonas)的外毒素A、假单胞菌外毒素40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α帚曲霉素、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、眼镜蛇毒因子、核糖核酸酶、工程化的志贺毒素(Shiga toxin)、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)、麻风树毒蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、加利车霉素(calicheamicin)、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素、奥里斯他汀(auristatin)、金霉素、钇、铋、考布他丁(combrestatin)、多米卡星(duocarmycin)、多拉司他汀(dolastatin)、cc1065或顺铂。在一些实施方案中，抗体可连接至剂，诸如酶抑制剂、增殖抑制剂、裂解剂、DNA或RNA合成抑制剂、膜通透性改性剂、DNA代谢物、二氯乙基硫化物衍生物、蛋白质产生抑制剂、核糖体抑制剂或细胞凋亡诱导剂。在一些实施方案中，抗体缀合至药物诸如拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑异构酶I抑制剂。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体与例如通过增强膜的渗透而促进抗体跨生物膜转运的分子连接，从而促进蛋白质跨膜易位。因此，例如，抗体可连接到细胞渗透剂，诸如细胞渗透肽。细胞渗透肽的实例包括TAT、穿透蛋白、聚精氨酸分子、Kunitz结构域衍生的肽，例如angiopep-2、SynB、buforin、转运素(transportan)、两亲性肽等。在一些实施方案中，抗体可与阳离子分子(诸如多胺)缀合。在一些实施方案中，抗体可缀合至促进跨血脑屏障转运(例如转胞吞作用)的剂。因此，例如，抗体可缀合至与内化的内皮细胞受体(例如，转铁蛋白受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体或低密度脂蛋白受体等)结合的剂。在一些实施方案中，抗体可缀合至促进所述抗体进入细胞质的毒素，例如志贺毒素。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体与多肽免疫调节剂(例如佐剂)缀合或共同施用。调节剂的实例包括但不限于细胞因子、生长因子、淋巴毒素、肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白细胞介素(例如，白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15Rα，例如，sushi结构域、复合物、IL-18和IL-21)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(例如，干扰素-α、-β或-γ)、促红细胞生成素和促血小板生成素或其组合。在一些实施方案中，抗体与佐剂连接或共同施用，所述佐剂诸如Toll样受体(TLR)激动剂、C型凝集素受体(CLR)激动剂、视黄酸诱导基因I样受体(RLR)激动剂、皂苷、多糖诸如甲壳素、壳聚糖、β-葡聚糖、ISCOM、QS-21、干扰素基因刺激剂(STING)激动剂或另一种免疫增强剂。
在一些实施方案中，抗体可连接至放射性核素、铁相关化合物、染料、荧光剂或成像剂。在一些实施方案中，抗体可连接至剂，诸如但不限于金属；金属螯合剂；镧系元素；镧系元素螯合剂；放射性金属；放射性金属螯合剂；正电子发射核；微泡(用于超声)；脂质体；在脂质体或纳米球中微囊化的分子；单晶氧化铁纳米化合物；磁共振成像造影剂；吸光剂、反射剂和/或散射剂；胶体颗粒；荧光团，诸如近红外荧光团。
诱导免疫反应的方法
在另一方面，本文提供了通过将如本文所述的肿瘤结合抗体施用于患有包含肿瘤结合抗体所结合的细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的受试者来诱导免疫反应的方法。在一些实施方案中，肿瘤结合抗体是如上所述的表1或表2中列出的抗体或其变体。
通过施用如本文所述的抗体诱导的免疫反应可为先天性或适应性免疫反应。在一些实施方案中，抗体例如通过抗体与靶肿瘤细胞的结合以及与效应细胞上Fc受体的接合而使得效应细胞被激活，来直接激活免疫反应。在一些实施方案中，抗体通过诱导由抗体与靶细胞和效应细胞结合而引发的免疫反应以及随后诱导下游免疫反应，来间接激活免疫反应。在一些实施方案中，抗体激活单核细胞、骨髓细胞和/或NK细胞，例如巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或NK细胞。在一些实施方案中，抗体激活T淋巴细胞和/或B细胞。
癌症治疗
在另一方面，如本文所提供的肿瘤结合抗体(例如，如上所述的表1中列出的抗体或其变体)可与治疗剂一起用于治疗癌症。在一些方面，本公开另外提供了鉴定作为用具有抗肿瘤作用的抗肿瘤抗体治疗的候选者的受试者的方法。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定具有与本公开的抗肿瘤抗体结合的肿瘤细胞的患者的方法。在一些实施方案中，肿瘤样品来自原发性肿瘤。在替代实施方案中，肿瘤样品为转移性病灶。抗体通过与细胞外RNA-蛋白质复合物的结合相互作用而与肿瘤细胞的结合可使用任何测定(诸如免疫组织化学或流式细胞术)来测量。在一些实施方案中，抗体与样品中至少0.2％、0.5％或1％、或至少5％或10％、或至少20％、30％或50％的肿瘤细胞的结合可用作确定将用如本文所述的抗肿瘤抗体治疗的患者的选择标准。在其他实施方案中，对血液组分(例如，循环外泌体(exosome)和/或细胞外RNA-蛋白质复合物)的分析用于鉴定其肿瘤细胞正在产生细胞外RNA-蛋白质复合物的患者。
任何数量的癌症都可用本发明的抗肿瘤抗体治疗。在一些实施方案中，癌症为癌或肉瘤。在一些实施方案中，癌症为血液癌症。在一些实施方案中，癌症为乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、肾细胞癌、膀胱癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌、结直肠癌、肛门癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、头颈癌、脑癌例如胶质母细胞瘤、黑色素瘤或者骨或软组织肉瘤。在一个实施方案中，癌症为肢端黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症为急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路与下丘脑胶质瘤、支气管腺瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样血管内皮瘤(EHE)、食道癌、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、胃癌、毛细胞白血病、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、下丘脑和视觉通路胶质瘤、儿童期、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、喉癌、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell cancer)、间皮瘤、转移性颈鳞癌、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病、髓性白血病、成人急性、骨髓增生性病症、慢性、粘液瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、少突胶质细胞瘤、口腔癌(oral cancer)、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤因氏肉瘤、卡波西氏肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞泽里综合征(Sézary syndrome)、非黑色素瘤皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、鳞状细胞癌、颈鳞癌、胃癌、皮肤T细胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、滋养层肿瘤、妊娠、尿道癌、子宫癌、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
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macroglobulinemia)或维尔姆斯氏肿瘤(Wilms tumor)。
在一些实施方案中，癌症为肺癌，例如非小细胞肺腺癌或鳞状细胞癌；乳腺癌，例如，三-、ER/PR+Her2-、ER/PR-Her2+或三-；结直肠癌，例如腺癌、粘液腺癌或乳头状腺癌；食道癌；胃癌；肾癌，例如肾透明细胞癌；卵巢癌，例如卵巢子宫内膜样癌、卵巢粘液性囊腺癌或卵巢浆液性囊腺癌；黑色素瘤，例如肢端黑色素瘤、皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤；子宫癌或宫颈癌；肝癌，例如肝细胞癌或胆管癌；膀胱癌，例如移行性或尿路上皮性膀胱癌；或睾丸癌。
在一个方面，本公开的方法包括使用适合用于癌症治疗的给药方案将抗肿瘤抗体(例如，如上所述的表1中列出的抗体或其变体)作为药物组合物以治疗有效量施用于癌症患者。所述组合物可配制用于多种药物递送系统。一种或多种生理上可接受的赋形剂或载剂也可包含在组合物中以用于适当的制剂。用于本发明中的合适的制剂可发现于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins,2005中。
抗肿瘤抗体以适合用于向患者施用的溶液形式(诸如注射用无菌等渗水性溶液)提供。抗体以合适的浓度溶解或悬浮于可接受的载剂中。在一些实施方案中，载剂为水性的，例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等。所述组合物可含有接近生理条件所需的辅助药物物质，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂等。
将药物组合物以足以治愈或至少部分地阻止疾病或疾病的症状及其并发症的量施用于患者。将足够实现此目标的量定义为“治疗有效剂量”。通过监测患者对疗法的反应来确定治疗有效剂量。指示治疗有效剂量的典型基准包括患者疾病症状的改善。此用途的有效量将取决于疾病的严重程度和患者的一般健康状况，包括其他因素，诸如年龄、体重、性别、施用途径等。抗体的单次或多次施用可根据患者所需要和耐受的剂量和频率施用。无论如何，所述方法提供了足够量的抗肿瘤抗体来有效治疗患者。
抗肿瘤抗体可通过任何合适的手段施用，包括例如肠胃外、肺内和鼻内施用，以及局部施用，诸如肿瘤内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，抗体可通过吹入施用。在说明性实施方案中，抗体可在4℃下以10mg/ml储存在注射用无菌等渗盐水溶液中，并在施用于患者前在100ml或200ml 0.9％注射用氯化钠中稀释。在一些实施方案中，抗体以0.01mg/kg与25mg/kg之间的剂量通过静脉输注在1小时的时程中施用。在其他实施方案中，抗体通过静脉输注在15分钟与2小时之间的时间段内施用。在再其他实施方案中，施用程序是通过皮下推注注射。
选择抗体剂量以便为患者提供有效疗法，并且所述剂量在小于0.01mg/kg体重至约25mg/kg体重的范围内或在每名患者1mg–2g的范围内。优选地，剂量在0.1–10mg/kg或大约50mg–1000mg/名患者的范围内。根据抗体的药代动力学(例如，抗体在循环中的半衰期)和药效学反应(例如，抗体治疗作用的持续时间)，可以适当的频率重复剂量，所述频率可在每天一次至每三个月一次或每六个月一次的范围内。在一些实施方案中，约7天与约25天之间的体内半衰期和抗体给药在每周一次与每3个月一次或每6个月一次之间重复。在其他实施方案中，抗体大约每月一次施用。
在说明性实施方案中，抗体可以10mg/ml或20mg/ml储存在无菌等渗水性溶液中。所述溶液可包含诸如缓冲剂和稳定剂的剂。例如，在一些实施方案中，包含缓冲剂诸如组氨酸以维持约5.5的制剂pH。可添加另外的试剂(诸如蔗糖)或替代物，以防止溶液中以及冷冻和解冻过程中的聚集和解聚。可包含诸如聚山梨醇酯80的剂或替代物以降低表面张力并稳定抗体以抵抗搅拌诱导的变性以及气液和冰液表面变性。在一些实施方案中，将注射用溶液储存在4℃下，并在施用于患者前在100ml或200ml 0.9％注射用氯化钠中稀释。
在一些实施方案中，将用于IV施用的抗体(例如，具有SEQ ID NO:1723的重链序列和SEQ ID NO:1724的轻链序列的抗体)以20mg/mL的目标浓度在20mM组氨酸缓冲液、8％(重量/体积)蔗糖和0.02％(重量/体积)聚山梨醇酯80以pH 5.5配制。
抗肿瘤抗体可与一种或多种另外的治疗剂(例如，放射疗法、化学治疗剂和/或免疫治疗剂)一起施用。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体可与靶向免疫检查点抗原的剂联合施用。在一个方面，所述剂为生物治疗剂或小分子。在另一方面，所述剂为单克隆抗体、人源化抗体、人抗体、融合蛋白或其组合。在某些实施方案中，所述剂例如通过阻断配体与受体的结合来抑制检查点抗原，所述检查点抗原可为PD1、PDL1、CTLA-4、ICOS、PDL2、IDO1、IDO2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、GITR、HAVCR2、LAG3、KIR、LAIR1、LIGHT、MARCO、OX-40、SLAM、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD80、CD86、CD137(4-1BB)、CD160、CD39、VISTA、TIGIT、SIGLEC、CGEN-15049、2B4、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其受体，或其组合。在一些实施方案中，所述剂靶向PD-1，例如，阻断PD-L1与PD-1的结合或以其他方式抑制PD-1的抗体。在一些实施方案中，所述剂靶向CTLA-4。在一些实施方案中，所述剂靶向LAG3。在一些实施方案中，所述剂靶向TIM3。在一些实施方案中，所述剂靶向ICOS。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体可与治疗性抗体(诸如靶向肿瘤细胞抗原的抗体)联合施用。治疗性抗体的实例包括利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿特立单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、AMP-514、PDR001、特瑞普利单抗(cemiplimab)、BMS-936559、CK-301、依帕珠单抗(epratuzumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达雷木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、地努图希单抗(dinutuximab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、依匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)和兰尼单抗(ranibizumab)。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗体与化学治疗剂一起施用。癌症化学治疗剂的实例包括烷基化剂诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺；烷基磺酸盐诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博莱霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)；丝裂霉素类、酶酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培来霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲酶素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercindin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶；叶酸类似物诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；西交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛(doxetaxel)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；多西他赛；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；米托蒽醌(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-1 1；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；维甲酸衍生物诸如贝沙罗汀(bexarotene)；阿利维甲酸(alitretinoin)；地尼白介素；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义中还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、米非司酮(mifepristone)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY 1 17018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素药，诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁他胺(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。其他癌症治疗剂包括索拉非尼(sorafenib)和其他蛋白激酶抑制剂，诸如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、福坦替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、莫立替尼(mubritinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、凡德他尼(vandetanib)、威罗菲尼(vemurafenib)和舒尼替尼(sunitinib)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、依维莫司(everolimus)和其他mTOR抑制剂。另外的化学治疗剂的实例包括拓扑异构酶I抑制剂(例如，伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、喜树碱及其类似物或代谢物，以及多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；烷化剂(例如，美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替哌、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲酶素、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基产生剂，诸如博来霉素；和核苷模拟物(例如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和羟基脲)。说明性化学治疗剂另外包括紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春新碱、长春花碱和相关类似物；沙利度胺(thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和相关类似物(例如，CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))；NF-κΒ抑制剂，包括ΙκΒ激酶的抑制剂和其他已知在癌症中上调、过度表达或激活的蛋白质或酶的抑制剂，其抑制下调细胞复制。另外的剂包括天冬酰胺酶和卡介苗(BacillusCalmete-Guérin)制剂。
在一些实施方案中，将如本文所述的抗肿瘤抗体在诱导应激颗粒的治疗剂(例如，化学治疗剂，诸如多柔比星)(“SG诱导剂”)之后施用或与其同时施用。增加癌细胞中应激颗粒的量可促进抗肿瘤抗体靶向肿瘤细胞。可诱导应激颗粒的其他示例性治疗剂包括嘧啶类似物(例如，5-FU，商品名为
Figure GDA0003431173340001391
)；蛋白酶抑制剂(例如，硼替佐米，商品名为
Figure GDA0003431173340001392
)；激酶抑制剂(例如，索拉非尼和伊马替尼，商品名分别为
Figure GDA0003431173340001401
和
Figure GDA0003431173340001402
)；砷化合物(例如，三氧化二砷，商品名为
Figure GDA0003431173340001403
)；诱导DNA损伤的铂基化合物(例如，顺铂和
Figure GDA0003431173340001404
商品名分别为
Figure GDA0003431173340001405
和
Figure GDA0003431173340001406
)；破坏微管的剂(例如，长春花碱，商品名为
Figure GDA0003431173340001407
或
Figure GDA0003431173340001408
长春新碱，商品名为
Figure GDA0003431173340001409
或
Figure GDA00034311733400014010
长春瑞滨，商品名为
Figure GDA00034311733400014011
)；拓扑异构酶II抑制剂(例如，依托泊苷，商品名为Etopophos、
Figure GDA00034311733400014012
)；以及诱导DNA损伤的剂，例如照射。可诱导应激颗粒形成的许多示例性治疗剂公开于Mahboubi等人,Biochimicaet Biophysica Acta 1863(2017)884-895中。
本文所述的抗肿瘤抗体和SG诱导剂(或此类剂的组合)的各种组合可用于治疗癌症患者。通过“组合治疗”或“与……组合”，并不意味着暗示治疗剂必须同时施用和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。抗肿瘤抗体和SG诱导剂可按照相同或不同的给药方案施用。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体和SG诱导剂在治疗期的整个或部分期间以任何顺序依次施用。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体和SG诱导剂同时或大约同时施用(例如，彼此相隔约1、5、10、15、20或30分钟内)。在其他实施方案中，可在施用抗肿瘤抗体之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天施用SG诱导剂。在一些实施方案中，在施用抗肿瘤抗体之前1至4周或更长时间施用SG诱导剂。
还可将抗肿瘤抗体与基于细胞的疗法(诸如自然杀伤(NK)细胞疗法或癌症疫苗)联合施用于癌症患者。在一些情况下，癌症疫苗为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于细胞的疫苗、基于病毒或病毒片段的疫苗或基于抗原呈递细胞(APC)的疫苗(例如基于树突状细胞的疫苗)。癌症疫苗包括
Figure GDA00034311733400014013
sipuleucel-T
Figure GDA00034311733400014014
NeuVaxTM、HER-2ICD基于肽的疫苗、HER-2/neu肽疫苗、AdHER2/neu树突状细胞疫苗、HER-2脉冲DC1疫苗、Ad-sig-hMUC-l/ecdCD40L融合蛋白疫苗、MVX-ONCO-1、hTERT/生存素/CMV多肽疫苗、E39、J65、P10s-PADRE、rV-CEA-Tricom、
Figure GDA0003431173340001411
HER2VRP、AVX901、ONT-10、ISAlOl、ADXSl1-001、VGX-3100、INO-9012、GSK1437173A、BPX-501、AGS-003、IDC-G305、
