CN101044242A - 肿瘤特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了肿瘤特异性抗体的重链和轻链互补决定区的氨基酸和核酸序列。此外，本发明还提供了肿瘤特异性抗体和免疫偶联物、其方法和用途。所述免疫偶联物包含附于毒素或标记物的肿瘤特异性抗体。本发明还涉及使用本发明的肿瘤特异性抗体的诊断方法和试剂盒。

Description

肿瘤特异性抗体
发明领域
本发明涉及人肿瘤特异性结合蛋白及其应用。特别的，本发明涉及对抗原或癌细胞分子特异的抗体或抗体片段、及含有本发明的结合蛋白的免疫偶联物，以及它们的使用方法。
发明背景
在2000年，全世界有约2200万人患癌症，620万人死于这类疾病。每年有超过1000万新增病例，且预计在未来15年内增加50％(WHO，世界癌症报道(World Cancer Report))。Bernard W.Stewart和Paul Kleihues编，IARC Press，Lyon，2003)。目前的癌症治疗局限于侵入性手术、放射疗法和化学疗法，所有的这些方法或是导致潜在的严重副作用，非特异性毒效和/或由创伤带来的体形和/或生活质量的改变。癌症可发展成为对化学疗法产生不反应性，从而降低了其他治疗手段的选择余地和成功率。对于一些癌症的预后比其他的更坏，且对于某些癌症，如肺癌或胰腺癌，其结果几乎都是致命的。此外，那些有着相对较高治疗成功率的癌症，例如乳腺癌，同样也有着非常高的发生率，因此也是主要的杀手。
例如，每年全世界有超过100万的新增乳腺癌患者。治疗的方法包括从微创到放疗手术移除乳房组织和淋巴结，以及用放射和化学疗法处理转移性病灶。对于5年存活率约为50％的局部病灶的预后相对较乐观，但是一旦癌症发生转移，则变得无法医治，平均的存活率变为约2年。尽管治疗成功率在增加，每年仍有将近400,000的妇女死于乳腺癌，在妇女中死于癌症最高的数目，超过了因肺癌死亡的人数。在那些短期和长期幸存者中，绝多数仍受到因侵入性和毁坏外形的外科治疗带来的终生的创伤。
另一个例子是肝癌，其每年有超过50万的新增病例，且由于治疗效率的低下，导致几乎同样数目的死亡率。肝细胞癌占所有肝癌的约80％，且很少能医治。其5年的存活率仅为约10％，且确诊后的存活时间通常少于6个月。尽管手术切除病患组织可能会有效，但由于存在肝硬化的危险，该方法对于大多数患者并不适用。肝细胞癌对辐射有强的抵制力，且对化学疗法的响应差。
再一个例子是胰腺癌，其每年有约200,000的新增病例，且预后很低。事实上，绝大多数的患者在确诊后1年内死亡，只有极少数的患者存活5年。外科手术是唯一可行的治疗方法。但由于手术不仅仅是切除胰腺的至少一部分，而且还包括切除整个十二指肠、部分的空肠、胆管和胆囊以及末梢的胃切除术，因此手术常常导致高的致病率和并发症。在某些病例中，还移除了脾和淋巴结。
膀胱癌是全世界第9大癌症，每年有约330,000的新增病例，年死亡率为130,000。在欧洲，该疾病每年导致约50,000人死亡。现有的治疗方法包括以灌注法施行化学疗法和卡介苗(BCG)免疫疗法，但卡介苗免疫疗法会增加系统感染肺结核细菌的危险。除了此侵略性的疗法外，这些表面乳突状的肿瘤中有70％将会在长期的治疗过程中复发，且其中一部分会发展成扩散性肿瘤。膀胱癌的高发病率和与之相关的重复治疗过程，使得这类癌症的治疗成为患者终生的治疗中最为昂贵的部分。对于重复患病的病人而言，唯一的选择是进行多次麻醉的膀胱镜检查手术，或进行主要的放射性的改变其生活的手术(通常是膀胱切除术)。放射性膀胱切除术包括切除男性的膀胱、前列腺和精囊，以及女性的卵巢、子宫、尿道和部分的阴道。
还有很多癌症的例子也均存在着现有疗法无法满足患者需要的问题。这些疗法或者是因为效果甚低，和/或因为它们有高的发病率和严重的副作用。然而，上述这些选择的统计数字和事实很好地说明了人们对更加安全有效的癌症疗法的需要。
导致现有癌症疗法的不足的原因之一是它们缺少对患病组织和细胞的选择性。手术切除总是包含移除看似正常的被认为是“安全地带”的组织，而这样会增加致病率和并发症的危险。另外，手术切除还包含移除一些散置于肿瘤细胞中、有可能维持或恢复受感染的器官或组织的健康组织。放射线和化疗由于其非特异性的作用模式，会损害到许多正常的细胞。这将会导致严重的副作用，例如严重的恶心、体重减轻和体力降低、脱发等，并且还会增加其在以后患其他癌症的危险。对于癌细胞有更高选择性的治疗将不会伤及正常细胞，从而将提高作用/副作用比例和生活质量。
对癌症之类的选择性可通过使用对仅存在于或主要上存在于癌细胞中的分子有特异性的抗体来提高。这样的抗体可被用于调节免疫系统以及增强患者自身免疫系统对癌症的识别和毁灭。它们还可以妨碍或改变目标分子的功能，从而妨碍或改变癌细胞的功能。它们还能用于靶向药物、基因、毒素或其他与癌细胞医学相关的分子。这种抗体—药物复合物通常被称作为免疫毒素或免疫偶联物，且今年来许多这样的化合物都被进行了测试。[KreitmanRJ(1999)Immunotoxins in cancer therapy.Curr Opin Immunol 11：570-578；Kreitman RJ(2000)Immunotoxins.Expert Opin Pharmacother 1：1117-1129；Wahl RL(1994)Experimental radioimmunotherapy.A brief overview.Cancer73：989-992；Grossbard ML，Fidias P(1995)Prospects for immunotoxin therapy ofnon-Hodgkin′s lymphoma.Clin Immunol Immunopathol 76：107-114；Jurcic JG，Caron PC，Scheinberg DA(1995)Monoclonal antibody therapy of leukemia andlymphoma.Adv Pharmacol 33：287-314；Lewis JP，DeNardo GL，DeNardo SJ(1995)Radioimmunotherapy of lymphoma：a UC Davis experience.Hybridoma14：115-120；Uckun FM，Reaman GH(1995)Immunotoxins for treatment ofleukemia and lymphoma.Leuk Lymphoma 18：195-201；Kreitman RJ，WilsonWH，Bergeron K，Raggio M，Stetler-Stevenson M，FitzGerald DJ，Pastan I(2001)Efficacy of the anti-CD22 recombinant immunotoxin BL22 inchemotherapy-resistant hairy-cell leukemia.N Engl J Med 345：241-247].迄今已测试过的对抗已知肿瘤标记物的抗体均为鼠的单克隆抗体，有时通过分子工程进行“人类化”。不幸的是，它们的靶也能大量存在于正常细胞的子集中，因此增加了非特异性毒性效果的危险。此外，这些抗体基本上是鼠蛋白，它们被人类患者的免疫体统识别为外来蛋白。接下来的免疫反应和抗体响应可导致效率的尚失或副作用的产生。
本发明的发明人在开发治疗癌症的抗体过程中使用了各种不同的方法。与对带有癌细胞的试验动物或分离的癌细胞标记物进行免疫处理不同的是，本发明的发明人仅仅寻求那些可被患者自身免疫系统识别的标记物，换句话说，那些被免疫系统识别为外来分子的标记物。这就意味着识别物或抗原通常是不存在于正常细胞中的，因此进一步降低非特异性毒性的危险。杂种细胞文库产生自癌症患者提供的淋巴细胞，且由它们分泌的抗体进行了结合到正常和癌细胞的测试。只有那些显示出对癌细胞有高选择性的抗体才被留作以后的评价及作为癌症治疗和诊断试剂的研究。本专利申请的主题即是这样的一种高选择性的抗体。除了具有选择性外，该抗体由于是完全的人蛋白，因此能与病人的免疫系统完全相容。本发明的抗体可以用作诊断或治疗用，或者作为改造其他靶抗原的结合分子的基础。
抗体分子的基本结构包括4条蛋白链，其中2条重链，2条轻链。这些链通过二硫键相互连接。每条轻链均是由轻链可变区和轻链稳定区组成。每条重链均是由重链可变区和重链稳定区组成。轻链和重链的可变区可进一步细分为结构区和超变区，被称作互补决定区(CDR)。每条轻链和重链的可变区均是由3个CDRs和4个结构区组成。
CD44代表着由总共含20个外显子的单基因编码的细胞表面糖蛋白家族。外显子19和20一同被表达为细胞质尾(cytoplasmic tail)，因此被大多数研究课题组分组为“外显子19”(Liao et al.J.Immunol 151：6490-99，1993)。此后，术语外显子19将被用于指定基因组的外显子19和20。结构和功能的多样化通过选择性地连接信使RNA而实现。这里的信使RNA包含了10个“变异性”外显子，其被认定为外显子6-15，或者通常情况下为“变异性外显子”1-10(v1-v10)。在人类中，变异性外显子1含有停止密码子，且通常不被表达。因此，最长的潜在CD44变异体是CD44v2-10(参见Naor et al.Adv Cancer Res71：241-319，1997对CD44的综述)。
外显子1-5和所有的变异性外显子是细胞外区的部分，并含有许多转译后修饰的潜在位点。跨膜区虽对于不同种属是高度保守的，但细胞内尾(intracellular tail)可被截去从而形成其他种类的变异体。这类变异体之一包含了变异性外显子8-10，但缺少外显子19的部分。对细胞外区的改变显示出对CD44功能的改变，这在一定程度上取决于CD44对透明质酸(HA)的结合和内化(internalization)。CD44不仅仅涉及结合到细胞外分子，而且其还具有细胞信号特性(综述见Turley et al.J Biol Chem 277(7)：4589-4592，2002)。
“标准”CD44(CD44s)，CD44的最常见的表达形式，含有外显子1-5和16-19，且均非变异性外显子。核心蛋白的分子量为37-38kDa，但转译后修饰可导致分子量达到85-95kDa或更高(Drillenburg et al.，Blood 95(6)：1900，2000)。它组成性地(constitutively)结合到透明质酸，一种细胞外的粘多糖，因此，CD44通常被称作HA受体。有趣的是，变异性外显子的存在可以降低CD44对HA的结合，因而CD44变异体不能被称作组成性地结合HA，但这样的结合是可诱导的(综述见Naor et al.Adv Cancer Res 71：241-319，1997)。变异体的一些实例请参考图17。
CD44E，也被称作CD44v8-10，除外显子1-5和16-19外，还含有变异性外显子8-10。其他的变异体包括CD44v3-10、CD44v6、CD44v7-8等等。变异性外显子是CD44细胞外区的一部分。
CD44E可存在于某些正常的上皮细胞(epithelial cells)，特别是由复层扁平上皮(stratified squamous epithelium)和腺上皮(glandular epithelium)的基底细胞(basal cell)的生殖细胞(generative cells)产生(Mackay et al.J CellBiol 124(1-2)：71-82，1994)以及出现在胎儿的一些发展阶段。但重要的是，它在各种癌细胞中被过度地表达。通过使用RT-PCR，Iida和Bourguignon(J CellPhysiol 162(1)：127-133，1995)以及Kalish等(Frontiers Bioscience 4(a)：1-8，1999)已经发现CD44E存在于正常的乳房组织，并且比CD44s更为大量地存在。他们还发现CD44，包括CD44E和CD44s均被过度地表达，而且主要存在于转移的乳腺癌组织中。Miyake等(J Urol 167(3)：1282-87，2002)报道了CD44v8-10 mRNA在尿道上皮细胞癌(urothelial cancer)中强烈地表达，且甚至在患侵袭性对表浅性(invasive vs superficial)尿道上皮细胞癌的病人的尿液中脱落的细胞中也能被检测出。CD44v8-10与CD44v10 mRNA的比例在肿瘤中增加，且被显示为在乳房、肺、喉和膀胱中具有诊断价值。CD44v8-10的存在也经免疫组织学的多克隆抗体所验证(Okamoto et al.J Natl Cancer Inst90(4)：307-15，1997)。CD44v8-10也可被过度表达于胆囊癌(Yamaguchi et al.Oncol Rep 7(3)：541-4，2000)、肾脏细胞癌(Hara et al.Urology 54(3)：562-6，1999)、睾丸生殖细胞肿瘤(Miyake et al.Am J Pathol 152(5)：1157-60，1998)、非小细胞肺癌(Sasaki et al.Int J Oncol 12(3)：525-33，1998)、结肠直肠癌(Yamaguchi et al.J Clin Oncol 14(4)：1122-27，1996)、和胃癌(Yamaguchi et al.Jpn J Cancer Res 86(12)：1166-71，1995)。CD44v8-10的过度表达也显示出对前列腺癌的诊断价值(Martegani et al.Amer J Pathol 154(1)：291-300，1999)。
甲胎蛋白(AFP)是在胎儿期合成的一种主要的血清蛋白。其在成人体中的出现通常是癌症的指示，特别是患肝癌和畸胎癌。它是类蛋白基因家族中的成员。该类蛋白基因家族中还包括血清和α清蛋白以及维生素D-结合蛋白。AFP包含590种氨基酸，分子量为约69-70kDa，且具有一糖基化的位点(Morinaga et al.，Proc Natl Acad Sci 80：4604-08，1983；Mizejewski Exp BiolMed 226(5)：377-408，2002)。分子变异体(Molecular variants)已在啮齿动物动物中得到研究和确认，但尚无人类中变异体蛋白被检测到的报道。最近的一份报道确认了变异体mRNA，如果经表达，则会编码65kDa的蛋白。该蛋白被表达以维持在细胞质内(Fukusawa et al.J Soc Gynecol Investig May 20，e-publication，2005)。
发明概述
本发明者们制备了人肿瘤特异性抗体，其结合到包括膀胱、乳腺、卵巢、前列腺和子宫在内的多种肿瘤细胞。重要的是，该抗体不会显著地结合到正常的组织上，因此使得其有望用于肿瘤的治疗中。本发明者们克隆并测定了抗体的序列，确定出抗体的轻链和重链可变区以及互补决定区1，2和3的序列。从而，本发明者们提供了分离的轻链互补决定区1，2和3，其分别包括氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)，EDTKRPS(SEQ ID NO：2)和QAWDSRTEI(SEQ ID NO：3)；以及分离的重链互补决定区1，2和3，其分别包括氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)，YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQID NO：5)和KYCGGDCRSGFDI(SEQ ID NO：6)。
本发明还提供了分离的编码轻链互补决定区1，2和3的核酸序列，其分别包括氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)，EDTKRPS(SEQ IDNO：2)和QAWDSRTEI(SEQ ID NO：3)；以及分离的编码重链互补决定区1，2和3的核酸序列，其分别包括氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)，YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQ ID NO：5)和KYCGGDCRSGFDI(SEQ IDNO：6)。
此外，本发明的其他方面还涉及分离的轻链可变区，其包含了本发明(SEQID NOS：1-3)的轻链互补决定区1，2和/或3；以及分离的重链可变区，其包含了本发明(SEQ ID NOS：4-6)的重链互补决定区1，2和/或3。在一个实施方式中，轻链可变区包含了示于图1中的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。在另一个实施方式中，重链可变区包含了示于图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
本发明还提供了编码本发明的轻链可变区的分离的核酸序列，以及编码本发明的重链可变区的分离的核酸序列。在一个实施方式中，轻链可变区包含了示于图1中的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。在另一个实施方式中，重链可变区包含了示于图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
本发明的另一方面是关于结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其含有至少一个本发明的轻链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：1-3)和/或至少一个本发明的重链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NO：4-6)。本发明还提供了结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其含有本发明的轻链可变区和/或本发明的重链可变区。
发明者们还确认了结合到本发明的结合蛋白上的抗原。因此，本发明提供了结合到含CD44E的5-v8界面、CD44的v8外显子或氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白的本发明的结合蛋白。本发明还提供的本发明的结合蛋白结合到CD44E；甲胎蛋白；分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间、优选为5.4的蛋白；分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白；或者含有氨基酸序列是AFP的107到487(SEQ IDNO：14)，AFP的107到590(SEQ ID NO：15)或AFP的107到609(SEQ IDNO：16)的蛋白。
此外，本发明提供了含有本发明的结合蛋白的组合物，例如抗体和抗体片段，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稳定剂。
本发明的另一方面是一免疫偶联物包含：(1)本发明的结合蛋白，其优选为结合到肿瘤细胞之中或之上的抗原或分子上的抗体或抗体片段，其附于(2)效应分子上。本发明的进一方面是一免疫偶联物包含：(1)本发明的结合蛋白，优选为结合到被肿瘤细胞内化的抗原或分子上的抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。在一优选的实施方式中，效应分子是(i)一标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一癌症治疗试剂，其或者是毒害细胞、抑制细胞生长，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力。优选的，上述癌症治疗试剂是毒素。
本发明还提供含有本发明的免疫偶联物的组合物，以及该免疫偶联物在制备治疗或预防及诊断癌症的药物中的应用。此外，本发明还提供了使用本发明的免疫偶联物及相关试剂盒治疗或预防癌症的方法。
本发明的另一方面是诊断哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与本发明的结合蛋白接触，所述结合蛋白在允许形成结合蛋白-抗原复合物的条件下，结合到肿瘤细胞之中或之上的抗原；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的含量；以及
(3)将测试样品中的结合蛋白-抗原复合物的含量与对照物比较。
本发明还包括诊断哺乳动物中癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与本发明的结合蛋白接触，所述结合蛋白是在允许形成结合蛋白-甲胎蛋白复合物的条件下，特异性地结合到甲胎蛋白或其变体上的结合蛋白；
(2)测量测试样品中结合蛋白-甲胎蛋白复合物的含量；以及
(3)将测试样品中的结合蛋白-甲胎蛋白复合物的含量与对照物比较。
本发明的另一方面是涉及包含本发明的免疫偶联物的诊断试剂，其中的效应分子是一标记物，其可以直接或间接地生成可探测的信号。
本发明还包括可特异性地结合到本发明的结合蛋白之一的分离的蛋白、其核酸序列及应用。
本发明的其他特征及益处将由以下的详细说明中更清楚地看出。然而，应当明白的是这些详细的说明和具体的例子虽然给出了本发明的优选的实施例，但它们仅是为了示例的目的。本领域的技术人员能够在不脱离本发明精神下，从本发明详细的描述中得出各种基于本发明的变化和改进。
附图的简要说明
本发明将借由附图加以说明，其中：
图1是轻链可变区VB1-008的核酸和氨基酸序列。
图2是重链可变区VB1-008的核酸和氨基酸序列。
图3是用VB1-008染色的SKBR-3(400X倍)固定细胞球(A)、和同型对照抗体4B5(B)。注意明显的膜染色(箭头)。
图4是用VB1-008免疫组织化学染色的正常的睾丸以及同型对照抗体4B5的代表性图片。(A)用VB1-008染色的样品925测试组织(400X倍)。箭头指示出成熟的精液细胞的膜染色。(B)用IgG同型对照物4B5染色的样品925测试组织(400X倍)。注意没有染色。箭头指向与用VB1-008(A)中染色作对照物的成熟精液细胞。
图5显示了用VB1-008和IgG同型对照物4B5染色的样品3427A1乳腺癌(breast adenocarcinoma)(400X倍)。注意肿瘤细胞膜的染色，特别是与细胞外基质接触的细胞(白色箭头)。靠近肿瘤中心的细胞显示出主要的细胞质的染色(黑色箭头)。箭头指向未染色的肿瘤细胞。肿瘤细胞是用VB1-008进行的染色。
图6显示了用VB1-008(A)和IgG同型对照物4B5(B)染色的样品946 B1膀胱癌(400X倍)。箭头指示出用VB1-008(A)染色的肿瘤细胞膜，但没有对照抗体(B)。
图7显示了用VB1-008和IgG对照抗体4B5染色的样品4036A2子宫癌(200X倍)。注意是用VB1-008(A&C)，而不是用对照抗体(B)对细胞膜进行的染色(箭头)。更高的子宫癌放大倍数(600X倍)显示了膜的染色(C)。
图8显示了于不同温度下培养A-375细胞之后、由流式细胞仪确定的抗体细胞的表面结合。在4℃下培养细胞悬浮液后的A-375细胞的荧光标记物：4B5(1)和VB1-008(2)。将抗体结合细胞加温到37℃后的A-375细胞的荧光标记物：VB1-008(3)60分钟，(4)120分钟。
图9显示了共聚焦显微镜对VB1-008内化的评估。A-375细胞与抗体一同在4℃下培养，洗净并加温到37℃保持60分钟。细胞用荧光标记物的第二抗体固定、浸透和标记。在VB1-008于4℃下培养60分钟后，对A-375细胞的荧光标记物显示出标记物的圆周表面分布(60X×4)放大(A)。当抗体结合的细胞在37℃下培养60分钟后，细胞通过内化的抗体，显示出强的细胞内染色，(60X×4)倍(B).