Figure GDA0003431173340001412
肾(HAR)免疫疗法、Prevenarl3、MAGER-3.A1、NA17.A2、DCVax-Direct、潜伏膜蛋白-2(LMP2)负载的树突状细胞疫苗(NCT02115126)、HS410-101(NCT02010203，Heat Biologies)、EAU RF 2010-01(NCT01435356，GSK)、140036(NCT02015104，Rutgers Cancer Institute of New Jersey)、130016(NCTO1730118，National Cancer Institute)、MVX-201101(NCT02193503，Maxivax SA)、ITL-007-ATCR-MBC(NCT01741038，Immunovative Therapies,Limited)、CDR0000644921(NCT00923143，Abramson cancer center of the University of Pennsylvania)、SuMo-Sec-01(NCT00108875，Julius Maximilians Universitaet Hospital)或MCC-15651(NCT01176474，Medarex,Inc,BMS)。
在一些实施方案中，本发明的抗肿瘤抗体可与减轻由刺激免疫系统引起的副作用的剂(例如皮质类固醇)一起施用。
在本发明的上下文中，可在施用抗肿瘤抗体之前或施用抗肿瘤抗体之后施用与本发明的抗肿瘤抗体联合施用的治疗剂。在一些实施方案中，抗肿瘤抗体可与另外的治疗剂同时施用。
提供以下实施例用于说明性目的，并且不旨在限制本发明。本领域技术人员将容易地识别可被改变或修改以产生基本上相同的结果的多种非关键参数。
实施例
实施例1.具有抗肿瘤作用的抗体变体的鉴定。
命名为AIP-192482的初始先导抗体序列是通过对体内肿瘤模型筛选与抗PD1抗体疗法的组合中鉴定的非小细胞肺癌患者的浆母细胞进行测序获得的。
在初始筛选中采用EMT6异位肿瘤模型。向Balb/c小鼠沿右侧皮下注射106个EMT6细胞。在Balb/c小鼠的EMT6同基因异位乳腺癌模型中进一步评价来自谱系的初始抗体的抗肿瘤活性。一旦肿瘤达到平均75-120mm3，基于肿瘤体积(TV)将小鼠随机分到治疗组。用测试抗体和/或检查点抑制剂疗法进行的治疗在随机化当天开始。除非另有说明，否则测试抗体通过腹膜内(i.p.)注射每周两次施用，持续3.5周(TWx3.5w)。通过每周两次i.p.注射，持续3.5周(7次剂量)，以每种抗体5mg/kg(mpk)(20mg/kg总抗体)的剂量测试四种抗体池。将动物与抗小鼠PD1抗体组合处理，以10mpk i.p.给药，每周两次，持续两周。初始先导抗体也以20mpk与抗PD1组合单独测试(池外)。含有先导抗体的抗体池表现出抗肿瘤活性(图1)。
在EMT6肿瘤模型(皮下注射肿瘤细胞)中生成并测试初始先导抗体的变体。将变体作为单一疗法进行测试，并以10mpk的剂量施用，每周两次，持续3.5周，如上所述。鉴定了具有抗肿瘤活性的变体(图2A和2B)。
初始先导抗体和变体的存活概率数据在图3A和图3B中示出。通过对数秩检验计算P值。初始先导抗体在5mpk和10mpk的剂量下均表现出对存活的显著影响。变体AIP-106042和AIP-100196(图3A)表现出显著的影响，变体AIP-122563、AIP-165430、AIP-157397和AIP-171142(图3B)也是如此。其他变体也表现出增加的存活概率，尽管处于较低水平(图3A和3B)。例如，与对照相比，抗体AIP-148327在第40天增加了存活概率(图3B)。
施用变体对肿瘤体积的影响在图4A和4B中示出。数据表示为归一化曲线上面积(NAAC)。基于每个单独抗体的肿瘤体积曲线计算其NAAC值。NAAC值在0与1之间。所述值越接近1，随着时间的推移，肿瘤体积越小，即治疗越有效。鉴定了对肿瘤体积有显著影响的变体，例如，AIP-106042和AIP-100196(图4A)以及AIP-171142、AIP-157397、AIP-165430和AIP-122563(图4B)。用其他抗体变体进行的治疗也导致肿瘤体积的至少一定程度的减小。
还产生了在第一代变体筛选中鉴定为具有抗肿瘤活性的抗体变体。如上所述，还在EMT6肿瘤模型中评价了作为单一疗法的这些变体。变体以图5A-5D所示的剂量施用，每周两次，持续3.5周。鉴定了具有抗肿瘤作用的变体(图5A-5D)。
用第二代变体进行治疗的抗体的存活数据在图6A和6B中示出。通过对数秩检验计算P值。鉴定了表现出存活概率显著增加的变体(例如，AIP-155066、AIP-166120、AIP-142079、AIP-104188(图6A)以及AIP-158623、AIP-133645、AIP-136538、AIP-187893和AIP-160470(图6B)。
在EMT6肿瘤模型中，施用第二代变体对肿瘤体积的影响在图7A和7B中示出。变体AIP-155066、AIP-166120、AIP-142079和AIP-104188在以5mpk的量施用时表现出显著高于对照的NAAC值，其中大多数变体在2.5mpk的量时也表现出显著高于对照的NAAC值。变体AIP-158623、AIP-136538、AIP-133645和AIP-187893在所有测试浓度下均表现出显著的NAAC值；其中一些变体表现出远高于对照的NAAC值。
当与抗PD1抗体组合施用时，评价用前述分析中鉴定的变体中的两种(AIP-133645和AIP-160470)进行的治疗。再次使用EMT6肿瘤模型。初始先导抗体以5mpk和10mpk的剂量施用。变体以2.5mpk和5mpk给药。抗PD1抗体以10mpk施用。研究设计在图8中示出。以指定的剂量和频率通过i.p.注射施用抗体。当作为单一疗法施用时，初始先导抗体和两种变体的存活分析在图9中示出。两种变体AIP-160470和AIP-133645都能够改进相对于初始先导抗体的存活。当作为单一疗法施用时，先导抗体和两种变体对肿瘤生长、存活概率和肿瘤体积的影响分别在图10、图11和图12中示出。当抗体与抗-PD1抗体组合施用时，对肿瘤生长、存活概率和肿瘤体积的影响分别在图13、图14和图15中示出。
初始先导抗体和变体AIP-160470和AIP-133645的抗肿瘤作用也在CT-26结直肠癌异位同基因小鼠肿瘤模型中作为单一疗法进行评价。向动物沿右侧皮下注射106个CT26肿瘤细胞。通过i.p.注射2x/wk，持续3.5周，以20mpk的剂量施用抗体。对肿瘤生长、存活概率和肿瘤体积的影响分别在图16、图17和图18中示出。所有三种抗体在降低肿瘤生长、改进存活概率、减小肿瘤体积方面均表现出显著的治疗作用。
实施例2.抗体结合的组织学分析
还分析了与小鼠和人肿瘤细胞及邻近组织的结合。测试了初始先导抗体和变体子集与人雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(II期)和邻近乳腺组织的结合。将冷冻样品冷冻切片，安装在载玻片上并用4％PFA轻轻固定。使用10μg/ml、1μg/ml和0.3μg/ml一抗和IgG对照(未检测到信号)孵育载玻片，之后使用缀合至Cy5的抗小鼠二抗孵育，用Hoechst复染，并在水性封固的培养基中覆盖盖玻片。相邻载玻片用苏木精和伊红(H&E)染色。图19比较了初始先导抗体与肿瘤和TAT的结合和变体AIP-157397和AIP-165430与其的结合。变体AIP-157397表现出与肿瘤结合的信号显著增加。与初始先导相比，与TAT结合的信号也增加，但结合可滴定，使得在TAT中没有观察到信号。变体AIP-165430与先导相比表现出与肿瘤的结合增强，其中对TAT的结合增加最小。同种型对照未表现出信号(数据未示出)。
变体AIP-106042和AIP-100196与人ER阳性乳腺癌组织和TAT的结合也使用如所述制备的载玻片进行评价，并使用30μg/ml、10μg/ml和3μg/ml第一抗体和IgG对照进行染色。相邻切片使用H&E进行染色。变体AIP-106042和AIP-100196都与肿瘤组织结合，但与先导相比时水平降低(图20和21)。即使在最高测试浓度下也几乎没有观察到与TAT的结合(数据未示出)。
还评价了与初始先导抗体表现出的结合相比，变体AIP-160470、AIP-133645、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-187893、AIP-142079、AIP-184490和AIP-104188对ER阳性乳腺肿瘤组织和TAT的结合。ER阳性乳腺肿瘤和TAT切片用H&E染色，并用1μg/ml、3μg/ml和10μg/ml的先导抗体、变体或同种型对照(IgG)进行免疫染色。通过荧光显微镜评估免疫反应性，并捕获不同浓度的图像。除AIP-136538外，先导和所有变体(AIP-160470、AIP-133645、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-187893、AIP-142079、AIP-184490和AIP-104188)均检测到阳性免疫反应性(即，高于IgG对照的信号)(图22)。无论抗体浓度如何，图像都与ER阳性乳腺癌核心中相似的荧光强度相匹配。除AIP-136538和AIP-104188外，所有测试变体在乳腺肿瘤内均表现出与初始先导抗体观察到的荧光强度相似的荧光强度，但第一抗体浓度低3至10倍。还评估了肿瘤标记与TAT结合的选择性。与先导相比，肿瘤与邻近组织信号的比率显著增强，其中变体的子集包括AIP-160470和AIP-133645。
还评估了与EMT-6肿瘤结合的抗体。在接种106个EMT-6细胞后大约7天，从动物收获肿瘤样品。评估了变体AIP-157397、AIP-165430、AIP-160470、AIP-133645、AIP-158623、AIP-155066、AIP-136538、AIP-166120、AIP-187893、AIP-142079、AIP-184490和AIP-104188的EMT-6结合活性(数据未示出)。可能是由于与内源性Fc受体的相互作用，小鼠组织中的背景免疫反应性略微较高。虽然所有变体均表现出与EMT-6肿瘤细胞的结合，但变体之间的信号强度差异明显。
还评价了初始先导抗体(图23A)以及变体AIP-133645(图23B)和AIP-160470(图23C)与接种人癌细胞系(异种移植物)或小鼠癌细胞系(同基因的)的小鼠中产生的肿瘤的结合。将冷冻肿瘤冷冻切片到载玻片上。抗体和同种型对照(IgG)缀合至AF647，并且载玻片与缀合物一起孵育，然后用Hoechst复染。相邻切片也使用H&E染色。对于所有肿瘤，使用变体抗体染色的肿瘤切片表现出与先导相比增强的信号，所述肿瘤包括源自人肺A549细胞、人胰腺BXPC3细胞、人结肠癌Colo-205细胞或人前列腺癌PC3细胞的肿瘤以及源自小鼠结肠癌、乳腺癌、肺癌或肾癌细胞系的肿瘤。
实施例3.组合疗法—组织学分析
初始先导抗体在EMT-6肿瘤模型中作为单一疗法以及与抗PD-1抗体的组合使用如实施例1中所述的给药方案在体内进行评价。来自PBS、抗PD1、先导抗体或组合疗法治疗的队列的EMT-6肿瘤在接种后两周和三周收获，并进行组织学评价。肿瘤切片用H&E和马松三色(Masson’s trichrome)(Trichrome)染色。通过CD4(CD4+T细胞)、CD8(CD8+T细胞)、CD335(NK细胞)、CD68(巨噬细胞)和iNOS(诱导型一氧化氮合酶)的免疫荧光，在肿瘤切片中评估免疫细胞表型和激活状态。在接种后两周(数据未示出)和三周(图24)均用检查点抑制剂治疗后，肿瘤中的免疫细胞浸润增加。此外，在来自用先导抗体或先导抗体与检查点抑制剂的组合治疗的小鼠的肿瘤中，在两周(数据未示出)和三周(图24)时均观察到强烈的浸润。iNOS免疫反应性增加表明来自先导和组合疗法治疗的队列的肿瘤中存在有活性的促炎反应。
实施例4.离体结合测定与体内抗肿瘤活性相关
在离体结合测定中分析初始先导抗体和变体抗体，以确定与体内抗肿瘤活性的相关性。离体测定的示意图在图25中示出。向小鼠注射肿瘤细胞，并使肿瘤生长到约500-600mm3的大小。收获肿瘤，将其消化，并通过流式细胞术分析与活肿瘤细胞表面结合的抗体。如实施例1中所述，在用抗体进行体内治疗后，结合与代表肿瘤体积的NAAC值相关。结果表明，抗体与离体EMT6细胞的结合在很大程度上与体内结果相关(图26和图27)。因此，离体流式分析提供了在很大程度上与体内功能相关的筛选测定，所述测定可用于鉴定可能引发抗肿瘤作用的抗体。
实施例5.抗体与靶标的结合的分析
为了确定AIP-192482结合的肿瘤细胞上的靶标，用全细胞提取物进行免疫沉淀(IP)。将A549细胞在补充有35S标记的甲硫氨酸和半胱氨酸的不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中孵育过夜(37℃，5％CO2)。将细胞在放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(25mM Tris·HCl pH 7.6，150mM NaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中裂解，之后用缓冲液(1x磷酸盐缓冲盐水，补充有450mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40，5％甘油)洗涤5次。使用AIP-192482或对照抗体的IP反应使用与DynabeadsTMM-280Tosylactivated顺磁珠交联的抗体过夜进行。然后在磁体上收集珠，并在含有450mM NaCl的缓冲液中洗涤，并用50mM Tris、pH8.0、1mM EDTA和1％脱氧胆酸钠洗脱。将与抗体结合的放射性标记抗原洗脱到2x还原SDS-PAGE样品缓冲液中，并在4％-20％变性SDS-PAGE凝胶上解析。通过磷成像放射自显影使解析的蛋白质可视化。对于质谱(MS)分析，使用未经代谢标记的A549细胞制备裂解物，并且IP反应按比例扩大。然后通过nanoLC-MS/MS分析(由Alphalyse和MS Bioworks执行)评价洗脱液。
SDS-PAGE分析(图28)鉴定了大量独特的蛋白质，大小在15.8kDa至152.8kDa的范围内。通过MS分析鉴定的蛋白质中有许多RNA结合蛋白。这些鉴定的蛋白质中很多已被证明存在于应激颗粒中，参见Markmiller等人,Cell,172,590–604,2018年1月25日；和Youn等人,Molecular Cell,69,517–532(2018)和Jain等人,Cell 164,487–498
2016年1月28日。表3列出了在AIP-192482下拉的免疫沉淀复合物中鉴定的示例性蛋白质。根据先前发表的分析，这些鉴定的蛋白质基于它们是否也已知处于应激颗粒中进行分类：i)对US-02细胞的生化分离分析，如Jain等人(2016)中所述；ii)对HEK293细胞进行的APEX(邻近标记)分析，如Markmiller等人(2018)中所述；iii)对神经祖细胞进行的APEX(邻近标记)分析，如Markmiller等人(2018)中所述；以及iv)对HEK293细胞的BioID(邻近标记)分析，如Youn等人(2018)中所述。组1蛋白质(12种蛋白质)在先前通过所有四项已发表分析在应激颗粒中检测到的蛋白质(20种蛋白质)的列表中。组2蛋白质(12种蛋白质)在先前通过四项已发表分析中的三项在应激颗粒中检测到的蛋白质(38种蛋白质)的那些列表中。组3蛋白质(20种蛋白质)在先前通过四项已发表分析中的两项在应激颗粒中检测到的蛋白质的列表中。组4蛋白质(63种蛋白质)在先前通过Jain等人在应激颗粒中检测到的蛋白质(139种)的列表中。
表3.MS鉴定的免疫沉淀复合物中的示例性蛋白质
Figure GDA0003431173340001481
Figure GDA0003431173340001491
如上表3所示，在使用AIP-192482的免疫沉淀中鉴定的蛋白质列表与根据已发表文献已知存在于应激颗粒中的蛋白质列表之间存在显著重叠。此外，与普遍观点相反的是，在应激下的细胞中，如此少的PABPC1分配到应激颗粒中(根据Wheeler等人,Methods126:12-17(2017)为6％)允许通过使用结合PABPC1的抗体从粗裂解物中免疫沉淀应激颗粒，如上所示，AIP-192482直接从全细胞裂解物中成功免疫沉淀了包含PABPC1的复合物。
与对照免疫沉淀物相比，在MS中鉴定的以2倍或更高水平存在于AIP-192482免疫沉淀物中或评分为2或更高的另外的蛋白质为：
ABCF1、ACIN1、ACLY、ADAR、AGO1、AGO2、AGO3、AHNAK、ATP2A2、ATXN2、BAG2、BOP1、BUB3、CAD、CASC3、CDC5L、CELF1、CLTA、CNBP、COPA、CRNKL1、DARS、DDX17、DDX18、DDX21、DDX5、DDX54、DDX6、DHX15、DHX30、DHX36、DHX57、DHX9、DICER1、DKC1、DNTTIP2、EDC4、EEF1D、EEF2、EFTUD2、EIF2AK2、EIF2S1、EIF3D、EIF3E、EIF3I、EIF4A3、EIF4G1、EIF6、ELAVL1、EPRS、FAM120A、FBL、FMR1、FTSJ3、FUBP3、FUS、FXR1、FXR2、GAR1、GEMIN4、GNL3、GRSF1、GTPBP4、HEATR1、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H3A、HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPA3、HNRNPAB、HNRNPC、HNRNPD、HNRNPDL、HNRNPF、HNRNPH1、HNRNPH3、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPM、HNRNPR、HNRNPUL1、HNRNPUL2、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、ILF2、ILF3、KARS、KHDRBS1、L1RE1、LARP1、MAGOHB、MAK16、MAP1B、MATR3、MBNL1、MOV10、MRTO4、MVP、MYBBP1A、MYO1B、NAT10、NCL、NHP2、NIFK、NKRF、NOL11、NOL6、NOP2、NOP56、NOP58、PABPC1、PABPC4、PCBP2、PDCD11、PES1、PGD、PLEC、PPP1CB、PRKDC、PRKRA、PRPF19、PRPF4B、PRPF8、PRRC2C、PTBP1、PTBP3、PUM1、PURA、PURB、PWP1、PWP2、RAB14、RAB2A、RACK1、RALY、RAN、RBM14、RBM34、RBM4、RBM45、RBM8A、RBMX、RCC2、RPL10A、RPL11、RPL12、RPL13A、RPL14、RPL15、RPL17、RPL18、RPL18A、RPL19、RPL21、RPL22、RPL23、RPL23A、RPL24、RPL26、RPL27、RPL29、RPL3、RPL30、RPL32、RPL34、RPL35A、RPL36、RPL4、RPL5、RPL6、RPL7、RPL7A、RPL8、RPLP0、RPLP1、RPLP2、RPS11、RPS13、RPS17、RPS23、RPS24、RPS26、RPS27A、RPS3、RPS3A、RPS5、RPS6、RPS8、RPS9、RPSA、RRBP1、RRP1、RRP9、RRS1、RSL1D1、RTCB、RUVBL2、RYDEN、SART3、SF3B3、SKIV2L2、SLC3A2、SND1、SNRNP200、SNRNP70、SNRPB、SNRPD1、SNRPD2、SNRPD3、SON、SRP68、SRP72、SRPK1、SRPK2、SRRM2、SRSF1、SRSF10、SRSF2、SRSF3、SRSF6、SRSF7、SRSF9、SSB、STAU1、STAU2、STRAP、SYNCRIP、TARBP2、TARDBP、TCOF1、TCP1、THOC2、THOC6、TNRC6A、TOP1、TRA2A、TRA2B、TRIM25、TRIM56、TTN、U2AF2、UGDH、UPF1、UTP15、UTP18、UTP4、UTP6、WDR12、WDR36、WDR43、WDR46、WDR74、WDR75、XAB2、XRCC5、XRN2、YBX1、YBX3、YTHDC2、ZC3H7A、ZC3HAV1、ZCCHC3和ZNF326。
为了测试RNA是否是AIP-192482结合的复合物的一部分，从放射性标记的A549细胞中制备裂解物，然后用递增量的RNA酶A(0.001μg/ml至10μg/ml)或DNA酶I(20μg/ml)处理。使用AIP-192482在IP中使用经处理的裂解物。通过SDS-PAGE，之后通过放射自显影分析结合的蛋白质。结果表明，用RNA酶而不是DNA酶的处理以RNA酶剂量依赖性方式消除了AIP-192482免疫沉淀的蛋白质(图29)。此作用对AIP-192482抗原具有特异性，因为没有观察到EGFR与抗EGFR对照抗体结合的此种作用(数据未示出)。此结果表明RNA有助于AIP-192482与其靶标结合(参见图38A和图38B)。
进行另外的MS分析以鉴定靶标的组分。在一项此类分析中，将由未标记的A549细胞制备的RIPA裂解物与AIP-192482缀合的M-280珠一起孵育，然后使用DTSSP(ThermoFisher)进行交联。淬灭后，用RNA酶(100ng/ml)处理裂解物。将珠在高盐缓冲液中洗涤，并将抗原使用0.5N氢氧化铵洗脱，然后进行nanoLC-MS/MS(MS Bioworks)。进行凝胶消化并分析蛋白质。一种RNA结合蛋白PABPC1在所有MS运行的结果中以高丰度存在，并在RNA酶处理后富集(图30)。
PABPC1在用人PABPC1-FLAG表达质粒瞬时转染的293T细胞中表达为C末端FLAG融合体，并通过抗FLAG抗体色谱纯化。纯化的PABPC1与通过由T7启动子驱动的线性化质粒模板的体外转录产生的纯化的聚(A)RNA(56聚体)一起孵育。然后将复合的PABPC1-RNA与单价AIP-192482Fab一起孵育，并且将所得复合物在Superose 6凝胶过滤柱(GE Lifesciences)上以按质量计15:15:1的PABPC1:AIP-192482Fab:RNA的最终比例进行解析。柱洗脱液的A280吸光度和柱馏分的SDS-PAGE分析(图31)表明，AIP-192482Fab、PABPC1和聚(A)RNA形成高分子大小的复合物，其在单个组分之前从柱上显著洗脱。RNA酶A也包含在柱色谱之前的AIP-192482孵育步骤中。未观察到此样品的高分子大小的复合物。
如上所解释，来自使用AIP-192482获得的A549细胞的交联的RNA酶处理的免疫沉淀物的MS结果表明免疫沉淀物中存在PABPC1。PABPC3/4、MOV10、UPF1和其他蛋白质也被鉴定为存在于免疫沉淀物中的组分。
实施例6.共聚焦成像示出抗体靶向的复合物的定位和组分
对用抗体染色的EMT6肿瘤组织进行免疫荧光显微镜检查。AIP-192482示出与EMT6肿瘤内的G3BP阳性结构亚群共定位。参见图32A-D。图像示出AIP-192482信号与G3BP(应激颗粒的另一个标志物)的信号之间存在广泛重叠。结果表明存在对AIP-192482不呈阳性的较小G3BP斑点。尽管这些G3BP阳性结构的子集(即非常小的斑点)对AIP-192482免疫反应性不呈阳性，但在结构上更具异质性的较大聚集体中，反应性共定位。这表明AIP-192482与具有RNP的复合物缔合。
本文所公开的抗体通过共聚焦显微镜示出靶向位于细胞外的蛋白质复合物。如图33A-D所示，AIP-160470发生反应，在此处也检测到CD9反应性。共聚焦成像示出AIP-160470反应性在本质上明显是细胞外的，这证实了如下所述的流式细胞术数据。对人乳腺癌组织进行了类似的共聚焦显微镜实验，这也表明AIP-160470与出现在细胞外的直径约1μm的许多CD9阳性囊泡共定位。
另外的共聚焦显微镜成像示出AIP-160470信号与RNA结合蛋白(包括PABPC1和MOV10)共定位，并且标记与人卵巢癌组织中的细胞外斑点和质膜一致。
实施例7.流式细胞术示出抗体靶向的复合物的表面定位
将EMT6细胞用化学治疗剂多柔比星(“DOX”)或顺铂(“CDDP”)处理，持续16小时。DOX和CDDP都是已知的应激颗粒的诱导剂，Vilas-Boas等人,J Neurooncol 127:253–260(2016)；和Morita等人,Biochemical and Biophysical Research Communications 417:399-403(2012)。将处理的细胞接种在96孔板中，并用AIP-192482、AIP-160470或AIP-195694(阴性对照)染色。然后用与Alexa 647缀合的二抗对细胞进行染色，并在流式细胞仪上进行分析。针对治疗细胞中使用的化学治疗剂的浓度，绘制与抗体与EMT6细胞的结合相对应的几何平均荧光图，参见图35A-B和图36。这些数据表明，这些抗体与细胞表面结合，这补充了图33中示出体内EMT6细胞的生长也诱导此种表面反应性的共聚焦数据。实施例4的离体流式分析也证实了这种细胞外表面定位。
实施例8.AIP-160470的变体的生成
在上述实施例中评价了AIP-192482的抗体变体。使用AIP-160470作为亲本比较序列，通过将各种取代引入CDR中，产生许多另外的抗体变体。在体外Fc受体接合测定中测试了变体。变体包括在每个CDR中引入的各个取代，以及其中最多四个取代被引入到HCDR1中、最多五个取代被引入到HCDR2中、最多十三个取代被引入到HCDR3中、最多六个取代被引入到LCDR1中、最多三个取代被引入到LCDR2中和最多六个取代被引入到LCDR3中的变体。还测试了变体CDR1、CDR2和CDR3序列的组合。对变体进行体外活性测试，并对子集进行体内抗肿瘤活性测试，如下所述。表1B和表2B中提供了有活性的变体的CDR序列。
体外活性
体外抗体的活性使用FcR接合测定来确定。变体在FcγRIIa-H ADCP报告基因生物测定(Promega)中测试。此测定用于测量特异性结合并激活FcγRIIa的抗体的效力和稳定性。所述采用使用稳定表达人FcγRIIa-H(高亲和力H131变体)的Jurkat细胞和NFAT诱导的荧光素酶。在与靶细胞结合的测试抗体的Fc区与Jurkat效应细胞上的FcγR接合后，Jurkat细胞中产生细胞内信号，从而产生可量化的NFAT-RE介导的荧光素酶活性。下面的“详细方法”部分中详细描述了用于分析变体的测定。
在体外测定中有活性的变体的活性在图39中示出。如图39所示，如果变体表现出500nM或更低的EC50；或如果变体具有相对于AIP-160470为至少0.5的Δ活性值，则将它们视为有活性。具有相对于AIP-160470为零的Δ值的抗体被认为是无活性的。下面的“详细方法”部分描述了活性的评分。
变体的体内活性
选择在体外有活性的变体的子集，以使用EMT6小鼠模型来评价体内抗肿瘤活性。进行了两轮体内研究。第1轮包括AIP-192482、AIP-160470和16种其他变体。第2轮包括AIP-192482、AIP-160470、第1轮的重复变体(AIP-101235)以及如本文所述生成的16种另外的变体。因此，如本申请中所述的体内研究包含34种独特的抗体，其中这34种抗体中的3种在两轮中都进行了测试。在第1轮和第2轮中体内测试的变体分别描述于图40和41中，其包括EC50值和Δ活性排序。使用存活、归一化曲线上面积度量(NAAC)和归一化生长速率度量(NGRM)评估体内抗肿瘤活性，其中NAAC和NGRM均在Atreca开发。下面的“详细方法”部分中提供了这些测定的描述。如方法部分所解释，基于体内活性的“体内有活性的”通过存活、NAAC和NGRM分析中的至少一项中p值≤0.05来评估，即如果抗体表现出存活、NAAC和/或NGRM的p值小于或等于0.05(任何单独的一项都足够)，则抗体被视为“体内有活性的”。研究设计在图42中示出。图43提供了示出在第2轮随机化时各队列肿瘤体积的数据。图44示出了第2轮中变体的抗肿瘤作用，按中值存活排序。图45示出了在第2轮中表现出最有效反应的抗体，按NAAC效应大小排序。图46示出了在第2轮中表现出最有效反应的抗体，按NGRM效应大小排序。图47示出了在第2轮中引发最完全反应的抗体。“完全反应”(CR)是当三个连续的肿瘤体积测量值(TVM)被记录为0mm3(在第40天的分析)时。引发最完全反应的抗体是指引发组中大多数动物作为完全反应的抗体，例如，如果组中存在6只小鼠，并且6只小鼠中的3只为CR，则所述抗体引发3个CR，并且所述图示出了CR数值最高的抗体。图48提供了在第2轮中表现出最持久反应的抗体的数据。如图48中定义的“持久反应”(DR)表示给药后持续的肿瘤消退窗口(在第40天的分析)。图49中提供了具有抗肿瘤作用的变体抗体的子集的体内活性的总结。
研究体外FcγRIIa测定中的活性、体内活性与体内抗肿瘤活性之间的关系，以确定体外测定是否预测体内活性。为了对体外Fc-γ受体测定结果与体内活性之间的关系进行建模，使用R版本3.4.3(The R Foundation)构建具有线性项的多元逻辑回归模型。所述模型在包括AIP-192482、AIP-186435、AIP-172643、AIP-172872和AIP-114111的数据子集上进行训练，这导致所有抗体只有一个假阳性(AIP-163039)，其中没有观察到体内活性。对于每种抗体，在多次运行中取EC50(nM)和Δ活性的平均值，将Δ活性归一化为AIP-160470，并通过存活、NAAC和NGRM分析中的至少一项中p值≤0.05来评估体内活性。结果在图50A和50B中示出。分析表明，体外EC50和归一化Δ活性超过两个图中所示的阈值线的抗体通常预测在体内表现出抗肿瘤活性。
经工程化的FR
AIP-160470的VH和VL序列也经工程化以含有来自不同IGHV或IGLV基因的框架区。框架区是定义的CDR残基之间的那些区。AIP 160470的VH的FR区最密切对应于IGHV3-15，IMGT ID X92216，并且AIP 160470的VL的FR区最密切对应于IGLV1-47，IMGT ID Z73663。
AIP-127782具有AIP-160470的CDR，并经工程化以具有IGHV3-72(IMGT IDX92206)的VH FR和IGLV1-51(IMGT ID Z73661)的VL FR。AIP-127782在体外接合测定中有活性。还在体内评价了抗肿瘤活性(如下)。此抗体在EMT6小鼠模型中也表现出抗肿瘤活性。
产生了三种另外的抗体。AIP-180422具有AIP-160470的CDR、IGHV3-72(IMGT IDX92206)的VH FR和天然IGLV1-47(IMGT ID Z73663)的VL FR。AIP-166722具有AIP-160470的CDR、IGHV3-72(IMGT ID X92206)的VH FR和IGLV1-40(IMGT ID M94116)的VL FR。AIP-193490具有AIP-160470的CDR、IGHV3-49(IMGT ID M99401)的VH FR；和IGLV1-40(IMGT IDM94116)的VL FR。这些抗体在体外接合测定中都表现出活性。这些抗体未经体内测试。
详细方法
EMT6同基因小鼠肿瘤模型，体内抗肿瘤活性评价
如上所述使用EMT6同基因小鼠肿瘤模型来评估ATRC-101的mIgG2a嵌合变体的抗肿瘤功效。使用的程序根据DeFalco等人,Clin.Immunol.187:37-45,2018进行修改。EMT6小鼠肿瘤细胞通过每2至3天传代细胞(1:10传代)在培养物中繁殖。在接种当天，收集细胞，计数，并在不含补充剂的Waymouth培养基中稀释至5×106个细胞/mL。在接种之前和之后立即测试细胞活力。通过皮下注射0.2mL不含补充剂的Waymouth培养基中的1×106个EMT6细胞对每只4-6周龄的雌性BALB/c小鼠进行右后侧接种。细胞接种的那天被指定为研究第0天。包括>30％的超量以实现具有一致且均匀的肿瘤体积的研究组。在细胞接种后大约三天，小鼠肿瘤变得持续可见且可感知。在随机化之前测量肿瘤体积2-3次。在研究第7天，使用StudyLog实验室动物管理软件(版本3.1.399.23)的“匹配分布”随机化功能对小鼠进行随机化，以确保均匀的肿瘤体积。患有溃疡前肿瘤、不规则形状肿瘤或多发性肿瘤的小鼠被排除在随机化之外。在制剂缓冲液(达尔伯克氏PBS，DPBS)中制备测试制品和媒介物对照。将稀释的抗体在无菌、预密封的单剂量硼硅酸盐玻璃小瓶中等分，并保持在4℃直至给药。从随机化日开始，基于小鼠体重，通过每周两次IP注射，以10ml/kg给药测试制品，共7次剂量。所有小鼠按计划给药，或直到基于根据Explora BioLabs的动物使用协议EB17-010-104定义的安乐死标准并符合终点，将它们从研究中移除。在随机化后使用连接到StudyLog实验室动物管理软件(版本3.1.399.23)的电子卡尺每周两次测量肿瘤体积。使用以下等式自动计算肿瘤体积：
肿瘤体积(mm3)＝长(mm)×宽2(mm)×0.5
在施用测试制品后，连续三次测量肿瘤体积为0mm3的小鼠被认为表现出完全反应(CR)。在给药窗口关闭后继续持续肿瘤消退的小鼠被认为表现出持久反应(DR)。
当观察到IACUC协议批准的任何终点中的任一个时，处死小鼠：
肿瘤体积大于≥2000mm3，肿瘤阻止正常动物功能(姿势、步态、进食或饮水能力、呼吸等)，或广泛的肿瘤溃疡(>50％肿瘤面积；或如果有证据表明溃疡性肿瘤导致慢性疼痛)
使用Atreca,Inc开发的归一化曲线上面积(NAAC)和归一化生长速率度量(NGRM)对肿瘤体积进行统计分析。
为了确定NAAC，将肿瘤体积曲线与2000mm3肿瘤体积终点之间的面积除以直至肿瘤接种后研究第35天可能的总面积。在所有动物具有可测量肿瘤体积的第一时间点与肿瘤体积在0mm3至2000mm3之间的研究第35天之间确定可能的总面积。NAAC值在0与1之间。曲线与肿瘤体积终点之间面积较小的个体的NAAC值接近于0，并且曲线与肿瘤体积终点之间面积较大的个体的NAAC值接近于1。
为了确定NGRM，首先计算对数转化的肿瘤体积与时间的斜率，然后重新缩放到肿瘤接种后20天。然后将这些斜率归一化为0与1之间的值。肿瘤体积随时间推移增加的个体的NGRM值接近于0，并且肿瘤体积随时间推移稳定或减少的个体的NGRM值接近于1。
用单侧Wilcoxon秩和检验来评价NAAC和NGRM治疗组和对照组分布之间的统计学显著性差异，从而使用R版本3.4.3(The R Foundation)得到p值。最终肿瘤体积未达到1800mm3并且直至分析持续时间的80％时未存活的动物被排除在NAAC和NGRM分析之外。
使用研究终点数据进行存活分析。用Kaplan-Meier方法估计每组的存活曲线。使用单侧对数秩检验进行统计分析，以使用R版本3.4.3(The R Foundation)评估测试组相对于PBS对照的存活优势。所述模型预测在本文中命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的抗体将具有抗肿瘤活性。
使用EMT6肿瘤细胞的FcγRIIa接合测定
如本文所述的抗肿瘤抗体的靶标在体内生长时由肿瘤细胞表达，但不在体外标准培养条件下生长的肿瘤细胞中表达。所述测定在离体细胞(即，在体内同基因(免疫匹配)小鼠中作为肿瘤移植物生长的肿瘤细胞)上进行，然后在24-48小时内收获并加工。
测定具有四个部分：A.体外制备EMT6小鼠乳腺癌细胞储备液；EMT6肿瘤在Balb/c小鼠体内的接种和生长；C.收获EMT6肿瘤细胞并制备离体细胞库；使用离体EMT6细胞进行FcγR2a接合测定。下面提供每个步骤的方案。
A.体外制备EMT6小鼠乳腺癌细胞
1.从液氮中取出一小瓶EMT6细胞
2.在37℃水浴中解冻，直到几乎完全解冻(应保留一小块冰)3.将解冻的细胞悬浮液(1ml)添加到50ml管中的9ml EMT6细胞培养基中
4.旋转，300xg，室温，5分钟
5.吸取上清液并将细胞重悬于15ml EMT6培养基中
6.将细胞悬浮液添加到T75 TC处理的细胞培养烧瓶中
7.在37℃、5％CO2下的加湿孵育箱中生长细胞
8.在周一、周三和周五供应新鲜培养基
9.当细胞达到80％汇合时扩增细胞
a.从烧瓶中吸取细胞培养基
b.用不含Ca2+Mg2+的10ml PBS洗涤一次
c.添加2ml TrypLE(#12604021，Invitrogen)
d.在37℃下孵育5分钟
e.轻轻敲击烧瓶以分离细胞(在显微镜下确认)
f.向培养皿中添加7ml NGM，轻轻上下吸移以重悬
g.在新烧瓶中以1:10分流
h.添加培养基。轻轻上下吸移以创建均匀的悬浮液
i.在37℃、5％CO2下的加湿孵育箱中生长细胞
10.一旦细胞达到80％汇合，收获冷冻的等分试样：
11.如上所述分离细胞，并在50ml管中合并
12.取10μl细胞悬液，并添加10μl台盼蓝
13.充分混合并使用Countess II细胞计数器(#AMQAX1000，Fisher Scientific)对细胞进行计数。
计算细胞活力
14.旋转，300xg，室温，5分钟
15.在纯FBS中以4x106个细胞/ml重悬
16.添加等量的预先制备的含有20％DMSO的FBS。(不要将100％DMSO直接添加到细胞中)
17.通过轻轻上下吸移充分混合
18.将1ml(2x106个细胞)细胞悬浮液等分到冷冻管中，并在-80℃下在Mr Frosty(51000001，ThermoFisher)中冷冻
19.第二天转移至长期液态N2储存
B.EMT6肿瘤在Balb/c小鼠体内的接种和生长
从主库解冻EMT6细胞
1.在37℃水浴中解冻来自部分A的1小瓶EMT6细胞。将细胞转移到15ml锥形管中。添加10ml正常生长培养基。在室温下以300xg离心5分钟。吸取上清液。将细胞沉淀重悬于15ml NGM中并在T75烧瓶中接种
2.在第2天，使用上述传代细胞的方法将细胞从T75传代到T225
3.在第4天，传代细胞1:10(如果过周末，则为1:12)
4.在第6天或第7天，传代细胞1:10(如果过周末，则为1:12/如果需要大量细胞，
则在此阶段扩增)
5.在第8天或第9天，将细胞扩增到10个烧瓶中
6.在第10天或第11天，收获细胞进行体内注射：
EMT6肿瘤接种
A.从烧瓶中吸取细胞培养基
B.用不含Ca2+Mg2+的10ml PBS(对于T225为20ml)洗涤一次
C.添加2ml TrypLE(#12604021，Invitrogen)(对于T225为5ml)
D.在37℃下孵育5分钟
E.轻轻敲击烧瓶以分离细胞(在显微镜下确认)
F.用7ml(对于T225为15ml)EMT6培养基将细胞从烧瓶中冲洗掉
G.对细胞进行计数，并用台盼蓝确定活力
a.如果活力低于85％，则不继续
H.旋转，300xg，室温，5分钟
I.吸取上清液
J.将细胞悬浮于不含FBS的Waymouth培养基中，以达到5x106个细胞/ml
a.1个T225细胞培养烧瓶将产生约18-24x106个活细胞
K.从现在开始将细胞保持于冰上
L.使用异氟醚吸入麻醉8周龄雌性BALB/c小鼠
M.剃光BALB/c小鼠的左侧
N.使用带有25G针头的1ml注射器皮下注射200ul细胞悬浮液(共1x106个细胞)
a.确保您没有看到细胞回流到注射器中
b.确保细胞悬浮液不会从注射部位泄露
O.接种完成后检查细胞计数和活力
a.应在10％窗口内
P.使用卡尺监测肿瘤生长
C.收获EMT6肿瘤和离体细胞库的制备
1.如用卡尺测量的，一旦肿瘤达到500–800mm3，就收获肿瘤
2.去除所有周围的皮肤和肌肉
3.将肿瘤转移到冰上的RPMI培养基中，所述培养基中含有1/500稀释度(100μg/mL)的Primocin 4.(可合并肿瘤并将体积按比例扩大)
5.制备肿瘤消化混合物(每1个肿瘤)
a.含有Ca2+Mg2+的3.3ml HBSS
b.33ul胶原酶A(最终浓度：0.2mg/ml)
c.33ul分散酶II(最终浓度：0.8mg/ml)
d.17ul DNA酶(最终浓度：0.02mg/ml)
e.6.6uL Primocin
f.混合并通过0.22微米醋酸纤维素过滤器过滤以灭菌
6.从RPMI中恢复肿瘤。将肿瘤切成小块，并向每个肿瘤添加1ml消化混合物7.在37℃下在带盖的FACS管、15或50ml螺旋盖管中孵育，连续旋转
15分钟
8.使细胞静置30秒
9.用1ml移液管小心地去除上清液，并添加至3ml冰上的纯FBS中，所述FBS中含有
浓度100μg/mL的Primocin
10.再添加1ml消化混合物并重复2次，总共3次
11.(您可以从1ml移液管尖端上切下顶部，并在消化步骤之间使用其
进行机械解离)
12.最后一次消化后，细胞悬浮液应通过1ml微量移液管尖端
13.通过100微米细胞过滤器将FBS中收集的细胞过滤到新的50ml管中
14.旋转，300xg，4℃，10分钟
15.去除上清液并将细胞重悬于1ml纯FBS(含有100μg/mL的Primocin)中
16.计数并将细胞用FBS(含有100μg/mL的Primocin)调节至6x106个细胞/ml
a.由于碎片的原因，用Countess II或血细胞计数器的细胞计数可能不准确i.推荐用1:1000Draq5(5mM储备液浓度)对有核细胞进行染色，并
在APC通道中的流式细胞仪上计数
ii.以1:1000添加DAPI允许有核群体的活细胞门控
(需要紫激光)
1.通过添加1μl Draq5(5mM储备液)和1μl
DAPI至1ml PBS中来制备染色溶液
2.向圆底96孔中添加40μl染色溶液3.添加10μl细胞悬浮液并充分混合
4.在室温下在黑暗中孵育5分钟
5.通过流式分析样品
a.首先对Draq5(APC通道)阳性细胞进行门控
b.确定Draq5阳性群体内的DAPI(BV421通道)
阴性细胞
6.如果流式细胞仪可测量事件/μl，则您可以直接计算
细胞数(Cytflex可做到这一点)
7.如果流式细胞仪不能测量事件/μl(像大多数BD仪器一样)，则您需要添加计数珠以获得细胞计数
b.活力应高于75％
17.用FBS(含有100μg/mL的Primocin)将细胞以4x106个细胞/ml重悬
18.添加等量的含有20％DMSO和100μg/mL Primocin的FBS
19.通过上下吸移充分混合
20.将1ml(2x106个细胞)细胞悬浮液等分到冷冻管中，并在-80℃下在Mr Frosty中冷冻
a.预期细胞数为约10x10^6个细胞/肿瘤
21.第二天转移至长期液态N2储存
a.取1个样品小瓶并根据“离体细胞解冻”方案进行解冻b.控制细胞计数
D.使用离体EMT6细胞进行接合测定
离体细胞解冻
1.将小瓶在37℃水浴中解冻
2.将小瓶中的内容物转移到50ml锥形管中
3.将19mL RPMI+2％FBS逐滴添加到细胞中，同时旋转悬浮液
4.旋转，300xg，4℃，5分钟
5.重悬于1mL PBS+2％FBS+2mM EDTA中
6.旋转，300xg，4℃，5分钟
7.重悬于2mL测定缓冲液(RPMI1640+4％低IgG血清)中
8.重悬于1ml测定缓冲液中
9.计数并将细胞在测定缓冲液中调节至0.5x106个细胞/ml
a.如部分C；16a
FcγRIIa接合测定(Promega试剂盒#G9991)中所述进行细胞计数
1.在测定缓冲液中以1.5倍过量制备抗体系列稀释液。
a.75ul总测定体积
b.10-6M起始浓度
c.6点剂量反应曲线中的对数稀释，一式三份
2.将25ul抗体稀释液添加到白色平底96孔板中。
a.仅使用内部60孔
b.将未使用的孔用75ul测定缓冲液填充
3.向含有抗体稀释液的每个孔中添加25ul离体细胞
a.轻轻敲击板，以将细胞与抗体混合
4.在37℃、5％CO2下孵育15分钟。
5.将一小瓶FcγRIIa-H效应细胞(0.62mL)(Promega试剂盒3G991)在37℃水浴中解冻
a.解冻后立即将小瓶从37℃取出
6.将小瓶的内容物转移到含有5.3mL测定缓冲液的锥形管中
7.将管倒置4-5次进行混合
8.计数并将细胞调节至0.5x106个细胞/ml
a.可使用常规细胞计数器或血细胞计数器进行细胞计数9.将25ul FcγRIIa-H效应细胞添加到经调理的靶细胞中
a.E:T比率为1:1
10.轻轻地来回摇动板以混合内容物(75ul总体积)
11.在37℃、5％CO2下孵育5小时
12. 5小时后，通过将整瓶Bio-GloTM
测定缓冲液添加到Bio-Glo荧光素酶测定底物(每个试剂盒总共10mL)中来制备Bio-Glo荧光素酶溶液。
13.从孵育箱中取出板
14.向每个反应孔中添加75ul Bio-GloTM混合物
15.在室温下在黑暗中孵育15分钟
16.在合适的酶标仪中测量发光
17.绘制曲线并计算EC50值
试剂和缓冲液
EMT6完全培养基(正常生长培养基，NGM)
Waymouth MB 752/1培养基+2mM L-谷氨酰胺+15％胎牛血清(FBS)+1％青霉素-链霉素
测定缓冲液
RPMI1640+4％低IgG胎牛血清(FBS)
胶原酶A(Sigma-Aldrich，#10103586001)
1.添加含有Ca2+Mg2+的HBSS，以创建50mg/ml的储备溶液
2.多次倒置管
3.在室温下孵育5分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖管中
5.在-20℃下储存长达一个月
6.避免重复冻/融循环
分散酶II(Sigma-Aldrich，#D4693-1G)
1.用10mM钠将1g分散酶II在10mL分子生物学级水中复原醋酸盐(pH 7.5)和5mM醋酸钙
2.多次倒置管
3.在室温下孵育60分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖管中
5.在4℃下储存长达一个月
DNA酶(Sigma-Aldrich，#4536282001)
1.添加含有Ca2+Mg2+的HBSS，以创建2mg/ml的储备溶液
2.多次倒置管
3.在室温下孵育5分钟
4.等分到1.5ml弹扣盖管中
5.在-20℃下储存长达7天
6.避免重复冻/融循环
实施例9.用于癌症疗法的抗体的评价--综述
在以下实施例中另外评价了用于治疗癌症的抗体。所述抗体在本实施例中称为ATRC-101。所述ATRC-101是完全人免疫球蛋白G，亚类1(IgG1)/λ抗体，其包含AIP-160470的VH和VL区。重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1723和1724中提供。ATRC-101是在通过Immune Repertoire
Figure GDA0003431173340001701
(IRCTM)技术从非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌患者分离的浆母细胞B细胞生成的抗体库中发现的抗体的序列变体。在收集样品时，患者正在进行治疗，所述治疗部分地包括抗程序性死亡受体1(PD-1)单克隆抗体。
ATRC-101的安全性特征是在一系列体外细胞因子释放和组织交叉反应性测定以及同基因疾病模型(接种有EMT6肿瘤细胞的雌性BALB/c小鼠)中的重复剂量安全性研究中建立的。还在食蟹猴中进行了非良好实验室实践(GLP)4周重复剂量毒性研究，以评价ATRC-101的潜在非靶标相关毒性。
ATRC-101非临床安全包装的设计反映了抗体靶标的特征和提出的作用机制。ATRC-101靶标是包含RNA结合蛋白和(聚(A)RNA)的肿瘤相关细胞外复合物。尽管聚(A)RNA和RNA结合蛋白(诸如聚腺苷酸结合蛋白家族成员)在正常人、恒河猴和小鼠组织中广泛表达，但ATRC-101优先与肿瘤细胞结合。在多种人肿瘤类型(包括NSCLC、乳腺癌、CRC、卵巢癌和黑色素瘤)中观察到ATRC-101的肿瘤选择性结合，其中肿瘤细胞呈阳性，但邻近组织不呈阳性。当这些细胞在体外培养时，与从肿瘤组织中提取的小鼠EMT6肿瘤细胞的结合随着时间的推移而丧失。另外，ATRC-101与人肿瘤组织的结合表明取决于复合物的核糖核酸酶敏感组分。ATRC-101不与肿瘤邻近的正常细胞、正常食蟹猴组织和大多数正常小鼠组织结合。总之，这些数据表明ATRC-101靶标为肿瘤相关的，并且细胞表面定位取决于体内肿瘤生长的背景。肿瘤相关性可基于错误折叠、错误定位、翻译后修饰和/或尚未明确的因素。因此，由于正常动物组织中没有或非常低的ATRC-101靶标表达，小鼠和食蟹猴不是毒理学测试的适当物种。
临床前模型的药理学评价表明，一旦ATRC-101与肿瘤细胞上表达的靶标结合，Fc依赖性与先天免疫细胞的相互作用就会将存在于肿瘤微环境中的淋巴和骨髓细胞群的构成从主要与促肿瘤和免疫抑制活性相关联的表型转变为与抗肿瘤发生和更多促炎活性相关联的表型。ATRC-101在体外似乎不介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。所有可用数据表明，ATRC-101与其靶标的结合不触发或消除任何信号转导途径。
ATRC-101不与正常人外周血单核细胞(PBMC)结合。此外，在基于PBMC或全血的测定中，ATRC-101不在体外诱导细胞因子释放。因此，ATRC-101被认为具有较低的触发人细胞因子释放的风险。
为了支持小鼠的临床前功效和安全性研究以及食蟹猴的药代动力学/毒代动力学研究，开发了灵敏和特异性液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，分别用于检测小鼠和猴血清中的ATRC-101。
ATRC-101的药代动力学特征在食蟹猴的单剂量研究和重复剂量研究中进行表征。以1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量水平单次静脉(IV)推注施用于食蟹猴后，通常在给药后0.083小时与1小时之间观察到最大血清浓度的时间(Tmax)。半衰期(T1/2)在177小时至225小时的范围内。表观清除率(CL)和表观分布容积(Vd)分别在0.15mL/小时/kg与0.436mL/小时/kg以及51.4mL/kg与117mL/kg之间的范围内。ATRC-101的全身暴露在测试范围内随剂量增加而增加，并且所述增加大致与剂量成比例。在食蟹猴的4周重复剂量IV毒性和毒代动力学研究中，其中动物在第1天、第8天、第15天和第22天通过IV施用接受4次周剂量的ATRC-101，通常在输注开始(SOI)后0.75小时观察到Tmax。由于在Tmax后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
在EMT6-BALB/c同基因乳腺癌模型中评价ATRC-101和MFC-042嵌合体(携带ATRC-101的相同人Fv区，但表达小鼠IgG2aFc区；也称为AIP-160470-mIgG2a)的安全性。本研究评价了以下安全性参数：死亡率/濒死率、临床体征、体重、临床病理学(血液学和临床化学)、血清细胞因子评价、血清测试制品浓度、大体尸检结果、器官重量和组织病理学检查(9个器官加上荷瘤动物的肿瘤组织)。向天然和EMT6同基因乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠重复剂量腹膜内(IP)施用0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的MFC-042或0mg/kg、1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的ATRC-101耐受良好，并且在所检查的参数中的任一项中均未注意到毒理学上显著的效应。基于这些安全性评估结果，MFC-042和ATRC-101在天然和EMT6同基因乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠中的无不良反应水平(NOAEL)被认为是30mg/kg。