图10A，B和C显示了使用VB1-008的免疫沉淀反应的西方印迹分析(western analysis)。图10A显示了非还原条件下的实验结果，图10B和C显示了还原条件下的实验结果。
图11A和B显示出在纯化的抗原复合物中的两个清楚的蛋白质的点，它们的分子量非常接近。由于有蛋白堆叠，在1D-PAGE中蛋白可能未显示为两个带。图11A代表了2D-凝胶的西方墨点法图谱(western blot profile)，图11B代表了考马斯(Coomassie)染色后的对应物。
图12A和B显示了获得的肽以及原始AFP分子的序列覆盖率图，其登记号为#GI|4501989。图12A显示了由2D凝胶获得的肽图。以粗体表示的氨基酸代表经MS分析确认的氨基酸序列。阴影区代表同源肽序列，故此可看出序列覆盖率。图12B显示了由1D和2D凝胶获得的完整肽图。黑体表示的氨基酸代表经MS分析确认的氨基酸序列。阴影区代表同源肽序列，故此描述了序列覆盖率。划下划线的氨基酸未被检测到。
图13显示了以1000g的MDA-MB-435S膜为源的VB1-008抗原的免疫净化。净化后的抗原在非还原样品条件下溶解到SDS-PAGE上。为了保持结合抗原的天然构造，避免使用例如DTT或β-巯基乙醇的还原剂。样品溶解于凝胶的两条通道上。通道(A)用蛋白染色；另一通道(B)用VB1-008探测进行西方墨点法分析，以保证特定抗原的存在。从凝胶的考马斯(Coomassie)染色部分切除带“E”，送MS分析。
图14显示了获得的完整肽图以及CD44分子的序列覆盖率，其登记号为#GI|105583。以红色体表示的氨基酸代表由MS分析确认的氨基酸序列。阴影区代表同源肽序列，故此可看出序列覆盖率。划下划线的氨基酸构成了异构体3或CD44E可变区(v8-v10)的特征。
图15A显示了VB1-008与重组AFP分子的反应活性，其中的AFP分子可以由RDI系统以商业途径获得。重组AFP分子经电泳转移到硝化纤维素膜上，并用VB1-008探测。结果清楚表明了VB1-008与AFP的反应活性。
图15B和C是“B”和“C”的2D-凝胶图谱，它们是通过使用VB1-008得到的免疫沉淀反应。凝胶被转移到硝化纤维上，并用CD44抗体和AFP抗体探测，这两种抗体都分别是鼠单克隆抗体。
图16是非还原条件下的西方印迹分析。使用CD44抗体(anti-CD44)将CD44从MDA-MB-435S细胞进行免疫纯化，纯化后的部分用于非还原条件下的SDS-PAGE和WB分析。实验分3批进行，每批都完全相同。每批实验均使用5μg/mL的CD44抗体、AFP抗体和VB1-008探测。CD44抗体和AFP抗体均为鼠单克隆抗体，而VB1-008是VBI的人单克隆抗体。
图17是人CD44基因中不同外显子的分布代表示意图。可变区的选择性拼接(Alternative splicing)导致了许多异构体的产生，在相应的图中示意地表示出一些报道过的异构体。
图18A描绘了CD44E的氨基酸序列。高亮部分表示用于产生肽1-3的一段17个氨基酸。蛋白的C-端区的高亮部分为阴性对照肽。图18B显示了VB1-008与肽1-3结合实验的结果。
图19A显示了用肽1-3抑制VB1-008结合的竞争研究结果。图19B显示了用肽1-3抑制对照抗体(EGFR抗体)的竞争研究结果。
图20显示了免疫偶联物VB6-008的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。PelB引导序列的序列用小写字母表示，且其起始密码子用粗体表示。停止译码(stopcodes)以大写粗体字母表示。
图21显示了免疫偶联物VB6-008的重链和轻链的氨基酸序列(SEQ IDNO：12 and 13)。
图22显示了完整的VB6-008构建(construct)。
图23显示了VB6-008单元#1，其包括PelB-VH-CH-Furin-De-Bouganin。
图24显示了VB6-008#2单元，其由PelB-VL-CL组成。
图25显示了使用VB6-008进行体外细胞毒素实验的结果。
图26描绘了γ盒(gamma cassette)。
图27描绘了Fab-bouganin免疫毒素的组合。
发明的详细说明
(A)定义
在此使用的术语“系统地给予”意味着例如通过注射(皮下、静脉、肌肉等)或口服、吸入、经皮肤给予或局部施用(例如局部药膏或油膏等)、栓剂施用，或植入手段等方便的方法进行系统地给予免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂。植入物可以是多孔的、非多孔的，或凝胶状的物质，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。栓剂通常含占重量比例为0.5％到10％的活性成分。
在此使用的术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。抗体可由重组源得到和/或由转基因动物产生。在此使用的术语“抗体片段”意在包括Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，dsFv，ds-scFv，其二聚体、微型抗体、双链抗体和多聚抗体，以及双特异性抗体片段。可使用常规技术将抗体变为片段。例如，F(ab′)2片段可经由胃蛋白酶处理抗体而产生。产生的F(ab′)2片段可经处理而减少二硫键，从而产生Fab′片段。木瓜蛋白酶的消化可导致Fab片段的形成。Fab、Fab′和F(ab′)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚抗体、微型抗体、双链抗体和双特异性抗体片段，以及其他片段也可通过重组技术合成。
在此使用的术语“本发明的抗体或抗体片段”包括至少一本发明的轻链互补决定区(即1个或多个SEQ ID NOS：1-3)和/或至少一本发明的重链互补决定区(即1个或多个SEQ ID NOS：4-6)。优选地，抗体或抗体片段包含轻链CDR序列(SEQ ID NOS：1-3)和/或重链CDR序列(SEQ ID NOS：4-6)或这些序列的功能性变异体(functional variants of the sequences)，这样，这些抗体或抗体片段就能够结合到肿瘤细胞上而不会过多地结合到正常细胞上。本发明的抗体或抗体片段还包括结合到CD44E；甲胎蛋白；分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间、优选为5.4的蛋白；分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白；或者含有氨基酸序列是AFP的107到487(SEQ ID NO：14)，AFP的107到590(SEQ ID NO：15)或AFP的107到609(SEQ ID NO：16)的蛋白上的抗体或抗体片段。此外，本发明的抗体或抗体片段包括结合到含CD44E的5-v8界面、CD44的v8外显子或氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白上的抗体或抗体片段。
“至少为适度的严格杂交条件”是指为促进在溶液中两个互补核酸分子间进行选择性杂交所选择的条件。杂交可发生在全部或部分核酸序列分子上。杂交的部分的长度通常至少为15个(例如，20，25，30，40或50)核苷。本领域技术人员应当知道核酸双链(duplex)或杂种的稳定性取决于Tm，而在含钠缓冲液中，Tm是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/l)，或类似的方程)。因此，决定杂种稳定性的洗涤条件的参数为钠离子浓度和温度。为了确认某一分子与一已知的核酸分子是相似的，而不是相同的，可假设1％的不符将会导致Tm降低约1℃。例如，如果认为核酸分子有大于95％的同一性，则最终的洗涤温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域的技术人员将能够轻松地选择合适的杂交条件。在优选的实施方式中，选择的是严格的杂交条件。例如，以下条件可应用于获得严格杂交：基于上述方程，在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt溶液/1.0％SDS中于Tm-5℃的条件下进行杂交，然后在60℃下用0.2xSSC/0.1％SDS洗。适度的严格杂交条件包括在42℃下于3xSSC中洗的步骤。然而应当理解的是，相当的严格度可通过替代缓冲液、盐和温度的使用来获得。另外，还可在如下著作中找到关于杂交条件的其他指导：Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，1989，6.3.1-6.3.6，以及Sambrook et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989，Vol.3。
在此使用的术语“结合蛋白”指特异性地结合到其他物质上的蛋白。在一实施方式中，结合蛋白为抗体或抗体片段。
在此使用的术语“本发明的结合蛋白”包括本发明的抗体或抗体片段。
“适合体内施用的生物相容性形式”是指其疗效超过毒效的被施用的物质的形式。
在此使用的术语“癌症”包括可被本发明的蛋白，优选为本发明的抗体或抗体片段结合的癌症。
在此使用的术语“CD44”指由含共19个外显子的单一基因编码的CD44分子家族。这里有10个变异性外显子。可变区内的选择性拼接导致许多不同的CD44变异体的产生(见图17)。术语“CD44E”也被称作CD44v8-10，是指CD44的上皮变异体。除外显子1-5和16-19外，CD44E还包括变异性外显子8-10。术语“CD44的v8外显子”指CD44的变异性外显子8。术语“CD44E的5-v8界面”指CD44E中外显子5与变异性外显子8连接的区域。这是一连续的序列，其包括了CD44E的部分外显子5的区域以及部分变异性外显子8的区域。
在此使用的“保守氨基酸取代”是指在该氨基酸中，一氨基酸残基被另一氨基酸残基所取代，而不尚失蛋白所期望的功能。
术语“控制释放系统”指本发明的免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂可以可控的方式给予。例如，用微型泵可直接将可控的剂量送至肿瘤区域，从而能够很好地调节药物组合物送药的时机和浓度(例如参见Goodson，1984，inMedical Applications of Controlled Release，vol.2，pp.115-138)。
在此使用的术语“直接给予”是指免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂可在肿瘤内、血管内和肿瘤周围给予，而无任何限制。例如，免疫偶联物可通过一次或多次直接注射到肿瘤中、通过连续或间断地灌注入肿瘤中、通过引入免疫偶联物蓄库、通过在肿瘤中引入一缓慢释放装置、通过在肿瘤中引入一缓慢释放的配方，和/或通过直接施用到肿瘤上来进行给予。“在肿瘤中”施用包括将免疫偶联物和/或其他癌症治疗剂引入肿瘤区域，或者引入基本上直接流入肿瘤区域的血管或淋巴管中。
在此用的术语“有效量”是指为获得预期的结果，在一段时间内和一定剂量下产生效果的量。免疫偶联物的量取决于动物的疾病状态、年龄、性别、体重。可对剂量的选取进行调整，以期获得最佳治疗反应。例如，可将一剂分为若干次每日施用，或者可以根据治疗情况的紧迫度而适当地降低剂量。
在此用的术语“重链互补决定区”指在抗体分子的重链可变区域内的超级可变区(regions of hypervariability)。重链可变区有3个互补决定区，从氨基端到羧基端，分别是重链互补决定区1、重链互补决定区2和重链互补决定区3。
在此用的术语“重链可变区”指重链的可变区。
在此用的术语“本发明的免疫偶联物”包含(1)结合蛋白，优选为本发明的抗体或抗体片段，其附于(2)效应物分子上。效应物分子可以是任意的希望递达癌症细胞的分子，其包括但不限于(i)一标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一癌症治疗试剂，其或者是毒害细胞、抑制细胞生长，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力的毒素。
在此使用的术语“分离的核酸序列”是指在用重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养介质时的核酸，或在用化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质时的核酸。另外，分离的核酸基本上也没有那些天然侧接于核酸(即位于核酸5′和3′端的序列)的序列，而由此衍生出该分离的核酸。术语“核酸”意在包括DNA和RNA，可以是双链的或单链的。
在此使用的术语“分离的蛋白”，例如轻链互补区1，2和3、重链互补区1，2和3、轻链可变区、重链可变区和本发明的结合蛋白，是指在用重组DNA技术产生时基本上没有细胞物质或培养介质时的蛋白，或在用化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质时的蛋白。
在此用的术语“轻链互补决定区”指在抗体分子的轻链可变区域内的超级可变区。轻链可变区有3个互补决定区，从氨基端到羧基端，分别是轻链互补决定区1、轻链互补决定区2和轻链互补决定区3。
在此用的术语“轻链可变区”指轻链的可变区。
在此用的术语“修饰过的bouganin”指具有在PCT/CA2005/000410和美国专利申请No.11.084,080中描述的具有减少的倾向以激活免疫反应的修饰过的bouganin。在一个例子中，修饰过的bouganin具有氨基酸序列(SEQID NO：17)：
YNTVSFNLGEAYEYPTFIQDLRNELAKGTPVCQLPVTLQTIADDKRF
VLVDITTTSKKTVKVAIDVTDVYVVGYQDKWDGKDRAVFLDKVPT
VATSKLFPGVTNRVTLTFDGSYQKLVNAAKADRKALELGVNKLEFS
IEAIHGKTINGQEAAKFFLIVIQMVSEAARFKYIETEVVDRGLYGSFK
PNFKVLNLENNWGDISDAIHKSSPQCTTINPALQLISPSNDPWVVNK
VSQISPDMGILKFKSSK.
在此用的术语“核酸序列”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)键连组成的核苷(nucleoside)或核苷酸(nucleotide)单体的序列。该术语也包括含有非天然发生的单体或其部分的修饰过的或取代过的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并可包含天然碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列也可含修饰的碱基。这些修饰的碱基的例子包括含氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
在此用的术语“序列同源性”指两个多肽序列中的序列相同的百分比例。为确定两个多肽序列中的序列相同的百分比例，需将该两个序列的氨基酸序列进行排列，优选用Clustal W运算法则(Thompson，JD，Higgins DG，Gibson TJ，1994，Nucleic Acids Res.22(22)：4673-4680)，及BLOSUM 62记分矩阵(Henikoff S.and Henikoff J.G.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)，以及空位开放罚分为10，空位延伸罚分(gap extension penalty)为0.1，这样就获得了两序列中最高等级的匹配，其中在该两序列中之一的至少50％的总长度包括在排列之中。另一可用于排列序列的方法是Needleman和Wunsch排列算法(J.Mol.Biol.，1970，48：443)，其由Smith和Waterman加以修改(Adv.Appl.Math.，1981，2：482)，从而就获得了两序列中最高等级的匹配，并确定了两序列中相同的氨基酸的数目。其他计算两氨基酸序列的等同百分比的方法包括通常有如在Carillo和Lipton(SIAM J.Applied Math.，1988，48：1073)中描述的方法，以及在Computational Molecular Biology，Lesk，e.d.Oxford University Press，New York，1988，Biocomputing：Informatics andGenomics Projects中描述的方法。通常，计算机程序会被用于这些计算。可用于此的计算机程序包括但不限于GCG(Devereux et al.，Nucleic Acids Res.，1984，12：387)BLASTP，BLASTN和FASTA(Altschul et al.，J.Molec.Biol.，1990：215：403)。
在此用的术语“治疗癌症”指抑制癌细胞的复制，抑制癌细胞的扩散(转移)，抑制肿瘤的生长，减少癌细胞的数量或肿瘤生长，降低癌症的恶性程度(例如，增加的癌细胞分化)，或改善与癌症相关的症状。
在此用的术语“变异体”包括本发明的氨基酸和核酸序列的经修饰的或化学等同物，其与本发明的蛋白和核酸分子以基本相同的方式执行基本相同的功能。例如，本发明的蛋白的变异体包括但不限于：保守氨基酸取代。本发明的蛋白的变异体还包括本发明的蛋白的添加和缺失。
在此用的术语“甲胎蛋白变异体”包括甲胎蛋白的变异体，例如包含氨基酸序列SEQ ID NO：14，15或16的蛋白；或者是甲胎蛋白的截断版本，其分子量为48-54kDa，等电位点在5.1-5.4之间。
(B)本发明的蛋白和核酸
(i)轻链和重链互补决定区以及轻链和重链可变区
本发明提供分离的轻链互补决定区1，其包含氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)。本发明还提供分离的轻链互补决定区2，其包含氨基酸序列EDTKRPS(SEQ ID NO：2)。此外，本发明还提供分离的轻链互补决定区3，其包含氨基酸序列QAWDSRTEI(SEQ ID NO：3)。
本发明提供分离的轻链互补决定区1，其包含氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)。本发明还提供分离的轻链互补决定区2，其包含氨基酸序列YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQ ID NO：5)。此外，本发明还提供分离的轻链互补决定区3，其包含氨基酸序列KYCGGDCRSGFDI(SEQ ID NO：6)。
本发明提供分离的轻链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)，EDTKRPS(SEQ ID NO：2)和QAWDSRTEI(SEQ ID NO：3)；以及分离的重链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)，YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQ ID NO：5)和KYCGGDCRSGFDI(SEQ ID NO：6)。
本发明还包括CDR序列的变异体，其可结合到相同的由上述CDR序列识别的抗原决定区或抗原上。
本发明的其他方面还有分离的轻链可变区，其包括本发明的轻链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：1-3)；以及重链可变区，其包括本发明的重链互补决定区1，2和/或3(SEQ ID NOS：4-6)。在一实施方式中，轻链可变区包括示于图1中的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，而重链可变区包括示于图2中的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。
本发明还包括分离的轻链可变区和重链可变区的变异体，它们能够可结合到相同的由上述分离的轻链可变区和分离的重链可变区序列识别的抗原决定区或抗原上。
本领于的技术人员应当理解，本发明包括氨基酸序列SEQ ID NOS：1-6，7和9，包括本发明揭露的序列的化学等同物的变异体。这样的等同物包括与在此揭露的特异性蛋白以基本相同的方式实现基本相同的功能的蛋白。CDR序列的功能变异体将能够结合到由天然CDR序列识别的抗体或抗原决定区。例如，等同物包括但不限于保守氨基酸取代。
在一个实施方式中，轻链互补决定区1，2和3及重链互补决定区1，2和3的变异氨基酸序列至少有50％，优选为至少60％，更优选为至少70％，最优选为至少80％，进一步更优选为至少90％的序列分别与SEQ ID NOS：1-6等同。
在另一实施方式中，轻链可变区及重链可变区的变异氨基酸序列至少有50％，优选为至少60％，更优选为至少70％，最优选为至少80％，进一步更优选为至少90％的序列分别与SEQ ID NOS：7和9等同。
本发明还提供编码本发明的轻链可变区的分离的核酸序列，以及编码本发明的重链可变区的分离的核酸序列。在一实施方式中，轻链可变区包含示于图1中的核酸序列(SEQ ID NO：8)。在另一实施方式中，重链可变区包含示于图2中的核酸序列(SEQ ID NO：10)。本发明还包括编码本发明的轻链可变区和重链可变区的核酸序列的变异体。例如，变异体包括至少在适当的严格杂交条件下，杂交到编码本发明的轻链可变区和重链可变区的核酸序列。
本发明还提供编码轻链互补决定区1，2和/或3的分离的核酸序列，其分别包括氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)，EDTKRPS(SEQ IDNO：2)和QAWDSRTEI(SEQ ID NO：3)；以及编码重链互补决定区1，2和/或3的分离的核酸序列，其分别包括氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)，YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQ ID NO：5)和KYCGGDCRSGFDI(SEQ IDNO：6)。本发明还包括编码以上讨论的CDR序列的变异体的分离的核酸。编码本发明的CDR序列的变异体的核酸包括至少在适当的严格杂交条件下，杂交到编码示于SEQ ID NOS：1-6中的氨基酸序列的CDR序列的核酸序列。
(ii)结合蛋白
本发明的一方面是结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其包括至少一本发明的轻链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：1-3)和/或至少一本发明的重链互补决定区(即一个或多个SEQ ID NOS：4-6)。这样的结合蛋白可通常被称作“本发明的结合蛋白”，或更适意地称之为“本发明的抗体或抗体片段”。
在一实施方式中，结合蛋白，更适意地为抗体或抗体片段，包括轻链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列SGDNLGNKYVC(SEQ ID NO：1)，EDTKRPS(SEQ ID NO：2)和QAWDSRTEI(SQ ID NO：3)；以及重链互补决定区1，2和3，其分别包含氨基酸序列GDEYYWS(SEQ ID NO：4)，YMSYRGSSYYSPSLQS(SEQ ID NO：5)和KYCGGDCRSGFDI(SEQ IDNO：6)。本发明还提供结合蛋白，更适意地为抗体或抗体片段，其包括本发明的轻链可变区和/或本发明的重链可变区。
本领域的技术人员应当理解，本发明包括上述揭露的特异性结合蛋白的变异体，其包括上述揭露的序列的化学等同物。这样的等同物与上述揭露的结合蛋白以基本相同的方式实现基本相同的功能。结合蛋白的功能变异体将结合到含CD44E的5-v8界面、CD44的v8外显子、氨基酸序列ATNMDSSHSIT、氨基酸序列SEQ ID NOS：14，15或16的蛋白上，或将结合到具有分子量在47-53kDa之间且等电点在5.2-5.5之间的蛋白上；具有分子量在48-54kDa之间且等电点在5.1-5.4之间的蛋白、CD44E，或甲胎蛋白或其变异体上。
如上所述，本发明的发明人们确定出结合到本发明结合蛋白之上的抗原。特别的，他们还指示出本发明的结合蛋白结合到CD44E的细胞外区域。此外，他们还指出本发明的结合蛋白结合到AFP或其变异体上。
很重要的一点是认识到CD44分子具有高度的N-和O-糖基化以及加成软骨素硫酸盐(chondroitin sulfate)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)的倾向。然而，这些翻译后修饰的模式是不确定的，且看似为细胞特异性的，可潜在地影响CD44结合到HA或其他细胞外分子的能力。翻译后修饰的可变模式与CD44抗体单克隆抗体的制备尤其相关，这是由于尽管分子的一级机构与用于产生抗体的抗原一样，但已显示出抗体的结合受到了这些修饰的影响(Matzuki et al.Cancer Res 63：8278-83，2003；Martegani et al.Amer J Pathol154(1)：291-300，1999)。由于其糖基化模式可能会与肿瘤细胞的不同，这也限制了重组CD44作为免疫原的使用。因此，本发明的结合蛋白的独特之处就在于它识别存在于人肿瘤细胞中的CD44的形式。
因此，本发明提供了本发明的结合蛋白，其结合到含CD44E的5-v8界面、CD44的v8外显子或氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白上。本发明还提供了本发明的结合蛋白，其结合到CD44E；甲胎蛋白；分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间、优选为5.4的蛋白；分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白；或者含有氨基酸序列是AFP的107到487(SEQ ID NO：14)，AFP的107到590(SEQ ID NO：15)或AFP的107到609(SEQ ID NO：16)的蛋白。本发明还提供本发明的结合蛋白，其结合到含SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44或45，以及分子量在47-53kDa之间、等电点在5.2-5.5之间的蛋白；或含SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74或75，以及分子量在48-54kDa之间、等电点在5.1-5.4之间的蛋白。