在食蟹猴中进行非GLP 4周毒性研究，以评价ATRC-101的潜在非靶标相关毒性。在本研究中，本研究评价了以下参数：死亡率/濒死率、临床体征、定性食物消耗、体重、临床病理学(血液学、临床化学和尿液分析)、细胞因子、TK参数、器官重量、肉眼和显微镜检查(20个器官/组织，包括脑、心脏、肺、肝、肾和胰腺)。通过每周一次静脉内(IV)输注施用ATRC-101，持续4周，在食蟹猴中在施用的所有剂量水平下：10mg/kg/周、30mg/kg/周和100mg/kg/周，耐受良好。NOAEL被认为是100mg/kg/周，其中相关的最大观察浓度(Cmax)值对于雄性为2410μg/mL且对于雌性为2690μg/mL，并且在第22天(528天)从零时间到最后一次测量时间的浓度时间曲线下面积(AUC0-t)值对于雄性为185000μg·小时/mL且对于雌性为186000μg·小时/mL。
ATRC-101和嵌合ATRC-101变体在若干种同基因小鼠肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性。ATRC-101的抗肿瘤活性在与PD-1抑制剂组合时增强。
在食蟹猴中以高达100mg/kg的剂量(浓度：20mg/mL)重复给药(每周一次，共4次剂量)后，ATRC-101注射部位没有刺激或局部耐受问题的临床证据。
在正常人组织中的GLP组织交叉反应性研究中，在一些人组织中观察到使用ATRC-101的染色。然而，几乎所有染色本质上都是细胞质的，因此不被认为是毒理学问题，因为ATRC-101不太可能穿过细胞膜或直接与细胞质组分相互作用。
基于研究目标和可用的动物模型/测定，使用临床候选物ATRC-101以及表达人或小鼠Fc区的ATRC-101的序列变体进行对ATRC-101的药理学评价。ATRC-101与序列变体之间关系的概述在图51中示出。
以下实施例提供了以上总结的研究的进一步细节
实施例10.肿瘤组织和细胞系中的ATRC-101靶标表达
显色IHC、免疫荧光显微镜和流式细胞术用于评价(i)多种人肿瘤组织、(ii)小鼠肿瘤组织和(iii)人和小鼠肿瘤细胞系中的ATRC-101靶标表达(在本文中通过对结合抗体的反应性定义)。
在对多种人肿瘤的分析中，AIP-160470-mIgG2a以高度选择性的方式与CRC、TNBC和黑色素瘤肿瘤组织结合，但不与邻近组织结合，图52。
在一组人肿瘤核心中评估了靶标结合的普遍性。如果染色为阴性或微弱，则将样品评分为无反应性，并且如果染色为中等、阳性或强烈，则将样品评分为反应性。AIP-160470-mIgG2a靶标结合存在于大于50％的测试肿瘤核心中，对于NSCLC(65％)、乳腺癌(65％)、CRC(57％)和卵巢癌(58％)。黑色素瘤表现出43％的反应性。肝癌表现出19％的反应性。观察到于反应性核心成比例的癌症亚型特异性差异。
这些研究表明，ATRC-101的靶标在多种人肿瘤(包括NSCLC、CRC、TNBC、黑色素瘤和卵巢癌)组织中高度表达。研究数据表明ATRC-101靶标为肿瘤相关的，并且细胞表面定位取决于肿瘤生长的背景。
免疫荧光用于评估核酸酶消化RNA是否影响与人雌激素受体阳性(ER+)乳腺癌结合的嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a。用RNA酶A和RNA酶H预处理新鲜冷冻的组织切片以浓度依赖性方式消除了嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与人ER+乳腺癌的结合，图53。相比之下，脱氧核糖核酸酶(DNA酶)I预处理并没有消除结合。此数据表明，通过免疫荧光评估的ATRC-101靶标表达取决于靶标的RNA酶敏感性组分。
在同基因BALB/c小鼠中生长的小鼠EMT6肿瘤细胞上评价ATRC-101靶标表达。嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与EMT6-BALB/c同基因肿瘤核心结合，但不与邻近组织结合。
ATRC-101靶标的表面表达也通过流式细胞术在小鼠和人源肿瘤细胞系上进行评估。嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与小鼠离体EMT6-BALB/c同基因肿瘤细胞结合，解离，并立即染色。当小鼠离体EMT6细胞随后在染色前体外培养两天或更多天时，未检测到结合。当小鼠EMT6细胞系在染色前仅在体外生长，而不在BALB/c小鼠中作为皮下移植物生长时，未观察到结合。还观察到在染色前在小鼠中作为皮下移植物生长的离体Renca、CT26和LLC1肿瘤细胞的表面结合。体外生长的21种人肿瘤细胞系未观察到表面结合。
总之，IHC、免疫荧光和流式细胞术的观察结果表明，ATRC-101靶标是含有RNA的肿瘤相关复合物，并且此复合物的表达及其表面定位取决于肿瘤细胞如何生长。
实施例11.正常人、食蟹猴和小鼠组织以及正常人血细胞中的ATRC-101靶标表达
显色IHC和免疫荧光用于评价(i)正常人组织、(ii)正常食蟹猴组织和(iii)正常小鼠组织中的ATRC-101靶标表达(在本文中通过对结合抗体的反应性定义)。
在代表30种正常人组织类型的两个福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织微阵列(FDA808J-1和FDA808J-2)中，通过免疫荧光评价AIP-160470-mIgG2a的特异性结合。嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a用于最小化非特异性相互作用。在人腺癌中观察到肿瘤选择性结合，将其包括作为阳性对照(图54A)。
在90个核心的正常组织上观察到AIP-160470-mIgG2a免疫反应性。在同种型对照中，只有胃和小脑表现出弥散性非确定性信号，每个都在三个核心之一中具有自溶迹象。在舌(头颈部唾液腺)的浆液性腺泡腺上皮细胞中检测到微弱的异质信号，所述上皮细胞本质上是分泌性的，从而增加了非特异性结合的可能性。与AIP-160470-mIgG2a相反，针对PABPC-1产生的商业多克隆抗体表现出对肿瘤组织和正常组织两者的免疫反应性(图54A和54B)。在单独的分析中，通过对结直肠癌和正常人肝、肾、胃、心脏、胰腺和肺组织的IHC评估，也观察到肿瘤选择性结合。
在非GLP研究中，在正常食蟹猴和小鼠组织中评估了ATRC-101的潜在物种交叉反应性。用于此评估的ATRC-101抗体浓度表现出优先且可区分地标记阳性对照小鼠EMT6肿瘤内的活的恶性细胞，而不标记邻近皮肤或基质。在代表15种器官类型的新鲜冷冻正常食蟹猴组织中，在这些条件下未检测到同种型对照的明确染色。在代表30种不同器官类型的新鲜冷冻正常小鼠组织中，大多数没有表现出明确反应性。在小鼠口腔、胃、小肠和脾脏中观察到微弱至轻微的染色。
在观察到与离体EMT6-BALB/c同基因肿瘤细胞结合的浓度下，通过流式细胞术未观察到嵌合亲本抗体AIP-192482-mIgG2a和嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a与正常人PBMC配制品的结合。
实施例12.ATRC-101和ATRC-101变体结合亲和力和体外活性
如上所解释，ATRC-101的体外活性在靶标和效应子双重接合测定中进行评估。此测定使用携带荧光素酶报告基因的经工程化的Jurkat细胞和离体EMT6肿瘤细胞(来自冷冻储备液)来检测双重Fv和Fc接合。FcγRIIa-H报告基因在EMT6离体细胞和ATRC-101蛋白存在的情况下被激活，并导致荧光素酶的表达。报告基因的活性由Bio-GloTM荧光素酶测定系统确定。
在此测定中，ATRC-101以67.8±37nM的半数最大有效浓度(EC50)诱导荧光素酶表达。当使用培养的不表达可检测水平的ATRC-101靶标的EMT6细胞进行测定时，未检测到荧光素酶信号。类似地，ATRC-101的糖基化Fc变体(其携带N297A突变，并因此缺乏Fc效应功能)在此测定中不诱导荧光素酶信号。这些数据表明，靶标与Fv区的结合和Fc区与FcγR2a的接合都是靶标和效应子双重接合测定中ATRC-101的活性所必需的。
在靶标和效应子双重接合测定中，ATRC-101(AIP-160470-hIgG1)的体外效力最大，其次是序列优化变体AIP-133645-hIgG1，然后是亲本抗体AIP-192482-hIgG1。类似地，在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中，ATRC-101嵌合变体(AIP-160470-mIgG2a)的体内效力最大，其次是嵌合变体AIP-133645-mIgG2a，其中亲本抗体的嵌合变体AIP-192482-mIgG2a表现出最低的抗肿瘤效应。
进行体外ADCC和CDC测定，以评估ADCC或CDC是否有助于ATRC-101的作用机制。ADCC测定使用CD16转染的NK92细胞系作为效应细胞，并使用肿瘤衍生的离体EMT6细胞(表达靶标)或培养的EMT6细胞(不表达靶标)作为靶细胞。在此测定中，嵌合抗体AIP-160470-mIgG2a没有表现出对小鼠离体EMT6、离体Renca或离体LLC1细胞的细胞杀伤活性，而阳性对照抗体AIP-171125-mIgG2a表现出对各种靶细胞的杀伤作用。
类似地，AIP-192482-mIgG2a在使用兔血清作为补体来源并使用肿瘤来源的离体EMT6细胞作为靶细胞的CDC测定中未表现出CDC活性。这些数据表明，ATRC-101似乎不通过ADCC或CDC机制起作用。
ATRC-101在人外周血单核细胞和全血体外测定中诱导的细胞因子释放的评估
单克隆抗体对免疫细胞的全身激活可导致细胞因子释放综合征。已经表明，使用固定化抗体和人PBMC的体外细胞因子释放测定(CRA)可预测患者的细胞因子释放综合征。使用Charles River实验室(Portishead，UK)的CRA的人PBMC和全血版本评估ATRC-101在体外诱导细胞因子释放的能力。
在CRA的PBMC版本中，在从多个健康人供体获得的PBMC上评估ATRC-101诱导细胞因子释放的能力。此测定形式使用以1μg/孔固定的测试和对照制品，并且被认为能够预测与治疗性单克隆抗体TGN1412的I期临床试验期间观察到的细胞因子风暴反应类似的细胞因子风暴反应。抗CD28克隆28.1(Ancell Corp.，Bayport，MN，USA)和muromonab抗CD3(Orthoclone OKT3)用作PBMC CRA中的阳性对照。包括人IgG1(hIgG1)同种型抗体(靶向β-半乳糖苷酶)、制剂缓冲液和达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)作为阴性对照。
在CRA的全血版本中，在来自多个健康人供体的全血上评估ATRC-101导致细胞因子释放的能力。此测定形式使用浓度为1.1nM的溶液中的测试制品。抗CD28和阿仑单抗(抗CD52)用作阳性对照，并且包括hIgG1同种型抗体、制剂缓冲液和DPBS作为此测定形式中的阴性对照。
在CRA的PBMC和全血版本中，使用ATRC-101观察到的细胞因子释放与使用hIgG1同种型对照观察到的细胞因子释放相当。与ATRC-101相关的细胞因子释放通常显著低于对相关阳性对照抗体的刺激作出反应所观察到的细胞因子释放。基于这些数据，ATRC-101具有较低的触发人细胞因子释放的风险。
实施例13.体内药理学
ATRC-101表明与含有体外转录RNA和(i)重组人/非人灵长类动物PABPC-1或(ii)具有相当亲和力的重组小鼠PABPC-1的体外重构的复合物结合，并与人和小鼠两者的肿瘤核心结合。因此，使用临床候选物ATRC-101以及表达人或小鼠Fc区的ATRC-101的序列变体，在同基因小鼠模型中进行ATRC-101的体内药理学评价。由于hIgG1对小鼠Fcγ受体的亲和力降低，因此在同基因小鼠模型中，小鼠嵌合体变体预期具有比hIgG1更高的抗肿瘤功效。
MFC-042和ATRC-101在同基因EMT6乳腺癌模型中的临床前功效和安全性评估(研究ATRC-101.PD.18.01和ATRC-101.PD.18.02)
本研究的目的是评价施用于天然和EMT6同基因乳腺癌癌荷瘤雌性BALB/c小鼠的MFC-042(携带ATRC-101的相同人Fv区，但表达小鼠IgG2a Fc区；也称为AIP-160470-mIgG2a)和ATRC-101的临床前功效和安全性终点。本研究由同时进行的两部分组成：MFC-042评估(部分A；ATRC-101.PD.18.01)和ATRC-101评估(部分B；ATRC-101.PD.18.02)。
在研究的部分A中，在第1天、第4天、第8天、第11天和第15天，通过腹膜内(IP)注射向具有已建立的皮下EMT6肿瘤(组平均肿瘤体积(MTV)＝112至113mm3)的七组雌性BALB/c小鼠(15只动物/组)给药0(媒介物)、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg MFC-042。以相同剂量方案用媒介物或30mg/kg MFC-042治疗两组非荷瘤(天然)小鼠(15只动物/组)。在第16天对动物实施安乐死以进行尸检。
在研究的部分B中，在第1天、第4天、第8天、第11天和第15天，通过IP注射向具有已建立的皮下EMT6肿瘤(组MTV＝108mm3)的四组雌性BALB/c小鼠(15只动物/组)给药0mg/kg(媒介物)、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg ATRC-101。以相同剂量方案用媒介物或30mg/kgATRC-101治疗两组天然小鼠(15只动物/组)。在第16天对动物实施安乐死以进行尸检。
本研究评价了以下参数和终点：死亡率/濒死率、临床体征、体重、总体功效评估、临床病理学参数(血液学和临床化学)、血清细胞因子评估、血清测试制品浓度、大体尸检结果、器官重量和显微镜检查(9个器官加上荷瘤动物的肿瘤组织)。基于肿瘤生长抑制(TGI)确定总体功效，所述肿瘤生长抑制定义为治疗组和对照组的MTV之间的差异百分比，并在第15天(部分A)或第14天(部分B)进行评估。
在高达30mg/kg的剂量水平下，向天然和EMT6乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠重复剂量IP施用MFC-042和ATRC-101，耐受良好。
在部分A(图55A)中，第15天组1(媒介物对照)的MTV已达到787mm3，其中个体肿瘤体积在288至1352mm3的范围内。相比之下，较低剂量的MFC-042治疗组(组2至组4)与媒介物对照组或彼此之间没有统计学差异(使用Mann-Whitney U检验，p>0.05)，其中MTV为719、847和726mm3，分别相当于接受0.1mg/kg、0.3mg/kg和1mg/kg MFC-042的治疗组的9％、-8％和8％TGI。更高剂量的MFC-042(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)将MTV分别降低至221(72％TGI)、92(88％TGI)和196mm3(75％TGI)，并且与组1显著不同(对于3mg/kg，p<0.01，并且对于10mg/kg和30mg/kg，p<0.001)。值得注意的是，所有三种高剂量均达到远高于合同研究组织认为表明潜在的治疗活性的60％阈值的TGI。在3mg/kg时观察到最小的抗肿瘤活性，其中血清浓度在16.6μg/mL至20.3μg/mL的范围内。在第1天给药后6小时，在10mg/kg时注意到最大抗肿瘤活性，其中测得的血清浓度在21.9μg/mL至87.5μg/mL的范围内。通过显微镜，用≥3mg/kg MFC-042治疗的小鼠肿瘤的坏死区域较小，偶尔缺乏中心坏死区域，并且常常伴有混合细胞炎症(≥10mg/kg)。在以≥10mg/kg施用MFC-042的小鼠的肺中未观察到肿瘤栓塞。
在部分B(图55B)中，第14天组1(媒介物对照)的MTV已达到486mm3，其中个体肿瘤体积在221至936mm3的范围内。相比之下，用1mg/kg ATRC-101治疗(组2)与用媒介物对照治疗没有统计学差异(p>0.05)，其中MTV为550mm3，相当于-13％TGI。相比之下，更高剂量的ATRC-101(10mg/kg和30mg/kg)将MTV分别降低至256mm3(47％TGI)和75mm3(85％TGI)，并且与组1显著不同(对于10mg/kg，p<0.01，并且对于30mg/kg，p<0.001)。值得注意的是，30mg/kg ATRC-101(其中测得的最高血清浓度为295μg/mL)超过表明潜在的治疗活性的60％TGI阈值。鉴于ATRC-101是对小鼠Fcγ受体的亲和力降低的全人抗体，预期与MFC-042相比，ATRC-101的效力更低。通过显微镜，用30mg/kg ATRC-101治疗的小鼠肿瘤的坏死区域较小，偶尔缺乏中心坏死区域，并且有丝分裂率较低。另外，在用ATRC-101治疗的小鼠的肺中未观察到肿瘤栓塞。
总之，施用MFC-042(3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)或ATRC-101(10mg/kg和30mg/kg)显著抑制雌性BALB/c小鼠中同基因EMT6乳腺癌肿瘤的生长。所有治疗均耐受良好。
ATRC-101变体在同基因小鼠肿瘤模型中的功效
在EMT6、CT26和E0711同基因肿瘤模型中评估嵌合ATRC-101变体的抗肿瘤功效，所述模型是基于它们对检查点抑制剂疗法表现出的反应性而选择的。使用携带表达小鼠Fc区的人Fv区的小鼠嵌合变体进行这些研究，以在体内实现与小鼠Fcγ受体的最佳相互作用。
ATRC-101变体单独或与PD-1阻断剂组合在EMT6同基因小鼠肿瘤模型中的功效
进行了四项研究，以评估ATRC-101的mIgG2a嵌合变体在EMT6同基因小鼠乳腺癌模型中的抗肿瘤功效。在所有三项研究中，BALB/c小鼠在第0天皮下接种1×106个EMT6小鼠乳腺癌细胞，并在肿瘤建立时开始施用测试制品。通过Atreca,Inc开发的NAAC和归一化生长率度量(NGRM)参数的Wilcoxon秩和检验，进行不同治疗组的肿瘤体积之间的统计比较。
在一项研究(研究EFF-010)中，EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型用于评价在AIP-192482同种型变体施用后，Fc效应功能对抗肿瘤功效的影响。亲本抗体AIP-192482被表达为Fc效应感受态mIgG2a(AIP-192482-mIgG2a)、Fc效应突变非N-糖基化mIgG2a(AIP-192482-mIgG2a-N297A)或小鼠免疫球蛋白G，亚类1(mIgG1；AIP-192482-mIgG1)或小鼠免疫球蛋白G，亚类3(mIgG3；AIP-192482-mIgG3)，其中与mIgG2a相比，Fc效应功能较弱。
在本研究中，与媒介物对照相比，施用10mg/kg AIP-192482-mIgG2a导致显著的抗肿瘤功效(基于NAAC或NGRM的单侧Wilcoxon秩和检验，p<0.0001)，其中在20只小鼠中的15只中观察到完全肿瘤消退(CR)(图56)。施用AIP-192482-mIgG2a-N297A变体后未观察到显著的抗肿瘤功效，而AIP-192482-mIgG1和AIP-192482-mIgG3表现出一定程度的抗肿瘤活性(基于NAAC的Wilcoxon秩和检验，分别为p<0.001和p＝0.01)。这些结果表明，在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中，Fc效应功能与嵌合亲本AIP-192482的抗肿瘤活性相关，并且是所述抗肿瘤活性所必需的。
在另一项研究(研究EFF-016)中，在研究第6天，将具有已建立的皮下EMT6肿瘤的七组小鼠(组平均肿瘤体积为156mm3)随机分到每组20只小鼠的治疗组。在第7、10、14、17、21、24和27天，向小鼠IP给药(i)10mg/kg AIP-192482-mIgG2a；(ii)5mg/kg AIP-192482-mIgG2a；(iii)5mg/kg AIP-133645-mIgG2a；(iv)2.5mg/kg AIP-133645-mIgG2a；(v)5mg/kgAIP-160470mIgG2a；或(vi)2.5mg/kg AIP-160470-mIgG2a。向媒介物对照动物给药达尔伯克氏PBS(DPBS)。
通过度量NAAC和NGRM分析，与媒介物对照组相比，施用AIP-192482-mIgG2a、AIP-133645-mIgG2a或AIP-160470-mIgG2a在每个测试剂量水平下导致肿瘤体积显著减小(图57)。在剂量为5mg/kg时，AIP-133645-mIgG2a和AIP-160470-mIgG2a的抗肿瘤功效均显著高于AIP-192482-mIgG2a(通过两种比较的NAAC和NGRM分析，p<0.05)。在5mg/kg时，对于AIP-160470-mIgG2a，观察到与媒介物对照施用相比的最大效应大小(指示抗肿瘤作用)。[
与媒介物施用相比，施用AIP-192482-mIgG2a、AIP-133645-mIgG2a或AIP-160470-mIgG2a在每个剂量水平下导致显著的存活益处(对于所有测试制品和剂量水平，p<0.001)，其中中值存活相对于媒介物对照组延迟。
在本研究中，所有mIgG2a嵌合ATRC-101变体均表现出抗肿瘤功效，其中观察到AIP-160470-mIgG2a(ATRC-101的嵌合形式)的效应大小最大。
在研究EFF-004中，EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型用于评价单独施用或与10mg/kg抗小鼠PD-1单克隆抗体(克隆RMP1-14，BioXCell)组合施用时，20mg/kg AIP-192482-mIgG2a对肿瘤体积和存活的影响。在本研究中，单独施用或与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用时，20mg/kg AIP-192482-mIgG2a表现出显著的抗肿瘤活性，而抗小鼠PD-1单克隆抗体作为单一疗法施用时未表现出抗肿瘤功效。
在本研究中，单独施用AIP-192482-mIgG2a和AIP-192482-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用分别导致16只小鼠中的11只和15只小鼠中的13只出现CR。在第51天(最后一次治疗后24天)，再激发具有CR的动物。在单独或与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用AIP-192482-mIgG2a后具有CR的24只小鼠中，20只在再激发后保持无肿瘤，这表明AIP-192482-mIgG2a可诱导免疫记忆。
研究EFF-020进一步探讨了与抗小鼠PD-1单克隆抗体共同施用的影响。在研究第7天，将具有已建立的皮下EMT6肿瘤的雌性BALB/c小鼠随机分到每组20只小鼠的治疗组，其中组平均肿瘤体积为大约104mm3。在第7、11、14、18、21、25、28天，向小鼠IP给药媒介物(DPBS)或者各2个剂量水平的AIP-192482-mIgG2a或AIP-160470-mIgG2a。在第7、11、14、18天，还向小鼠IP给药10mg/kg抗小鼠PD-1单克隆抗体(克隆RMP1-14，BioXCell)或媒介物(DPBS)。
在本研究中，与媒介物对照组相比，单一疗法治疗组表现出肿瘤生长的显著减少(对于每次比较的NAAC和NGRM度量分析，p<0.01)。与媒介物对照组、抗小鼠PD-1单一疗法组和相应的AIP-192482-mIgG2a单一疗法组相比，施用5mg/kg或10mg/kg AIP-192482-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合导致肿瘤体积的显著减小(通过对每次比较的NAAC和NGRM度量分析，p<0.05；(图58A)。在5mg/kg或10mg/kg AIP-192482-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合时，CR的数量分别从AIP-192482-mIgG2a单一疗法组的0增加到6个CR和4个CR。
在本研究中，与媒介物对照组和抗小鼠PD-1单一疗法组相比，施用2.5mg/kg或5mg/kg AIP-160470-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合导致肿瘤体积的显著减小(通过对每次比较的NAAC和NGRM度量分析，p<0.001；图58B)。AIP-160470-mIgG2a和抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用与AIP-160470-mIgG2a作为单一疗法的施用之间的肿瘤体积在任一剂量水平下都没有显著差异。然而，CR的效应大小和数量增加
ATRC-101变体在CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中的功效
进行了两项研究(EFF-031和EFF-039)，以评估ATRC-101的mIgG2a嵌合变体在CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效。在两项研究中，向BALB/c小鼠皮下接种1×106个CT26小鼠结肠癌细胞系，并在肿瘤建立时开始施用测试制品。通过Atreca,Inc开发的NAAC和NGRM参数的Wilcoxon秩和检验，进行不同治疗组的肿瘤体积之间的统计比较。
在研究EFF-031中，CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型用于评价以20mg/kg每周三次IP给药，持续3周的(i)AIP-192482-mIgG2a、(ii)AIP-133645-mIg2a或(iii)AIP-160470-mIgG2a对肿瘤体积和存活的影响。在本研究中，与给药DPBS的媒介物对照组相比，所有三种测试制品均表现出显著的抗肿瘤功效和存活益处。
在研究EFF-039中，在研究第9天，将具有已建立的皮下CT26肿瘤(组平均肿瘤体积为大约145mm3)的小鼠随机分到治疗组。在第9、11、13、15、18、20、22、25、27和29天，向小鼠IP给药20mg/kg AIP-192482-mIgG2a(40只小鼠)或媒介物(DPBS；20只小鼠)。媒介物对照组中的肿瘤表现出肿瘤体积的快速增长图59A)。AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤活性显著高于媒介物对照组(对于NAAC，p＝1.21×10-10，并且对于NGRM，p＝1.63×10-11)。与媒介物对照相比，在AIP-192482-mIgG2a治疗组中观察到显著的存活益处。
直至第97天观察给药AIP-192482-mIgG2a的动物，以评估反应的持久性。到第97天，已施用AIP-192482-mIgG2a的组在40只小鼠中的21只中表现出CR(图59B)。
在研究第99天(施用最后一次AIP-192482-mIgG2a剂量后70天)，向具有CR的动物对侧侧腹接种1×106个CT26细胞。同时，在研究第99天，向20只抗体天然、年龄匹配的BALB/c小鼠接种1×106个CT26细胞作为对照。在再激发中未施用测试制品剂量。接种CT26细胞的天然BALB/c对照小鼠表现出肿瘤快速生长。相比之下，对先前施用AIP-192482-mIgG2a作出CR反应的所有21只小鼠在再激发后仍然没有肿瘤，这表明与相应的AIP-160470-mIgG2a单一疗法相比，AIP-160470-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合在任一剂量水平下施用后，AIP-192482-mIgG2a施用可在CT26同基因小鼠肿瘤模型中产生持久的抗肿瘤反应和免疫记忆，在2.5mg/kg时从4个CR到10个CR，并且在5mg/kg AIP-160470-mIgG2a时从4个CR到8个CR。
总之，来自这些的数据表明，在CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中，ATRC-101变体的施用具有抗肿瘤活性，并且与PD-1阻断剂组合时，所述活性增强。
ATRC-101变体在CT26-BALBc同基因小鼠肿瘤模型中的功效
进行了两项研究(EFF-031和EFF-039)，以评估ATRC-101的mIgG2a嵌合变体在CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效。在两项研究中，向BALB/c小鼠皮下接种1×106个CT26小鼠结肠癌细胞系，并在肿瘤建立时开始施用测试制品。通过Atreca,Inc开发的NAAC和NGRM参数的Wilcoxon秩和检验，进行不同治疗组的肿瘤体积之间的统计比较。
在研究EFF-031中，CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型用于评价以20mg/kg每周三次IP给药，持续3周的(i)AIP-192482-mIgG2a、(ii)AIP-133645-mIg2a或(iii)AIP-160470-mIgG2a对肿瘤体积和存活的影响。在本研究中，与给药DPBS的媒介物对照组相比，所有三种测试制品均表现出显著的抗肿瘤功效和存活益处。
在研究EFF-039中，在研究第9天，将具有已建立的皮下CT26肿瘤(组平均肿瘤体积为大约145mm3)的BALB/c小鼠随机分到治疗组。在第9、11、13、15、18、20、22、25、27和29天，向小鼠IP给药20mg/kg AIP-192482-mIgG2a(40只小鼠)或媒介物(DPBS；20只小鼠)。媒介物对照组中的肿瘤表现出肿瘤体积的快速增长(图59A)。AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤活性显著高于媒介物对照组(对于NAAC，p＝1.21×10-10，并且对于NGRM，p＝1.63×10-11)。与媒介物对照相比，在AIP-192482-mIgG2a治疗组中观察到显著的存活益处。
直至第97天观察给药AIP-192482-mIgG2a的动物，以评估反应的持久性。到第97天，已施用AIP-192482-mIgG2a的组在40只小鼠中的21只中表现出CR(图59B)。
在研究第99天(施用最后一次AIP-192482-mIgG2a剂量后70天)，向具有CR的动物对侧侧腹接种1×106个CT26细胞。同时，在研究第99天，向20只抗体天然、年龄匹配的BALB/c小鼠接种1×106个CT26细胞作为对照。在再激发中未施用测试制品剂量。接种CT26细胞的天然BALB/c对照小鼠表现出肿瘤快速生长。相比之下，所有21只对先前施用AIP-192482-mIgG2a作出CR反应的小鼠在再激发后仍然没有肿瘤，这表明AIP-192482-mIgG2a施用可在CT26-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中产生持久的抗肿瘤反应和免疫记忆。
ATRC-101变体AIP-192482-mIgG2a单独和与PD-1阻断剂组合在E0771同基因小鼠肿瘤模型中的功效
在研究EFF-006中，E0771-C57BL/6同基因小鼠肿瘤模型用于评价单独施用或与抗小鼠PD-1单克隆抗体(克隆RMP1-14，BioXCell)组合施用时，施用AIP-192482-mIgG2a对肿瘤体积的影响。向C57BL/6小鼠皮下接种1×106个E0771小鼠髓质乳腺腺癌细胞系的细胞。在研究第8天，将具有已建立的皮下E0771肿瘤的四组雌性小鼠随机分到每组20只小鼠的治疗组，其中每组的平均肿瘤体积为大约104mm3。在第9、13、16、20、23、27和30天，向小鼠IP给药20mg/kg AIP-192482-mIgG2a或媒介物(DPBS)。在第9、13、16和20天，还向小鼠IP给药2.5mg/kg抗小鼠PD-1单克隆抗体或媒介物(DPBS)。通过Atreca,Inc开发的NAAC和NGRM参数的Wilcoxon秩和检验，进行不同治疗组的肿瘤体积之间的统计比较。
在本研究中，与媒介物对照相比，单独施用AIP-192482-mIgG2a或抗小鼠PD-1单克隆抗体导致一些动物的肿瘤体积生长延迟，但未导致肿瘤体积显著减小(图60)。与媒介物施用(对于NAAC，p＝0.0176，并且对于NGRM，p＝0.0007)、单独施用抗小鼠PD-1(对于NAAC，p＝0.0455，并且对于NGRM，p＝0.00194)和单独施用AIP-192482-mIgG2a(对于NGRM，p＝0.0262)相比，AIP-192482-mIgG2a与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用导致肿瘤体积显著减小。
这些结果表明，在E0771-C57BL/6同基因小鼠肿瘤模型中，与相应的单一疗法相比，ATRC-101变体与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合施用提高抗肿瘤功效。
宿主T细胞对AIP-192482-mIgG2a在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效的影响
EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型用于评估T细胞对亲本抗体AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤功效的潜在贡献，所述亲本抗体在EMT6-BALB/c小鼠同基因肿瘤模型中具有抗肿瘤活性。
在研究TMD04中，在存在或不存在消耗小鼠CD8+T细胞的抗小鼠CD8α抗体的情况下，评估AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤功效。为了评估抗肿瘤功效，向BALB/c小鼠皮下接种EMT6细胞。一旦肿瘤建立，向小鼠每周两次给药(i)消耗T细胞的抗小鼠CD8α抗体或媒介物(DPBS)和(ii)AIP-192482-mIgG2a或媒介物对照(DPBS)。在本研究中，在不存在抗小鼠CD8α耗竭抗体的情况下，施用AIP-192482-mIgG2a导致肿瘤生长显著减少(对于NAAC和NGRM两者的比较，p<0.0001；图61)。当施用抗小鼠CD8α抗体时，AIP-192482-mIgG2的抗肿瘤功效被消除。
在研究EMT6-ATRC-e002中，在缺乏T细胞的EMT6荷瘤BALB/c裸鼠(BALB/cnu/nu(CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl))中评估AIP-192482-mIgG2a的抗肿瘤功效。向BALB/c裸鼠皮下接种EMT6细胞。从肿瘤接种后7天开始(组平均肿瘤体积在80mm3和150mm3之间)，向小鼠每周三次给药(i)10mg/kg AIP-192482-mIgG2a；(ii)20mg/kg AIP-192482-mIgG2a；或(iii)媒介物对照(DPBS)。直至研究第25天，所有三个治疗组的动物均表现出肿瘤体积的快速进展，其中AIP-192482-mIgG2a施用对肿瘤体积无影响。
总之，来自两个实验的数据表明，AIP-192482-mIgG2a在小鼠模型中的抗肿瘤活性需要T细胞，最有可能是CD8+T细胞。
AIP-192482-mIgG2a对EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中的肿瘤微环境的影响
在EMT6-BALB/c同基因小鼠肿瘤模型中评估了施用亲本抗体AIP-192482-mIgG2a对TME的影响，其中AIP-192482-mIgG2a具有抗肿瘤活性。
作为研究EFF-004的一部分，在第7、10、14、18和21天，通过免疫荧光对从IP给药20mg/kg AIP-192482-mIgG2a或媒介物(DPBS)的小鼠中收获的肿瘤评估TME。在第15天，在施用3次剂量的AIP-192482-mIgG2a或媒介物后，给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠肿瘤中的CD8+T细胞比例显著高于给药媒介物的小鼠肿瘤中的比例(通过Fisher最小显著性差异检验，p<0.05；图62)。类似地，在第15天，给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠肿瘤中iNOS(诱导型一氧化氮合酶)阳性、促炎性M1极化巨噬细胞的比例显著高于给药媒介物的小鼠肿瘤(通过未配对的t检验，p<0.01；图62)。
在第22天，在施用5次剂量的AIP-192482-mIgG2a或媒介物后，给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠肿瘤中的CD4+FoxP3+调节性T细胞(Treg)的比例显著低于从给药媒介物的小鼠收获的肿瘤中的比例。
作为一项研究(研究TMD04)的一部分，其中向具有已建立EMT6肿瘤的BALB/c小鼠每周两次IP给药10mg/kg AIP-192482-mIgG2a或媒介物。在本研究中，在第26天研究结束时，大多数给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠被安乐死，并且大多数媒介物治疗小鼠在第25天与第27天之间达到肿瘤体积≥2000mm3时被安乐死。安乐死后收获肿瘤并解离，并且对所得细胞配制品进行染色，以通过流式细胞术评估肿瘤内淋巴和骨髓亚群的存在。
与给药媒介物的小鼠肿瘤相比，在给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠肿瘤中观察到CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、Treg和单核细胞骨髓源性抑制细胞(M-MDSC)的比例显著增加。相反，F4/80+巨噬细胞和粒细胞骨髓源性抑制细胞(G-MDSC)群体减少，每个表明与给药媒介物的小鼠肿瘤相比，给药AIP-192482-mIgG2a的小鼠肿瘤减少了10倍以上。
总之，通过组织标本上的免疫荧光和细胞悬浮液的流式细胞术鉴定的细胞类型表明，ATRC-101靶标的结合导致TME中淋巴和骨髓细胞群的比例和性质发生变化，从主要与促肿瘤和免疫抑制特性相关联的细胞群到与抗肿瘤、促炎症特性更密切相关的细胞群。
次要药效学
使用阵列细胞表达筛选系统(Retrogenix，Whaley Bridge，High Peak，UK)评估ATRC-101的特异性和选择性。阵列细胞表达筛选系统已用于特异性评估和靶标鉴定。在本研究中评价的表达为人IgG1(AIP-192482-hIgG1)的亲本抗体AIP-192482未表现出与所用HEK293细胞的背景结合。
在阵列固定的HEK293细胞上以2μg/mL的浓度筛选AIP-192482-hIgG1，每个细胞表达3559种全长人质膜蛋白中的一种。在初级筛选以及确认/特异性筛选中探测重复阵列。未观察到AIP-192482-hIgG1与表达的蛋白中的任一种的特异性结合。结果表明，ATRC-101不会与构成所测试文库的3559种人质膜蛋白中的任一种特异性或选择性地结合。
安全性药理学
ATRC-101是具有旨在治疗癌症患者的选择性机制且不属于预期导致心血管效应的药物或化学类别的单克隆抗体。如ICH指南S6(R1)、S7A和S9中详述的那样，实现特异性受体靶向的生物技术衍生产品诸如用于抗癌药物的单克隆抗体不需要进行特定的安全性药理学研究。
此外，由于正常组织中没有或非常低的ATRC-101靶标表达，小鼠和食蟹猴不是安全性药理学或毒理学研究的适当物种。然而，在食蟹猴中进行了4周的探索性静脉毒性研究，并且在ATRC-101剂量≤100mg/kg时未观察到非靶标效应(如通过常规临床观察、临床病理学、细胞因子、大体和显微镜评价所评价的)(AUC范围为185000至186000小时·μg/mL)。在ATRC-101和MFC-042≤30mg/kg的剂量水平(荷瘤小鼠的最高血清浓度分别为295μg/mL和290μg/mL)下，在EMT6-BALB/c同基因肿瘤模型中也没有观察到靶标相关的不良反应(如通过常规临床观察、临床病理学、细胞因子、大体和显微镜评价所评价的)。
基于免疫沉淀和质谱数据，ATRC-101识别含有人聚腺苷酸结合蛋白家族成员和聚(A)RNA的复合物的靶标。ATRC-101以纳摩尔亲和力与含有体外转录的聚(A)RNA和(i)重组人/非人灵长类动物PABPC-1或(ii)重组小鼠PABPC-1的体外重构复合物结合。
虽然PABPC-1和聚(A)RNA广泛存在于正常细胞中，但ATRC-101靶标似乎为肿瘤相关的。在多种人肿瘤类型(包括NSCLC、乳腺癌、CRC、卵巢癌和黑色素瘤)中观察到与ATRC-101靶标的肿瘤选择性结合，其中肿瘤核心呈阳性，但邻近组织不呈阳性。类似地，在小鼠EMT6肿瘤核心中检测到ATRC-101的靶标，但在邻近组织中未检测到。当这些细胞在体外培养时，与从肿瘤核心中提取的小鼠EMT6肿瘤细胞的结合随着时间的推移而丧失。另外，表明与人肿瘤核心中的ATRC-101靶标的结合取决于复合物的RNA酶敏感组分。
在正常人组织、正常食蟹猴组织和大多数正常小鼠组织中，药理学评估表明没有明确的ATRC-101靶标结合。在正常人组织中的GLP组织交叉反应性研究中，在一些人组织中观察到使用ATRC-101的染色。然而，几乎所有检测到的染色本质上都是细胞质的，单在人肾脏远端肾小管上皮细胞中注意到的罕见且稀疏的染色除外。所述结果被认为不是毒理学相关的。
总的来说，药理学和毒理学评估表明ATRC-101的靶标为肿瘤相关的，并且细胞表面定位取决于体内肿瘤生长的背景。ATRC-101靶标的肿瘤相关性的基础和ATRC-101的选择性仍在研究中。
ATRC-101和嵌合ATRC-101变体在EMT6、CT26和E0771同基因小鼠肿瘤模型中表现出抗肿瘤活性，其中没有毒性迹象。ATRC-101变体与PD-1阻断剂组合表现出增强的抗肿瘤活性。ATRC-101变体的抗肿瘤活性取决于Fc效应功能和宿主T细胞的存在，并且与TME中的抗肿瘤、促炎症变化相关联。ATRC-101似乎不通过ADCC或CDC机制起作用。ATRC-101在体外不与人PBMC结合，并且在体外测定中似乎不会导致PBMC和全血中的细胞因子释放。
基于这些体内和体外观察，提出临床候选物ATRC-101部分地通过以下方式来导致肿瘤生长抑制和消退：(a)改变肿瘤微环境的组成，使其更具抗肿瘤性和促炎性，以及(b)诱导招募效应CD8+T细胞来攻击肿瘤的适应性免疫反应。
基于人癌症和黑色素瘤中的肿瘤选择性结合以及小鼠模型中的抗肿瘤活性，选择ATRC-101施用于患者，以治疗晚期实体瘤。
实施例14.毒理学
ATRC-101的非临床安全性研究由以下组成：利用人细胞和组织对ATRC-101进行体外评估，以及分别在小鼠疾病模型中进行体内动物研究以评估潜在的靶标相关毒性和在食蟹猴中进行体内动物研究以解决潜在的靶标相关毒性和脱靶毒性。这种非临床安全性策略与ICH S6(R1)以及ICH S9中详述的建议一致，并且被认为适用于评价ATRC-101的安全性特征。毒理学评价的范围适合于支持其提出的用于治疗癌症的临床用途。
ATRC-101的毒理学评价范围证明了可接受的安全性特征，并且支持癌症患者的首次人体给药。提出的人体起始剂量为0.3mg/kg，这比EMT6同基因乳腺癌研究中的NOAEL(30mg/kg；人体等效剂量(HED)＝2.4mg/kg)低8倍，并且预期为起始临床剂量提供足够的安全裕度。
人组织交叉反应性研究是按照GLP法规进行的。非GLP研究是根据国际协调会议(International Conference on Harmonization，ICH)指南进行的，其使用良好的科学实践并遵循测试设施和适用场所的适用标准操作程序(SOP)。
单剂量毒性
未进行单剂量毒性研究。然而，在食蟹猴中进行了4周观察期的单剂量IV推注药代动力学(PK)和耐受性研究。在这项研究中，在食蟹猴中以高达30mg/kg的剂量水平施用ATRC-101耐受良好。
重复剂量毒性
考虑到ATRC-101靶标是与正常动物组织中无或非常低的表达相关联的肿瘤，因此在重复剂量EMT6-BALB/c同基因乳腺癌模型中评价了ATRC-101的潜在靶标相关毒性。另外，在食蟹猴中进行非GLP重复剂量毒性研究，以评价ATRC-101的潜在非靶标相关毒性。
ATRC-101和MFC-042在同基因EMT6乳腺癌模型中的临床前功效和安全性评估(研究ATRC-101.PD.18.01和ATRC-101.PD.18.02)
在小鼠EMT6-BALB/c同基因乳腺癌模型的临床前功效和安全性评估研究中纳入了安全性参数，以评价ATRC-101和MFC-042(携带ATRC-101的相同人Fv区，但表达小鼠IgG2aFc区)的潜在靶标相关毒性。本研究由同时进行的两部分组成：MFC-042评估(部分A；ATRC-101.PD.18.01)和ATRC-101评估(部分B；ATRC-101.PD.18.02)。
在研究的部分A中，在第1天、第4天、第8天、第11天和第15天，通过IP注射向具有已建立的皮下EMT6肿瘤(组平均肿瘤体积(MTV)＝112至113mm3)的七组雌性BALB/c小鼠(15只动物/组)给药0(媒介物)、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg MFC-042。以相同剂量方案用媒介物或30mg/kg MFC-042治疗两组非荷瘤(天然)小鼠(15只动物/组)。在第16天对动物实施安乐死以进行尸检。
在研究的部分B中，在第1天、第4天、第8天、第11天和第15天，通过IP注射向具有已建立的皮下EMT6肿瘤(组MTV＝108mm3)的四组雌性BALB/c小鼠(15只动物/组)给药0mg/kg(媒介物)、3mg/kg、10mg/kg或30mg/kg ATRC-101。以相同剂量方案用媒介物或30mg/kgATRC-101治疗两组天然小鼠(15只动物/组)。在第16天对动物实施安乐死以进行尸检。
本研究评价的参数包括死亡率/濒死率、临床体征、体重、总体功效评估、临床病理学(血液学和临床化学)、血清测试制品浓度、血清细胞因子评估、大体尸检结果、器官重量和显微镜检查(脑、心、肺、肝、肾、胰腺、脾、胃和淋巴结，以及荷瘤动物的肿瘤组织)。
对荷瘤小鼠的重复剂量的≥10mg/kg的ATRC-101或≥3mg/kg的MFC-042显著抑制EMT6-BALB/c同基因乳腺肿瘤的生长。在这些组中，通常具有肿瘤消退证据的肿瘤生长抑制达到或超过潜在治疗活性的阈值。
研究中没有ATRC-101或MFC-042相关的死亡率。没有ATRC-101或MFC-042相关的不良临床观察或对体重的影响。在血液学和临床化学参数中没有注意到毒理学上的显著效应。在第16天被安乐死的小鼠中，没有大体病理学观察或器官重量的显著变化。
施用ATRC-101和MFC-042后注意到的细胞因子水平和趋势在向小鼠肿瘤模型施用人蛋白质的预期生物反应范围内，且/或与测试制品的抗肿瘤活性有关，因此不被认为是不利的。
通过显微镜，尸检时收集的肿瘤块由排列成串和束的肿瘤细胞组成。总的来说，在接种EMT6肿瘤细胞的所有小鼠中均观察到肿瘤块。在终末安乐死时，没有ATRC-101或MFC-042相关的不良显微镜检查结果。
向天然和EMT6同基因乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠重复剂量IP施用0mg/kg、1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的ATRC-101或0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的MFC-042耐受良好，并且未注意到毒理学上显著的效应。基于这些安全性评估结果，ATRC-101和MFC-042在天然和EMT6同基因乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠中的NOAEL被认为是30mg/kg。在此剂量水平下，在荷瘤小鼠和天然小鼠中，ATRC-101的最高血清浓度分别为295μg/mL和281μg/mL；在荷瘤小鼠和天然小鼠中，MFC-042的最高血清浓度分别为367μg/mL和533μg/mL。
用ATRC-101在食蟹猴中进行的4周剂量范围结果毒理学研究(ATRC-101.TX.18.01)
本研究的目的是确定在向食蟹猴每周一次通过IV输注(持续30分钟)施用，持续4周(第1、8、15和22天)时，ATRC-101的潜在非靶标相关毒性和毒代动力学(TK)。在研究中，将8只天然猴子随机分配到4个组(1只动物/性别/组)。向动物每周一次通过30分钟IV输注0(媒介物)、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg ATRC-101，持续4周(4次剂量)。剂量体积为5mL/kg。
本研究评价了以下参数：死亡率/濒死率、临床体征、定性食物消耗、体重、临床病理学(血液学、临床化学和尿液分析)、细胞因子、TK参数、器官重量、肉眼和显微镜检查(20个器官/组织，包括脑、心脏、肺、肝、肾和胰腺)。
在TK评价中，通常在输注开始后0.75小时(Tmax)(输注结束后0.25小时)观察到Cmax。由于在Tmax后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加。虽然1只动物/性别/组，但是所述增加似乎大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
以0mg/kg/周、10mg/kg/周、30mg/kg/周或100mg/kg/周的剂量向食蟹猴每周一次静脉施用ATRC-101，持续4周，耐受良好。所有动物均存活到终末尸检(第29天)。在临床体征、定性食物消耗、体重、临床病理学参数或大多数细胞因子方面没有ATRC-101相关的变化。没有ATRC-101相关的大体病理学结果、明确的器官重量结果或显微镜检查结果。
通过每周一次IV输注ATRC-101，持续4周，在食蟹猴中在施用的所有剂量水平下：10mg/kg/周、30mg/kg/周和100mg/kg/周，耐受良好。NOAEL被认为是100mg/kg/周，其中在第22天，相关的Cmax值对于雄性为2410μg/mL且对于雌性为2690μg/mL，并且AUC0-t对于雄性为185000μg·小时/mL且对于雌性为186000μg·小时/mL。
局部耐受性
在食蟹猴的非GLP 4周重复剂量毒性研究中评估了ATR C-101的局部耐受性(ATRC-101.TX.18.01)。以高达100mg/kg的剂量(其中ATRC-101浓度为20mg/mL)重复给药(IV，每周一次，共4次剂量)后，ATRC-101注射部位没有刺激或局部耐受问题的临床证据。
其他毒性研究