本发明还包括结合到氨基酸序列ATNMDSSHSIT的结合蛋白。
在一些实施方式中，抗体或抗体片段包含所有或部分重链恒定区，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE，IgM或IgD恒定区。优选的，重链恒定区是IgG1重链恒定区。再有，抗体或抗体片段可包含所有或部分κ(kappa)轻链恒定区或λ(lambda)轻链恒定区。优选的是，轻链恒定区是λ轻链恒定区。
为产生源自人的单克隆抗体，产生抗体的细胞(淋巴细胞)可从患癌症人中获得，且通过标准的体细胞融合程序与骨髓瘤细胞融合，从而固定这些细胞以产生杂种细胞(hybridoma cells)。这些技术已被习知(例如，首先由Kohler和Milstein提出的杂种细胞技术(Nature  256：495-497(1975))，以及其他的技术，例如人B-细胞杂种细胞技术(Kozbor et al.，Immunol.Today  4：72(1983))，EBV-杂种细胞技术以产生人单克隆抗体(Cole et al.，Methods Enzymol，121：140-67(1986))，和筛选组合的抗体文库(Huse et al.，Science  246：1275(1989))。另外的产生人单克隆抗体的例子描述于WO/9947929中。在另一例子中，可使用记载于Dan等(J Neurosurgery 76：660-69，1992)中的一种类似骨髓瘤融合模式。杂种细胞可经免疫化学筛选以产生与癌细胞的特异性反应的抗体，而且该单克隆抗体可以被分离。
对特殊的抗原或分子，如癌细胞上的抗原或分子有反应性的特异性抗体，或抗体片段也可通过筛选编码免疫球蛋白基因或其部分的表达文库，并表达于具有细胞表面成分的细菌来产生。例如，完整的Fab片段，VH区域和FV区域可使用抗菌素表达文库来表达在细菌中(例如，参见Ward et al.，Nature  341：544-546(1989)；Huse et al.，Science  246：1275-1281(1989)；和McCafferty et al.，Nature  348：552-554(1990))。
本发明包括所有的与本发明的抗体或抗体片段结合到相同抗原的抗体和抗体片段。本领域技术人员应当理解结合测试可用于发现具有与本发明的抗体或抗体片段相同的结合特异性的其他抗体和抗体片段。如以下所示例的，竞争结合分析可用于发现这样的其他抗体。
在使用流式细胞仪进行竞争分析前，先确定本发明的抗体的最低浓度(Ab1)，在该浓度下，抗体对固定数量的肿瘤细胞(例如，对应于VB1-008的A-375细胞)产生最大的结合。从呈指数增长的培养基(cultures)中收集总计为106个细胞，并与各种浓度的抗体于4℃下培养1小时。细胞经洗涤并与适当的探测抗体于4℃下再培养1小时。洗涤后，细胞用流式细胞仪进行分析。对每一测试抗体，以平均荧光对抗体浓度作图，由数据得到饱和曲线。
对于竞争分析，肿瘤细胞按上述进行制备，并用固定浓度的抗体(Ab1)一式两份进行处理。固定浓度是抗体对按上述确定的固定数量的肿瘤细胞产生最大的结合的最低浓度。在加入Ab1后立即向每个试管中加入不同浓度的潜在抑制抗体(Ab2)，并将混合物在4℃下培养1小时。抑制百分比以及随最大平均荧光强度的变化均通过从各测试样品(Ab1+Ab2)的平均荧光读数中扣除背景荧光(PBS-5％FCS)而计算得到。然后，结果除以Ab1的平均荧光(最大结合)与背景(如下)的差。抑制百分比再乘以100后得到。用重复点的平均值及它们的相对误差对抗体浓度作图。以下公式用于计算抑制百分比：
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MF背景)/(MFAb1-MF背景)]×100
其中，PI＝抑制百分比；MF(b1+Ab2)＝由Ab1+Ab2混合物测得的平均荧光；MF背景＝以PBS-5％FCS得到的背景平均荧光。
从而，本发明提供能结合到肿瘤细胞上抗原的结合蛋白，该结合蛋白可通过如下方法鉴别，该方法包括：
(1)用最小浓度的本发明的结合蛋白与固定数量的肿瘤细胞一起培养，优选的是采用产生对固定数量的肿瘤细胞的最大结合的抗体或抗体片段(Ab1)，并测量Ab1的平均荧光(MFAb1)；
(2)通过向Ab1和肿瘤细胞中加入Ab2，测试试验结合蛋白(Ab2)两个或更多浓度，并测量平均荧光(MF(Ab1+Ab2))；
(3)测量背景荧光强度(MF背景)；
(4)计算PI，其中，
           PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MF背景)/(MFAb1-MF背景)]×100；以及
(5)将PI与对照物的PI值进行比较；
其中，与对照物的PI有统计上的显著不同的PI表明试验结合蛋白能够结合到肿瘤细胞的抗原上。
竞争结合分析也能用于肽，优选为由SEQ ID NO：28定义的肽。与以上描述的方法类似的是，在进行竞争结合分析之前，先确定对固定数量的肿瘤细胞产生最大的结合的试验结合蛋白(Ab2)的最低浓度。
因此，本发明的一实施方式提供了能结合到肿瘤细胞上抗原的结合蛋白，其中，该结合蛋白能通过如下方法鉴别，该方法包括：
(1)用最小浓度的试验结合蛋白(Ab2)与固定数量的肿瘤细胞一起培养，该试验结合蛋白(Ab2)产生对固定数量的肿瘤细胞的最大结合，并测量Ab2的平均荧光(MFAb2)；
(2)通过培养过量摩尔的SEQ ID NO：28定义的肽和所述的最低浓度的试验结合蛋白(Ab2)，制备肽和Ab2的混合物；
(3)将所述混合物加入到肿瘤细胞中，并测量平均荧光(MF(Ab2+肽))；
(4)测量背景荧光强度(MF背景)；
(5)计算PI，其中，
     PI＝[(MF(Ab2+肽)-MF背景)/(MFAb2-MF背景)]×100；以及
(6)将PI与对照物的PI值进行比较；
其中，与对照物的PI有统计上的显著不同的PI表明试验结合蛋白能够结合到肿瘤细胞的抗原上。
本领域技术人员应当知道，通过增加其对CD44E和AFP的亲和力或通过选择结合到一抗原，亲和力成熟技术(affinity maturation techniques)可用于修饰本发明的结合蛋白或免疫偶联物。后者可导致2种优先结合到AFP或CD44E的分离的抗体或免疫偶联物的发展。
通常使用两种策略来增加抗体的结合亲和力。一种方法应用到Ab-Ag复合物的晶体结构的分辨率来识别抗原结合中涉及的关键残基(Davies D.R.，Cohen G.H.1996.Interactions of protein antigens with antibodies.Proc Natl.Acad.Sci.U.S A.93，7-12)。接着，这些残基可发生突变而增加交互作用。  另一方法是模仿体内的抗原刺激，其驱动由B细胞产生的免疫球蛋白的亲和成熟。在免疫反应的成熟过程中，免疫球蛋白的可变区发生体细胞突变(McHeyzer-Williams M.2003.B-cell signaling mechanism and activation.Fundamental Immunology，Fifth edition，195-225)。此对免疫系统有高度特异性的过程其特征在于在非常高的速率下引入突变点。它仅仅发生在编码可变区的DNA片段中，且不包括保守区域。然后，表达发生了体细胞突变的变异的抗体的B细胞被进行抗原介导的选择，从而选择更高亲和免疫球蛋白。为在体外重复该现象，采用了多种方法通过任意的或有目标的方法来引入突变。任意突变可使用易错PCR、链替换或突变大肠杆菌(E.coli)菌株来引入(Clackson T.Hoogenboom N.R.，Griffiths A.D.and Winter G.1991 Makingantibody fragments using phage display libraries.Nature 352，624-628，HawkinsR.E.，Russell S.J.and Winter G.1992.Selection of phage antibodies by bindingaffinity.Mimicking affinity maturation.J.Mol.Biol.226，889-896，Low N.，Holliger P.and Winter G.1996.Mimicking somatic hypermutation：affinitymaturation of antibodies displayed on bacteriophage using a bacterial mutatorstrain.J Mol.Biol.260，359-368)。由该方法产生了巨大的文库，并通过如核糖体、抗菌素或酵母等的展示技术来选择反应性的克隆。(Min L.(2000).Applications of display technology in protein analysis.Nat.Biotechnol.18，1251-1256)。
CDR的目标突变，特别是轻链和重链的CDR3已展示出其为增加抗体亲和性的有效技术。CDR3的3-4氨基酸段或其被称为“热点”的特定区域是形成突变的标的。据Yang等报道，通过4个CDR残基的突变，抗-HIV gp120Fab片段增加了420倍亲和性(Yang W.P.，Green K.，Pinz-Sweeney S.，BrionesA.T.，Burton D.R.and Barbas C.F.III.1995.CDR walking mutagenesis for theaffinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into picomolar range.J.Mol.Biol.，254，392-403)。在VL CDR3中的突变以及在C6.5 scFv中的VHCDR3的3个突变导致了1230倍的亲和性的增加。(Schier R.，McCall A.，AdamsG.P.，Marshall K.W.，Merrit H.，Yin M.，Crawford R.S.Weiner L.M.，Marks C.and Marks J.D.1996.Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fvby molecular evolution of the complementary determining regions in the center ofthe antibody binding site.J.Mol.Biol.，263，551-567)。
“热点”是体内体细胞超突变发生的序列。(Neuberger M.S and MilsteinC.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。热点序列可被定义为在某些密码子中的一致核苷酸序列。一致序列是四核苷酸，RGYW，其中，R可以是A或G，Y可以是C或T，W可以是A或T(Neuberger M.S andMilstein C.1995.Somatic hypermutation.Curr.Opin.Immunol.7，248-254)。此外，由核苷AGY编码的丝氨酸残基主要存在于可变区域的CDR区，并超过那些由TCN编码的对应于潜在热点序列的残基。(Wagner S.D.，Milstein C.andNeuberger M.S.1995.Codon bias targets mutation.Nature，376，732)。结构分析表明，CDR环，特别是CDR3环对抗原结合贡献最大(Giudicelli V.，ChaumeD.and Lefranc M.P.2004.IMGT/V-QUEST，an integrated software program forimmunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis.Nucleis Acids Res.32，435-440)。因此，本发明每一抗体的重链和轻链的CDR的核苷酸序列均被扫描以检查热点序列和AGY密码子的存在。使用国际ImMunoGen Tics数据库(International ImMunoGen Tics database)，将轻链和重链的CDR区中经确认的热点与重链和轻链的生殖序列进行比较(IMGT，http://imgt.cines.fr/textes/vquest/)(Davies D.R.，Padlan E.A.and Sheriff S.1990.Antibody-antigen complexes.Annu.Rev.Biochem.59，439-473)。若一序列与生殖系相同，则说明体细胞突变未发生；因此，任意突变被引入来模仿发生在体内的体细胞事件。与此相反的是，不同的序列则说明一些体细胞突变已经发生。然而该体内体细胞突变是否为最佳，还有待于决定。编码CDR中埋藏的或保守的氨基酸的热点未被诱变。这些残基通常对整个结构都是至关重要的，且由于它们被埋藏而不太可能与抗原发生作用。此外，序列可以与生殖系序列中预测有体细胞突变常发生之处相比较(Tomlinson I.M.，Cox J.P.L.，Gherardi E.，Lesk A.M.and Chotia C.1995.The structural repertoire of the humanVldomain.EMBO J.14，4628-4638，Tomlinson I.M.，Walter G.，Jones P.T.，DearP.H.，Sonnhammer E.L.L.and Winter G.1996.The imprint of somatichypermutation on the repertoire of human germline V genes.J.Mol.Biol.256，813-817)。类似的方法应用于BL22 scFv的亲和力成熟。引入重链CDR3的点突变导致5-10倍在各种CD22阳性细胞系的结合活性的增加(Salvatore G.，Beers R.，Margulies I.，Kreitman R.J.and Pastan I.2002.Improved cytotoxicactivity toward cell lines and fresh leukemia cells of a mutant anti-CD22immunotoxin obtained by antibody phage display.Clinical Cancer research，8，995-1002)。CDR1和CDR2环中的各种氨基酸的突变也产生了亲和力提高在3-7倍范围内的突变体(Ho M.，Kreitman J.，Onda M.and Pastan I.2005.In vitroantibody evolution targeting germline hot spots to increase activity of ananti-CD22 immunotoxin.J.Biol.Chem.，280，607-617)。
在通过任意的或有目标的方法引入突变后，抗体得以表达并评价其功能。例如，可基于结合进行功能性筛选。一旦功能得以评估，即可用已知方法进行所选抗体的DNA序列分析。
在其他的实施方式中，锚固周质表达(anchored periplasmic expression)(APEx)方法被用于本发明的结合蛋白或免疫偶联物的亲和力成熟，该方法描述于Harvey，B等中(PNAS 2004 June 22；101(25)：9193-8)。
从而，本发明包括本发明的结合蛋白，该结合蛋白经亲和力成熟而增加结合蛋白对CD44E和AFP或它们的变异体的亲和力，或选择对CD44E和AFP或它们的变异体有亲和力的结合蛋白。
本发明还提供了包含本发明的结合蛋白的组合物，优选的是含抗体和抗体片段，以及药学上可接收的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
(C)免疫偶联物
本发明也包括免疫偶联物，其包括：(1)本发明的的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)效应分子上。在一实施方式中，本发明的结合蛋白结合到肿瘤细胞之中或之上的抗原或分子上。
抗原可是含CD44E的5-v8界面的蛋白；含CD44的v8外显子的蛋白；CD44E；含氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白；甲胎蛋白或其变异体；具有分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间，优选为5.4的蛋白上；具有分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间，优选为5.2的的蛋白；或者含有氨基酸序列是AFP的107到487(SEQ ID NO：14)，AFP的107到590(SEQ ID NO：15)或AFP的107到609(SEQ ID NO：16)的蛋白。在另一实施例中，抗原是氨基酸序列含SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44或45和分子量在47-53kDa之间、等电点在5.2-5.5之间的蛋白；或含氨基酸序列SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74或75和分子量在48-54kDa之间、等电点在5.1-5.4之间的蛋白。
在一优选的实施方式中，效应物分子是(i)一标记物，其可直接或间接地生成可检测的信号，或者是(ii)一癌症治疗试剂，其或者是毒害细胞、抑制细胞生长，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力。这样的免疫偶联物在此通常被成为“本发明的免疫偶联物”。
在本发明的实施例中，效应物分子是癌症治疗试剂。癌症治疗试剂优选是毒素，其或者是毒害细胞、抑制细胞生长，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力。因此，本发明的一方面是涉及免疫偶联物，其包含：(1)本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)癌症治疗试剂上，例如毒素之上。
在另一实施方式中，免疫偶联物被内化，且癌症治疗试剂为毒素，其阻碍了细胞的蛋白合成，从而导致细胞死亡。重要的是，由于多数的正常细胞并不普遍表达存在于癌症细胞上的抗原，它们不能结合及内化免疫偶联物，并受到保护而不被毒素或其他癌症治疗试剂所毒杀。
可在本发明的免疫偶联物中使用各种效应物分子，而许多这样的效应物分子是细胞那活化的分子。因此，在本发明的一实施方式中，免疫偶联物被癌症细胞内化。
在优选的实施方式中，效应物分子是癌症治疗试剂，更优选的是包含具有核糖体失活活性多肽的毒素，其包括但不限于：多花白树素(gelonin)、bouganin、皂草毒素蛋白(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A链、bryodin、白喉毒素(diphtheria toxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假单细胞外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)和它们的变异体。当蛋白是核糖体失活蛋白时，免疫偶联物必须在结合到癌细胞时被内化，从而毒素对细胞产生毒害作用。因此，在本发明的一实施方式中，效应物分子是毒素，免疫偶联物被癌症细胞内化。
在本发明的一实施方式中，毒素是bouganin或假单细胞外毒素A，以及它们的变异体。在另一实施方式中，毒素是经修饰的bouganin，或假单细胞外毒素A的截去形式，其由氨基酸252-608组成。
本发明包括的免疫偶联物含有由核酸序列SEQ ID NO：11(图20)编码的蛋白。本发明还包括了含氨基酸序列SEQ ID NO：12 and 13(图21)的免疫偶联物。
在其他的非限制性实施方式中，癌症治疗试剂包含破坏DNA的试剂。因此，癌症治疗试剂可以不局限于烯二炔类(例如刺孢霉素和esperamicin)以及非烯二炔类小分子试剂(例如博来霉素(bleomycin)、methidiumpropyl-EDTA-Fe(II))。可用于本发明中的其他癌症治疗试剂包括但不限于：正定霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、远端霉素A(distamycin A)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素C(mitomycin C)，海鞘素(ecteinascidins)、duocarmycin/CC-1065以及博来霉素/培洛霉素(pepleomycin)。
在其他非限制性实施方式中，癌症治疗试剂包含破坏微管蛋白的试剂。这样的试剂可包括但不限于：力索新(rhizoxin)/美登素(maytansine)、紫杉醇(paclitaxel)、长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、auristatin海兔毒素10MMAE和peloruside A。
在其他的非限制性实施例中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗部分可包含烷基化试剂，其包括但不限于：Asaley NSC 167780、AZQ NSC 182986、BCNU NSC 409962、白消安(Busulfan)NSC 750、羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)NSC 271674、CBDCA NSC 241240、CCNU NSC79037、CHIP NSC 256927、苯丁酸氮芥(chlorambucil)NSC 3088、氯脲霉素(chlorozotocin)NSC 178248、顺式-铂(cis-platinum)NSC 119875、克罗米松(clomesone)NSC 338947、氰基吗啉代阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)NSC 357704、cyclodisone NSC 348948、二去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)NSC 132313、fluorodopan NSC 73754、hepsulfamNSC 329680、羟胺硫蒽酮(hycanthone)NSC 142982、美法仑(melphalan)NSC 8806、甲基CCNU NSC 95441、丝裂霉素C NSC 26980、米托唑酰胺(mitozolamide)NSC 353451、氮芥(nitrogen mustard)NSC 762、PCNU NSC95466、哌嗪NSC 344007、二酮哌嗪(piperazinedione)NSC 135758、哌泊溴烷(pipobroman)NSC 25154、甲基丝裂霉素(porfiromycin)NSC 56410、螺旋乙内酰脲芥(spirohydantoin mustard)NSC 172112、特洛西酮(teroxirone)NSC 296934、tetraplatin NSC 363812、噻替派(thio-tepa)NSC 6396、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)NSC 9706、尿嘧啶氮芥(uracil nitrogenmustard)NSC 34462和Yoshi-864 NSC 102627。
在另一非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗部分可包含抗有丝分裂试剂，其包括但不限于：allocolchicine NSC 406042、软海绵素(Halichondrin)B NSC 609395、秋水仙碱(colchicine)NSC 757、秋水仙碱衍生物NSC 33410、海兔毒素10 NSC 376128(NG-auristatin衍生的)、美登素(maytansine)NSC 153858、力索新(rhizoxin)NSC 332598、紫杉醇(taxol)NSC 125973、紫杉醇衍生物NSC 608832、硫代秋水仙碱(thiocolchicine)NSC361792、三苯甲游基半胱氨酸(trityl cysteine)NSC 83265、硫酸长春碱(vinblastine sulfate)NSC 49842和硫酸新长春碱(vincristine sulfate)NSC67574。
在另一非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗部分可包含拓扑异构酶I抑制剂，其包括但不限于：camptothecin NSC 94600，喜树碱(camptothecin)、钠盐NSC 100880、氨基喜树碱(aminocamptothecin)NSC603071、喜树碱衍生物NSC 95382、喜树碱衍生物NSC 107124、喜树碱衍生物NSC 643833、喜树碱衍生物NSC 629971、喜树碱衍生物NSC 295500、喜树碱衍生物NSC 249910、喜树碱衍生物NSC 606985、喜树碱衍生物NSC374028、喜树碱衍生物NSC 176323、喜树碱衍生物NSC 295501、喜树碱衍生物NSC 606172、喜树碱衍生物NSC 606173、喜树碱衍生物NSC 610458、喜树碱衍生物NSC 618939、喜树碱衍生物NSC 610457、喜树碱衍生物NSC610459、喜树碱衍生物NSC 606499、喜树碱衍生物NSC 610456、喜树碱衍生物NSC 364830、喜树碱衍生物NSC 606497和吗啉代阿霉素(morpholinodoxorubicin)NSC 354646。