ATRC-101在正常人组织中的组织交叉反应性研究(ATRC-101.TX.19.01)
在正常人组织中进行GLP组织交叉反应性研究，以评价ATRC-101(2μg/mL和10μg/mL)与来自34个正常人组织(每个组织3个供体)的综合小组的冷冻切片的潜在交叉反应性。
在两种浓度下，ATRC-101对人乳腺肿瘤016327T2中罕见的阳性对照赘生性细胞产生弱到强的细胞质和细胞质颗粒染色。ATRC-101在任一染色浓度下均未与人乳腺肿瘤016327T2中的阴性对照基质成纤维细胞发生特异性反应。对照制品人IgG1不与阳性或阴性对照组织成分发生特异性反应。测定对照载玻片也没有染色。ATRC-101在所有染色运行中与阳性对照材料发生特异性反应、以及缺乏与阴性对照材料的特异性反应性以及缺乏对照制品的反应性表明，所述测定是灵敏的、特异性的且可重现的。
在肾小管上皮中观察到使用ATRC-101的膜和细胞质染色(弱-强，罕见)。在以下中注意到胞质染色：输卵管(粘膜)、胰腺(导管、腺泡)、唾液腺(腺泡)、甲状腺(滤泡、滤泡旁细胞)和子宫(子宫内膜)的上皮(弱-强，频率可变)；小肠中的单核细胞(弱-中度，罕见)；乳腺中的肌上皮(弱-中度，罕见-偶尔)；胰腺中的胰岛细胞(弱-中度，非常罕见)；脑(小脑，大脑)和脊髓中的神经元(弱-强，罕见-偶尔)；眼睛外丛状层中的视网膜细胞(弱-强，偶尔)；膀胱、乳腺、眼睛、胃肠道(食道、小肠[神经节细胞])、皮肤、脊髓(脊髓神经根)、横纹(骨骼)肌中与周围神经相关联的细胞/突起(弱-强，非常罕见-偶尔)；神经垂体中的垂体细胞(弱-中度，频繁)。在光学显微镜的分辨率下，无法鉴定人脑(小脑，大脑)中神经毡染色(弱-中度，频繁)的亚细胞定位。
总之，在一些人组织中观察到使用ATRC-101的染色。然而，几乎所有使用ATRC-101的染色本质上都是细胞质的，在组织交叉反应性研究中，与细胞质位点结合的单克隆抗体通常被认为很少或没有毒理学意义，因为抗体药物在体内进入细胞质隔室的能力有限(Hall等人,2008；Leach等人,2010)。使用ATRC-101的膜染色仅限于罕见的人肾中的肾小管上皮细胞(1％-5％的细胞)。因此，预计这种染色不具有毒理学意义。在光学显微镜的分辨率下无法鉴定人脑中神经毡染色的亚细胞定位；然而，预计这种染色不具有毒理学意义，因为这种组织成分受到血脑屏障的保护。
非临床毒理学结果
ATRC-101与含有聚腺苷酸结合蛋白家族成员和聚(A)RNA的复合物的肿瘤相关型式结合。基于体外人PBMC结合和细胞因子释放研究结果，这种抗体被认为具有较低的在人体内触发细胞因子释放的风险。进行了一系列全面的非临床毒性研究，以确定ATRC-101的毒理学特征。
在同基因EMT6-BALB/c乳腺癌小鼠模型的临床前功效和安全性研究中评价了ATRC-101的潜在靶标相关毒性。在本研究中，向天然和EMT6-BALB/c同基因乳腺癌荷瘤小鼠施用0mg/kg、1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的ATRC-101或0mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg剂量水平的MFC-042(小鼠IgG2a Fc区上ATRC-101的相同人Fv区)耐受良好，并且未注意到毒理学上显著的效应。ATRC-101和MFC-042在天然和荷瘤雌性BALB/c小鼠中的NOAEL被认为是30mg/kg。在此剂量水平下，在荷瘤小鼠和天然小鼠中，ATRC-101的最高血清浓度分别为295μg/mL和281μg/mL；在荷瘤小鼠和天然小鼠中，MFC-042的最高血清浓度分别为367μg/mL和533μg/mL。
在食蟹猴的4周重复剂量毒性研究中，评价了ATRC-101的潜在非靶标相关毒性。通过每周一次IV输注ATRC-101，持续4周，在食蟹猴中在施用的所有剂量水平下：10mg/kg/周、30mg/kg/周和100mg/kg/周，耐受良好。NOAEL被认为是100mg/kg/周，其中在第22天，Cmax值对于雄性为2410μg/mL且对于雌性为2690μg/mL，并且AUC0-t对于雄性为185000μg·小时/mL/mL且对于雌性为186000μg·小时/mL。
在正常人组织中的GLP组织交叉反应性研究中，在一些人组织中观察到使用ATRC-101的染色。然而，几乎所有染色本质上都是细胞质的，并且不是毒理学问题，因为ATRC-101不太可能穿过细胞膜或直接与细胞质组分相互作用。使用ATRC-101的膜相关染色仅限于罕见的人肾中的肾小管上皮细胞(1％-5％的细胞)。鉴于染色频率的罕见性，预计这种染色不具有毒理学意义。此外，ATRC-101(i)似乎不介导ADCC或CDC，(ii)未发现ATRC-101与其靶标的结合触发或消除任何信号转导途径，(iii)并且任何潜在的肾毒性将在提出的临床试验中通过尿液分析和临床化学进行监测。综上所述，在体外组织交叉反应性研究中，罕见的肾小管上皮细胞中注意到的膜染色被认为对患者安全性的风险较低。
总的来说，非临床毒理学研究的结果证明了可接受的安全性特征，并且支持ATRC-101进入癌症患者的临床研究。
人体剂量原理
选择0.3mg/kg的人体起始剂量的科学依据是基于对所有可用ATRC-101非临床药理学、PK和毒理学数据以及可用文献的综合评价。基于ATRC-101人体剂量模拟，在0.3mg/kg的提出的人体起始剂量下，预期Cmax为大约7.81μg/mL，并且预期AUC0-672小时为约53.1天·μg/mL。
与在EMT6乳腺癌荷瘤雌性BALB/c小鼠的重复剂量临床前功效和安全性研究中确定的30mg/kg的NOAEL剂量相比，提出的0.3mg/kg起始剂量提供了相当大的安全裕度。0.3mg/kg的人体起始剂量是NOAEL(小鼠中30mg/kg＝2.44mg/kg人体等效剂量)的1/8。这提供了在0.3mg/kg的提出的起始剂量下人体预期的Cmax(7.81μg/mL)的大约47倍的安全裕度。
实施例15.药代动力学
在单剂量PK研究中，将6只天然食蟹猴(3只雄性和3只雌性)随机分配到3个剂量组，并通过静脉内(IV)推注注射以1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg施用ATRC-101。在施用ATRC-101后观察动物28天。在不同时间点收集血清样品，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行分析，以确定ATRC-101浓度。
单次IV施用后，在给药后0.083小时与1小时之间观察到最大血清浓度(Cmax)，1mg/kg下的雌性除外，其在给药后8小时观察到最大血清浓度。半衰期(T1/2)在177小时至225小时的范围内。表观清除率(CL)和表观分布容积(Vd)分别在0.159mL/小时/kg与0.436mL/小时/kg之间以及51.4mL/kg与117mL/kg之间的范围内。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加。所述增加大致与剂量成比例，1mg/kg与10mg/kg之间的雌性除外，其增加低于剂量比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异，1mg/kg下除外，其中雌性暴露比雄性高2倍。
在食蟹猴的4周重复剂量IV毒性研究中，评价了ATRC-101的毒代动力学(TK)特征。向八(8)只天然动物(4只雄性和4只雌性)以0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg每周一次IV输注(30分钟)ATRC-101，共4次剂量。在不同时间点收集血清样品，并通过ELISA方法进行分析。通常在开始输注(SOI)后0.75小时观察到最大血清浓度。由于在Cmax的时间(Tmax)后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
用于测量BALB/c小鼠血清中ATRC-101浓度的LC-MS/MS方法(ATRC-101.PD.18.02)
使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法确定BALB/c小鼠血清中ATRC-101的浓度。在所述方法中，测量从ATRC-101中消化的特征肽PEP-1，以确定ATRC-101的浓度(PEP-1的浓度与ATRC-101的浓度相当)。在此测定中，将每10μL等分试样的标准品、质量控制(QC)样品或研究样品与25μL工作内标溶液(25μg/mL于水中)、15μL水和150μL SMART消化缓冲液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)混合。对样品进行短暂离心，并将所得上清液的200μL等分试样转移到SMART Digestion微管中。将样品涡旋并在65℃下振荡孵育2小时。将反应混合物的200μL等分试样与5μL20％亚硫酸氢钠混合。将反应用5μL纯甲酸淬灭。将样品涡旋并离心。将所得上清液的150μL等分试样转移到干净的96孔低结合板中。将等分试样注射到LC-MS/MS系统上进行分析。液相色谱系统使用Phenomenex XB-C18柱，1.0x50mm(2.7μm粒径)，其中梯度流由水/甲酸(100/0.5，体积/体积)和乙腈/甲酸(100/0.5，体积/体积)组成，流速为0.600mL/分钟。使用配备有在正离子模式下运行的ESI
Figure GDA0003431173340002011
电离源的Waters Xevo TQ-S三重四极杆LC-MS/MS系统检测特征肽和内标。此方法适用于从10μL BALB/c小鼠血清等分试样中定量ATRC-101，标称浓度范围为2μg/mL至250μg/mL。
用于测量食蟹猴血清中ATRC-101浓度的ELISA方法(ATRC-101.PK.18.01)
使用ELISA方法确定食蟹猴血清中的ATRC-101浓度。此测定采用定量免疫测定技术。简而言之，用绵羊抗人IgG包被微量滴定板以捕获ATRC-101。使用在纯食蟹猴血清中800ng/mL、400ng/mL、300ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、75ng/mL、50ng/mL、30ng/mL、20ng/mL、10ng/mL(包括10ng/mL和800ng/mL的锚定点)浓度的人抗体ATRC-101制备的范围内的十一种标准品生成的标准曲线对测定进行校准。QC样品以在纯食蟹猴血清中250ng/mL、175ng/mL和40ng/mL浓度的ATRC-101在血清中制备。使用Watson LIMS，版本7.3.0.01进行酶标仪的数据回归。使用4参数模型拟合sigmoid校准曲线，其中加权方程为1/y2。标准品、QC样品和研究样品以5倍的最低所需稀释度进行分析，并确定纯猴血清中的样品浓度(μg/mL)。在制备标准品、测试样品和空白之前和之后制备一组QC样品。ATRC-101的检测是用山羊抗人IgG(重链和轻链)与辣根过氧化物酶缀合完成的。将四甲基联苯胺用作显色底物。所述方法的定量范围为20–400ng/Ml。
ATRC-101的吸收在食蟹猴的单剂量IV推注PK研究和重复剂量IV输注毒性研究中进行表征。通过ELISA方法确定ATRC-101的猴血清浓度。
在单剂量药代动力学研究中，将6只天然食蟹猴(3只雄性和3只雌性)随机分配到3个剂量组，并通过IV推注注射以1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg施用ATRC-101。Tmax通常在给药后0.083小时与1小时之间观察到。T1/2在177小时至225小时的范围内。CL和Vd分别在0.15mL/小时/kg与0.436mL/小时/kg以及51.4mL/kg与117mL/kg之间的范围内。全身暴露于ATRC-101在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加大致与剂量成比例。
在食蟹猴的4周重复剂量IV毒代动力学研究中，将8只天然动物(4只雄性和4只雌性)随机分配到4个剂量组，并以0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg每周一次IV输注(30分钟)给予ATRC-101，共4次剂量。Tmax通常在SOI后0.75小时观察到。由于在Tmax后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
食蟹猴中ATRC-101的4周观察期的单剂量静脉推注药代动力学研究(ATRC-101.PK.18.01)
本研究的目的是评价单次IV推注剂量施用后食蟹猴中ATRC-101的PK。
在本研究中，将6只天然动物(1只动物/性别/组)随机分配到3个组，并通过IV推注注射一次施用1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg的ATRC-101。ATRC-101在20mM组氨酸、8％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80，pH 6.0中配制，并进一步稀释至目标浓度进行给药。剂量体积为3.0mL/kg。在给药前第1天、给药后5分钟、1、4、8、12、24、48、96、168、240、336、504和672小时收集药代动力学样品。通过ELISA方法确定ATRC-101的血清浓度。
本研究中的参数包括存活、临床观察、体重、体温、临床病理学(血液学和血清化学)和PK分析。所有动物均存活至研究结束。未观察到ATRC-101相关的临床体征。在体重、体温或临床病理学方面没有ATRC-101相关的结果。在治疗组的给药前时间点收集的所有样品中，ATRC-101的血清浓度均低于定量下限(LLOQ＝20ng/mL)。在第1天施用ATRC-101后，ATRC-101在整个672小时采样期内对于所评价的剂量水平是可量化的。图63.给药后8小时给予1mg/kg的雌性中的浓度高于给予10mg/kg的雌性(分别为241μg/mL与129μg/mL)。
施用ATRC-101后，在给药后0.083小时与1小时之间观察到Tmax，1mg/kg剂量水平下的雌性除外，其在给药后8小时观察到最大浓度。最大血清浓度之后ATRC-101下降，其中T1/2在177小时至225小时的范围内。CL和Vd分别在0.159mL/小时/kg与0.436mL/小时/kg之间以及51.4mL/kg与117mL/kg之间的范围内。
如由Cmax和从时间0到分析时间的曲线下面积(AUC0-t)定义，全身暴露于ATRC-101在测试范围内随着剂量的增加而增加。对于评价的剂量水平，所述增加似乎大致与剂量成比例，1mg/kg与10mg/kg之间的雌性除外，其增加低于剂量比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异，1mg/kg剂量水平下除外，其中雌性暴露似乎比雄性高2倍。
用ATRC-101在食蟹猴中进行的4周剂量范围结果毒理学研究(ATRC-101.TX.18.01)
本研究的目的是评价在向食蟹猴每周一次通过IV输注施用，持续4周时，ATRC-101的潜在非靶标相关毒性和TK。
在本研究中，将8只天然猴子随机分配到4个组(1只动物/性别/组)。向动物每周一次通过30分钟IV输注0(媒介物)、10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg ATRC-101，持续4周(4次剂量)。剂量体积为5mL/kg。在第1天和第22天的一系列时间点收集毒代动力学样品。通过ELISA方法确定ATRC-101的血清浓度。
在第-7天收集的所有给药前样品中，在第1天和第22天收集的对照组所有样品中，以及在第1天给药前时间点收集的治疗组所有样品中，ATRC-101的血清浓度均低于LLOQ(20ng/mL)。在第1天和第22天施用ATRC-101后，ATRC-101在所有剂量水平下在整个168小时采样期内都是可量化的。ATRC-101治疗组的ATRC-101血清浓度在图64中示出。
施用ATRC-101后，在SOI后0.75小时与4.5小时之间观察到Tmax，对应于输注结束(EOI)后0.25小时和4小时，其中大多数情况是在SOI后0.75小时(EOI后0.25小时)。由于在Tmax后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。
如由Cmax和AUC0-t定义，全身暴露于ATRC-101在测试范围内随着剂量的增加而增加。考虑到1只动物/性别/组，但是所述增加似乎大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
PK建模方法用于预测人体内ATRC-101的PK参数。将在研究ATRC-101.PK.18.01中观察到的ATRC-101全身浓度与时间用标准的2室PK模型进行建模，并给予体重对人体进行异速缩放。进行模拟，以获得在6周内每三周一次施用0.1mg/kg、0.3mg/k、1mg/k、3mg/k、10mg/k和30mg/kg剂量后的预期人体血清时程。在单次IV施用后预测人体暴露度量。在0.3mg/kg的浓度下，人体内Cmax估计达到7.81μg/mL，并且AUC0-672小时估计为53.1天·μg/mL。
预计的人PK参数与靶标和效应子双重接合测定中活性的体外药理学研究的相关浓度有关。在靶标和效应子双重接合测定中，ATRC-101的半数最大有效浓度(EC50)示出为68nM。此测定中ATRC-101的剂量反应曲线符合四参数逻辑回归模型，以评估有效浓度(EC20、EC50和EC80)。估计人体内0.3mg/kg的剂量水平会导致Cmax(7.81μg/mL)低于EC50，并在大约6天内(给药间隔的约33％；基于靶标和效应子双重接合测定)达到20％的最大有效浓度(EC20)。
向食蟹猴以1mg/kg、10mg/kg和30mg/kg的剂量水平单次IV推注施用后，在给药后0.083小时与1小时之间观察到Tmax，1mg/kg下的雌性除外，其在给药后8小时观察到最大浓度。T1/2在177小时至225小时的范围内。CL和Vd分别在0.15mL/小时/kg与0.436mL/小时/kg以及51.4mL/kg与117mL/kg之间的范围内。全身暴露于ATRC-101在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加似乎大致与剂量成比例，1mg/kg与10mg/kg之间的雌性除外，其增加低于剂量比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异，1mg/kg剂量水平下除外，其中雌性暴露似乎比雄性高2倍。
在4周的重复剂量毒性和TK研究中，以10mg/kg/周、30mg/kg/周和100mg/kg/周通过30分钟IV输注每周一次施用后，通常在SOI后0.75小时观察到Tmax。由于在Tmax后观察到相对持续的浓度，因此没有表征任何动物的终末消除阶段。全身暴露在测试范围内随着剂量的增加而增加，并且所述增加似乎大致与剂量成比例。在暴露方面没有显著的性别相关差异。重复施用后，第22天的全身暴露通常高于第1天，其中个体累积比率在1.64至2.17的范围内。
总的来说，这些数据表明ATRC-101的PK特征对于人IgG1单克隆抗体而言是典型的。来自食蟹猴的单剂量PK研究的数据用于预测人体内ATRC-101的PK参数。在0.3mg/kgATRC-101的剂量下，人体内Cmax估计达到7.81μg/mL，并且AUC0-672小时估计为53.1天·μg/mL。
根据监管指南，尚未对动物进行ATRC-101的代谢、组织分布或排泄研究。作为典型的单克隆抗体，ATRC-101预期通过不依赖于药物代谢酶(诸如细胞色素P450酶)的生化途径降解为小肽和氨基酸，因此预计不会发生药物-药物相互作用。
应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其产生的各种修改或变化将为本领域技术人员所想到并且欲包括于本申请的精神和权限以及随附权利要求的范围内。本文引用的所有公布、专利、登录号和专利申请出于引用它们的上下文中的目的据此以引用的方式并入。
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Claims (117)

1.一种与肿瘤组织结合的分离的抗体，其中所述抗体与包含聚腺苷酸化RNA的细胞外RNA-蛋白质复合物结合。
2.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含mRNA。
3.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含多个不同的RNA。
4.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含一个或多个mRNA结合蛋白。
5.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含核糖体蛋白质。
6.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚(A)+结合蛋白。
7.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含聚腺苷酸结合蛋白家族成员。
8.如权利要求7所述的抗体，其中所述聚腺苷酸结合蛋白家族成员为PABPC1(PABPC1)、PABPC3(PABPC3)或PABPC4(PABPC4)。
9.如权利要求8所述的抗体，其中所述PABPC家族成员为PABPC1。
10.如权利要求1所述的抗体，其中所述细胞外RNA-蛋白质复合物包含MOV10。
11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体与聚腺苷酸化RNA结合蛋白结合。
12.如权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述RNA-蛋白质复合物包含生物分子缩合物。
13.如权利要求12所述的抗体，其中所述生物分子缩合物由缺氧和/或化学治疗药物诱导。
14.如权利要求12或13所述的抗体，其中所述生物分子缩合物通过成为肿瘤细胞而诱导。
15.如权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中所述抗体通过与FcγR结合来诱导细胞信号传导。
16.如权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与FcγRIIa结合的Fc区。
17.如权利要求16所述的抗体，其中所述抗体在FcγRIIa接合测定中具有500nM或更低的EC50。
18.如权利要求17所述的抗体，其中所述FcγRIIa接合测定采用体内传代的EMT6肿瘤细胞。
19.一种与肿瘤组织结合的抗体，其中所述抗体与细胞外RNA-蛋白质复合物结合，并且其中所述抗体包含：
重链可变区，其包含：
包含序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)的HCDR1，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR1；
包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)的HCDR2，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR2；以及
包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：21)的HCDR3，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR3；
轻链可变区，其包含：
包含序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)的LCDR1，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR1；
包含序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)的LCDR2，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR2；以及
包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)的LCDR3，或其中1个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR3。
20.如权利要求19所述的抗体，其中所述抗体包含含有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)的HCDR1、含有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)的HCDR2、含有序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：21)的HCDR3、含有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)的LCDR1、含有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)的LCDR2和含有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)的LCDR3。
21.如权利要求20所述的抗体，其中所述VH包含与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：94)具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且所述VL包含与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)具有至少95％同一性的氨基酸序列。
22.如权利要求21所述的抗体，其中所述VH包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：94)；并且所述VL包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)。
23.如权利要求19至22中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1721的重链恒定区序列和SEQ ID NO：1722的轻链恒定区序列。
24.如权利要求23所述的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO：1723的序列，并且所述轻链包含SEQ ID NO：1724的序列。
25.一种与肿瘤组织结合的抗体，其中所述抗体与细胞外RNA-蛋白质复合物结合，并且其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含：
(i)SEQ ID NO：1-8或169-362中的任一个的HCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR1的变体；
(ii)SEQ ID NO：9-19或363-556中的任一个的HCDR2，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR2的变体；以及
(iii)SEQ ID NO：20-47、557-750或1727中的任一个的HCDR3，或其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸相对于所述序列被取代的HCDR3的变体；
(b)轻链可变区，其包含：
(i)SEQ ID NO：48-58或751-944中的任一个的LCDR1，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR1的变体；
(ii)SEQ ID NO：59-67或945-1138中的任一个的LCDR2，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR2的变体；以及
(iii)SEQ ID NO：68-76或1139-1332中的任一个的LCDR3，或其中1、2、3、4或5个氨基酸相对于所述序列被取代的LCDR3的变体。
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述取代中的至少1或2个是保守取代；所述取代中的至少50％是保守取代；或所述取代全部都是保守取代。
27.如权利要求25或26所述的抗体，其中所述CDR中的每个中的取代提供包含符合下式的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3：
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)X9(S/T)(SEQ ID NO：1734)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；X6为A、H、K、M、N或R；并且X9为F、M或Y；
(b)HCDR2序列(F/R)I(K/Q)(A/S)X5X6X7(A/G)X9X10T(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)(SEQ IDNO：1735)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X7为D、E或N；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；以及
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)X5CX7(G/S)X9X10CX12X13X14(D/E)X16SX18X19X20X21X22X23X24X25(F/Y)(F/Y)X28X29(D/N)X31(SEQ ID NO：1736)，其中X3为A、P、S或T；X5为A、C或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X13为A、N或S；X14为H、Q、R或S；X16为N、Q或T；X18为F、M或Y；X19为C、S或V；X20为A、G或N；X21为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N、S或Y；X24为A、K、N、P、Q或S；X25为D、K、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列X1G(A/S)X4(S/T)(D/N)I(G/Q)(H/S)X10X11(T/V)X13(SEQ ID NO：1737)，其中X1为H、S或T；X4为E、K、P或S；X10为A、H、N、S或T；X11为A、D、S、T或Y；并且X13为A、L、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7(SEQ ID NO：1738)，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)(F/W)(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)(SEQ ID NO：1739)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q、R或W。
28.如权利要求25所述的抗体，所述抗体包含VH区，其包含含有SEQ ID NO：1-8或169-362中的任一个的序列的HCDR1、含有SEQ ID NO：9-19或363-556中的任一个的序列的HCDR2、含有SEQ ID NO：20-47或557-750或1727中的任一个的序列的HCDR3；含有SEQ IDNO：48-58或751-944中的任一个的序列的LCDR1、含有SEQ ID NO：59-67或945-1138中的任一个的序列的LCDR2和含有SEQ ID NO：68-76或1139-1332中的任一个的序列的LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3中的至少一个中的1或2个氨基酸被取代。
29.如权利要求25所述的抗体，所述抗体包含VH区，其包含SEQ ID NO：77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或VL区，其包含SEQ ID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
30.如权利要求25所述的抗体，所述抗体包含VH区，其包含SEQ ID NO：77-122和1333-1526或1725中的任一个的VH区中列出的抗体的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和VL区，其包含SEQ IDNO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的对应轻链的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
31.如权利要求25所述的抗体，其中所述CDR中的每个中的取代提供包含符合下式的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3：
(a)HCDR1序列G(F/Y)X3X4(A/S)X6A(W/Y)(F/M)(S/T)，其中X3为D、T或V；X4为A、F或Y；并且X6为A、H、K、M或N；
(b)HCDR2序列RIK(A/S)X5X6(D/N)(A/G)X9X10(D/E)(A/S)(P/S)(K/Q)，其中X5为A、N、T或V；X6为D、H、Q、S或T；X9为E、G、H、K或Q；并且X10为A、I、Q或T；
(c)HCDR3序列(I/T)(S/T)X3(F/Y)CCX7(G/S)X9X10CX12(N/S)X14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24，X25(F/Y)YX28X29(D/N)X31，其中X3为A、P或S；X7为H、L、Q或R；X9为A、G、K或N；X10为A、N、Q、R或S；X12为A、L或P；X14为H、Q、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或Q；X25为D、Q、R或S；X28为F、L、W或Y；X29为F、M或V；并且X31为I、P或V；
(d)LCDR1序列(S/T)G(A/S)X4(S/T)(D/N)IG(H/S)X10X11(T/V)X13，其中X4为K、P或S；X10为A、N、S或T；X11为A、S、T或Y；并且X13为A、S、T或Y；
(e)LCDR2序列X1(D/N)X3X4(Q/R)(A/P)X7，其中X1为A、H、K、M、N或R；X3为N、S或T；X4为A、L、Q或Y；并且X7为L、Q、S或Y；以及
(f)LCDR3序列(A/S)(S/T)W(D/N)X5X6X7X8(I/V)X10(I/V)，其中X5为D、E或N；X6为A、D、Q或S；X7为L、N或S；X8为L、N、S或T；并且X10为H、K、Q或R。
32.如权利要求27或31所述的抗体，其包含表1A和表2A中命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3或其变体，与表1B或表2B中示出的对应CDR序列相比，所述变体中的至少一个、两个、三个、四个、五个或全部六个所述CDR含有1或2个氨基酸取代。
33.如权利要求27或31所述的抗体，其中所述抗体包含表1A或表2A中命名为AIP-192482、AIP-171142、AIP-165430、AIP-189526、AIP-122563、AIP-158623、AIP-155066、AIP-166120、AIP-133645、AIP-187893、AIP-142079、AIP-160470、AIP-102396、AIP-150055、AIP-167084、AIP-185304、AIP-134770、AIP-141887、AIP-196203、AIP-128195、AIP-116579、AIP-192329、AIP-197809、AIP-142489、AIP-167726、AIP-199834、AIP-143179、AIP-195587、AIP-153462、AIP-115363、AIP-151090、AIP-168083、AIP-161082、AIP-114196、AIP-189338、AIP-183190、AIP-110143、AIP-147176、AIP-134312、AIP-128243、AIP-156172、AIP-147389、AIP-124314、AIP-185291、AIP-135247、AIP-113513、AIP-102299、AIP-179097、AIP-109343、AIP-119622、AIP-191735、AIP-157078、AIP-153475、AIP-133650、AIP-190915、AIP-167400、AIP-109729、AIP-151709、AIP-136628、AIP-101601、AIP-146871、AIP-170053、AIP-199483、AIP-162041、AIP-180675、AIP-183133、AIP-191470、AIP-151167、AIP-106633、AIP-102624、AIP-109484、AIP-126080、AIP-161571、AIP-163039、AIP-101235、AIP-182061、AIP-181246、AIP-192216、AIP-171912、AIP-172872、AIP-167833、AIP-190051、AIP-145518、AIP-167533、AIP-112580、AIP-143155、AIP-119664、AIP-190526、AIP-114403、AIP-156760、AIP-103803、AIP-195588、AIP-145722、AIP-178251、AIP-116142、AIP-183350、AIP-127108、AIP-128147、AIP-109510、AIP-104086、AIP-143132、AIP-170105、AIP-169636、AIP-152243、AIP-138776、AIP-103817、AIP-130491、AIP-188155、AIP-167246、AIP-106139、AIP-198351、AIP-159326、AIP-192275、AIP-190761、AIP-166832、AIP-148062、AIP-129145、AIP-111240、AIP-153888、AIP-130915、AIP-109048、AIP-170569、AIP-154873、AIP-159037、AIP-186826、AIP-156514、AIP-157122、AIP-173276、AIP-150485、AIP-166847、AIP-124013、AIP-126285、AIP-168605、AIP-190274、AIP-136060、AIP-180422、AIP-166722、AIP-127782、AIP-189473、AIP-192571、AIP-112328、AIP-125258、AIP-150199、AIP-125062、AIP-177193、AIP-115388、AIP-107759、AIP-170221、AIP-143369、AIP-189475、AIP-102833、AIP-157045、AIP-175775、AIP-154181、AIP-125984、AIP-160829、AIP-184744、AIP-128136、AIP-181273、AIP-153125或AIP-131972的抗体的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
34.一种与肿瘤组织结合的抗体，其中所述抗体与细胞外RNA-蛋白质复合物结合，并且其中所述抗体包含：
(a)重链可变区，其包含：
(i)具有序列GF(T/V)(F/Y)(S/A)X6AWM(S/T)(SEQ ID NO：1728)的HCDR1，其中X6为K、A或M；
(ii)具有RIK(S/A)X5X6(D/E)(G/A)X9X10T(D/E)YAA(P/S)VKG(SEQ ID NO：1729)的序列的HCDR2，其中X5为V、N、A或T；X6为T、Q、S、D或H；X9为E、H、K或G；并且X10为T、Q或I；以及
(iii)具有(I/T)(S/T)SFCC(H/R)(G/S)X9X10CPSX14(D/E)TS(F/Y)CX20(G/N)X22X23X24X25(F/Y)Y(F/Y)(M/V)(D/N)X31(SEQ ID NO：1730)的序列的HCDR3，其中X9为A、G、K或N；X10为N、Q、R或S；X14为H、R或S；X20为A、G或N；X22为Q、S或Y；X23为D、F、N或Y；X24为A、K、N、P或S；X25为D、Q、R或S；X19为D或N；并且X31为I、P或V；以及
(b)轻链可变区，其包含：
(i)具有SG(S/A)X4(S/T)(N/D)IGSSX11VX13(SEQ ID NO：1731)的序列的LCDR1，其中X4为S、P或K；X11为S、Y或T；并且X13为S、Y或T；
(ii)具有(K/M)(N/D)X3X4R(P/A)X7(SEQ ID NO：1732)的序列的LCDR2，其中X3为S、N或T；X4为L、Q或A；X5为P或A；X7为Q、S、Y或L；以及
(iii)具有(S/A)(T/S)W(D/N)X5X6(L/N)X8(V/I)R(V/I)(SEQ ID NO：1733)的序列的LCDR3，其中X5为E、D或N；X6为S、A或Q；并且X8为N、S或T。
35.如权利要求34所述的抗体，其中，在所述HCDR1序列中，位置3为T；位置4为F；位置5为S；位置6为K；且/或位置10为S。
36.如权利要求34所述的抗体，其中所述HCDR1序列包含序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)。
37.如权利要求34所述的抗体，其中所述HCDR1包含GFTFSAAWMS(SEQ ID NO：4)、GFVFSKAWMS(SEQ ID NO：7)、GFTFAKAWMS(SEQ ID NO：6)、GFTYSKAWMS(SEQ ID NO：5)、GFTFSMAWMS(SEQ ID NO：3)、GFTYSAAWMS(SEQ ID NO：2)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO：8)中的任一个的序列。
38.如权利要求34至37中任一项所述的抗体，其中，在所述HCDR2序列中，位置4为S；位置5为V；位置6为T；位置7为D；位置8为G；位置9为E；位置10为T；位置12为D；且/或位置16为P。
39.如权利要求34至37中任一项所述的抗体，其中所述HCDR2包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)。
40.如权利要求34至37中任一项所述的抗体，其中所述HCDR2包含序列RIKSVTDGEQTDYAAPVKG(SEQ ID NO：18)、RIKAADDGKQTDYAAPVKG(SEQ ID NO：19)、RIKSVTDGETTEYAASVKG(SEQ ID NO：9)、RIKAVHDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：10)、RIKSNTDAETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：11)、RIKSVQDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：12)、RIKSVTDGHTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：13)、RIKSVTDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO：14)、RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：15)、RIKSTSDGGITDYAAPVKG(SEQ ID NO：16)或RIKSVTEGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：17)。
41.如权利要求34至40中任一项所述的抗体，其中，在所述HCDR3序列中，位置1为T；位置2为S；位置7为R；位置8为G；位置9为G；位置10为S；位置14为H；位置15为D；位置18为Y；位置20为G；且/或位置21为G。
42.如权利要求34至40中任一项所述的抗体，其中所述HCDR3包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGYYKSYYYMDV(SEQ ID NO：33)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：21)或TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSFYYMDV(SEQ ID NO：28)。
43.如权利要求34至40中任一项所述的抗体，其中所述HCDR3包含序列：
TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：32)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：29)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：27)、ISSFCCHSNNCPSSDTSYCNGYYKQYYFMDV(SEQ ID NO：26)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCGGQFKSYYFMDV(SEQ ID NO：25)、ISSFCCRGKQCPSSDTSYCNGYYADYYFMDV(SEQ ID NO：24)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO：23)、TTSFCCRGASCPSSDTSYCAGSYKSYYFVNI(SEQ ID NO：22)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：20)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO：42)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGSYKSYYYMDV(SEQ ID NO：41)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：37)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDSRYYYMDV(SEQ ID NO：40)、TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：39)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO：34)、TTSFCCRGGRCPSRDTSFCGGQYNSYYYMDV(SEQ ID NO：38)、TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQYNRYYYMDV(SEQ ID NO：36)和TTSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO：35)。
44.如权利要求34至43中任一项所述的抗体，其中，在所述LCDR1序列中，位置3为S；位置4为S；位置5为S；位置6为N；位置11为S；且/或位置13为S。
45.如权利要求34至43中任一项所述的抗体，其中所述LCDR1包含序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)。
46.如权利要求34至43中任一项所述的抗体，其中所述LCDR1包含序列SGSKSNIGSSYVS(SEQ ID NO：50)、SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO：56)、SGSKSNIGSSSVY(SEQ ID NO：55)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO：54)、SGASSNIGSSSVS(SEQ ID NO：52)、SGSSTNIGSSTVS(SEQ IDNO：53)、SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO：51)或SGSSTNIGSSSVT(SEQ ID NO：49)。
47.如权利要求34至46中任一项所述的抗体，其中，在所述LCDR2序列中，位置1为K；位置2为N；位置3为N；位置4为Q；位置6为P；且/或位置7为S。
48.如权利要求34至46中任一项所述的抗体，其中所述LCDR2序列包含序列KNQRPS(SEQID NO：59)。
49.如权利要求34至46中任一项所述的抗体，其中所述LCDR2包含序列KNNQRPY(SEQ IDNO：66)、KDNQRPS(SEQ ID NO：62)、KNTQRPS(SEQ ID NO：65)、KNNARPY(SEQ ID NO：64)、KNTQRAS(SEQ ID NO：63)、MNNQRPY(SEQ ID NO：61)或KDNQRPL(SEQ ID NO：60)。
50.如权利要求34至49中任一项所述的抗体，其中，在所述LCDR3序列中，位置1为S；位置2为T；位置4为D；位置5为D；位置6为S；位置7为L；位置8为S；位置9为V；且/或位置11为V。
51.如权利要求34至49中任一项所述的抗体，其中所述LCDR3序列包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)。
52.如权利要求34至49中任一项所述的抗体，其中所述LCDR3序列包含序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO：72)、SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO：71)、ATWDDQLSVRV(SEQ ID NO：69)、ATWDDSLTVRI(SEQ ID NO：76)、ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO：70)或STWDESLSVRV(SEQ IDNO：73)。