在另一非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗部分可包含拓扑异构酶II抑制剂，其包括但不限于：阿霉素(doxorubicin)NSC123127、氨萘非特(amonafide)NSC 308847、m-AMSA NSC 249992、蒽吡唑类(anthrapyrazole)衍生物NSC 355644、吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)NSC 366140、盐酸比生群(bisantrene HCL)NSC 337766、正定霉素(daunorubicin)NSC 82151、脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin)NSC 267469、米托蒽醌(mitoxantrone)NSC 301739、美诺立尔(menogaril)NSC 269148、N，N-联卞基正定霉素NSC 268242、oxanthrazole NSC 349174、柔红脖(rubidazone)NSC 164011、VM-26 NSC 122819和VP-16 NSC 141540。
在另一非限制性实施方式中，本发明的免疫偶联物的癌症治疗部分可包含RNA或DNA抗代谢物，其包括但不限于：L-阿拉诺新(alanosine)NSC153353、5-氮杂胞苷(azacytidine)NSC 102816、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)NSC 19893、阿西维辛(acivicin)NSC 163501、氨基喋呤(aminopterin)衍生物NSC 132483、氨基喋呤衍生物NSC 184692、氨基喋呤衍生物NSC 134033、an antifol NSC 633713、an antifol NSC 623017、Baker′s soluble antifol NSC139105、二氯烯丙基甲花醌(dichlorallyl lawsone)NSC 126771、布利喹啉(brequinar)NSC 368390、呋喃氟脲嘧啶(ftorafur)(前体药物(pro-drug))NSC148958、5，6-二氢-5-氮杂胞嘧啶核苷NSC 264880、甲氨蝶呤(methotrexate)NSC 740、甲氨蝶呤衍生物NSC 174121、N-(磷乙酰基)-L-天冬氨酸酯(PALA)NSC 224131、吡唑呋喃菌素(pyrazofurin)NSC 143095、三甲曲沙(trimetrexate)NSC 352122、3-HP NSC 95678、2′-脱氧-5-氟尿嘧啶NSC 27640、5-HP NSC107392、α-TGDR NSC 71851、甘氨阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)NSC303812、ara-C NSC 63878、5-氮-2′-脱氧胞苷NSC 127716、β-TGDR NSC 71261、环胞苷NSC 145668、胍唑(guanazole)NSC 1895、羟基脲NSC 32065、次黄嘌呤核苷甘油二醛(inosine glycodialdehyde)NSC 118994、macbecin II NSC330500、吡唑啉咪唑(pyrazoloimidazole)NSC 51143、硫鸟嘌呤NSC 752和巯基嘌呤(thiopurine)NSC 755。
本发明进一步提供了免疫偶联物，其包含：(i)本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，其附于(2)效应分子上，该效应分子可为直接或间接地生成可检测的信号的标记物。这些免疫偶联物可用于研究或诊断，例如用于癌症的体内探测。标记物优选为能够直接或间接地生成可检测的信号。例如，标记物可是不透射线的或是放射线同位素，例如，3H，14C，32P，35S，123I，125I，131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，例如荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)或荧光素(luciferin)；酶，例如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)或山葵过氧化酶(horseradish peroxidase)；成像试剂；或金属离子。
在另一实施方式中，免疫偶联物可被间接检测到。例如，对免疫偶联物有特异性的第二抗体，且含有可用于检测免疫偶联物的可探测的标记物。
本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，可通过任意能将该结合蛋白与效应物分子关联或连接的方法而“附于”效应物分子之上。例如，结合蛋白可通过化学或重组的方式而附于效应物分子上。用于制备融合物或偶联物的化学方法已为本领域所知，其可用于制备免疫偶联物。用于偶联结合蛋白和效应物分子的方法必须能够将结合蛋白连接到效应物分子上，而不会影响结合蛋白结合到癌细胞上抗原的能力。
在一实施方式中，结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，以及效应物分子均是蛋白且可使用习知方法进行偶联。有几百中用于偶联两蛋白的偶联剂。(例如，见“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”.1991，Shans Wong，CRC Press，Ann Arbor)。通常，偶联剂的选择是基于在结合蛋白上或可被插入到结合蛋白上(优选为抗体或抗体片段，和/或效应物分子)的反应性官能团。此外，如果有没有反应性基团，则可使用光活化的偶联剂。在某些情况下，需要在结合蛋白，优选为抗体或抗体片段和效应物分子之间加入一间隔区(spacer)。已知的偶联剂包括同型双官能团偶联剂(homobifunctional agents)：戊二醛(glutaraldehyde)，乙二酸二甲酯(dimethyladipimidate)和双重氮对二胺基联苯(Bis(diazobenzidine))，以及异型官能团偶联剂(heterobifunctionalagents)：间双马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺(m Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)和硫代间双马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺(Sulfo-m Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide)。
也可使用重组DNA技术来制备结合蛋白-效应物分子蛋白的融合物。在此，编码结合蛋白的DNA序列融合到编码效应物分子的DNA序列中，产生嵌合(chimeric)DNA分子。嵌合DNA序列被转移到表达融合蛋白的宿主细胞中。融合蛋白可从细胞培养基中获得，并用常规技术进行纯化。
将作为标记物的效应物分子附在结合蛋白上的方法包括描述于以下文献中的方法：Hunter，et al.，Nature 144：945(1962)；David，et al.，Biochemistry13：1014(1974)；Pain，et al.，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；Nygren，J.Histochem.and Cytochem.30：407(1982)；Wensel and Meares，Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy，Elsevier，N.Y.(1983)；andColcher et al.，″Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For TheLocalization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice″，Meth.Enzymol.，121：802-16(1986)。
(D)本发明蛋白的制备
本领域技术人员应当能理解，本发明的蛋白，例如轻链和重链的互补决定区，轻链和重链的可变区，抗体和抗体片段，免疫偶联物，可通过许多方法制备，但最为优选的是采用重组方法进行制备。
因此，本发明的核酸分子可通过已知的方法引入到能确保良好地表达本发明蛋白的适意的表达载体中。可用的表达载体包括但不限于：考斯质粒，质粒，或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒，和腺相关病毒，只要载体与宿主细胞相容即可以使用。表达载体“适合于宿主细胞的转化”，意为表达载体含有本发明的核酸分子以及基于被用于进行表达的宿主细胞而选择的调整序列，其有效地间接到核酸分子上。有效地间接意为核酸通过允许核酸进行表达的方式而连接到调整序列上。
因此，本发明构思出了本发明的重组表达载体，其包括本发明的核酸分子、或其片段，以及用于转录和翻译插入的蛋白序列必不可少的调节序列。
适合的调节序列可有多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物，或昆虫的基因(例如，见描述于以下文献中的调节序列：Goeddel，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))。适合的调节序列的选择取决于如下讨论的所选的宿主细胞，且这可以由本领域技术人员容易地实现。这些调节序列的例子包括：转录启动子和强化因子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括一转录起始信号。此外，基于所选的宿主细胞以及使用的载体，还可向表达载体中引入其他序列，例如复制起点，附加的DNA限制性位点，强化因子，以及可施加诱导转录的序列。
本发明的重组表达载体还可含有选择标记基因，从而便于选择与本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择标记基因是编码蛋白如G418和潮霉素(hygromycin)这类对某些药物产生抵制性的蛋白、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶、或免疫球蛋白或其一部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选为lgG的基因。通过选择标记蛋白例如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰基转移酶或萤火虫荧光素酶浓度的改变来监控选择标记基因的转录。如果选择标记基因编码的蛋白产生对抗生素的抵抗性，如新霉素抵抗性，则转化的细胞可用G418进行挑选。插入了选择标记基因的细胞将存活，而其他的细胞则会死亡。这就使得对本发明的重组表达载体的表达的形象化和分析，特别是使得确定表达和表现型的突变效果成为可能。可以理解的是，选择标记物可从感兴趣的核酸引入到分离的载体上。
重组的表达载体也可以含有对融合部分进行编码的基因，该融合部分提供重组蛋白的增强表达；重组蛋白的增强的溶解性；以及通过在亲和纯化中作为配体而辅助目标重组蛋白的纯化。例如，蛋白水解的分裂位点可被加入到目标重组蛋白中，以允许在纯化融合蛋白后，重组蛋白从融合部分分离。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.，Melbourne，Australia)，pMal(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A到重组蛋白上。
重组表达载体可被引入到宿主细胞中而产生转化的宿主细胞。术语“用转化”，“用转染”，“转化”和“转染”意在包含用习知的许多方法之一，将核酸(例如载体)引入到细胞中。在此使用的术语“转化的宿主细胞”也意在包括能够进行糖基化的细胞，其用本发明的重组表达载体进行了转化。原核细胞可用核酸通过如电穿孔或氯化钙介导的转化而被转化。例如，可用常规方法，如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转化、阳离子脂质体、电穿孔或显微注射等将核酸引入到哺乳动物细胞中。合适的转化方法核转染宿主细胞均可在Sambrook等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))的著作以及其他实验教科书中找到。
合适的宿主细胞包括大量不同的真核宿主细胞和原核宿主细胞。例如，本发明的蛋白可在酵母细胞或哺乳动物细胞中得以表达。其他适用的宿主细胞可在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1991)中找到。此外，本发明的蛋白还可以在原核细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)(Zhang et al.，Science 303(5656)：371-3(2004))中表达。
适合于实现本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于：啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母(Kluyveromyces)属，以及各种曲霉菌属的酵母。用于在酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体包括pYepSec1(Baldari.et al.，Embo J.6：229-234(1987))，pMFa(Kurjan and Herskowitz，Cell 30：933-943(1982))，pJRY88(Schultz et al.，Gene 54：113-123(1987))，和pYES2(Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。酵母和真菌转化的方式已为本领域技术人员所熟知。(见Hinnenet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1929(1978)；Itoh et al.，J.Bacteriology153：163(1983)，和Cullen et al.(BiolTechnology 5：369(1987))。
适合于进行本发明的哺乳动物细胞包括：COS(例如ATCC No.CRL1650或1651)，BHK(例如ATCC No.CRL 6281)，CHO(ATCC No.CCL 61)，HeLa(例如ATCC No.CCL2)，293(ATCC No.1573)和NS-1细胞。适合于直接在哺乳动物细胞中表达的表达载体通常包括启动子(例如，来自病毒性物质，如多瘤病毒、腺病毒2，细胞巨化病毒和猿病毒40)，以及其他的转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.，Nature329：840(1987))和pMT2PC(Kaufman et al.，EMBO J.6：187-195(1987))。
由在此所述的教导，也可以容易地实现启动子、终止子以及向植物、鸟、昆虫细胞中引入适当类型的表达载体的方法。例如，在一实施方式中，本发明的蛋白可以从植物细胞得以表达(见Sinkar et al.，J.Biosci(Bangalore)11：47-58(1987)，该文综述了发根农杆菌载体(Agrobacterium rhizogenes)的使用；另见Zambryski et al.，Genetic Engineering，Principles and Methods，Hollaender and Setlow(eds.)，Vol.VI，pp.253-278，Plenum Press，New York(1984)，该文描述了使用表达载体用于植物细胞，包括PAPS2022，PAPS2023，and PAPS2034)。
适合于进行本发明的昆虫细胞包括源自蚕(Bombyx)、蛾(Trichoplusia)或Spodotera种的细胞和细胞系。可用于培养的昆虫细胞(SF 9 cells)中蛋白表达的虾杆状病毒(Baculovirus)载体包括pAc系列(Smith et al.，Mol.Cell Biol.3：2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow，V.A.，and Summers，M.D.，Virology 170：31-39(1989))。适合表达本发明的重组蛋白的一些虾杆状病毒-昆虫细胞表达系统描述在PCT/US/02442中。
可选择的，本发明的蛋白也可表达在非人基因转录的动物中，如在鼠、兔、羊和猪中(Hammer et al.Nature 315：680-683(1985)；Palmiter et al.Science222：809-814(1983)；Brinster et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438-4442(1985)；Palmiter and Brinster Cell 41：343-345(1985)以及U.S.Patent No.4,736,866)。
本发明的蛋白可通过化学合成法使用蛋白化学中习知的方法，例如固定相合成法制备(Merrifield，J.Am.Chem.Assoc.85：2149-2154(1964)；Frische etal.，J.Pept.Sci.2(4)：212-22(1996))或在均相溶液里合成(Houbenweyl，Methods of Organic Chemistry，ed.E.Wansch，Vol.15 I and II，Thieme，Stuttgart(1987))。
N-端区或C-端区融合蛋白包含与其他分子偶联的蛋白，例如，蛋白可通过重组技术经融合制得。所得的融合蛋白含有融合到在此描述的挑选的蛋白或标记物蛋白之上的本发明的蛋白。本发明的重组蛋白也可由已知技术偶联到其他蛋白上。例如，可使用WO 90/10457中描述的异型双官能含硫的偶联剂、N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫-丙酸)或N-琥珀酰亚胺-5硫代乙酸偶联蛋白。可用于制备融合蛋白或偶联物的蛋白的例子包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白、荷尔蒙、生长因子、外源凝集素、胰岛素、低密脂蛋白、葡萄蛋白、内啡肽、铁传递蛋白、铃蟾肽(bombesin)、脱唾液酸糖原蛋白谷胱甘肽-巯基-转移酶(asialoglycoprotein glutathione-S-transferase(GST))、红血球凝聚素(HA)和截断的myc。
因此，本发明提供了重组表达载体，其包含编码本发明蛋白的核酸序列，例如本发明的轻链和重链互补决定区，轻链和重链可变区，结合蛋白，例如抗体和抗体片段，以及免疫偶联物。再有，本发明提供含有本发明的重组表达载体的宿主细胞。
(E)治疗方法和药物组合物
发明者们已表明本发明的结合蛋白结合到CD44E的细胞外区域，且本发明的结合蛋白被内化。因此，本发明的结合蛋白可用于目标供给有生物活性或与医药相关的试剂，例如成像、放射性或细胞毒素试剂。
发明者们还表明本发明的结合蛋白结合到AFP或其变异体。在循环中可发现以自由形式存在的全长的AFP，且它在结合到其受体时被内化。从而，用本发明的结合蛋白以循环AFP作为目标，也能用作目标药物的递送。
在一实施方式中，本发明提供治疗或预防癌症的方法，该方法包括给予疑似患癌症的病人有效量的本发明的免疫偶联物，其中，效应物分子是癌症治疗试剂。在另一实施方式中，本发明提供有效量的本发明的免疫偶联物在制备治疗和预防癌症的药物中的应用，其中，效应物分子是癌症治疗制剂。此外，本发明提供有效量的本发明的免疫偶联物，包括另外的癌症治疗制剂在制备同时、分开或连续治疗或预防癌症的药物中的应用，其中，效应物分子是癌症治疗制剂。
在本发明的一实施方式中，癌症包括但不限于：子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、胆囊癌、肝癌、头和颈癌、扁平细胞癌、胃肠癌、乳癌(例如恶性肿瘤、输送管、小叶和乳头)、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病(例如急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)、脑癌、神经母细胞瘤、肉瘤、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫内膜癌、质浆细胞瘤、淋巴瘤和黑素瘤。在一优选的实施方式中，癌症包括但不限于：膀胱癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、子宫癌和头和颈癌。
本发明的免疫偶联物的选择性抑制或破坏癌细胞的能力可通过使用癌细胞系在体外容易地进行测试。本发明的免疫偶联物的选择抑制效果可通过如展示对癌细胞的细胞繁殖的选择性抑制性来确定。
毒性也可基于细胞生存能力来测量，例如，癌症和正常细胞培养基在暴露于免疫偶联物时的存活度可进行比较。细胞生存能力可借由已知的技术，如台盼蓝排除法(trypan blue exclusion assays)进行评价。
在另一例子中，可使用许多模型来测试本发明的免疫偶联物的效力。Thompson，E.W.等(Breast Cancer Res.Treatment 31：357-370(1994))描述了一种模型，其通过测量肿瘤细胞介导的细胞外基质的蛋白水解和肿瘤细胞对重构基底膜(胶原质、层粘蛋白、纤维连接蛋白、Matrigel或凝胶)的入侵，来确定人乳癌细胞在体外的入侵性。其他的适用的癌细胞模型包括培养的卵巢腺癌细胞(Young，T.N.et al.Gynecol.Oncol.62：89-99(1996)；Moore，D.H.etal.Gynecol.Oncol.65：78-82(1997))，人滤泡性甲状腺癌细胞(Demeure，M.J.etal.，World J.Surg.16：770-776(1992))，人黑素瘤(A-2058)和纤维肉瘤(HT-1080)细胞系(Mackay，A.R.et al.Lab.Invest.70：781 783(1994))，以及肺鳞片(HS-24)和腺癌(SB-3)细胞系(Spiess，E.et al.J.Histochem.Cytochem.42：917-929(1994))。体内测试系统涉及植入肿瘤，肿瘤在无胸腺的裸鼠中的生长和转移的测量已被描述(Thompson，E.W.et al.，Breast Cancer Res.Treatment31：357-370(1994)；Shi，Y.E.et al.，Cancer Res.53：1409-1415(1993))。
本发明的免疫偶联物可配入药物组合物中，以适合体内的生物相容形式给予受试者。可向包括人和动物在内的有机生物施予药物。施予治疗活性量的本发明的药物组合物被定义为以一定剂量，在一定时间内有效地获得期待结果的必要的用量。例如，治疗有效量的物质可根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的重组蛋白在个体中产生期望反应的能力等因素而定。可对剂量的选取进行调整，以期获得最佳治疗反应。例如，例如，可将一剂分为若干次每日施用，或者可以根据治疗情况的紧迫度而适当地降低剂量。
因此，本发明提供了用于治疗和预防癌症的药物组合物，其包含本发明的免疫偶联物，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一优选的实施方式中，在药物组合物中免疫偶联物的效应物分子是癌症治疗试剂，更优选是毒素。
包含本发明的免疫偶联物的药物制剂可系统地进行施予。药物制剂可直接施予到癌症位点。取决于施予的方式，可将免疫偶联物进行涂层，以保护化合物不受到酶、酸和其他钝化化合物的天然环境的作用。
根据本发明的一方面，免疫偶联物通过直接施予而给予患者。本发明构思出了给予至少为足以获得端点量的药物组合物，如果需要，还包括药学上可接受的载体。
本发明也提供了降低手术后并发症危险的方法，包括在手术治疗癌症之前、之中和之后，施予有效量的本发明的免疫偶联物。
在此所述的组合物可通过已知的制备药学可接受的组合物的方法制备，该药学可接受的组合物在施予时，有效量的活性物质与药学可接受的载体结合形成混合物。适合的载体例如在以下文献中有描述：Remington′sPharmaceutical Sciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，USA 1985)。基于此，组合物包括但不限于与一种或多种药学可接受的载体或稀释剂相关的物质的溶液，且在具有适当的pH值和等渗透压的缓冲液中含有生理液。
药物组合物包括但不限于：冻干粉或水性或非水灭菌的可注射溶液或悬浮液，其可进一步含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使组合物基本上与受药者的组织和血液相容的溶质。其他可存在于该组合物中的成分如包括水、醇、多元醇、甘油和植物油。即时注射溶液和悬浮液可用灭菌粉末、颗粒、药片或浓缩的溶液或悬浮液配制。免疫偶联物的非限制性的供给形式可以是如冻干粉，其可以在向病人施予前，用蒸馏水或盐水复原。
本发明的药物组合物可含有药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体包括基本上化学惰性的和非毒性的组合物，它们不会影响到药物组合物的生物活性的效力。合适的药学上可接受的载体的例子包括但不限于：水、盐水溶液、甘油溶液、乙醇、N-(1(2，3-二油基氧)丙基)N，N，N-氯化三甲铵(DOTMA)，二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE)和脂质体。这样的组合物应当含有治疗有效量的化合物，以及适当含量的载体，以提供直接供病人施用的形式。
组合物可以是药学上可接受的盐的形式，其包括但不限于那些用自由氨基和那些用自由羧基形成的盐，其中，自由氨基如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等；自由羧基如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等。
在本发明的各种实施方式中，药物组合物被直接系统地施用或直接至肿瘤区域。
药物组合物可用于治疗动物，包括哺乳动物，优选为人的癌症的方法中。施用的免疫偶联物的剂量和类型将取决于许多能够容易地在人类实验者中得以监控的因素。这样的因素包括癌症的病因学和严重程度(级别和阶段)。
本领域技术人员，例如内科医师应当能够不难认识到使用本发明的免疫偶联物治疗癌症的结果。例如，标准的医用测试癌症的临床标记物的方法可作为治疗效力的有力指示。这样的测试包括但不限于：身体检查、生活质量量表、疾病标记物、12-导联ECG、肿瘤测量、活体组织检查、细胞检查、细胞学研究、最长肿瘤直径计算、肿瘤的放射线照相术、数字成像、维生征象、体重、不良事件的记录、传染性事件的评价、伴随药物的评价、疼痛评价、血液或血清化学、尿样分析、CT扫描以及药物代谢动力学分析。此外，包含免疫偶联物和另一癌症治疗剂的组合疗法的协同效应可通过与经历单一疗法的病人进行对比研究来确定。
本发明的另一实施方式是关于治疗或预防癌症的试剂盒，其包括有效量的本发明的免疫偶联物，以及使用其治疗癌症的指导说明。
在大多数核准的抗癌疗法中，抗癌疗法与其他抗癌疗法联合使用。因此，本发明提供了用于预防或治疗癌症的方法，该方法使用本发明免疫偶联物以及至少一种另外的抗癌疗法。其他的癌症疗法可以在施予免疫偶联物之前、交叠、同时和/或之后施用。当同时施用时，免疫偶联物和其他的癌症制剂可在同一制剂中或在不同的制剂中，如果在不同的制剂中，则可选用不同施用方法。一种或多种免疫偶联物和一种或多种其他癌症疗法的组合可以协同对抗癌症。其他的癌症疗法包括但不限于：放射性和其他的抗癌制剂。这些其他的癌症制剂可包括但不限于：2，2′，2″三氯三乙胺、6-氮尿苷(6-azauridine)，6-重氮-5-氧-L-己氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)，6-巯基嘌呤(mercaptopurine)，aceglarone，aclacinomycins放射菌素，六甲蜜胺(altretamine)，氨鲁米特(aminoglutethimide)，氨鲁米特(aminoglutethimide)，胺苯吖啶(amsacrine)，阿纳托唑(anastrozole)，安西他滨(ancitabine)，血管生成素反义寡核苷酸(angiogenin antisense oligonucleotide)，安曲霉素(anthramycin)，阿扎胞苷(azacitidine)，重氮乙酰丝氨酸(azaserine)，氮丙环(aziridine)，batimastar，bcl-2反义寡核苷酸，苯佐替派(benzodepa)，必卡他胺(bicalutamide)，比生群(bisantrene)，博来霉素(bleomycin)，布舍瑞林(buserelin)，白消安(busulfan)，放线菌素C(cactinomycin)，卡普睾酮(calusterone)，卡铂(carboplatin)，卡巴醌(carboquone)，洋红霉素(carminomycin)，卡莫氟(carmofur)，卡莫司汀(carmustine)，卡柔比星(carubicin)，嗜癌菌素(carzinophilin)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)，氯地孕酮(chlormadinone acetate)，氯脲霉素(chlorozotocin)，色霉素(chromomycins)，顺铂(cisplatin)，克拉屈滨(cladribine)，环磷酰胺(cyclophosphamide)，阿糖胞苷(cytarabine)，达卡巴嗪(dacarbazine)，更生霉素(dactinomycin)，正定霉素(daunorubicin)，地磷酰胺(defosfamide)，秋水仙胺(demecolcine)，denopterin，地托比星(detorubicin)，地吖醌(diaziquone)，烯紫衫醇(docetaxel)，去氧氟尿苷(doxifluridine)，多柔比星(doxorubicin)，屈洛昔芬(droloxifene)，屈他雄酮(dromostanolone)，依达曲沙(edatrexate)，eflomithine，依利醋铵(elliptiniumacetate)，乙嘧替氟(emitefur)，enocitabune，表柔吡星(epirubicin)，环硫雄醇(epitiostanol)，依索比星(esorubicin)，雌莫司汀(estramustine)，依托格鲁(etoglucid)，依托泊苷(etoposide)，法倔唑(fadrozole)，芬维A胺(fenretinide)，2-去氧氟尿苷(floxuridine)，氟达拉滨(fludarabine)，氟尿嘧啶(fluorouracil)，氟他胺(flutamide)，亚叶酸(folinic acid)，福美斯坦(formestane)，磷雌酚(fosfestrol)，福莫司汀(fotemustine)，硝酸镓(galliumnitrate)，吉西他汀(gemcitabine)，戈舍瑞林(goserelin)，己雌酚(hexestrol)，羟基脲(hydroxyurea)，伊达比星(idarubicin)，异环磷酰胺(ifosfamide)，英丙舒凡(improsulfan)，干扰素-α(interferon-alpha)，干扰素-β(interferon-beta)，干扰素-γ(interferon-gamma)，白细胞介素-2(interleukin-2)，左旋门冬酰胺酶(L-asparaginase)，香菇多糖(lentinan)，来曲唑(letrozole)，柳菩林(leuprolide)，洛莫司汀(lomustine)，氯尼达明(lonidamine)，甘露醇氮芥(mannomustine)，麻西罗霉素(marcellomycin)，双氯乙基甲胺(mechlorethamine)，盐酸氧化双氯乙基甲胺(mechlorethamine oxidehydrochloride)，安宫黄体素(medroxyprogesterone)，醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)，氯地孕酮(melengestrol)，美法仑(melphalan)，美诺立尔(menogaril)，美雄烷(mepitiostane)，甲氨蝶呤(methotrexate)，美妥替哌(meturedepa)，米帕(miboplatin)，米替福新(miltefosine)，二溴甘露醇(mitobronitol)，米托胍腙(mitoguazone)，二溴卫矛醇(mitolactol)，丝裂霉素(mitomycins)，米托坦(mitotane)，米托蒽醌(mitoxantrone)，莫哌达醇(mopidamol)，霉酚酸(mycophenolic acid)，尼鲁米特(nilutamide)，尼莫司汀(nimustine)，nitracine，诺拉霉素(nogalamycin)，novembichin，olivomycins，草酸铂(oxaliplatin)，紫杉醇(paclitaxel)，喷司他丁(pentostatin)，培洛霉素(peplomycin)，哌磷酰胺(perfosfamide)，蛋氨氮芥(phenamet)，苯芥胆甾醇(phenesterine)，哌泊溴烷(pipobroman)，哌泊舒凡(piposulfan)，吡柔比星(pirarubicin)，吡曲克辛(piritrexim)，普卡霉素(plicamycin)，足叶草酸2-乙基-酰肼(podophyllinic acid 2-ethyl-hydrazide)，聚磷酸雌二醇(polyestradiol phosphate)，卟吩姆钠(porfimer sodium)，甲基丝裂霉素(porfiromycin)，泼尼莫司汀(prednimustine)，丙卡巴肼(procabazine)，丙帕锗(propagermanium)，PSK，蝶罗呤(pteropterin)，嘌呤霉素(puromycin)，quelamycin，雷莫司汀(ranimustine)，丙亚胺(razoxane)，鲁道柔比星(rodorubicin)，罗喹美克(roquinimex)，sizofican，索布佐生(sobuzoxane)，螺锗(spirogermanium)，链黑菌素(streptonigrin)，链脲佐菌素(streptozocin)，它莫西芬(tamoxifen)，泰素帝(taxotere)，替加氟(tegafur)，替莫唑胺，(temozolomide)，替尼泊甙(teniposide)，细交链孢菌酮酸(tenuzonic acid)，testolacone，硫咪嘌呤(thiamiprine)，巯基鸟嘌呤(thioguanine)，塞替派(thiotepa)，托穆戴克斯(Tomudex)，拓扑替康(topotecan)，托瑞米芬(toremifene)，三亚胺醌(triaziquone)，三亚乙基密胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)，三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramide)，曲洛司坦(trilostane)，三甲曲沙(trimetrexate)，曲普瑞林(triptorelin)，曲洛磷胺(trofosfamide)，trontecan，结核菌素(tubercidin)，乌苯美司(ubenimex)，尿嘧啶芥子气(uracil mustard)，乌瑞替派(uredepa)，乌拉坦(urethan)，长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)，阿糖胞苷(cytosinearabinoside)，吉妥单抗(gemtuzumab)，thioepa，cyclothosphamide，抗代谢物(antimetabolites)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，6-巯基嘌呤(6-mercaptopurin)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)，阿糖胞苷(cytarabine)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，氟达拉滨(fludarabine)，吉西他汀(gemcitabine)，达卡巴嗪(dacarbazine)，temozoamide)，六甲密胺(hexamethylmelamine)，LYSODREN，核苷相似物(nucleoside analogues)，植物生物碱(plant alkaloids)(例如，泰素(Taxol)，紫杉醇(paclitaxel)，喜树碱(camptothecin)，拓扑替康(topotecan)，伊立替康(irinotecan)(CAMPTOSAR，CPT-11)，长春新碱(vincristine)，长春花生物碱(vinca alkyloids)，例如，长春碱(vinblastine))鬼臼毒素(podophyllotoxin)，表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，VP-16(依托泊苷(etoposide))，松胞菌素B(cytochalasin B)，短杆菌肽D(gramicidin D)，溴化乙锭(ethidium bromide)，依米丁(emetine)，蒽环类(anthracyclines)(例如，正定霉素)，阿霉素脂质体(doxorubicin liposomal)，二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)，米拉霉素(mithramycin)，放线菌素D(actinomycin D)，阿地白介素(aldesleukin)，allutamine，biaomycin，卡培他滨(capecitabine)，carboplain，chlorabusin，cyclarabine，daclinomycin，floxuridhe，lauprolide acetate，左旋咪唑(levamisole)，lomusline，mercaptopurino，美司钠(mesna)，mitolanc，pegaspergase，pentoslatin，picamycin，riuxlmab，坎帕斯-1(campath-1)，straplozocin，维A酸(tretinoin)，VEGF反义寡核苷酸，长春地辛(vindesine)和，长春瑞宾(vinorelbine)。含有一种或多种癌症制剂的组合物(例如，FLAG，CHOP)也可用于本发明。FLAG包含氟达拉滨(fludarabine)，阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含环磷酰胺(cyclophosphamide)，长春新碱(vincristine)，阿霉素(doxorubicin)和强的松(prednisone)。已知的所有癌症制剂可参见最新版的The Merck Index和Physician′s Desk Reference两书。
用于联合疗法的药物组合物也可包括，但不限于：抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)，平阳霉素(bleomycin)，米拉霉素(mithramycin)，氨茴霉素(anthramycin))，门冬酰胺酶(asparaginase)，杆状菌(Bacillus)和介兰(Guerin)，白喉毒素(diphtheria toxin)，普鲁卡因(procaine)，丁卡因(tetracaine)，利多卡因(lidocaine)，普萘洛尔(propranolol)，抗有丝分裂剂，相思豆毒素(abrin)，蓖麻毒蛋白A(ricinA)，绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)，神经生长因子，血小板衍生的生长因子，组织血浆酶原活化因子，抗组胺剂，抗作呕剂等。
实际上，向需要治疗的病人施用有效量的免疫偶联物，可减少其他具有显著临床功效的癌症制剂的剂量。这种其他癌症制剂剂量减少的功效在没有施用免疫偶联物时未观察到。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包括施用减少剂量的一种或多种其他癌症制剂。
再有，与标准治疗方法的周期长短或多少相比，向需要治疗的病人施予含免疫偶联物的联合制剂可导致更短的治疗次数。因此，本发明提供了治疗肿瘤或癌症的方法，该方法包括施用减少剂量的一种或多种其他癌症制剂，以获得相对较短的持续时间和/或更少的治疗周期。
因此，根据本发明，包含免疫偶联物和其他癌症制剂的联合疗法可降低整个癌症治疗的毒性(即副作用)。例如，与单一疗法或其他联合疗法相比，当施用减少剂量的免疫偶联物和/或其他癌症制剂时，和/或当减少周期的持续时间(即单一施药的时段或系列施药的时段)时，和/或当减少周期数目时，可观察到毒性的降低。
因此，本发明提供药物组合物，其包含免疫偶联物和一种或多种其他癌症制剂，可选择地含在药学可接受的载体中。
本发明还提供含有有效量的免疫偶联物的试剂盒，可选择地与一种或多种其他癌症制剂联合，以及使用其治疗癌症的指导说明。
如上所述，用免疫偶联物的联合疗法可能敏化癌症或肿瘤对其他癌症制剂的施用。因此，本发明构思出用于预防、治疗、和/或预防癌症反复发生的联合疗法，该疗法包括在施用减少剂量的癌症制剂之前、之后或同时，施用有效量的免疫偶联物。例如，用免疫偶联物的最初的治疗可能增加癌症或肿瘤对随后的癌症制剂的剂量的敏感程度。该剂量接近或低于单独施用癌症制剂或无免疫偶联物时的标准剂量的下限。当同时施予时，免疫偶联物可与癌症制剂分开施用，可选择地通过不同的施用模式给予。
因此，在一实施方式中，其他的癌症制剂包括顺铂(cisplatin)，例如PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)，其剂量大约在5到10，11到20，21到40，或41到75mg/m2/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括卡铂(carboplatin)，例如PARAPLATIN(Bristol Myers)，其剂量大约在2到3，4到8，9到16，17到35，或36到75mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括环磷酰胺(cyclophosphamide)，例如CYTOXAN(Bristol Myers Squibb)，其剂量大约在0.25到0.5，0.6到0.9，1到2，3到5，6到10，11到20，或21到40mg/kg/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括阿糖胞苷(cytarabine)，例如CYTOSAR-U(Pharmacia & Upjohn)，其剂量大约在0.5 to 1，2 to 4，5 to 10，11到25，26到50，或51到100mg/m2/周期的范围。在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括阿糖胞苷脂质体例如DEPOCYT(Chiron Corp.)，其剂量大约在5到50mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括达卡巴嗪(dacarbazine)，例如DTIC或DTICDOME(Bayer Corp.)，其剂量大约在15到250mg/m2/周期的范围，或大约在0.2到2mg/kg/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括拓扑替康(topotecan)，例如HYCAMTIN(SmithKline Beecham)，其剂量大约在0.1到0.2，0.3到0.4，0.5到0.8，或0.9到1.5mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括依立替康(irinotecan)，例如CAMPTOSAR(Pharmacia & Upjohn)，其剂量大约在5到9，10到25，或26到50mg/m2/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括氟达拉滨(fludarabine)，例如FLUDARA(Berlex Laboratories)，其剂量大约在2.5到5，6到10，11到15，或16到25mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(Ara-C)，其剂量大约在200到2000mg/m2/周期，300到1000mg/m2/周期，400到800mg/m2/周期，或500到700mg/m2/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括多烯紫衫醇(Docetaxel)，例如TAXOTERE(Rhone Poulenc Rorer)，其剂量大约在6到10，11到30，或31到60mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括紫杉醇(Paclitaxel)，例如TAXOL(泰素)(Bristol Myers Squibb)，其剂量大约在10到20，21到40，41到70，或71到135mg/kg/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)，其剂量大约在0.5到5mg/kg/周期，1到4mg/kg/周期，或2-3mg/kg/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括多柔比星(doxorubicin)，例如ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)，DOXIL(Alza)，RUBEX(Bristol MyersSquibb)，其剂量大约在2到4，5到8，9到15，16到30，或31到60mg/kg/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括依托泊苷(etoposide)，例如VEPESID(Pharmacia & Upjohn)，其剂量大约在3.5到7，8到15，16到25，或26到50mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括长春质碱(vinblastine)，例如VELBAN(Eli Lilly)，其剂量大约在0.3到0.5，0.6到0.9，1到2，或3到3.6mg/m2/周期的范围。
在另一实施方式中，其他的癌症制剂包括长春新碱(vincristine)，例如ONCOVIN(Eli Lilly)，其剂量大约在0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 or 0.7mg/m2/周期的范围。
在又一实施方式中，其他的癌症制剂包括甲氨蝶呤(methotrexate)，其剂量大约在0.2到0.9，1到5，6到10，或11到20mg/m2/周期的范围。
在另一实施方式中，免疫偶联物与至少一种其他的免疫制剂联合施用，该其他的免疫制剂包括但不限于：利妥昔(rituxan)，利妥昔单抗(rituximab)，campath-1，吉妥单抗(gemtuzumab)和trastuzutmab。
在又一实施方式中，免疫偶联物与至少一种血管新生抑制剂联合施用，该血管新生抑制剂包括但不限于：血管生成抑制素(Angiostatin)，沙利度胺(thalidomide)，kringle 5，内皮抑素(endostatin)，丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)，抗凝血酶(anti-thrombin)，纤维连接蛋白的29kDa N-端基和40kDa C-端基水解蛋白片段，催乳素的16 kDa水解蛋白片段，血小板因子4的7.8kDa水解蛋白片段，对应于血小板因子4的13-氨基酸肽(Maione et al.，1990，Cancer Res.51：2077-2083)，对应于胶原质I片段的14-氨基酸肽(Tolmaet al.，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，对应于凝血酶敏感蛋白I片段的19氨基酸肽(Tolsma et al.，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，对应于SPARC片段的20-氨基酸肽(Sage et al.，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，和它们变异体，包括其药学上可接受的盐。
在另一实施方式中，免疫偶联物与至少一种放射疗法联合施用。该疗法也可包括手术和/或化学疗法。例如，免疫偶联物可与放射疗法以及顺铂(Platinol)，5-氟尿嘧啶(5-FU，Adrucil)，卡铂(伯尔定，Paraplatin)和/或紫杉醇(Taxol)联合物施用。使用免疫偶联物进行治疗可减少放射剂量和/或放射治疗的频率，例如可减少影响吞咽功能从而导致减重或脱水的严重喉咙疼痛的发生。
在又一实施方式中，免疫偶联物与至少一种细胞激素(cytokines)联合施用，该细胞激素包括但不限于：淋巴因子(lymphokine)，肿瘤坏疽因子(tumor necrosis factors)，类肿瘤坏疽因子的细胞激素，淋巴毒素、干扰素，巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte monocyte colony stimulating factor)，白细胞介素(包括但不限于：白细胞介素-1，白细胞介素-2，白细胞介素-6，白细胞介素-12，白细胞介素-15，白细胞介素-18)，和它们的变异体，包括它们的药学可接受的盐。
在另一实施方式中，免疫偶联物与癌症疫苗或生物制剂联合施用，该癌症疫苗或生物制剂包括但不限于：自体同源的细胞或组织，非自体同源的细胞或组织，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)，甲胎蛋白，人类绒毛膜性腺激素(human chorionic gonadotropin)，卡介苗活疫苗(BCG live vaccine)，分枝杆菌细胞壁-DNA复合物(Mycobacterial cell wall-DNA complexes)，黑色素细胞衍生蛋白(melanocyte lineage proteins)和突变的肿瘤特异性抗原。
在又一实施方式中，免疫偶联物与荷尔蒙疗法联合施用。荷尔蒙制剂包括但不限于：荷尔蒙兴奋剂(hormonal agonist)，荷尔蒙拮抗剂(hormonalantagonist)(例如，氟他胺(flutamide)，它莫西芬(tamoxifen)，醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON))，和类固醇(例如，地塞米松(dexamethasone)，类维生素A，倍他米松(betamethasone)，氢化可的松(cortisol)，可的松(cortisone)，强的松(prednisone)，去氢睾酮(dehydrotestosterone)，糖肾上腺皮质激素(glucocorticoid)，盐皮质激素(mineralocorticoid)，雌激素(estrogen)，睾丸激素(testosterone)，孕酮(progestin)).