53.如权利要求34所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)、GFTFSAAWMS(SEQ ID NO：4)或GFTFSKAWMT(SEQ ID NO：8)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)或RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：15)；
所述HCDR3具有序列TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：32)、TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：20)、TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO：23)、ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：30)、ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：27)、TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：21)或TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO：34)；
所述LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO：56)、SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)、SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO：54)或SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO：51)；
所述LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)或KDNQRPS(SEQ ID NO：62)；并且
所述LCDR3具有序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO：72)、STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)、SSWDDSNSVRI(SEQ ID NO：71)或ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO：70)。
54.如权利要求53所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：92)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：77)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：80)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：86)、EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：94)和EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：95)中的任一个的序列具有至少90％同一性的序列。
55.如权利要求53或54所述的抗体，其中所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：138)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：136)、QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：132)和QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：141)中的任一个的序列具有至少90％同一性的序列。
56.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)；
所述HCDR3具有序列TSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：32)；
所述LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVY(SEQ ID NO：56)；
所述LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)；并且
所述LCDR3具有序列STWDDALSVRV(SEQ ID NO：72)。
57.如权利要求56所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：92)的序列具有至少90％同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：138)的序列具有至少90％同一性的序列。
58.如权利要求56所述的抗体，其中所述重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSSDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：92)；并且所述轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVYWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDALSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：138)。
59.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)；
所述HCDR3具有TSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：20)的序列；
所述LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)；
所述LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)；并且
所述LCDR3具有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)。
60.如权利要求59所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：77)的序列具有至少90％同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)的序列具有至少90％同一性的序列。
61.如权利要求59所述的抗体，其中所述重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRSGSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：77)；并且所述轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)。
62.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)；
所述HCDR3具有序列TSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDP(SEQ ID NO：23)；
所述LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)；
所述LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)；并且
所述LCDR3具有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)。
63.如权利要求62所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：80)的序列具有至少90％序列同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)的序列具有至少90％同一性的序列。
64.如权利要求62所述的抗体，其中所述重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGNQCPSSDTSYCGGQYPSYYYMDPWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：80)；并且所述轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：140)。
65.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSAAWMS(SEQ ID NO：4)；
所述HCDR2具有序列RIKSTSDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：15)；
所述HCDR3具有序列ISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDV(SEQ ID NO：30)；
所述LCDR1具有序列SGSSTNIGSSSVS(SEQ ID NO：54)；
所述LCDR2具有序列KDNQRPS(SEQ ID NO：62)；并且
所述LCDR3具有序列SSWDDSNSVPI(SEQ ID NO：71)。
66.如权利要求65所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)的序列具有至少90％同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：136)的序列具有至少90％同一性的序列。
67.如权利要求65所述的抗体，其中所重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSTSDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGGSCPSRDTSYCGGQYKSYYFMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：90)；并且所述轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSTNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSSWDDSNSVRIFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：136)。
68.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSAAWMS(SEQ ID NO：4)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)；
所述HCDR3具有序列ISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：27)；
所述LCDR1具有序列SGSKSNIGSSSVS(SEQ ID NO：51)；
所述LCDR2具有序列KDNQRPS(SEQ ID NO：62)；并且
所述LCDR3具有序列ATWDNSLSIRV(SEQ ID NO：70)。
69.如权利要求68所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：86)的序列具有至少90％同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：132)的序列具有至少90％同一性的序列。
70.如权利要求68所述的抗体，其中所述重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSAAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCISSFCCRGNSCPSSDTSYCNGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：86)；并且轻链可变区包含序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSKSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKDNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDNSLSIRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：132)。
71.如权利要求53所述的抗体，其中：
所述HCDR1具有序列GFTFSKAWMT(SEQ ID NO：8)；
所述HCDR2具有序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)；
所述HCDR3具有序列TSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDV(SEQ ID NO：34)；
所述LCDR1具有序列SGSSSNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)；
所述LCDR2具有序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)；并且
所述LCDR3具有序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)。
72.如权利要求71所述的抗体，其中所述重链可变区具有与EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：95)的序列具有至少90％同一性的序列；并且
所述轻链可变区具有与QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：141)的序列具有至少90％同一性的序列。
73.如权利要求71所述的抗体，其中所述重链可变区包含序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSVLYLQMSSLKTEDTAVYFCTSSFCCRGGSCPSHDTSFCGGQDKRYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：95)；并且所述轻链可变区具有包含序列QSVLTQAPSASETPGQRVIISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：141)的序列。
74.如权利要求34所述的抗体，其包含：
重链可变区，其包含：
包含序列GFTFSKAWMT(SEQ ID NO：8)或GFTFSKAWMS(SEQ ID NO：1)的HCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR1；
包含序列RIKSVTDGETTDYAAPVKG(SEQ ID NO：9)的HCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR2；
以及包含序列TSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDV(SEQ ID NO：21)的HCDR3，或其中1、2或3个氨基酸相对于所述序列被取代的变体HCDR3；
轻链可变区，其包含：
包含序列SGSSDNIGSSSVS(SEQ ID NO：48)的LCDR1，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR1；
包含序列KNNQRPS(SEQ ID NO：59)的LCDR2，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR2；以及
包含序列STWDDSLSVRV(SEQ ID NO：68)的LCDR3，或其中1或2个氨基酸相对于所述序列被取代的变体LCDR3。
75.如权利要求18至74中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含：
重链可变区，其包含FR1，所述FR1包含相对于SEQ ID NO：77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR1序列的1、2或3个位置处的取代；FR2，所述FR2包含相对于SEQ IDNO：77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR2序列的1、2或3个位置处的取代；FR3，所述FR3包含相对于SEQ ID NO：77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR3序列的1、2或3个位置处的取代；和/或FR4，所述FR4包含相对于SEQ ID NO：77-122或1333-1526或1725中的任一个的VH区的对应FR4序列的1或2个位置处的取代；以及
轻链可变区，其包含FR1，所述FR1包含相对于SEQ ID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR1序列的1、2或3个位置处的取代；FR2，所述FR2包含相对于SEQID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR2序列的1、2或3个位置处的取代；FR3，所述FR3包含相对于SEQ ID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR3序列的1、2或3个位置处的取代；和/或FR4，所述FR4包含相对于SEQ ID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个的VL区的对应FR4序列的1或2个位置处的取代。
76.如权利要求18至74中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与SEQ ID NO：77-122或13333-1526或1725中的任一个具有至少95％同一性的VH；和与SEQ ID NO：123-168或1527-1720或1726中的任一个具有至少95％同一性的对应VL。
77.如权利要求18至77中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：1721的重链恒定区序列和SEQ ID NO：1722的轻链恒定区序列。
78.一种诱导免疫反应的方法，所述方法包括施用如权利要求1至77中任一项所述的抗体。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述免疫反应包括ADCP反应。
80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述抗体经静脉内施用。
81.一种治疗患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的癌症患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求34至77中任一项所述的抗体。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
84.如权利要求81、82或83所述的方法，其中所述抗体经静脉内施用。
85.如权利要求81至84中任一项所述的方法，其还包括施用化学疗法和/或放射疗法。
86.如权利要求81至85中任一项所述的方法，其还包括施用靶向免疫检查点抗原的剂。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述剂为单克隆抗体。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述单克隆抗体阻断PD-1配体与PD-1的结合。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述单克隆抗体为抗PD-1抗体。
90.一种鉴定患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的患者的方法，所述方法包括使来自所述患者的肿瘤样品与如权利要求1至77/中任一项所述的抗体接触。
91.一种表达载体，其包含编码如权利要求25至77中任一项所述的抗体的VH区的多核苷酸。
92.一种表达载体，其包含编码如权利要求25t至77中任一项所述的抗体的VL区的多核苷酸。
93.一种表达载体，其包含编码如权利要求25至77中任一项所述的抗体的VH区和VL区的多核苷酸。
94.一种表达载体，其包含编码如权利要求25至77中任一项所述的VH或VLCDR3的多核苷酸。
95.一种宿主细胞，其包含如权利要求91至94中任一项所述的表达载体。
96.一种宿主细胞，其包含编码如权利要求25t至77中任一项所述的抗肿瘤抗体的VH区的多核苷酸。
97.一种宿主细胞，其包含编码如权利要求25t至77中任一项所述的抗肿瘤抗体的VL区的多核苷酸。
98.一种宿主细胞，其包含编码如权利要求25t至77中任一项所述的抗肿瘤抗体的VH区和VL区的多核苷酸。
99.如权利要求95至98中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO细胞。
100.如权利要求99所述的宿主细胞，其中所述CHO细胞为CHOK-1细胞。
101.一种产生抗体的方法，所述方法包括在表达编码所述重链的多核苷酸和编码所述轻链的多核苷酸的条件下培养如权利要求93或98所述的宿主细胞。
102.一种鉴定具有抗肿瘤活性的抗体的方法，所述方法包括诱变编码如权利要求25至77中任一项所述的抗体的VH或VLCDR3的多核苷酸；表达包含所述诱变的VH或VLCDR3的抗体；以及选择在体内抑制肿瘤生长或减小肿瘤大小、肿瘤侵袭和/或转移的抗体。
103.如权利要求1至77中任一项所述的抗体在体内诱导免疫反应的方法中的用途。
104.如权利要求25至77中任一项所述的抗体在体内诱导免疫反应的方法中的用途。
105.如权利要求1至77中任一项所述的抗体在治疗癌症的方法中的用途。
106.如权利要求25至77中任一项所述的抗体在治疗癌症的方法中的用途。
107.如权利要求34至77中任一项所述的抗体在治疗患有包含细胞外RNA-蛋白质复合物的肿瘤的受试者的癌症的方法中的用途。
108.如权利要求105、106、107所述的用途，其中所述癌症为肺癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、黑色素瘤、子宫癌、肝癌、膀胱癌或睾丸癌。
109.如权利要求108所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌或黑色素瘤。
110.如权利要求105至108中任一项所述的用途，其中所述抗体经静脉内施用。
111.如权利要求105至110中任一项所述的用途，其中所述方法还包括施用化学疗法和/或放射疗法。
112.如权利要求105至111中任一项所述的用途，其中所述方法还包括靶向免疫检查点抗原的剂。
113.如权利要求112所述的用途，其中所述剂为单克隆抗体。
114.如权利要求113所述的用途，其中所述单克隆抗体阻断PD-1配体与PD-1的结合。
115.如权利要求114所述的用途，其中所述单克隆抗体为抗PD-1抗体。
116.一种多肽，其包含VH序列EVQLVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFTFSKAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSVTDGETTDYAAPVKGRFTISRDDSKSTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTSSFCCRGGSCPSHDTSYCGGQYKSYYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：94)；和VL序列QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSSSVSWYQQLPGTAPKLLIYKNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCSTWDDSLSVRVFGGGTKLTVL(SEQID NO：140)。
117.一种多肽，其包含SEQ ID NO：1723的重链序列和SEQ ID NO：1724的轻链区序列。
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