在另一实施方式中，免疫偶联物与基因治疗计划联合物施用，以治疗或预防癌症。
因此，联合疗法可增加癌症或肿瘤对所施用的免疫偶联物和/或其他的癌症制剂的敏感度。这样，有望获得更短的治疗周期，从而减少毒性事件。治疗的周期可随所施用的特定的癌症制剂而改变。本发明也考虑了连续或不连续地进行给药，或者将每日的剂量分为若干次进行给药。本领域技术人员应当能够认识到适当的对特定癌症的治疗周期，而本发明考虑了对每一癌症疗法的最佳治疗计划的评估。具体的专业指导已为人知。参见例如Therasse et al.，2000，“New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors.European Organization for Research and Treatment of Cancer，National CancerInstitute of the United States，National Cancer Institute of Canada，”J Natl CancerInst.Feb 2；92(3)：205-16。
免疫偶联物可通过任何适合的方法例如注射、口服、吸入、经皮肤、在肿瘤内施予。而其他的癌症制剂可通过相同的或不同的模式施予。此外，当需要向病人施予多种癌症制剂时，免疫偶联物和一种或多种其他的癌症制剂可用一种方法施予，而其他的癌症制剂可用另一种模式施予。
(F)诊断方法和试剂
本发明的结合蛋白选择地结合到癌细胞或被癌细胞内化的分子，而无明显地结合到正常细胞。因此，结合蛋白可用于诊断癌症。如上所述，发明者们已表明本发明的结合蛋白结合到CD44E的细胞外区域。发明者们还表明本发明的结合蛋白结合到AFP或其变异体上。AFP与不正常生长、细胞转化和癌症相关。因此，结合蛋白对肿瘤抗原的特异性使得其可用于癌症的诊断。
在一优选的实施方式中，结合蛋白为本发明的抗体或抗体片段。并且，癌细胞可被评价以确定它们对本发明方法的易感性。评价方法例如取癌细胞样品，确定样品结合到本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段的能力。
因此，本发明包括诊断方法、试剂和试剂盒，它们本身可用在本发明的治疗方法之前、之中或之后，以确定是否有癌细胞的存在，所述癌细胞表达抗原，并结合到本发明的蛋白，优选抗体或抗体片段上。
在一实施方式中，本发明提供诊断哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与本发明的结合蛋白接触，所述结合蛋白是在允许形成结合蛋白-抗原复合物的条件下，结合到肿瘤细胞之中或之上的抗原的结合蛋白；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的含量；以及
(3)将测试样品中的结合蛋白-抗原复合物的含量与对照物作比较。
在一实施方式中，抗原为CD44E；分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间、优选为5.4的蛋白；或含CD44E的5-v8界面、CD44的v8外显子、氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白。在另一实施方式中，抗原为甲胎蛋白或其变异体；分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白；或含有氨基酸序列是SEQ ID NOS：14，15或16的蛋白。在又一例子中，抗原为含有氨基酸序列是SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44或45、分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间的蛋白；或含有氨基酸序列是SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74或75、分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间的蛋白。
本发明的又一实施方式是诊断哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与抗体接触，所述抗体是在允许形成抗体-甲胎蛋白复合物的条件下，结合到甲胎蛋白或其变异体上的抗体，以及在允许形成抗体-CD44E复合物的条件下，结合到CD44E上的抗体；
(2)测量测试样品中抗体-甲胎蛋白复合物和抗体-CD44E复合物的含量；以及
(3)将测试样品中的抗体-甲胎蛋白复合物和抗体-CD44E复合物的含量与对照物作比较。
本发明进一步包括用于诊断癌症的试剂盒，其包括任何一种本发明的结合蛋白，以及使用其诊断癌症的指导说明。本发明还包括用于诊断癌症的试剂盒，其包括结合到甲胎蛋白的抗体和结合到CD44E的抗体，以及使用其诊断癌症的指导说明。
为应用于诊断，本发明的结合蛋白，优选为抗体或抗体片段，可用可探测的标记物，如不透射线的或放射线同位素例如3H，14C，32P，35S，123I，125I，131I；荧光(荧光团)或化学发光(发色团)化合物，例如荧光素异硫氰酸盐、若丹明或荧光素；酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或山葵过氧化酶；成像试剂；或金属离子进行标记。如上所述，将标记附着于结合蛋白，如抗体或抗体片段之上的方法已为习知。
本发明的另一方面是诊断哺乳动物中癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)测量在取自所述哺乳动物的样品中本发明抗体的量；以及
(2)将测试样品中本发明抗体的量与对照物作比较。
在一实施方式中，本发明抗体的量是通过用如ELISA来测量测试样品中的本发明抗体的量而测定。在另一实施方式中，本发明抗体的量是通过用如RT-PCR来测量编码测试样品中的本发明的抗体的核酸表达水平而测定。
(G)抗原
如上所述，本发明者们确认了本发明结合蛋白的抗原。因此，本发明包括可特异地与本发明的结合蛋白之一结合的分离的蛋白、其核酸序列和用途。
在一实施例中，分离的蛋白是分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间，优选为5.4的蛋白；分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白；或者含有氨基酸序列是AFP的107到487(SEQ IDNO：14)，AFP的107到590(SEQ ID NO：15)或AFP的107到609(SEQ IDNO：16)的蛋白。在一实施例中，分离的蛋白是含SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44或45，以及分子量在47-53kDa之间、等电点在5.2-5.5之间的蛋白；或含SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74或75，以及分子量在48-54kDa之间、等电点在5.1-5.4之间、优选为5.2的蛋白。
(H)本发明的结合蛋白的其他用途
CD44的抗体也显示出对CD44H的PMA-引发的结合的阻断(其标准形式也称为CD44s)以及对CD44E结合到透明质酸(HA)的阻断(Liao et al.JImmunol 151(11)：6490-99，1993)。CD44变异体的聚类(Clustering)，特别是那些含变异体外显子9的对于结合到HA以及可被PMA引入显得尤为重要。下游细胞内信号与该聚类相关且对其进行干扰，从而影响细胞功能(Suzuki etal.，JBC 277(10)：8022-32，2002)。通过用聚类进行干扰，抗体对HA结合的阻断效果可被调解。不论机制如何，本发明的结合蛋白可被用于调整CD44对细胞外分子的结合以及来自聚类的下游细胞信号，或者调整CD44对HA或/或其他细胞外分子的结合。
因此，本发明包括使用本发明的结合蛋白来调整CD44的活性。例如，本发明的结合蛋白可被用于干扰CD44对HA的结合。本发明的结合蛋白也可用于提高CD44的活性。
以下用非限制性的实施例来说明本发明：
实施例
实施例1：VB1-008单克隆抗体的生成
VB1-008单克隆抗体是由患乳癌病人的外周血淋巴细胞产生。
TM-SH-P2被用作融合伙伴(fusion partner)来产生单克隆抗体VB1-008是IgG1，λ-单克隆抗体。
信使RNA(mRNA)从杂种细胞中分离，且第一股互补DNA(cDNA)被合成。然后，通过PCR，cDNA被用于分离抗体H和L链基因。根据H(γ)和L(λ)链同型的共有骨架区来设计PCR引物。PCR的产物被分别克隆成TOPO-pCR 2.1载体，且被转化到大肠杆菌(E.coli)细胞中。在TOPO-pCR 2.1中含有嵌入片段的独立的克隆经分离并生长。质粒DNA经纯化并测定序列。
γ引物：
1)5’TCT AAA GAA GCC CCT GGG AGC ACA GCT CAT CAC CAT G3’(SEQ ID NO：18)
2)5’GCC CGG GGA GCG GGG GCT TGC CGG CCG TCG CAC TCA 3’(SEQ ID NO：19)
3)5：ACC ATG AGT GAG AAA AAC TGG ATT TGT GTG GCA 3’(SEQ ID NO：20)
4)5’GGA GCC GGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA 3’(SEQ ID NO：21)
5)5’CTC ACC ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG GTT 3’(SEQ ID NO：22)
6)5’GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC 3’(SEQ ID NO：23)
λ引物：
7)5’GGC TCG AGA TGR CCT GSW CYC CTC TCY TYC TSW YC 3’(SEQ ID NO：24)
8)5’CCC GTC GAC GAA GCT CCT TCA GAG GAG GG 3’*(SEQ ID NO：25)
注：为了用单一引物分离尽可能多的种类，对某些共有引物使用混合碱基：R＝A+G，D＝A+T+G，Y＝C+T，H＝A+C+T，V＝A+C+G，K＝T+G，S＝C+G，W＝A+T。
各PCR反应在50μL的反应体积内包含以下成分：
10xPCR缓冲剂          5μL
2mM dNTPs             5μL
50mM MgCl2            2μL
5’引物               20pmoL
3’引物               20pmoL
Taq DNA聚合酶         2.5U
DNA模板               50ng
PCR循环条件为：94℃下1分钟，62℃下1分钟，72℃下1.5分钟，进行30个循环，且最后在72℃下延伸10分钟。扩增的PCR产物经电泳在1％的琼脂糖凝胶上分离，切离，用Qiaquick凝胶回收试剂盒纯化，并克隆到TOPO pCR 2.1克隆载体中，然后用373 DNA延伸测序仪进行DNA测序(Griffin G.H.and Griffin M.A.：PCR technology，Current innovations.CRC Press，Boca.Raton.Florida3431.USA；Cloning vector pCR 2.1，Catalogue #205184.Invitrogen，Carlsbad，CA；Qiagen，Qiaquick gel extraction kit，Catalogue #28706.Qiagen Inc.，Mississauga，ON；and 373 DNA Stretch.PE Applied Biosystems，Mississauga ON.)。
VB1-008的CDR序列示于表1。
轻链可变区和重链可变区分别示于图1和图2。
实施例2：由肿瘤细胞反应性测定的抗体谱(Antibody Profiling)
用流式细胞仪测试VB1-008，以获得肿瘤细胞对两板(panel)细胞系的反应性。第一板包含15种不同类型的上皮癌细胞，而第二板由5种正常细胞组成。VB1-008的结果总结于表2中。VB1-008对于所有测试的癌症类型，均有MF＞2.0。MF值显示出在各适应症中，由所有细胞系中相对于对照抗体的平均荧光平均增加倍数的总和计算得到的平均。最强的适应症为：乳房、肺、黑素瘤和前列腺，但并不限于此。相比之下，VB1-008对大多数肿瘤细胞系的反应性比对正常细胞系更强。尽管肾和肺细胞系是两个例外，它们仍低于相应的肿瘤细胞类型。见表2。VB1-008对肿瘤的反应性的增加倍数：正常值在～2-7之间变化。
实施例3：正常组织微阵列
测试VB1-008对流动阳性肿瘤细胞系SKBR-3的作用，以评估表明膜染色的适当的组织形式以及定义最佳的染色条件。该抗体表明在所有的实验组，包括固定的嵌入细胞中的细胞质和细胞膜的染色。在与VB1-008过夜培养的固定的细胞球中，80％的细胞显示出细胞质的染色，10％的细胞显示出细胞膜的染色。福尔马林固定的细胞球核的细胞膜染色的代表性图片见于图3。
一旦最佳染色条件得以确定，则对抗体进行测试，且与在用于正常组织反应性的临界正常低密度(LD)阵列之上的同型对照物(4B5)进行比较。VB1-008的结果总结于表3中。在任何正常的临界组织中均没有发现明显的膜染色。非临界正常组织的高密度(HD)阵列染色表明细胞表面染色仅限于与繁殖相关的组织(睾丸和输卵管，图4，表4)有关的上皮细胞。另外，在任何组织中均没有发现明显的染色。
实施例4：肿瘤组织微阵列
在HD福尔马林固定的肿瘤TMA中测试VB1-008对肿瘤组织的反应性。见表5。VB1-008显示出对许多适应症，包括膀胱、乳房、结肠、肾、肝、卵巢、前列腺、直肠胃和子宫的中等的细胞表面反应性。VB1-008细胞与子宫颈癌、肺癌、胰腺癌和皮肤癌的表面结合表达得较少且反应性较低。描述VB1-008的细胞表面反应性，但非某些癌症的同型符合的对照抗体的代表性图片示于图5-7。
实施例5：VB1-008结合及经流式细胞仪和共焦显微镜内化的评价：
使用VB1-008和两个对肿瘤细胞系A-375显示强反应性的对照抗体(5E9和MA-103)来评价VB1-008的内化。代表性的实验示于表6。在不同的温度下的VB1-008结合结果与内化抗体5E9的没有区别。在37℃下60分钟后，结合于膜上的VB1-008从细胞表面消失，且平均荧光减少了57.5％。37℃下的培养时间的增加与继续减少的平均荧光有关。到120分钟时，平均荧光已减少了62.2％。显示细胞表面结合的流式柱状图见图8。为了确认结合于细胞表面的VB1-008是否被内化到A-375细胞或从质膜脱落，通过直接观察荧光分布以及借用激光扫描共焦显微镜观察细胞内染色，对经抗体处理的细胞作进一步评价。与MA-103和5E9相同，用VB1-008在4℃下培养A-375细胞60分钟显示出荧光标记的圆周表面分布(图9A)。将VB1-008抗体结合的细胞加温到37℃揭示了用内化的抗体在60分钟内的细胞内染色的断续的模式。见图9B。
实施例6：结合亲和力
使用流式细胞仪测定功能亲和力[Benedict，C.A.，NacKrell，A.J.andAnderson，W.F.(1997)J.Immunol.Methods，201：223-231]。对固定数目的肿瘤细胞(A-375)用不同浓度范围的抗体作用2小时，以建立饱和曲线。数值和图标分析使用Sigma Plot(Jandel Scientific，San Rafael，CA)产生。确定的平均荧光的倒数作为抗体浓度的倒数的函数作图，以通过Lineweaver-Burk方法确定KD。作图产生一直线，而KD由该曲线的斜率计算得到。分离常数KD的值由以下方程确定：1/F＝1/Fmax+(KD/Fmax)(1/IgG或IgM或scFv)，其中，F＝扣除背景的平均荧光，Fmax由图中计算得到。VB1-008的分离常数显示为5.88×10-8M。
实施例7：VB1-008抗原识别
细胞
研究中使用了乳癌细胞系，MDA-MB 435S，MDA-MB-231；MCF-7；黑素瘤细胞系，A-375；胰腺肿瘤细胞系，PANC-1和T-细胞系，Daudi和Ramos(表7)。这些细胞系的选择是基于流式细胞仪获得的肿瘤细胞系谱的结果。
肿瘤细胞系的生长和维持
研究中的细胞系由ATCC购得，并按ATCC的教导和建议进行培养。在90％的汇合(confluence)下收集细胞，其生存率＞90％。
结合到VB1-008上抗原的初步表征
获得初步表征数据的实验是被设计成评定采用斑点试验的基于凝胶之方法的可行性的实验；以及被进行以确定与抗原相关的抗原决定区之性质的实验。
由这些实验获得的数据将VB1-008抗原分类为可用肽的抗原决定区“污点化”(“blottable”)的抗原，即所述抗原决定区是涉及结合到抗原上VB1-008的抗原决定区的既非糖基化的，也非脂质体化的抗原决定区。应当注意的是抗原可以在非结合位点被糖基化。
VB1-008Ag富集和纯化
免疫沉淀反应
使用最低量为500g的膜蛋白进行免疫亲和纯化。单独使用蛋白-G琼脂糖的预清洁步骤是在加入抗体前的抗原纯化中的第一步。在某些情况下，进行两次预清洁，以提供更严格的分析。在混合物中，总共为15-20g的抗体被用作沉淀剂。抗原-抗体混合物在4℃的模拟生理条件的缓冲条件下诱变(nutated)过夜。值得注意的是要确保在抗原分离过程的每一步中都要使用蛋白酶抑制剂。
免疫复合物经离心、用RIP-A裂解缓冲液(RIP-Alysis buffer)洗涤，并用0.2M pH2.5的糖胶洗提。代表未结合部分的上清液被储存以测试那些未被亲和纯化分离的蛋白。免疫沉淀在两种强阳性细胞系，即A-375和MDA-MB-435S下进行；一种弱阳性细胞系，即MCF-7；和三种阴性细胞系，即Panc-1；Daudi和Ramos上进行，并一直使用VB1-008和等量的平行处理的4B5(同型相匹的对照物)。
基于凝胶的分析和西方墨点法
1D-PAGE
经纯化的蛋白置于制备样品的还原和非还原条件下，随后用SDS-PAGE/西方墨点法进行分析。当使用还原条件时，分离的抗原用含1％-巯基乙醇的样品缓冲液在65℃下处理15分钟；当使用非还原条件时，抗原与除去了任何还原剂的样品缓冲液混合。所得的墨点用要求的抗体以及相应的偶联到HRP上的第二抗体进行探测，通过化学发光显形出免疫纯化的蛋白。
2D-PAGE
经免疫沉淀的蛋白经二维凝胶电泳分离，以消除1D-PAGE分析中可能发生的任何的蛋白堆叠效应。2D-凝胶电泳在第一维根据蛋白的等电点(Pi)，在第二维根据蛋白的分子量来溶解蛋白。这样，溶解的蛋白被转移到硝化纤维膜，过夜，并如在1D-PAGE中进行处理。按照要求，用VB1-008、CD44抗体和AFP抗体探测西方墨点法，反应性蛋白通过化学发光显形。
肽的提取及抗原ID
从1D-凝胶和2D-凝胶中切离蛋白并进行分析。得到了基于所获得的肽的数目而预测的可能的蛋白的原始数据。在Thermo Finnigan的‘QSTAR-和LCQ-dodeca LC-MS/MS上进行LC-MS/MS分析。在相同设备上进行鉴别的蛋白质的从头测序。
实施例7(a)1D-PAGE/西方印迹分析
在抗原-阳性细胞系(A-375，MDA-MB-435S，)中，当在1D-PAGE上于非还原条件下分离之后，仅在～110kDa处检测到一条特异性带(图10A)。相同的带在弱阳性细胞系(MCF-7)中被很弱地检测到，而在抗原-阴性细胞系(Daudi)中未检测到。当样品在制备样品的还原条件下经SDS-PAGE分离时，在抗体-阳性细胞系MDA-MB-435S，A-375，MDA-MB-231中在～50kDa处检测到强表达的一明显的带，在110kDa处检测到一弱带，而相同的带在MCF-7中为弱表达，在抗原-阴性细胞系中，如Daudi和Panc-1未检测到(图10B；图10C)；Ramos是上述观测的例外(图11B和10C)。没有细胞系显示出与4B5的免疫沉淀。西方印迹分析的数据总结于表8中。
为了确定由IP和西方墨点法探测的抗原结合的特异性，预先清洁4种细胞系，并将所得溶液用VB1-008进行免疫沉淀。如图10B所示，在MCF-7未观察到带，但是其他的细胞系在～50kDa和～110kDa处显示出相同的2条特异性带(弱)。除此之外，如图10A所示，用4B5进行的免疫沉淀没有产生任何可检测的用VB1-008进行免疫沉淀的活性蛋白，这表明在所使用的纯化技术中的特异性。将由流式细胞仪测得的VB1-008对7种细胞系的结合谱与免疫纯化实验的观测结果进行比较(表8)。
实施例7(b)2D-PAGE分析
为了确定等电点(Pi)以及评估在1D-PAGE分析中可能的蛋白堆叠，在二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)上分离VB1-008的纯化的抗原。其中，在第一维中的分离是基于Pi，在第二维中的分离是基于分子量。然后将凝胶转移到硝化纤维膜上，并进行标准的西方墨点分析处理。由于2D凝胶对检测蛋白的量的要求约比1D凝胶的要求高4倍，因此将4次分别的免疫沉淀反应获得的纯化的抗原被收集至一起进行一次2D-PAGE分析。在西方墨点分析中，同时对两个独立的凝胶进行处理，以保证在考马斯染色的凝胶上检测的蛋白是与在西方墨点分析中观测的蛋白一样。2D西方墨点分析用VB1-008进行探测，并用ECL(化学发光)进行检测。如图11A所示，在～49kDa/Pi＝5.2-5.6检测到两点。
图11B代表了经二维凝胶电泳分离的MDA-MB-435S的免疫沉淀的考马斯染色谱图。将观测到的标记为“C”和“D”的两点切离用于MS分析。确认的蛋白分别在表9A和9B中有详细描述。
肽的提取和蛋白分析
使用A-375和MDA-MB-435S膜来免疫纯化特异性结合到VB1-008上的抗原。在凝胶分离的还原条件下，在两细胞系中均观察到～50kDa处的带；而在非还原条件下，在MDA-MB-435S细胞中观察到～110kDa处的带，其被称之为“E”。将这些蛋白带从考马斯染色的凝胶中切离用于MS分析。
来自1D-凝胶带和2D-点的蛋白用胰蛋白酶消化而将它们从凝胶上释放出，并在反相LC-MS/MS系统中分析。通过使用生物信息工具进行数据库分析，蛋白的特性得以揭露。原始的数据包括所得的肽，以及包括污染物如角蛋白在内的一系列所提出的蛋白。为获得分析，将MS/MS谱图直接交由Mascot搜索引擎 www.Matrixscience.com.
分析肽的质量及它们的特性
候选蛋白的等电点(Pi)和分子量的关系是蛋白ID的一关键参数。应当注意的是在分析中应确保确认的肽的质量和它们的Pi分别在±3kDa和±0.2Pi的范围。这是因为肽的内在的以不同变异的状态存在的可能性会导致他们的质量和Pi偏离理论计算值。任何可接受的偏离都步应该不超过上述规定的范围。当肽的数量非常少时，需要额外的MS步骤，且通过“从头测序”法获得更多的信息。在从头测序中，第二次MS步骤将在第一次MS中获得的各肽打碎成肽碎片离子(y和b离子)，它们各自代表了氨基酸的离子化形式。然后可从所得的质谱图推导出各肽的序列。
肽普遍具有发生变异如蛋氨酸的氧化；以及在MS/MS碎裂中发生酸性“R”基团酯化、氨基形成乙酰胺以及脯氨酸、羟(基)脯氨酸和糖胶残基羟基化之类的倾向。当这些变异发生时，尽管肽的质量是相同的，但会被认为是不同的肽，从而导致对蛋白ID评分模式中的错误的加分，而蛋白ID评分应当是所有确认的单个的肽的累积单元。如果对肽的分析不正确，则会因错误的记分而导致对蛋白的错误的识别。因此，很重要的一点是分析和选择无重复表达或于他处表达的“独特的”肽，并且基于这些独特的肽进行正确的评分。此外，一些其他的参数，例如SE窗口、丢失的裂解部分的数量、亚稳片段、单个氨基酸变体等也在进行最终内部分析前加以考虑。执行这些严格步骤的结果是将肽的数目大大减少至很少的数目。使用这些编辑过的列单进行数据库的检索减少了对应的蛋白。由于在此应用的是免疫纯化步骤，与已知的污染物，如肌动蛋白、波形蛋白、角蛋白、细胞角蛋白、微管蛋白一起，残余的抗体也被认为是污染物。所得的3-4个最终的蛋白具有基于由2D-PAGE推演出的蛋白的Pi和分子量进行选择和排除后得到的真实的ID。
2D点“C”的分析
由2D-凝胶切离的点“C”被确认为仅为甲胎蛋白(AFP)，而其他的两种所列蛋白为蛋白酶抑制剂，其加入的目的是在研究中实现蛋白的完整性。Pi也与可能的AFP分子相匹配。MS分析揭示了有65种肽，但仅有30种独特的肽被收集且它们占人类AFP的54％的序列覆盖率，而每种肽显示出与原始蛋白100％的同源性。然而，AFP分子缺少了从N-端区起的起始的160aa。对人类AFP分子的序列分析清楚地显示出赖氨酸和精氨酸残基存在于这些起始的106aa中。如果它们存在于分子中，则可作为肽而被切断。对2D点“C”的从头测序信息表明从N-端区起缺少了160aa，而这在建立了AFP特征时常见现象(图12A)。由1D凝胶和2D凝胶得到的重新排序的组合的结果示于图12B。结果表明从N-端区起缺少了160aa。表11A列出了确认出的肽。
2D点“D”的分析
来自2D-凝胶的点“D”揭示了除共纯化污染物，肌动蛋白、肌动蛋白结合蛋白辅肌动蛋白之外的3种蛋白的特征。然而，除了CD44之外，另两种蛋白的Pi与在2D点中观察到的Pi截然不同，因此被排除到蛋白ID之外。CD44异形体3的分子量经确定为53.585±3kDa，这与在对点“D”的2D-PAGE分析中观察到的分子量和Pi完全符合。
110kDa抗原带的分析
如先前所述，在还原条件下，在～110kDa处的带可通过考马斯染色和西方斑点试验来显现。由2D-PAGE分析清楚地表明在约～50kDa处的两个组分分别被确认为CD44和AFP，当在非还原的凝胶分离条件下，构象得以保持时，它们共同形成110kDa的带。因此，为了进行确认，将110kDa带切离并进行分析以确认蛋白组成。如图13A所示的在～110kDa的带被切离(E)用于MS分析。由100kDa的带确认的蛋白的详细情况示于表10中。
蛋白带“E”的MS分析
蛋白带“E”的MS分析结果见于表10中。除共纯化污染物，即肌动蛋白、辅肌动蛋白和波形蛋白外，确认了另3种蛋白的特征。它们是CD44，AFP和热休克蛋白90。热休克蛋白90不符合确认的分子量，因此被排除到候选蛋白之外。由于CD44是与膜相关的蛋白，起有可能是同族抗原。另外还证实了AFP与CD44共纯化(图15A)，然而，在膜表面上没有探测到AFP。
使用上下蛋白质组学(top-down proteomics)方法可清楚地看出分离抗原的分子量(50kDa)对应于CD44E的预测的分子量。流动实验和对给定细胞系的结合等级排序也证实了该发现。表11B和12中的数据描述了与MS/MS分析确认的肽谱相关的细节。具体而言，分离出与CD44分子的3个不同区域相符合的8个肽。特别的，除了存在于母体分子上之外，有一个肽符合CD44E的独特v8-v9的区域。
图14代表了将所得肽与蛋白数据库对应后得到的序列覆盖率。在细胞外区域的对应中总共获得8个肽，一个在CD44分子的可变区，4个在CD44分子的细胞质区。肽的与CD44变异体的同型检索和对应表明，CD44R1和CD44 R2也在可变区表达v8-v10外显子。然而，它们从外显子19缺少了细胞质尾(cytoplasmic tail)的主要部分。因此，在我们分析的8个确认的肽中，仅对4个显示出同源性，因此，不符合由免疫沉淀纯化的抗原的分子量/Pi标准。预测的CD44E分子量为53.8kDa，而观察到的分子量和Pi证明完全符合。因此，可能为VB1-008抗原的CD44异形体是CD44E或者上皮形式，其也被称为异形体-3。
实施例7(c)VB1-008抗原的确认
(1)由流式细胞仪测定的CD44抗体和AFP抗体细胞表面反应性
CD44作为VB1-008的同族抗原(cognate antigen)的可能性已通过免疫纯化、基于凝胶的分析和MS分析得以清楚地建立。在所有应用VB1-008的研究中均使用膜制剂，其中根据初步表征实验清楚地揭示出了结合到VB1-008的抗原所在的膜的位置。为确定抗原的两组分在细胞表面的取向，用流式细胞仪在一板细胞系上用VB1-008、CD44抗体、AFP抗体和EGFR抗体测定反应性。研究中还用到同型匹配对照物。
选择一板表达不同VB1-008Ag水平的细胞系来进行比较细胞表面反应性实验。从各细胞系中约选用300,000个左右的细胞，测量VB1-008/CD44抗体/AFP抗体的平均荧光增加倍数并与相应的同型匹配对照物作比较。抗原强度栏(The antigen intensity column)是在各细胞系的WB分析中观察到的由相应抗体探测到的信号强度的汇集。VB1-008的同型匹配对照物为4B5-IgG，CD44抗体、AFP抗体和EGFR抗体的同型匹配对照物为鼠IgG，这是因为后三种抗体是鼠的单克隆抗体。
如表13所示，对CD44抗体结合的等级顺序与VB1-008的类似。AFP抗体未显示出任何对同型匹配对照物的可探测的结合。由于CD44抗体和AFP抗体是鼠的单克隆抗体，故使用EGFR抗体，一种鼠的单克隆抗体，作为阳性对照物。不仅是结合的等级顺序具有可比性，比起VB1-008结合，CD44抗体显示出极大的超过48倍的增加，这表明了同族抗原-抗体相互作用的存在。由西方墨点法谱图观察到的抗原强度也与由流式细胞仪获得的谱图具有可比性。
(2)重组AFP的1D-PAGE/西方墨点法分析
AFP是一种血清糖蛋白，可商业获得该蛋白的67kDa的重组分子。该分子由RDI实验室购得，且0.3μg的纯的蛋白、AFP和0.3μg的BSA在SDS-PAGE上进行电泳，然后转移到硝化纤维膜上，并用VB1-008进行探测。如图15A所示，观察到的阳性反应表明在AFP上的可由VB1-008识别的抗原决定区的存在。由于AFP是用VB1-008进行免疫沉淀以及用MS分析确认的两种蛋白中的一种，当前的西方墨点分析实验证实了在用VB1-008的免疫纯化样品中AFP的存在。
(3)VB1-008Ag的西方墨点分析以及其与AFP抗体和CD44抗体的反应性
对MDA-MB-435S膜的VB1-008免疫沉淀反应的洗出液进行2D-PAGE分离，结果揭示了两截然不同的点“C”和“D”的存在，它们分别是在Pi范围为5.1-5.4、分子量为51±3kDa，以及Pi范围为5.2-5.5、分子量为50±3kDa。当用VB1-008探测时，该两点也得以显示。对这两点的LC-MS/MS分析揭示出AFP和CD44的特性，它们甚至可通过在非还原条件下的110kDa带中存在而得以证实。因此，在下一步中，重复与免疫纯化相同的条件，在2D-PAGE上溶解，转移到硝化纤维膜上，并用AFP抗体和CD44抗体作为西方墨点分析的探测。结果示于图15B和图15C中。
各种可商业获得的抗体、AFP抗体和CD44抗体分别特异性地与由MS分析确认的图11A和11B中的标记为点“C”和“D”的同族点反应。在图15B和C中，观察到两个具有大致相同的Pi，相差2-3kDa的点与CD44抗体发生相互作用，这可能是由于一些过程副产物中几个氨基酸的随机丢失，或由于CD44抗体对识别周边CD44抗原决定区的存在的敏感性而造成。需要强调的是，被确认为AFP和CD44的与VB1-008反应的两点，已通过各自的抗体在适当的质量和Pi的位置得以显示。
(4)AFP对CD44的交叉反应性
为了明白AFP对CD44的关系，设计出一实验，使用CD44抗体来免疫沉淀所有的异形体。这些选择性纯化的蛋白进行过SDS-PAGE和WB分析。同时进行三组相同的实验。用CD44抗体作为西方墨点法分析探针。
如图16中所示，当在非还原条件下实验时，AFP非常强烈地与分子量在115-200kDa之间的CD44反应。如在以前所观察到的，VB1-008按预期与CD44反应，且在～110kDa的范围出现一清洁的单带。因此，AFP有可能是另一共纯化蛋白，其具有与CD44发生相互作用的固有的能力。由于结合到CD44，当用VB1-008进行免疫纯化时，其分子量的值有所降低。
讨论
用VB1-008进行免疫纯化实验，在非还原条件下，在～110kDa处显示出一单特异带，而在1D-PAGE还原条件下，显示出一单一的50+3kDa的带。为了解决可能的蛋白堆叠以及确定蛋白的等电点，进行了2D-PAGE分析。2D-PAGE分析的结果显示出分别在Pi＝5.1-5.4和5.2-5.5，分子量为51±3kDa和50±3kDa的两点的存在。对这些2D点的MS/MS分析恢复了32和8种肽，其分别覆盖了各个经确认的蛋白的54％和28％。两种推定的抗原被确认为是CD44异形体3和甲胎蛋白的低分子量形式。
确认实验被进行以证实上述提及抗原的存在。用VB1-008探测的重组AFP分子的SDS-PAGE/西方墨点分析显示出一在67kDa范围内的对应于阳性反应的强烈的单带，因此证实了AFP的存在。为了确认CD44的存在，使用流式细胞仪并采用CD44抗体对相同板的细胞进行测试。与VB1-008相比，CD44显示出结合的强烈的增加，且也保留了相同的等级顺序。AFP没有结合到任何测试的细胞系。这些结果表明CD44是细胞表面抗原，其被VB1-008所识别。并且，免疫纯化和随后的MS/MS分析也清楚地表明了有AFP的涉入。
作为VB1-008Ag的CD44E
蛋白的鉴定是通过源自经免疫沉淀纯化的VB1-008Ag的胰蛋白酶切肽(tryptic peptides)的m/z测量而完成的。经蛋白数据库的全面检索，获得了对应于由8种肽组成的一组的理想结果，这8种肽被确认为来自免疫纯化的VB1-008Ag，指向CD44异形体3，其也被称为CD44E或上皮形式。纯化的抗原的分子量排除了两种异形体(1和2)作为在细胞系中被VB1-008识别的抗原的可能性。其他的异形体，例如异形体2，其编码除v1或CD44v3之外的所有外显子，以及8-10预计可与VB1-008反应，但是它们的分子量和/或pl与那些观察到的作为VB1-008细胞表面抗原的不一致。
我们的证据表明了在以CD44抗体探测的2D-PAGE以及在样品制备的还原条件下的1D-PAGE中均出现了CD44E或异形体3的预计分子量在50±3kDa，而在非还原条件下，在1D-PAGE和西方墨点分析中观察到在110±10kDa。蛋白LC-MS/MS分析确认了CD44E的存在。
实施例8：抗原决定区谱图-结合实验
如上所述，免疫沉淀反应和MS分析已确认了CD44E(异形体3)为VB1-008抗原。CD44E与其他的拼接变异体不同的是，在保留序列外显子1-5和16-20之间具有外显子v8-v10。然后从CD44E的独特区域(即跨越外显子5-v8连接点的氨基酸序列)合成肽，以确认VB1-008的反应性抗原决定区。从CD44E的C-端区获取的相同长度的肽被用作阴性对照物。
方法和试剂
源自CD44E独特区的肽：
跨越CD44E的外显子5-V8的合成肽购自Global peptide services，LLC。CD44E定购。来自CD44E的氨基酸序列(17aa)跨越从外显子5起的6个氨基酸长度，以及从v8区的独特肽起的11个氨基酸长度。图18A中高亮部分代表了被分为3个肽的一段17个氨基酸，且在蛋白的C-端基区的阴性对照肽的序列用高亮表示。
各肽的氨基酸序列如下：
肽1：生物素-STDRIPATNMD-1445.2amu(SEQ ID NO：26)
肽2：生物素-RIPATNMDSSH-1453.27amu(SEQ ID NO：27)
肽3：生物素-ATNMDSSHSIT-1387.58amu(SEQ ID NO：28)
阴性：生物素-AVEDRKPSGLN-1410.19amu(SEQ ID NO：29)
肽的溶解：
所有的肽均溶解在PBS中。如果发现有任何溶解的困难，溶液的pH值用0.01N HCl或0.01N NaOH进行调节。肽保存在-20℃的母液(1000nM)中。
用肽对ELISA盘进行涂层：
用含0.5％甲醛的Hank’s缓冲盐水溶液(HBSS)，以1∶100的比例稀释肽溶液。在96孔的盘中，向每个孔中加入100μL的稀释肽溶液。盘在室温下培养1小时。除去上清夜，并将盘置开放地于37℃的培养器中培养16-18小时。涂布了肽的盘被置于塑料带中并在2-8℃下保存待用。
另外，肽也可以用碳酸盐/碳酸氢盐的pH9.6的缓冲液进行稀释，并进行涂盘。除了涂布缓冲液改变外，其他所有的步骤都相同。
将VB1-008结合到肽涂层的ELISA盘上：
根据SOP 2.1.19和SOP 2.2.7，将VB1-008结合到固定的肽上：
在肽涂层的盘过夜培养后，在安装了8-道转接器的重复吸液管的辅助下，向各盘手工加入300μL清洗缓冲液(含0.5％Tween20的PBS)。丢弃盘的内容物；将盘翻转并在3-4英寸的纸巾上轻拍以出去过量的液体。上述步骤重复两次或更多次。
阻断：
肽涂层的盘用阻断缓冲液(含1％BSA的PBS)以300μL/孔进行阻断。盘在室温下培养30-60分钟。培养结束后，抛弃阻断缓冲液。
结合：
向每个孔中加入相当于75μg/mL的VB1-008的等份用量，并在37℃培养2小时。按上述用清洗缓冲液(含0.5％Tween20的PBS)清洗盘。将盘在室温下用1∶6000的人IgG-HRP抗体的稀释液培养1小时。盘按前述被清洗。向各孔中加入100μL的TMB基质(TMB过氧化物酶基质KPL cat#50-76-00)，并在黑暗中培养5-10分钟。向各孔中加入100μL的1M磷酸以终止反应。用ELISA读盘器测量在450nm下的光学浓度。
此外，ELISA盘可根据SOP 2.1.111，用100μg/mL的VB1-008涂层，且根据生物素酰化探针的SOP 2.1.41，分析生物素酰化的肽对VB1-008的结合。
结果
从CD44E的独特区(即跨越外显子5-v8连接点的氨基酸序列)筛选合成肽揭示了，肽3显示出最强的结合，然后是肽2，显示出50-60％的观察到的肽3的结合。与肽1不同的是，用作阴性对照物的从CD44E的C-端基区取出的相同长度的肽没有显示出任何反应性。VB1-008与肽3的反应性表明CD44E的该区域含有VB1-008的反应性抗原决定区。见图18B。
实施例9：抗原决定区谱(Mapping)-竞争实验
下面分析用于VB1-008结合的肽的竞争效率。
方法和试剂
肿瘤细胞系的生长和维持：
细胞系是阳性VB1-008，即根据ATCC指南，培养并维持MDA-MB-435S。
合成的肽：
所有的肽均溶解于PBS中，并在-20℃以1.428mM(2mg/mL)存放在100μM溶液中。
竞争分析：
VB1-008(75g/mL)-0.5μM浓度被用于非竞争对照物。摩尔过量物(Molar excesses)，即20X，40X，100X和200X的肽被用与VB1-008竞争。在通过流动结合前，将肽/VB1-008混合物在冰上培养10分钟。使用4B5-IgG作为同型匹配对照物，使用EGFR抗体作为非相关的抗体。这两种抗体按与VB1-008完全相同的方法进行处理。
VB1-008的结合：
VB1-008以及EGFR抗体和4B5-IgG抗体对的MDA-MB435S细胞的结合，均通过流式细胞仪进行分析；分析是按照如前所述的最优化协议进行。用肽处理的细胞和未处理的细胞均被类似处理。
结果
如图19A所示，肽1不与VB1-008竞争结合到MDA-MB435S，肽2以60％的效率与VB1-008竞争结合到MDA-MB435S，肽3以96％的效率与VB1-008竞争结合到MDA-MB435S。对照物显示没有与VB1-008的竞争。
图19B显示出了同型匹配对照物的结果。没有肽或对照物与EGFR抗体有结合的竞争。
实施例10：VB1-008免疫毒素的细胞毒性
方法和试剂
按照揭露于PCT/CA2005/000410和美国专利申请11/084,080中的方法，构建VB6-008构建物，其包含附于修饰的bouganin之上的VB1-008。
产生一双顺反子(dicistronic)表达单元，其包含VB1-008的VH-CH区，该区通过使用对弗林蛋白酶(Furin)敏感的偶联剂连接到经修饰的bouganin，且其后紧接VB1-008区的VL-CL。VH和VL均处于PelB引导序列之后(见图26和27)。该双顺反子单元被克隆到pING3302 Xoma载体中，并受到树胶醛醣-可诱导的araBAD启动子的控制。邻接于VH-CH Bouganin和VL-CL的PelB引导序列的存在将导致蛋白向外周胞质空间中分泌，而此处的还原条件将允许在两恒定区域之间形成二硫键。最终的，Fab-bouganin融合蛋白将分泌到培养上清液中。通过置于VL-CL的N-端区的组氨酸亲和力标签(histidine affinity tag)，Fab-bouganin蛋白可通过使用Ni2+-螯合捕获方法得以纯化。VB6-008(395bp)的VH片段用以下的引物扩增，并通过使用PvuII和NheI限制性位点，克隆到PelB-VB6-011-F-bougγ盒中。
5’PvuII-QVQL
      5’ATG GCG CAG GTG CAG CTG CAG GAG TTG GGT CCA
      (SEQ ID NO：30)
3’VB4-008-NheI
      5’CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC GCT AGC GAC AGT
      GAC CAT TGT CCC(SEQ ID NO：31)
VB1-008轻链为λ，且由于λCL区含有SpeI限制性位点，故使用不同的限制性位点来组装VB6-008。因此，在VB6-008轻链片段的5’端位，用到HindIII限制性位点(在bouganin中)来将最终构建物组装到pSP73质粒中(见图27)。在VL-CL连接点附近没有发现限制性位点，因此每个克隆的VL-CL均通过拼接重叠延伸PCR(Splice Overlapping Extension PCR)方法获得。以下引物与D-bouganin 156一同使用，PelB信号，VB1-008杂种细胞的cDNA作为模板：
通过拼接重叠延伸聚合酶链式反应组装HindIII-boug-PelB-VB6-008λ，其中用到以下引物：
5’弗林蛋白酶(Furin)偶联剂D-bouganin
     5’CAC AGG CAG CCC AGA GGC TGG GAG CAG CTC TAC
     AAC ACC GTG TCA TTT AAC CTT(SEQ ID NO：32)
3’008-PelB
     5’CGT TCC ATA GAC CTG CAG TCT AGA GTC GAC TCA CTA
     TTT GGA GCT TTT AAA CTT(SEQ ID NO：33)
5’PelB-SalI
      5’AAG TTT AAA AGC TCC AAA TAG TGA TCT AGA GTC÷
      GAC CTG CAG GTC TAT GGA ACG ATA AAT(SEQ ID NO：34)
3’008-VL CL
      5’CAC TGA GGG TGG CTG AGT CAG CTC ATA GTG ATG
      GTG GTA GTG AGT(SEQ ID NO：35)
5’008-VL CL
      5’CAT CAC CAT CAC CAT CAC TAT GAG CTG ACT CAG
      CCA CCC TCA GTG(SEQ ID NO：36)
3’008 CL STOP
      5’CTC GAG TCA CTA TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TGT
      CTT CTC CAC(SEQ ID NO：37)
使用以上列出的6中引物，用三步拼接重叠延伸PCR法进行扩增。
第1步
引物1和2被用于扩增在3’端含有部分PelB启动子(820bp)的bouganin。在第二个PCR反应中，引物3和4被用于扩增在3’端含His标签以及部分VB6-008 VL(179bp)的PelB。在第三个PCR反应中，引物5和6被用于扩增在3’端有两个停止密码子以及XhoI位点(666bp)的VB6-008λ链。
第2步
在第二个PCR反应中，从各PCR产物中使用11的引物1和6，来生成HindIII-bouganin-PelB-VB6-008λ链(1591bp)。
在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳来分离扩增的PCR产物。切离感兴趣的带并用Qiaquick凝胶提取试剂盒纯化，克隆到TOPO pCR 2.1克隆载体中，并用373 DNA测序仪测序。
PCR产物被纯化和测序。经确认的克隆被HindIII和XhoI消化，且配合到先前用相应的酶消化过的PelB-VB4-008-F-boug/pSP73上(图27)。然后用EcoRI和XhoI消化VB6-008片段，克隆到pING3302表达载体中并转化到E104细胞中。
E104细胞在含30mL的TB介质的振荡培养瓶中于37℃下繁殖，烧瓶以225rpm的速度振动约5小时，直到光学密度(O.D.600nm)达到2为止。此时，用最终浓度为0.1％L-(+)的树胶醛醣诱发培养物16小时，并在25℃下培养。然后，在14000rpm下离心收集细胞球和上清夜5分钟。在还原或非还原条件下，使用抗-His(Amersham Biosciences 27-4710-01)和抗-人κ轻链(σA-7164)或抗-人λ轻链(σA-5175)进行西方墨点分析法对细胞球和上清液进行分析，从而确定免疫毒素的存在和大小。制成具有最高表达水平的克隆的研究细胞库(Research Cell Bank)，且3个独立的小瓶将被用于测试在2L的振荡培养瓶中在500mL TB水平下的诱导。每隔6小时，分离细胞球和上清夜，用西方墨点分析法来指示收获的最佳诱导后期的时间。
流式细胞仪被用于展现纯化的VB6免疫毒素保留了它们各自母抗体在使用抗原阳性和阴性细胞系时的结合特异性。结合将通过使用鼠的抗-His单克隆抗体(Amersham Biosciences 27-4710-01)而探测到。结合的特异性通过竞争分析来评定。简言之，VB6-免疫毒素(固定浓度)和相应的VB1抗体或同型匹配对照抗体(变化浓度)同时与抗原阳性细胞进行培养。结合将通过使用鼠的抗-His单克隆抗体而探测到。使用抗-His单克隆抗体而导致的结合的降低表明，VB6免疫毒素和相应的VB1抗体结合到相同的抗原上。预计VB6免疫毒素的结合水平在有同型匹配对照抗体存在下将不会改变。VB6免疫毒素的功能性亲和力通过使用抗原阳性细胞系的滴定曲线计算。通过使用抗原阳性和阴性细胞系，MTS分析被用于测量各VB6免疫毒素的IC50。VB6-4B5被用作阴性对照物。细胞毒性的特异性通过VB6免疫毒素和VB6-4B5的IC50的不同而测量。
结果
免疫偶联物(VB6-008)被构建出，其包含附于经修饰的bouganin上的VB1-008。免疫偶联物的核苷酸序列见于图20(SEQ ID NO：11)。免疫偶联物的氨基酸序列见于图21(SEQ ID NO：12)。图22显示出完整的VB6-080构建。图23显示出VB6-008单元#1，其包括PelB-VH-CH-Furin-De-Bouganin。图24显示出VB6-008单元#2，其包括PelB-VL-CL。
在体外评定VB6-008对抗原-阳性细胞MB-435SC的细胞毒性。Colo-320被用作阴性对照物。细胞与处于1000到1nm的VB8-008培养，5天后，测量变异性。如图25中所示，与阴性对照物相比，VB6-008免疫偶联物显著地杀死了抗原-阳性细胞。
尽管本发明已通过被认为是优选的实施例加以了说明，但应当理解本发明并不限于上述揭示的例子。相反，本发明还包括落入权利要求所表现的本发明的精神和范围中的各种变化和等同的情况。
正如各单独的出版公开物、专利和专利申请被具体和单独地完全引用，在此，所有的出版公开物、专利和专利申请均被全文引入作为参考。
表1：CDR序列
CDR 序列
                             VB1-008
             L-链                  H-链
CDR1CDR2CDR3   SGDNLGNKYVCEDTKRPSQAWDSRTEI     SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2SEQ ID NO：3   GDEYYWSYMSYRGSSYYSPSLQSKYCGGDCRSGFDI     SEQ ID NO：4SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6
表2：VB1-008对正常和肿瘤细胞表面结合的比较
    临床适应症     代表性肿瘤细胞系     N1     MF2     相对等级
    乳房     MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435S     3     17.2     1
    肺     A-549，NCI-H460，NCI-H69     3     16.1     2
    黑素瘤     A-375，SK-MEL-5a，b，SK-MEL-28a     3     15.6     3
    前列腺     DU-145a，b，f，PC-3a，b，g，LNCaPa，b，g     3     14.2     4
    卵巢     SK-OV-3a，OVCar-3     2     10.8     5
    肾     Caki-1a，A498a，ACHNa     3     10.5     6
    肝     SK-HEP-1，Hep-G2     2     8.3     7
    直肠     SW837，NCI-H630     2     7.5     8
    结肠     HT-29a，SW480，WiDr     3     7.2     9
    子宫颈     HeLa，C-41，C-33A     3     4.4     10
    胃     AGS，NCI-N-87，KATO III     3     4.0     11
    膀胱     UM-UC-3，T24     2     3.9     12
    子宫内膜     RL-95-2，HEC-1-A     2     3.9     12
    胰腺     PANC-1，BxPC-3，MIA PaCa-2     3     3.8     14
    头&颈     SCC-15，SCC-25     2     2.9     15
    正常细胞类型     细胞系     肿瘤：正常
    肾     HRE     1     6.1     1.7
    肺     NHLF     1     5.6     2.9
    内皮     HUVEC     1     1.6     N/A
    乳房     HMEC     1     2.4     7.2
    前列腺     PrEC     1     4.0     3.6
1N表明每适应症中测试的细胞系的数目。2MF：数值表明在各适应症中，由所有细胞系中相对于对照抗体的平均荧光平均增加倍数的总和计算得到的平均。0表示相对于参照抗体，没有可测量的反应性。a显示的是由AntiCancer Inc提供的rthotopic模型。b显示的是可用作GFP(绿色荧光蛋白)-转染子的细胞系。CHer2/neu-，ER+.dHer2/neu-，ER-，p53wt，raswt.eHer2/neu-，ER-，p53mt，raswt.f男性激素-响应的。g男性激素-不响应的。N/A，不适用。平均增加倍数(MF)被用于计算肿瘤：正常的比率
表3：VB1-008的临界正常组织(Critical Normal Tissue)的LD阵列
    组织     膜染色     评分范围*
    脑     无(0/2)     0
    结肠     无(0/5)     0
    心脏     无(0/5)     0
    肾     2/3     0-1(10％)
    肝     无(0/5)     0
    肺     无(0/5)     0
    胰腺     1/5     1(30％)
    胃     1/5     1(70％)
*评分是基于0-3+级进行评价，0＝没有染色，痕量小于1+，但大于0。1+到3+级代表染色强度的增加，3+最强，为黑棕色染色。通常，6个不同病人的单一样品被筛选出。当少于6个病人被筛选出时，表明评分或是丢失，或不能代表染色组织。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。
表4：VB1-008的HD正常TMA
    组织     膜染色     评分范围*
    肾上腺     无(0/2)     0
    大动脉     无(0/5)     0
    动脉     无(0/5)     0
    膀胱     无(0/5)     0
    脑     无(0/5)     0
    乳房     无(0/5)     0
    输卵管     3/4     1-2(30-60％)
    LN     无(0/3)     0
    肌肉     无(0/4)     0
    卵巢     无(0/5)     0
    垂体     无(0/5)     0
    胎盘     无(0/4)     0
    前列腺     4/5     0-1(10-20％)
    皮肤     ND
    脊髓     无(0/1)     0
    脾     无(0/2)     0
    睾丸     3/5     1-2(95％)
    胸腺     无(0/1)     0
    甲状腺     无(0/5)     0
    输尿管     1/2
    子宫     无(0/5)     0
*评分是基于0-3+级进行评价，0＝没有染色，痕量小于1+，但大于0。1+到3+级代表染色强度的增加，3+最强，为黑棕色染色。通常，8个不同病人的两个样品被筛选出。当少于8个病人被筛选出时，表明评分或是丢失，或不能代表染色组织。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。
表5：VB1-008的HD肿瘤TMA
    组织     膜染色   评分范围*
    膀胱     6/6   1-2(100％)
    乳房     6/7   1-2(100％)
    子宫颈     2/7   1(100％)
    结肠     3/3   1-2(100％)
    肾     5/8   1-2(100％)
    肝     5/7   1-2(100％)
    肺     1/8   1(100％)
    卵巢     6/7   1-2(100％)
    胰腺     4/7   1(100％)
    前列腺     5/5   1-2(100％)
    直肠     4/6   1-2(100％)
    皮肤     1/4   1(100％)
    胃     4/5   1-2(100％)
    子宫     8/8   1-2(100％)
    头&颈     4/8   1(100％)
*评分是基于0-3+级进行评价，0＝没有染色，痕量小于1+，但大于0。1+到3+级代表染色强度的增加，3+最强，为黑棕色染色。通常，8种不同蛋白中的两个样品被筛选出。当少于8种蛋白被筛选出时，表明评分或是丢失，或不能代表染色组织。头&颈癌包括咽喉癌、唇癌、喉癌、口癌、扁桃腺癌和牙龈癌。括号中的值表明在评分范围内被染色的细胞的百分比。
表6：抗体结合作为时间和温度函数的流式细胞仪评定
MAb ID 抗体1 培养时间(分钟)37℃下     平均荧光(MF)     MF增加的倍数2   ％MF的降低3
  VB1-008     17P2/C12 -4 134.0±11 31.7 -
    60     57.0±1.0     13.5     57.5
    120     50.7±1.1     12.0     62.2
非—内化对照物 MA-103 -     536.1±31.3     112.8     -
120 535.5±16.8     113.0 -
  I内化对照物     5E9     -     246±11     60.0     -
    60     53.5±1.5     13.0     78.3
    120     48±4     11.7     80.5
1表示出代表性的实验。2MF增加到阴性对照物之上，鼠骨髓瘤IgG或人IgG(4B5)。3MF从肿瘤细胞的细胞表面降低百分比。4(-)细胞在冰上培养120分钟。
表7：VB1-008对研究用各细胞系的同型匹配对照物的平均荧光的增强
 细胞系     MF*
 A-375     13.3
 MDA-MB-435S     15.8
 MDA-MB-231     14.2
 MCF-7     4.67
 PANC-1     8.3
 DAUDI     1.1
 RAMOS     1.3
表8：纯化抗原总结
细胞系   样品             制备   流动结果     强度
  还原的   非还原的
A-375   50±2kDa   100±5kDa     11.08     +++
MB435S   50+2kDa   100±5kDa     15.8     ++++
MB231   50+2kDa   100±5kDa     14.2     ++
MCF-7   50+2kDa   100±5kDa     4.63     +
PANC-1   -    -     8.95     -
DAUDI   -    -     1     -
RAMOS   50+2kDa   100±5kDa     1.1     +++
表9A：由LC-MS/MS从2D点-‘C’确认的蛋白的总结
                        2D点‘C’-48.8kDa(从MDA-MB-435S)
登记号# 蛋白ID Mw/Pi 肽     符合2DE
  gi|4501989   甲胎蛋白[人类](AFP)   68813/5.2     30     √
  gi|231315   α-1蛋白酶抑制剂   39099/5.27     7     C
  gi|224224   α-1抗胰蛋白酶   46731/4.35     6     C
C-共纯化污染物；
X-与观察到的Pi和/或Mw不符合；
√＝符合Pi和Mw
表9B：由LC-MS/MS从2D点-‘D’确认的蛋白的总结
                               2D点‘D’-45+2kDa
登记号# 蛋白ID Mw/PI 肽     符合2DE
gi|105583  细胞附着分子CD44-人 53585/5.4     3     √
gi|87056  核仁蛋白-相关的蛋白-人 77453/4.5     3     X
gi|2804273  α-辅肌动蛋白4[人类] 102661/5.27     5     C
gi|34862435  ER蛋白99/整联蛋白 92713/4.72     2     X
gi|71620  肌动蛋白-β-牛 41786/5.22     1     C
C-共纯化污染物；
X-与观察到的Pi和/或Mw不符合；
√＝在可接受范围内符合Pi和Mw
表10：由LC-MS/MS从蛋白带′E′确认的蛋白的总结
                       蛋白带′E′-VB1-008IP的110kDa带(非还原条件)
登记号#  蛋白ID Mw/PI     肽 符合2DE
gi|4501989  甲胎蛋白[人类](AFP) 68813/5.2     16     √
Gi|105583  细胞附着分子CD44-人 53585/5.4     8     √
gi|20177936  热休克蛋白Hsp90-beta[Hsp 84] 81912/4.77     10     X
gi|34862435 α-辅肌动蛋白 92713/4.72 2 C
gi|71620  肌动蛋白-β-牛 41786/5.22     5     C
gi|55408  波形蛋白[月鼠] 54418/5.01     3     C
C-共纯化污染物；
X-与观察到的Pi和/或Mw不符合；
√＝在可接受范围内符合Pi和Mw
表11A：AFP的从MS/MS回收的肽
 肽     SEQ ID NO
 YGHSDCCSQSEEGRHNCFLAHKFIYEIARHPFLYAPTILLWAARIIPSCCKAENAVECFQTKESSLLNQHACAVMKTFQAITVTKLSQKFTKLVLDVAHVHEHCCRGDVLDCLQDGEKIMSYICSQQDTLSNKGQCIIHAENDEKPEGLSPNLNRFLGDRDFNQFSSGEKDFNQFSSGEKDFNQFSSGEKNIFLASFVHEYSRNIFLASFVHEYSRRHPQLAVSVILRHPQLAVSVILRGYQELLEKYIQESQALAKRRSCGLFQKLGEYYLQNAFLVAYTKKKAPQLTSSELMAITRAPQLTSSELMAITRMAATAATCCQLSEDKLLACGEGAADIIIGHLCIRLLACGEGAADIIIGHLCIRDLCQAQGVALQTMKQEFLINLVKQEFLINLVKQKPQITEEQLEAVIADFSGLLEK     464748495051525354555657585960616263646566676869707172737475
表11B：从免疫纯化的CD44的MS分析回收的肽
NLQNVDMK-Exon 20(SEQ ID NO：38)
YVQKGEYR-Exon 5(SEQ ID NO：39)
KPSGLNGEASK-Exon 20(SEQ ID NO：40)
YGFIEGHVVIPR-Exon 3(SEQ ID NO：41)
TEAADLCK-Exon 2(SEQ ID NO：42)
LVINSGNGAVEDR-Exon 19(SEQ ID NO：43)
ESSETPDQFMTADETR-Exon 20(SEQ ID NO：44)
TGPLSMTTQQSNSQSFSTSHEGLEED-Exon v8-v9(SEQ ID NO：45)
表12：不同CD44异形体中肽的匹配
CD44异形体 登记号  肽的匹配  同源性
CD44 PGP Hutch蛋白 Gi|87056  2  100％
CD44 E/异形体3 GI|105583/GI|48255939  8*  100％
CD44 M4异形体 GI|346672  1  58.7％
CD44异形体1(母体) GI|48255935  8  100％
CD44H/CD44s异形体2(标准) GI|48255937  7  100％
CD44异形体4 GI|48255941  7  100％
CD44异形体5/异形体RC GI|48255943  1  100％
CD44异形体v3-v6 GI|11139066  2  100％
CD44自导引的抗原 GI|10432374  3  78.7％
CD44 T-细胞抗原 GI|13936302  1  100％
CD44 M3异形体 GI|346670  0  -
CD44异形体v6 GI|11139062  0  -
CD44异形体R1，R2 GI|87053  4  100％
表13：VB1-008，CD44抗体，AFP抗体和EGFR抗体的相对结合谱
 细胞系   VB1-008   CD44抗体   AFP抗体   Ag强度  EGFR抗体
 MB435S     15.8     773.5     1.95     ++++     33.1
 MB231     14.2     292     1.3     ++     149
 A-375     13.3     368     1.3     +++     16
 PANC-1     8.3     192.5     1.1     -     132.4
 MCF-7     4.63     52     1.1     +     7
 DAUD1     1     1.6     1.4     -     1.1
 RAMOS     1.1     1.3     1.3     +++     1.2

Claims (107)

1.包含氨基酸序列SEQ ID NO：1的分离的轻链互补决定区1或其变异体。
2.编码权利要求1的轻链互补决定区1的分离的核酸序列或其变异体。
3.包含氨基酸序列SEQ ID NO：2的分离的轻链互补决定区2或其变异体。
4.编码权利要求3的轻链互补决定区2的分离的核酸序列或其变异体。
5.包含氨基酸序列SEQ ID NO：3的分离的轻链互补决定区3或其变异体。
6.编码权利要求5的轻链互补决定区3的分离的核酸序列或其变异体。
7.包含氨基酸序列SEQ ID NO：4的分离的重链互补决定区1或其变异体。
8.编码权利要求7的重链互补决定区1的分离的核酸序列或其变异体。
9.包含氨基酸序列SEQ ID NO：5的分离的重链互补决定区2或其变异体。
10.编码权利要求9的重链互补决定区2的分离的核酸序列或其变异体。
11.包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的分离的重链互补决定区3或其变异体。
12.编码权利要求11的重链互补决定区3的分离的核酸序列或其变异体。
13.包含权利要求1，3和/或5的轻链互补决定区的分离的轻链可变区或其变异体。
14.编码权利要求13的轻链可变区的分离的核酸序列或其变异体。
15.包含权利要求7，9和/或11的重链互补决定区的分离的重链可变区或其变异体。
16.编码权利要求15的重链可变区的分离的核酸序列或其变异体。
17.包含氨基酸序列SEQ ID NO：7(图1)的分离的轻链可变区或其变异体。
18.包含轻链可变区SEQ ID NO：6(图1)的分离的核酸序列或其变异体。
19.包含氨基酸序列SEQ ID NO：9(图2，或其变异体)的分离的重链可变区。
20.包含重链可变区SEQ ID NO：10(图2)的分离的核酸序列或其变异体。
21.包含权利要求1，3和/或5的轻链互补决定区的结合蛋白或其变异体。
22.包含权利要求7，9和/或11的重链互补决定区的结合蛋白或其变异体。
23.包含权利要求1，3和/或5的轻链互补决定区以及权利要求7，9和/或11的重链互补决定区的结合蛋白或其变异体。
24.包含权利要求13或17的轻链可变区的结合蛋白或其变异体。
25.包含权利要求15或19的重链可变区的结合蛋白或其变异体。
26.包含权利要求13或17的轻链可变区以及权利要求15或19的重链可变区的结合蛋白或其变异体。
27.权利要求21-26中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白是抗体。
28.权利要求27的结合蛋白，其中，结合抗体是抗体片段。
29.权利要求28的结合蛋白，其中，抗体片段是Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，dsFv，ds-scFv，二聚抗体，微型抗体，双链抗体，和它们的多聚抗体，以及双特异性抗体片段。
30.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到包含CD44E的5-v8界面的蛋白上。
31.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到包含CD44的v8外显子的蛋白上。
32.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到CD44E上。
33.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到包含氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白上。
34.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到由氨基酸序列ATNMDSSHSIT构成的肽上。
35.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到甲胎蛋白或其变异体上。
36.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间的蛋白上。
37.权利要求36的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到进一步包含氨基酸序列SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44，和/或45的蛋白上。
38.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.5之间的蛋白上。
39.权利要求38的结合蛋白，其中，结合蛋白结合到进一步包含氨基酸序列SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74和/或75的蛋白上。
40.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合包含氨基酸序列SEQ ID NO：14的蛋白上。
41.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的蛋白上。
42.权利要求21-29中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白结合包含氨基酸序列SEQ ID NO：16的蛋白上。
43.结合到氨基酸序列ATNMDSSHSIT上的结合蛋白。
44.权利要求21-43中任何一项的结合蛋白，其中，结合蛋白是抗体。
45.权利要求44的结合蛋白，其中，抗体是抗体片段。
46.权利要求45的结合蛋白，其中，抗体片段是Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，dsFv，ds-scFv，二聚抗体，微型抗体，双链抗体，和它们的多聚抗体，以及双特异性抗体片段。
47.可结合到肿瘤细胞的抗原上的结合蛋白，其中，结合蛋白可由竞争结合分析确认。
48.权利要求47的结合蛋白，其中，竞争结合分析包括：
(1)用最小浓度的根据权利要求21-46中任意一项的结合蛋白(Ab1)与固定数量的肿瘤细胞一起培养，该结合蛋白产生对固定数量的肿瘤细胞的最大结合，并测量Ab1的平均荧光(MFAb1)；
(2)通过向Ab1和肿瘤细胞中加入Ab2，测试试验结合蛋白(test bindingprotein)(Ab2)两个或更多浓度，并测量平均荧光(MF(Ab1+Ab2)；
(3)测量背景平均荧光(MF背景)；
(4)计算PI，其中，
PI＝[(MF(Ab1+Ab2)-MF背景)/(MFAb1-MF背景)]×100；以及
(5)将PI与对照物的PI值进行比较；
其中，与对照物的PI有统计上的显著不同的PI表明试验结合蛋白能够结合到肿瘤细胞的抗原上。
49.权利要求47的结合蛋白，其中，竞争结合分析包括：
(1)用最小浓度的试验结合蛋白(Ab2)与固定数量的肿瘤细胞一起培养，该试验结合蛋白(Ab2)产生对固定数量的肿瘤细胞的最大结合，并测量Ab2的平均荧光(MFAb2)；
(2)通过培养过量摩尔的SEQ ID NO：28定义的肽和所述的最定浓度的试验结合蛋白(Ab2)，制备肽和Ab2的混合物；
(3)将所述混合物加入到肿瘤细胞中，并测量平均荧光(MF(Ab2+肽))；
(4)测量背景平均荧光(MF背景)；
(5)计算PI，其中，
PI＝[(MF(Ab2+肽)-MF背景)/(MFAb2-MF背景)]×100；以及
(6)将PI与对照物的PI值进行比较；
其中，与对照物的PI有统计上的显著不同的PI表明试验结合蛋白能够结合到肿瘤细胞的抗原上。
50.权利要求21-49中任何一项的结合蛋白，其中，利用亲和力成熟来增加结合蛋白对CD44E和/或AFP或它们的变异体的亲和性。
51.组合物，其包含权利要求21-50中任何一项的结合蛋白，以及药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
52.免疫偶联物，包含(1)权利要求21-50中任何一项的结合蛋白，其结合到癌细胞之上或之中的抗原，其附于(2)癌症治疗剂，该制剂或者是毒害细胞、抑制细胞生长，或者是阻止或降低癌症细胞分裂和/或转移的能力。
53.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含CD44E的5-v8界面的蛋白。
54.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含CD44的v8外显子的蛋白。
55.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是CD44E。
56.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间的蛋白。
57.权利要求56的免疫偶联物，其中，抗原包含氨基酸序列SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44，和/或45。
58.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白。
59.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是甲胎蛋白或其变异体。
60.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间的蛋白。
61.权利要求60的免疫偶联物，其中，抗原包含氨基酸序列SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74和/或75。
62.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ IDNO：14的蛋白。
63.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ IDNO：15的蛋白。
64.权利要求52的免疫偶联物，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ IDNO：16的蛋白。
65.权利要求52-64中任何一项的免疫偶联物，其中，癌症治疗剂为毒素。
66.权利要求65的免疫偶联物，其中，毒素是核糖体失活多肽。
67.权利要求66的免疫偶联物，其中，毒素选自由多花白树素(gelonin)、bouganin、皂草毒素蛋白(saporin)、篦麻毒素(ricin)、篦麻毒素A链、bryodin、白喉毒素(diphtheria toxin)、局限曲菌素(restrictocin)、假单细胞外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)或它们的变异体组成的组。
68.权利要求66的免疫偶联物，其中，毒素是经修饰的bouganin或它的变异体。
69.权利要求66的免疫偶联物，其中，毒素是假单细胞外毒素A的截去形式，其由氨基酸252-608或其变异体组成。
70.包含由核苷酸序列SEQ ID NO：11编码的蛋白的权利要求52的免疫偶联物。
71.包含氨基酸序列SEQ ID NO：12和13的权利要求52的免疫偶联物。
72.权利要求52-71中任何一项的免疫偶联物，其中，免疫毒素被癌细胞内化。
73.组合物，包含权利要求52-72中任何一项的免疫偶联物，以及药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂或稳定剂。
74.有效量的权利要求52-72中任何一项的免疫偶联物在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
75.权利要求74的应用，进一步包括使用一种或多种其他的癌症治疗制剂在制备同时、分开和连续治疗或预防癌症的药物中的应用。
76.治疗或预防癌症的的方法，包括向疑似患癌症的病人施予有效量的权利要求52-72中任何一项的免疫偶联物。
77.用于治疗或预防癌症的试剂盒，其包括有效量的权利要求52-72中任何一项的免疫偶联物，以及使用其治疗或预防癌症的指导说明。
78.诊断哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与权利要求21-50中任何一项的的结合蛋白接触，所述结合蛋白是在允许形成结合蛋白-抗原复合物的条件下，结合到肿瘤细胞之中或之上的抗原的结合蛋白；
(2)测量测试样品中结合蛋白-抗原复合物的含量；以及
(3)将测试样品中的结合蛋白-抗原复合物的含量与对照物作比较。
79.权利要求78的方法，其中，抗原是包含CD44E的5-v8界面的蛋白。
80.权利要求78的方法，其中，抗原是包含CD44的v8外显子的蛋白。
81.权利要求78的方法，其中，抗原是CD44E。
82.权利要求78的方法，其中，抗原是分子量在47-53kDa之间、且等电点在5.2-5.5之间的蛋白。
83.权利要求82的方法，其中，抗原包含氨基酸序列SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44，和/或45。
84.权利要求78的方法，其中，抗原是包含氨基酸序列ATNMDSSHSIT的蛋白。
85.权利要求78的方法，其中，抗原是甲胎蛋白或其变异体。
86.权利要求78的方法，其中，抗原是分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间的蛋白。
87.权利要求86的方法，其中，抗原包含氨基酸序列SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74和/或75。
88.权利要求78的方法，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ ID NO：14的蛋白。
89.权利要求78的方法，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ ID NO：15的蛋白。
90.权利要求78的方法，其中，抗原是包含氨基酸序列SEQ ID NO：16的蛋白。
91.诊断哺乳动物中的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将从所述哺乳动物取出的测试样品与抗体接触，所述抗体是在允许形成抗体-甲胎蛋白复合物的条件下，结合到甲胎蛋白或其变异体上的抗体，以及在允许形成抗体-CD44E复合物的条件下，结合到CD44E上的抗体；
(2)测量测试样品中抗体-甲胎蛋白复合物及抗体-CD44E复合物的的含量；以及
(3)将测试样品中的抗体-甲胎蛋白复合物和抗体-CD44E复合物的含量与对照物作比较。
92.用于诊断癌症的试剂盒，其包括有效量的权利要求21-50中任何一项的结合蛋白，以及使用其诊断癌症的指导说明。
93.用于诊断癌症的试剂盒，其包括结合到甲胎蛋白或其变异体的抗体和结合到CD44E的抗体，以及使用其诊断癌症的指导说明。
94.诊断试剂，包含(1)根据权利要求21-50中任何一项的结合蛋白，其附着于(2)直接或间接地产生可探测信号的标记物。
95.权利要求94的诊断试剂，其中，标记物是放射线同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶、成像试剂或金属离子。
96.试剂盒，其包括权利要求94或95的诊断试剂以及使用指导说明。
97.重组表达载体，其包含权利要求2，4，6，8，10，12，14，16，18和20中任何一项的核酸分子。
98.重组表达载体，其包含根据SEQ ID NO：11的核酸分子。
99.宿主细胞，其包含权利要求97-98中任何一项的重组表达载体。
100.分离的蛋白，其包含可特异性结合到权利要求21-50中的结合蛋白之一的氨基酸序列。
101.权利要求100的分离的蛋白，其中，分离的蛋白分子量在48-54kDa之间、且等电点在5.1-5.4之间。
102.权利要求101的分离的蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NOS：46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74和/或75。
103.权利要求100的分离的蛋白，其中，分离的蛋白分子量在47-53kD之间、且等电点在5.2-5.5之间。
104.权利要求103的分离的蛋白，其包含氨基酸序列SEQ ID NOS：38，39，40，41，42，43，44，和/或45。
105.权利要求100的分离的蛋白，其中，分离的蛋白包括氨基酸序列SEQID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。
106.编码权利要求100-105中任何一项的蛋白的分离的核酸序列。
107.权利要求100-105中任何一项的分离的蛋白在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
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